CN117947040A - 用于目的基因的表达盒及其应用 - Google Patents

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杨志文
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Abstract

本发明提供了用于目的基因的表达盒及其应用。具体地，本发明提供了一种具有HCR、DSE、TPL、eMlp等元件的表达盒及其编码核酸、表达载体、宿主细胞、药物组合物、基因递送系统与应用，还提供一种C1‑INH蛋白编码核酸分子及其应用。基于本发明提供的表达盒及其应用，可以实现低副作用、一次给药终身受益的疾病治疗效果。

Description

用于目的基因的表达盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地，涉及一种用于目的基因的表达盒及其应用。
背景技术
基因治疗是治疗遗传疾病的有效方法，通过将外源正常基因(也即目的基因)导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。基因治疗主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括：遗传病(如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症、遗传性血管水肿等)、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病(如艾滋病、类风湿等)。
在进行基因治疗时，如何在靶细胞中有效表达目的基因并获得预期的表达效果是至关重要的。以遗传性水肿为例，它是由于C1-INH蛋白缺乏导致，正常情况下C1-INH蛋白在血液中的含量应达到160μg/ml-320μg/ml，而在先前的临床实验中证明，C1-INH在血液中至少需要达到112μg/ml才能达到治愈的效果。如此之高的含量，对于目前的基因治疗方法来说，具有相当大的挑战性，因此亟需一种理想的表达盒或表达载体，期望其具备滴度高、能感染大量细胞、制备方便且重复性好、能定向进入目的细胞并整合到宿主染色体特异位点、能以附加体形式稳定存在、不含有能激发免疫反应的组分的种种优势，从而提高基因治疗的效果和成功率，并降低副作用。
因此，本领域需要开发一种能够有效提高目的基因表达量的表达盒。
发明内容
本发明的目的就是提供一种表达量高、副作用低的用于目的基因的表达盒。
本发明的另一目的是提供一种长时程表达的基因递送系统。
本发明的又一目的是提供一种低副作用、能实现一次给药终身受益的新型治疗手段。
在本发明的第一方面，提供了一种表达盒，所述表达盒从5'-3'端具有式I所示的结构：
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8 (I)
式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
Z1为HCR元件；
Z2为DSE元件；
Z3为TPL元件；
Z4为eMlp元件；
Z5为内含子元件；
Z6为无或Kozak序列；
Z7为目的基因；和
Z8为polyA元件。
在另一优选例中，所述Z1的序列如SEQ ID NO:4所示。
在另一优选例中，所述Z2的序列如SEQ ID NO:5所示。
在另一优选例中，所述Z3的序列如SEQ ID NO:6所示。
在另一优选例中，所述Z4的序列如SEQ ID NO:7所示。
在另一优选例中，所述Z5为SV40内含子。
在另一优选例中，所述Z5的序列如SEQ ID NO:8所示。
在另一优选例中，所述目的基因选自下组：正常基因、反义基因、自杀基因，或其组合。
在另一优选例中，所述Z7选自下组：serpinG1基因、FIX基因、荧光素酶基因、CFTR基因(囊性纤维病)、LDLR基因(家庭性高胆固醇血症)、α珠蛋白基因、β珠蛋白基因(地中海贫血病)、APC基因(家族性多发性结肠息肉)、SLC26A4基因、GJB2基因(先天性聋哑)、TYR基因、OCA2基因、TYRP1基因、SLC45A2基因(白化病)，或其组合。
在另一优选例中，所述Z7的序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述表达盒具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述表达盒的核苷酸序列与SEQ ID NO:3所示序列具有至少50％的同一性，优选地具有至少60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的同一性。
在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如本发明第一方面所述的表达盒。
在另一优选例中，所述核酸分子可为RNA、DNA或cDNA。
在另一优选例中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO:3所示。
在另一优选例中，所述核酸分子的序列与SEQ ID NO:3所示序列具有至少50％的同一性，优选地具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有如本发明第二方面所述的核酸分子或如本发明第一方面所述的表达盒。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统，或其组合。优选地，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒，或其组合。
在另一优选例中，所述表达载体为AAV载体。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：pTomo慢病毒载体、plenti、pLVTH、pLJM1、pHCMV、pLBS.CAG、pHR、pLV等。
在另一优选例中，所述的表达载体中还包括选自下组的：启动子、转录增强元件WPRE、长末端重复序列LTR等。
在另一优选例中，所述表达载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述多核苷酸或其片段、增强子、内含子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。
在另一优选例中，所述启动子选自下组：CB启动子、SV40启动子、SOX9启动子、ALB启动子、TBG启动子、ApoA1启动子、TTR启动子、CAG启动子、AAT启动子，或其组合。
在另一优选例中，所述内含子选自下组：SV40内含子、VH4内含子、U12内含子、Chi内含子、RHD内含子，或其组合。
在另一优选例中，所述表达载体从5'-3'端具有式II所示的结构：
A1-A2-A3 (II)
式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
A1为ITR-L序列；
A2为如本发明第一方面所述的表达盒；和
A3为ITR-R序列。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第三方面所述的表达载体，或其基因组中整合有如本发明第二方面所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
在本发明的第五方面，提供了一种基因递送系统，包括：如本发明第一方面所述的表达盒或如本发明第二方面所述的核酸分子，以及AAV衣壳蛋白。
在另一优选例中，所述AAV衣壳蛋白为天然AAV衣壳蛋白或人工改造的AAV衣壳蛋白。
在另一优选例中，所述AAV包括但不限于下组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-DJ。
在另一优选例中，所述AAV衣壳蛋白为AAV8的衣壳蛋白，具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在本发明的第六方面，提供了如本发明第一方面所述的表达盒、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的表达载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞，或如本发明第五方面所述的基因递送系统的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物为基因治疗药物。
在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，包括：
(i)如本发明第一方面所述的表达盒、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的表达载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞，或如本发明第五方面所述的基因递送系统，作为活性成分；和
(ii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述组分(i)占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％，较佳地10-99.9wt％，更佳地70-99wt％。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：冻干剂型、液态剂型。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。
在另一优选例中，所述药物组合物的施用方式包括静脉注射。
在另一优选例中，所述药物组合物是用于静脉注射的注射剂型。
在另一优选例中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：溶剂、分散介质、包衣、抗细菌或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
在另一优选例中，所述药学上可接受的载体为注射剂载体，较佳地，所述药学上可接受的载体包括盐水，所述盐水包括但不限于：缓冲盐水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、蔗糖溶液、盐溶液、聚山梨醇酯溶液，或其组合。
在另一优选例中，所述药学上可接受的载体可进一步包含添加剂，所述添加剂包括但不限于：稳定剂、防腐剂、有助于细胞摄取的转染促进剂，或其组合。
在另一优选例中，所述的药物组合物在基因治疗的应用中，可单独使用，或联合使用。
在另一优选例中，所述的联合使用包括：与其他基因治疗药物联合使用。
在本发明的第八方面，提供了一种基因治疗方法，所述方法包括步骤：给需要的对象施用如本发明第三方面所述的表达载体、如本发明第五方面所述的基因递送系统，或如本发明第七方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述施用的方式为静脉注射。
在另一优选例中，所述需要的对象包括人和非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述需要的对象为遗传性血管水肿患者或血友病患者。
在另一优选例中，所述基因递送系统的使用剂量为6E11vg/kg-6E13vg/kg，较佳地为2E12vg/kg-4E13vg/kg，更佳地为6E12vg/kg-2E13vg/kg。
在本发明的第九方面，提供了一种编码serpinG1基因的核酸分子，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示序列具有至少87％的同一性，优选地具有至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在本发明的第十方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有如本发明第九方面所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统，或其组合。优选地，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒，或其组合。
在另一优选例中，所述的表达载体中还包括选自下组的：启动子、转录增强元件WPRE、长末端重复序列LTR等。
在另一优选例中，所述表达载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述多核苷酸或其片段、增强子、内含子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。
在另一优选例中，所述表达载体具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述表达载体的核苷酸序列与SEQ ID NO:3所示序列具有至少50％的同一性，优选地具有至少60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的同一性。
在本发明的第十一方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第十方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明的第九方面所述的核酸分子。
在本发明的第十二方面，提供了如本发明第九方面所述的核酸分子、如本发明第十方面所述的表达载体，或如本发明第十一方面所述的宿主细胞的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于治疗遗传性血管水肿。
在另一优选例中，所述遗传性血管水肿为C1-INH缺乏型。
在另一优选例中，所述遗传性血管水肿包括1型HAE和2型HAE。
在本发明的第十三方面，提供了一种药物组合物，包括：
(i)如本发明第九方面所述的核酸分子、如本发明第十方面所述的表达载体或如本发明第十一方面所述的宿主细胞，作为活性成分；和
(ii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述组分(i)占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％，较佳地10-99.9wt％，更佳地70-99wt％。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：冻干剂型、液态剂型。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。
在另一优选例中，所述药物组合物的施用方式包括但不限于静脉注射、口服给药、皮下注射、肌内注射等。
在另一优选例中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：溶剂、分散介质、包衣、抗细菌或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
在另一优选例中，所述药学上可接受的载体为注射剂载体，较佳地，所述药学上可接受的载体包括盐水，所述盐水包括但不限于：缓冲盐水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、蔗糖溶液、盐溶液、聚山梨醇酯溶液，或其组合。
在另一优选例中，所述药学上可接受的载体可进一步包含添加剂，所述添加剂包括但不限于：稳定剂、防腐剂、有助于细胞摄取的转染促进剂，或其组合。
在另一优选例中，所述的药物组合物在治疗遗传性血管水肿的应用中，可单独使用，或联合使用。
在另一优选例中，所述的联合使用包括：与其他治疗遗传性血管水肿的药物联合使用。
在另一优选例中，所述的其他治疗遗传性血管水肿的药物包括：血源性C1酯酶抑制物、重组人C1酯酶抑制剂、缓激肽受体拮抗剂、血浆缓激肽释放酶抑制剂、达那唑、氨甲环酸，或其组合。
在本发明的第十四方面，提供了一种治疗遗传性血管水肿的方法，所述方法包括步骤：给需要的对象施用如本发明第十方面所述的表达载体，或如本发明第十三方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述施用的方式为静脉注射。
在另一优选例中，所述需要的对象包括人和非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述表达载体为AAV载体。
在另一优选例中，所述AAV载体的使用剂量为6E11vg/kg-6E13vg/kg，较佳地为2E12vg/kg-4E13vg/kg，更佳地为6E12vg/kg-2E13vg/kg。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了使用Western blot方法，利用FLAG抗体检测密码子优化A、B、C基因和WT基因的表达量结果；其中图1A显示了免疫印迹图，图1B显示了灰度比值(蛋白相对含量)。
图2显示了使用Western blot方法，利用SerpinG1抗体检测密码子优化A、B、C基因和WT基因的表达量结果；其中图2A显示了免疫印迹图，图2B显示了灰度比值(蛋白相对含量)。
图3显示了Y602表达盒的结构。
图4显示了Y602给药1周(左)和2周(右)后KO/KO小鼠及对照组小鼠血浆中的C1-INH含量。
图5显示了Y602与Y508表达盒的药效对比数据。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种用于目的基因的表达盒，并建立了基于AAV的基因递送系统。发明人还经过对serpinG1基因的密码子优化获得了高表达量的核酸分子，并在此基础上开发了能进一步提高C1-INH蛋白在体内及体外表达量的表达载体、宿主细胞及其应用。基于上述核酸分子、表达盒和基因递送系统等，本发明构建了一种低副作用、一次给药终身受益的治疗方法。在此基础上完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，其中包含本发明所提供的基因递送系统、表达载体或药物组合物。所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。
序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。
如本文所用，术语“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。
如本文所用，术语“AAV载体”、“重组AAV载体”、“重组腺相关病毒载体”、“rAAV”、“重组病毒”可互换使用，均指经改造的可用于运输、转导和在靶向部位特异性表达被包含的外源目的基因的AAV病毒颗粒，优选地所述靶向部位为肝脏。
表达盒
典型地，本发明的表达盒从5'-3'端具有式I所示的结构：
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8 (I)
式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
Z1为HCR元件；
Z2为DSE元件；
Z3为TPL元件；
Z4为eMlp元件；
Z5为内含子元件；
Z6为无或Kozak序列；
Z7为目的基因；和
Z8为polyA元件。
应理解，本发明表达盒中的目的基因，也即Z7可以为任选的感兴趣的目的基因，本发明的表达盒能够实现对任选的目的基因的表达。
优选地，本发明的表达盒用于表达serpinG1基因、FIX基因、荧光素酶基因、CFTR基因(囊性纤维病)、LDLR基因(家庭性高胆固醇血症)、α珠蛋白基因、β珠蛋白基因(地中海贫血病)、APC基因(家族性多发性结肠息肉)、SLC26A4基因、GJB2基因(先天性聋哑)、TYR基因、OCA2基因、TYRP1基因、SLC45A2基因(白化病)，或其组合。
典型地，本发明的表达盒为表达盒Y602，具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
本发明表达盒的优势在于：一方面，相比本领域现有技术中的常规表达盒，本发明的表达盒能实现更高的体外和/或体内表达量；另一方面，本发明人经筛选发现，相比本发明人同批次构建的其他表达盒(如Y508表达盒)，本发明的表达盒具有意外的更优效果。
核酸分子
本发明提供了编码如本发明第一方面所述的表达盒的核酸分子。本发明的核酸分子可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还提供了如本发明第九方面所述的核酸分子，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示序列具有至少87％的同一性，优选地具有至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
表达载体
本发明还涉及包含上述的适当核酸分子以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。用重组核酸分子转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。
制剂与组合物(药物组合物)
本发明提供一种制剂或组合物(优选地药物组合物)，所述制剂或组合物含有(a)如本发明第一方面所述的表达盒、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的表达载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞，或如本发明第五方面所述的基因递送系统，作为活性成分；以及(b)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供一种制剂或组合物(优选地药物组合物)，所述制剂或组合物含有(a)如本发明第九方面所述的核酸分子、如本发明第十方面所述的表达载体或如本发明第十一方面所述的宿主细胞，作为活性成分；以及(b)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
典型地，本发明的制剂或组合物用于基因治疗，较佳地，用于治疗遗传性血管水肿或血友病。
为了便于临床应用，本发明的制剂或组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。运输时需要将装有药物悬浊液的微小容器放置于干冰中。平时应保存于-80℃冰箱中。
本发明所述的制剂或组合物中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。
本发明所述制剂或组合物可以安全有效量施用，“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。
本发明所述的安全有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的安全有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述药物的药代动力学参数例如药物组织分布、生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是制剂或组合物中各组份能和本发明的活性成分之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。
制剂或组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。
制剂或组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如 )、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
遗传性水肿
遗传性血管水肿(hereditary angioedema,HAE)又称C1抑制物缺乏症，表现为C1抑制物量的缺乏或功能缺陷。是一种常染色体显性遗传病，发病率为1/10000-1/50000。临床上表现为反复发生、难以预测的皮肤和粘膜下水肿。如发生喉头水肿，可因窒息危及生命。遗传性血管水肿目前无法治愈，但可以通过药物等方式预防发作和控制急性期发作症状。
然而，使用小分子药物治疗需要每周甚至每天给药，且伴有较多的副作用；使用抑制剂治疗，需要在发病时期给药，存在治疗不及时的隐患以及患者依从性差的问题。
遗传性水肿的治疗方法
在常规治疗方法中，针对遗传性水肿的治疗可分为一般治疗、急性发作期治疗和预防性治疗，其中预防性治疗根据治疗周期的不同，又分为短期治疗和长期持续性治疗。
上述常规治疗方法通常采用血源性C1酯酶抑制物、重组人C1酯酶抑制剂、缓激肽受体拮抗剂、血浆缓激肽释放酶抑制剂、达那唑等小分子药物或制剂，可以起到一定的缓解急性发作、短长期预防等作用，但依然存在副作用较多、频繁给药、治疗不及时、患者依从性差等问题。
具体地，例如，目前遗传性血管水肿的一线治疗药物是小分子药物和C1/Kallikrein(激肽释放酶)抑制剂，治疗方式以按需治疗和预防治疗为主。然而，使用小分子药物治疗需要每周甚至每天给药，且伴有较多的副作用；使用抑制剂治疗，需要在发病时期给药，存在治疗不及时的隐患以及患者依从性差的问题。
而本发明则提供一种低副作用、能实现一次给药终身受益的新型治疗手段。典型地，本发明可采用基于AAV的基因递送系统特异性表达本发明的表达盒，其中表达盒中的目的基因为serpinG1基因，上述表达盒及基因递送系统能在需要的对象体内高表达C1-INH蛋白，以治疗遗传性血管水肿。
C1-INH
遗传性血管水肿(HAE)可分为C1-INH缺乏型和非C1-INH缺乏型。
C1-INH缺乏型是由C1-INH基因突变导致，临床可分为1型和2型，以实验室C1-INH浓度来区分。
1型HAE：实验室检查发现C4浓度降低，C1-INH浓度也降低，即为1型HAE。在我国的HAE患者以此型为主。
2型HAE：实验室检查发现C4浓度降低，C1-INH浓度正常或升高，但C1-INH功能下降，即为2型HAE。
非C1-INH缺乏型与F12、ANGPTI、PLG等基因突变有关。
在本发明中，本发明的核酸分子、表达盒、基因递送系统、制剂或组合物等主要针对C1-INH缺乏型HAE进行治疗，包括1型HAE和2型HAE，能对患者体内C1-INH的浓度降低和功能下降均产生相应的治疗性效果。
serpinG1基因
serpinG1基因为C1-INH蛋白的编码基因。在本发明中，基于野生型serpinG1基因进行了密码子优化，分别得到了serping1 optiA、serping1 optiB、serping1 optiC基因，简称A基因、B基因、C基因。
优选地，本发明的核酸分子为SEQ ID NO:1所示的B基因或为与SEQ ID NO:1所示序列具有至少87％的同一性，优选地具有至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸分子。
血友病与FIX基因
血友病(hemophilia)是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病。其临床上分为血友病A(凝血因子Ⅷ缺陷症)和血友病B(凝血因子Ⅸ缺陷症)两型，分别由凝血因子Ⅷ(FⅧ)和凝血因子IX(FIX)基因突变所致。在男性人群中，血友病A的发病率约为1/5000，血友病B的发病率约为1/25000；所有血友病男性患者中，血友病A约占80％-85％，血友病B约占15％-20％。女性血友病患者极其罕见。
凝血因子IX(FIX)是凝血过程中重要的凝血因子，由组织因子和活化的凝血因子Ⅶ(TF/FⅦa)在凝血初始阶段中激活，所产生的活化的FⅨ很快与TF/FⅦa、组织因子途径抑制物(TFPI)形成四聚体复合物，进而终止TF/FⅦa对凝血因子X(FX)和FIX的激活作用。但在活化的凝血因子Ⅷ(FⅧa)的辅助下，由活化的FⅨ(FⅨa)激活而生成的FXa是维持凝血过程和最终达到止血的关键；因此止血过程中起着不可替代的作用。FIX的编码基因(F9)位X染色体长臂(Xq27.1-q27.2)，有8个外显子和7个内含子组成，该基因突变是导致血友病B的根本原因。
腺相关病毒
目前已有许多病毒载体被用于基因治疗，包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒以及腺相关病毒(AAV)，其中具有低免疫原性的AAV目前已得到了广泛认可。
腺相关病毒，也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。AAV能感染多种细胞，并且可以稳定地以位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。
AAV具有较好的安全性和高效的感染效率，以及介导基因长期表达的特点。尽管AAV具有较低的免疫原性，但临床上常报道系统性给药AAV后会引发的较重的免疫反应，这大部分是由于使用较高的剂量所引起的。
而本发明提供的表达盒通过创造性的设计能够提高目的基因的表达量，因此构建包含本发明的表达盒的AAV载体能够降低AAV载体的给药剂量，从而既能够兼顾AAV载体的长时程表达、局部给药的优点，又能够降低施用高剂量AAV载体带来的副作用。
基因递送系统
在本发明中，建立了基于AAV的基因递送系统，其中AAV为经人工改造后的重组腺相关病毒载体。AAV在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，其作为病毒的复制起点，对病毒的包装也具有决定性作用。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。
AAV衣壳蛋白决定AAV具有组织细胞特异性。在本发明中，对于适用的AAV衣壳蛋白没有特别的限制。AAV衣壳蛋白可以为天然AAV衣壳蛋白或人工改造的AAV衣壳蛋白。AAV衣壳蛋白可包括选自下组的AAV：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-DJ。优选地，本发明的AAV衣壳蛋白为AAV8的衣壳蛋白，可具有如SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列。
AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6566118、6989264和6995006，它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请No.PCT/US2005/027091中有所描述，该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自AAV的载体的使用己有描述(参见例如国际专利申请公布No.WO91/18088和WO93/09239；美国专利No.4,797,368、6,596,535和5,139,941，以及欧洲专利No.0488528，它们均整体以引用方式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于AAV的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。
在具体的实施方式中，生产AAV载体需要用到包含ITR-L、重组目的基因组和ITR-R的DNA质粒，其中ITR-L和ITR-R分别位于重组基因组的两侧。上述DNA质粒、编码AAV cap/rep基因的质粒和由腺病毒或疱疹病毒提供的辅助基因可以通过使用已知技术，例如通过转染，同时被引入合适的宿主细胞来生产AAV病毒载体。所述DNA质粒可以在宿主细胞中表达，并被包装成病毒颗粒。
治疗方法
本发明的治疗方法通常可采用多种给药方式，给予需要的对象包含本发明的表达盒的多种表达载体(如DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统，或其组合)、宿主细胞、制剂或组合物。
例如，本发明提供了如本发明第八方面所述的基因治疗方法，或如本发明第十四方面所述的治疗遗传性血管水肿的方法。
典型地，本发明可采用基于AAV的基因递送系统(即AAV载体)特异性表达本发明的表达盒。上述治疗方法一方面通过表达盒的特殊设计增加了目的基因(蛋白)的表达水平，从而可以降低相应表达载体的用量而减少副作用；另一方面，采用局部给药方式的基因递送系统能有效避开系统性给药引起的不良反应。
通常，本发明的治疗方法为基因治疗方法，用于基因治疗的目的基因可分为三大类：正常基因、反义基因和自杀基因。
正常基因是从健康人体内分离得到的，它可通过同源重组方式置换病变基因或依靠其表达产物弥补病变基因的生理功能，这些基因常用于治疗各种基因缺陷型遗传疾病如血友病、地中海贫血病、遗传性血管水肿等。
反义基因主要用于治疗获得性分子疾病，通过反义基因体内表达产物(RNA)或与病毒激活因子编码基因互补，或与肿瘤基因mRNA互补，从而阻断其表达。反义基因的示例如：反义BL-2寡核苷酸、反义MYC片段、HIV-1基因组的基因片段(如pol基因、env基因、vif基因)的反义RNA等。
自杀基因是一类编码能杀伤癌变细胞的酶蛋白基因，它们存在于病毒、细菌和真菌中，能将无毒的细胞代谢产物转变为有毒的化学物。自杀基因的实例如：HSV-tk基因、CD基因，或自杀基因前体药物系统如gpt-6-TX系统、P450 2BI-CPA系统等。
此外，针对肿瘤的基因治疗方法主要包括：抑癌基因治疗法(反义BL-2寡核苷酸、反义MYC片段)、基因修饰瘤苗法、免疫基因治疗法(肿瘤细胞因子基因治疗、肿瘤MHC基因治疗、肿瘤抗原靶向的基因治疗(如TSA基因或TAA基因)、肿瘤共刺激分子基因治疗(如B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、ICAM-1(CD54))等)和自杀基因治疗法。
用于各种治疗目的与治疗方法的所有类型目的基因均包含在本发明的范围中。
本发明的主要优点包括：
1.本发明的表达盒通过创造性的设计能够使目的基因在体外及体内的表达都得到提高，有利于降低工业生产的经济成本和时间成本，并且基于目的蛋白的高表达，能够降低包含本发明表达盒的相关药物的使用剂量，从而减少副作用的发生。
2.本发明提供的治疗方法一方面能通过局部给药和相对较低的用药量能减少副作用，另一方面长时程的表达能力能实现一次给药终身受益的效果。
3.本发明的核酸分子可提高serpinG1基因的表达量，一方面利于降低生产成本，另一方面有利于降低包含本发明核酸分子的药物剂量。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
序列信息
serpinG1密码子优化序列(SEQ ID NO:1)：
ATGGCTTCTAGGCTGACACTGCTGACACTGCTGCTGCTGCTGCTGGCTGGAGATAGAGCCTCCAGCAATCCCAATGCCACATCCAGCTCCAGCCAAGACCCTGAGAGCCTCCAAGACAGAGGTGAGGGCAAAGTGGCCACAACTGTGATCTCCAAGATGCTCTTTGTGGAGCCTATTCTGGAGGTGAGCTCTCTGCCCACCACCAATTCCACAACCAATTCTGCCACCAAGATCACTGCCAACACCACTGATGAGCCTACAACACAGCCTACAACAGAACCTACCACACAGCCCACCATTCAGCCCACCCAGCCCACCACACAGCTGCCTACTGACAGCCCTACCCAGCCTACCACTGGCAGCTTCTGTCCTGGACCTGTGACACTGTGCTCTGATCTGGAGAGCCATAGCACAGAGGCTGTGCTGGGTGATGCTCTGGTGGATTTCTCTCTGAAGCTGTATCATGCCTTCTCTGCCATGAAGAAGGTAGAGACAAACATGGCCTTTAGCCCCTTCTCCATTGCTTCTCTGCTCACACAAGTGCTGCTGGGTGCTGGTGAGAATACCAAGACCAATCTGGAGTCCATCCTCTCCTACCCCAAGGACTTTACATGTGTGCACCAAGCCCTCAAGGGATTCACCACCAAGGGAGTGACAAGTGTGAGCCAAATCTTCCACTCCCCTGACCTGGCCATCAGAGACACCTTTGTGAATGCCTCTAGGACACTGTACAGCTCCTCCCCCAGAGTGCTGAGCAATAATAGTGATGCCAATCTGGAGCTCATCAATACATGGGTGGCTAAGAATACCAACAACAAGATCTCTAGGCTGCTGGATTCCCTCCCTTCTGACACAAGACTGGTGCTGCTGAATGCCATTTATCTGAGTGCCAAGTGGAAGACCACATTTGACCCCAAGAAGACAAGAATGGAGCCCTTTCACTTCAAGAACTCTGTCATCAAGGTGCCCATGATGAACAGTAAGAAGTATCCTGTGGCCCACTTCATTGACCAGACCCTCAAGGCCAAAGTGGGACAGCTGCAGCTGAGCCACAATCTGTCTCTGGTGATTCTGGTGCCCCAGAATCTGAAACATAGACTGGAGGACATGGAACAAGCTCTGAGCCCCAGTGTCTTTAAGGCCATCATGGAGAAGCTGGAGATGTCCAAGTTCCAGCCCACACTCCTCACACTGCCTAGAATCAAAGTCACCACAAGCCAAGACATGCTGAGCATCATGGAAAAGCTGGAATTCTTTGACTTCAGCTATGATCTGAACCTCTGTGGACTCACAGAGGATCCTGATCTGCAAGTGAGTGCCATGCAGCACCAGACTGTGCTGGAACTGACTGAAACTGGAGTGGAGGCTGCTGCTGCCAGTGCTATCAGTGTGGCTAGAACACTGCTGGTGTTTGAGGTGCAGCAGCCCTTTCTGTTTGTCCTCTGGGATCAGCAGCATAAGTTCCCTGTGTTCATGGGAAGGGTGTATGATCCTAGAGCCTGA
serpinG1野生型序列(SEQ ID NO:2)：
ATGGCCTCCAGGCTGACCCTGCTGACCCTCCTGCTGCTGCTGCTGGCTGGGGATAGAGCCTCCTCAAATCCAAATGCTACCAGCTCCAGCTCCCAGGATCCAGAGAGTTTGCAAGACAGAGGCGAAGGGAAGGTCGCAACAACAGTTATCTCCAAGATGCTATTCGTTGAACCCATCCTGGAGGTTTCCAGCTTGCCGACAACCAACTCAACAACCAATTCAGCCACCAAAATAACAGCTAATACCACTGATGAACCCACCACACAACCCACCACAGAGCCCACCACCCAACCCACCATCCAACCCACCCAACCAACTACCCAGCTCCCAACAGATTCTCCTACCCAGCCCACTACTGGGTCCTTCTGCCCAGGACCTGTTACTCTCTGCTCTGACTTGGAGAGTCATTCAACAGAGGCCGTGTTGGGGGATGCTTTGGTAGATTTCTCCCTGAAGCTCTACCACGCCTTCTCAGCAATGAAGAAGGTGGAGACCAACATGGCCTTTTCCCCATTCAGCATCGCCAGCCTCCTTACCCAGGTCCTGCTCGGGGCTGGGGAGAACACCAAAACAAACCTGGAGAGCATCCTCTCTTACCCCAAGGACTTCACCTGTGTCCACCAGGCCCTGAAGGGCTTCACGACCAAAGGTGTCACCTCAGTCTCTCAGATCTTCCACAGCCCAGACCTGGCCATAAGGGACACCTTTGTGAATGCCTCTCGGACCCTGTACAGCAGCAGCCCCAGAGTCCTAAGCAACAACAGTGACGCCAACTTGGAGCTCATCAACACCTGGGTGGCCAAGAACACCAACAACAAGATCAGCCGGCTGCTAGACAGTCTGCCCTCCGATACCCGCCTTGTCCTCCTCAATGCTATCTACCTGAGTGCCAAGTGGAAGACAACATTTGATCCCAAGAAAACCAGAATGGAACCCTTTCACTTCAAAAACTCAGTTATAAAAGTGCCCATGATGAATAGCAAGAAGTACCCTGTGGCCCATTTCATTGACCAAACTTTGAAAGCCAAGGTGGGGCAGCTGCAGCTCTCCCACAATCTGAGTTTGGTGATCCTGGTACCCCAGAACCTGAAACATCGTCTTGAAGACATGGAACAGGCTCTCAGCCCTTCTGTTTTCAAGGCCATCATGGAGAAACTGGAGATGTCCAAGTTCCAGCCCACTCTCCTAACACTACCCCGCATCAAAGTGACGACCAGCCAGGATATGCTCTCAATCATGGAGAAATTGGAATTCTTCGATTTTTCTTATGACCTTAACCTGTGTGGGCTGACAGAGGACCCAGATCTTCAGGTTTCTGCGATGCAGCACCAGACAGTGCTGGAACTGACAGAGACTGGGGTGGAGGCGGCTGCAGCCTCCGCCATCTCTGTGGCCCGCACCCTGCTGGTCTTTGAAGTGCAGCAGCCCTTCCTCTTCGTGCTCTGGGACCAGCAGCACAAGTTCCCTGTCTTCATGGGGCGAGTATATGACCCCAGGGCCTAA
Y602表达盒序列(SEQ ID NO:3)：
TAAAATGGGCAAACATGCTGTTTACTGAGCTGGGCACCGTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGAGGACGCCGCTGTTTACTGAGCTGGGCACAATGACCTTTGGCGAGCTGGACAGAGGGCCGGGCGCAGACGGGCAGGCGGGTGGGCAGCTCGGCGCTGACCTTTGCCCTTAGTCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACCGGGGTGACTTTGGTTAATCATTAACCAGCAACCACCCCCGTCGTCCCTGCGGGTCCACAGCTTAAATACGAACTCGAACGGGGCTCTGTCTCCTTAGCCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATCGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAAGTTTAAACTCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTCTCTCTTTTAGATTCCAACCTTTGGAACTGAGCCACCATGGCTTCTAGGCTGACACTGCTGACACTGCTGCTGCTGCTGCTGGCTGGAGATAGAGCCTCCAGCAATCCCAATGCCACATCCAGCTCCAGCCAAGACCCTGAGAGCCTCCAAGACAGAGGTGAGGGCAAAGTGGCCACAACTGTGATCTCCAAGATGCTCTTTGTGGAGCCTATTCTGGAGGTGAGCTCTCTGCCCACCACCAATTCCACAACCAATTCTGCCACCAAGATCACTGCCAACACCACTGATGAGCCTACAACACAGCCTACAACAGAACCTACCACACAGCCCACCATTCAGCCCACCCAGCCCACCACACAGCTGCCTACTGACAGCCCTACCCAGCCTACCACTGGCAGCTTCTGTCCTGGACCTGTGACACTGTGCTCTGATCTGGAGAGCCATAGCACAGAGGCTGTGCTGGGTGATGCTCTGGTGGATTTCTCTCTGAAGCTGTATCATGCCTTCTCTGCCATGAAGAAGGTAGAGACAAACATGGCCTTTAGCCCCTTCTCCATTGCTTCTCTGCTCACACAAGTGCTGCTGGGTGCTGGTGAGAATACCAAGACCAATCTGGAGTCCATCCTCTCCTACCCCAAGGACTTTACATGTGTGCACCAAGCCCTCAAGGGATTCACCACCAAGGGAGTGACAAGTGTGAGCCAAATCTTCCACTCCCCTGACCTGGCCATCAGAGACACCTTTGTGAATGCCTCTAGGACACTGTACAGCTCCTCCCCCAGAGTGCTGAGCAATAATAGTGATGCCAATCTGGAGCTCATCAATACATGGGTGGCTAAGAATACCAACAACAAGATCTCTAGGCTGCTGGATTCCCTCCCTTCTGACACAAGACTGGTGCTGCTGAATGCCATTTATCTGAGTGCCAAGTGGAAGACCACATTTGACCCCAAGAAGACAAGAATGGAGCCCTTTCACTTCAAGAACTCTGTCATCAAGGTGCCCATGATGAACAGTAAGAAGTATCCTGTGGCCCACTTCATTGACCAGACCCTCAAGGCCAAAGTGGGACAGCTGCAGCTGAGCCACAATCTGTCTCTGGTGATTCTGGTGCCCCAGAATCTGAAACATAGACTGGAGGACATGGAACAAGCTCTGAGCCCCAGTGTCTTTAAGGCCATCATGGAGAAGCTGGAGATGTCCAAGTTCCAGCCCACACTCCTCACACTGCCTAGAATCAAAGTCACCACAAGCCAAGACATGCTGAGCATCATGGAAAAGCTGGAATTCTTTGACTTCAGCTATGATCTGAACCTCTGTGGACTCACAGAGGATCCTGATCTGCAAGTGAGTGCCATGCAGCACCAGACTGTGCTGGAACTGACTGAAACTGGAGTGGAGGCTGCTGCTGCCAGTGCTATCAGTGTGGCTAGAACACTGCTGGTGTTTGAGGTGCAGCAGCCCTTTCTGTTTGTCCTCTGGGATCAGCAGCATAAGTTCCCTGTGTTCATGGGAAGGGTGTATGATCCTAGAGCCTGATTGCATGTTAATCAATAAACCGGTTGATTCGTTTCAGTTGAACTTTGGTCTCCTGTGCTTATCTTATCGGTTTCCATAGCAACTGGTTACACATTA
HCR序列(SEQ ID NO:4)：
CCGTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGG
DSE序列(SEQ ID NO:5)：
AGGACGCCGCTGTTTACTGAGCTGGGCACAATGACCTTTGGCGAGCTGGACAGAGGGCCGGGCGCAGACGGGCAGGCGGGTGGGCAGCTCGGCGCTGACCTTTGCCCTTAGTCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACCGGGGTGACTTTGGTTAATCATTAACCAGCAACCACCCCCGTCGTCCCTGCGGGTCCACAGCTTAAATACGAACTCGAACGGGGCTCTGTCTCCTTAGC
TPL序列(SEQ ID NO:6)：
GGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCA
eMLP序列(SEQ ID NO:7)：
AGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAAGTTTAAACT
SV40内含子序列(SEQ ID NO:8)：
CTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTCTCTCTTTTAGATTCCAACCTTTGGAACTGA
AAV8的cap序列(SEQ ID NO:9)：
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL*
材料、试剂与耗材
主要包括HEK 293T细胞；DMEM培养基；C57-serpinG1-/-；Human Serpin G1 ELISAKit(货号EK1667，武汉博士德)等。其他所用的材料、试剂与耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 serpinG1密码子优化体外筛选实验
1.载体构建：发明人将野生型(WT)serpinG1基因经过密码子优化后，得到3个版本，分别标记为A、B、C；将包括A、B、C基因和野生型serpinG1基因(SEQ ID NO:2)在内的优化前后的四个基因通过无缝克隆的方式分别构建在pcDNA3.1骨架载体上，得到4个带有FLAG标记的表达载体，即pcDNA3.1-serping1 optiA-3xFLAG-BGHpa、pcDNA3.1-serping1optiB-3xFLAG-BGHpa、pcDNA3.1-serping1 optiC-3xFLAG-BGHpa和pcDNA3.1-serping1wt-3xFLAG-BGHpa。
2.Serping1及密码子优化的serping1基因在细胞中的表达：为了测试密码子优化的基因与野生型基因的表达量情况，利用HEK 293T细胞进行表达测试。
将293T细胞铺在六孔细胞培养板中，待细胞密度达到80％-90％，用上述四个表达质粒转染细胞。48小时后，收集细胞，并提取胞内总蛋白，经BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号20201ES76，上海翊圣生物科技有限公司)定量后，进行Western blot，利用FLAG抗体(Monoclonal ANTI-M2-Peroxidase(HRP)antibody,sigma)和SerpinG1抗体(SERPING1 Antibody(OAAN00490),Aviva Systems Biology)检测各个基因的表达量。
如图1和表1所示，显示了使用Western blot方法，利用FLAG抗体检测密码子优化A、B、C基因和WT基因的表达量结果。
表1
根据图1A、图1B和表1的结果，均表明经密码子优化的B基因、C基因其表达量优于野生型serpinG1基因，并且其中B基因的表达量最佳，约达到野生型基因表达量的1.53倍，C基因的表达量约达到野生型基因表达量的1.39倍。而经密码子优化的A基因其表达量低于野生型serpinG1基因。
如图2和表2所示，显示了使用Western blot方法，利用SerpinG1抗体检测密码子优化A、B、C基因和WT基因的表达量结果。
表2
根据图2A、2B和表2的结果，表明经密码子优化的A基因、B基因、C基因其表达量均优于野生型serpinG1基因，并且其中B基因的表达量最佳，约达到野生型基因表达量的1.30倍，而A基因、C基因的表达量仅略高于野生型。
上述结果均显示，经密码子优化的B基因(SEQ ID NO:1)表达量最高，最高可达到野生型serpinG1基因的约1.53倍。
实施例2.含有seping1基因的AAV表达载体在模型小鼠体内的表达量检测
1.Y602表达盒的构建：将serpinG1基因片段(选择表达量最高的经密码子优化的B基因)、polyA片段(PA3)，以及各调控元件(包括HCR、DSE、TPL、eMlp、sv40内含子，任选地还可包括Kozak序列)通过无缝克隆的方式组合在一起，获得表达盒(5'-HCR-DSE-TPL-eMlp-sv40内含子-serping1-PA3-3')，即Y602表达盒。
如图3所示，显示了Y602表达盒的结构。
2.AAV载体的包装：将HEK293细胞以4×106/100ml直径的浓度接种至含有10％FBS的DMEM培养基的平板上，在37℃下含有5％ CO2的潮湿环境中培养过夜。第二天，构建包含Y602表达盒和两个末端反向重复序列(ITR)的AAV包装质粒，并制备含有本申请的核酸分子(SEQ ID NO:1)或对比例的核酸分子、AAV8衣壳蛋白和辅助质粒的PEI转染混合物，然后将转染混合物加入到细胞培养基中转染6小时后，用含有10％FBS的DMEM更换培养基，转染72h后收获细胞，从而获得含有重组病毒(重组AAV载体)的粗提物。用含有100mM氯化钠、2mM氯化镁和10mM Tris的缓冲液(pH＝8)重悬，于-80℃保存。
3.AAV载体的纯化和定量分析：将上一步获得的HEK-293细胞进行三次冻融循环，加入50U/mL Benzonase在37℃处理30min以除去未包封的DNA，3000g离心10min使细胞沉淀，上清转移进行超速离心。
配备碘克砂醇离心体系，用10ml注射器将四种梯度的iodixanol溶液按照17％、25％、40％、60％的顺序依次加到33ml Optiseal tube(Beckman)。每种溶液都从底部慢慢加入Optiseal管中：6ml的17％，6ml的25％，5ml的40％，4ml的60％。加完后在Optiseal管顶部标记样品名称，在40％和60％的交界处划线标记。然后用试管小心将上清添加到离心管中，在14℃离心53000g，时间为2h 40min。
将5ml注射器的针头沿之前标记的横线(40％和60％交界线)插入Optiseal tub中，吸出40％部分的溶液(约2-3ml)至新的15ml管中。将病毒溶液加至已平衡过的100KCentrifuge filter中，补加1×PBS(10-4F188)至约50ml线处，3500rpm，离心10min。去掉废液，再加满1×PBS(10-4F188)，3500rpm，离心10min。重复洗3次。
加300-500μl的1×PBS(10-4F188)收集纯化后的病毒(也即纯化后的重组AAV载体)。吸至1.5ml EP管中。然后根据说明书使用试剂盒对纯化的AAV载体基因组进行qPCR定量分析，测定病毒原液的滴度。
4.AAV载体在小鼠体内的表达与检测：将得到的重组AAV载体通过尾静脉注射到serping1模型鼠(包括serpinG1缺陷小鼠serping1-/-和正常对照(即非缺陷性)小鼠serping1+/+)，剂量为6E12 vg/kg，于注射1W、2W后分别检测血清中C1-INH含量，检测试剂盒Human Serpin G1 ELISA Kit(货号EK1667，武汉博士德)。
如图4所示，显示了注射AAV载体1W、2W后在serping1模型鼠中的C1INH含量，其中以注射盐水为对照，可看到注射AAV载体后，小鼠血浆中明显检测到高水平的C1INH含量，且C1INH的表达在时间上具有持续性。
如图5和表3所示，显示了将Y602表达盒与Y508表达盒(LP1-SERPING1-PA3，本发明人同批次构建的另一表达盒)对比的体内表达效果(即只替换了表达盒，其他实验步骤均相同)。根据C1INH含量的差异，发现Y602表达盒与Y508表达盒的相应C1INH含量存在显著性差异(p＜0.01)，Y602表达盒的表达量平均可达Y508表达盒的约3倍，最高可达约4倍。
表3
μg/ml n1 n2 n3 n4 n5 AVE
Y602 158.9 242.2 290.5 243.4 302.8 247.6
Y508 174.7 LOD 104.5 57.1 85.3 81.0
上述结果显示Y602表达盒能在体内高表达并持续表达，而且相比本发明人同批次构建的其他表达盒(例如Y508表达盒)明显具有更好的表达能力。经筛选，本发明的优选表达盒为Y602表达盒。
对比例实验：将不同目的基因用本发明的表达盒与其他常规表达盒表达的比较
本实施例采用实施例2中的AAV载体构建方法，和实施例2中的病毒包装方法。将Y602表达盒中的CDS元件更换为FIX或者luciferase，得到使用本发明的表达盒构建的表达载体vector FIX(A)或者vector luciferase(B)，同时构建FIX与luciferase包含在现有技术中其他常规表达盒上的载体，如更换启动子等，得到使用其他常规表达盒的对比载体vector FIX(C)或者vector luciferase(D)，用同样的AAV载体(如AAV8)包装上述ABCD四个载体，然后分别检测FIX或者luciferase的表达量。
分别比较A与C，B与D的表达效果，得到的结果表明使用本发明的表达盒表达的CDS要比其他表达盒更优，说明本发明的表达盒可适用于不同目的蛋白的表达，且效果更佳。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒从5'-3'端具有式I所示的结构：
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8(I)
式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
Z1为HCR元件；
Z2为DSE元件；
Z3为TPL元件；
Z4为eMlp元件；
Z5为内含子；
Z6为无或Kozak序列；
Z7为目的基因；和
Z8为polyA元件。
2.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述目的基因选自下组：serpinG1基因、FIX基因、荧光素酶基因，或其组合。
3.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述的表达盒。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如权利要求4所述的核酸分子或如权利要求1所述的表达盒。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求5所述的表达载体，或其基因组中整合有如权利要求4所述的核酸分子。
7.一种基因递送系统，其特征在于，包括：如权利要求1-3中任一项所述的表达盒或如权利要求4所述的核酸分子，以及AAV衣壳蛋白。
8.如权利要求1-3中任一项所述的表达盒、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求5所述的表达载体、如权利要求6所述的宿主细胞，或如权利要求7所述的基因递送系统的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物为基因治疗药物。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括：
(i)如权利要求1-3中任一项所述的表达盒、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求5所述的表达载体、如权利要求6所述的宿主细胞，或如权利要求7所述的基因递送系统，作为活性成分；和
(ii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
10.一种基因治疗的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：给需要的对象施用治疗有效量的如权利要求5所述的表达载体、如权利要求7所述的基因递送系统，或如权利要求9所述的药物组合物。
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