CN113747926A

CN113747926A - 用于肌肉表达的杂合启动子

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Publication number: CN113747926A
Application number: CN202080026214.XA
Authority: CN
Inventors: 基斯配·罗兹提; 帕特里斯·维达尔; 费德里克·敏果兹
Original assignee: Evry Wald Esson University; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon; Sorbonne Universite
Current assignee: Evry Wald Esson University; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon; Sorbonne Universite
Priority date: 2019-04-08
Filing date: 2020-04-07
Publication date: 2021-12-03
Also published as: CA3130525A1; JP2022527597A; US20220162640A1; KR20210148273A; EP3952920A1; WO2020208032A1

Abstract

本发明涉及在肌肉中驱动基因表达的杂合启动子。

Description

用于肌肉表达的杂合启动子

技术领域

本发明涉及在肌肉中驱动基因表达的杂合启动子。本发明还涉及含有所述杂合启动子的表达盒和载体。本文还公开了使用这些杂合启动子的方法，特别是基因治疗的方法。

背景技术

神经肌肉障碍代表了基于体内的基因疗法的主要挑战之一。对于许多疾病来说，在所需靶组织中转入基因的表达不足和抗转入基因免疫力仍然是实现成功基因疗法的重要障碍。因此，对于在感兴趣的细胞中提供转入基因的强表达，但使用低剂量的载体以防止所述载体的潜在毒性和针对所述载体的免疫应答两者，仍存在着需求。

理论上，这个目标可以通过选择在靶细胞中提供强表达的启动子来解决。然而，它们的使用可能产生几个问题。具体来说，在设计用于基因疗法的构建物时，人们必须牢记用于递送治疗性转入基因的载体特有的尺寸限制。例如，由于AAV载体的最大包封尺寸即大约5kb所带来的限制，引入到AAV载体中的元件应该具有减小的尺寸。

在这里，我们描述了具有与基因疗法载体例如AAV载体相容的尺寸的增强子/启动子组合的鉴定，所述组合允许在肌肉中高效表达蛋白质。

发明内容

本发明提供了产生具有肌肉特异性的新型杂合启动子的遗传工程策略。这些杂合启动子可用于神经肌肉疾病的基因疗法中。这些新型杂合启动子是基于可操作连接到肌肉选择性启动子的一个或多个肝选择性增强子的组合。令人吃惊的是，在本文中显示，当置于这种包括肝选择性增强子的杂合启动子的控制之下时，转入基因在肌肉细胞中的表达被提高。

因此，本发明的第一方面涉及一种核酸分子，其包含可操作连接到肌肉选择性启动子的一个或多个肝选择性增强子。

在另一个特定实施方式中，所述核酸分子包含可操作连接到肌肉选择性启动子的一个肝选择性增强子。在另一个实施方式中，所述核酸分子包含可操作连接到肌肉选择性启动子的多个肝选择性增强子。在特定实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括至少两个肝选择性增强子。在又一个实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括两个肝选择性增强子。在另一个实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括三个肝选择性增强子。在另一个实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括四个肝选择性增强子。在又一个实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括五个肝选择性增强子。在特定实施方式中，所述核酸分子包含一个、两个或三个肝选择性增强子，更特别地一个或三个肝选择性增强子。在特定实施方式中，所述多个肝选择性增强子中的所有肝选择性增强子具有相同的序列，或所述多个肝选择性增强子中的至少两个肝选择性增强子具有不同的序列。在特定实施方式中，所述多个肝选择性增强子中的所有肝选择性增强子具有相同的序列。

在本发明的核酸的特定实施方式中，所述增强子可以是短尺寸肝选择性增强子，或者所述多个肝选择性增强子可以是多个短尺寸肝选择性增强子。具体来说，在本发明中使用的肝选择性增强子可以由10至175个核苷酸，例如40至100个核苷酸，特别是50至80个核苷酸构成。在特定实施方式中，在本发明中使用的肝选择性增强子可以由70至75个核苷酸构成。在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是由SEQ ID NO：1构成的72个核苷酸的HS-CRM8增强子或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：1的功能性片段。在另一个实施方式中，所述肝选择性增强子是所述72个核苷酸的HS-CRM8增强子的功能性变体，所述功能变体与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性，特别是具有至少90％同一性，更特别地具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性，其中所述功能性变体具有肝选择性增强子活性。在另一个实施方式中，所述肝选择性增强子是由与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性，特别是具有至少90％同一性，更特别是具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的序列构成的序列的功能性片段，其中所述功能性片段具有肝选择性增强子活性。

优选地，所述启动子是短尺寸肌肉选择性启动子。在特定实施方式中，所述启动子是CK6启动子、CK8启动子、Acta1启动子或合成启动子C5.12(spC5.12，在本文中也被成为“C5.12”)。在特定实施方式中，所述肌肉选择性启动子是spC5.12启动子。在另一个特定实施方式中，所述spC5-12启动子选自：

-由SEQ ID NO：2、3或4中示出的序列、特别是SEQ ID NO：2中示出的序列构成的序列，或SEQ ID NO：2、3或4、特别是SEQ ID NO：2的功能性片段，其中所述片段具有肌肉选择性启动子活性；

-由与SEQ ID NO：2、3和4中的任一者具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：2、3和4中的任一者、特别是与SEQ ID NO：2具有至少85％同一性、特别是具有至少90％同一性、更特别是具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的序列构成的序列；和

-由与SEQ ID NO：2、3和4中的任一者具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：2、3和4中的任一者、特别是与SEQ ID NO：2具有至少85％同一性、特别是具有至少90％同一性、更特别是具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的序列构成的序列的功能性片段，其中所述功能性片段具有肌肉选择性启动子活性。

任选地，本文中描述的核酸分子还可以包含其他增强子，例如肌肉选择性增强子，例如SEQ ID NO：34的SA195增强子或SEQ ID NO：5的MCK增强子或这些增强子的功能性变体，所述功能性变体具有与SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：5的同一性为至少80％、例如与SEQID NO：34或SEQ ID NO：5的同一性为至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％的序列。在特定实施方式中，所述其他增强子位于所述肝选择性增强子或所述多个肝选择性增强子与所述肌肉选择性启动子之间。在特定实施方式中，在所述肝选择性增强子或所述多个肝选择性增强子与所述肌肉选择性启动子之间未提供其他增强子。

本发明的杂合启动子可以被可操作连接到感兴趣的转入基因。因此，本发明还涉及一种表达盒，其包含可操作连接到感兴趣的转入基因的本文中所述的核酸分子。

本发明还涉及一种包含上述表达盒的载体。在特定实施方式中，所述载体是质粒载体。在另一个实施方式中，所述载体是病毒载体。代表性的病毒载体包括但不限于腺病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体和细小病毒载体，例如AAV载体。在特定实施方式中，所述病毒载体是AAV载体，例如包含AAV8或AAV9衣壳的AAV载体。

本发明还涉及一种分离的重组细胞，其包含根据本发明所述的核酸构建物。

本发明还涉及一种药物组合物，其在可药用载体中包含本发明的载体或分离的细胞。

此外，本发明还涉及本文中公开的表达盒、载体或细胞，所述表达盒、载体或细胞用作药物。在这种情况下，包含在所述表达盒、载体或细胞中的感兴趣的转入基因是治疗性转入基因。

本发明还涉及本文中公开的表达盒、载体或细胞，所述表达盒、载体或细胞用于基因疗法。

另一方面，本发明涉及本文中公开的表达盒、载体或细胞，所述表达盒、载体或细胞用于治疗神经肌肉障碍。具体来说，所述神经肌肉障碍可以选自肌营养不良症(例如肌强直性营养不良(Steinert病)、杜氏肌营养不良、贝克型肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良、Emery-Dreifuss肌营养不良)、运动神经元疾病(例如肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、脊髓性肌肉萎缩症(婴儿型进行性脊髓性肌肉萎缩症(1型，Werdnig-Hoffmann病)、中间型脊髓性肌肉萎缩症(2型)、青少年型脊髓性肌肉萎缩症(3型，Kugelberg-Welander病)、成人型脊髓性肌肉萎缩症(4型))、脊髓延髓肌肉萎缩症(肯尼迪病))、炎性肌病(例如多发性肌炎皮肌炎、包涵体肌炎)、神经肌肉接头疾病(例如重症肌无力、Lambert-Eaton(肌无力)综合征、先天性肌无力综合征)、周围神经疾病(例如Charcot-Marie-Tooth病、弗里德希氏共济失调、Dejerine-Sottas病)、肌肉代谢疾病(例如磷酸化酶缺乏症(麦卡德尔氏病)、酸性麦芽糖酶缺乏症(庞贝氏病)、磷酸果糖激酶缺乏症(Tarui病)、去分支酶缺乏症(科里病或Forbes病)、线粒体肌病、肉碱缺乏症、肉碱棕榈酰基转移酶缺乏症、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症、乳酸脱氢酶缺乏症、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症)、内分泌异常引起的肌病(例如甲状腺亢进肌病、甲状腺功能减退性肌病)和其他肌病(例如先天性肌强直、先天性副肌强直、中央轴突症、线状体肌病、肌管性肌病、周期性瘫痪)。

在另一个特定实施方式中，所述疾病是科里病，并且所述感兴趣的转入基因是GDE，例如截短形式的GDE。

附图说明

图1.启动子/增强子关联的示意图。注明了每个元件的尺寸。

图2.肌肉中的mSeAP蛋白表达。将C57BL/6小鼠用2×10¹¹vg/小鼠的AAV9载体注射，所述载体在spC5-12启动子(spC5-12)或同一启动子与MCK(MCK-spC5-12)、H1和MCK(H1-MCK-spC5-12)或H3和MCK(H3-MCK-spC5-12)增强子的融合体的转录控制之下表达鼠类分泌型碱性磷酸酶(mSeAP)报告基因。注射PBS的小鼠被用作对照(PBS)。在注射后一个月，测量不同肌肉中的mSeAP活性并报告为与在PBS组中测量到的水平相比的变化倍数。统计分析通过ANOVA进行(*＝p<0.05，n＝每组5只)。

图3.非肌肉组织中的mSEAP表达。分析来自于如图2中所述处理的C57BL/6小鼠的肝、脑和肾的mSEAP活性。测量到的mSeAP活性被报告为与在注射PBS的小鼠中测量到的水平相比的变化倍数。统计分析通过ANOVA进行(*＝p<0.05，n＝每组5只)。

图4.为了提高肌肉中的转入基因表达，MCK增强子的存在不是必需的。将C57BL/6小鼠用4×10¹¹vg/小鼠的AAV9载体注射，所述载体在spC5-12启动子(spC5-12)或同一启动子与H3(H3-spC5-12)或H3和MCK(H3-MCK-spC5-12)增强子的融合体的转录控制之下表达鼠类分泌型碱性磷酸酶(mSeAP)报告基因。注射PBS的小鼠被用作对照(PBS)。在注射后一个月，测量心脏、膈膜、四头肌和三头肌中的mSeAP活性，并报告为与在PBS组中测量到的水平相比的变化倍数。统计分析通过ANOVA进行(*＝如所指示的p<0.05，n＝每组4只)。

图5.H3增强子在与不同的肌肉特异性启动子融合时提高肌肉表达。将C57BL/6小鼠用5×10¹¹vg/小鼠的AAV9载体注射，所述载体在CK6或CK8启动子或由与CK6(H3-CK6)或CK8(H3-CK8)融合的H3增强子构成的增强子-启动子组合的转录控制之下表达鼠类分泌型碱性磷酸酶(mSeAP)报告基因。注射PBS的小鼠被用作对照(PBS)。在载体注射后15天，测量心脏、四头肌和三头肌中的mSeAP活性，并报告为与在用CK6启动子控制之下的mSeAP注射的小鼠中测量到的水平相比的变化倍数。统计分析通过ANOVA进行(*＝如所指示的p<0.05，n＝每组4只)。

图6.H3增强子在与ACTA1肌肉特异性启动子融合时提高肌肉表达。将C57BL/6小鼠用4×10¹¹vg/小鼠的AAV9载体注射，所述载体在由与spC5-12(H3-spC5-12)或Acta1(H3-Acta1)启动子融合的H3增强子构成的增强子-启动子组合的转录控制之下表达鼠类分泌型碱性磷酸酶(mSeAP)报告基因。注射PBS的小鼠被用作对照(PBS)。在注射后一个月，测量心脏、膈膜、四头肌和三头肌中的mSeAP活性，并报告为与在PBS组中测量到的水平相比的变化倍数。统计分析通过ANOVA进行(*＝与PBS相比p<0.05，n＝每组4只)。

图7.F增强子在与肌肉特异性启动子融合时提高肌肉表达。将C57BL/6小鼠用4×10¹¹vg/小鼠的AAV9载体注射，所述载体在spC5-12启动子或F增强子与spC5-12启动子的组合(F-spC5-12)的转录控制之下表达鼠类分泌型碱性磷酸酶(mSeAP)报告基因。注射PBS的小鼠被用作对照(PBS)。在载体注射后15天，测量四头肌中的mSeAP活性，并报告为与在PBS组中测量到的水平相比的变化倍数。统计分析通过ANOVA进行(*＝与spC5-12相比p<0.05，n＝每组3-4只).

具体实施方式

定义

在本发明的情形中，“转录调控元件”是能够驱动或增强转入基因在组织或细胞中的表达的DNA序列。

在本发明的情形中，表述“肌肉选择性启动子”包括天然或合成的肌肉选择性启动子。此外，表述“肝选择性增强子”包括天然或合成的肝选择性增强子。

根据本发明，组织选择性意味着与在另一种组织中的表达相比，转录调控元件偏好性地在给定组织或一组组织中驱动(在启动子的情况下)或增强(在增强子的情况下)可操作连接到所述转录调控元件的基因的表达。“组织选择性”的这个定义不排除组织选择性转录调控元件(例如肌肉选择性启动子)在一定程度上泄漏的可能性。“泄漏”或其派生词意味着肌肉选择性启动子在另一种组织中驱动或提高可操作连接到所述启动子的转入基因的表达的可能性，尽管表达水平较低。例如，肌肉选择性启动子可能在肝组织中泄漏，意味着由该启动子驱动的表达在肌肉组织中比在肝组织中更高。或者，组织选择性转录调控元件可能是“组织特异性”转录调控元件，意味着该转录调控元件不仅以偏好性方式驱动或增强在给定组织或一组组织中的表达，而且该调控元件在其他组织中不驱动或增强或仅仅少量地驱动或增强表达。

根据本发明，“感兴趣的转入基因”是指编码RNA或蛋白质产物的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列可以根据所需目的引入到细胞中，并且能够在适合条件下表达。感兴趣的转入基因可以编码感兴趣的产物，例如感兴趣的治疗性或诊断性产物。“治疗性转入基因”被选择并用于引起所需的治疗结果，特别是用于在需要所述治疗性转入基因的表达的细胞、组织或器官中实现所述治疗性转入基因的表达。疗法可以通过多种方式实现，包括通过将蛋白质在不表达所述蛋白质的细胞中表达，通过将蛋白质在表达所述蛋白质的突变版本的细胞中表达，通过表达对表达它的靶细胞有毒的蛋白质(用于例如杀死不想要的细胞例如癌细胞的策略)，通过表达反义RNA以诱导基因阻遏或外显子跳跃，或通过表达目的是抑制蛋白质表达的沉默RNA例如shRNA。所述感兴趣的转入基因也可以编码用于靶向基因组工程的核酸酶，例如CRISPR相关蛋白9(Cas9)核酸内切酶、兆核酸酶或转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)。所述感兴趣的转入基因也可以是与CRISPR/Cas9系统一起使用的向导RNA或一组向导RNA，或与先前描述的核酸酶一起用于靶向基因组工程策略的校正矩阵。其他感兴趣的转入基因包括但不限于合成的长的非编码RNA(SINEUP；Carrieri等，2012,Nature491:454-7；Zucchelli等，2015,RNA Biol 12(8):771-9；Indrieri等，2016,Sci Rep 6:27315)和人造microRNA。在本发明的实践中有用的其他具体感兴趣的转入基因在下文描述。

根据本发明，术语“治疗”包括治愈、缓解或预防效果。因此，治疗性和预防性治疗包括改善障碍的症状或阻止或以其他方式降低发生特定障碍的风险。可以提供治疗以延迟、减缓或逆转疾病和/或其一种或多种症状的进展。术语“预防性”可以被认为是降低特定病症的严重性或发作。“预防性”还包括在以前被诊断出患有特定病症的患者中阻止所述病症的复发。“治疗性”还可以是指降低现有病症的严重性。术语“治疗”在本文中用于指称可以有益于动物、特别是哺乳动物、更特别是人类对象的任何方案。在特定实施方式中，所述哺乳动物可以是婴儿或成年对象，例如人类婴儿或成人。

“治疗上感兴趣的细胞”或“治疗上感兴趣的组织”在本文中意味着所述治疗性转入基因在其中的表达将对障碍的治疗有用的主要细胞或组织。在本发明中，感兴趣的组织是肌肉组织。

杂合启动子

本发明人设计了在本文中也被称为“杂合启动子”的转录调控元件，用于提高基因疗法的功效并在同时满足基因疗法载体的尺寸限制，例如AAV载体的尺寸限制。

本发明的核酸分子包含可操作连接到(ii)肌肉选择性启动子的(i)一个或多个肝选择性增强子。

所述肝选择性增强子或所述多个肝选择性增强子可以选自本领域技术人员已知的肝选择性增强子。在特定实施方式中，本发明的核酸分子包含一个且仅仅一个肝选择性增强子。在这个实施方式中，所述肝选择性增强子的尺寸可以是10至500个核苷酸，例如10至175个核苷酸，特别是40至100个核苷酸，特别是50至80个核苷酸，更特别是70至75个核苷酸。在其中使用多个肝选择性增强子的另一个实施方式中，所述多个肝选择性增强子的组合的尺寸可以是10至500个核苷酸，例如40至400个核苷酸，特别是70至250个核苷酸。在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是位于在肝细胞中选择性表达的基因的顺式位中的天然存在的增强子。在另一个特定实施方式中，所述肝选择性增强子可以是人工肝选择性增强子。在本发明的实践中有用的说明性人工肝选择性增强子包括但不限于在Chuah等，Molecule Therapy、2014、第22卷、第9期、第1605页中公开的那些，特别是选自HS-CRM1(SEQID NO：21)、HS-CRM2(SEQ ID NO：22)、HS-CRM3(SEQ ID NO：23)、HS-CRM4(SEQ ID NO：24)、HS-CRM5(SEQ ID NO：25)、HS-CRM6(SEQ ID NO：26)、HS-CRM7(SEQ ID NO：27)、HS-CRM8(SEQID NO：1)、HS-CRM9(SEQ ID NO：28)、HS-CRM10(SEQ ID NO：29)、HS-CRM11(SEQ ID NO：30)、HS-CRM12(SEQ ID NO：31)、HS-CRM13(SEQ ID NO：32)和HS-CRM14(SEQ ID NO：33)。在特定实施方式中，所述肝选择性增强子可以选自HS-CRM1、HS-CRM2、HS-CRM3、HS-CRM5、HS-CRM6、HS-CRM7、HS-CRM8、HS-CRM9、HS-CRM10、HS-CRM11、HS-CRM13和HS-CRM14。在另一个特定实施方式中，所述肝选择性增强子可以选自HS-CRM2、HS-CRM7、HS-CRM8、HS-CRM11、HS-CRM13和HS-CRM14。在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是由SEQ ID NO：1构成的HS-CRM8增强子或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：1的功能性片段。在另一个实施方式中，所述肝选择性增强子是与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性、特别是具有至少90％同一性、更特别是具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的HS-CRM8增强子的功能性变体，其中所述功能性变体具有肝选择性增强子活性。在另一个实施方式中，所述肝选择性增强子是由与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性、特别是具有至少90％同一性、更特别是具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的序列构成的序列的功能性片段，其中所述功能性片段具有肝选择性增强子活性。在多个肝选择性增强子的情况下，所述增强子可以被直接融合或用连接物隔开。直接融合意味着增强子的第一个核苷酸紧跟在上游增强子的最后一个核苷酸之后。在通过连接物连接的情况下，在上游增强子的最后一个核苷酸与随后的下游增强子的第一个核苷酸之间存在核苷酸序列。例如，所述连接物的长度可以在1至50个核苷酸之间，例如1至40个核苷酸，例如1至30个核苷酸，例如1至20个核苷酸，例如1至10个核苷酸。在本发明中，核酸分子的设计可以将上面提到的尺寸限制考虑在内，因此，此类连接物如果存在的话，优选是短的。代表性的短连接物包括由少于15个核苷酸，特别是少于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3个或少于2个核苷酸构成的核酸序列，例如1个核苷酸的连接物。

在本发明的核酸分子中存在的第二转录调控元件是肌肉选择性启动子，例如天然或合成的肌肉选择性启动子。所述肌肉选择性启动子是短尺寸肌肉选择性启动子。在本发明的情形中，“短尺寸启动子”具有2600个核苷酸以下，特别是2000个核苷酸以下的长度，并且在可操作连接到转入基因时具有肌肉选择性启动子活性。在特定实施方式中，所述肌肉选择性启动子具有1500个核苷酸以下、1100个核苷酸以下、600个核苷酸以下、500个核苷酸以下、400个核苷酸以下、300个核苷酸以下或200个核苷酸以下的长度。在本发明的实践中有用的说明性肌肉启动子包括但不限于CK6启动子(SEQ ID NO：6)、CK8启动子(SEQ ID NO：7)、Acta1启动子(SEQ ID NO：8)或合成启动子C5.12。在特定实施方式中，所述肌肉选择性启动子是合成启动子C5.12(spC5.12，在本文中也被成为“C5.12”)，例如在SEQ ID NO：2、3或4中示出的spC5.12或在Wang等，Gene Therapy第15期,第1489–1499页(2008)中公开的spC5.12启动子。本发明还可以使用肌肉选择性启动子的功能性片段和功能性变体。具体来说，在本发明的实践中有用的肌肉选择性启动子可以选自但不限于：

-由SEQ ID NO：2、3、4、6、7或8、特别是SEQ ID NO：2、3或4中示出的序列、更特别是SEQ ID NO：2中示出的序列构成的序列，或SEQ ID NO：2、3、4、6、7或8、特别是SEQ ID NO：2、3或4、更特别是SEQ ID NO：2的功能性片段，其中所述片段具有肌肉选择性启动子活性；

-由与SEQ ID NO：2、3、4、6、7或8中的任一者具有至少80％同一性，例如与SEQ IDNO：2、3、4、6、7或8中的任一者、特别是SEQ ID NO：2、3和4中的任一者、特别是SEQ ID NO：2具有至少85％同一性、特别是具有至少90％同一性、更特别是具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的序列构成的序列；和

-由与SEQ ID NO：2、3、4、6、7或8中的任一者具有至少80％同一性，例如与SEQ IDNO：2、3、4、6、7或8中的任一者、特别是SEQ ID NO：2、3和4中的任一者、特别是SEQ ID NO：2具有至少85％同一性、特别是具有至少90％同一性、更特别是具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的序列构成的序列的功能性片段，其中所述功能性片段具有肌肉选择性启动子活性。

其他肌肉选择性启动子包括但不限于MCK启动子(SEQ ID NO：14)、肌间线蛋白启动子(SEQ ID NO：15)和unc45b启动子(SEQ ID NO：16)或具有肌肉选择性启动子活性的这些启动子的功能性片段。在另一个实施方式中，所述肌肉选择性启动子的序列由与SEQ IDNO：14、15或16中的任一者具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：14、15或16中的任一者具有至少85％同一性、特别是具有至少90％同一性、更特别是具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的序列构成。在另一个实施方式中，所述肌肉选择性启动子是由与SEQ ID NO：14、15或16中的任一者具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：14、15或16中的任一者具有至少85％同一性、特别是具有至少90％同一性、更特别是具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的序列构成的序列的功能性片段，其中所述功能性片段具有肌肉选择性启动子活性。

此外但任选地，本文描述的核酸分子还可以包含其他增强子，例如肌肉选择性增强子，例如SEQ ID NO：5的MCK增强子或具有与SEQ ID NO：5的同一性为至少80％、例如与SEQ ID NO：5的同一性为至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％的序列的MCK增强子的功能性变体。在特定实施方式中，所述其他增强子，特别是SEQ ID NO：5的MCK增强子或其功能性变体，位于

所述肝选择性增强子或多个肝选择性增强子，以及

所述肌肉选择性启动子之间。

在本发明的情形中，所述引入到本发明的核酸分子中的转录调控元件(即(i)所述肝选择性增强子或所述多个肝选择性增强子；(ii)在前一段中提到的任选的其他增强子；和(iii)所述肌肉选择性启动子)可以被直接融合或通过连接物连接。例如，在具有一个肝选择性增强子和肌肉选择性启动子的设计的情况下，直接融合意味着所述启动子的第一个核苷酸紧跟在所述肝选择性增强子的最后一个核苷酸之后。此外，在具有多个肝选择性增强子和肌肉选择性启动子的设计的情况下，直接融合意味着所述启动子的第一个核苷酸紧跟在最3'端的肝选择性增强子的最后一个核苷酸之后。在通过连接物连接的情况下，在唯一的肝选择性增强子的最后一个核苷酸与所述启动子的第一个核苷酸之间，或在所述最3'端的肝选择性增强子的最后一个核苷酸与所述启动子的第一个核苷酸之间，存在核苷酸序列。例如，所述连接物的长度可以在1至1500个核苷酸之间，例如1至1000个核苷酸(例如101、300、500或1000个核苷酸，例如分别在SEQ ID NO：17、18、19和20中示出的连接物)，例如1至500个核苷酸，例如1至300个核苷酸，例如1至100个核苷酸，例如1至50个核苷酸，例如1至40个核苷酸，例如1至30个核苷酸，例如1至20个核苷酸，例如1至10个核苷酸。在本发明中，所述核酸分子的设计可以将上面提到的尺寸限制考虑在内，因此，此类连接物如果存在的话，优选是短的。代表性的短连接物包括由少于15个核苷酸，特别是少于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3个或少于2个核苷酸构成的核酸序列，例如1个核苷酸的连接物。

在特定实施方式中，本发明的核酸分子特别是从5’至3’依次包含：

-一个选择性肝选择性增强子，特别是HS-CRM8增强子或其功能性变体或功能性片段；和

-肌肉选择性启动子，特别是spC5.12启动子或其功能性变体或功能性片段。

根据这个实施方式的特定变化形式，本发明的核酸分子由SEQ ID NO：9中示出的序列构成，或由具有与SEQ ID NO：9的同一性为至少80％，例如与SEQ ID NO：9的同一性为至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％的序列并具有肌肉选择性启动子活性的SEQ ID NO：9中示出的序列的功能性变体构成。

-一个选择性肝选择性增强子，特别是HS-CRM8增强子或其功能性变体或功能性片段；

-肌肉选择性增强子，例如MCK增强子；和

根据这个实施方式的特定变化形式，本发明的核酸分子由SEQ ID NO：10中示出的序列构成，或由具有与SEQ ID NO：10的同一性为至少80％，例如与SEQ ID NO：10的同一性为至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％的序列并具有肌肉选择性启动子活性的SEQ ID NO：10中示出的序列的功能性变体构成。

-两个选择性肝选择性增强子，特别是HS-CRM8增强子或其功能性变体或功能性片段的两个重复序列；和

-两个选择性肝选择性增强子，特别是HS-CRM8增强子或其功能性变体或功能性片段的两个重复序列；

-肌肉选择性增强子，例如MCK增强子；和

-三个选择性肝选择性增强子，特别是HS-CRM8增强子或其功能性变体或功能性片段的三个重复序列；和

根据这个实施方式的特定变化形式，本发明的核酸分子由SEQ ID NO：11中示出的序列构成，或由具有与SEQ ID NO：11的同一性为至少80％，例如与SEQ ID NO：11的同一性为至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％的序列并具有肌肉选择性启动子活性的SEQ ID NO：11中示出的序列的功能性变体构成。

-三个选择性肝选择性增强子，特别是HS-CRM8增强子或其功能性变体或功能性片段的三个重复序列；

-肌肉选择性增强子，例如MCK增强子；和

根据这个实施方式的特定变化形式，本发明的核酸分子由SEQ ID NO：12中示出的序列构成，或由具有与SEQ ID NO：12的同一性为至少80％，例如与SEQ ID NO：12的同一性为至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％的序列并具有肌肉选择性启动子活性的SEQ ID NO：12中示出的序列的功能性变体构成。

在本文中具体公开的本发明的核酸分子的所有实施方式中，所述核酸分子可以包括位于肝选择性增强子与所述肌肉选择性启动子之间的连接物。

此外，在本文中具体公开的本发明的核酸分子的所有实施方式中，所述核酸分子可以包括位于两个肝选择性增强子之间的连接物。例如，在包含两个肝选择性增强子的实施方式中，连接物可以位于或不位于这两个肝选择性增强子之间。此外，在包含三个肝选择性增强子的实施方式中，连接物可以被包含在第一与第二肝选择性增强子之间和/或第二与第三肝选择性增强子之间。例如，在具有三个肝选择性增强子的实施方式中，连接物位于所述第一与第二肝选择性增强子之间，并且没有连接物位于所述第二与第三肝选择性增强子之间。在另一种变化形式中，在具有三个肝选择性增强子的实施方式中，没有连接物位于所述第一与第二肝选择性增强子之间，并且连接物位于所述第二与第三肝选择性增强子之间。

表达盒

本发明的核酸分子可以被引入到表达盒中，所述表达盒被设计用于提供感兴趣的转入基因在感兴趣的组织中的表达。

因此，本发明的表达盒包括上述核酸分子和感兴趣的转入基因。

所述表达盒可以包含至少一个能够进一步控制所述感兴趣的治疗性转入基因的表达的其他调控序列，所述控制通过下述方式实现：通过降低或抑制它在某些不感兴趣的组织中的表达，或通过使编码所述感兴趣的蛋白质、例如由所述感兴趣的转入基因编码的治疗性蛋白的mRNA稳定。这些序列包括例如沉默子(例如组织特异性沉默子)、microRNA靶序列、内含子和多腺苷化信号。

在特定实施方式中，本发明的表达盒从5'到3'依次包含：

-本发明的核酸分子；

-感兴趣的转入基因；和

-多腺苷化信号。

在这个实施方式的特定变化形式中，可以将内含子引入到本发明的核酸分子与所述感兴趣的转入基因之间。结果，所述内含子位于如上所述包含在所述核酸分子中的肌肉选择性启动子与所述感兴趣的转入基因之间。或者，所述内含子可以位于所述感兴趣的转入基因内。在特定实施方式中，所述内含子可以是SV40内含子，例如由SEQ ID NO：13构成的SV40内含子。

当然，从本文中公开的教示和分子生物学和基因疗法领域中的普通知识，本领域技术人员可以根据并入到所述表达盒中的感兴趣的转入基因的尺寸，选择并改变增强子数目、增强子尺寸、启动子尺寸、连接物尺寸和任何其他元件例如其他增强子(例如MCK增强子或其功能性变体)和内含子。

所述感兴趣的转入基因可以是在前面的“定义”章节中描述的任何转入基因。此外，在下面的表中提供了具体的示例性的感兴趣的转入基因，其中转入基因按照它们可能治疗的神经肌肉障碍的家族重新分组：

肌营养不良症

先天性肌营养不良症

先天性肌病

远端肌病

其他肌病

肌强直综合征

离子通道肌肉病

恶性高热

基因	蛋白质
		RYR1	鱼尼丁受体1(骨骼肌)
CACNA1S	电压依赖性钙通道，L型，α1S亚基

代谢性肌病

遗传性心肌病

先天性肌无力综合征

运动神经元疾病

遗传性运动和感觉神经病

遗传性截瘫

其他神经肌肉障碍

载体、细胞和药物组合物

本发明的表达盒可以被引入到载体中。因此，本发明还涉及包含上述表达盒的载体。在本发明中使用的载体是适合于RNA/蛋白质表达，特别是适合于基因疗法的载体。

在一个实施方式中，所述载体是质粒载体。

在另一个实施方式中，所述载体是非病毒载体，例如含有本发明的表达盒的纳米粒子、脂质纳米粒子(LNP)或脂质体。

在另一个实施方式中，所述载体是基于转座子的系统，允许将本发明的表达盒整合到靶细胞的基因组中，例如超高活性的睡美人(SB100X)转座子系统(Mates等，2009)。

在另一个实施方式中，所述感兴趣的转入基因是可用于靶向基因组工程的修复基质，例如适合于与如上所述的核酸内切酶一起用于校正基因的修复基质。更具体来说，所述载体包括含有与感兴趣的基因同源的臂的修复基质，用于同源驱动的整合。

在另一个实施方式中，所述载体是适用于基因疗法的靶向肌肉的病毒载体。在这种情况下，正如本领域中公知的，向本发明的表达盒添加适用于产生高效病毒载体的其他序列。在特定实施方式中，所述病毒载体源自于整合型病毒。具体来说，所述病毒载体可以源自于腺病毒、反转录病毒或慢病毒(例如整合缺陷型慢病毒)。在特定实施方式中，所述慢病毒是假型慢病毒，具有能够靶向感兴趣的细胞/组织例如肝和/或肌肉细胞的包膜(正如在专利申请EP17306448.6和EP17306447.8)中所述。在所述病毒载体源自于反转录病毒或慢病毒的情况下，所述其他序列是在所述表达盒两侧的反转录病毒或慢病毒LTR序列。在另一个特定实施方式中，所述病毒载体是细小病毒载体，例如AAV载体，例如适合于转导肌肉的AAV载体。在这个实施方式中，所述其他序列是在所述表达盒两侧的AAV ITR序列。

在优选实施方式中，所述载体是AAV载体。人类细小病毒腺相关病毒(AAV)是一种天然复制缺陷的依赖病毒，其能够整合到被感染细胞的基因组中以建立潜伏感染。所述最后一种特性在哺乳动物病毒中似乎是独一无二的，因为整合发生在人类基因组中的特定位点处，被称为AAVS1，位于19号染色体上(19q13.3-qter)。

因此，AAV载体作为用于人类基因疗法的潜在载体引起了相当大的兴趣。所述病毒的有利特性包括它与任何人类疾病不存在关联，它感染分裂和非分裂细胞两者的能力，并且可以感染源自于不同组织的广范围的细胞系。

在从人类或非人类灵长动物(NHP)分离并充分表征的AAV的血清型中，人类血清2型是被开发为基因转移载体的第一种AAV。其他目前使用的AAV血清型包括AAV-1、AAV-2变体(例如包含具有Y44+500+730F+T491V改变的工程化衣壳的四重突变衣壳优化的AAV-2，其公开在Ling等，2016年7月18日,Hum Gene Ther Methods.中)、AAV-3和AAV-3变体(例如包含具有两个氨基酸改变S663V+T492V的工程化AAV3衣壳的AAV3-ST变体，其公开在Vercauteren等，2016,Mol.Ther.24卷(6),第1042页中)、AAV-3B和AAV-3B变体、AAV-4、AAV-5、AAV-6和AAV-6变体(例如包含三重突变的AAV6衣壳Y731F/Y705F/T492V形式的AAV6变体，其公开在Rosario等，2016,Mol Ther Methods Clin Dev.3,第16026页中)、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-2G9、AAV-10例如AAVcy10和AAV-rh10、AAV-rh74、EP18305399中所公开的AAV-rh74-9(例如在EP18305399的实施例中描述的杂合衣壳rh74-9血清型；在本文中也被称为“-rh74-9”、“AAVrh74-9”或“AAV-rh74-9”的rh74-9血清型)、EP18305399中所公开的AAV-9-rh74(例如在EP18305399的实施例中描述的杂合衣壳9-rh74血清型；在本文中也被称为“-9-rh74”、“AAV9-rh74”、“AAV-9-rh74”或“rh74-AAV9”的-9-rh74血清型)、AAV-dj、Anc80、LK03、AAV2i8、猪AAV血清型例如AAVpo4和AAVpo6，以及所述AAV血清型的酪氨酸、赖氨酸和丝氨酸衣壳突变体等。此外，其他非天然的工程化变体和嵌合AAV也可能是有用的。

AAV病毒可以使用常规的分子生物学技术进行工程化改造，使得可以优化这些粒子以用于核酸序列的细胞特异性递送，用于最小化免疫原性，用于调节稳定性和粒子寿命，用于高效降解，用于向细胞核的精确递送。

用于组装成载体的所需AAV片段包括衣壳蛋白，包括vp1、vp2、vp3和高变区，rep蛋白，包括rep 78、rep 68、rep 52和rep 40，以及编码这些蛋白质的序列。这些片段可以在各种不同的载体系统和宿主细胞中容易地利用。

缺少Rep蛋白的基于AAV的重组载体以低效整合在宿主的基因组中，并主要作为稳定的环状游离体存在，可以在靶细胞中存留数年。

代替使用AAV天然血清型，在本发明的情形中也可以使用人工AAV血清型，包括但不限于具有非天然存在的衣壳蛋白的AAV。这种人工衣壳可以通过任何适合的技术，使用所选的AAV序列(例如vp1衣壳蛋白的片段)与异源序列相组合来产生，所述异源序列可以从不同的所选AAV血清型、同一AAV血清型的非毗连部分、非AAV病毒来源或非病毒来源获得。人工AAV血清型可以具有嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳，但不限于此。

在本发明的情形中，所述AAV载体包含能够转导感兴趣的靶细胞即肌细胞的AAV衣壳。

根据特定实施方式，所述AAV载体是AAV-1、AAV-2、AAV-2变体(例如包含具有Y44+500+730F+T491V改变的工程化衣壳的四重突变衣壳优化的AAV-2，其公开在Ling等，2016年7月18日,Hum Gene Ther Methods.[付印前的电子版]中)、AAV-3和AAV-3变体(例如包含具有两个氨基酸改变S663V+T492V的工程化AAV3衣壳的AAV3-ST变体，其公开在Vercauteren等，2016,Mol.Ther.24卷(6),第1042页中)、AAV-3B和AAV-3B变体、AAV-4、AAV-5、AAV-6和AAV-6变体(例如包含三重突变的AAV6衣壳Y731F/Y705F/T492V形式的AAV6变体，其公开在Rosario等，2016,Mol Ther Methods Clin Dev.3,第16026页中)、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-2G9、AAV-10例如AAV-cy10和AAV-rh10、AAV-rh39、AAV-rh43、AAV-rh74、AAV-rh74-9、AAV-dj、Anc80、LK03、AAV.PHP、AAV2i8、猪AAV血清型例如AAVpo4和AAVpo6，以及AAV血清型的酪氨酸、赖氨酸和丝氨酸衣壳突变体。在特定实施方式中，所述AAV载体是AAV8、AAV9、AAVrh74、AAVrh74-9或AAV2i8血清型(即所述AAV载体具有AAV8、AAV9、AAVrh74、AAVrh74-9或AAV2i8血清型的衣壳)。在另一个特定实施方式中，所述AAV载体是假型载体，即它的基因组和衣壳源自于不同血清型的AAV。例如，所述假型AAV载体可以是其基因组源自于上述AAV血清型之一并且其衣壳源自于另一种血清型的载体。例如，所述假型载体的基因组可以具有源自于AAV8、AAV9、AAVrh74、AAVrh74-9或AAV2i8血清型的衣壳，并且其基因组源自于不同血清型。在特定实施方式中，所述AAV载体具有AAV8、AAV9、AAVrh74或AAVrh74-9血清型、特别是AAV8或AAV9血清型、更特别是AAV8血清型的衣壳。

在另一个实施方式中，所述衣壳是修饰的衣壳。在本发明的情形中，“修饰的衣壳”可以是嵌合衣壳或包含源自于一种或多种野生型AAV VP衣壳蛋白的一种或多种变体VP衣壳蛋白的衣壳。

在特定实施方式中，所述AAV载体是嵌合载体，即它的衣壳包含源自于至少两种不同AAV血清型的VP衣壳蛋白，或包含至少一种嵌合VP蛋白，其合并了源自于至少两种AAV血清型的VP蛋白区域或结构域。例如，嵌合AAV载体可以源自于AAV8衣壳序列与不同于AAV8血清型的AAV血清型例如上面具体提到的那些中的任一者的序列的组合。

在另一个实施方式中，所述修饰的衣壳也可以源自于通过易错PCR和/或肽插入而插入的衣壳修饰(例如在Bartel等，2011中所述)。此外，衣壳变体可以包括单一氨基酸改变例如酪氨酸突变体(例如在Zhong等，2008中所述)。

此外，AAV载体的基因组可以是单链或自身互补的双链基因组(McCarty等，GeneTherapy,2003)。自身互补的双链AAV载体通过从AAV末端重复序列之一缺失末端解离位点来产生。这些复制基因组为野生型AAV基因组长度的一半的修饰的载体具有包装DNA二聚体的倾向。在优选实施方式中，在本发明的实践中使用的AAV载体具有单链基因组，并且此外优选地包含AAV8、AAV9、AAVrh74、AAVrh74-9或AAV2i8衣壳，特别是AAV8、AAV9、AAVrh74或AAVrh74-9衣壳，例如AAV8或AAV9衣壳，更特别是AAV8衣壳。正如本领域中已知的，可以将其他适合的序列引入到本发明的核酸构建物中，以获得有功能的病毒载体。适合的序列包括AAV ITR。

当然，在设计本发明的核酸序列和本发明的表达盒中，本领域技术人员应该注意用于将所述构建物递送到细胞或器官的载体的尺寸限制。具体来说，正如上文提到的，在所述载体是AAV载体的情况下，本领域技术人员知道AAV载体的主要限制是它的运载容量，其在不同AAV血清型中可能不同，但据认为限于亲本病毒基因组的尺寸左右。例如，5kb是通常认为的包装在AAV8衣壳中的最大尺寸(Wu Z.等，Mol Ther.,2010,18(1):80-86；Lai Y.等，Mol Ther.,2010,18(1):75-79；Wang Y.等，Hum Gene Ther Methods,2012,23(4):225-33)。因此，本领域技术人员在实践本发明中应该注意选择本发明的核酸构建物的组分，使得得到的包括编码AAV 5'-和3'-ITR的序列在内的核酸序列优选地不超过所使用的AAV载体的运载容量的110％，特别是优选地不超过5.5kb。

本发明还涉及一种分离的细胞，例如肌细胞，所述细胞用本发明的核酸序列或本发明的表达盒转化。本发明的细胞可以通过注射到需要的对象的感兴趣的组织中或血流中，递送到所述对象。在特定实施方式中，本发明涉及将本发明的核酸分子或表达盒引入到待治疗对象的细胞中，并将所述已引入有核酸或表达盒的细胞给回到所述对象。

本发明还提供了包含本发明的核酸分子、载体或细胞的药物组合物。此类组合物包含治疗有效量的本发明的核酸序列、载体或细胞，以及可药用载体。术语“可药用”意味着被联邦或州政府的管理机构批准或列于美国或欧洲药典或其他公认药典中可用于动物和人类。术语“载体”是指治疗剂与其一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或介质。此类药用载体可以是无菌液体例如水和油类，包括石油、动物、植物或合成来源的油类，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液和葡萄糖和甘油水溶液也可用作液体载体，特别是用于注射液。适合的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

如果需要，所述组合物也可以含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放制剂等的形式。口服制剂可以包含标准载体，例如药用级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药用载体的实例描述在E.W.Martin的《Remington制药学》(Remington'sPharmaceutical Sciences)中。此类组合物应含有治疗有效量的优选采取纯化形式的治疗剂连同适合量的载体，以便提供适合给药到对象的形式。在特定实施方式中，将本发明的核酸序列、表达盒、载体或细胞配制在包含磷酸盐缓冲盐水并增补有0.25％人血清白蛋白的组合物中。在另一个特定实施方式中，将本发明的载体配制在包含林格氏乳酸盐和非离子型表面活性剂例如pluronic F68的组合物中，所述表面活性剂的终浓度以总组合物的重量计为0.01-0.0001％，例如0.001％的浓度。所述制剂还可以包含血清白蛋白，特别是人血清白蛋白，例如0.25％的人血清白蛋白。用于储存或给药的其他适合制剂在本领域中是已知的，特别是来自于WO 2005/118792或Allay等，2011的制剂。

在优选实施方式中，所述组合物按照常规程序配制成适合于静脉内或肌肉内给药、优选为静脉内给药到人类的药物组合物。通常，用于静脉内给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，所述组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因，以缓解注射部位处的疼痛。

在一个实施方式中，本发明的核酸序列、表达盒或载体可以在囊泡、特别是脂质体中递送。在又一个实施方式中，本发明的核酸序列、表达盒或载体可以在受控释放系统中递送。

载体的使用方法

由于本发明，可以在肌肉或肌细胞中表达感兴趣的转入基因。

本发明的核酸分子、表达盒或载体可用于在肌细胞中表达基因。因此，本发明提供了一种在肌细胞中表达感兴趣的转入基因的方法，其中将本发明的表达盒引入到所述肌细胞中，并表达所述感兴趣的转入基因。所述方法可以是用于在肌细胞中表达感兴趣的转入基因的体外、离体或体内方法。

本发明的核酸分子、表达盒或载体也可用于基因疗法。因此，一方面，本发明涉及如上所述的核酸分子、表达盒、载体、细胞或药物组合物，所述核酸分子、表达盒、载体、细胞或药物组合物用作药物。因此，一方面，本发明涉及本文中公开的核酸分子、表达盒或载体，所述核酸分子、表达盒或载体用于疗法、特别是基因疗法中。同样地，本发明的细胞可用于疗法、特别是细胞疗法中。

另一方面，本发明涉及如上所述的核酸分子、表达盒、载体、细胞或药物组合物，所述核酸分子、表达盒、载体、细胞或药物组合物用于治疗神经肌肉障碍的方法中。

另一方面，本发明涉及如上所述的核酸分子、表达盒、载体、细胞或药物组合物的用途，所述核酸分子、表达盒、载体、细胞或药物组合物用于制造在治疗神经肌肉障碍中使用的药物。

另一方面，本发明涉及一种治疗神经肌肉障碍的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的本文中描述的核酸分子、表达盒、载体、细胞或药物组合物。

所述神经肌肉障碍具体来说是遗传或获得性障碍，例如遗传或获得性神经肌肉疾病。当然，治疗性转入基因和在有治疗兴趣的组织中驱动表达的启动子应根据待治疗的障碍来选择。

术语“神经肌肉障碍”涵盖直接地(随意肌病)或间接地(神经或神经肌肉接头病)损害肌肉功能的疾病和病患。说明性的神经肌肉障碍包括但不限于肌营养不良症(例如肌强直性营养不良(Steinert病)、杜氏肌营养不良、贝克型肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良、Emery-Dreifuss肌营养不良)、运动神经元疾病(例如肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、脊髓性肌肉萎缩症(婴儿型进行性脊髓性肌肉萎缩症(1型，Werdnig-Hoffmann病)、中间型脊髓性肌肉萎缩症(2型)、青少年型脊髓性肌肉萎缩症(3型，Kugelberg-Welander病)、成人型脊髓性肌肉萎缩症(4型))、脊髓延髓肌肉萎缩症(肯尼迪病))、炎性肌病(例如多发性肌炎皮肌炎、包涵体肌炎)、神经肌肉接头疾病(例如重症肌无力、Lambert-Eaton(肌无力)综合征、先天性肌无力综合征)、周围神经疾病(例如Charcot-Marie-Tooth病、弗里德希氏共济失调、Dejerine-Sottas病)、肌肉代谢疾病(例如磷酸化酶缺乏症(麦卡德尔氏病)、酸性麦芽糖酶缺乏症(庞贝氏病)、磷酸果糖激酶缺乏症(Tarui病)、去分支酶缺乏症(科里病或Forbes病)、线粒体肌病、肉碱缺乏症、肉碱棕榈酰基转移酶缺乏症、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症、乳酸脱氢酶缺乏症、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症)、内分泌异常引起的肌病(例如甲状腺亢进肌病、甲状腺功能减退性肌病)和其他肌病(例如先天性肌强直、先天性副肌强直、中央轴突症、线状体肌病、肌管性肌病、周期性瘫痪)。在这个实施方式中，本发明的核酸序列包含肝选择性、肌肉选择性和/或神经元选择性转录调控元件，例如肝选择性和肌肉选择性转录调控元件、肝选择性和神经元选择性转录调控元件以及肝选择性、肌肉选择性和神经元选择性转录调控元件。

在特定实施方式中，所述障碍是糖原贮积病。表述“糖原贮积病”表示一组涉及负责糖原的合成和降解的酶的遗传性代谢障碍。在更特定实施方式中，所述糖原贮积病可以是GSDI(方基盖氏病)、GSDII(庞贝氏病)、GSDIII(科里病)、GSDIV、GSDV、GSDVI、GSDVII、GSDVIII或心脏的致死性先天性糖原贮积病。更具体来说，所述糖原贮积病选自GSDI、GSDII和GSDIII，甚至更具体地选自GSDII和GSDIII。在甚至更特定实施方式中，所述糖原贮积病是GSDII。具体来说，本发明的核酸分子可能在基因疗法中有用，以治疗GAA缺陷型病症或伴有糖原积累的其他病症，例如GSDI(方基盖氏病)、GSDII(庞贝氏病)、GSDIII(科里病)、GSDIV、GSDV、GSDVI、GSDVII、GSDVIII和心脏的致死性先天性糖原贮积病，更特别是GSDI、GSDII或GSDIII，甚至更特别是GSDII和GSDIII。在另一个特定实施方式中，所述障碍是庞贝氏病，并且所述治疗性转入基因是编码酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)或其变体的基因。此类GAA的变体被具体公开在申请PCT/2017/072942、PCT/EP2017/072945和PCT/EP2017/072944中，所述申请通过引用以其整体并入本文。在这个实施方式中，本发明的序列包含肝选择性、肌肉选择性和/或神经元选择性转录调控元件，例如肝选择性和肌肉选择性转录调控元件、肝选择性和神经元选择性转录调控元件、肌肉选择性和神经元选择性转录调控元件以及肝选择性、肌肉选择性和神经元选择性转录调控元件。在特定实施方式中，所述障碍是婴儿期发作的庞贝氏病(IOPD)或迟发型庞贝氏病(LOPD)。优选地，所述障碍是IOPD。

本领域技术人员已知通过基因疗法在这些和其他障碍的治疗中有用的感兴趣的转入基因。例如，所述治疗性转入基因是：用于MPSI的溶酶体酶α-L-艾杜糖醛酸酶[IDUA(α-L-艾杜糖醛酸酶)]，用于庞贝氏病的酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)，用于科里病(GSDIII)的糖原脱支酶(GDE)或GDE的缩短形式(也被称为GDE的截短形式或mini-GDE)，用于GSDI的G6P，用于LGMD2D的α-肌聚糖蛋白(SGCA)，用于DMD的肌营养不良蛋白或其缩短的形式，以及用于SMA的SMN1。所述感兴趣的转入基因也可以是提供其他治疗性能而不是提供丢失蛋白或抑制给定蛋白质的表达的RNA的转入基因。例如，感兴趣的转入基因可以包括但不限于可以提高肌肉强度的转入基因。

下文提供了可以可操作连接到本发明的杂合启动子以用于特定疾病的感兴趣的治疗性转入基因的具体实例。

在特定实施方式中，所述疾病是科里病，并且所述感兴趣的转入基因编码GDE或GDE的缩短形式。适合用于本发明的GDE的缩短形式可以包括但不限于在EP18306088中所描述的。或者，本发明使用双重AAV载体系统来表达GDE，例如在WO2018162748中公开的双重AAV载体系统。在这个实施方式中，本发明的载体可以对应于所述双重AAV载体系统的第一AAV载体，其在5'和3'AAV ITR之间包含编码在本发明的核酸分子控制之下的GDE的N-端部分的第一核酸序列。

在另一个特定实施方式中，所述疾病是庞贝氏病，并且所述感兴趣的转入基因编码酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)或修饰的GAA。适合用于本发明的修饰的GDE包括但不限于在WO2018046772、WO2018046774和WO2018046775中所公开的。

在另一个特定实施方式中，所述障碍选自杜氏肌营养不良、肌管性肌病、脊髓性肌肉萎缩症、肢带型肌营养不良2I型、肢带型肌营养不良2A型、肢带型肌营养不良2B型、肢带型肌营养不良2C型或肢带型肌营养不良2D型和1型肌强直性营养不良。

本发明的载体的给药方法包括但不限于真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、WO2015158924中所描述的局域给药和口服途径。在特定实施方式中，所述给药通过静脉内或肌肉内途径。本发明的载体可以通过任何方便的途径给药，例如通过输注或快速浓注，通过经上皮或黏膜皮肤衬(例如口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)吸收，并且可以与其他生物活性药剂一起给药。给药可以是系统性或局部的。

在特定实施方式中，可能希望将本发明的药物组合物局部给药到需要治疗的区域，例如肝脏或肌肉。这可以例如利用植入物来实现，所述植入物是多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜例如硅橡胶膜或纤维。

在待治疗的障碍的治疗中有效的本发明的载体的量可以通过标准临床技术来确定。此外，可以任选地使用体内和/或体外测定法来帮助预测最佳剂量范围。在制剂中使用的准确剂量也取决于给药途径和疾病的严重程度，并且应当根据从业医师的判断和每位患者的情况决定。给药到需要的对象的本发明的载体的剂量随着几种因素而变，包括但不限于给药途径、治疗的具体疾病、对象的年龄或获得治疗效果必需的表达水平。本领域技术人员可以在本领域知识的基础上，根据这些因素和其他因素容易地确定需要的剂量。在治疗包括向对象给药AAV载体的情况下，载体的典型剂量是至少每千克体重1×10⁸份载体基因组(vg/kg)，例如至少1×10⁹vg/kg、至少1×10¹⁰vg/kg、至少1×10¹¹vg/kg、至少1×10¹²vg/kg、至少1×10¹³vg/kg、至少1×10¹⁴vg/kg或至少1×10¹⁵vg/kg。

在特定实施方式中，本发明的载体可以以比在基因疗法中使用的典型剂量更低的剂量给药。具体来说，在包括向需要的对象给药AAV载体的治疗中，所述载体可以以比上述典型剂量低至少2倍的剂量，特别是以比在基因疗法中常用的典型AAV剂量低至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍或甚至至少50倍的剂量给药。

实施例

材料和方法

体内研究

所有小鼠研究均按照法国和欧洲关于动物护理和实验的立法(2010/63/EU)进行，并得到当地机构伦理委员会批准(协议编号2016-002B)。通过尾静脉将AAV载体静脉内给药到6-8周龄雄性C57Bl6/J小鼠。PBS注射的同窝仔畜被用作对照。在处死后立即将小鼠用PBS灌注，以避免组织中的血液污染。在取样后，使用Fastprep管将组织在无DNA酶/RNA酶的水中匀浆(4m/s；60秒)。

mSeAP活性

组织中的mSeAP活性使用Phospha-LightTMSEAP报告基因测定系统(ThermoFisher)，遵照制造商的说明书进行测量。

质粒构建

增强子/启动子(EP)序列从商业化来源购买。使用XhoI和Mlu1限制性酶将mSeAPcDNA连接到每个EP序列。将得到的转入基因表达盒使用在所述序列两侧的XbaI限制性位点克隆到源自于AAV2的两个ITR之间。

在下面的表1中描述了实验部分中使用的启动子/增强子组合。

表1.附图中使用的启动子/增强子组合的描述

在附图中的名称	SEQ ID NO	增强子	启动子
				spC5-12	2	-	spC5-12<sup>1</sup>
MCK-spC5-12	35	MCK<sup>2</sup>	spC5-12<sup>1</sup>
				H1-MCK-spC5-12	10	H1<sup>3</sup>,MCK<sup>2</sup>	spC5-12<sup>1</sup>
H3-MCK-spC5-12	12	H3<sup>4</sup>,MCK<sup>2</sup>	spC5-12<sup>1</sup>
				H3-spC5-12	11	H3<sup>4</sup>	spC5-12<sup>1</sup>
CK6	6	-	CK6<sup>5</sup>
				H3-CK6	36	H3<sup>4</sup>	CK6<sup>5</sup>
CK8	7	-	CK8<sup>6</sup>
				H3-CK8	37	H3<sup>4</sup>	CK8<sup>6</sup>
H3-ACTA1	38	H3<sup>4</sup>	ACTA1<sup>7</sup>
				F-spC5-12	39	F<sup>8</sup>	spC5-12<sup>1</sup>

¹spC5-12启动子(SEQ ID NO：2)；²MCK增强子(SEQ ID NO：5)；³SEQ ID NO：1的一个拷贝；⁴SEQ ID NO：1的三个拷贝；⁵CK6启动子(SEQ ID NO：6)；⁶CK8启动子(SEQ ID NO：7)；⁷ACTA1启动子(SEQ ID NO：8)；⁸纤维蛋白原α链增强子(SEQ ID NO：30)。

结果

我们评估了由图1中报告的增强子和启动子的四种组合驱动的组织特异性表达。这些启动子由肌肉特异性启动子(spC5-12)与肌肉增强子MCK的组合构成(MCK-spC5-12，表1)。这种启动子与增强子的组合在文献中被称为E-Syn(Wang B.Gene therapy 2008)。通过将肝增强子HS-CRM8的一个(H1)或三个重复序列(H3)融合在MCK-spC5-12启动子/增强子组合的第1位处，获得了新的杂合启动子(分别为H1-MCK-spC5-12和H3-MCK-spC5-12，表1)。为了验证这些构建物的组织特异性，我们使用了小鼠分泌型碱性磷酸酶(mSeAP)报告基因。将带有这个报告基因和四种启动子/增强子组合的转入基因表达盒在通过三重转染和氯化铯梯度纯化产生的AAV9载体中形成假型。

将所述mSeAP-AAV9载体以每只小鼠2×10¹¹份载体基因组的剂量静脉内注射到2月龄C57Bl6/J雄性小鼠中。平行地，将小鼠用磷酸盐缓冲盐水(PBS)注射作为对照。在载体注射后1个月将动物处死。将小鼠用PBS灌注，以避免组织中的血液污染。对肌肉和非肌肉组织进行生物化学分析，以定量mSeAP酶活性。在肌肉中，与PBS注射的小鼠相比，spC5-12启动子或MCK-spC5-12增强子/启动子不引起显著且可检测的mSEAP活性(图2)。有趣的是，在H1-MCK-spC5-12和H3-MCK-spC5-12杂合启动子的转录控制之下表达mSEAP的AAV9在不同骨骼肌中允许mSEAP活性5至10倍的显著提高(图2)。在膈膜和胫骨后肌中，我们观察到mSEAP活性的更高提高，对于H3-MCK-spC5-12增强子/启动子来说分别为150和20倍。在肝脏中，我们未观察到mSEAP表达的任何显著提高(图3)。在肾脏和脑中，在接受带有H1-MCK-spC5-12和H3-MCK-spC5-12的载体的小鼠中观察到mSEAP表达的2至3倍的显著提高(图3)。

鉴于肌肉中的mSEAP表达比其他组织高得多，这些数据证实了将HS-CRM8的一个或三个拷贝融合在合成肌肉启动子(MCK-spC5-12)的5’处特异性提高了转入基因在肌肉中的表达，因此为神经肌肉障碍的基因疗法提供了一种新工具。

然后，我们通过移除MCK增强子来减小启动子的尺寸。我们制备了在下述启动子的转录控制之下表达mSEAP的AAV9载体：(i)spC5-12启动子，(ii)与HS-CRM8的三个拷贝直接融合的spC5-12启动子(H3-spC5-12)，或(iii)H3-MCK-spC5-12杂合启动子。将所述mSeAP-AAV9载体以每只小鼠4×10¹¹份载体基因组的剂量注射到C57Bl/6雄性小鼠中。平行地，将小鼠用磷酸盐缓冲盐水(PBS)注射作为对照。在载体注射后1个月将动物处死。将小鼠用PBS灌注，以避免组织中的血液污染。对肌肉组织进行分析以定量mSeAP酶活性。重要的是在肌肉中，与spC5-12启动子不同，spC5-12启动子与H3或H3-MCK的融合导致与PBS注射的小鼠相比显著且可检测的mSEAP活性(图4)。这些数据表明转入基因的肌肉表达的提高不依赖于MCK增强子的存在。下述的转入基因表达盒构建物不包括该增强子。

为了证实在将H3增强子与肌肉启动子融合时观察到的效果的鲁棒性，我们产生了包含在体内基因疗法中常用的CK6和CK8启动子的两个新的启动子/增强子组合。我们制备了在CK6或CK8启动子的转录控制之下或在与HS-CRM8的三个拷贝直接融合的CK6或CK8(分别为H3-CK6和H3-CK8)的控制之下表达mSEAP的AAV9载体。将所述mSeAP-AAV9载体以每只小鼠5×10¹¹份载体基因组的剂量注射到C57Bl/6雄性小鼠中。在载体注射后15天将动物处死。将小鼠用PBS灌注，以避免组织中的血液污染。对肌肉组织进行分析以定量mSeAP酶活性。重要的是在肌肉中，H3与CK6和CK8两种肌肉特异性启动子的融合导致分别与亲本CK6和CK8启动子相比显著且可检测的mSEAP活性(图5)。对于不同启动子也报告了类似的发现，ACTA1在与HS-CRM8的三个拷贝融合时(H3-ACTA1)，在肌肉中导致mSEAP转入基因的表达水平与使用H3-spC5-12杂合启动子测量到的水平相近(图6)。值得注意的是，在不同的实验设置中，ACTA1启动子在肌肉中显示出与spC5-12启动子相当的效能(数据未示出)。这些数据表明不论肌肉选择性启动子如何，H3均诱导启动子效能的提高。

最后，为了证实其他肝选择性增强子具有相似的效果，我们测试了与spC5-12启动子融合的控制纤维蛋白原α链转录的调控序列(在Chuah等，Molecule Therapy,2014,第22卷,第9期,第1605页中被描述为HS-CRM11)(F-spC5-12)。所述F-spC5-12杂合启动子与spC5-12启动子相比导致mSEAP转入基因表达的显著提高(图7)，因此表明与H3相似，其他肝特异性增强子在肌肉中也提高由肌肉特异性启动子驱动的转入基因表达。

序列表

<110> 吉尼松公司（GENETHON）等

<120> 用于肌肉表达的杂合启动子

<130> B2985PC00

<160> 39

<170> PatentIn 3.3版

<210> 1

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM8 (x1)

<400> 1

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 60

ggctaagtcc ac 72

<210> 2

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> spC5.12 (1)

<400> 2

caccgcggtg gcggccgtcc gccctcggca ccatcctcac gacacccaaa tatggcgacg 60

ggtgaggaat ggtggggagt tatttttaga gcggtgagga aggtgggcag gcagcaggtg 120

ttggcgctct aaaaataact cccgggagtt atttttagag cggaggaatg gtggacaccc 180

aaatatggcg accggttcct caaccggtcg ccatatttgg gtgtccgccc tcggccgggg 240

ccgcattcct gggggccggg cggtgctccc gcccgcctcg ataaaaggct ccggggccgg 300

cggcggccca cgagc 315

<210> 3

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> spC5.12 (2)

<400> 3

ccgagctcca ccgcggtggc ggccgtccgc cctcggcacc atcctcacga cacccaaata 60

tggcgacggg tgaggaatgg tggggagtta tttttagagc ggtgaggaag gtgggcaggc 120

agcaggtgtt ggcgctctaa aaataactcc cgggagttat ttttagagcg gaggaatggt 180

ggacacccaa atatggccca aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg 240

tccgccctcg gccggggccg cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata 300

aaaggctccg gggccggcgg cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct 360

ctagaactag tggatccccc gggctgcagg aattcgatat 400

<210> 4

<211> 358

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> spC5.12 (3)

<400> 4

caccgcggtg gcggccgtcc gccctcggca ccatcctcac gacacccaaa tatggcgacg 60

ggtgaggaat ggtggggagt tatttttaga gcggtgagga aggtgggcag gcagcaggtg 120

ttggcgctct aaaaataact cccgggagtt atttttagag cggaggaatg gtggacaccc 180

aaatatggcg acggttcctc acccgtcgcc atatttgggt gtccgccctc ggccggggcc 240

gcattcctgg gggccgggcg gtgctcccgc ccgcctcgat aaaaggctcc ggggccggcg 300

gcggcccacg agctacccgg aggagcggga ggcgccaagc tctagaacta gtggatct 358

<210> 5

<211> 208

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> MCK增强子

<400> 5

cactacgggt ctaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg 60

gttataatta accccaacac ctgctgcccc ccccccccca acacctgctg cctgagcctg 120

agcggttacc ccaccccggt gcctgggtct taggctctgt acaccatgga ggagaagctc 180

gctctaaaaa taaccctgtc cctggtgg 208

<210> 6

<211> 575

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CK6启动子

<400> 6

ctacgggtct aggctgccca tgtaaggagg caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt 60

tataattaac cccaacacct gctgcccccc cccccccaac acctgctgcc tgagcctgag 120

cggttacccc accccggtgc ctgggtctta ggctctgtac accatggagg agaagctcgc 180

tctaaaaata accctgtccc tggtgggccc aatcaaggct gtgggggact gagggcaggc 240

tgtaacaggc ttgggggcca gggcttatac gtgcctggga ctcccaaagt attactgttc 300

catgttcccg gcgaagggcc agctgtcccc cgccagctag actcagcact tagtttagga 360

accagtgagc aagtcagccc ttggggcagc ccatacaagg ccatggggct gggcaagctg 420

cacgcctggg tccggggtgg gcacggtgcc cgggcaacga gctgaaagct catctgctct 480

caggggcccc tccctgggga cagcccctcc tggctagtca caccctgtag gctcctctat 540

ataacccagg ggcacagggg ctgcccccgg gtcac 575

<210> 7

<211> 454

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CK8启动子

<400> 7

ctacaaacgc tagcatgctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc 60

tggttataat taacccagac atgtggctgc cccccccccc ccaacacctg ctgcctctaa 120

aaataaccct gcatgccatg ttcccggcga agggccagct gtcccccgcc agctagactc 180

agcacttagt ttaggaacca gtgagcaagt cagcccttgg ggcagcccat acaaggccat 240

ggggctgggc aagctgcacg cctgggtccg gggtgggcac ggtgcccggg caacgagctg 300

aaagctcatc tgctctcagg ggcccctccc tggggacagc ccctcctggc tagtcacacc 360

ctgtaggctc ctctatataa cccaggggca caggggctgc cctcattcta ccaccacctc 420

cacagcacag acagacactc aggagccagc cagc 454

<210> 8

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> Acta1启动子

<400> 8

aaaggcatag ccccatatat cagtgatata aatagaacct gcagcaggct ctggtaaatg 60

atgactacaa ggtggactgg gaggcagccc ggccttggca ggcatcgacc gggccaaccc 120

gctccttctt tggtcaacgc aggggacccg ggcgggggcc caggccgcga accggccgag 180

ggagggggct ctagtgccca acacccaaat atggctcgag aagggcagcg acattcctgc 240

ggggtggcgc ggagggaatg cccgcgggct atataaaacc tgagcagagg gacaagcggc 300

caccgcagcg gacagcgcca agtg 324

<210> 9

<211> 395

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM8 x 1 - spC5.12

<400> 9

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 60

ggctaagtcc acaagcttca caccgcggtg gcggccgtcc gccctcggca ccatcctcac 120

gacacccaaa tatggcgacg ggtgaggaat ggtggggagt tatttttaga gcggtgagga 180

aggtgggcag gcagcaggtg ttggcgctct aaaaataact cccgggagtt atttttagag 240

cggaggaatg gtggacaccc aaatatggcg accggttcct caaccggtcg ccatatttgg 300

gtgtccgccc tcggccgggg ccgcattcct gggggccggg cggtgctccc gcccgcctcg 360

ataaaaggct ccggggccgg cggcggccca cgagc 395

<210> 10

<211> 601

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM8 x 1 - MCK增强子 - spC5.12

<400> 10

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 60

ggctaagtcc acaagcttca ctacgggtct aggctgccca tgtaaggagg caaggcctgg 120

ggacacccga gatgcctggt tataattaac cccaacacct gctgcccccc cccccccaac 180

acctgctgcc tgagcctgag cggttacccc accccggtgc ctgggtctta ggctctgtac 240

accatggagg agaagctcgc tctaaaaata accctgtccc tggtggcacc gcggtggcgg 300

ccgtccgccc tcggcaccat cctcacgaca cccaaatatg gcgacgggtg aggaatggtg 360

gggagttatt tttagagcgg tgaggaaggt gggcaggcag caggtgttgg cgctctaaaa 420

ataactcccg ggagttattt ttagagcgga ggaatggtgg acacccaaat atggcgaccg 480

gttcctcaac cggtcgccat atttgggtgt ccgccctcgg ccggggccgc attcctgggg 540

gccgggcggt gctcccgccc gcctcgataa aaggctccgg ggccggcggc ggcccacgag 600

c 601

<210> 11

<211> 545

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM8x3 - spC5.12

<400> 11

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 60

ggctaagtcc acaagcttgg gggaggctgc tggtgaatat taaccaaggt caccccagtt 120

atcggaggag caaacagggg ctaagtccac gggggaggct gctggtgaat attaaccaag 180

gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg ggctaagtcc acaagcttca caccgcggtg 240

gcggccgtcc gccctcggca ccatcctcac gacacccaaa tatggcgacg ggtgaggaat 300

ggtggggagt tatttttaga gcggtgagga aggtgggcag gcagcaggtg ttggcgctct 360

aaaaataact cccgggagtt atttttagag cggaggaatg gtggacaccc aaatatggcg 420

accggttcct caaccggtcg ccatatttgg gtgtccgccc tcggccgggg ccgcattcct 480

gggggccggg cggtgctccc gcccgcctcg ataaaaggct ccggggccgg cggcggccca 540

cgagc 545

<210> 12

<211> 751

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM8x3 - MCK增强子 - spC5.12

<400> 12

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 60

ggctaagtcc acaagcttgg gggaggctgc tggtgaatat taaccaaggt caccccagtt 120

atcggaggag caaacagggg ctaagtccac gggggaggct gctggtgaat attaaccaag 180

gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg ggctaagtcc acaagcttca ctacgggtct 240

aggctgccca tgtaaggagg caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt tataattaac 300

cccaacacct gctgcccccc cccccccaac acctgctgcc tgagcctgag cggttacccc 360

accccggtgc ctgggtctta ggctctgtac accatggagg agaagctcgc tctaaaaata 420

accctgtccc tggtggcacc gcggtggcgg ccgtccgccc tcggcaccat cctcacgaca 480

cccaaatatg gcgacgggtg aggaatggtg gggagttatt tttagagcgg tgaggaaggt 540

gggcaggcag caggtgttgg cgctctaaaa ataactcccg ggagttattt ttagagcgga 600

ggaatggtgg acacccaaat atggcgaccg gttcctcaac cggtcgccat atttgggtgt 660

ccgccctcgg ccggggccgc attcctgggg gccgggcggt gctcccgccc gcctcgataa 720

aaggctccgg ggccggcggc ggcccacgag c 751

<210> 13

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> SV40内含子

<400> 13

ctctaaggta aatataaaat ttttaagtgt ataatgtgtt aaactactga ttctaattgt 60

ttgtgtattt tagattccaa cctatggaac t 91

<210> 14

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> MCK启动子

<400> 14

caatcaaggc tgtgggggac tgagggcagg ctgtaacagg cttgggggcc agggcttata 60

cgtgcctggg actcccaaag tattactgtt ccatgttccc ggcgaagggc cagctgtccc 120

ccgccagcta gactcagcac ttagtttagg aaccagtgag caagtcagcc cttggggcag 180

cccatacaag gccatggggc tgggcaagct gcacgcctgg gtccggggtg ggcacggtgc 240

ccgggcaacg agctgaaagc tcatctgctc tcaggggccc ctccctgggg acagcccctc 300

ctggctagtc acaccctgta ggctcctcta tataacccag gggcacaggg gctgcccccg 360

ggtcac 366

<210> 15

<211> 1060

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 肌间线蛋白启动子

<400> 15

taccccctgc cccccacagc tcctctcctg tgccttgttt cccagccatg cgttctcctc 60

tataaatacc cgctctggta tttggggttg gcagctgttg ctgccaggga gatggttggg 120

ttgacatgcg gctcctgaca aaacacaaac ccctggtgtg tgtgggcgtg ggtggtgtga 180

gtagggggat gaatcaggga gggggcgggg gacccagggg gcaggagcca cacaaagtct 240

gtgcgggggt gggagcgcac atagcaattg gaaactgaaa gcttatcaga ccctttctgg 300

aaatcagccc actgtttata aacttgaggc cccaccctcg acagtaccgg ggaggaagag 360

ggcctgcact agtccagagg gaaactgagg ctcagggcca gctcgcccat agacatacat 420

ggcaggcagg ctttggccag gatccctccg cctgccaggc gtctccctgc cctcccttcc 480

tgcctagaga cccccaccct caagcctggc tggtctttgc ctgagaccca aacctcttcg 540

acttcaagag aatatttagg aacaaggtgg tttagggcct ttcctgggaa caggccttga 600

ccctttaaga aatgacccaa agtctctcct tgaccaaaaa ggggaccctc aaactaaagg 660

gaagcctctc ttctgctgtc tcccctgacc ccactccccc ccaccccagg acgaggagat 720

aaccagggct gaaagaggcc cgcctggggg ctgcagacat gcttgctgcc tgccctggcg 780

aaggattggt aggcttgccc gtcacaggac ccccgctggc tgactcaggg gcgcaggcct 840

cttgcggggg agctggcctc cccgccccca cggccacggg ccgccctttc ctggcaggac 900

agcgggatct tgcagctgtc aggggagggg aggcgggggc tgatgtcagg agggatacaa 960

atagtgccga cggctggggg ccctgtctcc cctcgccgca tccactctcc ggccggccgc 1020

ctgcccgccg cctcctccgt gcgcccgcca gcctcgcccg 1060

<210> 16

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> Unc45b启动子

<400> 16

tttctcattc tagaaagtac cagtcaactc tccaccagcc cagctgttgg cagacgcaca 60

cctccatccc cctgccctca gacatttgcc actgatttct cagctgtcat cccctctcca 120

taaatagacc ctatcagaga aagtccattg cactaatata aggggtgacc acatttctac 180

aaaaccacaa ttaat 195

<210> 17

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 连接物

<400> 17

cgatgggcaa ctcatgcaat tattgtgagc aatacacacg cgcttccagc ggagtataaa 60

tgcctaaagt aataaaaccg agcaatccat ttacgaatgt t 101

<210> 18

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 连接物

<400> 18

cgatgggcaa ctcatgcaat tattgtgagc aatacacacg cgcttccagc ggagtataaa 60

tgcctaaagt aataaaaccg agcaatccat ttacgaatgt ttgctgggtt tctgttttaa 120

caacattttc tgcgccgcca caaattttgg ctgcatcgac agttttcttc tgcccaattc 180

cagaaacgaa gaaatgatgg gtgatggttt cctttggtgc tactgctgcc ggtttgtttt 240

gaacagtaaa cgtctgttga gcacatcctg taataagcag ggccagcgca gtagcgagta 300

<210> 19

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 连接物

<400> 19

cgatgggcaa ctcatgcaat tattgtgagc aatacacacg cgcttccagc ggagtataaa 60

tgcctaaagt aataaaaccg agcaatccat ttacgaatgt ttgctgggtt tctgttttaa 120

caacattttc tgcgccgcca caaattttgg ctgcatcgac agttttcttc tgcccaattc 180

cagaaacgaa gaaatgatgg gtgatggttt cctttggtgc tactgctgcc ggtttgtttt 240

gaacagtaaa cgtctgttga gcacatcctg taataagcag ggccagcgca gtagcgagta 300

gcattttttt catggtgtta ttcccgatgc tttttgaagt tcgcagaatc gtatgtgtag 360

aaaattaaac aaaccctaaa caatgagttg aaatttcata ttgttaatat ttattaatgt 420

atgtcaggtg cgatgaatcg tcattgtatt cccggattaa ctatgtccac agccctgacg 480

gggaacttct ctgcgggagt 500

<210> 20

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 连接物

<400> 20

cgatgggcaa ctcatgcaat tattgtgagc aatacacacg cgcttccagc ggagtataaa 60

tgcctaaagt aataaaaccg agcaatccat ttacgaatgt ttgctgggtt tctgttttaa 120

caacattttc tgcgccgcca caaattttgg ctgcatcgac agttttcttc tgcccaattc 180

cagaaacgaa gaaatgatgg gtgatggttt cctttggtgc tactgctgcc ggtttgtttt 240

gaacagtaaa cgtctgttga gcacatcctg taataagcag ggccagcgca gtagcgagta 300

gcattttttt catggtgtta ttcccgatgc tttttgaagt tcgcagaatc gtatgtgtag 360

aaaattaaac aaaccctaaa caatgagttg aaatttcata ttgttaatat ttattaatgt 420

atgtcaggtg cgatgaatcg tcattgtatt cccggattaa ctatgtccac agccctgacg 480

gggaacttct ctgcgggagt gtccgggaat aattaaaacg atgcacacag ggtttagcgc 540

gtacacgtat tgcattatgc caacgccccg gtgctgacac ggaagaaacc ggacgttatg 600

atttagcgtg gaaagatttg tgtagtgttc tgaatgctct cagtaaatag taatgaatta 660

tcaaaggtat agtaatatct tttatgttca tggatatttg taacccatcg gaaaactcct 720

gctttagcaa gattttccct gtattgctga aatgtgattt ctcttgattt caacctatca 780

taggacgttt ctataagatg cgtgtttctt gagaatttaa catttacaac ctttttaagt 840

ccttttatta acacggtgtt atcgttttct aacacgatgt gaatattatc tgtggctaga 900

tagtaaatat aatgtgagac gttgtgacgt tttagttcag aataaaacaa ttcacagtct 960

aaatcttttc gcacttgatc gaatatttct ttaaaaatgg 1000

<210> 21

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM1

<400> 21

cagccaatga aatacaaaga tgagtctagt taataatcta caattattgg ttaaagaagt 60

atattagtgc taatttccct ccgtttgtcc tagcttttct c 101

<210> 22

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM2

<400> 22

tgaatgacct tcagcctgtt cccgtccctg atatgggcaa acattgcaag cagcaaacag 60

caaacacata g 71

<210> 23

<211> 173

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM3

<400> 23

ggcgtattct taagaataga ttaaataatc ataaaaagat ctatacttaa aaattgaaaa 60

atgcttaaat attaaaattc ttctcataaa aaaatactaa tttaaaaatg agcctgaaat 120

gtttatctat ttattgcaca gggttgcata cataaaacga cacaccctct tgt 173

<210> 24

<211> 551

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM4

<400> 24

agtttggaac aagactatat accatatcct acaggaagaa taaaagtaaa ggaaaggtgc 60

catctctact gaatagagag tcctaacaaa aaggcttcaa aaggactctg catctttaat 120

aatataaaaa ggctaggaca caaacagcat catctaaaat gccattagaa atacttcaca 180

tacaaaaagg tctaagtaaa gcaggatttt ataaagtgat caaaaaagaa acactaaggg 240

ggaaaaatct tttaagatta aagaggtttt tcaaaggaca agttgaagtg gctgtaaaat 300

ttatgaggca gcattaaact tcagttctaa gtaacaataa attattcacc ataaaaacat 360

acatgtgtca aatattataa gcctcttaaa ctttttaaaa caatttcttg cagaactgat 420

tagatatatt aagtcaagat tagcagatac taactttttc attagcatac tatgatcact 480

cagagtaaag gaggaaattt agaaaagaaa taagacagaa ccatcaatag tcgattcacc 540

accaaatgtg a 551

<210> 25

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM5

<400> 25

tgcgggaatc agcctttgaa acgatggcca acagcagcta ataataaacc agtaatttgg 60

gatagacgag tagcaagagg gcattggttg gtgggtcacc ctccttctca gaacacatta 120

taaaaacctt ccgtttccac a 141

<210> 26

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM6

<400> 26

gcatgatttt aaggactggt tgtttatgag ccaatcagag gtgttgaata aacacctccc 60

tactaggtca aggtagaaag gggagggcaa atattggaaa aaaaaaacat gatgagaagt 120

ctataaaaat tgtgt 135

<210> 27

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM7

<400> 27

ctaaaatggg caaacattgc aagcagcaaa cagcaaacac acagccctcc ctgcctgctg 60

accttggagc tggggcagag gtcagagacc tctc 94

<210> 28

<211> 171

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM9

<400> 28

aggaggaact gctcaaaaca gacagaggct ctttgtttgc tttgcttctg tgtcaactgg 60

gcaacatttg gaaacaacaa atattggttc agaggcccac tgctttctta cccacctcct 120

gctggtcagc ttttccagct ttcctgcacg tacacacaag cgcagctatt t 171

<210> 29

<211> 170

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM10

<400> 29

cgatgctcta atctctctag acaaggttca tatttgtatg ggttacttat tctctctttg 60

ttgactaagt caataatcag aatcagcagg tttgcagtca gattggcagg gataagcagc 120

ctagctcagg agaagtgagt ataaaagccc caggctggga gcagccatca 170

<210> 30

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM11

<400> 30

tgccactcct agttcccatc ctatttaaat ctgcaagagg tttggttaat cattggcttt 60

gtcctgtgta gaca 74

<210> 31

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM12

<400> 31

ttccttcccc cttccaagac ccccctgaat cctatcaaaa gcacatcttc cattcattgc 60

ttcccggtgt cattatgaca agcggctaca aatcaatagc agagggaaag gcaggaccaa 120

cccgcactca ccaagtgata aagattcact ctcagccccg atttgctaat agcccataat 180

agcagccatt ggcgccccgc attaaataat acatttcact ccgcgtttat tatgggattt 240

ttaaaactcc tcaccaaatt ggattttctc gatggtctct aatttccaca tttatcattt 300

aaaattaaac tgctctgtgg aaagggggga tagagaagaa gaaggtagag agaggccaga 360

cagtactgta tttttccttt tgactccccc ctttatgaaa acccataaat aatatcaggt 420

atcacagcta taagcagcag g 441

<210> 32

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM13

<400> 32

ggagttgctg gtgcttcccc aggctggaga ttgagttaat attaacaggc ccaaggcgat 60

gtgggcttgt gcaatcatag gcccggcc 88

<210> 33

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM14

<400> 33

atcgccaggt cacctgagga gttaatgaat acatatctcc t 41

<210> 34

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> SA195增强子

<400> 34

actagttgag taagtgaaaa aataataatc tgtaaaaatg atgaatccca atgactcaca 60

tgttgcaaaa taactaggaa gcaaaaggga aattagactt taaagagcgt aatcagatgc 120

aagaaatgtt ggcttgtagg tggttaacta aaatcgctta cgggaagctc agacagctgg 180

ggaatcctga tttagtagac 200

<210> 35

<211> 523

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> MCK增强子 - spC5.12

<400> 35

cactacgggt ctaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg 60

gttataatta accccaacac ctgctgcccc ccccccccca acacctgctg cctgagcctg 120

agcggttacc ccaccccggt gcctgggtct taggctctgt acaccatgga ggagaagctc 180

gctctaaaaa taaccctgtc cctggtggca ccgcggtggc ggccgtccgc cctcggcacc 240

atcctcacga cacccaaata tggcgacggg tgaggaatgg tggggagtta tttttagagc 300

ggtgaggaag gtgggcaggc agcaggtgtt ggcgctctaa aaataactcc cgggagttat 360

ttttagagcg gaggaatggt ggacacccaa atatggcgac cggttcctca accggtcgcc 420

atatttgggt gtccgccctc ggccggggcc gcattcctgg gggccgggcg gtgctcccgc 480

ccgcctcgat aaaaggctcc ggggccggcg gcggcccacg agc 523

<210> 36

<211> 803

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM8x3 - CK6

<400> 36

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 60

ggctaagtcc acaagcttgg gggaggctgc tggtgaatat taaccaaggt caccccagtt 120

atcggaggag caaacagggg ctaagtccac gggggaggct gctggtgaat attaaccaag 180

gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg ggctaagtcc acactagtct acgggtctag 240

gctgcccatg taaggaggca aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta taattaaccc 300

caacacctgc tgcccccccc cccccaacac ctgctgcctg agcctgagcg gttaccccac 360

cccggtgcct gggtcttagg ctctgtacac catggaggag aagctcgctc taaaaataac 420

cctgtccctg gtgggcccaa tcaaggctgt gggggactga gggcaggctg taacaggctt 480

gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca tgttcccggc 540

gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac cagtgagcaa 600

gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca cgcctgggtc 660

cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca ggggcccctc 720

cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat aacccagggg 780

cacaggggct gcccccgggt cac 803

<210> 37

<211> 563

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM8x3 - CK8

<400> 37

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 60

ggctaagtcc acaagcttgg gggaggctgc tggtgaatat taaccaaggt caccccagtt 120

atcggaggag caaacagggg ctaagtccac gggggaggct gctggtgaat attaaccaag 180

gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg ggctaagtcc acactagtct acaaacgcta 240

gcatgctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg gttataatta 300

acccagacat gtggctgccc cccccccccc aacacctgct gcctctaaaa ataaccctgc 360

atgccatgtt cccggcgaag ggccagctgt cccccgccag ctagactcag cacttagttt 420

aggaaccagt gagcaagtca gcccttgggg cagcccatac aaggccatgg ggctgggcaa 480

gctgcacgcc tgggtccggg gtgggcacgg tgcccgggca acgagctgaa agctcatctg 540

ctctcagggg cccctccctg ggg 563

<210> 38

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM8x3 - Acta1

<400> 38

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 60

ggctaagtcc acaagcttgg gggaggctgc tggtgaatat taaccaaggt caccccagtt 120

atcggaggag caaacagggg ctaagtccac gggggaggct gctggtgaat attaaccaag 180

gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg ggctaagtcc acactagtaa aggcatagcc 240

ccatatatca gtgatataaa tagaacctgc agcaggctct ggtaaatgat gactacaagg 300

tggactggga ggcagcccgg ccttggcagg catcgaccgg gccaacccgc tccttctttg 360

gtcaacgcag gggacccggg cgggggccca ggccgcgaac cggccgaggg agggggctct 420

agtgcccaac acccaaatat ggctcgagaa gggcagcgac attcctgcgg ggtggcgcgg 480

agggaatgcc cgcgggctat ataaaacctg agcagaggga caagcggcca ccgcagcgga 540

cagcgccaag tg 552

<210> 39

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HS-CRM11 - spC5-12

<400> 39

tgccactcct agttcccatc ctatttaaat ctgcaagagg tttggttaat cattggcttt 60

gtcctgtgta gacaactagt ctagtcaccg cggtggcggc cgtccgccct cggcaccatc 120

ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt ttagagcggt 180

gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg gagttatttt 240

tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgaccgg ttcctcaacc ggtcgccata 300

tttgggtgtc cgccctcggc cggggccgca ttcctggggg ccgggcggtg ctcccgcccg 360

cctcgataaa aggctccggg gccggcggcg gcccacgagc 400

Claims

1.一种核酸分子，其包含可操作连接到肌肉选择性启动子的一个或多个肝选择性增强子，其中：

-所述肝选择性增强子包含选自下述的序列或由所述序列构成：SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQID NO：33，与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的所述序列中的任一者具有80％同一性的功能性变体，及其功能性片段；或

-所述多个肝选择性增强子包括至少一个包含选自下述的序列或由所述序列构成的肝选择性增强子：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33，与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：21、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的所述序列中的任一者具有80％同一性的功能性变体，及其功能性片段。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述多个肝选择性增强子中的所有肝选择性增强子具有相同的序列。

3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述多个肝选择性增强子中的至少两个肝选择性增强子具有不同的序列。

4.根据权利要求1至3中的任一项所述的核酸分子，其中所述多个肝选择性增强子包括至少两个肝选择性增强子。

5.根据权利要求1至4中的任一项所述的核酸分子，其中所述多个肝选择性增强子包括三个肝选择性增强子。

6.根据权利要求1至5中的任一项所述的核酸分子，其中所述肝选择性增强子的序列由SEQ ID NO：1构成，或者是具有与SEQ ID NO：1的同一性为至少80％的序列的功能性变体。

7.根据权利要求1至5中的任一项所述的核酸分子，其中所述肝选择性增强子的序列由SEQ ID NO：30构成，或者是具有与SEQ ID NO：30的同一性为至少80％的序列的功能性变体。

8.根据权利要求1至7中的任一项所述的核酸分子，其中所述启动子是spC5-12启动子，特别地其中所述spC5-12启动子由SEQ ID NO：2、3或4中示出的序列构成，或者由具有与SEQID NO：2、3或4的同一性为至少80％的序列的功能性变体构成。

9.根据权利要求1至7中的任一项所述的核酸分子，其中所述启动子是CK6启动子，特别地其中所述CK6启动子由SEQ ID NO：6中示出的序列构成，或者由具有与SEQ ID NO：6的同一性为至少80％的序列的功能性变体构成。

10.根据权利要求1至7中的任一项所述的核酸分子，其中所述启动子是CK8启动子，特别地其中所述CK8启动子由SEQ ID NO：7中示出的序列构成，或者由具有与SEQ ID NO：7的同一性为至少80％的序列的功能性变体构成。

11.根据权利要求1至7中的任一项所述的核酸分子，其中所述启动子是ACTA1启动子，特别地其中所述ACTA1启动子由SEQ ID NO：8中示出的序列构成，或者由具有与SEQ ID NO：8的同一性为至少80％的序列的功能性变体构成。

12.根据权利要求1至11中的任一项所述的核酸分子，其还包含位于所述肝选择性增强子或所述多个肝选择性增强子与所述肌肉选择性启动子之间的肌肉选择性增强子。

13.一种表达盒，其包含可操作连接到感兴趣的转入基因的根据权利要求1至11中的任一项所述的核酸分子。

14.一种载体，其包含根据权利要求13所述的表达盒，特别地其中所述载体是质粒或病毒载体。

15.根据权利要求14所述的载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。

16.一种分离的重组细胞，其包含根据权利要求13所述的表达盒。

17.根据权利要求13所述的表达盒、根据权利要求14或15所述的载体或根据权利要求16所述的细胞，所述表达盒、载体或细胞用作药物。

18.根据权利要求13所述的表达盒、根据权利要求14或15所述的载体或根据权利要求16所述的细胞，所述表达盒、载体或细胞用于治疗神经肌肉障碍。

19.根据权利要求18所述供使用的根据权利要求13所述的表达盒、根据权利要求14或15所述的载体或根据权利要求16所述的细胞，其中所述神经肌肉障碍选自肌营养不良症(例如肌强直性营养不良(Steinert病)、杜氏肌营养不良、贝克型肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良、Emery-Dreifuss肌营养不良)、运动神经元疾病(例如肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、脊髓性肌肉萎缩症(婴儿型进行性脊髓性肌肉萎缩症(1型，Werdnig-Hoffmann病)、中间型脊髓性肌肉萎缩症(2型)、青少年型脊髓性肌肉萎缩症(3型，Kugelberg-Welander病)、成人型脊髓性肌肉萎缩症(4型))、脊髓延髓肌肉萎缩症(肯尼迪病))、炎性肌病(例如多发性肌炎皮肌炎、包涵体肌炎)、神经肌肉接头疾病(例如重症肌无力、Lambert-Eaton(肌无力)综合征、先天性肌无力综合征)、周围神经疾病(例如Charcot-Marie-Tooth病、弗里德希氏共济失调、Dejerine-Sottas病)、肌肉代谢疾病(例如磷酸化酶缺乏症(麦卡德尔氏病)、酸性麦芽糖酶缺乏症(庞贝氏病)、磷酸果糖激酶缺乏症(Tarui病)、去分支酶缺乏症(科里病或Forbes病)、线粒体肌病、肉碱缺乏症、肉碱棕榈酰基转移酶缺乏症、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症、乳酸脱氢酶缺乏症、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症)、内分泌异常引起的肌病(例如甲状腺亢进肌病、甲状腺功能减退性肌病)和其他肌病(例如先天性肌强直、先天性副肌强直、中央轴突症、线状体肌病、肌管性肌病、周期性瘫痪)。