JP2023520262A - 改善された第viii因子発現による血友病aのための遺伝子編集 - Google Patents
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Abstract
Description
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、特許請求される主題が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。詳細な説明は、例示的且つ説明的なものにすぎず、特許請求される主題を限定するものではないことを理解するべきである。本出願において、単数形の使用は、特に断らない限り、複数形を含む。明細書において使用されるように、単数形の「a」、「an」及び「the」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。本出願において、「又は」の使用は、別段の記載がない限り、「及び/又は」を意味する。更に、「含んでいる(including)」、並びに「含む(include)」及び「含まれる(included)」のような他の形態の使用は、限定的ではない。
ゲノム標的化核酸又はガイドRNA
本開示は、関連するポリペプチド(例えば、DNAエンドヌクレアーゼなどの部位特異的ポリペプチド)の活性を標的核酸内の特定の標的配列に誘導することができるゲノム標的化核酸を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、RNAである。ゲノム標的化RNAは、本明細書において「ガイドRNA」又は「gRNA」と称される。ガイドRNAは、少なくとも、目的の標的核酸配列にハイブリダイズし得るスペーサー配列及びCRISPR反復配列を有する。II型システムでは、gRNAは、tracrRNA配列と呼ばれる第2のRNAも有する。II型gRNAでは、CRISPR反復配列とtracrRNA配列が互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。V型gRNAでは、crRNAが二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は、gRNA及び部位特異的ポリペプチドが複合体を形成するように、部位特異的ポリペプチドに結合する。ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドと結合することによって複合体に標的特異性を提供する。従って、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導する。
ゲノム標的化核酸のいくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、活性を改変し、安定性を提供し、及び/又はゲノム標的化核酸の改変のための位置を提供することができる。スペーサー伸長配列は、オンターゲット若しくはオフターゲット活性又は特異性を改変することができる。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列が提供される。スペーサー伸長配列は、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000、又は7000以上を超えるヌクレオチドの長さを有し得る。スペーサー伸長配列は、約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000、又は7000ヌクレオチド以上の長さを有し得る。スペーサー伸長配列は、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000以上未満のヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、長さが10ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、10~30ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、30~70ヌクレオチド長である。
スペーサー配列は、目的の標的核酸中の配列にハイブリダイズすることができる。ゲノム標的化核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション(即ち、塩基対形成)を介して配列特異的な様式で標的核酸と相互作用する。従って、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変化する。
いくつかの実施形態では、最小CRISPR反復配列は、参照CRISPR反復配列(例えば、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)由来のcrRNA;例えば、J.J.Ferretti et al.,Proc Natl Acad Sci USA(2001)98(8):4658-63を参照されたい)に対して少なくとも約30%、約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、又は100%の配列同一性を有する配列である。
いくつかの実施形態では、最小tracrRNA配列は、参照tracrRNA配列(例えば、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)由来の野生型tracrRNA;例えば、J.J.Ferretti et al.,前出を参照されたい)に対して少なくとも約30%、約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、又は100%の配列同一性を有する配列である。
いくつかの実施形態では、最小CRISPR RNAと最小tracrRNAとの間の二重鎖に「バルジ」が存在する。バルジは、二重鎖内のヌクレオチドの不対領域である。いくつかの実施形態では、バルジは、部位特異的ポリペプチドへの二重鎖の結合に寄与する。バルジは、二本鎖の片側に不対5’-XXXY-3’を有し、ここでXは任意のプリンであり、Yは、反対側の鎖のヌクレオチドとゆらぎ対を形成できるヌクレオチドを有し、また二重鎖の反対側に不対ヌクレオチド領域を有する。二重鎖の両側の不対ヌクレオチドの数は、異なっていてもよい。
いくつかの実施形態では、1つ以上のヘアピンは、3’ tracrRNA配列中の最小tracrRNAの3’に位置する。
いくつかの実施形態では、3’ tracrRNA配列は、参照tracrRNA配列(例えば、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)由来のtracrRNA)に対して少なくとも約30%、約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、又は100%の配列同一性を有する配列を有する。
いくつかの実施形態では、tracrRNA伸長配列は、tracrRNAが単一分子ガイド又は2分子ガイドの状況にあるかどうかにかかわらず、提供され得る。いくつかの実施形態では、tracrRNA伸長配列は、約1ヌクレオチド~約400ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、tracrRNA伸長配列は、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、又は400ヌクレオチドを超える長さを有する。いくつかの実施形態では、tracrRNA伸長配列は、約20~約5000以上のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、tracrRNA伸長配列は、1000ヌクレオチドを超える長さを有する。いくつかの実施形態では、tracrRNA伸長配列は、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400以上未満のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、tracrRNA伸長配列は、1000ヌクレオチド未満の長さを有し得る。いくつかの実施形態では、tracrRNA伸長配列は、10ヌクレオチド未満の長さを有する。いくつかの実施形態では、tracrRNA伸長配列は、10~30ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、tracrRNA伸長配列は、30~70ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、単一分子ガイド核酸のリンカー配列は、約3ヌクレオチド~約100ヌクレオチドの長さを有する。例示的なリンカーは、約3nt~約90nt、約3nt~約80nt、約3nt~約70nt、約3nt~約60nt、約3nt~約50nt、約3nt~約40nt、約3nt~約30nt、約3nt~約20nt、約3nt~約10ntの長さを有する。例えば、リンカーは、約3nt~約5nt、約5nt~約10nt、約10nt~約15nt、約15nt~約20nt、約20nt~約25nt、約25nt~約30nt、約30nt~約35nt、約35nt~約40nt、約40nt~約50nt、約50nt~約60nt、約60nt~約70nt、約70nt~約80nt、約80nt~約90nt、又は約90nt~約100ntの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、単一分子ガイド核酸のリンカーは、4~40ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも約100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、又は7000以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大で約100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、又は7000以上のヌクレオチドである。
DNAエンドヌクレアーゼなどの部位特異的ポリペプチドは、核酸、例えばゲノムDNAに二本鎖切断又は一本鎖切断を導入することができる。二本鎖切断は、細胞の内因性DNA修復経路(例えば、相同性依存性修復(HDR)、非相同末端結合又は代替非相同末端結合(A-NHEJ)、又はマイクロ相同性媒介末端結合(MMEJ))を刺激することができる。NHEJは、相同鋳型を必要とせずに切断された標的核酸を修復することができる。これは、切断部位で標的核酸における小さい欠失又は挿入(インデル)を生じることがあり、遺伝子発現の破壊又は改変をもたらす場合がある。相同組換え(HR)としても知られるHDRは、相同修復鋳型、又はドナーが利用できるときに生じ得る。
いくつかの実施形態では、ゲノム編集方法及び組成物は、従って、DNAエンドヌクレアーゼなどの部位特異的ポリペプチドをコードする核酸(又はオリゴヌクレオチド)を使用することができる。部位特異的ポリペプチドをコードする核酸配列は、DNA又はRNAであり得る。部位特異的ポリペプチドをコードする核酸配列がRNAである場合、それはgRNA配列に共有結合され得るか、又は別個の配列として存在し得る。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチド(DNAエンドヌクレアーゼなど)は、それをコードする核酸配列の代わりに直接使用される。
別の態様では、本開示は、本開示のゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列を有する核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、及び/又は本開示の方法の実施形態を実施するために必要な任意の核酸若しくはタンパク質性分子を提供する。いくつかの実施形態では、このような核酸は、ベクター(例えば、組換え発現ベクター)である。
NHEJ及び/又はHDRによる標的DNAの改変は、例えば、突然変異、欠失、改変、組込み、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タギング、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座及び/又は遺伝子突然変異をもたらし得る。非天然核酸をゲノムDNAに組込むプロセスは、ゲノム編集の一例である。
CRISPR(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats))ゲノム遺伝子座は、多くの原核生物(例えば、細菌及び古細菌)のゲノム中に見出すことができる。原核生物では、CRISPR遺伝子座はウイルス及びファージなどの外来の侵入者から原核生物を防御するのを助ける免疫システムの一種として機能する生成物をコードしている。CRISPR遺伝子座機能には、3つの段階が存在する:CRISPR遺伝子座への新しい配列の組込み、CRISPR RNA(crRNA)の発現、及び外来侵入者核酸のサイレンシング。5種のCRISPRシステム(例えば、I型、II型、III型、U型、及びV型)が同定されている。
自然界のII型CRISPRシステムにおけるcrRNA生合成には、トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)が必要である。tracrRNAは、内因性のRNaseIIIによって改変され、その後、プレcrRNAアレイ中のcrRNA反復配列にハイブリダイズする。内因性のRNaseIIIがリクルートされて、プレcrRNAを切断する。切断されたcrRNAは、エキソリボヌクレアーゼトリミングに供されて成熟crRNA形態(例えば、5’トリミング)が生成される。tracrRNAはcrRNAにハイブリダイズしたままであり、tracrRNA及びcrRNAは、部位特異的ポリペプチド(例えば、Cas9)と結合する。crRNA-tracrRNA-Cas9複合体のcrRNAは、crRNAがハイブリダイズできる標的核酸に複合体を誘導する。crRNAの標的核酸へのハイブリダイゼーションは、標的核酸切断のためにCas9を活性化する。II型CRISPRシステムにおける標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と称される。本質的に、PAMは、標的核酸への部位特異的ポリペプチド(例えば、Cas9)の結合を容易にするために必須である。II型システム(Nmeni又はCASS4とも称される)は、II-A型(CASS4)及びII-B型(CASS4a)に更に細分される。M.Jinek et al.,前出は、CRISPR/Cas9システムがRNAプログラマブルゲノム編集に有用であることを報告し、国際特許出願国際公開第2013/176772号パンフレットは、部位特異的遺伝子編集のためのCRISPR/Casエンドヌクレアーゼシステムの多数の例及び適用を提供している。
V型CRISPRシステムは、II型システムといくつかの重要な相違を有する。例えば、Cpf1は、II型システムとは対照的に、tracrRNAを欠く単一のRNA誘導エンドヌクレアーゼである。実際、Cpf1関連CRISPRアレイは、更なるトランス活性化tracrRNAを必要とせずに、成熟crRNAにプロセシングされる。V型CRISPRアレイは、42~44ヌクレオチド長の短い成熟crRNAにプロセシングされ、各成熟crRNAは、19ヌクレオチドの直接反復から始まり、続いて23~25ヌクレオチドのスペーサー配列である。対照的に、II型システムにおける成熟crRNAは、20~24ヌクレオチドのスペーサー配列から始まり、続いて約22ヌクレオチドの直接反復である。また、Cpf1は、Cpf1-crRNA複合体が短いTリッチPAMが先行する標的DNAを効率的に切断するように、Tリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用し、これはII型システムの標的DNAに続くGリッチPAMとは対照的である。従って、V型システムは、PAMから離れた点で切断し、一方、II型システムは、PAMに隣接する点で切断する。更に、II型システムとは対照的に、Cpf1は、4又は5ヌクレオチドの5’オーバーハングを有するねじれ型DNA二本鎖切断を介してDNAを切断する。II型システムは、平滑二本鎖切断を介して切断する。II型システムと同様に、Cpf1は、予想されるRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを含むが、II型システムとは対照的に、第2のHNHエンドヌクレアーゼドメインを欠く。
例示的なCRISPR/Casポリペプチドは、I.Fonfara et al.,Nucleic Acids Res.(2014)42:2577-90の図1におけるCas9ポリペプチドを含む。CRISPR/Cas遺伝子命名システムは、Cas遺伝子が発見されて以来、広範な書き換えを行っている。Fonfara(前出)の図5は、異なる種由来のCas9ポリペプチドのPAM配列を提供する。
ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチド(例えば、Cas9などの核酸誘導ヌクレアーゼ)と相互作用し、それによって複合体を形成する。ゲノム標的化核酸(例えば、gRNA)は、部位特異的ポリペプチドを標的核酸に誘導する。
ゲノム編集、特に、合成FVIIIコード配列を細胞のゲノムに挿入するためのシステムが本明細書に提供される。このシステムは、例えば細胞のゲノムを編集するため、及び対象(例えば、血友病Aを有する対象)を処置するために、本明細書に記載される方法において使用され得る。
ゲノム編集、特に、その合成FVIIIタンパク質を細胞のゲノムに挿入する方法が本明細書に提供される。この方法は、対象(例えば、血友病Aを有する患者)を処置するために使用され得、このような場合、細胞は、対象又は別個のドナーから単離され得る。次いで、細胞の染色体DNAを、本明細書に記載される材料及び方法を用いて編集する。
いくつかの実施形態では、特定の参照遺伝子座に対する5’境界及び/又は3’境界の位置のシフトが使用されて、遺伝子編集の特定の適用を容易にするか又は増強し、これは、本明細書に更に記載及び例示されるように、編集のために選択されるエンドヌクレアーゼシステムに部分的に依存する。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、「標的化組込み」と称される、肝細胞のゲノム中の特定の位置に合成FVIIIコード配列を組込むことである。いくつかの実施形態では、標的化組込みは、配列特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムDNA中に二本鎖切断を生成することによって可能になる。
いくつかの実施形態では、細胞に導入されたポリヌクレオチドは、本明細書に更に記載され、当技術分野で知られているように、例えば、活性、安定性又は特異性を増強し、送達を変更し、宿主細胞における自然免疫応答を低減し、又は他の増強のために、個別に又は組み合わせて使用することができる1つ以上の改変を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法で使用される任意の核酸分子、例えば、本開示のゲノム標的化核酸及び/又は部位特異的ポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達のために送達ビヒクル中又は送達ビヒクルの表面上にパッケージングされる。送達ビヒクルには、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、及びミセルが含まれるが、これらに限定されない。当技術分野で記載されるように、様々な標的化部分を使用して、このようなビヒクルと所望の細胞型又は位置との優先的な相互作用を増強し得る。
一態様において、本開示は、細胞内のゲノムを編集する方法を提供し、それによって遺伝子改変細胞を作り出す。いくつかの態様では、遺伝子改変細胞の集団が提供される。従って、「遺伝子改変細胞」は、ゲノム編集(例えば、CRISPR/Cas9/Cpf1システムを使用する)によって導入された少なくとも1つの遺伝子改変を有する細胞を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変肝細胞である。外因性ゲノム標的化核酸及び/又はゲノム標的化核酸をコードする外因性核酸を有する遺伝子改変細胞が、本明細書で意図される。
血友病は、「軽度」(FVIIIタンパク血清中濃度0.40~0.05IU/mL)、「中等度」(0.05~0.01IU/mL)、又は「重度」(0.01IU/mL未満、正常の1%未満)に分類される(G.C.White et al.,Thromb Haemost(2001)85(3):560-75)。FVIII補充タンパク療法を受けている血友病A患者の解析は、正常の3%、5%、10%、15%、20%の予測FVIIIトラフ値では、出血が起こらない頻度は、各々71%、79%、91%、97%、100%と報告している(G.Spotts et al.,Blood(2014)124:689)。このことから、FVIII値が最低値の15~20%を超えて維持された場合、出血性事象の割合は、0近くまで低下することが示唆される。血友病Aの治癒に必要な正確なVIIIレベルは明らかにされておらず、対象間で異なる可能性が高いが、約5%~約30%のレベルは、出血性事象の有意な減少をもたらすと予想される。
いくつかの実施形態では、本開示のエクスビボ方法は、ゲノム編集細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む。これは、当技術分野で公知の非経口投与の任意の方法を使用して達成され得る。例えば、遺伝子改変細胞は、対象の血液中に直接注射され得るか、肝臓中若しくはその近くに直接注射され得る(埋込まれ得る)か、又は別様に対象に投与され得る。
一態様では、本開示は、本明細書に開示される方法を実施するための組成物を提供する。組成物は、以下の1つ以上を含み得る:ゲノム標的化核酸(例えば、gRNA);部位特異的ポリペプチド(例えば、DNAエンドヌクレアーゼ)又は部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;及び本明細書に開示される方法の所望の遺伝子改変をもたらすために挿入されるポリヌクレオチド(例えば、ドナー鋳型)。
いくつかの実施形態は、上記の組成物のいずれか、例えば、ゲノム編集のための組成物、又は治療細胞組成物、及び1つ以上の更なる成分を含むキットを提供する。
遺伝子編集は、特定の配列を標的とするように操作された部位特異的ポリペプチドを使用して行うことができる。現在までに、このようなヌクレアーゼには、4つの主なタイプが存在する:メガヌクレアーゼ及びその機能的等価物、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、並びにCRISPR/CASヌクレアーゼシステム。ヌクレアーゼプラットフォームは、特にZFN及びTALENの特異性がタンパク質-DNA相互作用によるものである一方、RNA-DNA相互作用は、主にCasタンパク質を誘導するので、設計の困難さ、標的化密度及び作用様式において変化する。Cas9切断には、隣接モチーフであるPAMも必要であり、これは、異なるCRISPRシステム間で異なる。化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)由来のCas9は、NRG PAMを使用して切断するが、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)由来のCRISPRは、NNNNGATT(配列番号312)、NNNNNGTTT(配列番号313)及びNNNNGCTT(配列番号314)を含むPAMを有する部位で切断することができる。多数の他のCas9オルソログは、代替PAMに隣接するプロトスペーサーを標的とする。
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、II型エンドヌクレアーゼFokIの触媒ドメインに連結された、操作された亜鉛フィンガーDNA結合ドメインを有するモジュラータンパク質である。FokIは二量体としてのみ機能するので、一対のZFNを操作して、反対のDNA鎖上の同族標的「半部位」配列に結合し、それらの間に正確な間隔を置いて、触媒的に活性なFokI二量体の形成を可能にする必要がある。FokIドメインが二量体化すると(それ自体は配列特異性を有さない)、ゲノム編集の開始段階として、ZFNの半部位間にDNA二本鎖切断が生じる。
TALENは、ZFNと同様に、操作されたDNA結合ドメインがFokIヌクレアーゼドメインに連結され、一対のTALENがタンデムに作用して標的化DNA切断を達成する別の形式のモジュラーヌクレアーゼを表す。ZFNとの主な相違点は、DNA結合ドメインの性質、及び関連する標的DNA配列認識特性である。TALEN DNA結合ドメインはTALEタンパク質に由来し、これはもともと植物の細菌病原体キサントモナス属(Xanthomonas sp.)にて記載されていた。TALEは、33~35アミノ酸反復のタンデムアレイを有し、各反復は、一般に長さが20bpまでの標的DNA配列中の単一塩基対を認識し、40bpまでの全標的配列長を与える。各反復のヌクレオチド特異性は、12位及び13位の2つのアミノ酸のみを含む反復可変二残基(RVD)によって決定される。塩基グアニン、アデニン、シトシン、及びチミンは、4つのRVD:各々、Asn-Asn、Asn-Ile、His-Asp、及びAsn-Glyによって主に認識される。これは、亜鉛フィンガーよりもはるかに単純な認識コードを構成し、従って、ヌクレアーゼ設計について後者よりも有利である。それにもかかわらず、ZFNと同様に、TALENのタンパク質-DNA相互作用は、その特異性において絶対的ではなく、TALENもまた、オフターゲット活性を減少させるためのFokIドメインの偏性ヘテロ二量体変異体の使用から利益を得る。
ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)は、長い認識配列(14~44塩基対)を有し、高い特異性で-多くの場合、ゲノムに特有の部位で-DNAを切断する部位特異的エンドヌクレアーゼである。真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア、及びファージを含む広範囲の宿主に由来する、LAGLIDADG(配列番号6)、GIY-YIG、His-Cisボックス、H-N-H、PD-(D/E)xK、及びVsr様を含む、それらの構造によって分類されるHEの少なくとも6つの公知のファミリーが存在する。ZFN及びTALENと同様に、HEを使用して、ゲノム編集の初期段階として標的遺伝子座にDSBを作製することができる。更に、いくつかの天然及び操作されたHEは、DNAの一本鎖のみを切断し、それにより部位特異的ニッカーゼとして機能する。HEの大きい標的配列及びそれらが提供する特異性は、それらを、部位特異的DSBを作製するための魅力的な候補としている。
ハイブリッドヌクレアーゼの更なる例として、MegaTALプラットフォーム及びTev-mTALENプラットフォームは、TALE DNA結合ドメインと触媒活性HEとの融合を使用し、TALEの調節可能なDNA結合及び特異性、並びにHEの切断配列特異性の両方を利用する:例えば、Boissel et al.,Nuc.Acids Res.(2014)42:2591-601;Kleinstiver et al.,G3(2014)4:1155-65;及びBoissel and Scharenberg,Methods Mol.Biol.(2015)1239:171-96を参照されたい。
上記のヌクレアーゼプラットフォームの構造的及び機能的特性を組み合わせることにより、固有の欠点のいくつかを潜在的に克服し得るゲノム編集への更なるアプローチが提供される。一例として、CRISPRゲノム編集システムは、一般に、DSBを作製するために単一のCas9エンドヌクレアーゼを使用する。標的化の特異性は、標的DNAとワトソン-クリック塩基対を形成するガイドRNA中の20又は22のヌクレオチド配列によって駆動される(化膿レンサ球菌(S.pyogenes)由来のCas9の場合は、隣接するNAG又はNGG PAM配列中の更なる2塩基を加える)。このような配列は、ヒトゲノム中で独特であるのに十分長いが、RNA/DNA相互作用の特異性は絶対的ではなく、特に標的配列の5’半分では、時に顕著な乱交が許容され、特異性を駆動する塩基の数を効果的に減少させる。これに対する1つの解決策は、Cas9又はCpf1触媒機能を完全に不活性化し(RNA誘導DNA結合機能のみを保持する)、代わりにFokIドメインを不活性化Cas9に融合することであった(例えば、Tsai et al.,Nature Biotech(2014)32:569-76;及びGuilinger et al.,Nature Biotech(2014)32:577-82を参照されたい)。FokIは、触媒活性になるために二量体化しなければならないので、二量体を形成し、DNAを切断するために、2つのFokI融合物を密接につなぎ留めるために2つのガイドRNAが必要である。このことは、組み合わせた標的部位における塩基の数を本質的に2倍にし、それによって、CRISPRベースのシステムによる標的化のストリンジェンシーを増加させる。
実施形態1。デオキシリボ核酸(DNA)エンドヌクレアーゼ又はDNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸;宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を含むガイドRNA(gRNA)又はgRNAをコードする核酸;及び合成FVIIIタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型であって、合成FVIIIタンパク質がBドメイン置換を含み、Bドメイン置換が0~9個のN結合グリコシル化部位及び3~約40個のアミノ酸長を含むドナー鋳型を含むシステム。
構築物設計
ゲノム中にFVIIIコード核酸を挿入することの課題は、天然のFVIIIコード配列が7053bpであり、とりわけアデノ関連ウイルス中にパッケージングすることが困難であることである(AAVは、Cas9のような配列特異的ヌクレアーゼにより作成された二本鎖切断での組込みのための鋳型として、インビボ送達のための4800~5000bpの範囲でのパッケージング限界を有する)。この問題を解決するために、出願人らは、改変されたBドメインを有するFVIIIコード配列のセットを設計した。FVIIIのBドメインは機能に必要ではないが、FVIIIの分泌を改善する。これらのFVIIIコード配列は、短いBドメイン(置換Bドメイン)を有する合成FVIIIを発現するように設計された。ゲノムに組込まれた後に、FVIIIタンパク質を産生及び分泌する能力のための置換Bドメインを有する合成FVIIIコード配列を評価するために、構築物を設計して、マウスアルブミン遺伝子のイントロン1へのFVIIIコード配列の組込みを標的とした。アルブミン遺伝子座は、肝臓細胞において活性である強力なプロモーターを提供し、その結果、この遺伝子座に挿入された適切なFVIIIコード配列を、アルブミンプロモーターに作動可能に連結された場合に発現させることができる。
これらの実験で使用したgRNAを化学的に合成し、ヌクレアーゼに対する耐性を改善するために化学的に改変されたヌクレオチドを組込んだ。一例におけるgRNAは、以下の構造から構成される:
mRNAは、当技術分野で公知の方法によって産生され得る。本明細書で使用される1つのこのような方法は、T7ポリメラーゼを使用するインビトロ転写であり、ここでmRNAの配列は、T7ポリメラーゼプロモーターを含むプラスミド中にコードされる。簡潔には、T7ポリメラーゼ及びリボヌクレオチドを含む適切な緩衝液中でプラスミドをインキュベートすると、所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするRNA分子が産生された。天然のリボヌクレオチド又は化学的に改変されたリボヌクレオチドのいずれかを反応混合物中で使用して、天然のmRNAの天然の化学構造又は改変された化学構造のいずれかを有するmRNA分子を生成することができる。本明細書に記載の研究では、天然(未改変)リボヌクレオチドを使用した。更に、mRNAの5’末端がキャップされるようにキャッピング成分を転写反応に含めた。
これらの研究において使用されるLNPの主要成分は、脂質C12-200である(Love et al.,2010、前出)。C12-200は、負に荷電したRNA分子と複合体を形成する。一般に、C12-200を1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、DMPE-mPEG2000、及びコレステロールと組み合わせた。例えば、NanoAssemblr(登録商標)デバイス(Precision NanoSystems、Vancouver、BC)中で、制御された条件下でgRNA及びmRNAなどの核酸と混合した場合、核酸がLNP内に封入されたLNPの自己集合が生じた。LNP中のgRNA及びCas9 mRNAを組み立てるために、エタノール及び脂質ストックを、必要に応じてガラスバイアルにピペットで入れた。例示的な比は、50:10:38.5:1.5のモル比のC12-200、DOPE、コレステロール及びmPEG2000-DMGから構成された。gRNA及びmRNAを、RNaseを含まないチューブ中の100mMクエン酸ナトリウム(pH 3.0)及び300mM NaCl中で希釈した。NanoAssemblr(登録商標)カートリッジ(Precision NanoSystems)を、脂質側をエタノールで、RNA側を水で洗浄した。脂質の作業ストックをシリンジに引き込み、シリンジから空気を除去し、シリンジをカートリッジに挿入した。同じ手順を、gRNA及びCas9 mRNAの混合物をシリンジに装填するために使用した。次いで、NanoAssemblr(登録商標)ランを、製造者の推奨条件下で行った。LNP懸濁液を、10K分子量カットオフ(MWCO)透析カートリッジを使用して、4リットルのPBS中で4時間透析し、次いで、100K MWCOスピンカートリッジ(Amicon)を通した遠心分離によって濃縮した(遠心分離中にPBS中で3回洗浄することを含む)。最後に、LNP懸濁液を0.2μmシリンジフィルターを通して滅菌濾過した。エンドトキシンレベルを、市販のエンドトキシンキットを使用して決定し(Limulus amebocyte lysate(LAL)アッセイ)、粒径分布を動的光散乱によって決定した。
マウスモデルを使用して、設計された構築物がFVIIIを産生する能力を試験した。血友病Aのマウスモデルは、当技術分野で公知である(例えば、L.Bi et al.,Nat Genet(1995)10:119-21、doi:10.1038/ng0595-119)。プラスミドpCB076、pCB100、pCB1003、pCB085、及びpCB080を、Qiagen EndoFree(登録商標)プラスミドmaxiプレップキット(cat #12362)を使用して精製し、次いで、0.9%生理食塩水中で最終濃度15μg/mLに希釈した。血友病Aマウス(B6株;129S-F8tm1Kaz/J株)、マウスFVIIIタンパク質を欠くマウス株を、The Jackson Laboratory(Bar Harbor、ME)から入手した。血友病Aマウスのコホートに、5~6秒間、マウス当たり2mLの希釈プラスミドDNAを尾静脈から流体力学的注射(「HDI」)により注射した。HDIプロセスは、肝細胞を含む肝臓細胞の核へのプラスミドDNAの送達をもたらすことが報告されている(例えば、F.Niola et al.,Meth Mol Biol(2019)1961:329-41を参照されたい)。注射の翌日に、マウスに、spCas9 mRNA及びガイドRNA mAlbT1を封入したLNP製剤の眼窩後方(「RO」)注射を行った。マウスに投与されたLNPの用量は、1mg/kg体重のspCas9 mRNA+1mg/kg体重のgRNAであった。
合成FVIIIコード配列がAAVを用いてマウスの肝臓に送達された場合に、Bドメイン置換ペプチドの同じ有益な効果が生じたかどうかを決定するために、プラスミドpCB099(配列番号311)及びpCB102(配列番号341)を構築し、AAV8(Vector Biolabs、Malvern、PA、又はSabTech、Philadelphia、PA)にパッケージングした。プラスミドは、以下のエレメントを用いて構築した(順に):ITR|gRNA標的部位(mAlbT1の場合)|18bpスペーサー|スプライスアクセプター部位(SA)|FVIIIコード配列|ポリアデニル化シグナル(「sPA」)|gRNA標的部位|ITR。pCB099及びpCB102のFVIIIコード配列は、各々、pCB076(Bドメイン置換を有する)及びpCB100(SQリンカーのみを有する)のFVIIIコード配列と同一であった。これらのFVIIIカセットはプロモーターを欠いており、従って、非組込みAAVエピソームゲノムとしてFVIIIを発現することができない。これらのAAVウイルスによって送達されるFVIIIの発現には、適切なプロモーターに隣接する組込みが必要である。
実施例1及び2からのデータは、6つのN結合グリカンモチーフを含むBドメイン置換を挿入することが、FVIIIの発現及び標的化組込みの頻度を改善したことを実証する。しかしながら、この改善のBドメイン置換中のN-グリカン配列の数への依存性は、不明であった。従って、発明者らは、FVIII発現のこの態様を精査するための実験を設計した。特に、FVIII発現の改善に必要なN結合グリカンモチーフの最小数を決定することが所望された。
異なる数のN-グリカンモチーフが発現に及ぼす影響を探るために、1~9個のN-グリカンモチーフを含む一連のドナープラスミドを構築した。これらを表4にまとめる。全てのプラスミドは、5’から3’の順に、以下の配列エレメントから構成されていた:mAlbT1 gRNAの標的配列|18bpスペーサー|スプライスアクセプター|シグナルペプチドがTGジヌクレオチドで置換されたBドメイン欠失FVIIIコード配列|ポリアデニル化シグナル配列。これらのプラスミドの各々において、FVIIIコード配列は、シグナルペプチドがTGジヌクレオチドで置換されているが、Bドメイン置換において1~9個のN結合グリコシル化部位を有する、pCB076(実施例1参照)において使用されたコドン最適化配列に基づいた。全てのプラスミドは、同じpUC19ベースの細菌性プラスミド骨格(細菌の複製起点及びカナマイシン耐性遺伝子を含む)を含んでいた。
血友病Aマウスに、実施例1の方法を用いて、プラスミドpCB077、pCB1006、pCB1007、又はpCB1008を、マウス当たり30μgで、流体力学的注射によって投与した。翌日、同じマウスに、spCas9 mRNA及びmALbT1 gRNAを封入したLNPの1:1混合物を、2mg/kg体重の総RNA用量で眼窩後方に注射した。LNPは、実施例1に記載したように調製した。FVIII活性を、実施例1に記載の方法を用いて、6日後にマウスの血液中で測定した。結果を図3にまとめ、4つのプラスミドドナーによって産生されたFVIIIのレベルが類似していることを実証した。
プラスミドpCB1007、pCB1017、及びpCB1018を精製し、上記のように血友病Aマウスに投与した。翌日、マウスにspCas9 mRNA(1mg/kg)とガイドRNA(gRNA)mAlbT1(1mg/kg)を封入したC12-200ベースLNPの眼窩後方(RO)注射を行った。血液サンプルを、LNP投与の5日後及び7日後に、クエン酸ナトリウム中へのRO採血によって採取し(クエン酸ナトリウム対血液の比1:9)、血漿を遠心分離によって収集した。血漿中のFVIII活性を、実施例1に記載の方法を用いて測定した。
プラスミドpCB1018(3つのN-グリカンモチーフを有するBドメイン置換を有するFVIIIドナーを含む)、pCB1029(2つのN-グリカンモチーフを有するBドメイン置換を有するFVIIIドナーを含む)、及びpCB1030(1つのN-グリカンモチーフを有するBドメイン置換を有するFVIIIドナーを含む)を精製し、上記のように流体力学的注射によって血友病Aマウスに投与した。翌日、マウスにspCas9 mRNA(1mg/kg)とgRNA mAlbT1(1mg/kg)を封入したC12-200に基づくLNPの眼窩後方(RO)注射を行った。LNP投与の5日後及び8日後に、RO採血によって血液サンプルをクエン酸ナトリウム(クエン酸ナトリウム対血液の比1:9)に採取し、遠心分離によって血漿を収集した。血漿中のFVIII活性を上記のように測定し、正常活性のパーセント(1U/mL=100%)として表した。
上記で試験した異なるFVIIIカセットの固有発現効率を比較した。実施例3を通して記載されたデータセットは、同じ系統のマウス(血友病Aマウス)及び同じ実験プロトコルを用いて、合計5件の研究で作成された。FVIII活性は、5日目又は6日目のいずれかに、及び8日目又は9日目に再び測定した。最終FVIII活性測定日(8日目又は9日目)に屠殺したマウスの全肝臓から抽出したDNA中の標的化組込み頻度を測定した。固有発現効率の収集を図8に示す。この比較には、異なるコドン最適化を有するFVIIIカセットが含まれる。正規化FVIII発現に対する異なる数のグリカンの影響の比較は、図8の最初の9つのバーである「co1」と呼ばれるコドン最適化を有するドナーについて行うことができる。これらのドナーは、Bドメイン置換におけるN-グリカンモチーフの数のみが異なるFVIIIカセットを含む。固有発現効率は、1~7個のN-グリカンモチーフを含むグリカン変異体について有意に異ならなかった。2つのN-グリカンモチーフを有するドナー(「co1-2」)がより低い正規化FVIII活性(5、6、又は7個のN-グリカンを含む変異体の約45の値と比較して、30の値)の傾向を示したが、この差は統計的に有意ではなかった。Bドメインの代わりにN-グリカンモチーフを含まないドナー(「co1-0」)は、有意に低い正規化FVIII活性(グリカン及び同じコドン最適化を有する変異体の40~50の値と比較して、7.4の値)を示した。5つのグリカン及びコドン最適化co2を有するFVIIIドナーは、5つのN-グリカンモチーフを有するco1と同等であったが、5つのN-グリカンを有するco3は、5つのN-グリカンを有するco1の効率の約50%で発現した。これらのデータは、単一のN-グリカンモチーフを含むBドメイン置換を含むFVIIIコード配列が2~7個のN-グリカンモチーフを含むBドメイン置換で達成されるものと同等のFVIII発現レベルを付与するのに十分であったことを実証する。単一のN-グリカンモチーフ(図8の「co1-1」/pCB1030)を含むBドメイン置換を含むFVIIIコード配列は、Bドメイン置換を欠く同じFVIIIコード配列(「co1-0」/pCB100)の約5.4倍効率的に発現された(40.1/7.4)。従って、6個未満のN-グリカン、例えば、5個のN-グリカン、4個のN-グリカン、3個のN-グリカン、2個のN-グリカン、又は1個のN-グリカンを有するBドメイン置換を含むFVIIIコード配列は、FVIIIタンパク質に付加される非天然アミノ酸の数の減少、及びDNAドナーのサイズの減少のために、遺伝子編集アプローチにおける使用のための利点を有する。
プラスミド構築物
合成FVIIIの発現に対する異なる形態のコドン最適化の効果を決定するために実験を行った。Bドメインの代わりに14アミノ酸のSQリンカーを含む成熟(シグナルペプチドを欠く)Bドメイン欠失ヒトFVIIIコード配列(1438アミノ酸の全コード配列)を、GeneArtで入手可能な市販のアルゴリズムを適用することによってコドン最適化し(co3)、これは、天然配列中に存在する54から198までCGジヌクレオチドの数を増加させた。Bドメイン欠失FVIII(「co4」)のco3形態の変異体は、公表されたH.sapiensコドン使用頻度表(H.C.Brown et al.,Mol Ther Meth & Clin Dev(2018)9:57-69(doi:10.1016/j.omtm.2018.01.004)に従って、次に最も高頻度のコドン又はより頻繁に使用されるコドンのいずれかである代替コドンを選択することによって、手動で198個のCGジヌクレオチドを除去することによって作製した。Bドメイン欠失FVIII(「FVIII-BDD」)コード配列を、肝臓において高度に発現される遺伝子のコドンバイアスに基づくアルゴリズムを使用してコドン最適化して(H.C.Brown et al.,前出)、176個のCGジヌクレオチドを含むFVIII-BDDコドン2を生成した。ここではFVIII-BDD co5と称される、全てのCGジヌクレオチドを除去するように更に改変したこの構築物も合成した。J.McIntosh et al.,Blood(2013)121(17):3335-44及び米国特許第9,393,323号明細書(その中の配列番号1)のコドン最適化FVIII-BDDコード配列も構築し、本明細書で「co1」と称した。245個のCGジヌクレオチドを含む、国際公開第2011/005968号に公開されたBドメイン欠失FVIIIコード配列の更なるコドン最適化変異体(その中の配列番号5)を合成した(本明細書では「FVIII-BDD co6」)。プラスミドは、以下のように構築した:pUC19プラスミド骨格|ITR|gRNA mALbT1の標的部位|18bpスペーサー|スプライスアクセプター(SA)|TGジヌクレオチド|Bドメイン欠失FVIII配列|ポリA(sPA)|gRNA mALbT1の標的部位|ITR(ここでドナー配列コドン最適化は、co2(pCB1002、配列番号323)、co3(pCB1001、配列番号322)、co4(pCB1000、配列番号321)、又はco5(pCB103、配列番号336)であった)。
これらの製剤を試験するために、4又は5匹の血友病Aマウスのコホートに、尾静脈を介して、AAV8ウイルス(AAV8-pCB103、AAV8-pCB1002、AAV8-pCB1001、及びAAV8-pCB1000)の各々を、2×1012vg/kgの用量で注射した。4週間後、全てのマウスにmAlbT1 gRNAとspCas9 mRNAを封入したLNPの1:1混合物を総RNA用量2mg/kgで静脈内注射した。LNPは、実施例1に記載の方法に従って処方した。血液中のFVIII活性を、実施例1に記載の方法を用いて測定した。結果を図4にまとめる。
Bドメイン置換を有する合成FVIIIを用いて異なるコドン最適化の効果を試験するために、シグナルペプチドを欠くFVIII-BDDコード配列を、co1、co4及びco5と命名される3つのコドン最適化DNA配列を使用し、更にBドメインの代わりにBドメイン置換を含んで構築した。Bドメイン置換は、5つのN-グリカンモチーフ(配列:ATNVSNNSNTSNDS、配列番号343)を含んでいた。これらのコード配列の5’側には、mALbT1 gRNAの標的部位、18bpスペーサー、スプライスアクセプター、及び2つのヌクレオチド(TG)が隣接していた。TGジヌクレオチドは、マウスアルブミンエクソン1へのスプライシング後、正しい読み枠を維持する。短いポリアデニル化シグナル(sPA)は、コード配列の3’末端に含まれていた。これら3つのプラスミド中の合成FVIIIコード配列は、同一のアミノ酸配列を有するFVIIIタンパク質をコードするが、コード配列は、異なるコドン最適化のために異なるDNA配列によりコードされる。pCB1007(co1、配列番号326)、pCB1019(co4、配列番号332)、及びpCB1020(co5、配列番号333)と指定されるこれらのプラスミドを、血友病Aマウスにおいて、mALbT1 gRNAの標的部位でのCRISPR/Cas9切断によって媒介されるアルブミンイントロン1への標的化組込み後に、活性FVIIIタンパク質を発現する能力について試験した。
A1ドメインにおけるシャペロン免疫グロブリン結合タンパク質(BiP)の潜在的結合部位内の点突然変異(F309S)は、培養物中の細胞においてBドメイン欠失FVIIIの分泌を約3倍改善したことが報告されている(M.Swaroop et al.,J Biol Chem(1997)272:24121-24)。FVIIIのF309A突然変異タンパク質は、同様に分泌を改善した。F309SとBドメインの226アミノ酸N末端部分の組み合わせは、Bドメイン欠失FVIIIと比較して、マウスにおけるインビボでのFVIIIレベルを20~30倍改善し、一方、Bドメインの226アミノ酸N末端の付加は、FVIIIレベルを5倍だけ改善したことが報告された(H.Z.Miao et al.,Blood(2004)103(9):3412-19)。
DNA構築物
アルブミン遺伝子座の代替としてトランスフェリン遺伝子座への組込み及びトランスフェリン遺伝子座からの発現を調べるために、ヒトFVIIIドナーカセット(配列番号224)を、以下のように5’から3’の順で配列エレメントを用いて構築した:AAV2の逆方向末端反復(ITR)|gRNA mTF-T2の標的部位|18bpスペーサー|スプライスアクセプター|マウストランスフェリンのシグナルペプチドの最後の4アミノ酸をコードする配列(ggctgtgtctggct、配列番号225)|合成FVIIIコード配列|ポリアデニル化シグナル(spA)|gRNA mTF-T2の標的部位|AAV2の逆方向末端反復(ITR)。gRNA mTF-T2の標的部位の配列は、マウスゲノム中の標的配列の逆相補体であり、これは、順方向での組込みに有利に働く可能性が存在する。ポリアデニル化シグナルは、ポリアデニル化を効果的に誘導することが報告されている短い49bpの配列である(N.Levitt et al.,Genes Dev(1989)3:1019-25)。合成FVIIIコード配列は、Bドメインの代わりにアミノ酸配列
5匹の血友病Aマウスのコホートに、2×1012vg/kg体重の用量でAAV8-pCB1009を尾静脈に静脈内(i.v.)注射した。AAV8ウイルスは、肝細胞を優先的に形質導入する。4週間後、同じマウスに、1つはspCas9 mRNAを封入し、1つはガイドRNA mTF-T2を封入した2つのLNPの1:1(RNAの質量による)混合物を、2mg/kg体重の総RNA用量で静脈内注射した。LNPは、主に肝細胞に取り込まれる。LNPを投与した10日後、血液サンプルを得、上記のようにアッセイした。FVIII活性は、正常ヒトFVIIIレベルの平均954%(±251%)であり(図6)、9.54IU/mL又は血友病ではないヒトの平均レベルの9.5倍に相当した。ナイーブな血友病Aマウスでは、FVIII活性が検出されなかった(正常の0.5%未満)。
別の実施例において、ドナー鋳型は、非ウイルスLNP送達システムを用いてインビボで送達される。DNA分子は、上記のものと同様のLNP粒子に封入され、静脈内注射によって肝臓に送達される。エンドソームから細胞質へのDNAの脱出は比較的効率よく起こるが、大きい荷電DNA分子の核内への移行は効率的ではない。ある場合に、AAV ITR配列をドナー鋳型に組込むことによってAAVゲノムを模倣することにより、核へのDNAの送達が改善される。この場合、ITR配列は、DNAを安定化させるか、又はさもなければ核移行を改善する。ドナー鋳型配列からCGジヌクレオチド(CpG配列)を除去することもまた、核送達を改善する。CGジヌクレオチドを含むDNAは、自然免疫システムによって認識され、排除される。人工DNA配列中に存在するCpG配列の除去は、非ウイルス及びウイルスベクターによって送達されるDNAの持続性を改善する。コドン最適化のプロセスは、多くの場合、最も頻繁なコドンが第3位にC残基を有するので、一般にCGジヌクレオチドの含有量を増加させ、これは、次のコドンがGで始まる場合にCGの生成の機会を増加させる。ドナー鋳型のLNP送達と、続いて1時間~5日後のgRNA及びCas9 mRNAを含むLNPの送達の組み合わせを、血友病Aマウスにおいて評価する。
アルブミン又はトランスフェリン遺伝子座の代替として、フィブリノーゲンα遺伝子座への組込み及びフィブリノーゲンα遺伝子座からの発現を調べるために、以下のエレメントを有するカセットを有するAAV8ウイルス(AAV8-pCB1010、配列番号361)を構築した:gRNA mFGA-T6の標的部位、18bpスペーサー、FIXスプライスアクセプター、成熟ヒトFVIIIコード配列(内因性FGAエクソン1へのスプライシング後にFGAシグナルペプチドを完了するように改変されたN末端を有する)(ここでBドメインは、6つのN-グリカンモチーフ、ポリアデニル化配列、及びgRNA mFGA-T6の標的部位で置換されている)。
ヒト肝細胞における本発明のシステムの操作を実証するために、ヒトと非ヒト霊長類間の完全な同一性を有すること、並びに初代ヒト肝細胞における切断効率の評価のためのHuH7及びHepG2細胞における切断効率についてのスクリーニングに基づいて、4つのgRNA(T4-配列番号357、T5-配列番号358、T11-配列番号359、及びT13-配列番号360)を調製した。初代ヒト肝細胞(BioIVTから入手)を解凍し、凍結保存肝細胞回収媒体(CHRM)(Gibco)に移し、低速でペレット化し、次いで、コラーゲンIV(Corning)で予めコーティングした24ウェルプレート中、0.7×106細胞/mLの密度で、InVitroGRO(商標)CP媒体(BioIVT)+Torpedo(商標)Antibiotic Mix(BioIVT)中にプレーティングした。プレートを5% CO2中37℃でインキュベートした。細胞が接着した後(プレーティングの3~4時間後)、プレートに接着しなかった死細胞を新鮮な温かい完全培地で洗い流し、更なる培地を添加し、細胞を5% CO2中37℃でインキュベートした。細胞をトランスフェクトするために、Cas9 mRNA(Trilink)及びガイドRNAを氷上で解凍し、次いで、ウェル当たり0.6μgのmRNA及び0.2μgのガイドRNAで30μLのOpti-Mem(商標)培地(Gibco)に添加した。Opti-Mem(商標)中に2:1の体積対全核酸重量で30μL希釈したMessengerMax(商標)(Thermo Fisher)を、Cas9 mRNA/gRNA Opti-Mem(商標)溶液と共に室温で20分間インキュベートした。この混合物を、24ウェルプレート中の培養肝細胞の1ウェル当たり500μLの肝細胞プレーティング培地に滴加し、細胞を5% CO2中37℃でインキュベートした。細胞を洗浄し、翌朝再給餌した。200μLの温0.25%トリプシン-EDTA(Gibco)を各ウェルに添加し、37℃で5~10分間インキュベートすることによって、トランスフェクションの48時間後にゲノムDNA抽出のために細胞を収集した。細胞を除去した後、200μLのFBS(Gibco)を添加してトリプシンを不活性化した。1mLのPBS(Gibco)を添加した後、細胞を1200rpmで3分間ペレット化し、次いで50μLのPBSに再懸濁した。ゲノムDNAを、MagMAX(商標)DNA Multi-Sample Ultra 2.0 Kit(Applied Biosytems)を使用して、キットの説明書に従って抽出した。ゲノムDNAの質及び濃度を、分光光度計を用いて分析した。TIDE分析のために、ゲノムDNAを、35サイクルのPCR及び55℃のアニーリング温度を使用して、予想されるオンターゲット切断部位に隣接するプライマー(AlbF:CCCTCCGTTTGTCCTAGCTTTTC、配列番号353、及びAlbR:CCAGATACAGAATATCTTCCTCAACGCAGA、配列番号354)及びPlatinum(登録商標)PCR SuperMix High Fidelity(Invitrogen(商標))を使用してPCR増幅した。PCR生成物をアガロースゲル電気泳動によって分析して、正しいサイズの生成物(1053bp)が産生されたことを確認し、次いで精製し、プライマー(順方向:CCTTTGGCACAATGAAGTGG、配列番号355;逆方向:GAATCTGAACCCTGATGACAAG、配列番号356)を使用して配列決定した。配列データを、Tsunamiと命名されたTIDESアルゴリズム(E.K.Brinkman et al.,Nuc Acids Res(2014)42(22):e168)の改変バージョンを使用して分析した。これは、gRNA/Cas9複合体の予測される切断部位に存在するインデルの頻度を決定する。
この研究は、Bドメイン置換が0、1、3、5、又は6個のグリカンのいずれかを含むFVIIIをコードするAAV8ウイルスからのFVIII発現を評価した。FVIIIコード配列をコドン最適化し、次いでCpGを手動で除去した。この研究で使用した構築物を図9に示す。
本開示の他の箇所に開示される配列に加えて、以下の配列は、説明の目的のために提供される本開示の例示的な実施形態においてそれらが言及又は使用されているために提供される。
Claims (136)
- 宿主細胞DNA配列を改変するためのシステムであって:
デオキシリボ核酸(DNA)エンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸と;
宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を含むガイドRNA(gRNA)又は前記gRNAをコードする核酸と;
合成FVIIIタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型であって、前記合成FVIIIタンパク質がBドメイン置換を含み、前記Bドメイン置換が0~9個のN結合グリコシル化部位及び3~約40個のアミノ酸長を含むドナー鋳型と
を含むシステム。 - 前記Bドメイン置換が、0~6個のN結合グリコシル化部位を含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記Bドメイン置換が、0~3個のN結合グリコシル化部位を含む、請求項2に記載のシステム。
- 前記Bドメイン置換が、配列番号362~369、371及び373のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記Bドメイン置換が、配列番号362~366、371及び373のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号362~366、371及び373のいずれか1つと少なくとも80%の同一性を有するその変異体を含む、請求項4に記載のシステム。
- 前記Bドメイン置換が、配列番号362~364、371及び373のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項5に記載のシステム。
- 前記宿主細胞遺伝子座が、肝臓で発現される遺伝子の遺伝子座である、請求項1~6のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記宿主細胞遺伝子座が、急性期タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座である、請求項1~7のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記急性期タンパク質が、アルブミン、トランスフェリン、又はフィブリノーゲンである、請求項8に記載のシステム。
- 前記宿主細胞遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、請求項1~7のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、及びCpf1エンドヌクレアーゼ、並びにその機能的誘導体からなる群から選択される、請求項1~10のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼがCas9である、請求項11に記載のシステム。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸が、前記宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項1~11のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がデオキシリボ核酸(DNA)である、請求項1~13のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がリボ核酸(RNA)である、請求項1~13のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記RNAがmRNAである、請求項15に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型核酸配列が、前記宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項1~16のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型核酸配列が、FVIIIタンパク質をコードする野生型核酸配列と比較して、CpGジヌクレオチドの減少した含有量を含む、請求項1~17のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型核酸配列がCpGジヌクレオチドを含まない、請求項18に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターにコードされる、請求項1~19のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、合成FVIIIタンパク質をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットの片側又は両側にgRNA標的部位が隣接している、請求項1~20のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記ドナーカセットの両側にgRNA標的部位が隣接している、請求項21に記載のシステム。
- 前記ドナーカセットの5’側にgRNA標的部位が隣接している、請求項21に記載のシステム。
- 前記gRNA標的部位が、前記システム中のgRNAの標的部位である、請求項21~23のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型の前記gRNA標的部位が、前記システム中のgRNAに対するゲノムgRNA標的部位の逆相補体である、請求項24に記載のシステム。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、リポソーム又は脂質ナノ粒子中に含まれる、請求項1~25のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記リポソーム又は脂質ナノ粒子が前記gRNAも含む、請求項26に記載のシステム。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼが前記gRNAと複合体化され、それによってリボ核タンパク質(RNP)複合体を提供する、請求項1~27のいずれか1項に記載のシステム。
- 宿主細胞内のゲノムを編集する方法であって:
(a)宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を含むgRNA又は前記gRNAをコードする核酸と;
(b)DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸と;
(c)合成FVIIIタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型であって、前記合成FVIIIタンパク質がBドメイン置換を含み、前記Bドメイン置換が0~9個のN結合グリコシル化部位及び3~約40個のアミノ酸長を含むドナー鋳型と、
を前記細胞に提供することを含む方法。 - 前記Bドメイン置換が、0~6個のN結合グリコシル化部位を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記Bドメイン置換が、0~3個のN結合グリコシル化部位を含む、請求項30に記載の方法。
- 前記Bドメイン置換が、配列番号362~369、371、及び373のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記Bドメイン置換が、配列番号362~366、371、及び373のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号362~366、371、及び373のいずれか1つと少なくとも80%の同一性を有するその変異体を含む、請求項32に記載の方法。
- 前記Bドメイン置換が、配列番号362~364、371、及び373のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の方法。
- 前記宿主細胞内因性遺伝子座が、肝臓で発現される遺伝子の遺伝子座である、請求項29~34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞内因性遺伝子座が、急性期タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座である、請求項29~35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記急性期タンパク質が、アルブミン、トランスフェリン、又はフィブリノーゲンである、請求項36に記載の方法。
- 前記宿主細胞内因性遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、請求項29~34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、及びCpf1エンドヌクレアーゼ;又はその機能的誘導体からなる群から選択される、請求項29~38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼがCas9である、請求項39に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸が、前記宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項29~40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がDNAである、請求項29~41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がリボ核酸(RNA)である、請求項29~41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記RNAがmRNAである、請求項43に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型がAAVベクターにコードされる、請求項29に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型核酸配列が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項29~45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型核酸配列が、FVIIIをコードする野生型核酸配列と比較して、CpGジヌクレオチドの減少した含有量を含む、請求項29~46のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型核酸配列がCpGジヌクレオチドを含まない、請求項47に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型が、合成FVIIIタンパク質をコードする前記核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットの片側又は両側にgRNA標的部位が隣接している、請求項29~48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナーカセットの両側にgRNA標的部位が隣接している、請求項49に記載の方法。
- 前記ドナーカセットの5’側にgRNA標的部位が隣接している、請求項49に記載の方法。
- 前記gRNA標的部位が、(a)の前記gRNAの標的部位である、請求項49~51のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型の前記gRNA標的部位が、(a)の前記gRNAに対する前記細胞ゲノム中のgRNA標的部位の逆相補体である、請求項52に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、リポソーム又は脂質ナノ粒子中に処方される、請求項29~53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リポソーム又は脂質ナノ粒子が前記gRNAも含む、請求項54に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼ及び前記gRNAが、前記gRNAと予め複合体化された前記DNAエンドヌクレアーゼを含むRNP複合体として前記宿主細胞に提供される、請求項29~55のいずれか1項に記載の方法。
- (a)の前記gRNA又は前記gRNAをコードする核酸、及び(b)の前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、(c)の前記ドナー鋳型が前記細胞に提供されて4日を超えた後に前記細胞に提供される、請求項29~56のいずれか1項に記載の方法。
- (a)の前記gRNA又は前記gRNAをコードする核酸、及び(b)の前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、(c)の前記ドナー鋳型が前記細胞に提供された少なくとも14日後に前記細胞に提供される、請求項29~57のいずれか1項に記載の方法。
- (a)の前記gRNA又は前記gRNAをコードする核酸、及び(b)の前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸の1つ以上の更なる用量が、(a)の前記gRNA又は前記gRNAをコードする核酸、及び(b)の前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸の第1の用量に続いて前記細胞に提供される、請求項57又は58に記載の方法。
- (a)の前記gRNA又は前記gRNAをコードする核酸、及び(b)の前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸の1つ以上の更なる用量が、合成FVIIIタンパク質をコードする前記核酸配列の標的化組込みの標的レベルが達成されるか、又は合成FVIIIタンパク質をコードする前記核酸配列の標的発現レベルが達成されるまで、(a)の前記gRNA又は前記gRNAをコードする核酸、及び(b)の前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸の前記第1の用量に続いて前記細胞に提供される、請求項59に記載の方法。
- 前記細胞が肝臓細胞である、請求項29~60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がヒト肝細胞又はヒト類洞上皮細胞である、請求項61に記載の方法。
- 細胞であって、前記細胞のゲノムが合成FVIIIタンパク質をコードするDNAを含み、前記合成FVIIIタンパク質がBドメイン置換を含み、前記Bドメイン置換が0~9個のN結合グリコシル化部位及び3~約40個のアミノ酸長を含む、細胞。
- 前記合成FVIIIタンパク質が、内因性アルブミンプロモーター、内因性トランスフェリンプロモーター、又は内因性フィブリノーゲンαプロモーターに作動可能に連結される、請求項63に記載の細胞。
- 前記合成FVIIIタンパク質をコードする核酸配列が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項63に記載の細胞。
- 前記細胞がヒト肝臓細胞である、請求項63に記載の細胞。
- 前記細胞が、ヒト肝細胞又はヒト類洞上皮細胞である、請求項66に記載の細胞。
- 前記細胞が、請求項29~62のいずれか1項に記載の方法によって調製され、又は請求項29~62のいずれか1項に記載の方法によって調製された細胞の子孫である、請求項67に記載の細胞。
- 対象における血友病Aを処置する方法であって、以下:
(a)宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を含むgRNA又は前記gRNAをコードする核酸;
(b)DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸;及び
(c)合成FVIIIタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型であって、前記合成FVIIIタンパク質がBドメイン置換を含み、前記Bドメイン置換が0~9個のN結合グリコシル化部位及び3~約40個のアミノ酸長を含む、ドナー鋳型
を前記対象の細胞に提供することを含む、方法。 - 前記Bドメイン置換が、0~6個のN結合グリコシル化部位を含む、請求項69に記載の方法。
- 前記Bドメイン置換が、0~3個のN結合グリコシル化部位を含む、請求項70に記載の方法。
- 前記Bドメイン置換が、配列番号362~369、371、及び373のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項69に記載の方法。
- 前記Bドメイン置換が、配列番号362~366、371、及び373のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号362~366、371、及び373のいずれか1つと少なくとも80%の同一性を有するその変異体を含む、請求項72に記載の方法。
- 前記Bドメイン置換が、配列番号362~364、371、及び373のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項73に記載の方法。
- 前記宿主細胞遺伝子座が、肝臓で発現される遺伝子の遺伝子座である、請求項69~74のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞遺伝子座が、急性期タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座である、請求項69~75のいずれか1項に記載の方法。
- 前記急性期タンパク質が、アルブミン、トランスフェリン、又はフィブリノーゲンである、請求項76に記載の方法。
- 前記宿主細胞遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、請求項69~74のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、及びCpf1エンドヌクレアーゼ;又はその機能的誘導体からなる群から選択される、請求項69~78のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼがCas9である、請求項79に記載の方法。
- 前記Cas9がspCas9又はSluCas9である、請求項80に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項69~81のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がDNAである、請求項69~82のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がRNAである、請求項69~82のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする前記RNAがmRNAである、請求項84に記載の方法。
- (a)の前記gRNA又は前記gRNAをコードする核酸、(b)の前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸、及び(c)の前記ドナー鋳型のうちの1つ以上が、リポソーム又はLNP中に処方される、請求項69~85のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型がAAVベクターにコードされる、請求項69~86のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型核酸配列が、前記宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項69~87のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型核酸配列が、FVIIIをコードする野生型核酸配列と比較して、CpGジヌクレオチドの減少した含有量を含む、請求項69~88のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型核酸配列がCpGジヌクレオチドを含まない、請求項89に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型が、合成FVIIIタンパク質をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットの片側又は両側にgRNA標的部位が隣接している、請求項69~90のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナーカセットの両側にgRNA標的部位が隣接している、請求項91に記載の方法。
- 前記ドナーカセットの5’側にgRNA標的部位が隣接している、請求項91に記載の方法。
- 前記gRNA標的部位が、前記gRNAの標的部位である、請求項91~93のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型の前記gRNA標的部位が、(a)の前記gRNAに対する前記細胞ゲノム中の前記gRNA標的部位の逆相補体である、請求項94に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型を前記細胞に提供することが、前記ドナー鋳型を前記対象に静脈内投与することを含む、請求項69~95のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、リポソーム又はLNP中に処方される、請求項69~96のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リポソーム又はLNPが前記gRNAも含む、請求項97に記載の方法。
- 前記gRNA又は前記gRNAをコードする核酸、及び前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記細胞に提供することが、前記リポソーム又は脂質ナノ粒子を前記対象に静脈内投与することを含む、請求項98に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼ及び前記gRNAがリボ核タンパク質(RNP)複合体として前記宿主細胞に提供され、このRNP複合体が、前記gRNAと複合体化された前記DNAエンドヌクレアーゼを含む、請求項69~99のいずれか1項に記載の方法。
- (a)の前記gRNA又は前記gRNAをコードする核酸、及び(b)の前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、(c)の前記ドナー鋳型が前記細胞に提供されて4日を超えた後に前記細胞に提供される、請求項69~100のいずれか1項に記載の方法。
- (a)の前記gRNA又は前記gRNAをコードする核酸、及び(b)の前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、(c)の前記ドナー鋳型が前記細胞に提供された少なくとも14日後に前記細胞に提供される、請求項69~101のいずれか1項に記載の方法。
- (a)の前記gRNA又は前記gRNAをコードする核酸、及び(b)の前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸の1つ以上の更なる用量が、(a)の前記gRNA又は前記gRNAをコードする核酸、及び(b)の前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸の第1の用量に続いて前記細胞に提供される、請求項101又は102に記載の方法。
- (a)の前記gRNA又は前記gRNAをコードする核酸、及び(b)の前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸の1つ以上の更なる用量が、合成FVIIIタンパク質をコードする前記核酸配列の標的化組込みの標的レベル及び/又は合成FVIIIタンパク質をコードする前記核酸配列の標的発現レベルが達成されるまで、(a)の前記gRNA又は前記gRNAをコードする核酸、及び(b)の前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸の前記第1の用量に続いて前記細胞に提供される、請求項103に記載の方法。
- (a)の前記gRNA及び(b)の前記DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記細胞に提供することが、前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸及び前記gRNAを含む脂質ナノ粒子を前記対象に投与することを含む、請求項101~104のいずれか1項に記載の方法。
- (c)の前記ドナー鋳型を前記細胞に提供することが、AAVベクターにコードされる前記ドナー鋳型を前記対象に投与することを含む、請求項101~105のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が肝細胞である、請求項69~106のいずれか1項に記載の方法。
- 合成FVIIIタンパク質をコードする前記核酸配列が、前記対象の前記肝臓で発現される、請求項69~107のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項63~68のいずれか1項に記載の細胞を対象に投与することを含む、前記対象における血友病Aを処置する方法。
- 前記細胞が、前記対象に対して自己である、請求項109に記載の方法。
- 前記対象から生物学的サンプルを得ることを更に含み、前記生物学的サンプルが肝臓細胞を含み、前記細胞が前記肝臓細胞から調製される、請求項110に記載の方法。
- 使用説明書を更に含む、請求項1~28のいずれか1項に記載のシステムの1つ以上の要素を含むキット。
- 合成FVIIIタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記合成FVIIIタンパク質がBドメイン置換を含み、前記Bドメイン置換が0~9個のN結合グリコシル化部位及び3~約40個のアミノ酸長を含む、核酸。
- 前記Bドメイン置換が、0~6個のN結合グリコシル化部位を含む、請求項113に記載の核酸。
- 前記Bドメイン置換が、0~3個のN結合グリコシル化部位を含む、請求項113に記載の核酸。
- 前記Bドメイン置換が、配列番号362~369、371、及び373のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項113に記載の核酸。
- 前記Bドメイン置換が、配列番号362~364、371、及び373のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号362~364、371、及び373のいずれか1つと少なくとも80%の同一性を有するその変異体を含む、請求項116に記載の核酸。
- 前記Bドメイン置換が、配列番号362~363、371、及び373のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項116に記載の核酸。
- 合成FVIIIタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項113~118のいずれか1項に記載の核酸。
- 合成FVIIIタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、FVIIIをコードする野生型核酸配列と比較して、CpGジヌクレオチドの減少した含有量を含む、請求項113~119のいずれか1項に記載の核酸。
- 合成FVIIIタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列がCpGジヌクレオチドを含まない、請求項120に記載の核酸。
- 前記核酸がウイルスベクターである、請求項113~121のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記ウイルスベクターがAAVベクターである、請求項122に記載の核酸。
- 対象におけるFVIIIの量を増加させる方法であって:
FVIIIの第1の血清レベルを有する前記対象の細胞に、以下:
(a)宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を含むgRNA又は前記gRNAをコードする核酸;
(b)DNAエンドヌクレアーゼ又は前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸;及び
(c)合成FVIIIタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型であって、前記合成FVIIIタンパク質がBドメイン置換を含み、前記Bドメイン置換が0~9個のN結合グリコシル化部位及び3~約40個のアミノ酸長を含む、ドナー鋳型
を提供することを含む、方法。 - FVIIIの第1の血清レベルが約0.40IU/mL未満である、請求項124に記載の方法。
- FVIIIの前記第1の血清レベルが約0.05IU/mL未満である、請求項125に記載の方法。
- FVIIIの前記第1の血清レベルが約0.01IU/mL未満である、請求項125に記載の方法。
- 血友病Aの処置のための、請求項1~28のいずれか1項に記載のシステムの使用。
- 血友病Aの処置のための医薬の製造のための、請求項1~28のいずれか1項に記載のシステムの使用。
- 血友病Aの処置のための、請求項63~68のいずれか1項に記載の細胞の使用。
- 血友病Aの処置のための医薬の製造のための、請求項63~68のいずれか1項に記載の細胞の使用。
- 血友病Aの処置のための、請求項112に記載のキットの使用。
- 血友病Aの処置のための医薬の製造のための、請求項112に記載のキットの使用。
- 血友病Aの処置のための、請求項113~123のいずれか1項に記載の核酸の使用。
- 血友病Aの処置のための医薬の製造のための、請求項113~123のいずれか1項に記載の核酸の使用。
- Bドメイン置換を含み、前記Bドメイン置換は、0~9個のN結合グリコシル化部位及び3~約40個のアミノ酸長を含む、合成FVIIIタンパク質。
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