JP2023520262A - 改善された第ｖｉｉｉ因子発現による血友病ａのための遺伝子編集 - Google Patents

改善された第ｖｉｉｉ因子発現による血友病ａのための遺伝子編集 Download PDF

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Abstract

本明細書では、いくつかの実施形態において、エクスビボ又はインビボで対象の血友病Ａを処置するための材料及び方法が提供される。また本明細書では、いくつかの実施形態において、Ｂドメイン置換を有する合成ＦＶＩＩＩをコードするコード配列をゲノムにノックインするための材料及び方法が提供される。

Description

本明細書に提供される開示は、エクスビボ及びインビボの両方で血友病Ａを処置するための材料及び方法に関する。更に、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）などの血液凝固タンパク質の発現、機能、又は活性を調節するための遺伝子編集のための材料及び方法が提供される。
血友病Ａ（ＨｅｍＡ）は、ＦＶＩＩＩ遺伝子（Ｆ８）の遺伝子欠陥を原因とし、この欠陥は血液中のＦＶＩＩＩタンパク濃度の低い又は検出不可能なレベルをもたらす。その結果、組織損傷部位で効果的な血餅の形成が起こらず、処置しなければ致死的となり得る制御不能の出血につながる。欠陥又は非機能性ＦＶＩＩＩタンパク質の補充は、ＨｅｍＡ対象にとって有効な処置であり、現在の標準治療である。しかしながら、タンパク補充療法では、ＦＶＩＩＩタンパク質を高頻度で静脈内投与する必要が存在し、これは、成人では不都合であり、小児では問題が存在し、費用が法外（２００，０００ドル／年超）であり、そして処置レジメンを綿密に追跡しなければ破綻出血性事象が発生し得る。
血友病Ａの永久的な治癒が非常に望ましい。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を用いたウイルスベースの遺伝子治療は、前臨床動物モデル及びヒト対象においてある程度の有望性が示されているが、多くの欠点が存在する。例えば、報告されているＡＡＶベースの遺伝子治療では、ＡＡＶウイルスカプシド（一般には、とりわけ、血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ８若しくはＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ１０を用いる）内に封入された肝臓特異的プロモーターによって駆動されるＦＶＩＩＩコード配列を用いる。一般に、遺伝子治療に使用されるＡＡＶウイルスは、パッケージされたコード配列カセットを形質導入された細胞の核内に送達し、ここでカセットは、ほとんどエピソームに留まり、治療タンパク質を生じるのは、治療コード配列のエピソームコピーである。ＡＡＶは、封入されたＤＮＡを宿主細胞のゲノムに組込む機構を有していない。治療コード配列は、エピソームとして維持されているので、宿主細胞が分裂して娘細胞から失われ得るときには協調的に複製されない。ＡＡＶエピソームを含む肝臓細胞が分裂を誘導されると、ＡＡＶゲノムは複製されず、その代わりに希釈されることが実証されている。従って、ＡＡＶベースの遺伝子治療は、肝臓がまだ成人サイズに達していない小児では効果が期待できない。現在の治療法は不十分であるため、成人及び小児に対するＨｅｍＡの有効且つ永続的な、又は長期にわたる新たな処置に対する決定的な必要性が存在する。
ＦＶＩＩＩは、最初に、ドメイン構造Ａ１－Ａ２－Ｂ－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２を有するタンパク質として発現される。このタンパク質は、かさばった高度にグリコシル化されたＢドメインのタンパク質分解性切断によって活性化され、重鎖（Ａ１－Ａ２）及び軽鎖（Ａ３－Ｃ１－Ｃ２）ヘテロ二量体を残す。ＦＶＩＩＩタンパク質のＢドメインは、生物学的活性に必要とされない。ＦＶＩＩＩコード配列からの大きいＢドメインの除去は、インビボ送達に使用されるＡＡＶベクターへの信頼できるパッケージングを可能にするために必須である。しかしながら、最大１８個のＮ結合グリコシル化部位を含むＢドメインを除去すると、ＦＶＩＩＩタンパク質の分泌が障害される。従って、効率的且つ効果的に発現され得る改善された形態のＦＶＩＩＩに対する決定的な必要性が存在する。
出願人らは、機能性ＦＶＩＩＩタンパク質の発現をもたらす、欠陥Ｆ８遺伝子を補足するために使用され得る遺伝子編集の組成物及び方法を発見した。従って、本明細書に提供される発明は、宿主細胞ＤＮＡ配列を改変するためのシステム及び組成物、宿主細胞ゲノムを改変するための方法、発現の改善をもたらす合成第ＶＩＩＩ因子コード配列を挿入するための方法及びシステム、対象に投与することができる発現の改善をもたらす合成第ＶＩＩＩ因子コード配列を有する細胞、血友病Ａを処置するための方法、並びに前述のいずれかを具体化するキットを含む。
一態様では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はｇＲＮＡをコードする核酸と、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を有するドナー鋳型であって、合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を含み、Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を有するドナー鋳型とを有する、宿主細胞ＤＮＡ配列を改変するためのシステムが本明細書に提供される。
別の態様では、宿主細胞におけるゲノムを編集する方法であって、宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸と；ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と；合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を有するドナー鋳型であって、合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を有し、Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を有するドナー鋳型とを細胞に提供することを含む方法が提供される。
別の態様では、細胞のゲノムが合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＤＮＡを含み、合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を有し、Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を有する細胞が提供される。
別の態様では、上記のような合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＤＮＡを有する細胞を対象に投与することによって、対象における血友病Ａを処置する方法が提供される。
別の態様では、以下を対象中の細胞に提供することによって、対象における血友病Ａを処置する方法が提供される：宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸と；ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と；合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を有するドナー鋳型であって、合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を有し、Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を有するドナー鋳型。
別の態様では、上記のシステムの１つ以上の要素を含み、使用説明書を更に含むキットが本明細書に提供される。
別の態様では、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸が提供され、ここで合成ＦＶＩＩＩタンパク質はＢドメイン置換を有し、Ｂドメイン置換は、０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を有する。
別の態様では、ＦＶＩＩＩの第１の血清レベルを有する対象の細胞に以下を提供することによって、対象におけるＦＶＩＩＩの量を増加させる方法が本明細書に提供される：宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸と；ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と；合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を有するドナー鋳型であって、合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を有し、Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を有するドナー鋳型。
本開示の特定の特徴及び利点の理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるであろう：
ＦＶＩＩＩドナー鋳型をコードする５つのプラスミドを流体力学的に注射し、続いてＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡのＬＮＰ送達を行った後のマウスの血液中のＦＶＩＩＩレベルを示す。 ＦＶＩＩＩドナー鋳型ｐＣＢ０９９及びｐＣＢ１０２を封入したＡＡＶ８ウイルスを注射し、４週間後にｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ ｍＡＬｂＴ１を封入したＬＮＰを投与したマウスの血液中のＦＶＩＩＩレベルを示す。ＦＶＩＩＩレベルは、ＬＮＰを注射した１０日後に測定した。 ＨＤＩにより４つの異なるＦＶＩＩＩドナープラスミドを投与し、続いてｓｐＣａｓ９及びｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡを封入したＬＮＰを投与した血友病Ａマウスの血液中のＦＶＩＩＩ活性を示す。 ＬＮＰを投与した１１日及び２８日後の血友病Ａマウスの血液中のＦＶＩＩＩ活性を示す。マウスは、ＬＮＰ投与の４週間前に２×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８ウイルスを受けた。 プラスミドｐＣＢ１００７（ｎ＝７マウス）、ｐＣＢ１０１９（ｎ＝７）及びｐＣＢ１０２０（ｎ＝６）を流体力学的に注射し、ｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡを封入したＬＮＰを眼窩後方に注射したマウスの血液中のＦＶＩＩＩ活性を示す。ＦＶＩＩＩは、ＬＮＰ投与後６日目と９日目に測定した。 プラスミドｐＣＢ１００７（ｎ＝７マウス）、ｐＣＢ１０２５（ｎ＝７）及びｐＣＢ１０２６（ｎ＝６）を流体力学的に注射し、ｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡを封入したＬＮＰを眼窩後方に注射したマウスの血液中のＦＶＩＩＩ活性を示す。ＦＶＩＩＩは、ＬＮＰ投与後６日目と９日目に測定した。 ４人のドナー由来の初代ヒト肝細胞におけるガイドＲＮＡ Ｔ４、Ｔ５、Ｔ１１、及びＴ１３（ヒトアルブミンイントロン１を標的とする）の切断効率に関する結果を示し、１９塩基対２０塩基の標的配列を比較している。 ０～７個のＮ結合グリカンモチーフ及び異なるコドン最適化を有するＦＶＩＩＩドナーカセットについての固有発現効率（ＦＶＩＩＩ活性を標的化組込み頻度で除したもの）を示す。 Ｂドメイン置換が０、１、３、５、又は６個のグリカンのいずれかを含むＦＶＩＩＩ構築物を示す。 ＬＮＰを投与した１１日後の血友病Ａマウスの血液中のＦＶＩＩＩ活性を示す。 ＬＮＰを投与した２８日後の血友病Ａマウスの血液中のＦＶＩＩＩ活性を示す。 ０、１、３、５、又は６個のＮ結合グリカンモチーフを有するＦＶＩＩＩドナーカセットについての固有発現効率（ＦＶＩＩＩ活性を標的化組込み頻度で除したもの）を示す。
ＲＮＡガイド下エンドヌクレアーゼ編集は、例えば、遺伝子治療のレンチウイルス方法を上回る利点を提供する。しかしながら、編集プロトコルにおける大きい配列の挿入は、例えば、大きい配列は、送達のためにパッケージングすることが困難であり得るか、又は短い配列と比較して、製造することが困難であり得るため、問題となり得る。いくつかのタンパク質は、それらが発現している細胞から正しく分泌されるためにＮ結合グリコシル化部位の存在を必要とする。Ｎ－グリコシル化部位のコンセンサスアミノ配列はＮ－Ｘ－Ｔ／Ｓであり、ここでＸは、プロリンを除く任意の残基である。グリカンがＮ（アスパラギン）残基に付加される（Ｋ．Ｆ．Ｍｅｄｚｉｈｒａｄｓｚｋｙ，Ｍｅｔｈ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００８）４４６：２９３－３１６）。出願人らは、このようなタンパク質におけるＮ結合グリコシル化部位の数を大幅に減少させ得るか、又は排除し得、それによって、転写、翻訳又は分泌に悪影響を及ぼすことなく、タンパク質コード配列のサイズを減少させ得ることを発見した。例えば、出願人らは、ＦＶＩＩＩコード配列のＢドメインを操作して、グリコシル化部位の数を減少させるか又は排除することによって、得られる操作された（合成）ＦＶＩＩＩの転写、翻訳又は分泌に有意に影響を及ぼすことなく、遺伝子編集において使用されるＦＶＩＩＩ配列のサイズを減少させることができ、一方で、ＦＶＩＩＩ機能を有する操作されたＦＶＩＩＩタンパク質を産生することを発見した。更に、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩに付加されるＮ－グリカン部位の数を最小限にすることによって、抗体又はＴ細胞のための新規エピトープを作製するリスクを最小限にし、それにより、新規ＦＶＩＩＩタンパク質が対象において免疫応答を誘導し得るリスクを減少させる。本開示は、とりわけ、ゲノム編集によって細胞内のＦＶＩＩＩなどの血液凝固タンパク質の発現、機能又は活性を調節するための遺伝子編集のための組成物及び方法を提供する。本開示はまた、とりわけ、エクスビボ及びインビボの両方で、血友病Ａを有する対象を処置するための組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、改善された組込み及び改善された発現を提供するゲノム編集方法及びシステム、並びに血友病Ａを改善することができる合成ＦＶＩＩＩコード配列及びタンパク質を提供する。
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、特許請求される主題が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。詳細な説明は、例示的且つ説明的なものにすぎず、特許請求される主題を限定するものではないことを理解するべきである。本出願において、単数形の使用は、特に断らない限り、複数形を含む。明細書において使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。本出願において、「又は」の使用は、別段の記載がない限り、「及び／又は」を意味する。更に、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」のような他の形態の使用は、限定的ではない。
開示の特徴は単一の実施形態に関連して説明することができるが、特徴は、別々に又は任意の適切な組み合わせで提供することもできる。逆に、明確にするために、本明細書では開示を別々の実施形態に関連して説明することができるが、開示は、単一の実施形態で実施することもできる。本明細書に引用される任意の公開された特許出願並びに任意の他の公開された参考文献、文書、原稿及び科学文献は、任意の目的のために参照により本明細書に組込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。更に、材料、方法及び例は、例示にすぎず、限定されるものではない。
本明細書で使用される場合、範囲及び量は、「約」特定の値又は範囲として表すことができる。「約」は正確な量も含む。従って、「約５μＬ」は「約５μＬ」を意味し、また「５μＬ」も意味する。一般に、用語「約」は、±１％、±２％、±３％、±５％、又は±１０％などの実験誤差内にあると予想される量を含む。
本明細書において、ある範囲の数値が提示される場合、その範囲の下限と上限の間の各々の介在値、その範囲の上限と下限である値、及びその範囲内の全ての記載値が開示に包含されることが意図される。範囲の下限と上限内の全ての可能な下位範囲もまた、本開示によって意図される。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では、ペプチド結合によって互いに連結された一連の直鎖アミノ酸残基を示すために互換的に使用され、この一連のアミノ酸残基には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、及びそれらの断片が含まれ得る。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸及び／又は合成（例えば、改変又は天然に存在しない）アミノ酸から構成され得る。用語「アミノ酸」又は「ペプチド残基」は、本明細書で使用される場合、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸の両方を指すことができる。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、融合タンパク質を含み、これには、非限定的に、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有するか又は有さない異種及び同種リーダー配列との融合物、免疫学的にタグ付けされたタンパク質、検出可能な融合パートナーを有する融合タンパク質、例えば、融合パートナーとして蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを含む融合タンパク質が含まれる。更に、アミノ酸配列の始め又は終わりのダッシュは、１つ以上のアミノ酸残基の更なる配列へのペプチド結合、又はカルボキシル若しくはヒドロキシル末端基への共有結合のいずれかを示すことに留意すべきである。しかしながら、ダッシュの欠如は、アミノ酸配列の表現においては、それらを省略するのが慣用的であるので、そのようなペプチド結合又はカルボキシル若しくはヒドロキシル末端基への共有結合が存在しないことを意味すると解釈されるべきではない。
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴ」、「コード配列」、及び「核酸」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの異なる長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。従って、これらの用語は、限定されないが、一本鎖、二本鎖若しくは多本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基若しくは他の天然、化学的若しくは生化学的に改変された、非天然、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を有するポリマーを含む。
用語「機能的に等価である」又は「機能的等価物」は、本明細書に開示される化合物に由来する構造又は配列を有し、その構造又は配列が本明細書に開示されるものと十分に類似しており、その結果、同じ若しくは類似の活性及び有用性を有するか、又はそのような類似性に基づいて、参照される化合物と同じ若しくは類似の活性及び有用性を示すことが当業者によって予想される、核酸又はタンパク質などの任意の分子を非限定的に指す。機能的等価物、「誘導体」又は「変異体」を得るための改変は、例えば、１つ以上の核酸又はアミノ酸残基の付加、欠失及び／又は置換を含み得る。
タンパク質の機能的等価物又は機能的等価物の断片は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有し得る。用語「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸を元のアミノ酸と類似の特性を有する別のアミノ酸で置換すること、即ち、アミノ酸を同じグループからの別のアミノ酸で置換することを指す。保存的アミノ酸のグループは、以下の通りである：
Figure 2023520262000001
保存的置換は、所定のペプチド又はその断片の任意の位置に導入され得る。しかしながら、非保存的置換、特に、これに限定されないが、任意の１つ以上の位置における非保存的置換の導入もまた所望され得る。ペプチドの機能的に等価な断片の形成を導く非保存的置換は、例えば、極性、電荷、立体バルク、及び／又は他のタンパク質若しくは核酸への結合において異なるが、機能的等価物又は変異体断片の抗凝固機能性を維持する。
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列のための参照配列（付加又は欠失を有さない）と比較して、付加又は欠失（即ち、ギャップ）を有し得る。いくつかの場合には、パーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を与え、この一致した位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で除し、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを与えることによって計算される。配列同一性は、例えば、ＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｒｏ ＮＴＩに含まれ、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ／ｃｌｕｔａｌ２／に基づく）を使用して、標準パラメーター（例えば、ギャップオープニングペナルティー＝１５；ギャップ伸長ペナルティー＝６．６；ギャップ分離ペナルティー範囲＝８）を使用して決定され得る。
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関連する用語「同一」又はパーセント「同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、又は手動アラインメント及び目視検査によって測定して、比較ウィンドウ又は指定領域にわたって最大対応について比較及び整列される場合に、同じであるか、又は同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（例えば、特定の領域（例えば、ポリペプチド配列全体又はポリペプチドの個々のドメイン）にわたって６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性）を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。その場合、そのような配列は、「実質的に同一」と言われる。この定義はまた、試験配列の相補体を指す。
本明細書で互換的に使用される用語「相補的」又は「実質的に相補的」は、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）が、核酸が非共有結合する、即ち、別の核酸とワトソン－クリック塩基対及び／又はＧ／Ｕ塩基対を配列特異的、逆平行様式で形成する（即ち、核酸が相補的核酸に特異的に結合する）ことを可能にするヌクレオチドの配列を有することを意味する。当技術分野で知られているように、標準的なワトソン－クリック塩基対形成には、アデニン（Ａ）とチミジン（Ｔ）の対形成、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）の対形成、及びグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の対形成が含まれる。
特定のＲＮＡを「コードする」ＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードすることができ、又はＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、又はガイドＲＮＡ；「非コード化」ＲＮＡ又は「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコードすることができる。「タンパク質コード配列又は特定のタンパク質若しくはポリペプチドをコードする配列」は、ｍＲＮＡに転写され（ＤＮＡの場合）、適切な調節配列の制御下に置かれると、インビトロ又はインビボでポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。
本明細書で使用される場合、「コドン」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子において一緒になって遺伝暗号の単位を形成する３つのヌクレオチドの配列を指す。本明細書で使用される用語「コドン縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の変異を可能にする遺伝暗号の性質を指す。
用語「コドン最適化された」又は「コドン最適化」は、適切な宿主の形質転換のための遺伝子又は核酸分子のコード領域を指し、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変することなく宿主生物のコドン使用を反映するように遺伝子又は核酸分子のコード領域のコドンを改変することを指す。このような最適化には、少なくとも１つの、又は１つを超える、又は有意な数のコドンを、その生物の遺伝子においてより頻繁に使用される１つ以上のコドンで置換することが含まれる。コドン使用表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２０１９年１月３０日訪問）で入手可能な「コドン使用データベース」で容易に入手可能である。各生物におけるコドン使用又はコドン優先性に関する知識を利用することによって、当業者は、任意の所定のポリペプチド配列に頻度を適用し得、ポリペプチドをコードするが、所定の種に最適なコドンを使用するコドン最適化されたコード領域の核酸断片を産生し得る。コドン最適化コード領域は、当業者に公知の方法によって設計される。
用語「組換え」又は「操作された」は、例えば、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが、改変されているか、又は実験室的方法による結果であることを示す。従って、例えば、組換えタンパク質又は操作されたタンパク質は、実験室的方法によって産生されたタンパク質を含む。組換えタンパク質又は操作されたタンパク質は、タンパク質の天然（非組換え又は野生型）形態内に見出されないアミノ酸残基を含み得、改変された（例えば、標識された）アミノ酸残基を含み得る。この用語は、ペプチド、タンパク質、又は核酸配列に対する任意の改変を含み得る。このような改変には、ペプチド、タンパク質又は核酸配列の任意の化学改変；ペプチド又はタンパク質中の１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、及び／又は置換；並びに核酸配列中の１つ以上の核酸の付加、欠失、及び／又は置換が含まれる。
用語「ゲノムＤＮＡ」又は「ゲノム配列」は、細菌、真菌、古細菌、植物又は動物のゲノムのＤＮＡを含むがこれらに限定されない生物のゲノムのＤＮＡを指す。
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」、「外因性遺伝子」、及び「外因性配列」は、細胞のゲノム中に存在しなかったが、例えばゲノム編集によってゲノム中に人工的に導入される核酸配列又は遺伝子を指す。
本明細書で使用される場合、「内因性遺伝子」又は「内因性配列」は、任意の人工的手段を介して導入されることなく、細胞のゲノム中に天然に存在する核酸配列又は遺伝子を指す。
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス、又はコスミドのようなレプリコンを意味し、これに、別のＤＮＡセグメント（例えば、「インサート」）が付着されて、細胞内の付着セグメントの複製をもたらし得る。
用語「発現カセット」は、プロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡコード配列を有するベクターを指す。「作動可能に連結された」は、そのように記載された成分が意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。例えば、プロモーターがその転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結される。用語「組換え発現ベクター」及び「ＤＮＡ構築物」は、本明細書では、ベクター及び少なくとも１つの挿入物を有するＤＮＡ分子を指すために互換的に使用される。組換え発現ベクターは、通常、インサートを発現及び／又は増殖させる目的のために、又は他の組換えヌクレオチド配列の構築のために生成される。核酸は、プロモーター配列に作動可能に連結されていても又はされていなくてもよく、ＤＮＡ調節配列に作動可能に連結されていても又はされていなくてもよい。
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。このような調節配列は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。調節配列には、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するもの、及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。
細胞は、組換え発現ベクターなどの外因性ＤＮＡにより「遺伝子改変」又は「形質転換」又は「トランスフェクト」されている（そのようなＤＮＡが細胞内に導入されている場合）。外因性ＤＮＡの存在は、永久的又は一過性の遺伝的変化をもたらす。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムに組込まれていてもいなくてもよい（共有結合していてもよい）。血友病Ａの処置などの治療活性を有する遺伝子改変（又は形質転換又はトランスフェクト）細胞を用いることができ、「治療細胞」と呼ぶことができる。
ペプチド断片などの分子に関連して使用される用語「濃度」は、所与の体積の溶液中に存在する分子の量、例えば分子のモル数を指す。
用語「急性期タンパク質」は、炎症に応答して発現又は血清濃度が変化するタンパク質を指す。急性期タンパク質の例としては、アルブミン、トランスフェリン、トランスサイレチン、フィブリノーゲン、アンチトロンビンなどが挙げられる。
用語「個体」、「対象」、及び「宿主」は、診断、処置又は治療が所望される任意の対象を指す。いくつかの態様では、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様では、対象は、ヒトである。いくつかの態様では、対象は、ヒト患者である。いくつかの態様では、対象は、血友病Ａを有するか、若しくはその疑いが存在し、且つ／又は血友病Ａの１以上の症状を有する。いくつかの態様では、対象は、診断時又はそれ以降に血友病Ａのリスクを診断されたヒトである。いくつかの場合には、血友病Ａのリスクの診断は、ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現に影響を及ぼす可能性のある内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子又はゲノム内のＦＶＩＩＩ遺伝子近傍のゲノム配列の１つ以上の突然変異の存在に基づいて決定することができる。
疾患又は状態に関して使用される用語「処置」は、個体を苦しめる状態に関連する症状の少なくとも改善が達成されることを意味し、改善は、治療される状態（例えば、血友病Ａ）に関連するパラメーター、例えば、症状の大きさの少なくとも減少を指すために広義に使用される。処置はまた、病理学的状態、又はそれに関連する少なくとも症状、又はその状態を特徴付ける少なくとも症状が、完全に阻害され、例えばその発生が防止されるか、又は宿主がもはやその状態に罹っていないように完全に排除されている状態を含む。従って、処置は、（ｉ）予防（即ち、臨床症状を発現させないようにすること、例えば、疾患の進行を防止することを含む、臨床症状の発現のリスクを低下させること）、及び（ｉｉ）阻害（即ち、臨床症状の発現を停止させるか、又は更なる発現を停止させること、例えば、活動性疾患を軽減するか、又は完全に阻害すること）を含む。
用語「有効量」、「薬学的有効量」、及び「治療有効量」は、特定の状態を有する対象に投与された場合に所望の有用性を提供するのに十分な量の組成物を意味する。血友病Ａのエクスビボ処置に関連して、用語「有効量」は、血友病Ａの少なくとも１つ以上の徴候又は症状を予防又は軽減するのに必要な治療細胞又はその子孫の集団の量を指し、所望の効果を提供するために、例えば、対象の血友病Ａの症状を処置するために、治療細胞又はその子孫を有する組成物の十分な量に関する。従って、「治療有効量」は、処置を必要とする対象、例えば、血友病Ａを有するか、又は血友病Ａのリスクがある対象に投与された場合に特定の効果を促進するのに十分な治療細胞又は治療細胞を有する組成物の量又は数を指す。有効量は、疾患の症状の発現を予防するか又は遅延させる、疾患の症状の経過を変える（例えば、しかし限定されないが、疾患の症状の進行を遅延させる）か、又は疾患の症状を逆転させるのに、十分な量又は数も含む。対象（例えば、患者）における血友病Ａのインビボ処置又はインビトロで培養された細胞において行われるゲノム編集に関連して、有効量は、対象又はインビトロで培養された細胞における細胞のゲノムを編集するために必要とされる、ｇＲＮＡ、ドナー鋳型及び／又は部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）のようなゲノム編集に使用される成分の量を指す。任意の所与の場合について、適切な「有効量」は当業者によって決定され得ることが理解される。
本明細書で使用される用語「医薬組成物」及び「医薬」は、本発明の細胞（合成ＦＶＩＩＩタンパク質を発現する）及び／又は本発明のシステムの１つ以上の成分（即ち、ｇＲＮＡ若しくはｇＲＮＡをコードする核酸、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ若しくはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、及び／又は合成第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするドナー鋳型）と組み合わされた、薬学的に許容され得る賦形剤を指す。
本明細書で使用される用語「薬学的に許容され得る賦形剤」は、対象に目的の化合物を投与するための薬学的に許容され得る担体、添加剤、又は希釈剤を提供する任意の適切な物質を指す。「薬学的に許容され得る賦形剤」は、薬学的に許容され得る希釈剤、薬学的に許容され得る添加剤、及び薬学的に許容され得る担体と称される物質を包含することができる。
用語「合成ＦＶＩＩＩ」は、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子のＡ及びＣドメインに対して実質的な配列同一性を有するが（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＤ９７５６６．１；Ｇ．Ａ．Ｖｅｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２：３３７－４２）、野生型Ｂドメインの代わりにＢドメイン置換を有するタンパク質を指す。本発明の一実施形態では、合成ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ及びＣドメインの配列は、Ａ及びＣドメインの野生型配列と８０、９０、９５、９８、又は９９％同一である。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン置換は、約１０～約２００アミノ酸を有する任意の配列のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン置換は、約２０～約１００個のアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン置換は、４０個未満のアミノ酸（例えば、３～４０個のアミノ酸の任意の数のアミノ酸を有する）と、発現時にＢドメイン置換のグリコシル化を提供する１～９個のＮ結合グリコシル化部位とを有することができる。Ｂドメイン置換は、プロテアーゼ切断部位を更に含み得、その結果、合成ＦＶＩＩＩタンパク質は、野生型タンパク質と同じ様式で重鎖及び軽鎖に切断され得る。一実施形態では、Ｂドメイン置換タンパク質配列は、１～９個のＮ結合グリコシル化（「グリカン」）部位に加えて、野生型ＢドメインのＮ末端及びＣ末端由来の１～１０個のアミノ酸を含む。一実施形態では、Ｂドメイン置換タンパク質配列は、１～６個のグリカン部位を有する。一実施形態では、Ｂドメイン置換タンパク質配列は、１～５個のグリカン部位を有する。一実施形態では、Ｂドメイン置換タンパク質配列は、１～４個のグリカン部位を有する。一実施形態では、Ｂドメイン置換タンパク質配列は、２～４個のグリカン部位を有する。一実施形態では、Ｂドメイン置換タンパク質配列は、配列番号３６２～３６９、３７１、及び３７３のいずれかの配列、又は配列番号３６２～３６９、３７１、及び３７３のいずれかの配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一である配列を有する。一実施形態では、Ｂドメイン置換タンパク質配列は、配列番号３６２～３６６、３７１、及び３７３のいずれかの配列、又は配列番号３６２～３６６、３７１、及び３７３のいずれかの配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一である配列を有する。一実施形態では、Ｂドメイン置換タンパク質配列は、配列番号３６２～３６４、３７１、及び３７３のいずれかの配列、又は配列番号３６２～３６４、３７１、及び３７３のいずれかの配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一である配列を有する。一実施形態では、Ｂドメイン置換タンパク質配列は、配列番号３６２～３６３のいずれかの配列、又は配列番号３６２～３６３のいずれかの配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一である配列を有する。一実施形態では、Ｂドメイン置換タンパク質配列は、配列番号３６２～３６９のいずれかの配列を有する。一実施形態では、Ｂドメイン置換タンパク質配列は、配列番号３６２～３６６のいずれかの配列を有する。一実施形態では、Ｂドメイン置換タンパク質配列は、配列番号３６２～３６４のいずれかの配列を有する。一実施形態では、Ｂドメイン置換タンパク質配列は、配列番号３６２～３６３、３７１、及び３７３のいずれかの配列を有する。一実施形態では、Ｂドメイン置換タンパク質配列は、配列番号３７１又は３７３のいずれかの配列を有する。
用語「セーフハーバー遺伝子座」は、細胞の代謝若しくは調節を破壊することなく（例えば、アポトーシス、増殖などを引き起こすことによって）、及び／又は他の細胞（編集されていない細胞）若しくは宿主生物全体にリスク又は有害作用を引き起こすことなく（例えば、成長因子の過剰発現などを不注意に引き起こすことによって）、改変され得る（例えば、切断することによって、又はドナー配列を挿入することによって）宿主細胞ゲノム内の遺伝子座を指す。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、宿主細胞において発現される遺伝子座である。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、アルブミン遺伝子座、フィブリノーゲン遺伝子座、ＡＡＶＳ１遺伝子座、又はトランスフェリン遺伝子座である。
核酸
ゲノム標的化核酸又はガイドＲＮＡ
本開示は、関連するポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどの部位特異的ポリペプチド）の活性を標的核酸内の特定の標的配列に誘導することができるゲノム標的化核酸を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、ＲＮＡである。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書において「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と称される。ガイドＲＮＡは、少なくとも、目的の標的核酸配列にハイブリダイズし得るスペーサー配列及びＣＲＩＳＰＲ反復配列を有する。ＩＩ型システムでは、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも有する。ＩＩ型ｇＲＮＡでは、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列が互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。Ｖ型ｇＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡが二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は、ｇＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドが複合体を形成するように、部位特異的ポリペプチドに結合する。ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドと結合することによって複合体に標的特異性を提供する。従って、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導する。
いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、２分子のｇＲＮＡである。２分子ｇＲＮＡは、２つのＲＮＡ鎖を有する。第１の鎖は、５’から３’方向に、場合によるスペーサー伸長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を有する。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び場合によるｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を有する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、単一分子ｇＲＮＡである。ＩＩ型システムにおける単一分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向に、場合によるスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び場合によるｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を有する。場合によるｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ｇＲＮＡへの更なる機能性（例えば、安定性）に寄与するエレメントを有し得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成する。場合によるｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１つ以上のヘアピンを有する。Ｖ型システムにおけるｓｇＲＮＡは、５’から３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びスペーサー配列を有する。
例示として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／Ｃｐｆ１システムで使用されるｇＲＮＡ、又は他のより小さいＲＮＡは、以下に例示され、且つ当技術分野で記載されるように、化学的手段によって容易に合成され得る。化学合成手順は継続的に拡大しているが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、これはＰＡＧＥのようなゲルの使用を回避する）のような手順によるこのようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長が１００ヌクレオチド程度を超えて有意に増加することにつれて、より困難になる傾向が存在する。より長いＲＮＡを生成するために使用される１つのアプローチは、一緒に連結される２つ以上の分子を生成することである。はるかに長いＲＮＡ、例えばＣａｓ９やＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするものは、酵素的により容易に生成される。ＲＮＡ改変、例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性若しくは程度を低減し、及び／又は他の属性を増強する改変は、当技術分野で記載されているように、ＲＮＡの化学合成及び／又は酵素的生成の間又は後に導入することができる。
スペーサー伸長配列
ゲノム標的化核酸のいくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、活性を改変し、安定性を提供し、及び／又はゲノム標的化核酸の改変のための位置を提供することができる。スペーサー伸長配列は、オンターゲット若しくはオフターゲット活性又は特異性を改変することができる。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列が提供される。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、又は７０００以上を超えるヌクレオチドの長さを有し得る。スペーサー伸長配列は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、又は７０００ヌクレオチド以上の長さを有し得る。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００以上未満のヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、長さが１０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、１０～３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、３０～７０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を有する。いくつかの実施形態では、この部分は、核酸標的化核酸の安定性を減少又は増加させる。いくつかの実施形態では、この部分は、転写ターミネーターセグメント（即ち、転写終結配列）である。いくつかの実施形態では、この部分は、真核細胞において機能する。いくつかの実施形態では、この部分は、原核細胞において機能する。いくつかの実施形態では、この部分は、真核細胞及び原核細胞の両方において機能する。適切な部分の非限定的な例としては、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及びタンパク質複合体による安定性及び／又は調節された接近可能性を可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列（即ち、ヘアピン）、ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列、追跡を提供する改変若しくは配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）、及び／又はタンパク質（例えば、転写アクチベーター、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する改変若しくは配列が挙げられる。
スペーサー配列
スペーサー配列は、目的の標的核酸中の配列にハイブリダイズすることができる。ゲノム標的化核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（即ち、塩基対形成）を介して配列特異的な様式で標的核酸と相互作用する。従って、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変化する。
本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、スペーサー配列は、システムにおいて使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’に位置する標的核酸にハイブリダイズするように設計される。スペーサーは、標的配列に完全に一致し得るか、又はミスマッチを有し得る。各Ｃａｓ９酵素は、該酵素が標的ＤＮＡにおいて認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、標的核酸において、配列５’－ＮＲＧ－３’を有するＰＡＭを認識し、ここでＲは、Ａ又はＧのいずれかを有し、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列によって標的化される標的核酸配列のすぐ３’である。
いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２０ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０未満のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０を超えるヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０以上のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０以上のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドの５’に接して２０塩基を有する。例えば、
Figure 2023520262000002
 を有する配列において、標的核酸は、Ｎ（ここでＮは、任意のヌクレオチドである）に対応する配列を有し、下線を付したＮＲＧ配列（Ｒは、Ｇ又はＡである）は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ ＰＡＭである。いくつかの実施形態では、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐ）Ｃａｓ９によって認識される配列として本開示の組成物及び方法において使用されるＰＡＭ配列は、ＮＧＧである。
いくつかの実施形態では、標的核酸にハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有する。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、約１０ｎｔ、約１５ｎｔ、約１８ｎｔ、約１９ｎｔ、約２０ｎｔ、約２５ｎｔ、約３０ｎｔ、約３５ｎｔ又は約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約８０ｎｔ、約６ｎｔ～約５０ｎｔ、約６ｎｔ～約４５ｎｔ、約６ｎｔ～約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約３５ｎｔ、約６ｎｔ～約３０ｎｔ、約６ｎｔ～約２５ｎｔ、約６ｎｔ～約２０ｎｔ、約６ｎｔ～約１９ｎｔ、約１０ｎｔ～約５０ｎｔ、約１０ｎｔ～約４５ｎｔ、約１０ｎｔ～約４０ｎｔ、約１０ｎｔ～約３５ｎｔ、約１０ｎｔ～約３０ｎｔ、約１０ｎｔ～約２５ｎｔ、約１０ｎｔ～約２０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１９ｎｔ、約１９ｎｔ～約２５ｎｔ、約１９ｎｔ～約３０ｎｔ、約１９ｎｔ～約３５ｎｔ、約１９ｎｔ～約４０ｎｔ、約１９ｎｔ～約４５ｎｔ、約１９ｎｔ～約５０ｎｔ、約１９ｎｔ～約６０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３５ｎｔ、約２０ｎｔ～約４０ｎｔ、約２０ｎｔ～約４５ｎｔ、約２０ｎｔ～約５０ｎｔ、又は約２０ｎｔ～約６０ｎｔであり得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１９ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１８ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１７ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１６ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１５ヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態では、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、最大で約３０％、最大で約４０％、最大で約５０％、最大で約６０％、最大で約６５％、最大で約７０％、最大で約７５％、最大で約８０％、最大で約８５％、最大で約９０％、最大で約９５％、最大で約９７％、最大で約９８％、最大で約９９％、又は１００％である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列の６つの隣接する最も５’側のヌクレオチドにわたって１００％である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、約２０個の連続したヌクレオチドにわたって少なくとも６０％である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列と標的核酸との長さは、１～６ヌクレオチドだけ異なっていてもよく、これは、バルジと考えることができる。
いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、コンピュータープログラムを使用して設計又は選択される。コンピュータープログラムは、予測融解温度、二次構造形成、予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノム状況、クロマチン接近可能性、％ＧＣ、ゲノム出現頻度（例えば、同一又は類似であるが、ミスマッチ、挿入又は欠失の結果として１つ以上のスポットで変化する配列の）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を使用することができる。
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列
いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、参照ＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｃｒＲＮＡ；例えば、Ｊ．Ｊ．Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００１）９８（８）：４６５８－６３を参照されたい）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の配列同一性を有する配列である。
いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、細胞内の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズし得るヌクレオチドを有する。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、二重鎖を形成する。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合わせて、部位特異的ポリペプチドに結合する。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％相補的である。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に最大で約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％相補的である。
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、約７ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の長さは、約７ｎｔ～約５０ｎｔ、約７ｎｔ～約４０ｎｔ、約７ｎｔ～約３０ｎｔ、約７ｎｔ～約２５ｎｔ、約７ｎｔ～約２０ｎｔ、約７ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、又は約１５ｎｔ～約２５ｎｔである。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、約９ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、約１２ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、少なくとも６、７、又は８個の連続するヌクレオチドのストレッチにわたって、参照最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型ｃｒＲＮＡ；例えば、Ｊ．Ｊ．Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，前出を参照されたい）と少なくとも約６０％同一である。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、少なくとも６、７、又は８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、参照最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列と少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一である。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ；例えば、Ｊ．Ｊ．Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，前出を参照されたい）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の配列同一性を有する配列である。
いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞内の最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズするヌクレオチドを有する。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、二重鎖を形成する。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、合わせて、部位特異的ポリペプチドに結合する。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも一部は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％相補的である。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ｎｔ～約５０ｎｔ、約７ｎｔ～約４０ｎｔ、約７ｎｔ～約３０ｎｔ、約７ｎｔ～約２５ｎｔ、約７ｎｔ～約２０ｎｔ、約７ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ又は約１５ｎｔ～約２５ｎｔの長さであり得る。いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約９ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約１２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｍ．Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７（６０９６）：８１６－２１に記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ ｎｔ ２３～４８からなる。
いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、又は８個の連続するヌクレオチドのストレッチにわたって、参照最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、野生型、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｔｒａｃｒＲＮＡ；例えば、Ｊ．Ｊ．Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，前出を参照されたい）配列と少なくとも約６０％同一である。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、又は８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、参照最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一又は１００％同一である。
いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、二重らせんを有する。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上のヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態では、二重鎖は、ミスマッチを有する（即ち、二重鎖の２本の鎖は、１００％相補的ではない）。いくつかの実施形態では、二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、又は５又はミスマッチを有する。いくつかの実施形態では、二重鎖は、最大で約１、２、３、４、又は５又はミスマッチを有する。いくつかの実施形態では、二重鎖は、２つ以下のミスマッチを有する。
バルジ
いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖に「バルジ」が存在する。バルジは、二重鎖内のヌクレオチドの不対領域である。いくつかの実施形態では、バルジは、部位特異的ポリペプチドへの二重鎖の結合に寄与する。バルジは、二本鎖の片側に不対５’－ＸＸＸＹ－３’を有し、ここでＸは任意のプリンであり、Ｙは、反対側の鎖のヌクレオチドとゆらぎ対を形成できるヌクレオチドを有し、また二重鎖の反対側に不対ヌクレオチド領域を有する。二重鎖の両側の不対ヌクレオチドの数は、異なっていてもよい。
一例では、バルジは、バルジの最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上に不対プリン（例えば、アデニン）を有する。いくつかの実施形態では、バルジは、バルジの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖の不対５’－ＡＡＧＹ－３’を有し、ここでＹは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対を形成できるヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態では、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、又は５以上の不対ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復側のバルジは、最大で１、２、３、４、又は５以上の不対ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復側のバルジは、１つの不対ヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態では、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上の不対ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上の不対ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、二重鎖の第２の側（例えば、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）のバルジは、４つの不対ヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも１つのゆらぎ対を有する。いくつかの実施形態では、バルジは、最大で１つのゆらぎ対を有する。いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも１つのプリンヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも３つのプリンヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、バルジ配列は、少なくとも５つのプリンヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、バルジ配列は、少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、バルジ配列は、少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを有する。
ヘアピン
いくつかの実施形態では、１つ以上のヘアピンは、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列中の最小ｔｒａｃｒＲＮＡの３’に位置する。
いくつかの実施形態では、ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の二重鎖中の最後の対形成ヌクレオチドから３’に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０以上のヌクレオチドで開始する。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の二重鎖中の最後の対形成ヌクレオチドの３’の最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上のヌクレオチドで開始することができる。
いくつかの実施形態では、ヘアピンは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０以上の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又はそれを超える連続したヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態では、ヘアピンは、ＣＣジヌクレオチド（即ち、２つの連続したシトシンヌクレオチド）を有する。
いくつかの実施形態では、ヘアピンは、二重鎖ヌクレオチド（即ち、一緒にハイブリダイズしたヘアピン中のヌクレオチド）を有する。例えば、ヘアピンは、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピン二重鎖においてＧＧジヌクレオチドとハイブリダイズするＣＣジヌクレオチドを有する。
ヘアピンの１つ以上は、部位特異的ポリペプチドのガイドＲＮＡ相互作用領域と相互作用し得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のヘアピンが存在し、いくつかの実施形態では、３つ以上のヘアピンが存在する。
３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
いくつかの実施形態では、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の配列同一性を有する配列を有する。
いくつかの実施形態では、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有する。例えば、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ｎｔ～約５０ｎｔ、約６ｎｔ～約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約３０ｎｔ、約６ｎｔ～約２５ｎｔ、約６ｎｔ～約２０ｎｔ、約６ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、又は約１５ｎｔ～約２５ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約１４ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、又は８個の連続したヌクレオチドのストレッチにわたって、参照３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と少なくとも約６０％同一である。例えば、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、又は８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、参照３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と少なくとも約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、又は１００％同一である。
いくつかの実施形態では、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つ以上の二重鎖領域を有する。いくつかの実施形態では、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つの二重鎖領域を有する。
いくつかの実施形態では、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ステムループ構造を有する。いくつかの実施形態では、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ中のステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０以上のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ中のステムループ構造は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ステムループ構造は、機能部分を有する。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、又はエクソンを有し得る。いくつかの実施形態では、ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、又は５以上の機能部分を有する。いくつかの実施形態では、ステムループ構造は、最大で約１、２、３、４、又は５以上の機能部分を有する。
いくつかの実施形態では、３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列中のヘアピンは、Ｐドメインを有する。いくつかの実施形態では、Ｐドメインは、ヘアピン中に二本鎖領域を有する。
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡが単一分子ガイド又は２分子ガイドの状況にあるかどうかにかかわらず、提供され得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約１ヌクレオチド～約４００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、又は４００ヌクレオチドを超える長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約２０～約５０００以上のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチドを超える長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００以上未満のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチド未満の長さを有し得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０～３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、３０～７０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、機能部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を有する。いくつかの実施形態では、機能部分は、転写ターミネーターセグメントを有する。いくつかの実施形態では、機能部分は、約１０ｎｔ～約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、又は約９０ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、又は約１５ｎｔ～約２５ｎｔの全長を有する。いくつかの実施形態では、機能部分は、真核細胞において機能する。いくつかの実施形態では、機能部分は、原核細胞において機能する。いくつかの実施形態では、機能部分は、真核細胞及び原核細胞の両方において機能する。
適切なｔｒａｃｒＲＮＡ伸長機能部分の非限定的な例には、３’ポリアデニル化テール、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及びタンパク質複合体による調節された安定性及び／又は調節された接近可能性を可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列、細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）にＲＮＡを標的化する配列、追跡を提供する改変若しくは配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）、及び／又はタンパク質（例えば、転写アクチベーター、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する改変若しくは配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、プライマー結合部位又は分子インデックス（例えば、バーコード配列）を有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１つ以上の親和性タグを有する。
単一分子ガイドリンカー配列
いくつかの実施形態では、単一分子ガイド核酸のリンカー配列は、約３ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有する。例示的なリンカーは、約３ｎｔ～約９０ｎｔ、約３ｎｔ～約８０ｎｔ、約３ｎｔ～約７０ｎｔ、約３ｎｔ～約６０ｎｔ、約３ｎｔ～約５０ｎｔ、約３ｎｔ～約４０ｎｔ、約３ｎｔ～約３０ｎｔ、約３ｎｔ～約２０ｎｔ、約３ｎｔ～約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ～約５ｎｔ、約５ｎｔ～約１０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２５ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約３５ｎｔ、約３５ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、又は約９０ｎｔ～約１００ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、単一分子ガイド核酸のリンカーは、４～４０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、又は７０００以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大で約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、又は７０００以上のヌクレオチドである。
リンカーは、多様な配列のいずれかを有し得るが、いくつかの実施形態では、リンカーは、ｇＲＮＡの他の機能的領域を妨害し得る分子内結合を引き起こし得る、ｇＲＮＡの他の部分と相同性の広範な領域を有する配列を有さないであろう。Ｍ．Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，（前出）において、単純な４ヌクレオチド配列－ＧＡＡＡが使用されたが、より長い配列を含む多数の他の配列が同様に使用され得る。
いくつかの実施形態では、リンカー配列は、機能部分を有する。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、タンパク質結合部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、又はエクソンを含む１つ以上の特徴を有し得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、又は５以上の機能部分を有する。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、最大で約１、２、３、４、又は５以上の機能部分を有する。
いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡによって標的化されるゲノム位置は、ゲノム、例えば、ヒトゲノム中の適切な内因性遺伝子座に、その中に、又はその近くにあり得る。内因性遺伝子座は、高度に発現される遺伝子、又は代替的に非常に選択的に発現される遺伝子（例えば、特定の組織においてのみ発現される遺伝子、又は特定の条件下で発現される遺伝子）を含むことに基づいて選択され得る。肝臓における発現のための例示的な遺伝子座には、例えば、アルブミン遺伝子座、トランスフェリン遺伝子座、及びフィブリノーゲン遺伝子座が含まれる。
いくつかの実施形態では、細胞内の内因性トランスフェリン遺伝子座内又はその近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、細胞内の内因性トランスフェリン遺伝子のイントロン１内の配列に相補的なスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１～１９０のいずれか１つからのスペーサー配列、又は配列番号１～１９０のいずれか１つと比較して３つ以下のミスマッチを有するその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号９６、５、６、９、８、１１、１５、１６、１２、７、１０、１７、１８、２９、７６、５０、５４、８１、６４、５１、１～４、１３、１４、１９～２８、３０～４９、５２、５３、５５～６３、６５～７５、７７～８０、８２～９５、及び９７～１９０のいずれか１つからのスペーサー配列、又は配列番号９６、５、６、９、８、１１、１５、１６、１２、７、１０、１７、１８、２９、７６、５０、５４、８１、６４、５１、１～４、１３、１４、１９～２８、３０～４９、５２、５３、５５～６３、６５～７５、７７～８０、８２～９５、及び９７～１９０のいずれか１つと比較して３つ以下のミスマッチを有するその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号５、６、９、８、１１、１５、１６、１２、７、及び１０のいずれか１つからのスペーサー配列、又は配列番号５、６、９、８、１１、１５、１６、１２、７、及び１０のいずれか１つと比較して３つ以下のミスマッチを有するその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１７、１８、２９、７６、５０、５４、８１、９６、６４、及び５１のいずれか１つからのスペーサー配列、又は配列番号１７、１８、２９、７６、５０、５４、８１、９６、６４、及び５１のいずれか１つと比較して３つ以下のミスマッチを有するその変異体を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１９ヌクレオチド長であり、それが選択される配列の１位のヌクレオチドを含まない。
いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡによって標的化されるゲノム位置は、ゲノム、例えば、ヒトゲノム中の内因性フィブリノーゲン－α鎖（フィブリノーゲン－α）遺伝子座に、その中に、又はその近くにあり得る。このような位置を標的とする例示的なガイドＲＮＡとしては、配列番号１９２～２７０のいずれかに列挙されるスペーサー配列及び関連するＣａｓ９又はＣｐｆ１切断部位が挙げられる。当業者に理解されるように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計される。例えば、配列番号１９２～２７０のいずれかに列挙されるスペーサー配列の各々は、単一のＲＮＡキメラ又はｃｒＲＮＡ（対応するｔｒａｃｒＲＮＡと共に）に入れられ得る。Ｍ．Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，前出、及びＥ．Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７１：６０２－０７を参照されたい。
アルブミン位置を標的とする例示的なガイドＲＮＡには、配列番号２７１～２９８のいずれか１つからのスペーサー配列及び関連するＣａｓ９又はＣｐｆ１切断部位が含まれる。例えば、配列番号２７１からのスペーサー配列を含むｇＲＮＡは、スペーサー配列ＵＡＡＵＵＵＵＣＵＵＵＵＧＣＧＣＡＣＵＡ（配列番号２９９）を含み得る。当業者によって理解されるように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計される。例えば、配列番号２７１～２９８のいずれか１つからのスペーサー配列の各々は、（対応するｔｒａｃｒＲＮＡと共に）単一のＲＮＡキメラ又はｃｒＲＮＡに入れることができる。
ドナー鋳型
ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどの部位特異的ポリペプチドは、核酸、例えばゲノムＤＮＡに二本鎖切断又は一本鎖切断を導入することができる。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存性修復（ＨＤＲ）、非相同末端結合又は代替非相同末端結合（Ａ－ＮＨＥＪ）、又はマイクロ相同性媒介末端結合（ＭＭＥＪ））を刺激することができる。ＮＨＥＪは、相同鋳型を必要とせずに切断された標的核酸を修復することができる。これは、切断部位で標的核酸における小さい欠失又は挿入（インデル）を生じることがあり、遺伝子発現の破壊又は改変をもたらす場合がある。相同組換え（ＨＲ）としても知られるＨＤＲは、相同修復鋳型、又はドナーが利用できるときに生じ得る。
相同ドナー鋳型は、標的核酸切断部位に隣接する配列と相同な配列を有する。修復鋳型として姉妹染色分体が、一般に、細胞によって使用される。しかしながら、ゲノム編集の目的のために、修復鋳型は、しばしば、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、又はウイルス核酸などの外因性核酸として供給される。外因性ドナー鋳型を用いて、更なる核酸配列（例えば、導入遺伝子）又は改変（例えば、単一又は複数の塩基変化又は欠失）を、相同性の隣接領域の間に導入し、その結果、更なる又は改変された核酸配列もまた、標的遺伝子座に組込まれるようになることが一般的である。ＭＭＥＪは、切断部位に小さい欠失及び挿入が生じ得るという点で、ＮＨＥＪと同様の遺伝的結果をもたらす。ＭＭＥＪは、切断部位に隣接する数個の塩基対の相同配列を利用して、好ましい末端結合ＤＮＡ修復の結果を促進する。場合によっては、ヌクレアーゼ標的領域における潜在的なマイクロ相同性の解析に基づいて、可能性のある修復結果を予測することが可能であり得る。
従って、いくつかの場合には、外因性ポリヌクレオチド配列を標的核酸切断部位に挿入するために、相同組換えが使用される。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書においてドナー鋳型（又はドナー、又はドナー配列、又はドナーＤＮＡ鋳型）と称される。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型、ドナー鋳型の一部、ドナー鋳型のコピー、又はドナー鋳型のコピーの一部が、標的核酸切断部位に挿入される。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、標的核酸切断部位に天然には存在しない配列である。
二本鎖切断が起こった細胞の核内部に十分な濃度で外来性ＤＮＡ分子が供給されると、外来性ＤＮＡは、ＮＨＥＪ修復過程中に二本鎖切断に挿入され、従ってゲノムへの永久的な付加となることができる。ドナー鋳型が、場合によりプロモーター、エンハンサー、ポリＡ配列、及び／又はスプライスアクセプター配列（本明細書では、「ドナーカセット」とも称される）などの関連する調節配列と一緒に、ＦＶＩＩＩ遺伝子などの目的の遺伝子のコード配列を含む場合、コード配列は、ゲノム中の組込まれたコピーから発現され得、細胞の寿命の間、永久的な発現をもたらす。更に、ドナー鋳型の組込まれたコピーは、細胞が分裂するときに娘細胞に伝達され得る。
二本鎖切断の両側のＤＮＡ配列と相同性のある、隣接するＤＮＡ配列（相同アームと称される）を含む十分な濃度のドナー鋳型の存在下で、ドナー鋳型はＨＤＲ経路を介して組込まれ得る。相同アームは、ドナー鋳型と二本鎖切断の両側の配列との間の相同組換えの基質として働く。これは、二本鎖切断の両側の配列が、改変されていないゲノムの配列から変化しない、ドナー鋳型の誤りのない挿入をもたらし得る。
ＨＤＲによる編集のために供給されるドナーは、非常に様々であるが、一般に、ゲノムＤＮＡへのアニーリングを可能にするために、小さい又は大きい隣接相同アームを有する意図された配列を含む。導入された遺伝的変化に隣接する相同領域は、３０ｂｐ以下、又はプロモーター、ｃＤＮＡなどを含み得るマルチキロ塩基カセットと同程度の大きさであり得る。一本鎖及び二本鎖オリゴヌクレオチドドナーの両方を使用することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、１００ｎｔ未満～多ｋｂを超えるサイズの範囲であるが、より長いｓｓＤＮＡも生成及び使用され得る。ＰＣＲアンプリコン、プラスミド、及びミニサークルを含む二本鎖ドナーがしばしば使用される。一般に、ＡＡＶベクターは、ドナー鋳型の送達の非常に有効な手段であることが見出されているが、個々のドナーについてのパッケージング限界は＜５ｋｂである。ドナーの活性転写はＨＤＲを３倍に増加させ、プロモーターの包含が変換を増加できることを示した。逆に、ドナーのＣｐＧメチル化は、遺伝子発現及びＨＤＲを減少させ得る。
いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡは、ヌクレアーゼと共に、又は多様な異なる方法（例えば、トランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクション、又はウイルス形質導入）によって独立して供給され得る。いくつかの実施形態では、ＨＤＲのためのドナーの利用可能性を増加させるために、一連の繋留選択肢を使用することができる。例としては、ドナーをヌクレアーゼに付着させること、近くに結合するＤＮＡ結合タンパク質に付着させること、又はＤＮＡ末端結合若しくは修復に関与するタンパク質に付着させることが挙げられる。
ＮＨＥＪ又はＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路及びＨＲの両方を使用する部位特異的遺伝子挿入を行うことができる。併用アプローチは、おそらくイントロン／エクソン境界を含む、特定の状況下で適用できる可能性がある。ＮＨＥＪは、イントロンにおけるライゲーションに有効であることが証明され得、一方、エラーのないＨＤＲは、コード領域においてより適切であり得る。
実施形態において、ゲノムに挿入される外因性配列は、野生型Ｂドメインがさもなければ存在する位置にＢドメイン置換を有する合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする合成ＦＶＩＩＩコード配列である。合成ＦＶＩＩＩコード配列は、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質の実質的な活性（例えば、凝固促進活性）を有する合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含み得る。合成ＦＶＩＩＩタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質が示す活性の少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は約１００％の活性度を有することができる。いくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質（例えば、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％のアミノ酸配列同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩタンパク質は、Ｂドメインを含まないＦＶＩＩＩタンパク質（例えば、Ｂドメインの切断後の野生型ＦＶＩＩＩタンパク質）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％のアミノ酸配列同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、当業者は、化合物（例えば、ペプチド又はタンパク質）の機能性又は活性を試験するための、当技術分野で公知の多数の方法を使用することができる。合成ＦＶＩＩＩタンパク質はまた、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質の任意の断片、又は全長野生型ＦＶＩＩＩタンパク質中のアミノ酸残基の１つ以上に保存的改変を有する改変ＦＶＩＩＩタンパク質の断片を含み得る。従って、いくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩコード配列は、ＦＶＩＩＩコード配列（例えば、野生型ＦＶＩＩＩコード配列）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の核酸配列同一性を有することができる。
本発明の実施形態において、合成ＦＶＩＩＩは、タンパク質の抗凝固特性に悪影響を及ぼすことなく、タンパク質の態様を改善する１つ以上の保存的又は非保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態では、３０９位のフェニルアラニンは、（非保存的に）セリン又はアラニンで置換されて、各々Ｆ３０９Ｓ及びＦ３０９Ａムテインを提供する。これらの置換は、Ａ１ドメインにおけるシャペロン免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）の潜在的結合部位を破壊し、それによってタンパク質の発現及び分泌を改善することが示唆される（Ｍ．Ｓｗａｒｏｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９７）２７２：２４１２１－２４）。
本発明のＢドメイン置換は、野生型ＦＶＩＩＩのＢドメインをはるかに小さいペプチド鎖で置換するが、依然としてプロテアーゼ切断部位及びＮ結合グリコシル化のための１つ以上の部位を提供する。Ｂドメイン置換は、約１０～約２００アミノ酸を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン置換は、約２０～約１００アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン置換は、約１～約４０アミノ酸、約１～約３５アミノ酸、約１～約３０アミノ酸、約１～約２５アミノ酸、約１～約２０アミノ酸、約１～約１５アミノ酸、約１～約１０アミノ酸、又は約１～約５アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン置換は、約５～約４０アミノ酸、約１０～約４０アミノ酸、約１５～約４０アミノ酸、約２０～約４０アミノ酸、約２５～約４０アミノ酸、約３０～約４０アミノ酸、又は約３５～約４０アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン置換は、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２２アミノ酸、２３アミノ酸、２４アミノ酸、２５アミノ酸、２６アミノ酸、２７アミノ酸、２８アミノ酸、２９アミノ酸、３０アミノ酸、３１アミノ酸、３２アミノ酸、３３アミノ酸、３４アミノ酸、３５アミノ酸、３６アミノ酸、３７アミノ酸、３８アミノ酸、３９アミノ酸、又は４０アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン置換をコードする核酸は、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン置換は、プロテアーゼ切断部位、例えばＲＨＱＲを含む。
その合成ＦＶＩＩＩコード配列の挿入に関するいくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩコード配列のｃＤＮＡを、欠陥ＦＶＩＩＩ遺伝子又はその調節配列を有する対象のゲノムに挿入することができる。このような場合、ドナーＤＮＡ又はドナー鋳型は、合成ＦＶＩＩＩをコードする配列を有する発現カセット又はベクター構築物であり得る。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、本明細書の他の箇所に記載される合成ＦＶＩＩＩをコードする配列を含み、使用され得る。
いくつかの実施形態では、ドナーカセットを含む本明細書に記載のドナー鋳型のいずれかによれば、ドナーカセットは、ｇＲＮＡ標的部位が片側又は両側に隣接する。例えば、このようなドナー鋳型は、ドナーカセットの５’にｇＲＮＡ標的部位及び／又はドナーカセットの３’にｇＲＮＡ標的部位を有するドナーカセットを含み得る。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ドナーカセットの５’にｇＲＮＡ標的部位を有するドナーカセットを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ドナーカセットの３’にｇＲＮＡ標的部位を有するドナーカセットを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ドナーカセットの５’にｇＲＮＡ標的部位及びドナーカセットの３’にｇＲＮＡ標的部位を有するドナーカセットを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ドナーカセットの５’にｇＲＮＡ標的部位及びドナーカセットの３’にｇＲＮＡ標的部位を有するドナーカセットを含み、２つのｇＲＮＡ標的部位は、同じ配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナー鋳型中の少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位は、ドナー鋳型のドナーカセットが組込まれる標的遺伝子座中のｇＲＮＡ標的部位と同じ配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナー鋳型中の少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位は、ドナー鋳型のドナーカセットが組込まれる標的遺伝子座中のｇＲＮＡ標的部位の逆相補体を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ドナーカセットの５’にｇＲＮＡ標的部位及びドナーカセットの３’にｇＲＮＡ標的部位を有するドナーカセットを含み、ドナー鋳型中の２つのｇＲＮＡ標的部位は、ドナー鋳型のドナーカセットが組込まれる標的遺伝子座中のｇＲＮＡ標的部位と同じ配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ドナーカセットの５’にｇＲＮＡ標的部位及びドナーカセットの３’にｇＲＮＡ標的部位を有するドナーカセットを含み、ドナー鋳型中の２つのｇＲＮＡ標的部位は、ドナー鋳型のドナーカセットが組込まれる標的遺伝子座中のｇＲＮＡ標的部位の逆相補体を含む。
部位特異的ポリペプチド又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸
いくつかの実施形態では、ゲノム編集方法及び組成物は、従って、ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどの部位特異的ポリペプチドをコードする核酸（又はオリゴヌクレオチド）を使用することができる。部位特異的ポリペプチドをコードする核酸配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。部位特異的ポリペプチドをコードする核酸配列がＲＮＡである場合、それはｇＲＮＡ配列に共有結合され得るか、又は別個の配列として存在し得る。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチド（ＤＮＡエンドヌクレアーゼなど）は、それをコードする核酸配列の代わりに直接使用される。
ベクター
別の態様では、本開示は、本開示のゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列を有する核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、及び／又は本開示の方法の実施形態を実施するために必要な任意の核酸若しくはタンパク質性分子を提供する。いくつかの実施形態では、このような核酸は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）である。
意図される発現ベクターには、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルスに基づくウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）及び他の組換えベクターが含まれるが、これらに限定されない。真核標的細胞のために意図される他のベクターには、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれるが、これらに限定されない。真核標的細胞のために意図される更なるベクターには、ベクターｐＣＴｘ－１、ｐＣＴｘ－２、及びｐＣＴｘ－３が含まれるが、これらに限定されない。他のベクターは、それらが宿主細胞と適合性である限り、使用され得る。
いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上の転写及び／又は翻訳制御エレメントを有する。利用される宿主／ベクターシステムに応じて、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む多数の適切な転写及び翻訳制御エレメントのいずれかを発現ベクター中に使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルス配列又はＣＲＩＳＰＲ機構の成分又は他のエレメントのいずれかを不活性化する自己不活性化ベクターである。
適当な真核生物プロモーター（即ち、真核細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長い末端反復（ＬＴＲ）由来のもの、ヒト伸長因子－１プロモーター（ＥＦ１）、ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）に融合したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを有するハイブリッド構築物、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセレートキナーゼ－１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）、並びにマウスメタロチオネイン－Ｉが挙げられる。
ｇＲＮＡを含む低分子ＲＮＡを発現させるためには、例えばＵ６及びＨ１を含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのプロモーターが有利であり得る。このようなプロモーターの使用を増強するための記載及びパラメーターは、当技術分野で公知であり、更なる情報及びアプローチが定期的に記載されている；例えば、Ｈ．Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ ３，ｅ１６１（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照されたい。
発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含むことができる。発現ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含み得る。発現ベクターはまた、部位特異的ポリペプチドに融合され、それにより融合タンパク質を生じる非天然タグ（例えば、ヒスチジンタグ、赤血球凝集素タグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなど）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、空間的に制限されたプロモーター及び／又は時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）である。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で発現されるべき少なくとも１つの遺伝子についてのプロモーターを有さない（ゲノム中に存在する内因性プロモーターの下で、ゲノムに挿入された後に、該遺伝子が発現されるならば）。
部位特異的ポリペプチド又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ
ＮＨＥＪ及び／又はＨＤＲによる標的ＤＮＡの改変は、例えば、突然変異、欠失、改変、組込み、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タギング、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座及び／又は遺伝子突然変異をもたらし得る。非天然核酸をゲノムＤＮＡに組込むプロセスは、ゲノム編集の一例である。
部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡを切断するゲノム編集に用いられるヌクレアーゼである。部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のポリペプチド、又はポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡのいずれかとして、細胞又は対象に投与され得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの状況において、部位特異的ポリペプチドはｇＲＮＡに結合し得、ｇＲＮＡは、次いで、ポリペプチドが指向される標的ＤＮＡ中の部位を特定する。本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはエンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）である。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、複数の核酸切断（即ち、ヌクレアーゼ）ドメインを有する。２つ以上の核酸切断ドメインは、リンカーを介して一緒に連結され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは可撓性リンカーである。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０以上のアミノ酸長を有し得る。
天然に存在する野生型Ｃａｓ９酵素は、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣドメインの２つのヌクレアーゼドメインを有する。本明細書において、「Ｃａｓ９」は、天然に存在するＣａｓ９及び組換えＣａｓ９の両方を指す。本明細書で意図されるＣａｓ９酵素は、ＨＮＨ若しくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、及び／又はＲｕｖＣ若しくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを有する。
ＨＮＨ及びＨＮＨ様ドメインは、ＭｃｒＡ様折り畳みを有する。ＨＮＨ及びＨＮＨ様ドメインは、２つの逆平行β鎖及びαヘリックスを有し、金属結合部位（例えば、二価カチオン結合部位）を有する。ＨＮＨ及びＨＮＨ様ドメインは、標的核酸の１つの鎖（例えば、ｃｒＲＮＡ標的鎖の相補鎖）を切断し得る。
ＲｕｖＣ及びＲｕｖＣ様ドメインは、ＲＮａｓｅＨ又はＲＮａｓｅＨ様折り畳みを有する。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨドメインは、核酸ベースの機能の多様なセットに関与し、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方に作用する。ＲＮａｓｅＨドメインは、複数のαヘリックスによって囲まれた５つのβ鎖を有する。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨ及びＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価カチオン結合部位）を有し、標的核酸の１つの鎖（例えば、二本鎖標的ＤＮＡの非相補鎖）を切断することができる。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書、配列番号８、又はＲ．Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１１）３９（２１）：９２７５－８２）、及び他の部位特異的ポリペプチド）に対して少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９）のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、１０個の連続するアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９）に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を有するＤＮＡエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、１０個の連続するアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチドに対して最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン中の１０個の連続するアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチドに対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン中の１０個の連続するアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチドに対して最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン中の１０個の連続するアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチドに対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン中の１０個の連続するアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチドに対して最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドの改変形態を有する。野生型の例示的部位特異的ポリペプチドの改変形態は、部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性を低下させる突然変異を有する。いくつかの実施形態では、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドの改変形態は、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満を有する。部位特異的ポリペプチドの改変形態は、実質的な核酸切断活性を有さないことができる。部位特異的ポリペプチドが実質的な核酸切断活性を有さない改変形態である場合、これは本明細書で「酵素的に不活性」と称される。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドの改変形態は、（例えば、二本鎖標的核酸の糖－リン酸骨格の１つのみを切断することによって）標的核酸上に一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導することができるような突然変異を有する。いくつかの実施形態では、突然変異は、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９）の複数の核酸切断ドメインの１つ以上において、核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満をもたらす。いくつかの実施形態では、突然変異は、標的核酸の相補鎖を切断する能力を保持するが、標的核酸の非相補鎖を切断する能力を低下させる、複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上をもたらす。いくつかの実施形態では、突然変異は、標的核酸の非相補鎖を切断する能力を保持するが、標的核酸の相補鎖を切断する能力を低下させる、複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上をもたらす。例えば、野生型の例示的な化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ポリペプチド中の残基（例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４及びＡｓｎ８５６）を突然変異させて、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）のうちの１つ以上を不活性化する。いくつかの実施形態では、突然変異されるべき残基は、野生型の例示的な化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ポリペプチド中の残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４及びＡｓｎ８５６に対応する（例えば、配列及び／又は構造アラインメントによって決定されるように）。突然変異の非限定的な例としては、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ及びＮ８５６Ａが挙げられる。当業者は、アラニン置換以外の突然変異が適切であることを認識するであろう。
いくつかの実施形態では、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＮ８５６Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、Ｈ８４０Ａ突然変異をＤ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＮ８５６Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、Ｎ８５４Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、又はＮ８５６Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、Ｎ８５６Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＤ１０Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生成する。１つの実質的に不活性なヌクレアーゼドメインを有する部位特異的ポリペプチドは、「ニッカーゼ」と称される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９の変異体を使用して、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集の特異性を増加させることができる。野生型Ｃａｓ９は、一般に、標的配列（内因性ゲノム遺伝子座など）中の特定の約２０ヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計された単一のガイドＲＮＡによって誘導される。しかしながら、ガイドＲＮＡと標的遺伝子座との間にいくつかのミスマッチを許容することができ、標的部位における必要な相同性の長さを、例えばわずか１３ｎｔの相同性まで効果的に減少させ、それによって、標的ゲノムの他の場所におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による結合及び二本鎖核酸切断－オフターゲット切断としても知られる－の潜在力の上昇をもたらす。Ｃａｓ９のニッカーゼ変異体は、各々、一方の鎖のみを切断するので、二本鎖切断をつくるためには、一対のニッカーゼが標的核酸の近接及び反対側の鎖に結合する必要があり、それによって二本鎖切断に相当する一対のニックをつくる。そのためには、２つの別々のｇＲＮＡ（各ニッカーゼにつき１つ）が標的核酸の近接及び反対側の鎖に結合しなければならない。この要求は、二本鎖切断が起こるために必要な最小限の相同性の長さを本質的に倍増させ、それによって二本鎖切断事象がゲノムの他の場所で起こる可能性を低下させ、ここで２つのｇＲＮＡ部位（存在する場合）は、二本鎖切断が起こることを可能にするように互いに十分近い可能性が低い。当技術分野で記載されているように、ＮＨＥＪに対してＨＤＲを促進するために、ニッカーゼを使用することもできる。ＨＤＲは、所望の変化を効果的に媒介する特定のドナー配列の使用を通じて、ゲノム中の標的部位に選択された変化を導入するために使用され得る。遺伝子編集において使用するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの記載は、例えば、国際特許出願国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット、Ｊ．Ｄ．Ｓａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２０１４）３２：３４７－５５、及びそこに引用される参考文献に見出され得る。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体、突然変異体、酵素的に不活性な及び／又は条件的に酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド）は、核酸を標的とする。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡを標的とする。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、ＲＮＡを標的とする。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上の非天然配列を有する（例えば、部位特異的ポリペプチドは、融合タンパク質である）。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、核酸結合ドメイン、及び２つの核酸切断ドメイン（例えば、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を有する。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、細菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメイン（即ち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を有する。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、細菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメインを有し、ここで核酸切断ドメインの一方又は両方は、細菌由来のＣａｓ９由来のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有する。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、細菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（例えば、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）、及び非天然配列（例えば、核局在化シグナル）又は部位特異的ポリペプチドを非天然配列に連結するリンカーを有する。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、細菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメイン（例えば、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を有し、部位特異的ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低下させる、核酸切断ドメインの一方又は両方における突然変異を有する。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、細菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメイン（例えば、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を有し、ヌクレアーゼドメインの１つは、アスパラギン酸１０の突然変異を有し、及び／又はヌクレアーゼドメインの１つは、ヒスチジン８４０の突然変異を有し、突然変異は、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低下させる。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼのような１つ以上の部位特異的ポリペプチドは、ゲノム中の特定の遺伝子座において１つの二本鎖切断を共にもたらす２つのニッカーゼ、又はゲノム中の特定の遺伝子座において２つの二本鎖切断を共にもたらす４つのニッカーゼを含む。或いは、１つの部位特異的ポリペプチドは、ゲノム中の特定の遺伝子座において１つの二本鎖切断に影響を及ぼす。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ゲノムを編集するために使用され得る。このような実施形態のいくつかでは、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、目的の標的ＤＮＡを含む細胞における発現について、当技術分野で公知の方法に従ってコドン最適化される。例えば、意図される標的核酸がヒト細胞内にある場合、Ｃａｓ９をコードするヒトコドン最適化ポリヌクレオチドを使用して、Ｃａｓ９ポリペプチドを産生し得る。
以下は、本開示の実施形態において使用され得る部位特異的ポリペプチドのいくつかの例を提供する。
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼシステム
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ））ゲノム遺伝子座は、多くの原核生物（例えば、細菌及び古細菌）のゲノム中に見出すことができる。原核生物では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はウイルス及びファージなどの外来の侵入者から原核生物を防御するのを助ける免疫システムの一種として機能する生成物をコードしている。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座機能には、３つの段階が存在する：ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座への新しい配列の組込み、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現、及び外来侵入者核酸のサイレンシング。５種のＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｕ型、及びＶ型）が同定されている。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、「反復配列」と称される多数の短い反復する配列を含む。発現されると、反復配列は二次ヘアピン構造（例えば、ヘアピン）を形成し、及び／又は、構造化されていない一本鎖配列を有することができる。反復配列は、通常、クラスターで生じ、しばしば種間で分岐する。反復配列は、「スペーサー」と称される特有の介在配列で規則的に間隔が空けられ、反復配列－スペーサー－反復配列の遺伝子座構造を生じる。スペーサーは、既知の外来侵入者配列と同一であるか、又は高い相同性を有する。スペーサー－反復配列ユニットはｃｒＲＮＡをコードし、これはスペーサー－反復配列ユニットの成熟形態にプロセシングされる。ｃｒＲＮＡは、標的核酸（原核生物において天然に存在する形態における、スペーサー配列は外来侵入者核酸を標的とする）の標的化に関与する「シード」又はスペーサー配列を有する。スペーサー配列は、ｃｒＲＮＡの５’又は３’末端に位置する。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はまた、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を有する。Ｃａｓ遺伝子は、原核生物における生合成及びｃｒＲＮＡ機能の干渉段階に関与するエンドヌクレアーゼをコードする。いくつかのＣａｓ遺伝子は、相同な二次構造及び／又は三次構造を有する。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム
自然界のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるｃｒＲＮＡ生合成には、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）が必要である。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内因性のＲＮａｓｅＩＩＩによって改変され、その後、プレｃｒＲＮＡアレイ中のｃｒＲＮＡ反復配列にハイブリダイズする。内因性のＲＮａｓｅＩＩＩがリクルートされて、プレｃｒＲＮＡを切断する。切断されたｃｒＲＮＡは、エキソリボヌクレアーゼトリミングに供されて成熟ｃｒＲＮＡ形態（例えば、５’トリミング）が生成される。ｔｒａｃｒＲＮＡはｃｒＲＮＡにハイブリダイズしたままであり、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と結合する。ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡがハイブリダイズできる標的核酸に複合体を誘導する。ｃｒＲＮＡの標的核酸へのハイブリダイゼーションは、標的核酸切断のためにＣａｓ９を活性化する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおける標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される。本質的に、ＰＡＭは、標的核酸への部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）の結合を容易にするために必須である。ＩＩ型システム（Ｎｍｅｎｉ又はＣＡＳＳ４とも称される）は、ＩＩ－Ａ型（ＣＡＳＳ４）及びＩＩ－Ｂ型（ＣＡＳＳ４ａ）に更に細分される。Ｍ．Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，前出は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムがＲＮＡプログラマブルゲノム編集に有用であることを報告し、国際特許出願国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレットは、部位特異的遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの多数の例及び適用を提供している。
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステム
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＩＩ型システムといくつかの重要な相違を有する。例えば、Ｃｐｆ１は、ＩＩ型システムとは対照的に、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一のＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼである。実際、Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、更なるトランス活性化ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせずに、成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイは、４２～４４ヌクレオチド長の短い成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ、各成熟ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの直接反復から始まり、続いて２３～２５ヌクレオチドのスペーサー配列である。対照的に、ＩＩ型システムにおける成熟ｃｒＲＮＡは、２０～２４ヌクレオチドのスペーサー配列から始まり、続いて約２２ヌクレオチドの直接反復である。また、Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１－ｃｒＲＮＡ複合体が短いＴリッチＰＡＭが先行する標的ＤＮＡを効率的に切断するように、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用し、これはＩＩ型システムの標的ＤＮＡに続くＧリッチＰＡＭとは対照的である。従って、Ｖ型システムは、ＰＡＭから離れた点で切断し、一方、ＩＩ型システムは、ＰＡＭに隣接する点で切断する。更に、ＩＩ型システムとは対照的に、Ｃｐｆ１は、４又は５ヌクレオチドの５’オーバーハングを有するねじれ型ＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。ＩＩ型システムは、平滑二本鎖切断を介して切断する。ＩＩ型システムと同様に、Ｃｐｆ１は、予想されるＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含むが、ＩＩ型システムとは対照的に、第２のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを欠く。
Ｃａｓ遺伝子／ポリペプチド及びプロトスペーサー隣接モチーフ
例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドは、Ｉ．Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１４）４２：２５７７－９０の図１におけるＣａｓ９ポリペプチドを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子命名システムは、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来、広範な書き換えを行っている。Ｆｏｎｆａｒａ（前出）の図５は、異なる種由来のＣａｓ９ポリペプチドのＰＡＭ配列を提供する。
ゲノム標的化核酸と部位特異的ポリペプチドの複合体
ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９などの核酸誘導ヌクレアーゼ）と相互作用し、それによって複合体を形成する。ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、部位特異的ポリペプチドを標的核酸に誘導する。
先に述べたように、いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチド及びゲノム標的化核酸は、各々、細胞又は対象に別々に投与することができる。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡと共に）と予め複合体化され得る。次いで、予め複合体化された材料は、細胞又は対象に投与され得る。このような予め複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られている。
ゲノム編集のためのシステム
ゲノム編集、特に、合成ＦＶＩＩＩコード配列を細胞のゲノムに挿入するためのシステムが本明細書に提供される。このシステムは、例えば細胞のゲノムを編集するため、及び対象（例えば、血友病Ａを有する対象）を処置するために、本明細書に記載される方法において使用され得る。
いくつかの実施形態では、（ａ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；（ｂ）細胞のゲノム中のアルブミン遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ；及び（ｃ）合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型を含むシステムが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、アルブミン遺伝子のイントロン１を標的とする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７１～２９８のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；（ｂ）配列番号２７１～２９８のいずれか１つからのスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び（ｃ）合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型を含むシステムが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７４、２７５、２８１及び２８３のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７４からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７５からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２８１からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２８３からのスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるシステムのいずれかによれば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、又はそれらの機能的等価物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ｓｐＣａｓ９）由来である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）（ＳｌｕＣａｓ９）由来である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるシステムのいずれかによれば、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるシステムのいずれかによれば、システムは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡプラスミドなどのＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるシステムのいずれかによれば、ドナー鋳型は、ＡＡＶベクターにコードされる。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、合成ＦＶＩＩＩコード配列を含むドナーカセットを含み、ドナーカセットは、ｇＲＮＡ標的部位が片側又は両側に隣接する。いくつかの実施形態では、ドナーカセットは、ｇＲＮＡ標的部位が両側に隣接する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ標的部位は、システムにおけるｇＲＮＡの標的部位である。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位は、システムにおけるｇＲＮＡに対する細胞ゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるシステムのいずれかによれば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソーム又は脂質ナノ粒子中に処方される。いくつかの実施形態では、リポソーム又は脂質ナノ粒子はまた、ｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リポソーム又は脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、システムは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸及びｇＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるシステムのいずれかによれば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはｇＲＮＡと複合体化され、ＲＮＰ複合体を形成する。
ゲノム編集の方法
ゲノム編集、特に、その合成ＦＶＩＩＩタンパク質を細胞のゲノムに挿入する方法が本明細書に提供される。この方法は、対象（例えば、血友病Ａを有する患者）を処置するために使用され得、このような場合、細胞は、対象又は別個のドナーから単離され得る。次いで、細胞の染色体ＤＮＡを、本明細書に記載される材料及び方法を用いて編集する。
合成ＦＶＩＩＩコード配列をゲノムにノックインする方法を本明細書に提供する。一態様において、本開示は、合成ＦＶＩＩＩコード配列の核酸配列、即ち、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列の、細胞のゲノムへの挿入を提供する。合成ＦＶＩＩＩタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質の実質的な活性、例えば、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質が示す活性の少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又は約１００％を有するペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、当業者は、化合物（例えば、ペプチド又はタンパク質）の機能性又は活性を試験するために、当技術分野で公知の多数の方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩタンパク質はまた、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質の任意の断片、又は全長野生型ＦＶＩＩＩタンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基に保存的改変を有する改変ＦＶＩＩＩタンパク質の断片を含み得る。いくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質の機能性に実質的に悪影響を及ぼさない１つ以上のアミノ酸の任意の改変、例えば、欠失、挿入及び／又は突然変異を含むこともできる。従って、いくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩコード配列の核酸配列は、ＦＶＩＩＩコード配列に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の核酸配列同一性を有することができる。
いくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩコード配列は、細胞内のゲノム配列に挿入される。いくつかの実施形態では、挿入部位は、細胞のゲノム中のアルブミン遺伝子座、トランスフェリン遺伝子座、又はフィブリノーゲンα遺伝子座にあるか、又はその中にある。いくつかの実施形態では、挿入部位は、アルブミン遺伝子座である。挿入方法は、アルブミン遺伝子の第１イントロン（又はイントロン１）を標的とする１つ以上のｇＲＮＡを用いる。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡは、合成ＦＶＩＩＩコード配列を有する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、ゲノム編集方法は、合成ＦＶＩＩＩコード配列を遺伝的に導入（ノックイン）するために、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼを利用する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、その相同体、天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化、又は改変型、及び上記のいずれかの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ｓｐＣａｓ９）由来である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）（ＳｌｕＣａｓ９）由来である。
いくつかの実施形態では、ゲノム編集の細胞対象は、そのような突然変異を有さない正常における発現と比較して、内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現の減少をもたらす、ゲノムにおける１つ以上の突然変異を有する。正常細胞は、ＦＶＩＩＩ遺伝子欠陥を有さない異なる対象に由来する（又は該対象から単離された）健常細胞又は対照細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ゲノム編集の細胞対象は、ＦＶＩＩＩ遺伝子関連状態又は障害、例えば血友病Ａの処置を必要とする対象に由来する（又は該対象から単離される）ことができる。従って、いくつかの実施形態では、そのような細胞における内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現は、正常細胞における内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子発現と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は約１００％減少する。
いくつかの実施形態では、ゲノム編集方法は、機能性ＦＶＩＩＩコード配列、例えば、インビボでＦＶＩＩＩタンパク質を安定に生成するように供給されたプロモーターに作動可能に連結されたＦＶＩＩＩコード配列の標的化組込み（ゲノムの非コード領域で）を行う。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩコード配列の標的化組込みは、目的の細胞型（例えば、肝細胞又は類洞内皮細胞）において高度に発現されるアルブミン遺伝子のイントロンにおいて生じる。
一態様において、合成ＦＶＩＩＩコード配列の核酸配列は、細胞のゲノムに挿入される。実施形態において、挿入される合成ＦＶＩＩＩコード配列は、改変ＦＶＩＩＩコード配列である。いくつかの実施形態では、改変ＦＶＩＩＩコード配列において、野生型ＦＶＩＩＩコード配列のＢドメインが欠失され、Ｂドメイン置換で置換される。いくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩは、そのサイズが小さい（４３７１ｂｐ対７０５３ｂｐ）ため、全長野生型ＦＶＩＩＩよりも優れている。従って、いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩシグナルペプチドを欠き、その５’末端（ＦＶＩＩＩコード配列のＮ末端）にスプライスアクセプター配列を含む合成ＦＶＩＩＩコード配列は、ヒトを含む哺乳動物の肝細胞における遺伝子座のイントロン１に特異的に組込まれる。一実施形態では、遺伝子座は、アルブミン遺伝子座である。別の実施形態では、遺伝子座は、トランスフェリン遺伝子座である。別の実施形態では、遺伝子座は、フィブリノーゲンα遺伝子座である。
トランスフェリンプロモーターからの合成ＦＶＩＩＩコード配列の転写は、トランスフェリンのエクソン１、イントロン１の一部及び組込まれた合成ＦＶＩＩＩコード配列を含むプレｍＲＮＡを生じ得る。このプレｍＲＮＡがイントロンを除去する自然なスプライシング過程を経ると、スプライシング機構は、トランスフェリンエクソン１の３’側のスプライスドナーを、挿入されたＤＮＡドナーの合成ＦＶＩＩＩコード配列の５’末端のスプライスアクセプターとなる次の利用可能なスプライスアクセプターに連結することができる。これにより、合成ＦＶＩＩＩの成熟コード配列に融合されたトランスフェリンエクソン１を含む成熟ｍＲＮＡが生じ得る。
アルブミンプロモーターからのこの合成ＦＶＩＩＩコード配列の転写は、アルブミンのエクソン１、イントロン１の一部及び組込まれた合成ＦＶＩＩＩコード配列を含むプレｍＲＮＡを生じ得る。このプレｍＲＮＡがイントロンを除去する自然なスプライシング過程を経ると、スプライシング機構は、アルブミンエクソン１の３’側のスプライスドナーを、挿入されたＤＮＡドナーの合成ＦＶＩＩＩコード配列の５’末端のスプライスアクセプターとなる次の利用可能なスプライスアクセプターに連結することができる。これにより、合成ＦＶＩＩＩの成熟コード配列に融合されたアルブミンエクソン１を含む成熟ｍＲＮＡが生じ得る。アルブミンのエクソン１は、シグナルペプチドに加えて２つの更なるアミノ酸をコードし、ヒトでは通常アルブミンのＮ末端のタンパク質配列ＤＡＨをコードするコドンの３分の１をコードする。従って、いくつかの実施形態では、細胞からの分泌の間のアルブミンシグナルペプチドの予想される切断後に、合成ＦＶＩＩＩタンパク質を生成することができ、この合成ＦＶＩＩＩタンパク質は、Ｎ末端に付加された３つの更なるアミノ酸残基を有し、合成ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端にアミノ酸配列
Figure 2023520262000003
 を生じる。これら３つのアミノ酸のうちの３番目（下線が付された）は、部分的にエクソン１の末端によってコードされ、部分的に合成ＦＶＩＩＩ ＤＮＡドナー鋳型によってコードされるので、第３の更なるアミノ酸残基のアイデンティティを、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ又はＡｒｇのいずれかであるように選択することが可能である。これらの選択肢のうち、Ｌｅｕはいくつかの実施形態において使用されるが、それは、Ｌｅｕが最小の分子複合体であり、従って、新規Ｔ細胞エピトープを形成する可能性が最も低く、その結果、合成ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端にアミノ酸配列
Figure 2023520262000004
 を生じるからである。或いは、ＤＮＡドナー鋳型は、第３の残基を欠失して合成ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端にアミノ酸配列
Figure 2023520262000005
 を生じるように設計され得る。いくつかの場合では、天然タンパク質の配列に更なるアミノ酸を付加することは、免疫原性リスクを増加させ得る。従って、合成ＦＶＩＩＩのＮ末端の２つの潜在的な選択肢の潜在的な免疫原性を予測するためのインシリコ分析が、１つの残基
Figure 2023520262000006
 の欠失がより低い免疫原性スコアを有することを実証する、いくつかの実施形態では、これは、少なくともいくつかの実施形態では設計であり得る。
いくつかの実施形態では、コドン使用が最適化された合成ＦＶＩＩＩをコードするＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞における発現を改善するために使用され得る（いわゆる「コドン最適化」）。コドン最適化を実施するための様々なコンピュータアルゴリズムも当技術分野で利用可能であり、これらは異なるＤＮＡ配列を生成する（Ｖ．Ｐ．Ｍａｕｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ（２０１４）２０：６０４－１３）。市販のコドン最適化アルゴリズムの例は、会社ＡＴＵＭ及びＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部）によって使用されるものである。ＦＶＩＩＩコード配列のコドン最適化は、マウスへの遺伝子ベースの送達後にＦＶＩＩＩの発現を有意に改善することが実証された（Ａ．Ｃ．Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００６）１０７（７）：２６５３－６１）；Ｎ．Ｊ．Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１１）１１７（３）：７９８－８０７；Ｐ．Ａ．Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００８）１５（４）：２８９－９７）。コドン最適化は、目的のコード配列の発現を改善するための確立されたアプローチであり、主として、コードされるアミノ酸配列を変化させることなく、あまり頻繁に使用されないコドンをより頻繁に使用されるコドンと置換することに基づいている。コドン偏りがタンパク質発現に影響を及ぼす可能性があるという最初の認識から、コドン最適化のための方法が進化し、ＧｅｎｅＡｒｔ及びＡＴＵＭなどのＤＮＡ合成会社によって提供されるものを含むアルゴリズムが市販されている。これらの市販のアルゴリズムは、ＤＮＡ合成サービスの一部としてユーザが無料で利用でき、隠れた（ｃｒｙｐｔｉｃ）スプライシングシグナルを除去し、コード配列全体にわたるＧ／Ｃ含有量を均一化するようにも設計されている。インビボでの細胞への外因性核酸の送達は、Ｔｏｌｌ受容体システムによるＣＧジヌクレオチド（ＣｐＧ配列とも呼ばれる）の認識によって少なくとも部分的に駆動される自然免疫応答を誘導することができ、特にプラスミドＤＮＡが送達ベクターである場合、これらの核酸に対する自然免疫応答を減少させる方法として、ＣＧジヌクレオチド含有量の減少が提案されている。Ｐ．Ｃｏｌｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ（２０１８）８：８７－１０４も参照されたい。遺伝子の天然に存在する（天然の）コード配列が哺乳動物種における発現のために最適化されている場合、より頻繁に使用されるコドンはコドンの第３の（ゆらぎ）位置においてより高い頻度のＧ及びＣヌクレオチドを含むため、ＣＧジヌクレオチドの数は一般に増加する。従って、コード配列中のＧ及びＣヌクレオチドの全体的な含有量の増加は、ＧＣジヌクレオチドのより高い含有量を生じるであろう。
いくつかの実施形態では、異なるアルゴリズムによってコドン最適化された合成ＦＶＩＩＩコード配列と、（ヒトゲノム中に存在する）天然ＦＶＩＩＩ配列との間の配列相同性又は同一性は、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、コドン最適化合成ＦＶＩＩＩコード配列は、天然ＦＶＩＩＩ配列に対して約７５％～約７９％の配列相同性又は同一性を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化合成ＦＶＩＩＩコード配列は、天然ＦＶＩＩＩ配列に対して約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％又は約８０％の配列相同性又は同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型又はドナー構築物は、合成ＦＶＩＩＩをコードするＤＮＡ配列を含むように調製される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡドナー鋳型は、コドン最適化ヒト合成ＦＶＩＩＩコード配列を含むように設計される。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、ＦＶＩＩＩのシグナルペプチドをコードする５’末端の配列が欠失され、スプライスアクセプター配列で置換され、更に、ポリアデニル化シグナルが、ＦＶＩＩＩ終止コドン（ＭＡＢ８Ａ－配列番号３０１）の後の３’末端に付加されるように行われる。スプライスアクセプター配列は、既知の遺伝子からの既知のスプライスアクセプター配列の中から選択され得るか、又は当技術分野で公知の多くのスプライスアクセプター配列のアラインメントに由来するコンセンサススプライスアクセプター配列が使用され得る。いくつかの実施形態では、高度に発現された遺伝子からのスプライスアクセプター配列が、そのような配列は最適なスプライシング効率を提供すると考えられるので、使用される。いくつかの実施形態では、コンセンサススプライシングアクセプター配列は、コンセンサス配列Ｔ／ＣＮＣ／ＴＴ／ＣＡ／ＧＡＣ／Ｔ（配列番号３０２）を有する分岐部位と、それに続く２０ｂｐ以内の１０～１２塩基のポリピリミジン路（Ｃ又はＴ）と、それに続くＡＧ＞Ｇ／Ａ（＞は、イントロン／エクソン境界の位置である）とから構成される。一実施形態では、合成スプライスアクセプター配列
Figure 2023520262000007
 が使用される。別の実施形態では、ヒトのアルブミン遺伝子イントロン１／エクソン２境界
Figure 2023520262000008
 又はマウス
Figure 2023520262000009
 由来の天然スプライスアクセプター配列が使用される。
ポリアデニル化配列は、細胞内のｍＲＮＡの安定性に不可欠なポリＡテールを付加するためのシグナルを細胞に提供する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡドナー鋳型はＡＡＶ粒子にパッケージングされることになるが、本発明の実施形態は、パッケージングされるＤＮＡのサイズを、約５Ｋｂ未満、又は約４．７Ｋｂ以下であり得るＡＡＶのパッケージング限界内に保つ。従って、いくつかの実施形態では、可能な限り短いポリＡ配列（例えば、約１０量体、約２０量体、約３０量体、約４０量体、約５０量体、又は約６０量体、又は前述の任意の介在する数のヌクレオチド）が使用される。コンセンサス合成ポリＡ シグナル配列は、文献（Ｎ．Ｌｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ（１９８９）３（７）：１０１９－２５）に記載されており、ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ（配列番号３０６）であり、多数の発現ベクターで一般に使用されている。
いくつかの実施形態では、組込みの頻度を改善するために、更なる配列エレメントをＤＮＡドナー鋳型に加えることができる。そのようなエレメントの１つは、相同性アームである。二本鎖切断（ＬＨＡ）の左側からの配列は、ＤＮＡドナー鋳型の５’（ＦＶＩＩＩコード配列のＮ末端）末端に付加され、二本鎖切断（ＲＨＡ）の右側からの配列は、ＤＮＡドナー鋳型の３’（ＦＶＩＩＩコード配列のＣ末端）末端に付加され、例えばＭＡＢ８Ｂ（配列番号３０８）である。
いくつかの実施形態に提供される代替ＤＮＡドナー鋳型設計は、ゲノム部位を切断するために使用されるｓｇＲＮＡの認識配列に相補的な配列を有する。ＭＡＢ８Ｃ（配列番号３０９）は、このタイプのＤＮＡドナー鋳型の例を表す。ｓｇＲＮＡ認識部位を含めることによって、ＤＮＡドナー鋳型は、ＤＮＡドナー鋳型及びｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９が送達された細胞の核内のｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体によって切断される。ドナー鋳型の線状断片への切断は、非相同末端結合機構又はＨＤＲ機構による二本鎖切断での組込みの頻度を増加させることができる。これは、核への送達後にＡＡＶゲノムがコンカテマー化してより大きい環状二本鎖ＤＮＡ分子を形成することが知られているため、ＡＡＶにパッケージされたドナー鋳型の送達の場合に特に有益であり得る（Ｈ．Ｎａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ（２００１）７５：６９６９－７６）。従って、いくつかの場合において、環状コンカテマーは、特にＮＨＥＪ機構によって、二本鎖切断において組込みのための効率の低いドナーであり得る。以前に、環状プラスミドＤＮＡドナー鋳型を用いた標的化組込みの効率は、プラスミド中に亜鉛フィンガーヌクレアーゼ切断部位を含めることによって増加し得ることが報告されている（Ｓ．Ｃｒｉｓｔｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２０１３）１１０：８７１－８０）。より最近になって、このアプローチはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用して適用された（Ｋ．Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１７）５４０：１４４－４９）。ｓｇＲＮＡ認識配列は、二本鎖ＤＮＡドナー鋳型のどちらかの鎖上に存在する場合に活性であるが、ゲノム中に存在するｓｇＲＮＡ認識配列の逆相補体の使用は、逆向きにおける組込みが、再切断されることによって挿入ドナー鋳型を解放することができるｓｇＲＮＡ認識配列を再作成することができるので、安定な組込みに有利になると予測される。ＮＨＥＪによる順方向でのゲノム中のこのようなドナー鋳型の組込みは、組込みまれたドナー鋳型をゲノムから切り出すことができないように、ｓｇＲＮＡ認識配列を再作成しないと予測される。ＦＶＩＩＩドナー鋳型の組込み効率に対する、相同性アームを有し又は有さずにドナーにｓｇＲＮＡ認識配列を含めることの利点は、例えば、ドナーの送達のためにＡＡＶを使用し、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９成分の送達のためにＬＮＰ（脂質ナノ粒子）を使用するマウスにおいて試験及び決定することができる。
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ｇＲＮＡ標的部位が片側又は両側に隣接する、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるドナーカセット中の合成ＦＶＩＩＩコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ドナーカセットの５’のｇＲＮＡ標的部位及び／又はドナーカセットの３’のｇＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、２つの隣接ｇＲＮＡ標的部位を含み、２つのｇＲＮＡ標的部位は、同じ配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナー鋳型中の少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子の第１のイントロンを標的とする１つ以上のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つの標的部位である。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナー鋳型中の少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子の第１のイントロン中の１つ以上のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つの標的部位の逆相補体である。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ドナーカセットの５’のｇＲＮＡ標的部位及びドナーカセットの３’のｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナー鋳型中の２つのｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子の第１のイントロンを標的とする１つ以上のｇＲＮＡによって標的化される。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ドナーカセットの５’のｇＲＮＡ標的部位及びドナーカセットの３’のｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナー鋳型中の２つのｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子の第１のイントロン中の１つ以上のｇＲＮＡの少なくとも１つの標的部位の逆相補体である。
標的部位、即ち、ＦＶＩＩＩコード配列が挿入されるゲノム位置へのＦＶＩＩＩコード配列の挿入は、内因性アルブミン遺伝子座又はその隣接配列にあり得る。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩコード配列は、挿入されたコード配列の発現がアルブミン遺伝子の内因性プロモーターによって制御されるように挿入される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩコード配列は、アルブミン遺伝子のイントロンの１つに挿入される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩコード配列は、アルブミン遺伝子のエクソンの１つに挿入される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩコード配列は、イントロン：エクソンの接合部に挿入される（又はその逆）。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩコード配列の挿入は、アルブミン遺伝子座の第１のイントロン（又はイントロン１）にある。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩコード配列の挿入は、アルブミン遺伝子の発現に有意な影響を与えず、例えば、アップレギュレート又はダウンレギュレートしない。
実施形態において、ＦＶＩＩＩコード配列の挿入のための標的部位は、内因性アルブミン遺伝子に、その中に、又はその近くにある。いくつかの実施形態では、標的部位は、ゲノム中のアルブミン遺伝子座のプロモーターの上流にある遺伝子間領域にある。いくつかの実施形態では、標的部位は、アルブミン遺伝子座内にある。いくつかの実施形態では、アルブミン遺伝子座のイントロンの１つにおける標的部位。いくつかの実施形態では、アルブミン遺伝子座のエクソンの１つにおける標的部位。いくつかの実施形態では、標的部位は、アルブミン遺伝子座のイントロンとエクソン（又はその逆）との間の接合部の１つにある。いくつかの実施形態では、標的部位は、アルブミン遺伝子座の第１のイントロン（又はイントロン１）にある。特定の実施形態では、標的部位は、アルブミン遺伝子の第１のエクソン（即ち、第１のエクソンの最後の核酸から）の少なくとも、約、又は最大で約０、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００又は５５０又は６００又は６５０ｂｐ下流である。いくつかの実施形態では、標的部位は、アルブミン遺伝子の第１のイントロンの少なくとも、約、又は最大で０．１ｋｂ、約０．２ｋｂ、約０．３ｋｂ、約０．４ｋｂ、約０．５ｋｂ、約１ｋｂ、約１．５ｋｂ、約２ｋｂ、約２．５ｋｂ、約３ｋｂ、約３．５ｋｂ、約４ｋｂ、約４．５ｋｂ又は約５ｋｂ上流である。いくつかの実施形態では、標的部位は、アルブミン遺伝子の第２のエクソンの約０ｂｐ～約１００ｂｐ上流、約１０１ｂｐ～約２００ｂｐ上流、約２０１ｂｐ～約３００ｂｐ上流、約３０１ｂｐ～約４００ｂｐ上流、約４０１ｂｐ～約５００ｂｐ上流、約５０１ｂｐ～約６００ｂｐ上流、約６０１ｂｐ～約７００ｂｐ上流、約７０１ｂｐ～約８００ｂｐ上流、約８０１ｂｐ～約９００ｂｐ上流、約９０１ｂｐ～約１０００ｂｐ上流、約１００１ｂｐ～約１５００ｂｐ上流、約１５０１ｂｐ～約２０００ｂｐ上流、約２００１ｂｐ～約２５００ｂｐ上流、約２５０１ｂｐ～約３０００ｂｐ上流、約３００１ｂｐ～約３５００ｂｐ上流、約３５０１ｂｐ～約４０００ｂｐ上流、約４００１ｂｐ～約４５００ｂｐ上流、又は約４５０１ｂｐ～約５０００ｂｐ上流のいずれかにある。いくつかの実施形態では、標的部位は、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第１のエクソンの末端（即ち、３’末端）の少なくとも３７ｂｐ下流である。いくつかの実施形態では、標的部位は、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第２のエクソンの開始（即ち、５’開始）の少なくとも３３０ｂｐ上流である。
いくつかの実施形態では、細胞内のゲノムを編集する方法であって、以下を細胞に提供することを含む方法が本明細書に提供される：（ａ）細胞ゲノム中のアルブミン遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び（ｃ）合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、アルブミン遺伝子のイントロン１を標的とする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７１～２９８のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞内のゲノムを編集する方法であって、以下を細胞に提供することを含む方法が本明細書に提供される：（ａ）配列番号２７１～２９８のいずれか１つからのスペーサー配列を含むｇＲＮＡ；（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び（ｃ）合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７４、２７５、２８１、及び２８３のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７４からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７５からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２８１からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２８３からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞、例えばヒト肝細胞である。
本明細書に記載の細胞内のゲノムを編集する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、若しくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、又はそれらの機能的等価物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ｓｐＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ＳｌｕＣａｓ９である。
本明細書に記載の細胞内のゲノムを編集する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列は、細胞内での発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。
本明細書に記載の細胞内のゲノムを編集する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、この方法は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を使用する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、細胞内での発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞、例えばヒト肝細胞である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡプラスミドなどのＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡである。
本明細書に記載の細胞内のゲノムを編集する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ＡＡＶベクターにコードされる。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、ドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。いくつかの実施形態では、ドナーカセットの両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ標的部位は、投与されるｇＲＮＡの標的部位である。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位は、ｇＲＮＡに対する細胞ゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。
本明細書に記載の細胞内のゲノムを編集する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソーム又は脂質ナノ粒子中に処方される。いくつかの実施形態では、リポソーム又は脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡも含む。いくつかの実施形態では、リポソーム又は脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、この方法は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸及びｇＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を使用する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。
本明細書に記載の細胞内のゲノムを編集する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡと予め複合体化され、ＲＮＰ複合体を形成する。
本明細書に記載の細胞内のゲノムを編集する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、ドナー鋳型が細胞に提供された後に、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が細胞に提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー鋳型が細胞に提供されて４日を超えた後に、細胞に提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー鋳型が細胞に提供された少なくとも１４日後に細胞に提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー鋳型が細胞に提供された少なくとも１７日後に細胞に提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）及び（ｂ）は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸及びｇＲＮＡを含む脂質ナノ粒子として細胞に提供される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、（ｃ）は、ドナー鋳型をコードするＡＡＶベクターとして細胞に提供される。
本明細書に記載の細胞内のゲノムを編集する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の更なる用量が、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の第１の用量に続いて細胞に提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の更なる用量は、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列の標的化組込みの標的レベル及び／又は合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列の標的発現レベルが達成されるまで、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の第１の用量に続いて細胞に提供される。
本明細書に記載の細胞内のゲノムを編集する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される。
いくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩコード配列を細胞ゲノムのアルブミン遺伝子座に挿入する方法であって、（ａ）Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）又はＣａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、（ｂ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸（ここでｇＲＮＡは、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼを誘導して、アルブミン遺伝子座の標的ポリヌクレオチド配列を切断することができる）、及び（ｃ）合成ＦＶＩＩＩコード配列を含む、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるドナー鋳型を細胞に導入することを含む方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ｉ）Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｉｉ）ｇＲＮＡを含む、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるＬＮＰを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ＡＡＶドナー鋳型である。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、合成ＦＶＩＩＩコード配列を含むドナーカセットを含み、ドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡの標的部位が隣接する。いくつかの実施形態では、ドナーカセットに隣接するｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子座におけるｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＣａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、及びｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸は、ドナー鋳型の細胞への導入後に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＣａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、及びｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸は、ドナー鋳型が細胞核に入ることを可能にするために、ドナー鋳型の細胞への導入後に十分な時間、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＣａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、及びｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸は、ドナー鋳型が一本鎖ＡＡＶゲノムから細胞核内の二本鎖ＤＮＡ分子に変換されることを可能にするために、ドナー鋳型の細胞への導入後に十分な時間、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。
合成ＦＶＩＩＩコード配列を本明細書に記載の細胞ゲノムのアルブミン遺伝子座に挿入する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、アルブミン遺伝子のイントロン１にある。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７１～２９８のいずれかのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７４、２７５、２８１、及び２８３のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７４からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７５からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡが配列番号２８１からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２８３からのスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩコード配列を細胞ゲノムのアルブミン遺伝子座に挿入する方法であって、（ａ）ｉ）Ｃａｓ９ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｉｉ）Ｃａｓ９ ＤＮＡエンドヌクレアーゼを誘導してアルブミン遺伝子座の標的ポリヌクレオチド配列を切断することができるｇＲＮＡを含む、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるＬＮＰ、並びに（ｂ）合成ＦＶＩＩＩコード配列を含む、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるＡＡＶドナー鋳型を細胞に導入することを含む方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は合成ＦＶＩＩＩコード配列を含むドナーカセットを含み、ドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡの標的部位が隣接する。いくつかの実施形態では、ドナーカセットに隣接するｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子座におけるｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＡＡＶドナー鋳型の細胞への導入後に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ドナー鋳型が細胞核に入ることを可能にするために、ＡＡＶドナー鋳型の細胞への導入後に十分な時間、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ドナー鋳型が一本鎖ＡＡＶゲノムから細胞核内の二本鎖ＤＮＡ分子に変換されることを可能にするために、ＡＡＶドナー鋳型の細胞への導入後に十分な時間、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、細胞へのＬＮＰの１つ以上（２、３、４、５以上など）の更なる導入は、細胞へのＬＮＰの最初の導入に続いて行われる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７１～２９８のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７４、２７５、２８１、及び２８３のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７４からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７５からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２８１からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２８３からのスペーサー配列を含む。
標的部位へのＦＶＩＩＩコード配列の挿入は、内因性フィブリノーゲン－α遺伝子座又はその隣接配列中にあり得る。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩコード配列は、挿入されたコード配列の発現がフィブリノーゲン－α遺伝子の内因性プロモーターによって制御されるように挿入される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩコード配列は、フィブリノーゲン－α遺伝子のイントロンの１つに挿入される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩコード配列は、フィブリノーゲン－α遺伝子のエクソンの１つに挿入される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩコード配列は、イントロン：エクソン（又はその逆）の接合部に挿入される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩコード配列の挿入は、フィブリノーゲン－α遺伝子座の第１のイントロン（又はイントロン１）にある。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩコード配列の挿入は、フィブリノーゲン－α遺伝子の発現に有意な影響を与えず、例えばアップレギュレート又はダウンレギュレートしない。
特定の実施形態では、標的部位は、フィブリノーゲン－α遺伝子の第１のエクソンの（即ち、第１のエクソンの最後の塩基対又は３’末端から）少なくとも、約又は最大で０、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１０７１ｂｐ、又は任意の介在長の核酸だけ下流である。いくつかの実施形態では、標的部位は、フィブリノーゲン－α遺伝子の第２のエクソンの（即ち、第２のエクソンの第１の核酸又は５’末端から）少なくとも、約又は最大で０．１ｋｂ、約０．２ｋｂ、約０．３ｋｂ、約０．４ｋｂ、約０．５ｋｂ、約１ｋｂ、又は任意の介在長の核酸だけ上流である。いくつかの実施形態では、標的部位は、フィブリノーゲン－α遺伝子の第２のエクソンの（即ち、第２のエクソンの第１の核酸又は５’末端から）約０ｂｐ～約１００ｂｐ、約１０１ｂｐ～約２００ｂｐ、約２０１ｂｐ～約３００ｂｐ、約３０１ｂｐ～約４００ｂｐ、約４０１ｂｐ～約５００ｂｐ、約５０１ｂｐ～約６００ｂｐ、約６０１ｂｐ～約７００ｂｐ、約７０１ｂｐ～約８００ｂｐ、約８０１ｂｐ～約９００ｂｐ、約９０１ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１００１ｂｐ～約１０７１ｂｐ上流のいずれかである。
いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩコード配列の挿入のための標的部位は、ゲノム中のヒトフィブリノーゲン－α遺伝子の第１エクソンの末端の少なくとも４０ｂｐ下流であり、ゲノム中のヒトフィブリノーゲン－α遺伝子の第２エクソンの開始の少なくとも６０ｂｐ上流である。
いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩコード配列の挿入のための標的部位は、ゲノム中のヒトフィブリノーゲン－α遺伝子の第１エクソンの末端の少なくとも４２ｂｐ下流であり、ゲノム中のヒトフィブリノーゲン－α遺伝子の第２エクソンの開始の少なくとも６５ｂｐ上流である。
いくつかの実施形態では、挿入は、ゲノム中のヒトフィブリノーゲン－α遺伝子の第１エクソンの末端の少なくとも１２ｂｐ下流であり、ゲノム中のヒトフィブリノーゲン－α遺伝子の第２エクソンの開始の少なくとも５２ｂｐ上流である。
いくつかの実施形態では、挿入は、ゲノム中のヒトフィブリノーゲン－α遺伝子の第１エクソンの末端の少なくとも９４ｂｐ下流であり、ゲノム中のヒトフィブリノーゲン－α遺伝子の第２エクソンの開始の少なくとも８６ｂｐ上流である。
本明細書に記載されるシステムのいずれかに従ういくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、トランスフェリン遺伝子のイントロン１への標的化組込みのための合成ＦＶＩＩＩをコードする核酸配列を含み、ここでドナー鋳型は、５’から３’へ、ｉ）第１のｇＲＮＡ標的部位；ｉｉ）スプライスアクセプター；ｉｉｉ）合成ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列；及びｉｖ）ポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ｉｖ）ポリアデニル化シグナルの下流に第２のｇＲＮＡ標的部位を更に含む。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡ標的部位及び第２のｇＲＮＡ標的部位は、同じである。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ｉｉ）スプライスアクセプターとｉｉｉ）合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列との間の内因性配列の活性の少なくとも一部を保持するトランスフェリン遺伝子又はその変異体のエクソン２にコードされるトランスフェリンシグナルペプチドの末端部分をコードする配列を更に含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ｉ）第１のｇＲＮＡ標的部位とｉｉ）スプライスアクセプターとの間にポリヌクレオチドスペーサーを更に含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドスペーサーは、１８ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一方の側が第１のＡＡＶ ＩＴＲ（逆方向末端反復）に隣接し、及び／又は他方の側が第２のＡＡＶ ＩＴＲに隣接する。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、及び／又は第２のＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ｉｉｉ）３、４、５、又は６つのＮ結合グリコシル化部位を含むＢドメイン置換を有する合成ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列。ドナー鋳型成分の例示的な配列は、配列番号３１０及び／又は３１１のドナー鋳型配列に見出すことができる。
標的配列選択
いくつかの実施形態では、特定の参照遺伝子座に対する５’境界及び／又は３’境界の位置のシフトが使用されて、遺伝子編集の特定の適用を容易にするか又は増強し、これは、本明細書に更に記載及び例示されるように、編集のために選択されるエンドヌクレアーゼシステムに部分的に依存する。
このような標的配列選択の第１の非限定的な態様において、多くのエンドヌクレアーゼシステムは、ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型又はＶ型エンドヌクレアーゼの場合、ＤＮＡ切断部位に隣接する特定の位置におけるＰＡＭ配列モチーフの必要性のような、切断のための潜在的な標的部位の最初の選択を導く規則又は基準を有する。
標的配列選択又は最適化の別の非限定的な態様において、標的配列とＤＮＡエンドヌクレアーゼの特定の組み合わせについての「オフターゲット」活性の頻度（即ち、選択された標的配列以外の部位で生じる二本鎖切断の頻度）は、オンターゲット活性の頻度と比較して評価される。いくつかの場合、所望の遺伝子座で正確に編集された細胞は、他の細胞と比較して選択的利点を有し得る。選択的利点の例としては、例えば、増強された複製速度、持続性、特定の条件に対する抵抗性、対象への導入後のインビボでの生着又は持続の成功率の向上、及びこのような細胞の維持又は数の増加又は生存率に関連する他の属性などの属性の獲得が挙げられるが、これらに限定されない。他の場合では、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞が、正しく編集された細胞を同定し、選別し、又はさもなければ選択するために使用される１つ以上のスクリーニング方法によって、積極的に選択され得る。選択的利点と誘導される選択方法の両方が、修正に関連する表現型を利用することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、２回以上編集されて、意図される細胞集団を選択又は精製するために使用される新たな表現型を作製する第２の改変を作製し得る。このような第２の改変は、選択マーカー又はスクリーニングマーカーのための第２のｇＲＮＡを加えることによって作製され得る。いくつかの場合には、ｃＤＮＡ及びまた選択マーカーを含むＤＮＡ断片を使用して、所望の遺伝子座で細胞を正確に編集することができる。
実施形態において、任意の選択的利点が適用可能であるか、又は任意の誘導される選択が特定の場合に適用されるかどうかにかかわらず、標的配列選択はまた、適用の有効性を増強するため、及び／又は所望の標的以外の部位での望ましくない改変の可能性を低減するために、オフターゲット頻度の考慮によって導かれる。本明細書及び当技術分野において更に記載及び例示されるように、オフターゲット活性の発生は、標的部位とオフターゲット部位との間の類似性及び相違性、並びに使用される特定のエンドヌクレアーゼを含む、多数の因子によって影響される。オフターゲット活性の予測を補助するバイオインフォマティクスツールが利用可能であり、しばしば、このようなツールは、オフターゲット活性の最も可能性の高い部位を同定するためにも使用され得、これは次いで、オフターゲット活性のオンターゲット活性に対する相対頻度を評価するために実験環境において評価され得、それによって、より高い相対オンターゲット活性を有する配列の選択を可能にする。このような技術の例は、本明細書に提供され、他のものは、当技術分野で公知である。
標的配列選択の別の態様は、相同組換え事象に関するものである。相同性の領域を共有する配列は、介在配列の欠失をもたらす相同組換え事象の焦点として働くことができる。このような組換え現象は、染色体及び他のＤＮＡ配列の複製の通常の過程で起こり、二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復の場合のようにＤＮＡ配列が合成されているときにも起こる。ＤＳＢは、正常な細胞複製サイクルの間に定期的に生じるが、ＵＶ光及びＤＮＡ切断の他のインデューサーのような因子、又は化学的インデューサーのような因子の存在によっても増強され得る。このようなインデューサーの多くは、ゲノム中でＤＳＢを無差別に発生させ、ＤＳＢは、正常細胞で規則的に誘導され、修復される。修復の間、元の配列を完全な忠実度で再構築することができるが、いくつかの場合には、小さいインデルがＤＳＢ部位に導入される。
ＤＳＢは、本明細書に記載のエンドヌクレアーゼシステムの場合のように、特定の位置に特異的に誘導することもでき、これを用いて、選択された染色体位置に、指向性又は優先的な遺伝子改変事象を引き起こすことができる。ＤＮＡ修復（及び複製）の状況において相同配列が組換えを受けやすい傾向は、多くの状況において利用することができ、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）を用いて、ドナー鋳型の使用を通して提供される目的の配列を所望の染色体位置に挿入するＣＲＩＳＰＲのような遺伝子編集システムの１つの適用の基礎である。
特定の配列間の相同性の領域（これは、わずか１０塩基対以下を有し得る「マイクロ相同性」の小さい領域であり得る）も、所望の欠失をもたらすために使用され得る。例えば、単一のＤＳＢは、近くの配列とマイクロ相同性を示す部位に導入される。このようなＤＳＢの修復の通常のプロセスにおいて、高頻度で起こる結果は、ＤＳＢ及び付随する細胞修復プロセスによって組換えが促進される結果としての介在配列の欠失である。
しかしながら、ある状況では、相同性の領域内の標的配列を選択することは、遺伝子融合（欠失がコード領域にある場合）を含む、はるかに大きい欠失を生じることもあり、これは、特定の状況を考慮すると、所望され得るか、又は所望され得ない。
本明細書に提供される例は、ＦＶＩＩＩコード配列を挿入するように設計されたＤＳＢの作製のための標的領域の選択、及びオンターゲット事象と比較してオフターゲット事象を最小限にするように設計されたそのような領域内の特定の標的配列の選択を更に説明する。
標的化組込み
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、「標的化組込み」と称される、肝細胞のゲノム中の特定の位置に合成ＦＶＩＩＩコード配列を組込むことである。いくつかの実施形態では、標的化組込みは、配列特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムＤＮＡ中に二本鎖切断を生成することによって可能になる。
いくつかの実施形態で使用されるＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムは、最適なＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ設計を同定するために多数のゲノム標的を迅速にスクリーニングすることができるという利点を有する。ゲノムの任意の領域を標的とするｓｇＲＮＡ分子は、２０ｂｐ配列を全てのＰＡＭモチーフに隣接して配置することによって、インシリコで設計することができる。ＰＡＭモチーフは、真核生物のゲノム中で平均して１５ｂｐごとに生じる。しかしながら、インシリコ方法によって設計されたｓｇＲＮＡは、異なる効率で細胞内に二本鎖切断を生成し、インシリコ方法を用いて一連のｓｇＲＮＡ分子の切断効率を予測することは現在可能ではない。ｓｇＲＮＡは、インビトロで迅速に合成できるので、これにより、所与のゲノム領域の全ての潜在的なｓｇＲＮＡ配列を迅速にスクリーニングして、最も効率的な切断をもたらすｓｇＲＮＡを同定することができる。一般に、所与のゲノム領域内の一連のｓｇＲＮＡを細胞内で試験する場合、０～９０％の切断効率の範囲が観察される。インシリコアルゴリズム及び実験室の実験を用いて、任意の所与のｓｇＲＮＡのオフターゲットの可能性を決定することもできる。ｓｇＲＮＡの２０ｂｐ認識配列に対する完全な一致は、主としてほとんどの真核生物ゲノムで１回だけであるが、ゲノム中には、ｓｇＲＮＡと１つ以上の塩基対ミスマッチを有する多数の更なる部位が存在するであろう。これらの部位は、しばしばミスマッチの数又は位置に基づいて予測不可能である可変頻度で切断され得る。インシリコ分析によって同定されなかった更なるオフターゲット部位での切断も起こり得る。従って、最も好ましいオフターゲットプロファイルを有するｓｇＲＮＡを同定するために、関連する細胞型中の多数のｓｇＲＮＡをスクリーニングすることは、治療用途のための最適なｓｇＲＮＡを選択する重要な成分である。好ましいオフターゲットプロファイルは、実際のオフターゲット部位の数及びこれらの部位における切断の頻度だけでなく、ゲノムにおけるこれらの部位の位置も考慮に入れる。例えば、機能的に重要な遺伝子、特に癌遺伝子又は抗癌遺伝子に近い又はその内部のオフターゲット部位は、機能が知られていない遺伝子間領域の部位よりも好ましくないと考えられる。従って、最適なｓｇＲＮＡの同定は、単に生物のゲノム配列のインシリコ解析によって予測することはできず、実験的な試験が必要である。インシリコ解析は、試験するガイドの数を絞り込むのに役立つが、高いオンターゲット切断を有するガイドを予測することも、望ましい低いオフターゲット切断を有するガイドを予測することもできない。実験データによると、各々が目的領域（アルブミンイントロン１など）のゲノムと完全に一致するｓｇＲＮＡの切断効率は、切断なしから９０％以上の切断まで様々であり、既知のアルゴリズムでは予測できないことが示されている。所与のｓｇＲＮＡがＣａｓ酵素による切断を促進する能力は、その領域のクロマチン構造によって決定できるゲノムＤＮＡのその特異的部位の接近可能性と関連付けることができる。肝細胞のような静止状態の分化した細胞のゲノムＤＮＡの大部分は、高度に凝縮したヘテロクロマチンに存在するが、活発に転写されている領域は、Ｃａｓタンパク質などのタンパク質のような大きい分子に接近しやすいことが知られている、より開いたクロマチン状態に存在する。活発に転写されている遺伝子内でも、結合した転写因子又は他の調節タンパクの有無により、ＤＮＡのいくつかの特定の領域は他よりも接近しやすい。ゲノム中の、又はイントロンのような特定のゲノム遺伝子座又はゲノム遺伝子座の領域内の、及びアルブミンイントロン１のような部位を予測することは不可能であり、従って、関連する細胞型において実験的に決定する必要があるであろう。いったん、いくつかの部位が挿入のための潜在的な部位として選択されると、例えば、実験的試験の有無にかかわらず、数個のヌクレオチドを選択された部位から上流又は下流に移動することによって、そのような部位にいくつかの変異を付加することが可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法で使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２７１～２９８のうちの１つ以上、又は配列番号２７１～２９８のものと少なくとも約８５％のヌクレオチド配列同一性を有するその任意の機能的等価物である。
核酸改変
いくつかの実施形態では、細胞に導入されたポリヌクレオチドは、本明細書に更に記載され、当技術分野で知られているように、例えば、活性、安定性又は特異性を増強し、送達を変更し、宿主細胞における自然免疫応答を低減し、又は他の増強のために、個別に又は組み合わせて使用することができる１つ以上の改変を有する。
特定の実施形態では、改変されたポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムにおいて使用され、この場合、細胞に導入されるガイドＲＮＡ（単一分子ガイド又は２分子ガイドのいずれか）及び／又はＣａｓ若しくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡは、以下に記載され、例示されるように改変され得る。このような改変ポリヌクレオチドは、任意の１つ以上のゲノム遺伝子座を編集するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムにおいて使用され得る。
このような使用の非限定的な例示の目的のためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムを使用して、ガイドＲＮＡの改変を用いて、単一分子ガイド又は２分子であり得るｇＲＮＡ、及びＣａｓ若しくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の形成又は安定性を増強し得る。ｇＲＮＡの改変はまた、又は代替的に、ゲノム編集複合体とゲノム中の標的配列との間の相互作用の開始、安定性又は動力学を増強するために使用され得、これは、例えば、オンターゲット活性を増強するために使用され得る。ガイドＲＮＡの改変はまた、又は代替的に、特異性、例えば、他の（オフターゲット）部位での効果と比較した、オンターゲット部位でのゲノム編集の相対的な割合を増強するために使用され得る。
改変はまた、又は代替的に、例えば、細胞内に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）による分解に対する耐性を増加させ、それによって細胞内でのその半減期を増加させることによって、ガイドＲＮＡの安定性を増加させるために使用することができる。ガイドＲＮＡの半減期を増加させる改変は、エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入されるガイドＲＮＡの半減期を増加させることが、ガイドＲＮＡ及びコードされるＣａｓ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが細胞内に共存する時間を増加させるために使用され得るので、エンドヌクレアーゼを生成するために翻訳される必要があるＲＮＡを介して編集されるべき細胞にＣａｓ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが導入される実施形態において特に有用であり得る。
改変はまた、又は代替的に、細胞に導入されるＲＮＡが自然免疫応答を誘発する可能性又は程度を減少させるために使用され得る。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む）の状況において十分に特徴付けられているこのような応答は、下記及び当技術分野において記載されるように、ＲＮＡの半減期の減少及び／又は免疫応答に関連するサイトカイン若しくは他の因子の誘発に関連する傾向がある。
細胞に導入されるエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに対して、限定されるものではないが、ＲＮＡの安定性を増強する改変（例えば、細胞内に存在するＲＮＡｓｅによるその分解を増加させることによる）、得られる生成物（即ち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を増強する改変、及び／又は細胞に導入されたＲＮＡが自然免疫応答を誘発する可能性又は程度を減少させる改変を含む、１つ以上のタイプの改変も行うこともできる。
前述及び他のものなどの改変の組み合わせも同様に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１の場合、例えば、ガイドＲＮＡ（上記で例示したものを含む）に１つ以上のタイプの改変を行うことができ、及び／又はＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ（上記で例示したものを含む）に、１つ以上のタイプの改変を行うことができる。
例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムで使用されるガイドＲＮＡ、又は他のより小さいＲＮＡは、化学的手段によって容易に合成され得、以下に例示され、当技術分野で記載されるように、多数の改変が容易に組込まれることを可能にする。化学合成手順は継続的に拡大しているが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、これはＰＡＧＥのようなゲルの使用を回避する）のような手順によるこのようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長が１００ヌクレオチド程度を超えて有意に増加することにつれて、より困難になる傾向がある。より長い長さの化学改変ＲＮＡを生成するために使用される１つのアプローチは、一緒に連結される２つ以上の分子を生成することである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡのような、はるかに長いＲＮＡは、酵素的により容易に生成される。酵素的に生成されるＲＮＡでの使用には、一般に、より少ないタイプの改変が利用可能であるが、以下及び当技術分野で更に記載されるように、例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性若しくは程度を減少させ、及び／又は他の属性を増強するために使用され得る改変が依然として存在し；新たなタイプの改変が定期的に開発されている。
改変のタイプ、特に、より小さい化学的に合成されたＲＮＡで頻繁に使用されるもの例として、改変は、糖の２’位、いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、又は２’－フルオロ改変ヌクレオチドで改変された１つ以上のヌクレオチドを有することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ改変は、ピリミジンのリボース上の２’－フルオロ、２’－アミノ、又は２’－Ｏ－メチル改変、脱塩基残基、又はＲＮＡの３’末端の逆塩基を含む。このような改変は、オリゴヌクレオチドに組込まれており、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対する２’－デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（即ち、より高い標的結合親和性）を有することが報告されている。
多数のヌクレオチド及びヌクレオシド改変が、それらが組込まれるオリゴヌクレオチドを、天然オリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼ消化に対してより抵抗性にすることが報告されており；これらの改変オリゴは、未改変オリゴヌクレオチドよりも長時間無傷で生存する。改変オリゴヌクレオチドの具体例としては、改変骨格を有するもの、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子若しくは複素環糖間結合が挙げられる。いくつかのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、及びヘテロ原子骨格、特に、ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２、ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる）、ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２、ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２及びＯ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２骨格（ここで天然ホスホジエステル骨格はＯ－Ｐ－Ｏ－ＣＨとして表される）；アミド骨格（Ａ．Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｅ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ（１９９５）２８：３６６－３７４参照）；モルホリノ骨格構造（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ及びＷｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号参照）；並びにペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（後述）を有するオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドである。リン含有結合には、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを有するメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデートを有するホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、並びに通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似体、並びにヌクレオシド単位の隣接対が３’－５’から５’－３’又は２’－５’から５’－２’に結合している逆極性を有するものが含まれるが、これらに限定されない；米国特許第３，６８７，８０８号明細書；米国特許第４，４６９，８６３号明細書；米国特許第４，４７６，３０１号明細書；米国特許第５，０２３，２４３号明細書；米国特許第５，１７７，１９６号明細書；米国特許第５，１８８，８９７号明細書；米国特許第５，２６４，４２３号明細書；米国特許第５，２７６，０１９号明細書；米国特許第５，２７８，３０２号明細書；米国特許第５，２８６，７１７号明細書；米国特許第５，３２１，１３１号明細書；米国特許第５，３９９，６７６号明細書；米国特許第５，４０５，９３９号明細書；米国特許第５，４５３，４９６号明細書；米国特許第５，４５５，２３３号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７６，９２５号明細書；米国特許第５，５１９，１２６号明細書；米国特許第５，５３６，８２１号明細書；米国特許第５，５４１，３０６号明細書；米国特許第５，５５０，１１１号明細書；米国特許第５，５６３，２５３号明細書；米国特許第５，５７１，７９９号明細書；米国特許第５，５８７，３６１号明細書；及び米国特許第５，６２５，０５０号明細書を参照されたい。
モルホリノベースのオリゴマー化合物は、Ｄ．Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ（２００２）４１（１４）：４５０３－１０；Ｓ．Ｃ．Ｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ（２００１）３０（３）：８９－９３（及びこの問題における他の論文）；Ｊ．Ｈｅａｓｍａｎ，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ（２００２）２４３：２０９－１４；Ａ．Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（２０００）２６：２１６－２０；Ｇ．Ｌａｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２０００）９７：９５９１－９６；及び米国特許第５，０３４，５０６号明細書に記載されている。
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣物は、Ｊ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ（２０００）１２２：８５９５－６０２に記載されている。
中にリン原子を含まない改変オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル骨格及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成部分を有する他の骨格を有するものを有する；米国特許第５，０３４，５０６号明細書；米国特許第５，１６６，３１５号明細書；米国特許第５，１８５，４４４号明細書；米国特許第５，２１４，１３４号明細書；米国特許第５，２１６，１４１号明細書；米国特許第５，２３５，０３３号明細書；米国特許第５，２６４，５６２号明細書；米国特許第５，２６４，５６４号明細書；米国特許第５，４０５，９３８号明細書；米国特許第５，４３４，２５７号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７０，９６７号明細書；米国特許第５，４８９，６７７号明細書；米国特許第５，５４１，３０７号明細書；米国特許第５，５６１，２２５号明細書；米国特許第５，５９６，０８６号明細書；米国特許第５，６０２，２４０号明細書；米国特許第５，６１０，２８９号明細書；米国特許第５，６０２，２４０号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第５，６１０，２８９号明細書；米国特許第５，６１８，７０４号明細書；米国特許第５，６２３，０７０号明細書；米国特許第５，６６３，３１２号明細書；米国特許第５，６３３，３６０号明細書；米国特許第５，６７７，４３７号明細書；及び米国特許第５，６７７，４３９号明細書を参照されたい。
１つ以上の置換糖部分、例えば、２’の位置に以下のうちの１つ：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、若しくはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ここでｎは、１～約１０である）；Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換された低級アルキル、アルカリール若しくはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ－、Ｓ－若しくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－若しくはＮ－アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基；又はオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、及び類似の特性を有する他の置換基も含まれ得る。いくつかの実施形態では、改変は、２’－メトキシエトキシ（２’－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）としても知られる）（Ｐ．Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ（１９９５）７８：４８６）を含む。他の改変は、２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ３）、２’－プロポキシ（２’－ＯＣＨ２－ＣＨ２ＣＨ３）及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）を含む。同様の改変を、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルのような糖模倣物を有することもできる。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合の両方、即ち骨格は、新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが報告されているオリゴヌクレオチド模倣物であるこのようなオリゴマー化合物の１つは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称されている。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えばアミノエチルグリシン骨格で置換されている。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；及び第５，７１９，２６２号を有するが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物の更なる教示は、Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４：１４９７－５００に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡはまた、追加的又は代替的に、核酸塩基（当技術分野では、単に「塩基」と称されることが多い）改変又は置換を含むことができる。本明細書で使用される場合、「未改変」又は「天然」核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含む。改変核酸塩基は、天然核酸には稀に又は一時的にのみ見出される核酸塩基、例えばヒポキサンチン、６－メチルアデニン、５－Ｍｅピリミジン、特に５－メチルシトシン（５－メチル－２’－デオキシシトシンとも称され、当技術分野では、しばしば５－Ｍｅ－Ｃと称される）、５－ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲントビオシルＨＭＣ、並びに合成核酸塩基、例えば２－アミノアデニン、２－（メチルアミノ）アデニン、２－（イミダゾリルアルキル）アデニン、２－（アミノアルキルアミノ）アデニン又は他のヘテロ置換アルキルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、８－アザグアニン、７－デアザグアニン、Ｎ６（６－アミノヘキシル）アデニン、並びに２，６－ジアミノプリンを含む；Ｇ．Ｇｅｂｅｙｅｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９７）１５：４５１３。当技術分野で公知の「ユニバーサル」塩基（例えば、イノシン）もまた含まれ得る。５－Ｍｅ－Ｃ置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２℃増加させることが報告されている。（Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）は、塩基置換の実施形態である。
いくつかの実施形態では、改変核酸塩基には、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチオシミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（偽ウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルクアニン（ｍｅｔｈｙｌｑｕａｎｉｎｅ）及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン、並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基が含まれる。
更なる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されているもの、“Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８～８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅ．Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔ’ｌ Ｅｄ，（１９９１）３０：６１３により開示されているもの、及びＹ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ｐｐ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３により開示されているものが含まれる。これらの核酸塩基の特定のものは、本開示のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシンを有する、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、並びにＮ－２、Ｎ－６及び０－６置換プリンが含まれる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２℃増加させることが報告されており（Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ、前出、２７６～７８頁）、塩基置換の実施形態であり、特に２’－Ｏ－メトキシエチル糖改変と組み合わされた場合に更により一層好ましい。改変核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書、米国特許第４，８４５，２０５号明細書；米国特許第５，１３０，３０２号明細書；米国特許第５，１３４，０６６号明細書；米国特許第５，１７５，２７３号明細書；米国特許第５，３６７，０６６号明細書；米国特許第５，４３２，２７２号明細書；米国特許第５，４５７，１８７号明細書；米国特許第５，４５９，２５５号明細書；米国特許第５，４８４，９０８号明細書；米国特許第５，５０２，１７７号明細書；米国特許第５，５２５，７１１号明細書；米国特許第５，５５２，５４０号明細書；米国特許第５，５８７，４６９号明細書；米国特許第５，５９６，０９１号明細書；米国特許第５，６１４，６１７号明細書；米国特許第５，６８１，９４１号明細書；米国特許第５，７５０，６９２号明細書；米国特許第５，７６３，５８８号明細書；米国特許第５，８３０，６５３号明細書；米国特許第６，００５，０９６号明細書及び米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号明細書に記載されている。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼをコードするガイドＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡ（又はＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞取り込みを増強する１つ以上の部分又はコンジュゲートに化学的に連結される。このような部分としては、脂質部分、例えばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、（１９８９）８６：６５５３－５６）；コリン酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔ（１９９４）４：１０５３－６０）；チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９９２）６６０：３０６－０９）及びＭａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔ，（１９９３）３：２７６５－７０）；チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９２）２０：５３３－５３８）；脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｆ．ＥＢＳ Ｌｅｔｔ（１９９０）２５９：３２７－３３０及びＳｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ（１９９３）７５：４９－５４）；リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ（１９９５）３６：３６５１－５４及びＳｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９０）１８：３７７７－８３）；ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｃｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９５）１４：９６９－７３）；アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ（１９９５）３６：３６５１－５４）；パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ（１９９５）１２６４：２２９－３７）；又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ－カルボニル－ｔ－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ（１９９６）２７７：９２３－３７）が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１号明細書、米国特許第５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３号明細書、米国特許第５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８号明細書及び米国特許第５，６８８，９４１号明細書も参照されたい。
いくつかの実施形態では、糖及び他の部分を使用して、カチオン性ポリソーム及びリポソームなどのヌクレオチドを有するタンパク質及び複合体を特定の部位に標的化することができる。例えば、肝細胞指向性転移は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を介して媒介され得る；例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ（２０１４）２１（１０）：１０２５－３０を参照されたい。当技術分野で公知の他のシステムを使用して、本発明の場合に使用される生体分子、及び／又はその複合体を、目的の特定の標的細胞に標的化することができる。
いくつかの実施形態では、これらの標的化部分又はコンジュゲートは、第１級又は第２級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含むことができる。本開示のコンジュゲート基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態特性を増強する基が含まれる。例示的なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料が挙げられる。本開示の状況において、薬力学特性を増強する基には、取り込みを改善し、分解に対する耐性を増強し、及び／又は標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。本開示の状況において、薬物動態特性を増強する基には、本開示の化合物の取り込み、分布、代謝又は排泄を改善する基が含まれる。代表的なコンジュゲート基は、参照により本明細書に組込まれる、１９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号明細書及び米国特許第６，２８７，８６０号明細書に開示されている。コンジュゲート部分には、脂質部分、例えばコレステロール部分、コリン酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル－５－トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール、又はトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１号明細書、米国特許第５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３号明細書、米国特許第５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８号明細書及び米国特許第５，６８８，９４１号明細書を参照されたい。
化学合成を受けにくく、一般に酵素合成によって生成されるより長いポリヌクレオチドも改変することができる。このような改変には、例えば、特定のヌクレオチド類似体の導入、分子の５’又は３’末端における特定の配列又は他の部分の組込み、及び他の改変が含まれ得る。例として、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡは、約４ｋｂの長さであり、インビトロ転写により合成することができる。ｍＲＮＡに対する改変は、例えば、その翻訳又は安定性を増加させる（例えば、細胞内での分解に対するその耐性を増加させることによって）、又は外因性ＲＮＡ、特にＣａｓ９をコードするＲＮＡのようなより長いＲＮＡの導入後に細胞においてしばしば観察される自然免疫応答を誘発するＲＮＡの傾向を減少させるために適用され得る。
ポリＡテール、５’キャップ類似体（例えば、抗逆方向キャップ類似体（Ａｎｔｉ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）又はｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））、改変５’又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、改変塩基（偽ＵＴＰ、２－チオ－ＵＴＰ、５－メチルシチジン－５’－三リン酸（５－メチル－ＣＴＰ）又はＮ６－メチル－ＡＴＰなど）の使用、又は５’末端リン酸を除去するためのホスファターゼによる処理など、多くのそのような改変が当技術分野で記載されている。これら及び他の改変は、当技術分野で知られており、ＲＮＡの新しい改変が定期的に開発されている。
インビボで送達される化学改変ｍＲＮＡを使用して、改善された治療効果を達成することができることが報告されている；例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１１）２９：１５４－５７を参照されたい。このような改変は、例えば、ＲＮＡ分子の安定性を増加させるため、及び／又はその免疫原性を減少させるために使用され得る。偽Ｕ、Ｎ６－メチル－Ａ、２－チオ－Ｕ及び５－メチル－Ｃのような化学改変を用いて、ウリジン及びシチジン残基の４分の１だけを各々２－チオ－Ｕ及び５－メチル－Ｃで置換すると、マウスにおけるｍＲＮＡのｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）媒介認識が有意に減少することが見出された。自然免疫システムの活性化を低下させることにより、これらの改変を用いて、ｍＲＮＡのインビボでの安定性及び寿命を効果的に増加させることができる；例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ．ａｌ．，前出を参照されたい。
自然抗ウイルス応答をバイパスするように設計された改変を組込んだ合成メッセンジャーＲＮＡを反復投与すると、分化したヒト細胞を多能性に再プログラムすることができることも報告されている。例えば、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２０１０）７（５）：６１８－３０を参照されたい。一次再プログラミングタンパク質として作用するこのような改変ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞型を再プログラミングする効率的な手段であり得る。このような細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と称され、５－メチル－ＣＴＰ、偽ＵＴＰ及び抗逆方向キャップ類似体（ＡＲＣＡ）を組込む酵素的に合成されたＲＮＡが細胞の抗ウイルス応答を効果的に回避するために使用され得ることが見出された；例えば、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，前出を参照されたい。
当技術分野で記載されるポリヌクレオチドの他の改変としては、例えば、ポリＡテールの使用、５’キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））の付加、５’又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の改変、及び５’末端リン酸を除去するためのホスファターゼでの処置が挙げられる。
本明細書で使用される改変ＲＮＡの生成に適用可能ないくつかの組成物及び技術が、ｓｉＲＮＡを含むＲＮＡｉの改変に関連して開発されている。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ干渉を介した遺伝子サイレンシングに対するそれらの効果が一般に一過性であり、反復投与を必要とし得るため、インビボで特定の課題を提示する。また、ｓｉＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、ウイルス感染の副産物であることが多いｄｓＲＮＡを検出及び中和するために哺乳類の免疫応答が進化してきた。従って、このような分子に応答してサイトカインの誘導を誘発し得る、ｄｓＲＮＡに対する細胞応答を媒介し得る哺乳動物酵素（例えば、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ応答性キナーゼ）、及び潜在的にレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ））、並びにＴｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８）が存在する；例えば、Ａｎｇａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）（２０１３）６（４）：４４０－６８；Ｋａｎａｓｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２０１２）２０（３）：５１３－２４；Ｂｕｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ（２０１１）６（９）：１１３０－４６；Ｊｕｄｇｅ ａｎｄ ＭａｃＬａｃｈｌａｎ、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（２００８）１９（２）：１１１－２４による考察；及びそれらに引用される参考文献を参照されたい。
多種多様な改変が開発されており、本明細書に記載されるように、ＲＮＡ安定性を増強し、自然免疫応答を減少させ、及び／又はヒト細胞へのポリヌクレオチドの導入に関連して有用であり得る他の利益を達成するために適用されている（例えばＫ．Ａ．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ（２０１１）２：７７－９６；Ｇａｇｌｉｏｎｅ ａｎｄ Ｍｅｓｓｅｒｅ、Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（２０１０）１０（７）：５７８－９５；Ｃｈｅｒｎｏｌｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２０１０）１２（２）：１５８－６７；Ｄｅｌｅａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ、Ｃｈａｐｔｅｒ １６：Ｕｎｉｔ １６．３（２００９）；Ｂｅｈｌｋｅ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（２００８）１８（４）：３０５－１９；Ｆｕｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ（２０１２）２２（３）：２０５－２１０；Ｂｒｅｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ（２０１２）３：１５４による考察を参照されたい。
改変ＲＮＡの多くの商業的供給者は、その多くがｓｉＲＮＡの有効性を改善するように設計された改変に特化している。文献に報告されている知見に基づいて、様々なアプローチが提供されている。例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎは、Ｋｏｌｅ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ（２０１２）１１：１２５－４０によって報告されているように、非架橋酸素の硫黄での置換（ホスホロチオエート、ＰＳ）が、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するために使用されていることに注目している。リボース２’位の改変は、ヌクレオチド間リン酸結合のヌクレアーゼ耐性を改善する一方で、二重鎖安定性（Ｔｍ）を増加させることが報告されており、これは免疫活性化からの防御を提供することも報告されている。小さい、耐容性の良い２’－置換（２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－ヒドロ）を伴う中等度のＰＳ骨格改変の組み合わせは、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００４）４３２：１７３－７８によって報告されているように、インビボでの適用のための高度に安定なｓｉＲＮＡと関連しており、２’－Ｏ－メチル改変は、Ｖｏｌｋｏｖ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（２００９）１９：１９１－２０２によって報告されているように、安定性の改善に有効であることが報告されている。自然免疫応答の誘導を減少させることに関して、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－ヒドロで特定の配列を改変することは、サイレンシング活性を一般に保存しながらＴＬＲ７／ＴＬＲ８相互作用を減少させることが報告されている；例えば、Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２００６）１３：４９４－５０５；及びＣｅｋａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００７）３６５：９０－１０８を参照されたい。２－チオウラシル、偽ウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、及びＮ６－メチルアデノシンなどの更なる改変もまた、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８によって媒介される免疫効果を最小限にすることが報告されている；例えば、Ｋ．Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００５）２３：１６５－７５を参照されたい。
当技術分野で公知であり、市販されているように、例えば、コレステロール、トコフェロール及び葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー、及びアプタマーを含む、細胞による送達及び／又は取り込みを増強することができる多数のコンジュゲートを、本明細書での使用のためにＲＮＡなどのポリヌクレオチドに適用することができる；例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．（２０１３）４：７９１－８０９、及びそこに引用される参考文献を参照されたい。
送達
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法で使用される任意の核酸分子、例えば、本開示のゲノム標的化核酸及び／又は部位特異的ポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達のために送達ビヒクル中又は送達ビヒクルの表面上にパッケージングされる。送達ビヒクルには、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、及びミセルが含まれるが、これらに限定されない。当技術分野で記載されるように、様々な標的化部分を使用して、このようなビヒクルと所望の細胞型又は位置との優先的な相互作用を増強し得る。
本開示の複合体、ポリペプチド、及び核酸は、ウイルス又はバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などによって細胞に導入することができる。
実施形態において、ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）及び／又はエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）は、当技術分野で公知のウイルス又は非ウイルス送達ビヒクルによって送達される。或いは、部位特異的ポリペプチドは、エレクトロポレーション又は脂質ナノ粒子など、当技術分野で公知のウイルス又は非ウイルス送達ビヒクルによって送達することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のポリペプチドとして、単独で、又は１つ以上のｇＲＮＡと予め複合体化されて、又は１つ以上のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとのいずれかで送達される。
実施形態において、ポリヌクレオチドは、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正に荷電したペプチド、小分子ＲＮＡコンジュゲート、アプタマー－ＲＮＡキメラ、及びＲＮＡ－融合タンパク質複合体を含むが、これらに限定されない非ウイルス送達ビヒクルによって送達される。いくつかの例示的な非ウイルス送達ビヒクルは、Ｐｅｅｒ及びＬｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（２０１１）１８：１１２７－３３（これは、他のポリヌクレオチドの送達にも有用なｓｉＲＮＡのための非ウイルス送達ビヒクルに焦点を当てている）に記載されている。
実施形態において、ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、及びエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって細胞又は対象に送達される。
核酸のためのいくつかの非ウイルス送達方法が、動物モデル及びヒトの両方において試験されているが、最も開発されたシステムは、脂質ナノ粒子である。ＬＮＰは、一般に、イオン化可能なカチオン性脂質と、３つ以上の更なる成分（一般に、コレステロール、ＤＯＰＥ、及び脂質を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ））とから構成される（例えば、実施例１を参照されたい）。カチオン性脂質は、正に荷電した核酸に結合して、核酸を分解から保護する高密度複合体を形成することができる。マイクロ流体システムを通過する間に、成分は自己集合して、５０～１５０ｎＭのサイズ範囲の粒子を形成し、ここで核酸はコアに封入され、カチオン性脂質と複合体化され、脂質二重層様構造によって囲まれる。対象の循環への注射後、これらの粒子は、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）に結合することができる。ａｐｏＥは、ＬＤＬ受容体のリガンドであり、受容体介在性エンドサイトーシスを介して肝臓の肝細胞への取り込みを媒介する。このタイプのＬＮＰは、げっ歯類、霊長類、ヒトの肝臓の肝細胞にｍＲＮＡ及びｓｉＲＮＡを効率よく送達することが報告されている。エンドサイトーシスの後、ＬＮＰは、エンドソームに存在する。封入された核酸は、カチオン性脂質のイオン化可能な性質によって媒介されるエンドソーム脱出のプロセスを経る。これは、ｍＲＮＡがコードされたタンパク質に翻訳され得る細胞質に核酸を送達する。従って、いくつかの実施形態では、ＬＮＰへのＣａｓ９をコードするｇＲＮＡ及びｍＲＮＡの封入は、静脈内注射後に肝細胞に両方の成分を効率的に送達するために使用される。エンドソーム脱出後、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡはＣａｓ９タンパク質に翻訳され、ｇＲＮＡと複合体を形成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質配列への核局在化シグナルの包接は、核へのＣａｓ９タンパク質／ｇＲＮＡ複合体の転位を促進する。或いは、小ｇＲＮＡは、核孔複合体を通過し、核内でＣａｓ９タンパク質と複合体を形成する。いったん核内に入ると、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、相同な標的部位についてゲノムをスキャンし、ゲノム中の所望の標的部位で優先的に二本鎖切断を生成する。インビボでのＲＮＡ分子の半減期は短く、数時間から数日程度である。同様に、タンパク質の半減期は短くなる傾向があり、数時間から数日程度である。従って、いくつかの実施形態では、ＬＮＰを使用するｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡの送達は、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の一過性の発現及び活性のみを生じ得る。これは、オフターゲット切断の頻度を減少させる利点を提供し得、従って、いくつかの実施形態では、遺伝毒性のリスクを最小限にする。ＬＮＰは、一般に、ウイルス粒子よりも免疫原性が低い。多くのヒトは、ＡＡＶに対する既存の免疫を有するが、ＬＮＰに対する既存の免疫はない。ＬＮＰに対する追加的且つ適応的な免疫応答が生じる可能性は低く、これによりＬＮＰの反復投与が可能となる。
治療コード配列がセーフハーバー遺伝子座のような宿主ゲノム遺伝子座に組込まれる、遺伝子編集に基づく遺伝子治療を対象に投与する場合、対象に最適な治療利益を提供する遺伝子発現のレベルを達成することは有利であろう。例えば、血友病Ａにおいて、血液中のＦＶＩＩＩタンパク質の最も望ましいレベルは、正常レベルの２０％～１００％、３０％～１００％、４０％～１００％、又は５０％～１００％の範囲であろう。ＡＡＶゲノムのエピソームコピーからの治療コード配列の発現を駆動するために強力なプロモーターを使用する標準的なＡＡＶベースの遺伝子治療は、ＡＡＶウイルスを１回だけ投与することができ、達成される発現レベルが対象間で著しく異なる（Ｓ．Ｒａｎｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２０１７）３７７：２５１９－３０）ため、達成される発現レベルの制御を可能にしない。対象にＡＡＶウイルスを投与した後、彼又は彼女は、前臨床モデルに基づき、ウイルスの効果的な再投与を防止することが期待されるウイルスカプシドタンパク質に対する高力価抗体を発現する（Ｈ．Ｐｅｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（２００８）１５：５４－６０）。ＡＡＶウイルスによって送達される治療遺伝子がアルブミンイントロン１のようなセーフハーバー遺伝子座においてゲノムに組込まれ、この標的化組込みは、ゲノムにおける二本鎖切断の生成を介して起こる１つのアプローチは、標的化組込みのレベル、ひいては、治療コード配列産物のレベルを制御する機会を提供する。肝臓が合成ＦＶＩＩＩをコードするドナーＤＮＡカセットを含むＡＡＶゲノムを封入したＡＡＶによって形質導入された後、ＡＡＶゲノムは、形質導入された細胞の核内でエピソーム的に維持される。これらのエピソームＡＡＶゲノムは、ある時間にわたり比較的安定であるため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって作成された二本鎖切断での標的化組込みのためのドナー鋳型のプールを提供する。
いくつかの異なるイオン化可能なカチオン性脂質が、ＬＮＰにおける使用のために開発されている。これらには、とりわけ、Ｃ１２－２００（Ｋ．Ｔ．Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２０１０）１０７：１８６４－６９）、ＭＣ３（Ｍ．Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ（２０１２）５１：８５２９－３３）、ＬＮ１６、及びＭＤ１（Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第８７５４０６２号明細書）が含まれる。Ｃ１２－２００は、１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）である。ＬＮＰの一タイプにおいて、ＧａｌＮａｃ部分はＬＮＰの外側に結合され、アシアロ糖タンパク質受容体を介した肝臓への取り込みのためのリガンドとして作用する。これらのカチオン性脂質のいずれも、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡの肝臓への送達のためのＬＮＰを処方するために使用される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約１０００ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、又は２５ｎｍ未満の直径を有する。或いは、ナノ粒子のサイズは、約１～１０００ｎｍ、１～５００ｎｍ、１～２５０ｎｍ、２５～２００ｎｍ、２５～１００ｎｍ、３５～７５ｎｍ、又は２５～６０ｎｍの範囲であり得る。
ＬＮＰは、カチオン性、アニオン性、又は中性脂質から作製することができる。融合性リン脂質ＤＯＰＥ又は膜成分コレステロールのような中性脂質は、トランスフェクション活性及びナノ粒子安定性を増強するために「ヘルパー脂質」としてＬＮＰに含まれ得る。カチオン性脂質の限界には、不十分な安定性及び迅速なクリアランス、並びに炎症性又は抗炎症性応答の発生による低い効力が含まれ得る。ＬＮＰはまた、疎水性脂質、親水性脂質、又は疎水性及び親水性脂質の両方を有し得る。
当技術分野で公知の任意の脂質又は脂質の組み合わせを使用して、ＬＮＰを生成することができる。ＬＮＰを生成するために使用される脂質の例としては、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ－コレステロール、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ－ＤＰｙＰＥ、及びＧＬ６７Ａ－ＤＯＰＥ－ＤＭＰＥ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。カチオン性脂質の例としては、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、及び７Ｃ１が挙げられる。中性脂質の例としては、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭが挙げられる。ＰＥＧ改変脂質の例としては、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４、及びＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０が挙げられる。
実施形態において、脂質は、ＬＮＰを生成するために、任意の数のモル比で組み合わせることができる。更に、ポリヌクレオチドは、ＬＮＰを生成するために、広範囲のモル比で脂質と組み合わされ得る。
実施形態において、部位特異的ポリペプチド及びゲノム標的化核酸は、各々、細胞又は対象に別々に投与され得る。部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に予め複合体化され得る。次いで、予め複合体化された材料を、細胞又は対象に投与することができる。このような予め複合体化材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られている。
ＲＮＡは、ＲＮＡやＤＮＡと特異的な相互作用を形成することができる。この特性は、多くの生物学的プロセスにおいて利用されるが、核酸に富む細胞環境における無差別な相互作用のリスクも伴う。この問題に対する１つの解決策は、ＲＮＡがエンドヌクレアーゼと予め複合体化されたリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）を形成することである。ＲＮＰの別の利点は、ＲＮＡが分解から保護されることである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＰ中のエンドヌクレアーゼは、改変されていても改変されていなくてもよい。同様に、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡは、改変されていても改変されていなくてもよい。多数の改変が当技術分野で公知であり、使用され得る。
エンドヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡは、一般に、約１：１のモル比で組み合わされる。或いは、エンドヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、約１：１：１のモル比で組み合わせることができる。しかしながら、広範囲のモル比を用いてＲＮＰを生成することができる。
いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶベクターが送達のために使用される。送達されるべきポリヌクレオチド、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能を含む、パッケージングされるべきＡＡＶゲノムが細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を生成するための技術は、当技術分野で標準的である。ｒＡＡＶの生成は、以下の成分が単一の細胞（パッケージング細胞として本明細書に示される）内に存在することを必要とする：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別々の（即ち、ｒＡＡＶゲノム中ではない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、限定されないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、及びＡＡＶ ｒｈ．７４を含む、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型に由来し得、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際特許出願国際公開第０１／８３６９２号パンフレットに開示されている。表１を参照されたい。
Figure 2023520262000010
いくつかの実施形態では、パッケージング細胞を作製する方法は、ＡＡＶ粒子産生に必要な成分を安定に発現する細胞株を作製することを含む。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノムを有するプラスミド（又は複数のプラスミド）、ｒＡＡＶゲノムとは別個のＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子のような選択マーカーは、細胞のゲノムに組込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８２）７９：２０７７－８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｃ．Ａ．Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９８３）２３：６５－７３）、及び直接平滑末端連結（Ｐ．Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８４）２５９：４６６１－６６）などの手順によって、細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスで感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模生産に適していることである。他の適切な方法は、ｒＡＡＶゲノム並びに／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するために、プラスミドではなくアデノウイルス又はバキュロウイルスを使用する。
ｒＡＡＶ生成の一般原理は、例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｃｕｒ Ｏｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９２）３（５）：５３３－３９；及びＮ．Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１５８：９７－１２９に考察されている。いくつかのアプローチは、Ｊ．Ｄ．Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８４）４：２０７２－８１；Ｐ．Ｌ．Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８４）８１：６４６６－７０；Ｊ．Ｄ．Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８５）５：３２５１－６０；Ｓ．Ｋ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９８８）６２：１９６３－７３；Ｊ．Ｓ．Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８８）８：３９８８－９６；Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９８９）６３：３８２２－２８）；米国特許第５，１７３，４１４号明細書；国際公開第９５／１３３６５号パンフレット及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号明細書；国際公開第９５／１３３９２号パンフレット；国際公開第９６／１７９４７号パンフレット；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００号明細書；国際公開第９７／０９４４１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３号明細書）；国際公開第９７／０８２９８号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２号明細書）；国際公開第９７／２１８２５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７号明細書）；国際公開第９７／０６２４３号パンフレット（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４号明細書）；国際公開第９９／１１７６４号パンフレット；Ｐ．Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９５）１３：１２４４－５０；Ｒ．Ｗ．Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（１９９３）４：６０９－１５；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（１９９６）３：１１２４－３２；米国特許第５，７８６，２１１号明細書；米国特許第５，８７１，９８２号明細書；並びに米国特許第６，２５８，５９５号明細書に記載されている。
ＡＡＶベクター血清型は、標的細胞型に一致させることができる。例えば、以下の例示的な細胞型は、とりわけ、示されるＡＡＶ血清型によって形質導入され得る。例えば、肝臓組織／細胞型に適切なＡＡＶベクターの血清型には、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９が含まれるが、これらに限定されない。
アデノ関連ウイルスベクターに加えて、他のウイルスベクターを使用することができる。そのようなウイルスベクターには、レンチウイルス、アルファウイルス、エンテロウイルス、ペスチウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、アルブミン遺伝子の１つ又は２つの遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡ、及びドナーＤＮＡは、各々別々に脂質ナノ粒子に処方されるか、又は全て１つの脂質ナノ粒子に共処方されるか、又は２つ以上の脂質ナノ粒子に共処方される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に処方され、一方、ｓｇＲＮＡ及びドナーＤＮＡは、ＡＡＶベクター中に送達される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に共処方され、一方、ドナーＤＮＡは、ＡＡＶベクター中に送達される。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＤＮＡプラスミドとして、ｍＲＮＡとして、又はタンパク質として送達する選択肢が利用可能である。ガイドＲＮＡは、同じＤＮＡから発現され得るか、又はＲＮＡとしても送達され得る。ＲＮＡは、その半減期を変更若しくは改善するか、又は免疫応答の可能性若しくは程度を減少させるために、化学的に改変され得る。エンドヌクレアーゼタンパク質は、送達の前にｇＲＮＡと複合体化され得る。ウイルスベクターは、効率的な送達を可能にする：Ｃａｓ９の分割バージョン及びＣａｓ９のより小さいオルソログが、ＨＤＲのドナーと同様に、ＡＡＶ中にパッケージングされ得る。これらの成分の各々を送達することができる一連の非ウイルス送達方法も存在し、又は非ウイルス及びウイルス方法をタンデムで使用することができる。例えば、ナノ粒子は、タンパク質及びガイドＲＮＡを送達するために使用することができ、一方、ＡＡＶは、ドナーＤＮＡを送達するために使用することができる。
治療処置のためのゲノム編集成分の送達に関連するいくつかの実施形態では、少なくとも２つの成分、配列特異的ヌクレアーゼ及びＤＮＡドナー鋳型が、形質転換される細胞（例えば、肝細胞）の核に送達される。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、肝臓に対して向性を有するＡＡＶにパッケージングされる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６又はＡＡＶ－ＤＪから選択される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶパッケージされたＤＮＡドナー鋳型は、対象に投与され、例えばまず末梢静脈注射によって、続いて配列特異的ヌクレアーゼによって、対象に投与される。ＡＡＶパッケージドナー鋳型を最初に送達する利点は、送達されたドナー鋳型が形質導入された肝細胞の核において安定に維持され、これにより、配列特異的ヌクレアーゼのその後の投与が可能になることである。これによりゲノムに二本鎖切断が生じ、続いてＨＤＲ又はＮＨＥＪによるドナー鋳型の組込みが起こる。いくつかの実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼは、所望の治療効果に十分なレベルで導入遺伝子の標的化組込みを促進するのに必要な時間だけ、標的細胞内で活性を維持することが望ましい。配列特異的ヌクレアーゼが長期間にわたって細胞内で活性のままである場合、これは、オフターゲット部位での二本鎖切断の頻度の増加をもたらす。具体的には、オフターゲット切断の頻度は、オフターゲット切断効率にヌクレアーゼが活性を示す時間を乗じた関数である。配列特異的ヌクレアーゼをｍＲＮＡの形態で送達することにより、ｍＲＮＡと翻訳されたタンパク質は細胞内で短命であるため、ヌクレアーゼ活性の持続時間は、数時間から数日の範囲で短くなる。従って、ドナー鋳型をすでに含む細胞への配列特異的ヌクレアーゼの送達は、オフターゲット組込みと比較して、標的化組込みのより良好な比を生じることが予想される。更に、末梢静脈注射後の肝細胞の核へのドナー鋳型のＡＡＶ媒介送達は、ウイルスが細胞に感染し、エンドソームを脱出して核に移行し、宿主成分による一本鎖ＡＡＶゲノムの二本鎖ＤＮＡ分子への変換に要する時間に起因して、一般に１～１４日程度の時間を要する。従って、いくつかの実施形態では、核へのドナー鋳型の送達は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を供給する前に完了し、それはこれらのヌクレアーゼ成分が約１～３日間活性であるためである。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり、これはアルブミン遺伝子のイントロン１内のＤＮＡ配列に指向されたｓｇＲＮＡとＣａｓ９ヌクレアーゼとから構成される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に作動可能に融合されたＣａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡとして送達される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子にパッケージされた肝細胞に送達される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、脂質Ｃ１２－２００を含む（Ｋ．Ｔ．Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２０１０）１０７：１８６４－６９）。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ中にパッケージングされたｓｇＲＮＡとＣａｓ９ ｍＲＮＡの比は、１：１（質量比）であり、それによりマウスにおいてインビボで最大のＤＮＡ切断を生じる。代替の実施形態において、ＬＮＰ中にパッケージングされたｓｇＲＮＡとＣａｓ９ ｍＲＮＡの異なる質量比、例えば、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１若しくは２：１、又は逆比を使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡは、別々のＬＮＰ製剤にパッケージングされ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含むＬＮＰは、ｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの約１～約８時間前に対象に送達されて、ｓｇＲＮＡの送達前にＣａｓ９ ｍＲＮＡが翻訳される最適な時間を可能にする。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡを封入するＬＮＰ製剤（「ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤」）が、対象、例えば、ＡＡＶにパッケージングされたＤＮＡドナー鋳型を以前に投与された対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤は、ＡＡＶドナー鋳型の投与後１日～２８日以内、又は７日～２８日以内、又は７日～１４日以内に対象に投与される。ＡＡＶドナー鋳型に対するＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の送達の最適なタイミングは、当技術分野で公知の技術（例えば、マウス及びサルを含む動物モデルにおいて行われる研究）を用いて決定され得る。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡドナー鋳型は、非ウイルス送達方法を使用して、対象の肝細胞（例えば、対象）に送達される。ある対象（一般に３０％）は、ＡＡＶによる効果的な遺伝子送達を妨げる、最も一般に使用されるＡＡＶ血清型に指向される既存の中和抗体を有するが、全ての対象は、非ウイルス送達方法で処置可能である。いくつかの非ウイルス送達方法論は、当技術分野で公知である。特に、ＬＮＰは、動物及びヒトにおける静脈内注射後に、それらの封入されたカーゴを肝細胞の細胞質に効率的に送達することが知られている。これらのＬＮＰは、受容体を介したエンドサイトーシスの過程を経て肝臓に能動的に取り込まれ、その結果、肝臓への優先的な取り込みが起こる。
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型の核局在化を促進するために、プラスミドの核局在化を促進することができるＤＮＡ配列、例えば、サルウイルス４０（ＳＶ４０）複製起点及び初期プロモーターの３６６ｂｐ領域をドナー鋳型に付加することができる。細胞タンパク質に結合する他のＤＮＡ配列もまた、ＤＮＡの核侵入を改善するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、導入されたＦＶＩＩＩの発現又は活性のレベルは、ＡＡＶドナー鋳型の後に、例えば、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼ又はＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の最初の投与後に、対象の血液（例えば、対象）中で測定される。ＦＶＩＩＩレベルが疾患を処置するのに十分でない場合、例えば、正常レベルの５％のレベルの場合には、ゲノムセーフハーバー遺伝子座への更なる標的化組込みを促進するために、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の２回目又は３回目の投与を行うことができる。所望の治療レベルのＦＶＩＩＩを得るために複数用量のＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤を使用することの実現可能性は、当技術分野で公知の技術（例えば、マウス及びサルを含む動物モデルを使用する試験）を用いて試験され、最適化され得る。
ｉ）ドナーカセットを含むＡＡＶドナー鋳型、及びｉｉ）対象へのＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の投与を含む、本明細書に記載される方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の最初の用量は、対象へのＡＡＶドナー鋳型の投与後約１日～約２８日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の最初の用量は、標的細胞の核へのドナー鋳型の送達を可能にするのに十分な時間後に対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の最初の用量は、標的細胞の核における一本鎖ＡＡＶゲノムの二本鎖ＤＮＡ分子への変換を可能にするのに十分な時間後に対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の１つ以上（例えば、２、３、４、５以上）の更なる用量が、最初の用量の投与後に対象に投与される。いくつかの実施形態では、ドナーカセットの標的化組込みの標的レベル及び／又はドナーカセットの標的発現レベルが達成されるまで、１つ以上の用量のＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤が対象に投与される。いくつかの実施形態では、この方法は、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の各投与後に、ドナーカセットの標的化組込みのレベル及び／又はドナーカセットの発現のレベルを測定することと、ドナーカセットの標的化組込みの標的レベル及び／又はドナーカセットの標的発現レベルが達成されない場合、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の更なる用量を投与することとを更に含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の更なる用量の少なくとも１つの量は、最初の用量と同じである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の更なる用量の少なくとも１つの量は、最初の用量より少ない。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の更なる用量の少なくとも１つの量は、最初の用量より多い。
遺伝子改変細胞及び細胞集団
一態様において、本開示は、細胞内のゲノムを編集する方法を提供し、それによって遺伝子改変細胞を作り出す。いくつかの態様では、遺伝子改変細胞の集団が提供される。従って、「遺伝子改変細胞」は、ゲノム編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムを使用する）によって導入された少なくとも１つの遺伝子改変を有する細胞を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変肝細胞である。外因性ゲノム標的化核酸及び／又はゲノム標的化核酸をコードする外因性核酸を有する遺伝子改変細胞が、本明細書で意図される。
いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、合成ＦＶＩＩＩコード配列の核酸配列を細胞のゲノム配列に挿入することによって編集され得る。いくつかの実施形態では、ゲノム編集に供される細胞は、そのような突然変異を有さない正常における発現と比較して、内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現低下をもたらすゲノム中の１つ以上の突然変異を有する。正常細胞は、ＦＶＩＩＩ遺伝子欠陥を有さない異なる対象を起源とする（又は単離された）健康又は対照細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ゲノム編集に供される細胞は、ＦＶＩＩＩ遺伝子関連状態又は障害の処置を必要とする対象を起源とする（又は単離される）ことができる。従って、いくつかの実施形態では、このような細胞における内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現は、正常細胞における内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子発現と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％減少している。
導入遺伝子（例えば、合成ＦＶＩＩＩコード配列をコードする核酸）の挿入が成功すると、細胞における導入された合成ＦＶＩＩＩコード配列の発現は、細胞の内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１，０００％、約２，０００％、約３，０００％、約５，０００％、約１０，０００％以上であり得る。いくつかの実施形態では、ゲノム編集細胞における合成ＦＶＩＩＩコード配列を含む、導入されたＦＶＩＩＩコード配列産物の活性は、細胞の内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１，０００％、約２，０００％、約３，０００％、約５，０００％、約１０，０００％以上であり得る。いくつかの実施形態では、細胞内の導入された合成ＦＶＩＩＩコード配列の発現は、細胞の内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現の少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約５０倍、約１００倍、約１０００倍以上である。また、いくつかの実施形態では、ゲノム編集細胞内の導入された合成ＦＶＩＩＩコード配列の活性は、正常な健康な細胞内のＦＶＩＩＩ遺伝子産物の活性に匹敵するか、又はそれより大きくなり得る。
血友病Ａを処置又は改善するための実施形態において、遺伝子編集の主要な標的は、ヒト細胞である。エクスビボ及びインビボ方法におけるいくつかの実施形態では、ヒト細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態では、必要としている対象に由来する（従って、すでに対象と完全に一致している）自己細胞において遺伝子編集を行うことによって、対象に安全に再導入することができ、対象の疾患に関連する１つ以上の臨床状態を改善するのに有効であろう細胞集団を効果的に生じさせることができる細胞を生成することが可能である。このような処置のためのいくつかの実施形態では、肝細胞は、当技術分野で公知の任意の方法に従って単離され、遺伝子改変された、治療的に有効な細胞を作製するために使用される。一実施形態において、肝臓幹細胞は、エクスビボで遺伝子改変され、次いで対象に再導入され、そこで、それらは、挿入されたＦＶＩＩＩコード配列を発現する遺伝子改変肝細胞又は類洞内皮細胞を生じる。
治療アプローチ
血友病は、「軽度」（ＦＶＩＩＩタンパク血清中濃度０．４０～０．０５ＩＵ／ｍＬ）、「中等度」（０．０５～０．０１ＩＵ／ｍＬ）、又は「重度」（０．０１ＩＵ／ｍＬ未満、正常の１％未満）に分類される（Ｇ．Ｃ．Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ（２００１）８５（３）：５６０－７５）。ＦＶＩＩＩ補充タンパク療法を受けている血友病Ａ患者の解析は、正常の３％、５％、１０％、１５％、２０％の予測ＦＶＩＩＩトラフ値では、出血が起こらない頻度は、各々７１％、７９％、９１％、９７％、１００％と報告している（Ｇ．Ｓｐｏｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１４）１２４：６８９）。このことから、ＦＶＩＩＩ値が最低値の１５～２０％を超えて維持された場合、出血性事象の割合は、０近くまで低下することが示唆される。血友病Ａの治癒に必要な正確なＶＩＩＩレベルは明らかにされておらず、対象間で異なる可能性が高いが、約５％～約３０％のレベルは、出血性事象の有意な減少をもたらすと予想される。
一態様において、対象のゲノムを編集することによって、対象における血友病Ａを処置する遺伝子治療アプローチが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、遺伝子治療アプローチは、機能的合成ＦＶＩＩＩコード配列を対象の関連する細胞型のゲノムに組込み、血友病Ａの永久的治癒を提供する。いくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩコード配列は、多くのタンパク質を効率的に発現し、血液中に分泌するため、肝細胞に組込まれる。更に、肝細胞が分裂するにつれて組込まれたコード配列が娘細胞に伝達されることから、肝臓が十分に成長していない小児対象に、肝細胞を用いたこの組込みアプローチを考慮することができる。
別の態様では、合成ＦＶＩＩＩコード配列を遺伝子座にノックインし、ＦＶＩＩＩタンパク質活性を回復させることによってゲノムに永久的な変化を生じさせるためにゲノム操作ツールを使用するための細胞エクスビボ及びインビボ方法が本明細書に提供される。このような方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼを使用して、ゲノムからの任意の配列を永久的に欠失、挿入、編集、修正、若しくは置換するか、又はゲノム遺伝子座に外因性配列（例えば、合成ＦＶＩＩＩコード配列）を挿入する。このようにして、本開示に記載される例は、（対象の生涯にわたって潜在的な治療を送達するのではなく）単一の処置でＦＶＩＩＩ遺伝子の活性を回復させる。
いくつかの実施形態では、エクスビボ細胞ベースの治療は、対象から単離された肝細胞を使用する。これらの細胞の染色体ＤＮＡを、本明細書に記載される材料及び方法を用いて編集する。最後に、編集された細胞及び／又はそれらの子孫を対象に投与又は埋込む。
エクスビボ細胞治療アプローチの１つの利点は、投与前に治療の包括的分析を実施する能力である。ヌクレアーゼベースの治療薬は、あるレベルのオフターゲット効果を有する。エクスビボで遺伝子修正を行うことにより、投与前に修正細胞集団の特徴を明らかにすることができる。本開示の態様には、任意のオフターゲット切断が対象に対する最小のリスクと関連するゲノム位置にあることを保証するために、修正細胞のゲノム配列を決定することが含まれる。更に、クローン集団を含む特定の細胞の集団を、投与又は埋込み前にスクリーニング又は単離し得る。
別の実施形態は、インビボベースの治療である。この方法では、対象の細胞の染色体ＤＮＡを、本明細書に記載の材料及び方法を用いて修正する。いくつかの実施形態では、細胞は肝細胞である。
インビボ遺伝子治療の利点は、治療的生産及び投与の容易さである。同じ治療アプローチ及び治療を用いて、２つ以上の対象、例えば、同じ又は類似の遺伝子型又は対立遺伝子を共有する多数の対象を処置することができる。対照的に、エクスビボ細胞治療は、一般に、単離され、操作され、同じ対象に戻される対象自身の細胞を使用する。
いくつかの実施形態では、対象は血友病Ａの症状を有する。いくつかの実施形態では、対象は、血友病Ａを有する疑いのあるヒトである。或いは、対象は、血友病Ａのリスクがあると診断されたヒトである。いくつかの実施形態では、処置を必要とする対象は、内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子又はその調節配列に１つ以上の遺伝的欠陥（例えば、欠失、挿入、及び／又は突然変異）を有し、その結果、ＦＶＩＩＩタンパク質の活性（発現レベル又は機能性を含む）が、正常な健康な対象と比較して実質的に減少している。
いくつかの実施形態では、対象における血友病Ａを処置する方法であって、以下を対象中の細胞に提供することを含む方法が本明細書に提供される：（ａ）細胞ゲノムにおけるアルブミン遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ；（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び（ｃ）合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、アルブミン遺伝子のイントロン１を標的とする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７１～２９８のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態では、対象における血友病Ａを処置する方法であって、以下を対象中の細胞に提供することを含む方法が本明細書に提供される：（ａ）配列番号２７１～２９８のいずれか１つからのスペーサー配列を含むｇＲＮＡ；（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び（ｃ）合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７４、２７５、２８１、及び２８３のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７４からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２７５からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２８１からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２８３からのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞、例えばヒト肝細胞である。いくつかの実施形態では、対象は、血友病Ａを有するか、又はその疑いがある対象である。いくつかの実施形態では、対象は、血友病Ａのリスクがあると診断される。
本明細書に記載される血友病Ａを処置する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、並びにそれらの機能的等価物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ｓｐＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ＳｌｕＣａｓ９である。
本明細書に記載される血友病Ａを処置する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩコード配列をコードする核酸配列は、細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。
本明細書に記載される血友病Ａを処置する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、この方法は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を使用する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞、例えばヒト肝細胞である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡプラスミドなどのＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡである。
本明細書に記載される血友病Ａを処置する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ＡＡＶベクターにコードされる。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、ドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。いくつかの実施形態では、ドナーカセットの両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ標的部位は、投与されるｇＲＮＡの標的部位である。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位は、投与されるｇＲＮＡの細胞ゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型を細胞に提供することは、ドナー鋳型を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内である。
本明細書に記載される血友病Ａを処置する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソーム又はＬＮＰ中に処方される。いくつかの実施形態では、リポソーム又はＬＮＰはまた、ｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、細胞にｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を提供することは、対象にリポソーム又はＬＮＰを投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内である。いくつかの実施形態では、リポソーム又はＬＮＰは、ＬＮＰである。いくつかの実施形態では、この方法は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸及びｇＲＮＡを含むＬＮＰを使用する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。
本明細書に記載される血友病Ａを処置する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡと予め複合体化され、ＲＮＰ複合体を形成する。
ＡＡＶが肝臓の細胞を含む細胞に感染するプロセスは、エンドソームからの脱出、ウイルスの脱殻及びＡＡＶゲノムの核への輸送を含む。一本鎖ゲノムがウイルスにパッケージングされる、これらの研究で用いられたＡＡＶの場合、一本鎖ゲノムは、第二鎖ＤＮＡ合成のプロセスを経て二本鎖ＤＮＡゲノムを形成する。一本鎖ゲノムの二本鎖ゲノムへの完全な変換に必要な時間は、十分に確立されていないが、律速段階であると考えられる（Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９９６）７０：３２２７－３４）。次いで、二本鎖線状ゲノムは、頭部から尾部及び尾部から頭部に結合したモノマーから構成される多量体環状形態にコンカテマー化される（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２０１０）２１：７５０－６２）。
本明細書に記載される血友病Ａを処置する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、投与されるｇＲＮＡ及び投与されるＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー鋳型が細胞に提供された後に、細胞に提供される。いくつかの実施形態では、投与されるｇＲＮＡ及び投与されるＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー鋳型が細胞に提供されて４日を超えた後に細胞に提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー鋳型が細胞に提供された少なくとも１４日後に細胞に提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ドナー鋳型が細胞に提供された少なくとも１７日後に細胞に提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼを細胞に提供することは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸及びｇＲＮＡを含むＬＮＰを対象に（例えば静脈内経路によって）投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型を細胞に提供することは、ＡＡＶベクターにコードされるドナー鋳型を対象に（例えば、静脈内経路によって）投与することを含む。
本明細書に記載の血友病Ａを処置する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の更なる用量が、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の第１の用量に続いて細胞に提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の更なる用量は、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列の標的化組込みの標的レベル及び／又は合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列の標的発現レベルが達成されるまで、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の第１の用量に続いて細胞に提供される。いくつかの実施形態では、細胞にｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼを提供することは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸及びｇＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を対象に（例えば静脈内経路によって）投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。
本明細書に記載される血友病Ａを処置する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列は、内因性トランスフェリンプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列は、内因性フィブリノーゲン－α鎖プロモーターの制御下で発現される。
本明細書に記載される血友病Ａを処置する方法のいずれかに従ういくつかの実施形態では、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列は、対象の肝臓で発現される。
対象への細胞の送達
いくつかの実施形態では、本開示のエクスビボ方法は、ゲノム編集細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む。これは、当技術分野で公知の非経口投与の任意の方法を使用して達成され得る。例えば、遺伝子改変細胞は、対象の血液中に直接注射され得るか、肝臓中若しくはその近くに直接注射され得る（埋込まれ得る）か、又は別様に対象に投与され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、所望の効果が生成されるように、所望の部位において導入された細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路によって、遺伝子改変治療細胞を対象に埋込み又は「移植」することを含む。治療細胞又はそれらの分化した子孫は、埋込まれた細胞又は細胞の成分の少なくとも一部が生存可能なままである、対象における所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって導入することができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間ほどの短さ、例えば、２４時間～数日、数年ほどの長さ、又は対象の生涯、即ち長期生着であり得る。
予防的に提供される場合、本明細書に記載される治療細胞は、血友病Ａの任意の症状の前に対象に投与される。従って、いくつかの実施形態では、遺伝子改変肝細胞集団の予防的投与は、血友病Ａ症状の発生を予防するために役立つ。
いくつかの実施形態において治療的に提供される場合、遺伝子改変肝細胞は、血友病Ａの症状又は兆候の開始時（又は後）、例えば、疾患の開始時に提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って投与される治療的肝細胞集団は、１つ以上のドナーから得られる同種異系肝細胞を有する。「同種異系」は、同じ種の１つ以上の異なるドナーから得られた肝細胞又は肝細胞を有する生物学的サンプルを指し、ここで１つ以上の遺伝子座における遺伝子は、同一ではない。例えば、対象に投与される肝細胞集団は、１つ以上の無関係なドナー対象、又は１つ以上の同一でない兄弟姉妹に由来し得る。いくつかの実施形態では、遺伝的に同一の動物から、又は同一の双生児から得られるもののような、同一遺伝子肝細胞集団を使用することができる。他の実施形態では、肝細胞は、自己細胞であり；即ち、肝細胞は、対象から得られるか又は単離され、同じ対象に投与され、即ち、ドナー及びレシピエントは、同じである。
一実施形態では、有効量は、血友病Ａの少なくとも１つ以上の徴候又は症状を予防又は軽減するために必要な治療細胞集団の量を指し、所望の効果、例えば血友病Ａを有する対象を処置するために十分な量の組成物に関連する。従って、実施形態では、治療有効量は、血友病Ａを有するか、又は血友病Ａのリスクがある対象などの対象に投与された場合に特定の効果を促進するのに十分な治療細胞又は治療細胞を有する組成物の量を指す。有効量はまた、疾患の症状の発症を予防若しくは遅延させ、疾患の症状の経過を変化させ（例えば、限定されないが、疾患の症状の進行を遅延させ）、又は疾患の症状を逆転させるのに十分な量を含む。任意の所与の場合について、適切な有効量は、当業者によって決定され得ることが理解される。
本明細書に記載される実施形態における使用のために、治療細胞、例えば、ゲノム編集肝細胞の有効量は、少なくとも約１０２細胞、少なくとも約５×１０２細胞、少なくとも約１０３細胞、少なくとも約５×１０３細胞、少なくとも約１０４細胞、少なくとも約５×１０４細胞、少なくとも約１０５細胞、少なくとも約２×１０５細胞、少なくとも約３×１０５細胞、少なくとも約４×１０５細胞、少なくとも約５×１０５細胞、少なくとも約６×１０５細胞、少なくとも約７×１０５細胞、少なくとも約８×１０５細胞、少なくとも約９×１０５細胞、少なくとも約１×１０６細胞、少なくとも約２×１０６細胞、少なくとも約３×１０６細胞、少なくとも約４×１０６細胞、少なくとも約５×１０６細胞、少なくとも約６×１０６細胞、少なくとも約７×１０６細胞、少なくとも約８×１０６細胞、少なくとも約９×１０６細胞、又はそれらの倍数であり得る。治療細胞は、１つ以上のドナーに由来するか、又は自己供給源から得られる。本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、治療細胞は、それを必要とする対象への投与前に、培養物中で増殖される。
いくつかの実施形態では、血友病Ａを有する対象の細胞において発現される機能性ＦＶＩＩＩのレベルの中程度及び漸増的増加は、疾患の１つ以上の症状を改善するために、長期生存を増加させるために、及び／又は他の処置に関連する副作用を減少させるために有益である。このような細胞をヒト対象に投与すると、増加したレベルの機能性ＦＶＩＩＩを産生する治療細胞の存在が有益である。いくつかの実施形態では、対象の有効な処置は、処置された対象における全ＦＶＩＩＩに対して、少なくとも約１％、３％、５％又は７％の機能性ＦＶＩＩＩを生じる。いくつかの実施形態では、機能性ＦＶＩＩＩは、全ＦＶＩＩＩの少なくとも約１０％である。いくつかの実施形態では、機能性ＦＶＩＩＩは、全ＦＶＩＩＩの少なくとも、約、又は最大で２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％である。同様に、機能性ＦＶＩＩＩのレベルが有意に上昇した細胞の比較的限られた亜集団を導入することさえも、いくつかの状況においては正常化された細胞が疾患細胞に対して選択的優位性を有するため、対象において有益である。しかしながら、機能性ＦＶＩＩＩのレベル上昇を伴う中程度のレベルの治療細胞でさえも、対象における血友病Ａの１つ以上の態様を改善するために有益である。いくつかの実施形態では、細胞が投与される対象における治療薬の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％以上が、増加したレベルの機能性ＦＶＩＩＩを産生する。
実施形態において、方法又は経路による対象への治療細胞組成物の送達は、所望の部位における細胞組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす。細胞組成物は、対象において効果的な処置をもたらす任意の適切な経路によって投与することができ、即ち、投与は、送達される組成物の少なくとも一部、即ち、少なくとも約１×１０４細胞が所望の部位にある期間送達される、対象における所望の位置への送達をもたらす。投与様式には、注射、注入、点滴、又は摂取が含まれる。「注射」は、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）、嚢下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内注射及び注入を含む。いくつかの実施形態では、経路は、静脈内である。細胞の送達のために、投与は、注射又は注入によるものであり得る。
一実施形態では、細胞は全身に投与され、換言すれば、治療細胞の集団は、標的部位、組織、又は器官に直接ではなく投与され、その結果、それは、代わりに、対象の循環系に入り、従って、代謝及び他の同様のプロセスに供される。
血友病Ａの処置のための組成物を有する処置の効力は、熟練した臨床医によって決定され得る。しかしながら、機能性ＦＶＩＩＩの徴候若しくは症状のいずれか１つ以上、一例として機能性ＦＶＩＩＩのレベルが有益な様式で変化する（例えば、少なくとも１０％増加する）か、又は疾患の他の臨床的に許容される症状若しくはマーカーが向上若しくは改善される場合、処置は有効な処置と考えられる。有効性は、入院又は医学的介入（例えば、疾患の進行が停止するか、又は少なくとも遅くなる）の必要性により評価される、個体の悪化の失敗により測定することもできる。これらの指標を測定する方法は当業者に公知であり、及び／又は本明細書に記載される。処置は、個体又は動物（いくつかの非限定的な例は、ヒト又は哺乳動物を含む）における疾患の任意の処置を含み、以下を含む：（１）疾患を阻害すること（例えば、症状の進行を停止又は遅延させること）；又は（２）疾患を軽減すること（例えば、症状の退行を引き起こすこと）；及び（３）症状の発症の可能性を予防又は減少させること。
組成物
一態様では、本開示は、本明細書に開示される方法を実施するための組成物を提供する。組成物は、以下の１つ以上を含み得る：ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）；部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）又は部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び本明細書に開示される方法の所望の遺伝子改変をもたらすために挿入されるポリヌクレオチド（例えば、ドナー鋳型）。
いくつかの実施形態では、組成物は、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、ゲノムに挿入されるポリヌクレオチド（例えば、ドナー鋳型）を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、（ｉ）ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）又は部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、（ｉ）ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）ゲノムに挿入されるポリヌクレオチド（例えば、ドナー鋳型）を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、（ｉ）部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）又は部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）ゲノムに挿入されるポリヌクレオチド（例えば、ドナー鋳型）を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、（ｉ）ゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）部位特異的ポリペプチド又は部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）ゲノムに挿入されるポリヌクレオチド（例えば、ドナー鋳型）を有する。
上記組成物のいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、単一分子ガイドゲノム標的化核酸を有する。上記組成物のいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、２分子ゲノム標的化核酸を有する。上記組成物のいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上の２分子ガイド又は単一分子ガイドを有する。いくつかの実施形態では、組成物は、核酸標的化核酸をコードするベクターを有する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、特にＣａｓ９である。
いくつかの実施形態では、組成物は、ゲノム編集、特に、細胞のゲノムへの合成ＦＶＩＩＩコード配列の挿入に適切な１つ以上のｇＲＮＡを含む。組成物のためのｇＲＮＡは、内因性アルブミン遺伝子で、その中で、又はその近くでゲノム部位を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、アルブミン遺伝子における、その中における、又はその近くにおけるゲノム配列に相補的なスペーサー配列を有する。
いくつかの実施形態では、組成物のｇＲＮＡは、配列番号２７１～２９８及びその変異体のいずれかから選択される配列であり、該変異体は、配列番号２７１～２９８のいずれかと少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の同一性又は相同性を有する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの変異体は、配列番号２７１～２９８のいずれかと少なくとも約８５％の相同性を有する。
いくつかの実施形態では、組成物のｇＲＮＡは、ゲノム中の標的部位に相補的なスペーサー配列を有する。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５塩基～２０塩基長である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列とゲノム配列との間の相補性は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％である。
いくつかの実施形態では、組成物は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、若しくはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、及び／又は合成ＦＶＩＩＩコード配列の核酸配列を有するドナー鋳型を有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、任意のオリゴヌクレオチド又は核酸配列のうちの１つ以上は、ＡＡＶベクターにコードされる。従って、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＡＡＶベクターにコードされる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＡＡＶベクターにコードされる。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ＡＡＶベクターにコードされる。いくつかの実施形態では、２つ以上のオリゴヌクレオチド又は核酸配列は、単一のＡＡＶベクターにコードされる。従って、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列及びＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、単一のＡＡＶベクターにコードされる。
いくつかの実施形態では、組成物は、リポソーム又は脂質ナノ粒子を有する。従って、いくつかの実施形態では、組成物の任意の化合物（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はそれをコードする核酸、ｇＲＮＡ、及びドナー鋳型）は、リポソーム又はＬＮＰ中に処方され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のそのような化合物は、共有結合又は非共有結合を介してリポソーム又はＬＮＰと結合する。いくつかの実施形態では、化合物のいずれかは、リポソーム又はＬＮＰ中に別々に又は一緒に含まれる。従って、いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はそれをコードする核酸、ｇＲＮＡ及びドナー鋳型の各々は、リポソーム又はＬＮＰ中に別々に処方される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡと共にリポソーム又はＬＮＰ中に処方される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はそれをコードする核酸、ｇＲＮＡ、及びドナー鋳型は、リポソーム又はＬＮＰ中に一緒に処方される。
いくつかの実施形態では、上記の組成物は、１つ以上の更なる試薬を更に有し、このような更なる試薬は、緩衝液、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを細胞に導入するための緩衝液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照ベクター、対照ＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからのポリペプチドのインビトロ産生のための試薬、配列決定のためのアダプターなどから選択される。緩衝液は、安定化緩衝液、再構成緩衝液、希釈緩衝液などであり得る。いくつかの実施形態では、組成物はまた、エンドヌクレアーゼによるＤＮＡのオンターゲット結合又は切断を促進又は増強するために、又は標的化の特異性を改善するために使用することができる１つ以上の成分を含む。
いくつかの実施形態では、組成物の任意の成分は、特定の投与様式及び剤形に応じて、担体、溶媒、安定剤、アジュバント、希釈剤などの薬学的に許容され得る賦形剤と共に処方される。実施形態において、ガイドＲＮＡ組成物は、一般に、製剤及び投与経路に応じて、生理学的に適合性のｐＨ、及び約３のｐＨ～約１１のｐＨ、約ｐＨ３～約ｐＨ７の範囲を達成するように処方される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約ｐＨ５．０～約ｐＨ８．０の範囲に調整される。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の薬学的に許容され得る賦形剤と一緒に、治療有効量の本明細書に記載される少なくとも１つの化合物を有する。場合により、組成物は、本明細書に記載される化合物の組み合わせを有することができ、細菌増殖の処置又は予防に有用な第２の活性成分（例えば、限定されないが、抗細菌剤又は抗微生物剤）を含むことができ、本開示の試薬の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上の他のオリゴヌクレオチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、及び／又はドナー鋳型と共に処方される。或いは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸及びドナー鋳型は、別々に、又は他のオリゴヌクレオチドと組み合わせて、ｇＲＮＡ製剤について上記した方法で処方される。
適切な賦形剤には、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性ウイルス粒子などの、大きくゆっくりと代謝される高分子を含む担体分子が含まれる。他の例示的な賦形剤には、酸化防止剤（例えば、限定されないが、アスコルビン酸）、キレート剤（例えば、限定されないが、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、限定されないが、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、及びヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、限定されないが、油、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノール）、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが含まれる。
いくつかの実施形態では、組成物の任意の化合物（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はそれをコードする核酸、ｇＲＮＡ、及びドナー鋳型）は、エレクトロポレーションなどのトランスフェクションを介して送達される。いくつかの例示的な実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、細胞への供給の前に、ｇＲＮＡと予め複合体化され、ＲＮＰ複合体を形成し、ＲＮＰ複合体は、エレクトロポレーションされる。このような実施形態において、ドナー鋳型は、エレクトロポレーションを介して送達され得る。
いくつかの実施形態では、「組成物」は、エクスビボ処置方法において使用される治療細胞を有する治療組成物を指す。
実施形態では、治療組成物は、細胞組成物と一緒に生理学的に耐容可能な担体、及び場合により、本明細書に記載されるような少なくとも１つの更なる生物活性剤を、活性成分としてそこに溶解又は分散させて含有する。いくつかの実施形態では、治療組成物は、治療目的のために哺乳動物又はヒト対象に投与される場合、実質的に免疫原性ではない。
一般に、本明細書に記載される遺伝子改変治療細胞は、薬学的に許容され得る担体と共に懸濁液として投与される。当業者は、細胞組成物中に使用される薬学的に許容され得る担体が、緩衝剤、化合物、凍結保存剤、保存剤、又は対象に送達される細胞の生存能を実質的に妨害する量の他の薬剤を含まないことを認識するであろう。細胞を有する製剤は、例えば、細胞膜の完全性を維持することを可能にする浸透圧緩衝液、及び場合により、投与時に細胞生存能を維持するか又は生着を増強するための栄養素を含むことができる。このような製剤及び懸濁液は、当業者に公知であり、及び／又は本明細書に記載されるように、細胞と共に使用するために適合され得る。
いくつかの実施形態では、細胞組成物はまた、乳化手順が細胞生存能に悪影響を及ぼさないことを条件として、乳化され得るか、又はリポソーム組成物として提示され得る。細胞及び任意の他の活性成分は、薬学的に許容され得、活性成分と適合性である賦形剤と、本明細書に記載される治療方法における使用に適した量で混合され得る。
細胞組成物に含まれる更なる薬剤は、その中の成分の薬学的に許容され得る塩を含むことができる。薬学的に許容され得る塩としては、無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、又は酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と共に形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩も、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄、及び有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導され得る。
生理学的に耐容可能な担体は、当技術分野で周知である。例示的な液体担体は、活性成分及び水に加えて材料を含まないか、又は生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウムなどの緩衝液、生理的食塩水、若しくはその両方、例えばリン酸緩衝食塩水を含む滅菌水溶液である。更に、水性担体は、２つ以上の緩衝塩、並びに塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、及び他の溶質を含むことができる。液体組成物はまた、水に加えて、そして水を排除して、液相を含むことができる。そのような付加的な液相の例としては、グリセリン、綿実油などの植物油、及び水－油エマルションが挙げられる。特定の障害又は状態の処置において有効である細胞組成物において使用される活性化合物の量は、障害又は状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定され得る。
キット
いくつかの実施形態は、上記の組成物のいずれか、例えば、ゲノム編集のための組成物、又は治療細胞組成物、及び１つ以上の更なる成分を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態では、キットは、所望の目的、例えば、ゲノム編集又は細胞治療のために、組成物と同時に又は連続して投与することができる１つ以上の更なる治療剤を有することができる。
いくつかの実施形態では、キットは、本方法を実施するためにキットの構成要素を使用するための説明書を更に含むことができる。本方法を実施するための説明書は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙又はプラスチックなどの基材上に印刷され得る。説明書は、添付文書としてキットに、キットの容器又はその構成要素（即ち、パッケージング又はサブパッケージングに関連する）のラベル付けなどに存在することができる。説明書は、適切なコンピュータ読み取り可能な記憶媒体、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する電子記憶データファイルとして存在することができる。場合によっては、実際の説明書は、キットには存在しないが、遠隔ソースから（例えば、インターネットを介して）説明書を取得するための手段が提供される。この実施形態の例は、説明書を見ることができる、及び／又は説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、指示書を得るための方法が適切な基材上に記録され得る。
更なる治療アプローチ
遺伝子編集は、特定の配列を標的とするように操作された部位特異的ポリペプチドを使用して行うことができる。現在までに、このようなヌクレアーゼには、４つの主なタイプが存在する：メガヌクレアーゼ及びその機能的等価物、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、並びにＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳヌクレアーゼシステム。ヌクレアーゼプラットフォームは、特にＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの特異性がタンパク質－ＤＮＡ相互作用によるものである一方、ＲＮＡ－ＤＮＡ相互作用は、主にＣａｓタンパク質を誘導するので、設計の困難さ、標的化密度及び作用様式において変化する。Ｃａｓ９切断には、隣接モチーフであるＰＡＭも必要であり、これは、異なるＣＲＩＳＰＲシステム間で異なる。化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９は、ＮＲＧ ＰＡＭを使用して切断するが、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣＲＩＳＰＲは、ＮＮＮＮＧＡＴＴ（配列番号３１２）、ＮＮＮＮＮＧＴＴＴ（配列番号３１３）及びＮＮＮＮＧＣＴＴ（配列番号３１４）を含むＰＡＭを有する部位で切断することができる。多数の他のＣａｓ９オルソログは、代替ＰＡＭに隣接するプロトスペーサーを標的とする。
Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、本開示の方法の実施形態において使用することができる。更に、治療標的部位などの本明細書に記載される教示は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、若しくはＭｅｇａＴＡＬなどの他の形態のエンドヌクレアーゼに適用することができ、又はヌクレアーゼの組み合わせを使用することができる。しかしながら、このようなエンドヌクレアーゼに本開示の教示を適用するためには、とりわけ、特定の標的部位に指向されたタンパク質を操作する必要があるであろう。
特異性を増加させるために、更なる結合ドメインをＣａｓ９タンパク質に融合させることができる。これらの構築物の標的部位は、同定されたｇＲＮＡ特定部位にマッピングされるが、亜鉛フィンガードメインなどのための更なる結合モチーフを必要とする。Ｍｅｇａ－ＴＡＬの場合、メガヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに融合され得る。メガヌクレアーゼドメインは、特異性を増加させ、切断を提供することができる。同様に、不活化又は「死んだ」Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）は、切断ドメインに融合され得、融合されたＤＮＡ結合ドメインのためのｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位及び隣接結合部位を必要とする。これは、更なる結合部位なしに結合を減少させるために、触媒不活化に加えて、ｄＣａｓ９のいくつかのタンパク質操作を必要とするであろう。
いくつかの実施形態では、本開示に従ってゲノムを編集する組成物及び方法（例えば、ＦＶＩＩＩコード配列のアルブミン遺伝子座への挿入）は、以下のアプローチのいずれかを使用する。
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＩＩ型エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインに連結された、操作された亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを有するモジュラータンパク質である。ＦｏｋＩは二量体としてのみ機能するので、一対のＺＦＮを操作して、反対のＤＮＡ鎖上の同族標的「半部位」配列に結合し、それらの間に正確な間隔を置いて、触媒的に活性なＦｏｋＩ二量体の形成を可能にする必要がある。ＦｏｋＩドメインが二量体化すると（それ自体は配列特異性を有さない）、ゲノム編集の開始段階として、ＺＦＮの半部位間にＤＮＡ二本鎖切断が生じる。
各ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、一般に、豊富なＣｙｓ２－Ｈｉｓ２構造の３～６個の亜鉛フィンガーを有し、各フィンガーは、主に標的ＤＮＡ配列の一方の鎖上のヌクレオチドのトリプレットを認識するが、４番目のヌクレオチドとの鎖間相互作用も重要であり得る。ＤＮＡと重要な接触を行う位置でのフィンガーのアミノ酸の変化は、所与のフィンガーの配列特異性を変化させる。従って、４フィンガー亜鉛フィンガータンパク質は、１２ｂｐの標的配列を選択的に認識し、ここで標的配列は、各フィンガーによって寄与されるトリプレット優先の複合体であるが、トリプレット優先は、隣接するフィンガーによって様々な程度に影響され得る。ＺＦＮの重要な側面は、単に個々のフィンガーを改変することによって、ほとんど全てのゲノムアドレスに容易に再標的化できることであるが、これをうまく行うためには、相当な専門知識が必要である。ＺＦＮのほとんどの適用において、４～６フィンガーのタンパク質が使用され、各々１２～１８ｂｐを認識する。従って、一対のＺＦＮは、一般に、半部位間の５～７ｂｐスペーサーを含まない、２４～３６ｂｐの組み合わされた標的配列を認識する。結合部位は、１５～１７ｂｐを含むより大きいスペーサーで更に分離することができる。この長さの標的配列は、設計過程で反復配列又は遺伝子相同体が除外されると仮定すると、ヒトゲノムでは独特である可能性が高い。それにもかかわらず、ＺＦＮタンパク質－ＤＮＡ相互作用は、その特異性において絶対的なものではないので、２つのＺＦＮ間のヘテロ二量体として、又は、ＺＦＮの一方若しくは他方のホモ二量体として、オフターゲット結合及び切断事象が起こる。後者の可能性は、ＦｏｋＩドメインの二量体化界面を操作して、「プラス」及び「マイナス」変異体（偏性ヘテロ二量体変異体としても知られる）を作製することによって効果的に排除されており、これは互いに二量体化することのみ可能であり、それ自体で二量体化しない。偏性ヘテロ二量体を強制すると、ホモ二量体の形成が妨げられる。これは、ＺＦＮ、及びこれらのＦｏｋＩ変異体を採用する任意の他のヌクレアーゼの非常に増強された特異性を有する。
様々なＺＦＮベースのシステムが当技術分野で記載されており、その修正が定期的に報告されており、多数の参考文献がＺＦＮの設計を誘導するために使用される規則及びパラメーターを記載している；例えば、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９９）９６（６）：２７５８－６３；Ｂ．Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０００）３０３（４）：４８９－５０２；Ｑ．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２００２）２７７（６）：３８５０－６；Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００５）２８０（４２）：３５５８８－９７；及びＤｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６（３１）：２９４６６－７８を参照されたい。
転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＴＡＬＥＮは、ＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合ドメインがＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに連結され、一対のＴＡＬＥＮがタンデムに作用して標的化ＤＮＡ切断を達成する別の形式のモジュラーヌクレアーゼを表す。ＺＦＮとの主な相違点は、ＤＮＡ結合ドメインの性質、及び関連する標的ＤＮＡ配列認識特性である。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインはＴＡＬＥタンパク質に由来し、これはもともと植物の細菌病原体キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）にて記載されていた。ＴＡＬＥは、３３～３５アミノ酸反復のタンデムアレイを有し、各反復は、一般に長さが２０ｂｐまでの標的ＤＮＡ配列中の単一塩基対を認識し、４０ｂｐまでの全標的配列長を与える。各反復のヌクレオチド特異性は、１２位及び１３位の２つのアミノ酸のみを含む反復可変二残基（ＲＶＤ）によって決定される。塩基グアニン、アデニン、シトシン、及びチミンは、４つのＲＶＤ：各々、Ａｓｎ－Ａｓｎ、Ａｓｎ－Ｉｌｅ、Ｈｉｓ－Ａｓｐ、及びＡｓｎ－Ｇｌｙによって主に認識される。これは、亜鉛フィンガーよりもはるかに単純な認識コードを構成し、従って、ヌクレアーゼ設計について後者よりも有利である。それにもかかわらず、ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質－ＤＮＡ相互作用は、その特異性において絶対的ではなく、ＴＡＬＥＮもまた、オフターゲット活性を減少させるためのＦｏｋＩドメインの偏性ヘテロ二量体変異体の使用から利益を得る。
ＦｏｋＩドメインの更なる変異体が作製されており、これらは、それらの触媒機能において不活性化されている。ＴＡＬＥＮ対又はＺＦＮ対のどちらかの半分が不活性なＦｏｋＩドメインを含む場合には、ＤＳＢではなく、標的部位で一本鎖ＤＮＡ切断（ニッキング）のみが起こることになる。結果は、Ｃａｓ９切断ドメインの１つが不活性化されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１「ニッカーゼ」突然変異体の使用と同等である。ＤＮＡニックは、ＨＤＲによるゲノム編集を駆動するのに使用できるが、ＤＳＢの場合よりも低い効率である。主な利点は、ＮＨＥＪを介した誤修復を起こしやすいＤＳＢとは異なり、オフターゲットニックが迅速且つ正確に修復されることである。
様々なＴＡＬＥＮベースのシステムが当技術分野で記載されており、その修正が定期的に報告されている：例えば、Ｂｏｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６（５９５９）：１５０９－１２；Ｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３５（６０６９）：７１６－９；及びＭｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６（５９５９）：１５０１を参照されたい。「Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ」プラットフォーム又はクローニングスキームに基づくＴＡＬＥＮの使用は、複数のグループによって記載されている：例えば、Ｔ．Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１１）３９（１２）：ｅ８２；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１１）３９（１４）：６３１５－２５；Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１１）６（２）：ｅ１６７６５；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２０１４）４１（６）：３３９－４７、Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｃａｎ １７；及びＴ．Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０１５）１２３９：１３３－５９を参照されたい。
ホーミングエンドヌクレアーゼ
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）は、長い認識配列（１４～４４塩基対）を有し、高い特異性で－多くの場合、ゲノムに特有の部位で－ＤＮＡを切断する部位特異的エンドヌクレアーゼである。真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア、及びファージを含む広範囲の宿主に由来する、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号６）、ＧＩＹ－ＹＩＧ、Ｈｉｓ－Ｃｉｓボックス、Ｈ－Ｎ－Ｈ、ＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、及びＶｓｒ様を含む、それらの構造によって分類されるＨＥの少なくとも６つの公知のファミリーが存在する。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥを使用して、ゲノム編集の初期段階として標的遺伝子座にＤＳＢを作製することができる。更に、いくつかの天然及び操作されたＨＥは、ＤＮＡの一本鎖のみを切断し、それにより部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥの大きい標的配列及びそれらが提供する特異性は、それらを、部位特異的ＤＳＢを作製するための魅力的な候補としている。
様々なＨＥベースのシステムが当技術分野で記載されており、それらの修正が定期的に報告されている：例えば、Ｓｔｅｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１４）２４（８）：６６３－８０；Ｂｅｌｆｏｒｔ ａｎｄ Ｂｏｎｏｃｏｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０１４）１１２３：１－２６；Ｈａｆｅｚ ａｎｄ Ｈａｕｓｎｅｒ、Ｇｅｎｏｍｅ（２０１２）５５（８）：５５３－６９による考察；並びにそこに引用される参考文献を参照されたい。
ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ－ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
ハイブリッドヌクレアーゼの更なる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォーム及びＴｅｖ－ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと触媒活性ＨＥとの融合を使用し、ＴＡＬＥの調節可能なＤＮＡ結合及び特異性、並びにＨＥの切断配列特異性の両方を利用する：例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１４）４２：２５９１－６０１；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇ３（２０１４）４：１１５５－６５；及びＢｏｉｓｓｅｌ ａｎｄ Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１５）１２３９：１７１－９６を参照されたい。
更なる変形では、ＭｅｇａＴｅｖ構造は、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）とＧＩＹ－ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼＩ－ＴｅｖＩ（Ｔｅｖ）に由来するヌクレアーゼドメインとの融合である。２つの活性部位は、ＤＮＡ基質上に約３０ｂｐ離れて位置し、非適合性付着末端を有する２つのＤＳＢを生成する；例えば、Ｗｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１４）４２：８８１６－２９を参照されたい。既存のヌクレアーゼベースのアプローチの他の組み合わせが進化し、本明細書に記載される標的化ゲノム改変を達成する際に有用であることが予想される。
ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ又はｄＣｐｆ１－Ｆｏｋ１及び他のヌクレアーゼ
上記のヌクレアーゼプラットフォームの構造的及び機能的特性を組み合わせることにより、固有の欠点のいくつかを潜在的に克服し得るゲノム編集への更なるアプローチが提供される。一例として、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集システムは、一般に、ＤＳＢを作製するために単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用する。標的化の特異性は、標的ＤＮＡとワトソン－クリック塩基対を形成するガイドＲＮＡ中の２０又は２２のヌクレオチド配列によって駆動される（化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９の場合は、隣接するＮＡＧ又はＮＧＧ ＰＡＭ配列中の更なる２塩基を加える）。このような配列は、ヒトゲノム中で独特であるのに十分長いが、ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性は絶対的ではなく、特に標的配列の５’半分では、時に顕著な乱交が許容され、特異性を駆動する塩基の数を効果的に減少させる。これに対する１つの解決策は、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１触媒機能を完全に不活性化し（ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合機能のみを保持する）、代わりにＦｏｋＩドメインを不活性化Ｃａｓ９に融合することであった（例えば、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２０１４）３２：５６９－７６；及びＧｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２０１４）３２：５７７－８２を参照されたい）。ＦｏｋＩは、触媒活性になるために二量体化しなければならないので、二量体を形成し、ＤＮＡを切断するために、２つのＦｏｋＩ融合物を密接につなぎ留めるために２つのガイドＲＮＡが必要である。このことは、組み合わせた標的部位における塩基の数を本質的に２倍にし、それによって、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムによる標的化のストリンジェンシーを増加させる。
更なる例として、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＩ－ＴｅｖＩのような触媒活性ＨＥへの融合は、ＴＡＬＥの調節可能なＤＮＡ結合及び特異性、並びにＩ－ＴｅｖＩの切断配列特異性の両方を利用し、オフターゲット切断を更に減少させることができると予想される。
本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の添付の説明に記載される。本開示の他の特徴、目的、及び利点は、以下の説明から明らかになるであろう。本明細書において、単数形は、文脈が明らかにそうではないことを指示しない限り、複数形も含む。特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、本明細書が優先する。
本明細書に記載された例及び実施形態は、単に例示を目的とし、それらに照らした修正又は変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組込まれる。
本明細書に提供される開示のいくつかの実施形態は、以下の非限定的な例によって更に例示される。
例示的な実施形態
実施形態１。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はｇＲＮＡをコードする核酸；及び合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型であって、合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を含み、Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を含むドナー鋳型を含むシステム。
実施形態２。Ｂドメイン置換が、０～６個のＮ結合グリコシル化部位を含む、実施形態１に記載のシステム。
実施形態３。Ｂドメイン置換が、０～３個のＮ結合グリコシル化部位を含む、実施形態２に記載のシステム。
実施形態４。Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６９、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のシステム。
実施形態５。Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６６、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列、又は配列番号３６２～３６６、３７１、及び３７３のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体を含む、実施形態４に記載のシステム。
実施形態６。Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６４、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態５に記載のシステム。
実施形態７。宿主細胞遺伝子座が、肝臓で発現される遺伝子の遺伝子座である、実施形態１～６のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態８。宿主細胞遺伝子座が、急性期タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座である、実施形態１～７のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態９。急性期タンパク質が、アルブミン、トランスフェリン、又はフィブリノーゲンである、実施形態８に記載のシステム。
実施形態１０。宿主細胞遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、実施形態１～７のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１１。ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、並びにその機能的誘導体からなる群から選択される、実施形態１～１０のいずれか１つのシステム。
実施形態１２。ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、実施形態１１に記載のシステム。
実施形態１３。ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１４。ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１５。ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１６。ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡがｍＲＮＡである、実施形態１５に記載のシステム。
実施形態１７。ドナー鋳型核酸配列が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１８。ドナー鋳型核酸配列が、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする野生型核酸配列と比較して、ＣｐＧジヌクレオチドの減少した含有量を含む、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１９。ドナー鋳型核酸配列がＣｐＧジヌクレオチドを含まない、実施形態１８に記載のシステム。
実施形態２０。ドナー鋳型が、ＡＡＶベクターにコードされる、実施形態１～１９のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態２１。ドナー鋳型が、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、ドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、実施形態１～２０のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態２２。ドナーカセットの両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、実施形態２１に記載のシステム。
実施形態２３。ドナーカセットの５’側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、実施形態２１に記載のシステム。
実施形態２４。ｇＲＮＡ標的部位が、システム中のｇＲＮＡの標的部位である、実施形態２１～２３のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態２５。ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位が、システム中のｇＲＮＡに対するゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、実施形態２４に記載のシステム。
実施形態２６。ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、リポソーム又は脂質ナノ粒子中に含まれる、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態２７。リポソーム又は脂質ナノ粒子がｇＲＮＡも含む、実施形態２６に記載のシステム。
実施形態２８。ＤＮＡエンドヌクレアーゼがｇＲＮＡと複合体化され、それによってリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を提供する、実施形態１～２７のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態２９。宿主細胞内のゲノムを編集する方法であって、（Ａ）宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸；（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び（ｃ）合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型を細胞に提供することを含み、合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を含み、Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を含む、方法。
実施形態３０。Ｂドメイン置換が、０～６個のＮ結合グリコシル化部位を含む、実施形態２９に記載の方法。
実施形態３１。Ｂドメイン置換が、０～３個のＮ結合グリコシル化部位を含む、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３２。Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６９、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態２９に記載の方法。
実施形態３３。Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６６、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列、又は配列番号３６２～３６６、３７１、及び３７３のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体を含む、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３４。Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６４、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３５。宿主細胞内因性遺伝子座が、肝臓で発現される遺伝子の遺伝子座である、実施形態２９～３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３６。宿主細胞内因性遺伝子座が、急性期タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座である、実施形態２９～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３７。急性期タンパク質が、アルブミン、トランスフェリン、又はフィブリノーゲンである、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８。宿主細胞内因性遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、実施形態２９～３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９。ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、若しくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；又はその機能的誘導体からなる群から選択される、実施形態２９～３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４０。ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、実施形態３９に記載の方法。
実施形態４１。ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態２９～４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４２。ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、実施形態２９～４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４３。ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、実施形態２９～４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４４。ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡがｍＲＮＡである、実施形態４３に記載の方法。
実施形態４５。ドナー鋳型がＡＡＶベクターにコードされる、実施形態２９に記載の方法。
実施形態４６。ドナー鋳型核酸配列が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態２９～４５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４７。ドナー鋳型核酸配列が、ＦＶＩＩＩをコードする野生型核酸配列と比較して、ＣｐＧジヌクレオチドの減少した含有量を含む、実施形態２９～４６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４８。ドナー鋳型核酸配列がＣｐＧジヌクレオチドを含まない、実施形態４７方法。
実施形態４９。ドナー鋳型が、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、ドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、実施形態２９～４８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５０。ドナーカセットの両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、実施形態４９に記載の方法。
実施形態５１。ドナーカセットの５’側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、実施形態４９に記載の方法。
実施形態５２。ｇＲＮＡ標的部位が、投与されるｇＲＮＡの標的部位である、実施形態４９～５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５３。ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位が、投与されるｇＲＮＡの細胞ゲノム中のｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、実施形態５２に記載の方法。
実施形態５４。ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、リポソーム又は脂質ナノ粒子中に処方される、実施形態２９～５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５。リポソーム又は脂質ナノ粒子がｇＲＮＡも含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態５６。ＤＮＡエンドヌクレアーゼ及びｇＲＮＡが、ｇＲＮＡと予め複合体化されたＤＮＡエンドヌクレアーゼを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として宿主細胞に提供される、実施形態２９～５５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５７。ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、ドナー鋳型が細胞に提供されて４日を超えた後に細胞に提供される、実施形態２９～５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５８。ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、ドナー鋳型が細胞に提供された少なくとも１４日後に細胞に提供される、実施形態２９～５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５９。ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の更なる用量が、ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の第１の用量に続いて細胞に提供される、実施形態５７又は５８に記載の方法。
実施形態６０。ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は核酸の１つ以上の更なる用量が、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列の標的化組込みの標的レベルが達成されるか、又は合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列の標的発現レベルが達成されるまで、ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の第１の用量に続いて細胞に提供される、実施形態５９に記載の方法。
実施形態６１。細胞が肝臓細胞である、実施形態２９～６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６２。細胞がヒト肝細胞又はヒト類洞上皮細胞である、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６３。細胞であって、細胞のゲノムが合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＤＮＡを含み、合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を含み、Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を含む、細胞。
実施形態６４。合成ＦＶＩＩＩタンパク質が、内因性アルブミンプロモーター、内因性トランスフェリンプロモーター、又は内因性フィブリノーゲンαプロモーターに作動可能に連結される、実施形態６３に記載の細胞。
実施形態６５。合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列が、細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態６３に記載の細胞。
実施形態６６。細胞がヒト肝臓細胞である、実施形態６３に記載の細胞。
実施形態６７。細胞がヒト肝細胞又はヒト類洞上皮細胞である、実施形態６６に記載の細胞。
実施形態６８。実施形態２９～６２のいずれか１つに記載の方法によって調製される、実施形態６７に記載の細胞。
実施形態６９。対象における血友病Ａを処置する方法であって、以下：（ａ）宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸；（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び（ｃ）合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型であって、合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を含み、Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を含む、ドナー鋳型を対象の細胞に提供することを含む、方法。
実施形態７０。Ｂドメイン置換が、０～６個のＮ結合グリコシル化部位を含む、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７１。Ｂドメイン置換が、０～３個のＮ結合グリコシル化部位を含む、実施形態７０に記載の方法。
実施形態７２。Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６９、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態２９に記載の方法。
実施形態７３。Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６６、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列、又は配列番号３６２～３６６、３７１、及び３７３のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体を含む、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７４。Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６４、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態７３に記載の方法。
実施形態７５。宿主細胞遺伝子座が、肝臓で発現される遺伝子の遺伝子座である、実施形態６９～７４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７６。宿主細胞遺伝子座が、急性期タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座である、実施形態６９～７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７７。急性期タンパク質が、アルブミン、トランスフェリン、又はフィブリノーゲンである、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７８。宿主細胞遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、実施形態６９～７４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７９。ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；又はその機能的誘導体からなる群から選択される、実施形態６９～７８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８０。ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、実施形態７９に記載の方法。
実施形態８１。Ｃａｓ９がｓｐＣａｓ９又はＳｌｕＣａｓ９である、実施形態８０に記載の方法。
実施形態８２。ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態６９～８１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８３。ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、実施形態６９～８２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８４。ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、実施形態６９～８２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８５。ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡがｍＲＮＡである、実施形態８４に記載の方法。
実施形態８６。ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、及びドナー鋳型のうちの１つ以上が、リポソーム又は脂質ナノ粒子中に処方される、実施形態６９～８５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８７。ドナー鋳型がＡＡＶベクターにコードされる、実施形態６９～８６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８８。ドナー鋳型核酸配列が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態６９～８７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８９。ドナー鋳型核酸配列が、ＦＶＩＩＩをコードする野生型核酸配列と比較して、ＣｐＧジヌクレオチドの減少した含有量を含む、実施形態６９～８８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９０。ドナー鋳型核酸配列がＣｐＧジヌクレオチドを含まない、実施形態８９に記載の方法。
実施形態９１。ドナー鋳型が、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、ドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、実施形態６９～９０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９２。ドナーカセットの両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、実施形態９１に記載の方法。
実施形態９３。ドナーカセットの５’側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、実施形態９１に記載の方法。
実施形態９４。ｇＲＮＡ標的部位がｇＲＮＡの標的部位である、実施形態９１～９３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９５。ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位が、ｇＲＮＡに対する細胞ゲノム中のｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、実施形態９４に記載の方法。
実施形態９６。ドナー鋳型を細胞に提供することが、ドナー鋳型を対象に静脈内投与することを含む、実施形態６９～９５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９７。ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、リポソーム又は脂質ナノ粒子中に処方される、実施形態６９～９６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９８。リポソーム又は脂質ナノ粒子がｇＲＮＡも含む、実施形態９７に記載の方法。
実施形態９９。ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に提供することが、リポソーム又は脂質ナノ粒子を対象に静脈内投与することを含む、実施形態９８に記載の方法。
実施形態１００。ＤＮＡエンドヌクレアーゼ及びｇＲＮＡがリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として宿主細胞に提供され、このＲＮＰ複合体が、ｇＲＮＡと複合体化されたＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む、実施形態６９～９９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０１。ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、ドナー鋳型が細胞に提供されて４日を超えた後に細胞に提供される、実施形態６９～１００のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０２。ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、ドナー鋳型が細胞に提供された少なくとも１４日後に細胞に提供される、実施形態６９～１０１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０３。ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の更なる用量が、ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の第１の用量に続いて細胞に提供される、実施形態１０１又は１０２に記載の方法。
実施形態１０４。ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の更なる用量が、ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の第１の用量に続いて、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列の標的化組込みの標的レベル及び／又は合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列の標的発現レベルが達成されるまで、細胞に提供される、実施形態１０３に記載の方法。
実施形態１０５。ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に提供することが、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸及びｇＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を対象に投与することを含む、実施形態１０１～１０４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０６。ドナー鋳型を細胞に提供することが、ＡＡＶベクターにコードされるドナー鋳型を対象に投与することを含む、実施形態１０１～１０５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０７。細胞が肝細胞である、実施形態６９～１０６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０８。合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列が、対象の肝臓で発現される、実施形態６９～１０７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０９。実施形態６３～６８のいずれか１つに記載の細胞を対象に投与することを含む、対象における血友病Ａを処置する方法。
実施形態１１０。細胞が対象に対して自己である、実施形態１０９に記載の方法。
実施形態１１１。対象から生物学的サンプルを得ることを更に含み、生物学的サンプルが肝臓細胞を含み、細胞が肝臓細胞から調製される、実施形態１１０に記載の方法。
実施形態１１２。使用説明書を更に含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のシステムの１つ以上の要素を含むキット。
実施形態１１３。合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を含み、Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を含む、核酸。
実施形態１１４。Ｂドメイン置換が０～６個のＮ結合グリコシル化部位を含む、実施形態１１３に記載の核酸。
実施形態１１５。Ｂドメイン置換が、０～３個のＮ結合グリコシル化部位を含む、実施形態１１３に記載の核酸。
実施形態１１６。Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６９、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１１３に記載の核酸。
実施形態１１７。Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６４、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列、又は配列番号３６２～３６４、３７１、及び３７３のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体を含む、実施形態１１６に記載の核酸。
実施形態１１８。Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６３、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１１６に記載の核酸。
実施形態１１９。合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態１１３～１１８のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態１２０。合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が、ＦＶＩＩＩをコードする野生型核酸配列と比較して、ＣｐＧジヌクレオチドの減少した含有量を含む、実施形態１１３～１１９のいずれか１項に記載の核酸。
実施形態１２１。合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列がＣｐＧジヌクレオチドを含まない、実施形態１２０に記載の核酸。
実施形態１２２。核酸がウイルスベクターである、実施形態１１３～１２１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態１２３。ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、実施形態１２２に記載の核酸。
実施形態１２４。対象におけるＦＶＩＩＩの量を増加させる方法であって、ＦＶＩＩＩの第１の血清レベルを有する対象の細胞に、以下：（ａ）宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸；（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び（ｃ）合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型であって、合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を含み、Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を含む、ドナー鋳型を提供することを含む、方法。
実施形態１２５。ＶＩＩＩの第１の血清レベルが約０．４０ＩＵ／ｍＬ未満である、実施形態１２４に記載の方法。
実施形態１２６。ＶＩＩＩの第１の血清レベルが約０．０５ＩＵ／ｍＬ未満である、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２７。ＶＩＩＩの第１の血清レベルが約０．０１ＩＵ／ｍＬ未満である、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２８。血友病Ａの処置のための、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のシステムの使用。
実施形態１２９。血友病Ａの処置のための医薬の製造のための、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のシステムの使用。
実施形態１３０。血友病Ａの処置のための、実施形態６３～６８のいずれか１つの細胞の使用。
実施形態１３１。血友病Ａの処置のための医薬の製造のための、実施形態６３～６８のいずれか１つに記載の細胞の使用。
実施形態１３２。血友病Ａの処置のための、実施形態１１２に記載のキットの使用。
実施形態１３３。血友病Ａの処置のための医薬の製造のための、実施形態１１２に記載のキットの使用。
実施形態１３４。血友病Ａの処置のための、実施形態１１３～１２３のいずれか１つに記載の核酸の使用。
実施形態１３５。血友病Ａの処置のための医薬の製造のための、実施形態１１３～１２３のいずれか１つに記載の核酸の使用。
実施形態１３６。Ｂドメイン置換を含み、Ｂドメイン置換は、０～９個のＮ結合グリコシル化部位を含み、長さが約４０アミノ酸以下である、合成ＦＶＩＩＩタンパク質。
実施例１：Ｎ－グリコシル化モチーフを含むアミノ酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断によって媒介されるマウスアルブミンイントロン１への標的化組込み後のＦＶＩＩＩの発現を改善する
構築物設計
ゲノム中にＦＶＩＩＩコード核酸を挿入することの課題は、天然のＦＶＩＩＩコード配列が７０５３ｂｐであり、とりわけアデノ関連ウイルス中にパッケージングすることが困難であることである（ＡＡＶは、Ｃａｓ９のような配列特異的ヌクレアーゼにより作成された二本鎖切断での組込みのための鋳型として、インビボ送達のための４８００～５０００ｂｐの範囲でのパッケージング限界を有する）。この問題を解決するために、出願人らは、改変されたＢドメインを有するＦＶＩＩＩコード配列のセットを設計した。ＦＶＩＩＩのＢドメインは機能に必要ではないが、ＦＶＩＩＩの分泌を改善する。これらのＦＶＩＩＩコード配列は、短いＢドメイン（置換Ｂドメイン）を有する合成ＦＶＩＩＩを発現するように設計された。ゲノムに組込まれた後に、ＦＶＩＩＩタンパク質を産生及び分泌する能力のための置換Ｂドメインを有する合成ＦＶＩＩＩコード配列を評価するために、構築物を設計して、マウスアルブミン遺伝子のイントロン１へのＦＶＩＩＩコード配列の組込みを標的とした。アルブミン遺伝子座は、肝臓細胞において活性である強力なプロモーターを提供し、その結果、この遺伝子座に挿入された適切なＦＶＩＩＩコード配列を、アルブミンプロモーターに作動可能に連結された場合に発現させることができる。
本明細書においてｐＣＢ０７６（配列番号３１６）、ｐＣＢ１００（配列番号３２０）、ｐＣＢ１００３（配列番号３２４）、ｐＣＢ０８５（配列番号３３１９）、又はｐＣＢ０８０（配列番号３１８）と称される一連のプラスミドを、公知の分子生物学技術を用いて構築した。同じｐＵＣ１９ベースの細菌性プラスミド骨格（細菌の複製起点とカナマイシン耐性遺伝子を含む）を、５つの全てのプラスミドに用いた。プラスミドは、以下のエレメント（順に）で構築した：ｇＲＮＡ標的部位（ｇＲＮＡ ｍＡｌｂＴ１について、配列番号３３８、マウスアルブミン遺伝子のエクソン１を標的とする）｜１８ｂｐスペーサー｜スプライスアクセプター部位（ＳＡ）｜ＦＶＩＩＩコード配列｜ポリアデニル化シグナル（「ｓＰＡ」）。プラスミドは、ヒトＦＶＩＩＩコード配列のコドン最適化、及びＢドメイン置換をコードする配列の存在（ｐＣＢ０７６）又は非存在（ｐＣＢ１００、ｐＣＢ１００３、ｐＣＢ０８５、及びｐＣＢ０８０）においてのみ異なっていた。この実施例で使用したＢドメイン置換は、ヒトＦＶＩＩＩ ＢドメインのＮ末端由来の最初の６つのＮ－グリコシル化モチーフからなっていた。
プラスミドｐＣＢ１００、ｐＣＢ１００３、ｐＣＢ０８５及びｐＣＢ０８０は、全て、Ｂドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩのコード配列を含み、Ｂドメインは、「ＳＱリンカー」（アミノ酸ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ、配列番号３３７をコードする）で置換されている。ＳＱリンカーは、プロテアーゼ切断部位（ＲＨＱＲ）を含むが、Ｎ結合グリコシル化部位を欠く。プラスミドｐＣＢ０７６（配列番号３１６）は、ｐＣＢ１００と同じコドン最適化Ｂドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩコード配列（「ｃｏ１」、以下の実施例４参照）と、Ｂドメインの代わりに、ＳＱリンカーに挿入されたヒトＦＶＩＩＩ ＢドメインのＮ末端からの最初の６個のＮ－グリコシル化モチーフに対応する１７個のアミノ酸をコードする更なるＤＮＡ配列（従って、Ｂドメイン置換を形成する）とを含む。他のプラスミドは、以下のコドン最適化を有する：ｐＣＢ１００－ｃｏ１（配列番号３２０）、ｐＣＢ１００３－ｃｏ２（配列番号３２４）、ｐＣＢ０８５－ｃｏ３（配列番号３１９）、及びｐＣＢ０８０－ｃｏ４（配列番号３１８）（以下の実施例４参照）。プラスミドは、ｇＲＮＡ ｍＡＬｂＴ１（ｔｇｃｃａｇｔｔｃｃｃｇａｔｃｇｔｔａｃ、配列番号３３８）を利用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、マウスアルブミン遺伝子のイントロン１において生成される二本鎖切断への標的化組込みのためのドナーであるように設計された。肝臓、特に肝細胞は、この標的化組込みの標的器官である。インビボでの肝細胞は、ほとんどが静止状態であり、非分裂細胞のＤＮＡ中の二本鎖切断を修復する優勢な細胞機構は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）であることが知られている（Ｚ．Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ（２００８）７：２９０２－０６）。線状の二本鎖ＤＮＡ分子（ドナー）及びゲノム中の二本鎖切断の存在下で、ドナーＤＮＡをＮＨＥＪ機構によって二本鎖切断部に挿入することができる。
或いは、ゲノム中の二本鎖切断の末端同士を同じＮＨＥＪ機構で再結合させることができ、この事象は一般にドナー鋳型の挿入よりも頻繁に起こる。ＮＨＥＪによる修復は、エラーを起こしやすいプロセスであり、これは、二本鎖切断部位での挿入又は欠失の導入につながる。細胞のゲノム中の二本鎖切断でのプラスミドとして送達されたドナー鋳型の標的化組込みは、ドナープラスミドにヌクレアーゼの切断部位を含めることによって増強され得る。プラスミドは環状分子であるので、二本鎖切断での組込みの鋳型とはならない。プラスミドに単一のガイドＲＮＡ切断部位を含めると、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の存在下でプラスミドが線状化する。従って、ｍＡＬｂＴ１ガイドのための単一ガイドＲＮＡ切断部位を、マウスゲノムに存在する配列の逆相補体でＦＶＩＩＩカセットの５’末端に挿入した。
ゲノムにおけるガイド配列の逆相補体の使用は、理論的には、カセットに隣接する２つのガイド部位が使用される場合、順方向での組込みに有利である。しかしながら、この利点は、１つのガイド切断部位のみが使用される場合に維持される可能性は低い。コード配列に隣接するガイド切断部位を含めると、コード配列カセットと細菌性プラスミド骨格（抗生物質耐性遺伝子と複製起点をコードする）からなる２つの線状断片が生成し、その場合、細菌性骨格断片は、ゲノム中の二本鎖切断部での組込みに競合する。この理由のために、出願人は、単一のガイド切断部位が使用されるようにプラスミドを設計した。合成ＦＶＩＩＩコード配列カセットは、５’末端で開始する以下のエレメント（順に）；ｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡ標的部位、１８ｂｐスペーサー配列、スプライスアクセプター配列（ＡＣＴＡＡＡＧＡＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＴＡＣＡＴＴＴＣＡＧ、配列番号３０７）、シグナルペプチドがジヌクレオチドＴＧで置換されたＢドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩコード配列、及びポリアデニル化シグナル（ａａｔａａａａｇａｔｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｔａｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇ、配列番号３０６）から構成された。
この構築物は、アルブミンのイントロン１に組込まれた後に、アルブミンのエクソン１、アルブミンのイントロン１の一部、及びＦＶＩＩＩコード配列カセットを含むハイブリッドプレｍＲＮＡを生成するように設計した。アルブミンイントロン１に組込まれた後、ある頻度で、細胞のスプライシング機構がイントロン１をスプライシングし、それによって、アルブミンエクソン１が成熟ＦＶＩＩＩのコード配列にインフレームで融合される成熟ｍＲＮＡを生成することが期待される。ＴＧジヌクレオチドは、翻訳リーディングフレームを維持するために構築物に含まれる。このｍＲＮＡの翻訳は、シグナルペプチド及びアルブミンのプロペプチドがＦＶＩＩＩの成熟コード配列に融合しているタンパク質を産生すると予測された。細胞の分泌機構を通過すると、シグナルペプチド及びプロペプチドが切断され、成熟ＦＶＩＩＩの天然のＮ末端に付加された３つのアミノ酸（Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ）が残ると予測された。この方法を用いて産生されたＦＶＩＩＩタンパク質は、これらの更なる３つのアミノ酸の存在にもかかわらず、マウスにおいて活性であった。
ｇＲＮＡ
これらの実験で使用したｇＲＮＡを化学的に合成し、ヌクレアーゼに対する耐性を改善するために化学的に改変されたヌクレオチドを組込んだ。一例におけるｇＲＮＡは、以下の構造から構成される：
Figure 2023520262000011
 （ここで、「Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ」は、天然ＲＮＡヌクレオチドであり、「ａ、ｇ、ｕ、ｃ」は、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドであり、「ｓ」は、ホスホロチオエート骨格を表す）。ｇＲＮＡのマウスアルブミン標的化配列に下線を付し、ｇＲＮＡ配列の残りは、共通の足場配列である。
ｍＲＮＡ
ｍＲＮＡは、当技術分野で公知の方法によって産生され得る。本明細書で使用される１つのこのような方法は、Ｔ７ポリメラーゼを使用するインビトロ転写であり、ここでｍＲＮＡの配列は、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターを含むプラスミド中にコードされる。簡潔には、Ｔ７ポリメラーゼ及びリボヌクレオチドを含む適切な緩衝液中でプラスミドをインキュベートすると、所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＲＮＡ分子が産生された。天然のリボヌクレオチド又は化学的に改変されたリボヌクレオチドのいずれかを反応混合物中で使用して、天然のｍＲＮＡの天然の化学構造又は改変された化学構造のいずれかを有するｍＲＮＡ分子を生成することができる。本明細書に記載の研究では、天然（未改変）リボヌクレオチドを使用した。更に、ｍＲＮＡの５’末端がキャップされるようにキャッピング成分を転写反応に含めた。
ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡは、核局在化ドメイン（ＮＬＳ）に融合したｓｐＣａｓ９タンパク質をコードするように設計されており、これは、ｓｐＣａｓ９タンパク質をゲノムＤＮＡの切断が起こり得る核コンパートメントへ輸送するのに必要である。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの更なる成分は、リボソーム結合を促進するための最初のコドンの前の５’末端のＫＯＺＡＫ配列、及び一連のＡ残基からなる３’末端のポリＡテールである。ＮＬＳ配列を有するｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡの例は、配列番号３４０に記載される。更に、ｓｐＣａｓ９コード配列の配列を、各アミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンを利用することによって、コドン使用について最適化した。更に、ｍＲＮＡのｓｐＣａｓ９タンパク質への効率的な翻訳を促進するために、コード配列を最適化して、潜在性リボソーム結合部位及び上流オープンリーディングフレームを除去した。
ＬＮＰ
これらの研究において使用されるＬＮＰの主要成分は、脂質Ｃ１２－２００である（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０、前出）。Ｃ１２－２００は、負に荷電したＲＮＡ分子と複合体を形成する。一般に、Ｃ１２－２００を１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ＤＭＰＥ－ｍＰＥＧ２０００、及びコレステロールと組み合わせた。例えば、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）デバイス（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）中で、制御された条件下でｇＲＮＡ及びｍＲＮＡなどの核酸と混合した場合、核酸がＬＮＰ内に封入されたＬＮＰの自己集合が生じた。ＬＮＰ中のｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡを組み立てるために、エタノール及び脂質ストックを、必要に応じてガラスバイアルにピペットで入れた。例示的な比は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比のＣ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロール及びｍＰＥＧ２０００－ＤＭＧから構成された。ｇＲＮＡ及びｍＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないチューブ中の１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ ３．０）及び３００ｍＭ ＮａＣｌ中で希釈した。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）カートリッジ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）を、脂質側をエタノールで、ＲＮＡ側を水で洗浄した。脂質の作業ストックをシリンジに引き込み、シリンジから空気を除去し、シリンジをカートリッジに挿入した。同じ手順を、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡの混合物をシリンジに装填するために使用した。次いで、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）ランを、製造者の推奨条件下で行った。ＬＮＰ懸濁液を、１０Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）透析カートリッジを使用して、４リットルのＰＢＳ中で４時間透析し、次いで、１００Ｋ ＭＷＣＯスピンカートリッジ（Ａｍｉｃｏｎ）を通した遠心分離によって濃縮した（遠心分離中にＰＢＳ中で３回洗浄することを含む）。最後に、ＬＮＰ懸濁液を０．２μｍシリンジフィルターを通して滅菌濾過した。エンドトキシンレベルを、市販のエンドトキシンキットを使用して決定し（Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）アッセイ）、粒径分布を動的光散乱によって決定した。
封入されたＲＮＡの濃度は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて決定した。或いは、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡを別々にＬＮＰ中に処方し、次いで、培養物中の細胞の処置又は動物への注射の前に一緒に混合した。別々に処方したｇＲＮＡとＣａｓ９ ｍＲＮＡを使用して、ｇＲＮＡとＣａｓ９ ｍＲＮＡの特定の比率を試験することができた。
代替のカチオン性脂質分子を利用する代替のＬＮＰ製剤もまた、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡのインビボ送達のために使用される。
構築物のインビボ試験
マウスモデルを使用して、設計された構築物がＦＶＩＩＩを産生する能力を試験した。血友病Ａのマウスモデルは、当技術分野で公知である（例えば、Ｌ．Ｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（１９９５）１０：１１９－２１、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ０５９５－１１９）。プラスミドｐＣＢ０７６、ｐＣＢ１００、ｐＣＢ１００３、ｐＣＢ０８５、及びｐＣＢ０８０を、Ｑｉａｇｅｎ ＥｎｄｏＦｒｅｅ（登録商標）プラスミドｍａｘｉプレップキット（ｃａｔ ＃１２３６２）を使用して精製し、次いで、０．９％生理食塩水中で最終濃度１５μｇ／ｍＬに希釈した。血友病Ａマウス（Ｂ６株；１２９Ｓ－Ｆ８ｔｍ１Ｋａｚ／Ｊ株）、マウスＦＶＩＩＩタンパク質を欠くマウス株を、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から入手した。血友病Ａマウスのコホートに、５～６秒間、マウス当たり２ｍＬの希釈プラスミドＤＮＡを尾静脈から流体力学的注射（「ＨＤＩ」）により注射した。ＨＤＩプロセスは、肝細胞を含む肝臓細胞の核へのプラスミドＤＮＡの送達をもたらすことが報告されている（例えば、Ｆ．Ｎｉｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１９）１９６１：３２９－４１を参照されたい）。注射の翌日に、マウスに、ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ ｍＡｌｂＴ１を封入したＬＮＰ製剤の眼窩後方（「ＲＯ」）注射を行った。マウスに投与されたＬＮＰの用量は、１ｍｇ／ｋｇ体重のｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ＋１ｍｇ／ｋｇ体重のｇＲＮＡであった。
ＬＮＰ単独を投与したマウスのグループを３日後に屠殺し、ＤＮＡを全肝臓から抽出し、ｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡの予想される切断部位でのインデルについてＴＩＤＥ分析（Ｅ．Ｋ．Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ（２０１４）４２：ｅ１６８）を用いてアッセイした。ＴＩＤＥ分析において、予想されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断部位のゲノム領域を、ＰＣＲによって処理細胞のゲノムＤＮＡから増幅し、次いで、Ｓａｎｇｅｒ配列決定に供する。配列決定クロマトグラムを、予測される切断部位周辺の領域における挿入及び欠失の頻度を決定するＴＩＤＥソフトウェアプログラムを用いて分析した。
これらの実験において、オンターゲット部位におけるインデルの頻度は、２５．４％であると決定された。プラスミドを注射したマウスにＬＮＰを投与した６日後、血液サンプルをＲＯ採血によりクエン酸ナトリウム（クエン酸ナトリウム対血液の比１：９）中に採取し、血漿を遠心分離により収集した。血漿中のＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ活性アッセイ（Ｄｉａｐｈａｒｍａ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ Ｆａｃｔｏｒ ＦＶＩＩＩ、ｃａｔ＃ Ｋ８２４０８６）を用いて測定した。組換えヒトＦＶＩＩＩであるＫｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ）を標準に使用し、血液中のＦＶＩＩＩ活性の１ｍＬ当たりの単位を正常活性のパーセントに変換した（１Ｕ／ｍＬ＝１００％）。結果を図１にまとめる。Ｂドメインの代わりに６つのＮ－グリカンＢドメイン置換配列を含むプラスミドｐＣＢ０７６を注射したマウスは、正常なヒトＦＶＩＩＩレベルの２０％に相当する平均合成ＦＶＩＩＩレベルを有していた。対照的に、６つのＮ－グリカンＢドメイン置換配列の非存在を除いてｐＣＢ０７６と同一であるｐＣＢ１００プラスミドを注射されたマウスは、それらの血液中で検出可能なＦＶＩＩＩレベルを有さなかった。６つのＮ－グリカンＢドメイン置換配列を欠く異なるコドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩコード配列を含むプラスミドｐＣＢ１００３、ｐＣＢ０８５、又はｐＣＢ０８０を注射したマウスは、非遺伝子編集（ナイーブ）血友病Ａマウスと比較した場合、血液中のＦＶＩＩＩ活性が低かったか、測定不能であった。ｐＣＢ１００３及びｐＣＢ０８０を注射されたマウスのいくつかは、正常の１～３％の範囲で、それらの血液中に検出可能なＦＶＩＩＩを有し、コドン最適化ｃｏ２（ｐＣＢ１００３）及びｃｏ４（ｐＣＢ０８０）がコドン最適化ｃｏ１（ｐＣＢ１００）及びｃｏ３（ｐＣＢ０８５）よりも活性である可能性を示した。
この研究でマウスの血液中で産生されたＦＶＩＩＩのレベルは、順方向（ＦＶＩＩＩタンパク質を産生することができる向き）のアルブミンイントロン１への標的化組込みの頻度、及びＦＶＩＩＩコード配列の固有発現効率の両方に依存していた。ＦＶＩＩＩコード配列の固有発現効率は、転写効率、翻訳効率（これは、使用されるコドン最適化のタイプによって変化する）、及び分泌プロセスの効率の関数である。ＦＶＩＩＩタンパク質の場合、タンパク質の分泌は律速段階であり得、ＦＶＩＩＩが細胞において高レベルで発現される場合に誘導され得る、折り畳まれていないタンパク質応答に関連することが報告されている。（Ｍ．Ｓｗａｒｏｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９７）２７２：２４１２１－２４；Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｂｌｏｏｄ（２００９）１１４：ＳＣＩ－１９）。
ＨＤＩ又は他の因子によるドナーの送達効率の変動性に起因してマウス間で変動し得る標的化組込み頻度と、合成ＦＶＩＩＩコード配列の固有発現効率とを区別するために、標的化組込み頻度を、液滴デジタルＰＣＲ（ＤＤ－ＰＣＲ）を使用して定量した。ＤＤ－ＰＣＲは、サンプル中の核酸配列の絶対コピー数を定量するための方法である。アルブミンイントロン１に挿入された合成ＦＶＩＩＩコード配列カセットの順方向のみを定量するために、一対のＰＣＲプライマーを、ｇＲＮＡ ｍＡＬｂＴ１切断部位の５’の部位においてアルブミンイントロン１中に位置する順方向プライマー及びＦＶＩＩＩコード配列の５’末端に位置する逆方向プライマーを用いて設計した。２つのプライマー間の配列に相補的な蛍光プローブを設計した。参照プライマー／プローブセットを、ｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡ部位から離れた部位で天然マウスアルブミン遺伝子配列に対して設計した。参照プライマープローブを使用して、各アッセイにおける投入マウスゲノムＤＮＡの量を正規化した。
この分析を実施するために、上記の実験からのマウスを、マウスにＬＮＰを投与した８日後に屠殺した。全肝臓をホモジナイズし、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅキットを用いて全ゲノムＤＮＡを精製した。次いで、等質量のゲノムＤＮＡを、上記のＤＤ－ＰＣＲアッセイを用いて、標的化組込み頻度についてアッセイした。各マウスについての結果を表２にまとめる。順方向における標的化組込み頻度は、０．０９％～０．９５％（１００単数体ゲノム当たり０．０９～０．９５コピー）の範囲であった。血液中の最大ＦＶＩＩＩレベルは、組込み頻度と正の相関を示し、ＦＶＩＩＩレベルは、アルブミンイントロン１に組み込まれたＦＶＩＩＩカセットのコピー数に依存していることを示した。ｐＣＢ０７６を注射したマウスにおける平均標的化組込み頻度は、ｐＣＢ１００を注射したマウスにおける０．２８±０．１５と比較して０．４７±０．２６であり、ＳＱリンカーの代わりにＢドメイン置換を含むｐＣＢ０７６を注射したマウスにおけるより高い組込み頻度の傾向を示したが、この差は統計的に有意ではなかった。
Figure 2023520262000012
各マウスの血液中のＦＶＩＩＩレベルを組込み頻度に正規化することにより、ＦＶＩＩＩコード配列の固有発現効率の尺度が提供される。標的化組込み頻度で除したＦＶＩＩＩレベルの比の平均は、ｐＣＢ０７６については４２であり、ｐＣＢ１００については５．３であり、この差は、両側スチューデントＴ検定を用いて決定して、統計的に有意であった（ｐ＝０．０００４）。これらの結果は、ｐＣＢ０７６における合成ＦＶＩＩＩコード配列の固有発現効率がｐＣＢ１００におけるコード配列のそれよりも約８倍大きいことを実証する。これは、ＳＱリンカーの代わりにＢドメイン置換をコードする配列を含むことが、このコドン最適化ＦＶＩＩＩコード配列の固有発現効率を約８倍改善したことを実証する。この改善の大きさは、ＦＶＩＩＩコード配列が強力な肝臓特異的プロモーターによって駆動される非組込みＡＡＶウイルス中でＦＶＩＩＩコード配列が送達される場合、同じ６つのグリカンモチーフ配列について報告された２倍の改善よりも有意に大きい（Ｊ．ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１３）１２１：３３３５－４４）。
実施例２：ＳＱリンカーをＢドメイン置換で置換すると、ＡＡＶによって送達され、アルブミンのイントロン１に組込まれたＦＶＩＩＩドナーカセットからのＦＶＩＩＩ発現が増加する
合成ＦＶＩＩＩコード配列がＡＡＶを用いてマウスの肝臓に送達された場合に、Ｂドメイン置換ペプチドの同じ有益な効果が生じたかどうかを決定するために、プラスミドｐＣＢ０９９（配列番号３１１）及びｐＣＢ１０２（配列番号３４１）を構築し、ＡＡＶ８（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ、又はＳａｂＴｅｃｈ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）にパッケージングした。プラスミドは、以下のエレメントを用いて構築した（順に）：ＩＴＲ｜ｇＲＮＡ標的部位（ｍＡｌｂＴ１の場合）｜１８ｂｐスペーサー｜スプライスアクセプター部位（ＳＡ）｜ＦＶＩＩＩコード配列｜ポリアデニル化シグナル（「ｓＰＡ」）｜ｇＲＮＡ標的部位｜ＩＴＲ。ｐＣＢ０９９及びｐＣＢ１０２のＦＶＩＩＩコード配列は、各々、ｐＣＢ０７６（Ｂドメイン置換を有する）及びｐＣＢ１００（ＳＱリンカーのみを有する）のＦＶＩＩＩコード配列と同一であった。これらのＦＶＩＩＩカセットはプロモーターを欠いており、従って、非組込みＡＡＶエピソームゲノムとしてＦＶＩＩＩを発現することができない。これらのＡＡＶウイルスによって送達されるＦＶＩＩＩの発現には、適切なプロモーターに隣接する組込みが必要である。
これらの実験において、血友病Ａマウスに、体重１ｋｇ当たり２×１０１２ベクターゲノム（「ｖｇ」）のＡＡＶ８－ｐＣＢ０９９又はＡＡＶ８－ｐＣＢ１０２を静脈内注射した。４週間後、マウスに２つのＬＮＰの１：１混合物を静脈内注射し、一方のＬＮＰはｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡを封入し、他方のＬＮＰはｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡを封入した。ＬＮＰは、実施例１に記載されるように調製され、総用量は、体重１ｋｇ当たり２ｍｇのＲＮＡであった。ＦＶＩＩＩ活性を、実施例１に記載の方法を使用して、ＬＮＰ投与の１０日後にマウスの血液中で測定した。ＬＮＰ投与の１０日後のマウスの血液中のＦＶＩＩＩレベル（図２）は、ＡＡＶ９－ｐＣＢ０９９を受けたマウスでは、正常なヒトＦＶＩＩＩレベルの平均２０％であったが、ＡＡＶ８－ｐＣＢ１０２（Ｂドメイン置換を欠く）を受けたマウスでは、バックグラウンドレベルであった。
ＬＮＰ投与後の２４日目に、マウスを屠殺し、全肝臓をホモジナイズし、全ゲノムＤＮＡを肝臓溶解物の一部から抽出した。順方向におけるアルブミンイントロン１への標的化組込みの頻度を、実施例１に記載のＤＤ－ＰＣＲアッセイを用いて定量した。各マウスについての結果を表３にまとめる。
結果は、ＡＡＶ８－ｐＣＢ０９９を注射したマウスにおける平均標的化組込み頻度（％／単数体ゲノム）が１．８６（±０．２５）であり、一方、ＡＡＶ８－ｐＣＢ１０２を注射したマウスでは、平均標的化組込み頻度が０．４６（±０．２）であったことを示す。この差は、両側スチューデントＴ検定を用いて統計的に有意であった（ｐ＜０．０１）。これらの結果は、Ｂドメイン置換を含めることが、４倍高い頻度の標的化組込みをもたらすことを実証し、ＦＶＩＩＩのＢドメインの代わりにグリカンを以前に含めることが、ＦＶＩＩＩの発現レベルを改善することのみが示されたことを考慮すると、予測されなかった結果である。ＡＡＶ８－ｐＣＢ０９９を注射したマウスの血液中の平均ＦＶＩＩＩレベルは、正常の１８．６（±２．２）％であり、一方、ＡＡＶ８－ｐＣＢ１０２を注射したマウスでは、平均ＦＶＩＩＩレベルは、正常の１．７（±１．１）％であった。この１１倍の差は、両側スチューデントＴ検定を用いて統計的に有意であった（ｐ＜０．０１）。ＦＶＩＩＩレベルを、個々のマウスにおけるＦＶＩＩＩレベルを標的化組込み頻度で除することによって、標的化組込み頻度に対して正規化した（表３）。標的化組込み頻度で除したＦＶＩＩＩ活性の比の平均は、ＡＡＶ８－ｐＣＢ０９９注射マウスで１０．２（±１．７），ＡＡＶ８－ｐＣＢ１０２注射マウスで３．１（±１．７）であった。この差は、両側スチューデントＴ検定を用いて統計的に有意であった（ｐ＜０．０１）。
これらのデータは、ＡＡＶ８－ｐＣＢ０９９におけるＦＶＩＩＩコード配列の固有発現効率が、ＡＡＶ８－ｐＣＢ１０２のものよりも３倍高いことを実証する。ＡＡＶ８－ｐＣＢ０９９は、Ｎ－グリカンモチーフ含有配列の存在によってのみＡＡＶ８－ｐＣＢ１０２と異なるので、これらのデータは、ＡＡＶ８－ｐＣＢ０９９におけるＮ－グリカンモチーフが固有発現効率に３倍の改善を与えることを実証する。従って、マウスの血液中のＦＶＩＩＩレベルの全体的な１１倍の改善は、組込まれたＦＶＩＩＩコード配列の４倍高い標的化組込み及び３倍の改善された発現効率の組み合わせによる。
Figure 2023520262000013
実施例３：Ｂドメイン置換におけるＮ－グリカンの数の最適化
実施例１及び２からのデータは、６つのＮ結合グリカンモチーフを含むＢドメイン置換を挿入することが、ＦＶＩＩＩの発現及び標的化組込みの頻度を改善したことを実証する。しかしながら、この改善のＢドメイン置換中のＮ－グリカン配列の数への依存性は、不明であった。従って、発明者らは、ＦＶＩＩＩ発現のこの態様を精査するための実験を設計した。特に、ＦＶＩＩＩ発現の改善に必要なＮ結合グリカンモチーフの最小数を決定することが所望された。
プラスミド構築物
異なる数のＮ－グリカンモチーフが発現に及ぼす影響を探るために、１～９個のＮ－グリカンモチーフを含む一連のドナープラスミドを構築した。これらを表４にまとめる。全てのプラスミドは、５’から３’の順に、以下の配列エレメントから構成されていた：ｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡの標的配列｜１８ｂｐスペーサー｜スプライスアクセプター｜シグナルペプチドがＴＧジヌクレオチドで置換されたＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩコード配列｜ポリアデニル化シグナル配列。これらのプラスミドの各々において、ＦＶＩＩＩコード配列は、シグナルペプチドがＴＧジヌクレオチドで置換されているが、Ｂドメイン置換において１～９個のＮ結合グリコシル化部位を有する、ｐＣＢ０７６（実施例１参照）において使用されたコドン最適化配列に基づいた。全てのプラスミドは、同じｐＵＣ１９ベースの細菌性プラスミド骨格（細菌の複製起点及びカナマイシン耐性遺伝子を含む）を含んでいた。
Figure 2023520262000014
構築物のインビボ試験：５、６及び７グリカン
血友病Ａマウスに、実施例１の方法を用いて、プラスミドｐＣＢ０７７、ｐＣＢ１００６、ｐＣＢ１００７、又はｐＣＢ１００８を、マウス当たり３０μｇで、流体力学的注射によって投与した。翌日、同じマウスに、ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡを封入したＬＮＰの１：１混合物を、２ｍｇ／ｋｇ体重の総ＲＮＡ用量で眼窩後方に注射した。ＬＮＰは、実施例１に記載したように調製した。ＦＶＩＩＩ活性を、実施例１に記載の方法を用いて、６日後にマウスの血液中で測定した。結果を図３にまとめ、４つのプラスミドドナーによって産生されたＦＶＩＩＩのレベルが類似していることを実証した。
本研究におけるマウスの血液中で産生されるＦＶＩＩＩのレベルは、順方向（ＦＶＩＩＩタンパク質を産生することができる向き）のアルブミンイントロン１への標的化組込みの頻度及びＦＶＩＩＩコード配列の固有発現効率の両方に依存する。ＦＶＩＩＩコード配列の固有発現効率は、転写速度、翻訳効率（使用されるコドン最適化のタイプに影響される）、及び分泌過程の効率の関数である。ＦＶＩＩＩタンパク質の場合、タンパク質の分泌は、律速段階であり得（Ｍ．Ｓｗａｒｏｏｐ ｅｔ ａｌ．，前出）、ＦＶＩＩＩが細胞において高レベルで発現される場合に生じる、折り畳まれていないタンパク質応答（Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ、前出）と関連することが示唆されている。個々のマウス間で変化することが予想される標的化組込み頻度と、組込まれた合成ＦＶＩＩＩコード配列の固有発現効率とを区別するために、標的化組込み頻度を、実施例１に記載されるように、液滴デジタルＰＣＲ（ＤＤ－ＰＣＲ）を使用して定量した。
マウスにＬＮＰを投与した８日後、マウスを屠殺し、全肝臓をホモジナイズし、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅキットを用いて全ゲノムＤＮＡを精製した。次いで、等質量のゲノムＤＮＡを、ＤＤ－量を使用して標的化組込み頻度についてアッセイした。各マウスについての結果を表５にまとめる。順方向の標的化組込み頻度は、個々のマウスで０．１７％から０．７０％の範囲であったが、４つのプラスミドについてのマウスの各グループ内の平均は、ｐＣＢ０７７、ｐＣＢ１００６、ｐＣＢ１００７、及びｐＣＢ１００８で各々０．４９％、０．４７％、０．５２％、及び０．３８％で類似していた。ｐＣＢ０７７、ｐＣＢ１００６、ｐＣＢ１００７、及びｐＣＢ１００８を注射したマウスについてのＴＩに対するＦＶＩＩＩ活性の比の平均は、各々５１．３３、４８．５４、４８．９、及び３８．９であり、プラスミド間の差は、統計的に有意ではなかった。これらの結果は、５つのＮ－グリカン部位（ｐＣＢ１００７）若しくは７つのグリカン部位（ｐＣＢ１００８）を含む、又はグリカントリペプチドモチーフの１つがＮＤＳからＮＤＴに変化した（ｐＣＢ１００６）合成ＦＶＩＩＩコード配列が、６つのＮ－グリカン部位（ｐＣＢ０７７）をコードする合成ＦＶＩＩＩコード配列と比較して、類似の固有発現効率を有することを実証する。
同じマウス研究を、プラスミドｐＣＢ１０１５（配列番号３２８）及びｐＣＢ１０１６（配列番号３２９）を用いて行い、ここでＮ－グリカンモチーフの数は、各々、８及び９に変化する。更に、１つ又は２つのＮ－グリカンモチーフのみを有する以外はｐＣＢ０７７と同一のプラスミドを構築し、ＬＮＰ中に送達された同じｇＲＮＡ及びｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡを用いてマウスアルブミンイントロン１への標的化組込み後にＦＶＩＩＩを発現する能力について試験した。
Figure 2023520262000015
構築物のインビボ試験：３、４、及び５グリカン
プラスミドｐＣＢ１００７、ｐＣＢ１０１７、及びｐＣＢ１０１８を精製し、上記のように血友病Ａマウスに投与した。翌日、マウスにｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）とガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ｍＡｌｂＴ１（１ｍｇ／ｋｇ）を封入したＣ１２－２００ベースＬＮＰの眼窩後方（ＲＯ）注射を行った。血液サンプルを、ＬＮＰ投与の５日後及び７日後に、クエン酸ナトリウム中へのＲＯ採血によって採取し（クエン酸ナトリウム対血液の比１：９）、血漿を遠心分離によって収集した。血漿中のＦＶＩＩＩ活性を、実施例１に記載の方法を用いて測定した。
５日目の血液中のＦＶＩＩＩ活性は、ｐＣＢ１００７、ｐＣＢ１０１８、及びｐＣＢ１０１８を注射したマウスで、各々平均８．１％、５．０％、及び２３．５％であった。７日目に、ＦＶＩＩＩ活性は、ｐＣＢ１００７、ｐＣＢ１０１８及びｐＣＢ１０１８を注射したマウスで、各々平均７．９％、３．０％及び１３．５％であった。従って、４つのＮ－グリカンモチーフ（ｐＣＢ１０１７）又は３つのＮ－グリカンモチーフ（ｐＣＢ１０１８）を有するプラスミドを注射されたマウスにおけるＦＶＩＩＩ発現は、Ｂドメイン置換に５つのＮ－グリカンモチーフを含む（ｐＣＢ１００７）プラスミドを受けたマウスのものと類似していた。
ＬＮＰ投与後の７日目に血液サンプルを採取した後、マウスを屠殺し、全肝臓を取り出し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中に保存した。ビーズベースのホモジナイザーを用いて全肝臓をホモジナイズし、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ｃａｔ ＃８０２０４）を用いてホモジネートのアリコートからＤＮＡを精製した。肝臓ゲノムＤＮＡを、実施例１に記載したように、ＦＶＩＩＩドナーカセットの順方向への組込みの頻度について、ＤＤ－ＰＣＲによって分析した。標的化組込み頻度の平均は、ｐＣＢ１００７、ｐＣＢ１０１７、及びｐＣＢ１０１８を注射したマウスで、各々０．２７％、０．２７％、及び０．５５％であり、これらの値は、統計的に差がなかった（両側スチューデントＴ検定）。
各マウスの血液中のＦＶＩＩＩレベルを組込み頻度に正規化することによって、ＦＶＩＩＩコード配列の固有発現効率の尺度が提供される。標的化組込み頻度で除したＦＶＩＩＩレベルの比の平均は、ｐＣＢ１００７（５つのＮ－グリカン）注射マウスで２３．６、ｐＣＢ１０１７（４つのＮ－グリカン）注射マウスで１１．６、及びｐＣＢ１０１８（３つのＮ－グリカン）注射マウスで２３．３であった。ｐＣＢ１０１７及びｐＣＢ１０１８注射マウスの標的化組込み比で除したＦＶＩＩＩは、ｐＣＢ１００７注射マウスのそれと統計的に差がなかった。
これらのデータは、４つのＮ－グリカンモチーフ又は３つのＮ－グリカンモチーフのいずれかを有するＢドメイン置換を含む合成ＦＶＩＩＩコード配列を使用することによって、アルブミンイントロン１に組込まれた場合、５つのＮ－グリカンモチーフを含むＦＶＩＩＩコード配列と同様の発現がもたらされることを実証する。従って、３つのＮ－グリカンモチーフを有するＢドメイン置換を有する合成ＦＶＩＩＩ構築物は、５つのＮ－グリカンモチーフを有するＢドメイン置換によって提供されるものと同等の改善されたＦＶＩＩＩ発現を提供する。推論によると、Ｂドメイン置換を含む５つのＮ－グリカンモチーフは、Ｂドメイン置換を含む６つのＮ－グリカンモチーフと同等であったため、発明者らは、３つのＮ－グリカンモチーフが６つのＮ－グリカンモチーフと同等に強力であると推論する。
構築物のインビボ試験：１つ及び２つのグリカン
プラスミドｐＣＢ１０１８（３つのＮ－グリカンモチーフを有するＢドメイン置換を有するＦＶＩＩＩドナーを含む）、ｐＣＢ１０２９（２つのＮ－グリカンモチーフを有するＢドメイン置換を有するＦＶＩＩＩドナーを含む）、及びｐＣＢ１０３０（１つのＮ－グリカンモチーフを有するＢドメイン置換を有するＦＶＩＩＩドナーを含む）を精製し、上記のように流体力学的注射によって血友病Ａマウスに投与した。翌日、マウスにｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）とｇＲＮＡ ｍＡｌｂＴ１（１ｍｇ／ｋｇ）を封入したＣ１２－２００に基づくＬＮＰの眼窩後方（ＲＯ）注射を行った。ＬＮＰ投与の５日後及び８日後に、ＲＯ採血によって血液サンプルをクエン酸ナトリウム（クエン酸ナトリウム対血液の比１：９）に採取し、遠心分離によって血漿を収集した。血漿中のＦＶＩＩＩ活性を上記のように測定し、正常活性のパーセント（１Ｕ／ｍＬ＝１００％）として表した。
５日目の血液中のＦＶＩＩＩ活性は、ｐＣＢ１０１８、ｐＣＢ１０２９、及びｐＣＢ１０３０を注射したマウスで、各々平均１２．８％、１５．８％、及び１３．４％であった。８日目に、ＦＶＩＩＩ活性は、ｐＣＢ１０１８、ｐＣＢ１０２９、及びｐＣＢ１０３０を注射したマウスで、各々平均１３．８％、１４．５％、及び１６．０％であった。従って、３つのＮ－グリカンモチーフ（ｐＣＢ１０１８）、２つのＮ－グリカンモチーフ（ｐＣＢ１０２９）、又は１つのＮ－グリカンモチーフ（ｐＣＢ１０３０）を有するＢドメイン置換を含むプラスミドを注射したマウスにおけるＦＶＩＩＩ発現は、互いに類似していた。
ＬＮＰ投与後の７日目に血液サンプルを採取した後、マウスを屠殺し、全肝臓を取り出し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中に保存した。全肝臓をホモジナイズし、肝臓ゲノムＤＮＡを、実施例１に記載したように、ＦＶＩＩＩドナーカセットの順方向への組込みの頻度について、ＤＤ－ＰＣＲによって分析した。標的化組込み頻度の平均は、ｐＣＢ１０１８、ｐＣＢ１０２９、及びｐＣＢ１０３０を注射したマウスで、各々０．２９％、０．４７％、及び０．３６％であった：これらの値は、統計的に差がなかった（両側スチューデントＴ検定）。
各マウスの血液中のＦＶＩＩＩレベルを組込み頻度に正規化することによって、ＦＶＩＩＩコード配列の固有発現効率の尺度が提供される。標的化組込み頻度で除したＦＶＩＩＩレベルの比の平均は、ｐＣＢ１０１８（３つのＮ－グリカン）注射マウスで４１．９、ｐＣＢ１０２９（２つのＮ－グリカン）注射マウスで３１．４、及びｐＣＢ１０３０（１つのＮ－グリカン）注射マウスで４０．２であった。ｐＣＢ１０２９（３つのＮ－グリカン）及びｐＣＢ１０３０（２つのＮ－グリカン）注射マウスについての固有発現効率は、ｐＣＢ１０１８（３つのＮ－グリカン）注射マウスのそれと統計的に差がなかった。これらのデータは、２つのＮ－グリカンモチーフ（アミノ酸配列ＮＡＴＮＶＳ）又は１つのＮ－グリカンモチーフ（アミノ酸配列ＮＡＴ）のいずれかを含むＢドメイン置換を含むＦＶＩＩＩドナーカセットが、３つのＮ－グリカンモチーフを有するＢドメイン置換を含むＦＶＩＩＩドナーカセットと等しい効率で発現されることを実証する。
Figure 2023520262000016
０、１、２、３、４、５、６、又は７個のＮ結合グリカンモチーフを含むＢドメイン置換を含むＦＶＩＩＩドナーカセットについてのインビボＦＶＩＩＩ発現結果の比較
上記で試験した異なるＦＶＩＩＩカセットの固有発現効率を比較した。実施例３を通して記載されたデータセットは、同じ系統のマウス（血友病Ａマウス）及び同じ実験プロトコルを用いて、合計５件の研究で作成された。ＦＶＩＩＩ活性は、５日目又は６日目のいずれかに、及び８日目又は９日目に再び測定した。最終ＦＶＩＩＩ活性測定日（８日目又は９日目）に屠殺したマウスの全肝臓から抽出したＤＮＡ中の標的化組込み頻度を測定した。固有発現効率の収集を図８に示す。この比較には、異なるコドン最適化を有するＦＶＩＩＩカセットが含まれる。正規化ＦＶＩＩＩ発現に対する異なる数のグリカンの影響の比較は、図８の最初の９つのバーである「ｃｏ１」と呼ばれるコドン最適化を有するドナーについて行うことができる。これらのドナーは、Ｂドメイン置換におけるＮ－グリカンモチーフの数のみが異なるＦＶＩＩＩカセットを含む。固有発現効率は、１～７個のＮ－グリカンモチーフを含むグリカン変異体について有意に異ならなかった。２つのＮ－グリカンモチーフを有するドナー（「ｃｏ１－２」）がより低い正規化ＦＶＩＩＩ活性（５、６、又は７個のＮ－グリカンを含む変異体の約４５の値と比較して、３０の値）の傾向を示したが、この差は統計的に有意ではなかった。Ｂドメインの代わりにＮ－グリカンモチーフを含まないドナー（「ｃｏ１－０」）は、有意に低い正規化ＦＶＩＩＩ活性（グリカン及び同じコドン最適化を有する変異体の４０～５０の値と比較して、７．４の値）を示した。５つのグリカン及びコドン最適化ｃｏ２を有するＦＶＩＩＩドナーは、５つのＮ－グリカンモチーフを有するｃｏ１と同等であったが、５つのＮ－グリカンを有するｃｏ３は、５つのＮ－グリカンを有するｃｏ１の効率の約５０％で発現した。これらのデータは、単一のＮ－グリカンモチーフを含むＢドメイン置換を含むＦＶＩＩＩコード配列が２～７個のＮ－グリカンモチーフを含むＢドメイン置換で達成されるものと同等のＦＶＩＩＩ発現レベルを付与するのに十分であったことを実証する。単一のＮ－グリカンモチーフ（図８の「ｃｏ１－１」／ｐＣＢ１０３０）を含むＢドメイン置換を含むＦＶＩＩＩコード配列は、Ｂドメイン置換を欠く同じＦＶＩＩＩコード配列（「ｃｏ１－０」／ｐＣＢ１００）の約５．４倍効率的に発現された（４０．１／７．４）。従って、６個未満のＮ－グリカン、例えば、５個のＮ－グリカン、４個のＮ－グリカン、３個のＮ－グリカン、２個のＮ－グリカン、又は１個のＮ－グリカンを有するＢドメイン置換を含むＦＶＩＩＩコード配列は、ＦＶＩＩＩタンパク質に付加される非天然アミノ酸の数の減少、及びＤＮＡドナーのサイズの減少のために、遺伝子編集アプローチにおける使用のための利点を有する。
実施例４：マウスにおけるセーフハーバー遺伝子座（例えば、アルブミン遺伝子座）への標的化組込み後の発現のためのＦＶＩＩＩコード配列の最適コドン最適化の同定
プラスミド構築物
合成ＦＶＩＩＩの発現に対する異なる形態のコドン最適化の効果を決定するために実験を行った。Ｂドメインの代わりに１４アミノ酸のＳＱリンカーを含む成熟（シグナルペプチドを欠く）Ｂドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩコード配列（１４３８アミノ酸の全コード配列）を、ＧｅｎｅＡｒｔで入手可能な市販のアルゴリズムを適用することによってコドン最適化し（ｃｏ３）、これは、天然配列中に存在する５４から１９８までＣＧジヌクレオチドの数を増加させた。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（「ｃｏ４」）のｃｏ３形態の変異体は、公表されたＨ．ｓａｐｉｅｎｓコドン使用頻度表（Ｈ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈ ＆ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ（２０１８）９：５７－６９（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｍ．２０１８．０１．００４）に従って、次に最も高頻度のコドン又はより頻繁に使用されるコドンのいずれかである代替コドンを選択することによって、手動で１９８個のＣＧジヌクレオチドを除去することによって作製した。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（「ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ」）コード配列を、肝臓において高度に発現される遺伝子のコドンバイアスに基づくアルゴリズムを使用してコドン最適化して（Ｈ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，前出）、１７６個のＣＧジヌクレオチドを含むＦＶＩＩＩ－ＢＤＤコドン２を生成した。ここではＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃｏ５と称される、全てのＣＧジヌクレオチドを除去するように更に改変したこの構築物も合成した。Ｊ．ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１３）１２１（１７）：３３３５－４４及び米国特許第９，３９３，３２３号明細書（その中の配列番号１）のコドン最適化ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤコード配列も構築し、本明細書で「ｃｏ１」と称した。２４５個のＣＧジヌクレオチドを含む、国際公開第２０１１／００５９６８号に公開されたＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩコード配列の更なるコドン最適化変異体（その中の配列番号５）を合成した（本明細書では「ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃｏ６」）。プラスミドは、以下のように構築した：ｐＵＣ１９プラスミド骨格｜ＩＴＲ｜ｇＲＮＡ ｍＡＬｂＴ１の標的部位｜１８ｂｐスペーサー｜スプライスアクセプター（ＳＡ）｜ＴＧジヌクレオチド｜Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列｜ポリＡ（ｓＰＡ）｜ｇＲＮＡ ｍＡＬｂＴ１の標的部位｜ＩＴＲ（ここでドナー配列コドン最適化は、ｃｏ２（ｐＣＢ１００２、配列番号３２３）、ｃｏ３（ｐＣＢ１００１、配列番号３２２）、ｃｏ４（ｐＣＢ１０００、配列番号３２１）、又はｃｏ５（ｐＣＢ１０３、配列番号３３６）であった）。
各プラスミド中のＦＶＩＩＩドナーカセットをＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接させ、ＨＥＫ２９３ベースのパッケージングシステムを用いてカセットをＡＡＶ８にパッケージングするために使用し、塩化セシウム密度遠心分離を用いて精製した。得られたＡＡＶ８ウイルス（ＡＡＶ８－ｐＣＢ１０３、ＡＡＶ８－ｐＣＢ１００２、ＡＡＶ８－ｐＣＢ１００１、及びＡＡＶ８－ｐＣＢ１０００と指定）を、ＦＶＩＩＩ遺伝子のコード配列内に位置するプライマー／プローブセットを用いて、Ｑ－ＰＣＲ又はＤＤ－ＰＣＲを用いて力価測定した。これらのＦＶＩＩＩドナーカセットは、アルブミンイントロン１への標的化組込み後にのみＦＶＩＩＩを発現するように設計されている。ドナーカセットはプロモーターを欠くので、組込まれていないエピソームウイルスゲノムからｍＲＮＡに転写されることができない。更に、全てのＦＶＩＩＩドナーカセットは、ＦＶＩＩＩコード配列のＮ末端にシグナルペプチド配列を欠いており、従って、組込まれていないエピソームウイルスコピーから発現され得るいずれのタンパク質も、循環中に分泌され得ない。アルブミンイントロン１に組込まれた後、ゲノム中のアルブミンプロモーターからの転写は、マウスアルブミンエクソン１、イントロン１の一部、及び合成ＦＶＩＩＩコード配列を含み、ＦＶＩＩＩドナーカセットの５’末端に含まれるポリアデニル化シグナルで終結するハイブリッドプレｍＲＮＡを生成する。アルブミンエクソン１のスプライスドナーとＦＶＩＩＩドナーカセットの５’末端に含まれるスプライスアクセプターとの間のこのプレｍＲＮＡのスプライシングは、アルブミンのエクソン１がシグナルペプチド及び成熟ＦＶＩＩＩコード配列にインフレームで融合したプレプロペプチドをコードするｍＲＮＡを生成する。このハイブリッドｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は、細胞の分泌機構を介してプロセシングされ、その間に、シグナルペプチド及びアルブミンのプレプロペプチドが切断され、その結果、ＦＶＩＩＩに通常は存在しない３つのアミノ酸が重鎖のＮ末端に含まれる、予想される２鎖ＦＶＩＩＩ分子が得られる。
構築物のインビボ試験
これらの製剤を試験するために、４又は５匹の血友病Ａマウスのコホートに、尾静脈を介して、ＡＡＶ８ウイルス（ＡＡＶ８－ｐＣＢ１０３、ＡＡＶ８－ｐＣＢ１００２、ＡＡＶ８－ｐＣＢ１００１、及びＡＡＶ８－ｐＣＢ１０００）の各々を、２×１０１２ｖｇ／ｋｇの用量で注射した。４週間後、全てのマウスにｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡとｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡを封入したＬＮＰの１：１混合物を総ＲＮＡ用量２ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。ＬＮＰは、実施例１に記載の方法に従って処方した。血液中のＦＶＩＩＩ活性を、実施例１に記載の方法を用いて測定した。結果を図４にまとめる。
これらの実験では、ＡＡＶ８－ｐＣＢ１０３及びＡＡＶ８－ｐＣＢ１００２（各々コドン最適化ｃｏ５及びｃｏ２を有するＦＶＩＩＩ－ＢＤＤを含む）を受けたマウスは、それらの血液中で検出可能なＦＶＩＩＩ活性を有さなかった。ウイルスｐＣＢ１００１（コドン最適化ｃｏ３）を受けたマウスは、ＬＮＰ投与後１１日目に平均８％のＦＶＩＩＩ活性を有し、２８日目に２０％のＦＶＩＩＩ活性を有した。ウイルスＡＡＶ８－ｐＣＢ１０００（コドン最適化ｃｏ４）を受けた５匹のマウスのうち３匹は、ＦＶＩＩＩ活性レベルが正常の１％～３％であった。これらのデータは、ＧｅｎｅＡｒｔアルゴリズムを用いてコドンを最適化したＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ＤＮＡ配列（ＡＡＶ８－ｐＣＢ１００１、ｃｏ３）が、肝臓で高度に発現する遺伝子の最も頻繁なコドンに基づいて最適化したＦＶＩＩＩ－ＢＤＤコドン（ＡＡＶ８－ｐＣＢ１０３及びＡＡＶ８－ｐＣＢ１００２）よりも高いレベルのＦＶＩＩＩ発現をもたらしたことを実証している。ＣＧジヌクレオチドを除去するためのＧｅｎｅＡｒｔコドン最適化ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ配列の改変（ＡＡＶ８－ｐＣＢ１０００、ｃｏ４）は、ＣＧジヌクレオチドを保持するＧｅｎｅＡｒｔアルゴリズムを用いてＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコドン最適化した同じカセットと比較して、ＦＶＩＩＩ発現の減少をもたらした。ｃｏ４最適化を有するＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｃｏ２及びｃｏ５最適化とは異なり、測定可能なＦＶＩＩＩ活性を生成することができた。ＡＡＶ８－ｐＣＢ１０２（ｃｏ１コドン最適化ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ＤＮＡ配列、実施例２参照）を受けたマウスは、２×１０１２ｖｇ／ｋｇの同じ用量でＡＡＶ８において送達し、同じ用量のＬＮＰを使用した場合、血友病ＡマウスにおいてＦＶＩＩＩ活性を生成しなかった（実施例２、図２、ＡＡＶ８－ｐＣＢ１０２）。このことは、マウスにおけるアルブミンイントロン１への標的化組込み後のＦＶＩＩＩの発現について、ｃｏ１がｃｏ３及びｃｏ４のコドン最適化ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ配列よりも劣っていたことを実証している。
実施例５：５つのＮ－グリカン並びに代替コドン最適化ｃｏ４及びｃｏ５を有する合成ＦＶＩＩＩをコードするドナー鋳型のアルブミンイントロン１への標的化組込み後のマウスにおけるＦＶＩＩＩの発現
Ｂドメイン置換を有する合成ＦＶＩＩＩを用いて異なるコドン最適化の効果を試験するために、シグナルペプチドを欠くＦＶＩＩＩ－ＢＤＤコード配列を、ｃｏ１、ｃｏ４及びｃｏ５と命名される３つのコドン最適化ＤＮＡ配列を使用し、更にＢドメインの代わりにＢドメイン置換を含んで構築した。Ｂドメイン置換は、５つのＮ－グリカンモチーフ（配列：ＡＴＮＶＳＮＮＳＮＴＳＮＤＳ、配列番号３４３）を含んでいた。これらのコード配列の５’側には、ｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡの標的部位、１８ｂｐスペーサー、スプライスアクセプター、及び２つのヌクレオチド（ＴＧ）が隣接していた。ＴＧジヌクレオチドは、マウスアルブミンエクソン１へのスプライシング後、正しい読み枠を維持する。短いポリアデニル化シグナル（ｓＰＡ）は、コード配列の３’末端に含まれていた。これら３つのプラスミド中の合成ＦＶＩＩＩコード配列は、同一のアミノ酸配列を有するＦＶＩＩＩタンパク質をコードするが、コード配列は、異なるコドン最適化のために異なるＤＮＡ配列によりコードされる。ｐＣＢ１００７（ｃｏ１、配列番号３２６）、ｐＣＢ１０１９（ｃｏ４、配列番号３３２）、及びｐＣＢ１０２０（ｃｏ５、配列番号３３３）と指定されるこれらのプラスミドを、血友病Ａマウスにおいて、ｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡの標的部位でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断によって媒介されるアルブミンイントロン１への標的化組込み後に、活性ＦＶＩＩＩタンパク質を発現する能力について試験した。
実験プロトコルは、実施例１と同一であった。プラスミドｐＣＢ１００７、ｐＣＢ１０１９、及びｐＣＢ１０２９のプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＥｎｄｏＦｒｅｅ（登録商標）ｍａｘｉｐｒｅｐキット（ｃａｔ ＃１２３６２）を使用して精製し、次いで、０．９％生理食塩水中で最終濃度１５μｇ／ｍＬに希釈した。血友病Ａマウスのコホートに、ＨＤＩによりマウス１匹当たり２ｍＬの希釈プラスミドＤＮＡを注射した。翌日、マウスにｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ体重）とｇＲＮＡ ｍＡｌｂＴ１（１ｍｇ／ｋｇ体重）を封入したＣ１２－２００ベースＬＮＰの眼窩後方注射を行った。ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡとｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡを封入したＬＮＰのみを注射した５匹の血友病Ａマウスのコホートを、投与３日後に屠殺し、全肝臓から抽出したゲノムＤＮＡを、アルブミンイントロン１のオンターゲット部位のインデルについて分析した。平均インデル頻度は５２．９％であり、肝臓のオンターゲット部位での効率的な切断を示した。
プラスミドを注射したマウスにＬＮＰを投与した６日後及び９日後に、ＲＯ採血によって血液サンプルをクエン酸ナトリウム（クエン酸ナトリウム対血液の比１：９）に採取し、遠心分離によって血漿を収集した。血漿中のＦＶＩＩＩ活性を、実施例１に記載の方法を用いて測定した。結果を図５にまとめる。
プラスミドｐＣＢ１００７、ｐＣＢ１０１９、又はｐＣＢ１０２０を受けたマウスにおける平均ＦＶＩＩＩ活性は、ＬＮＰ投与後６日目で正常の２２．３％、１７．６％、及び１７．８％であった。プラスミドｐＣＢ１００７、ｐＣＢ１０１９、又はｐＣＢ１０２０を受けたマウスにおける平均ＦＶＩＩＩ活性は、ＬＮＰ投与後９日目で正常の１９．７、１４．１、及び１４．９％であった。３つのプラスミドを投与したマウスにおけるＦＶＩＩＩレベルは、等分散（２標本等分散）両側Ｔ検定を用いて評価した場合、６日目でも９日目でも統計学的有意差はなかった（ｐ値は全て＞０．２８）。
これらの結果は、Ｂドメインの代わりに５つのＮ－グリカンモチーフを含むＢドメイン置換を有する合成ＦＶＩＩＩをコードするドナー鋳型の状況において、コドン最適化ｃｏ１、ｃｏ４及びｃｏ５（これらの全ては、ＣＧジヌクレオチドを欠く）がアルブミンイントロン１への標的化組込み後に同様のレベルのＦＶＩＩＩを産生したことを実証する。従って、特定のコドン最適化に明らかな利点はなく、ＣｐＧを含まないコドン最適化（例えば、ｃｏ１、ｃｏ４、及びｃｏ５）は、標的化組込み後に類似のレベルの合成ＦＶＩＩＩタンパク質を提供する。
実施例６：Ｂドメイン置換とＦ３０９のＳ又はＡへの突然変異の組み合わせ
Ａ１ドメインにおけるシャペロン免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）の潜在的結合部位内の点突然変異（Ｆ３０９Ｓ）は、培養物中の細胞においてＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩの分泌を約３倍改善したことが報告されている（Ｍ．Ｓｗａｒｏｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９７）２７２：２４１２１－２４）。ＦＶＩＩＩのＦ３０９Ａ突然変異タンパク質は、同様に分泌を改善した。Ｆ３０９ＳとＢドメインの２２６アミノ酸Ｎ末端部分の組み合わせは、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩと比較して、マウスにおけるインビボでのＦＶＩＩＩレベルを２０～３０倍改善し、一方、Ｂドメインの２２６アミノ酸Ｎ末端の付加は、ＦＶＩＩＩレベルを５倍だけ改善したことが報告された（Ｈ．Ｚ．Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００４）１０３（９）：３４１２－１９）。
３０９のフェニルアラニン残基をセリン又はアラニンで置換したＢドメイン置換の組み合わせが、標的化組込み後のＦＶＩＩＩ発現の更なる改善をもたらすかどうかを評価するために、プラスミドｐＣＢ１０２５（配列番号３３４）及びｐＣＢ１０２６（配列番号３３５）を構築した。両方のプラスミドは、５つのＮ結合グリコシル化部位を含むＢドメイン置換を有するコドンｃｏ４のコドン最適化ＦＶＩＩＩ ＤＮＡ配列を含んでいた。プラスミドは、以下のエレメントを有していた：ｐＵＣ１９プラスミド骨格｜ｇＲＮＡ ｍＡＬｂＴ１の標的部位｜１８ｂｐスペーサー｜スプライスアクセプター（ＳＡ）｜ＴＧジヌクレオチド｜５部位Ｂドメイン置換を有するＦＶＩＩＩ配列（ｃｏ４）｜ポリＡ（ｓＰＡ）。プラスミドｐＣＢ１００７は、ｐＣＢ１０２５が３０９位にＰｈｅの代わりにＡｌａを有し、ｐＣＢ１０２６が３０９位にＰｈｅの代わりにＳｅｒを有したことを除いて、ｐＣＢ１０２５及びｐＣＢ１０２６と同一であった。この研究では、対照薬としてプラスミドｐＣＢ１００７を用いた。
実験プロトコルは、実施例１と同一であった。プラスミドｐＣＢ１００７、ｐＣＢ１０２５、及びｐＣＢ１０２６を、Ｑｉａｇｅｎ ＥｎｄｏＦｒｅｅ（登録商標）ｍａｘｉｐｒｅｐキット（ｃａｔ ＃１２３６２）を使用して精製し、次いで、０．９％生理食塩水中で最終濃度１５μｇ／ｍＬに希釈した。血友病Ａマウスのコホートに、ＨＤＩによりマウス当たり２ｍＬの希釈プラスミドＤＮＡを注射した。翌日、ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）とｇＲＮＡ ｍＡｌｂＴ１（１ｍｇ／ｋｇ）を封入したＣ１２－２００ベースＬＮＰのＲＯ注射をマウスに与えた。ＬＮＰ投与の５日後（ｐＣＢ１０２５、ｐＣＢ１０２６）又はＬＮＰ投与の６日後（ｐＣＢ１０１９）に、ＲＯ採血によって血液サンプルをクエン酸ナトリウム（クエン酸ナトリウム対血液の比１：９）に採取し、遠心分離によって血漿を収集した。血漿中のＦＶＩＩＩ活性を、実施例１に記載の方法を用いて測定した。ＦＶＩＩＩ活性は、ｐＣＢ１０１９、ｐＣＢ１０２５、又はｐＣＢ１０２６を注射したマウスの３グループで同様であり、平均ＦＶＩＩＩ活性は、各々１７．６％、２７．２％、及び２４．５％であった。
同じ血友病Ａマウスの血液中のＦＶＩＩＩ活性もまた、ＬＮＰ後９日目（ｐＣＢ１０１９注射マウス）又はＬＮＰ後７日目（ｐＣＢ１０２５及びｐＣＢ１０２６注射マウス）にアッセイした。次いで、マウスを屠殺し、全肝臓を調製し、上記の実施例１に記載されたように組込み頻度について分析した。標的化組込み頻度は、３グループ間で類似しており、平均頻度は、ｐＣＢ１０１９注射マウスで０．４２、ｐＣＢ１０２５注射マウスで０．４７、ｐＣＢ１０２６注射マウスで０．３６であった。
各マウスの血液中のＦＶＩＩＩレベルを組込み頻度に正規化することにより、ＦＶＩＩＩコード配列の固有発現効率の尺度が提供される。ＦＶＩＩＩレベルを標的化組込み頻度で除した比の平均は、ｐＣＢ１０１９を注射したマウスでは３７．４、ｐＣＢ１０２５を注射したマウスでは４１．５、ｐＣＢ１０２６を注射したマウスでは４９．９であった。ｐＣＢ１０２５及びｐＣＢ１０２６を注射したマウスの標的化組込みに対して正規化したＦＶＩＩＩ活性の差は、ｐＣＢ１０１９を注射したマウスと比較して統計的に有意ではなく（両側スチューデントＴ検定）、アミノ酸Ｆ３０９をセリン又はアラニン（Ｂドメインの代わりに５つのＮ－グリカンモチーフを含むＦＶＩＩＩ－ＢＤＤカセットの状況で）に変更してもＦＶＩＩＩ発現は改善されないことが実証された。従って、ＶＩＩＩタンパク質に加えられた全てのアミノ酸変化が、アルブミンイントロン１への標的化組込み後のＶＩＩＩの発現に影響を及ぼすわけではない。
実施例７：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによる合成ＦＶＩＩＩのトランスフェリンイントロン１への標的化組込みは、ヒトＦＶＩＩＩの治療レベルの発現をもたらす
ＤＮＡ構築物
アルブミン遺伝子座の代替としてトランスフェリン遺伝子座への組込み及びトランスフェリン遺伝子座からの発現を調べるために、ヒトＦＶＩＩＩドナーカセット（配列番号２２４）を、以下のように５’から３’の順で配列エレメントを用いて構築した：ＡＡＶ２の逆方向末端反復（ＩＴＲ）｜ｇＲＮＡ ｍＴＦ－Ｔ２の標的部位｜１８ｂｐスペーサー｜スプライスアクセプター｜マウストランスフェリンのシグナルペプチドの最後の４アミノ酸をコードする配列（ｇｇｃｔｇｔｇｔｃｔｇｇｃｔ、配列番号２２５）｜合成ＦＶＩＩＩコード配列｜ポリアデニル化シグナル（ｓｐＡ）｜ｇＲＮＡ ｍＴＦ－Ｔ２の標的部位｜ＡＡＶ２の逆方向末端反復（ＩＴＲ）。ｇＲＮＡ ｍＴＦ－Ｔ２の標的部位の配列は、マウスゲノム中の標的配列の逆相補体であり、これは、順方向での組込みに有利に働く可能性が存在する。ポリアデニル化シグナルは、ポリアデニル化を効果的に誘導することが報告されている短い４９ｂｐの配列である（Ｎ．Ｌｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ（１９８９）３：１０１９－２５）。合成ＦＶＩＩＩコード配列は、Ｂドメインの代わりにアミノ酸配列
Figure 2023520262000017
 を含むＢドメイン置換をコードし、Ｂドメインを置換する異種３１アミノ酸配列を含んでいた。この配列は、Ｎ結合グリコシル化部位（太字で表される）に対応する６つのトリペプチドを含み、ＦＶＩＩＩの発現を改善することが示されている（Ｊ．ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１３）１２１：３３３５－４４）。
ｐＣＢ１００９ ＦＶＩＩＩドナーＤＮＡのＡＡＶ８へのパッケージングは、３つのプラスミド；１つは、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードし、２つ目は、アデノウイルスヘルパータンパク質をコードし、３つ目は、ＡＡＶ ＩＴＲ配列が隣接するＦＶＩＩＩドナーＤＮＡ配列を含む、でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において確立されたウイルスパッケージング方法を用いて達成された。トランスフェクトされた細胞は、第１のプラスミド上にコードされるＡＡＶカプシドタンパク質の組成によって特定される血清型のＡＡＶ粒子を生じた。これらのＡＡＶ粒子を細胞上清又は上清及び溶解細胞から回収し、ＣｓＣｌ勾配で精製した。デジタル液滴ＰＣＲ（ＤＤ－ＰＣＲ）によりドナーＤＮＡのゲノムコピー数を測定することにより、精製ウイルス粒子を定量した。
構築物のインビボ試験
５匹の血友病Ａマウスのコホートに、２×１０１２ｖｇ／ｋｇ体重の用量でＡＡＶ８－ｐＣＢ１００９を尾静脈に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。ＡＡＶ８ウイルスは、肝細胞を優先的に形質導入する。４週間後、同じマウスに、１つはｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡを封入し、１つはガイドＲＮＡ ｍＴＦ－Ｔ２を封入した２つのＬＮＰの１：１（ＲＮＡの質量による）混合物を、２ｍｇ／ｋｇ体重の総ＲＮＡ用量で静脈内注射した。ＬＮＰは、主に肝細胞に取り込まれる。ＬＮＰを投与した１０日後、血液サンプルを得、上記のようにアッセイした。ＦＶＩＩＩ活性は、正常ヒトＦＶＩＩＩレベルの平均９５４％（±２５１％）であり（図６）、９．５４ＩＵ／ｍＬ又は血友病ではないヒトの平均レベルの９．５倍に相当した。ナイーブな血友病Ａマウスでは、ＦＶＩＩＩ活性が検出されなかった（正常の０．５％未満）。
これらのデータは、トランスフェリンのイントロン１へのＦＶＩＩＩコード配列の標的化組込みが、高レベルのＦＶＩＩＩ発現及び活性をもたらし得ることを実証し、血友病Ａのような欠陥ＦＶＩＩＩを有する状態を処置するためのこの方法の有用性を実証する。
実施例８：更なる送達様式
別の実施例において、ドナー鋳型は、非ウイルスＬＮＰ送達システムを用いてインビボで送達される。ＤＮＡ分子は、上記のものと同様のＬＮＰ粒子に封入され、静脈内注射によって肝臓に送達される。エンドソームから細胞質へのＤＮＡの脱出は比較的効率よく起こるが、大きい荷電ＤＮＡ分子の核内への移行は効率的ではない。ある場合に、ＡＡＶ ＩＴＲ配列をドナー鋳型に組込むことによってＡＡＶゲノムを模倣することにより、核へのＤＮＡの送達が改善される。この場合、ＩＴＲ配列は、ＤＮＡを安定化させるか、又はさもなければ核移行を改善する。ドナー鋳型配列からＣＧジヌクレオチド（ＣｐＧ配列）を除去することもまた、核送達を改善する。ＣＧジヌクレオチドを含むＤＮＡは、自然免疫システムによって認識され、排除される。人工ＤＮＡ配列中に存在するＣｐＧ配列の除去は、非ウイルス及びウイルスベクターによって送達されるＤＮＡの持続性を改善する。コドン最適化のプロセスは、多くの場合、最も頻繁なコドンが第３位にＣ残基を有するので、一般にＣＧジヌクレオチドの含有量を増加させ、これは、次のコドンがＧで始まる場合にＣＧの生成の機会を増加させる。ドナー鋳型のＬＮＰ送達と、続いて１時間～５日後のｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡを含むＬＮＰの送達の組み合わせを、血友病Ａマウスにおいて評価する。
ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡのインビボ送達は、公知の方法によって達成され得る。１つの方法では、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質は、ＡＡＶウイルスベクターから発現される。この場合、ｇＲＮＡの転写はＵ６プロモーターによって駆動され、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの転写は、ユビキタスプロモーター、例えばＥＦ１－α、又はトランスサイレチンプロモーター／エンハンサーのような肝臓特異的プロモーター／エンハンサーのいずれかによって駆動される。ｓｐＣａｓ９コード配列（４．４Ｋｂ）のサイズは、単一のＡＡＶにおけるｓｐＣａｓ９及びｇＲＮＡカセットの包接を排除し、それによって、ｇＲＮＡ及びｓｐＣａｓ９を送達するために別個のＡＡＶを必要とする。第２の場合では、ウイルスゲノムの自己不活性化を促進する配列エレメントを有するＡＡＶベクターが使用される。この場合、ベクターＤＮＡ中にｇＲＮＡの切断部位を含めることによって、インビボでのベクターＤＮＡの切断が生じる。切断された場合にＣａｓ９の発現をブロックする位置に切断部位を含めることによって、Ｃａｓ９発現は、より短時間に限定される。ｇＲＮＡ及びＣａｓ９をインビボで細胞に送達するための第３の代替アプローチでは、非ウイルス送達方法が用いられる。一例では、非ウイルス送達方法としてＬＮＰが使用される。いくつかの異なるイオン化可能なカチオン性脂質が、ＬＮＰにおける使用のために利用可能である。これらには、とりわけ、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＬＮ１６、及びＭＤ１が含まれる。ＬＮＰの１つのタイプにおいて、ＧａｌＮａｃ部分がＬＮＰの外側に結合され、アシアロ糖タンパク質受容体を介して肝臓への取り込みのためのリガンドとして作用する。これらのカチオン性脂質のいずれも、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡの肝臓への送達のためのＬＮＰを処方するために使用される。
実施例９：マウスフィブリノーゲンαイントロン１における治療コード配列の標的化組込み
アルブミン又はトランスフェリン遺伝子座の代替として、フィブリノーゲンα遺伝子座への組込み及びフィブリノーゲンα遺伝子座からの発現を調べるために、以下のエレメントを有するカセットを有するＡＡＶ８ウイルス（ＡＡＶ８－ｐＣＢ１０１０、配列番号３６１）を構築した：ｇＲＮＡ ｍＦＧＡ－Ｔ６の標的部位、１８ｂｐスペーサー、ＦＩＸスプライスアクセプター、成熟ヒトＦＶＩＩＩコード配列（内因性ＦＧＡエクソン１へのスプライシング後にＦＧＡシグナルペプチドを完了するように改変されたＮ末端を有する）（ここでＢドメインは、６つのＮ－グリカンモチーフ、ポリアデニル化配列、及びｇＲＮＡ ｍＦＧＡ－Ｔ６の標的部位で置換されている）。
血友病ＡマウスにＡＡＶ８－ｐＣＢ１０１０を注射し、２８日後にＴ６ ｇＲＮＡ（マウスフィブリノーゲンαイントロン１を標的とする）とＣａｓ９ ｍＲＮＡを封入したＬＮＰを投与した。ＬＮＰの投与の１０日後、血液サンプルを、クエン酸ナトリウム（クエン酸ナトリウム対血液の比１：９）を含むキャピラリーチューブ中に眼窩後方採血によって採取し、血漿を遠心分離によって収集した。次いで、血漿サンプルを、上記のようにＦＶＩＩＩについてアッセイした。アッセイ結果は、正常なヒトＦＶＩＩＩ活性（正常は、１ＩＵ／ｍＬと規定）のパーセンテージとして報告した。ＦＶＩＩＩ活性は、正常ヒトＦＶＩＩＩレベルの平均１１２４％（±５２７％）であり、１１．２４ＩＵ／ｍＬ又は血友病ではないヒトの平均レベルの１１倍に相当した。ナイーブな血友病Ａマウスでは、ＦＶＩＩＩ活性が検出されなかった（正常の０．５％未満）。ＡＡＶ８－ｐＣＢ１０１０ウイルスは、コード配列がシグナルペプチドを欠き、プロモーターも欠くＶＩＩＩカセットを含むので、このウイルスのみでは、分泌されたＶＩＩＩタンパク質を生じさせることができない。
これらのデータは、コード配列の挿入のための部位としてのフィブリノーゲンの適合性を実証する。更に、それらは、Ｂドメイン置換ＦＶＩＩＩ配列が有用な量のＦＶＩＩＩを発現するために使用され得ることを実証する。従って、このような構築物及び方法は、欠陥ＦＶＩＩＩに関連する障害を処置するために使用することができる。
実施例１０：培養物中の初代ヒト肝細胞のヒトアルブミンイントロン１で効率よく切断するガイドＲＮＡの同定及び選択
ヒト肝細胞における本発明のシステムの操作を実証するために、ヒトと非ヒト霊長類間の完全な同一性を有すること、並びに初代ヒト肝細胞における切断効率の評価のためのＨｕＨ７及びＨｅｐＧ２細胞における切断効率についてのスクリーニングに基づいて、４つのｇＲＮＡ（Ｔ４－配列番号３５７、Ｔ５－配列番号３５８、Ｔ１１－配列番号３５９、及びＴ１３－配列番号３６０）を調製した。初代ヒト肝細胞（ＢｉｏＩＶＴから入手）を解凍し、凍結保存肝細胞回収媒体（ＣＨＲＭ）（Ｇｉｂｃｏ）に移し、低速でペレット化し、次いで、コラーゲンＩＶ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で予めコーティングした２４ウェルプレート中、０．７×１０６細胞／ｍＬの密度で、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ（商標）ＣＰ媒体（ＢｉｏＩＶＴ）＋Ｔｏｒｐｅｄｏ（商標）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｉｘ（ＢｉｏＩＶＴ）中にプレーティングした。プレートを５％ ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。細胞が接着した後（プレーティングの３～４時間後）、プレートに接着しなかった死細胞を新鮮な温かい完全培地で洗い流し、更なる培地を添加し、細胞を５％ ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。細胞をトランスフェクトするために、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）及びガイドＲＮＡを氷上で解凍し、次いで、ウェル当たり０．６μｇのｍＲＮＡ及び０．２μｇのガイドＲＮＡで３０μＬのＯｐｔｉ－Ｍｅｍ（商標）培地（Ｇｉｂｃｏ）に添加した。Ｏｐｔｉ－Ｍｅｍ（商標）中に２：１の体積対全核酸重量で３０μＬ希釈したＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ Ｏｐｔｉ－Ｍｅｍ（商標）溶液と共に室温で２０分間インキュベートした。この混合物を、２４ウェルプレート中の培養肝細胞の１ウェル当たり５００μＬの肝細胞プレーティング培地に滴加し、細胞を５％ ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。細胞を洗浄し、翌朝再給餌した。２００μＬの温０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を各ウェルに添加し、３７℃で５～１０分間インキュベートすることによって、トランスフェクションの４８時間後にゲノムＤＮＡ抽出のために細胞を収集した。細胞を除去した後、２００μＬのＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を添加してトリプシンを不活性化した。１ｍＬのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した後、細胞を１２００ｒｐｍで３分間ペレット化し、次いで５０μＬのＰＢＳに再懸濁した。ゲノムＤＮＡを、ＭａｇＭＡＸ（商標）ＤＮＡ Ｍｕｌｔｉ－Ｓａｍｐｌｅ Ｕｌｔｒａ ２．０ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）を使用して、キットの説明書に従って抽出した。ゲノムＤＮＡの質及び濃度を、分光光度計を用いて分析した。ＴＩＤＥ分析のために、ゲノムＤＮＡを、３５サイクルのＰＣＲ及び５５℃のアニーリング温度を使用して、予想されるオンターゲット切断部位に隣接するプライマー（ＡｌｂＦ：ＣＣＣＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＡＧＣＴＴＴＴＣ、配列番号３５３、及びＡｌｂＲ：ＣＣＡＧＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡ、配列番号３５４）及びＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動によって分析して、正しいサイズの生成物（１０５３ｂｐ）が産生されたことを確認し、次いで精製し、プライマー（順方向：ＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧ、配列番号３５５；逆方向：ＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧ、配列番号３５６）を使用して配列決定した。配列データを、Ｔｓｕｎａｍｉと命名されたＴＩＤＥＳアルゴリズム（Ｅ．Ｋ．Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１４）４２（２２）：ｅ１６８）の改変バージョンを使用して分析した。これは、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の予測される切断部位に存在するインデルの頻度を決定する。
Ｔ４（配列番号３５７）、Ｔ５（配列番号３５８）、Ｔ１１（配列番号３５９）、及びＴ１３（配列番号３６０）ガイドの２０ヌクレオチド標的配列又は１９ヌクレオチド標的配列（５’末端で１ｂｐ短い）のいずれかを含むガイドＲＮＡを試験した。１９ヌクレオチドｇＲＮＡは、より配列特異的であり得るが、より短いガイドは、より低い効力（インデルとして測定される二本鎖切断における効率）を有し得る。ヒトＡＡＶＳ１遺伝子座及びヒト補体因子を標的とする対照ガイドを、ドナー間の比較のために含めた。アルブミンイントロン１中の標的部位におけるインデル頻度を、ＴＩＤＥＳ方法を用いてトランスフェクションの４８時間後に測定した。図７に、４つの異なるヒトドナー由来の初代肝細胞のトランスフェクションの結果をまとめる。
結果は、異なるガイドについて２０％～８０％の範囲の切断効率を実証する。各アルブミンｇＲＮＡの２０ヌクレオチドバージョンは、１９ヌクレオチド変異体よりも一貫して強力であった。２０ヌクレオチドのｇＲＮＡの効力が優れていることは、１９ヌクレオチドｇＲＮＡがオフターゲット切断が少ないという点で有益である可能性を相殺するかもしれない。ガイドＲＮＡ Ｔ４は、インデル頻度が約６０％で、４つの細胞ドナーにわたって最も一貫した切断を示した。
実施例１１：異なる数のＮ－グリカンからなるＢ－ドメイン置換を有するコドン最適化ＦＶＩＩＩコード配列（ＣｐＧを含まない）を封入したＡＡＶ８ウイルスと、それに続くトランスフェリン遺伝子座を標的とするｇＲＮＡを有する単一ＬＮＰ用量からのＦＶＩＩＩ発現の評価
この研究は、Ｂドメイン置換が０、１、３、５、又は６個のグリカンのいずれかを含むＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶ８ウイルスからのＦＶＩＩＩ発現を評価した。ＦＶＩＩＩコード配列をコドン最適化し、次いでＣｐＧを手動で除去した。この研究で使用した構築物を図９に示す。
０日目に、血友病Ａマウス（８～１０週齢）に、尾静脈注射により各々のウイルスを投与した。２８日目に、血友病Ａマウスに、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（４１１μｇ／ｍｌ）及びガイドＲＮＡ ｍＴＦ－Ｔ２（３７９μｇ／ｍｌ）を封入した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を眼窩後方注射した。試験グループ及び投与量を表７に示す。
Figure 2023520262000018
ＬＮＰの投与の１１日後、血液サンプルを得、上記のようにアッセイした。次いで、ＬＮＰの投与の１８日後、血液サンプルを、末期心臓出血を介して得、上記のようにアッセイした。
１１日目に測定されたＦＶＩＩＩ活性レベルを図１０に示す。１８日目に測定されたＦＶＩＩＩ活性レベルを図１１に示す。ＦＶＩＩＩ活性レベルを表８及び９に提供する。
Figure 2023520262000019
Figure 2023520262000020
マウスを屠殺した後、全肝臓をホモジナイズし、全ゲノムＤＮＡを肝臓溶解物の一部から抽出した。順方向におけるアルブミンイントロン１への標的化組込みの頻度を、実施例１に記載のＤＤ－ＰＣＲアッセイを用いて定量した。結果を図１２及び表１０に示す。
Figure 2023520262000021
これらのデータは、０、１、３、５又は６個のいずれかのグリカンを含むＦＶＩＩＩコード配列が高レベルのＦＶＩＩＩ発現及び活性をもたらし得ることを実証し、血友病Ａのような欠陥ＦＶＩＩＩを有する状態を処置するためのこの方法の有用性を実証する。
本開示は、いくつかの説明された実施形態に関して、ある長さで、ある特定性を伴って説明されてきたが、本開示は任意のそのような詳細又は実施形態又は任意の特定の実施形態に限定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されて、先行技術に鑑みて、そのような特許請求の範囲の可能な限り広い解釈を提供し、従って、本開示の意図された範囲を効果的に包含するべきである。
配列表
本開示の他の箇所に開示される配列に加えて、以下の配列は、説明の目的のために提供される本開示の例示的な実施形態においてそれらが言及又は使用されているために提供される。
Figure 2023520262000022
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Claims (136)

  1. 宿主細胞ＤＮＡ配列を改変するためのシステムであって：
    デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と；
    宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸と；
    合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型であって、前記合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を含み、前記Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を含むドナー鋳型と
    を含むシステム。
  2. 前記Ｂドメイン置換が、０～６個のＮ結合グリコシル化部位を含む、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記Ｂドメイン置換が、０～３個のＮ結合グリコシル化部位を含む、請求項２に記載のシステム。
  4. 前記Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６９、３７１及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のシステム。
  5. 前記Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６６、３７１及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列、又は配列番号３６２～３６６、３７１及び３７３のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体を含む、請求項４に記載のシステム。
  6. 前記Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６４、３７１及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のシステム。
  7. 前記宿主細胞遺伝子座が、肝臓で発現される遺伝子の遺伝子座である、請求項１～６のいずれか１項に記載のシステム。
  8. 前記宿主細胞遺伝子座が、急性期タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座である、請求項１～７のいずれか１項に記載のシステム。
  9. 前記急性期タンパク質が、アルブミン、トランスフェリン、又はフィブリノーゲンである、請求項８に記載のシステム。
  10. 前記宿主細胞遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、請求項１～７のいずれか１項に記載のシステム。
  11. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、並びにその機能的誘導体からなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか１項に記載のシステム。
  12. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項１１に記載のシステム。
  13. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸が、前記宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１～１１のいずれか１項に記載のシステム。
  14. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項１～１３のいずれか１項に記載のシステム。
  15. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１～１３のいずれか１項に記載のシステム。
  16. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１５に記載のシステム。
  17. 前記ドナー鋳型核酸配列が、前記宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１～１６のいずれか１項に記載のシステム。
  18. 前記ドナー鋳型核酸配列が、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする野生型核酸配列と比較して、ＣｐＧジヌクレオチドの減少した含有量を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載のシステム。
  19. 前記ドナー鋳型核酸配列がＣｐＧジヌクレオチドを含まない、請求項１８に記載のシステム。
  20. 前記ドナー鋳型が、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる、請求項１～１９のいずれか１項に記載のシステム。
  21. 前記ドナー鋳型が、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、請求項１～２０のいずれか１項に記載のシステム。
  22. 前記ドナーカセットの両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、請求項２１に記載のシステム。
  23. 前記ドナーカセットの５’側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、請求項２１に記載のシステム。
  24. 前記ｇＲＮＡ標的部位が、前記システム中のｇＲＮＡの標的部位である、請求項２１～２３のいずれか１項に記載のシステム。
  25. 前記ドナー鋳型の前記ｇＲＮＡ標的部位が、前記システム中のｇＲＮＡに対するゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、請求項２４に記載のシステム。
  26. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、リポソーム又は脂質ナノ粒子中に含まれる、請求項１～２５のいずれか１項に記載のシステム。
  27. 前記リポソーム又は脂質ナノ粒子が前記ｇＲＮＡも含む、請求項２６に記載のシステム。
  28. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが前記ｇＲＮＡと複合体化され、それによってリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を提供する、請求項１～２７のいずれか１項に記載のシステム。
  29. 宿主細胞内のゲノムを編集する方法であって：
    （ａ）宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸と；
    （ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と；
    （ｃ）合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型であって、前記合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を含み、前記Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を含むドナー鋳型と、
    を前記細胞に提供することを含む方法。
  30. 前記Ｂドメイン置換が、０～６個のＮ結合グリコシル化部位を含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記Ｂドメイン置換が、０～３個のＮ結合グリコシル化部位を含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６９、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の方法。
  33. 前記Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６６、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列、又は配列番号３６２～３６６、３７１、及び３７３のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体を含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６４、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記宿主細胞内因性遺伝子座が、肝臓で発現される遺伝子の遺伝子座である、請求項２９～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記宿主細胞内因性遺伝子座が、急性期タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座である、請求項２９～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記急性期タンパク質が、アルブミン、トランスフェリン、又はフィブリノーゲンである、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記宿主細胞内因性遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、請求項２９～３４のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；又はその機能的誘導体からなる群から選択される、請求項２９～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸が、前記宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項２９～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がＤＮＡである、請求項２９～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項２９～４１のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ドナー鋳型がＡＡＶベクターにコードされる、請求項２９に記載の方法。
  46. 前記ドナー鋳型核酸配列が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項２９～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記ドナー鋳型核酸配列が、ＦＶＩＩＩをコードする野生型核酸配列と比較して、ＣｐＧジヌクレオチドの減少した含有量を含む、請求項２９～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記ドナー鋳型核酸配列がＣｐＧジヌクレオチドを含まない、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記ドナー鋳型が、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、請求項２９～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記ドナーカセットの両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記ドナーカセットの５’側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、請求項４９に記載の方法。
  52. 前記ｇＲＮＡ標的部位が、（ａ）の前記ｇＲＮＡの標的部位である、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記ドナー鋳型の前記ｇＲＮＡ標的部位が、（ａ）の前記ｇＲＮＡに対する前記細胞ゲノム中のｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、リポソーム又は脂質ナノ粒子中に処方される、請求項２９～５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記リポソーム又は脂質ナノ粒子が前記ｇＲＮＡも含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ及び前記ｇＲＮＡが、前記ｇＲＮＡと予め複合体化された前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含むＲＮＰ複合体として前記宿主細胞に提供される、請求項２９～５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. （ａ）の前記ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸、及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、（ｃ）の前記ドナー鋳型が前記細胞に提供されて４日を超えた後に前記細胞に提供される、請求項２９～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. （ａ）の前記ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸、及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、（ｃ）の前記ドナー鋳型が前記細胞に提供された少なくとも１４日後に前記細胞に提供される、請求項２９～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. （ａ）の前記ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸、及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の更なる用量が、（ａ）の前記ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸、及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の第１の用量に続いて前記細胞に提供される、請求項５７又は５８に記載の方法。
  60. （ａ）の前記ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸、及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の更なる用量が、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列の標的化組込みの標的レベルが達成されるか、又は合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列の標的発現レベルが達成されるまで、（ａ）の前記ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸、及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の前記第１の用量に続いて前記細胞に提供される、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記細胞が肝臓細胞である、請求項２９～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記細胞がヒト肝細胞又はヒト類洞上皮細胞である、請求項６１に記載の方法。
  63. 細胞であって、前記細胞のゲノムが合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＤＮＡを含み、前記合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を含み、前記Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を含む、細胞。
  64. 前記合成ＦＶＩＩＩタンパク質が、内因性アルブミンプロモーター、内因性トランスフェリンプロモーター、又は内因性フィブリノーゲンαプロモーターに作動可能に連結される、請求項６３に記載の細胞。
  65. 前記合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項６３に記載の細胞。
  66. 前記細胞がヒト肝臓細胞である、請求項６３に記載の細胞。
  67. 前記細胞が、ヒト肝細胞又はヒト類洞上皮細胞である、請求項６６に記載の細胞。
  68. 前記細胞が、請求項２９～６２のいずれか１項に記載の方法によって調製され、又は請求項２９～６２のいずれか１項に記載の方法によって調製された細胞の子孫である、請求項６７に記載の細胞。
  69. 対象における血友病Ａを処置する方法であって、以下：
    （ａ）宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸；
    （ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び
    （ｃ）合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型であって、前記合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を含み、前記Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を含む、ドナー鋳型
    を前記対象の細胞に提供することを含む、方法。
  70. 前記Ｂドメイン置換が、０～６個のＮ結合グリコシル化部位を含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記Ｂドメイン置換が、０～３個のＮ結合グリコシル化部位を含む、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６９、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項６９に記載の方法。
  73. 前記Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６６、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列、又は配列番号３６２～３６６、３７１、及び３７３のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体を含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６４、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記宿主細胞遺伝子座が、肝臓で発現される遺伝子の遺伝子座である、請求項６９～７４のいずれか１項に記載の方法。
  76. 前記宿主細胞遺伝子座が、急性期タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座である、請求項６９～７５のいずれか１項に記載の方法。
  77. 前記急性期タンパク質が、アルブミン、トランスフェリン、又はフィブリノーゲンである、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記宿主細胞遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、請求項６９～７４のいずれか１項に記載の方法。
  79. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；又はその機能的誘導体からなる群から選択される、請求項６９～７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記Ｃａｓ９がｓｐＣａｓ９又はＳｌｕＣａｓ９である、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項６９～８１のいずれか１項に記載の方法。
  83. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がＤＮＡである、請求項６９～８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がＲＮＡである、請求項６９～８２のいずれか１項に記載の方法。
  85. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項８４に記載の方法。
  86. （ａ）の前記ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸、（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、及び（ｃ）の前記ドナー鋳型のうちの１つ以上が、リポソーム又はＬＮＰ中に処方される、請求項６９～８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. 前記ドナー鋳型がＡＡＶベクターにコードされる、請求項６９～８６のいずれか１項に記載の方法。
  88. 前記ドナー鋳型核酸配列が、前記宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項６９～８７のいずれか１項に記載の方法。
  89. 前記ドナー鋳型核酸配列が、ＦＶＩＩＩをコードする野生型核酸配列と比較して、ＣｐＧジヌクレオチドの減少した含有量を含む、請求項６９～８８のいずれか１項に記載の方法。
  90. 前記ドナー鋳型核酸配列がＣｐＧジヌクレオチドを含まない、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記ドナー鋳型が、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、請求項６９～９０のいずれか１項に記載の方法。
  92. 前記ドナーカセットの両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記ドナーカセットの５’側にｇＲＮＡ標的部位が隣接している、請求項９１に記載の方法。
  94. 前記ｇＲＮＡ標的部位が、前記ｇＲＮＡの標的部位である、請求項９１～９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. 前記ドナー鋳型の前記ｇＲＮＡ標的部位が、（ａ）の前記ｇＲＮＡに対する前記細胞ゲノム中の前記ｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記ドナー鋳型を前記細胞に提供することが、前記ドナー鋳型を前記対象に静脈内投与することを含む、請求項６９～９５のいずれか１項に記載の方法。
  97. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、リポソーム又はＬＮＰ中に処方される、請求項６９～９６のいずれか１項に記載の方法。
  98. 前記リポソーム又はＬＮＰが前記ｇＲＮＡも含む、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸、及び前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記細胞に提供することが、前記リポソーム又は脂質ナノ粒子を前記対象に静脈内投与することを含む、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ及び前記ｇＲＮＡがリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として前記宿主細胞に提供され、このＲＮＰ複合体が、前記ｇＲＮＡと複合体化された前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む、請求項６９～９９のいずれか１項に記載の方法。
  101. （ａ）の前記ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸、及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、（ｃ）の前記ドナー鋳型が前記細胞に提供されて４日を超えた後に前記細胞に提供される、請求項６９～１００のいずれか１項に記載の方法。
  102. （ａ）の前記ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸、及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、（ｃ）の前記ドナー鋳型が前記細胞に提供された少なくとも１４日後に前記細胞に提供される、請求項６９～１０１のいずれか１項に記載の方法。
  103. （ａ）の前記ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸、及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の更なる用量が、（ａ）の前記ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸、及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の第１の用量に続いて前記細胞に提供される、請求項１０１又は１０２に記載の方法。
  104. （ａ）の前記ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸、及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の更なる用量が、合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列の標的化組込みの標的レベル及び／又は合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列の標的発現レベルが達成されるまで、（ａ）の前記ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸、及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の前記第１の用量に続いて前記細胞に提供される、請求項１０３に記載の方法。
  105. （ａ）の前記ｇＲＮＡ及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記細胞に提供することが、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸及び前記ｇＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を前記対象に投与することを含む、請求項１０１～１０４のいずれか１項に記載の方法。
  106. （ｃ）の前記ドナー鋳型を前記細胞に提供することが、ＡＡＶベクターにコードされる前記ドナー鋳型を前記対象に投与することを含む、請求項１０１～１０５のいずれか１項に記載の方法。
  107. 前記細胞が肝細胞である、請求項６９～１０６のいずれか１項に記載の方法。
  108. 合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列が、前記対象の前記肝臓で発現される、請求項６９～１０７のいずれか１項に記載の方法。
  109. 請求項６３～６８のいずれか１項に記載の細胞を対象に投与することを含む、前記対象における血友病Ａを処置する方法。
  110. 前記細胞が、前記対象に対して自己である、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記対象から生物学的サンプルを得ることを更に含み、前記生物学的サンプルが肝臓細胞を含み、前記細胞が前記肝臓細胞から調製される、請求項１１０に記載の方法。
  112. 使用説明書を更に含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載のシステムの１つ以上の要素を含むキット。
  113. 合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を含み、前記Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を含む、核酸。
  114. 前記Ｂドメイン置換が、０～６個のＮ結合グリコシル化部位を含む、請求項１１３に記載の核酸。
  115. 前記Ｂドメイン置換が、０～３個のＮ結合グリコシル化部位を含む、請求項１１３に記載の核酸。
  116. 前記Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６９、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１１３に記載の核酸。
  117. 前記Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６４、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列、又は配列番号３６２～３６４、３７１、及び３７３のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体を含む、請求項１１６に記載の核酸。
  118. 前記Ｂドメイン置換が、配列番号３６２～３６３、３７１、及び３７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１１６に記載の核酸。
  119. 合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１１３～１１８のいずれか１項に記載の核酸。
  120. 合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ＦＶＩＩＩをコードする野生型核酸配列と比較して、ＣｐＧジヌクレオチドの減少した含有量を含む、請求項１１３～１１９のいずれか１項に記載の核酸。
  121. 合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列がＣｐＧジヌクレオチドを含まない、請求項１２０に記載の核酸。
  122. 前記核酸がウイルスベクターである、請求項１１３～１２１のいずれか１項に記載の核酸。
  123. 前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項１２２に記載の核酸。
  124. 対象におけるＦＶＩＩＩの量を増加させる方法であって：
    ＦＶＩＩＩの第１の血清レベルを有する前記対象の細胞に、以下：
    （ａ）宿主細胞遺伝子座に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡをコードする核酸；
    （ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び
    （ｃ）合成ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含むドナー鋳型であって、前記合成ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン置換を含み、前記Ｂドメイン置換が０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を含む、ドナー鋳型
    を提供することを含む、方法。
  125. ＦＶＩＩＩの第１の血清レベルが約０．４０ＩＵ／ｍＬ未満である、請求項１２４に記載の方法。
  126. ＦＶＩＩＩの前記第１の血清レベルが約０．０５ＩＵ／ｍＬ未満である、請求項１２５に記載の方法。
  127. ＦＶＩＩＩの前記第１の血清レベルが約０．０１ＩＵ／ｍＬ未満である、請求項１２５に記載の方法。
  128. 血友病Ａの処置のための、請求項１～２８のいずれか１項に記載のシステムの使用。
  129. 血友病Ａの処置のための医薬の製造のための、請求項１～２８のいずれか１項に記載のシステムの使用。
  130. 血友病Ａの処置のための、請求項６３～６８のいずれか１項に記載の細胞の使用。
  131. 血友病Ａの処置のための医薬の製造のための、請求項６３～６８のいずれか１項に記載の細胞の使用。
  132. 血友病Ａの処置のための、請求項１１２に記載のキットの使用。
  133. 血友病Ａの処置のための医薬の製造のための、請求項１１２に記載のキットの使用。
  134. 血友病Ａの処置のための、請求項１１３～１２３のいずれか１項に記載の核酸の使用。
  135. 血友病Ａの処置のための医薬の製造のための、請求項１１３～１２３のいずれか１項に記載の核酸の使用。
  136. Ｂドメイン置換を含み、前記Ｂドメイン置換は、０～９個のＮ結合グリコシル化部位及び３～約４０個のアミノ酸長を含む、合成ＦＶＩＩＩタンパク質。
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