CN111902539A - 杂合调控元件 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及驱动基因表达的杂合转录调控元件，特别是杂合启动子，所述杂合转录调控元件通过具有不同组织选择性的至少两个转录调控元件例如以组织选择性方式在不同组织中驱动表达的两个启动子的融合来设计。
Description
技术领域
本发明涉及驱动基因表达的杂合转录调控元件，特别是杂合启动子，所述杂合转录调控元件通过具有不同组织选择性的至少两个转录调控元件、例如以组织选择性方式在不同组织中驱动表达的两个启动子的融合来设计。
背景技术
基因疗法具有提供遗传疾病的持续治疗性校正的潜力，目前已在许多临床试验中进行试验。然而，对于许多疾病来说，在所需靶组织中转入基因的表达不足和抗转入基因免疫仍然是获得成功的基因疗法的重要障碍。这对于由遍在表达或在身体的多个组织(例如肝、肌肉和中枢神经系统(CNS))中表达的基因的突变引起的疾病的治疗来说尤其重要。这些疾病的实例包括：i.溶酶体贮积病[(LSD)，例如庞贝氏病(PD)、I型至VII型黏多糖贮积症(MPSI-VII)、Sandhoff和Tay-Sachs病]；ii.代谢疾病[例如枫糖尿病(MSUD)、甲基丙二酸血症(MMA)、I型和III型糖原贮积病(GSDI、III)、尼曼-皮克病(NPC)、卡纳万病、苯丙酮尿症(PKU)]；和iii.神经肌肉疾病[例如脊髓性肌肉萎缩症(SMA)和弗里德希氏共济失调(FA)]。到目前为止，使用在不同组织中驱动表达的遍在启动子是将转入基因表达靶向到包括内脏器官、肌肉和CNS的多个受影响组织的唯一选择。遍在启动子远不是用于体内AAV基因疗法的理想工具，因为据报道它们由于具有强烈的反式激活活性而在动物模型中促进肝脏基因毒性，这可以导致肿瘤形成(Chandler等，JCI 2015；125(2):870–880)，并且与异位非生理性基因表达相关。最近，在临床前研究中，在通过高剂量的含有遍在鸡β肌动蛋白启动子的AAV载体的系统性递送治疗的非人类灵长类动物和仔猪中报道了严重毒性(Hinderer等，Hum Gene Ther.2018Feb 12.)。
此外，许多疾病由引起蛋白质产物的巨大改变或完全不存在(无效突变)的遗传突变引起。通过基因疗法治疗这些疾病会导致野生型蛋白质的重新表达，这具有引发有害免疫应答的高风险，可能会阻止治疗功效并甚至介导表达转入基因的细胞的破坏。这对于具有高免疫原性的治疗性蛋白质产物来说尤其重要，所述蛋白质产物例如：凝血因子VIII[FVIII，引起血友病A(HA)]，溶酶体酶α-L-艾杜糖醛酸酶[IDUA(α酶-L艾杜糖醛酸酶)，引起MPSI]和酸性-α-葡萄糖苷酶[(GAA)，引起庞贝氏病]和肌肉蛋白质[肌营养不良蛋白，引起杜氏肌营养不良(DMD)，和α-肌聚糖(SGCA)，引起肢带型肌营养不良2D(LGMD2D)]等。
庞贝氏病是由溶酶体酶酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)中的突变造成的一种严重的神经肌肉障碍，所述突变引起糖原在所有组织中的病理性积累。庞贝氏病被分类为两种形式：在出生的第一年中发病的婴儿期发作型庞贝氏病(IOPD)和晚些时候在儿童期、青春期或成年期出现的迟发型庞贝氏病(LOPD)[Kishnani等，Am J Med Genet C Semin MedGenet.2012]。对于IOPD来说，在生命的第一个月中的治疗性干预是重要的医疗需要。如果不治疗，IOPD在生命的第一年中导致死亡，而迟到/无效的治疗将不能逆转晚期病征[Chien等，Pediatr Neonatol.2013Aug；54(4):219-27]。使用重组人类GAA(rhGAA)的酶替代疗法(ERT)可用于PD。尽管是用于IOPD对象的挽救生命的治疗方法，但ERT在难以摄入rhGAA的CNS和肌肉群中的疗效有限。此外，ERT受阻于针对治疗性产品(rhGAA)诱导的免疫应答，所述免疫应答阻止了治疗效果。与ERT相似，在庞贝氏病的临床试验中(Corti等，Hum GeneTher Clin Dev.2017Dec；28(4):208-218)和在所述疾病的小鼠模型中的临床前研究中，AAV基因疗法面临同样的限制。具体来说：1.在使用遍在或肌肉选择性启动子将基因转移到肌肉后，观察到对GAA的强烈免疫应答；2.获得了GAA蛋白向受影响的组织例如全身肌肉和神经系统的受限的生物分布。所述GAA蛋白事实上被细胞天然分泌的能力很差，并且不能穿过血脑屏障(循环GAA蛋白的大小～110Kda)。
因此，对提供治疗性转入基因在身体的多个组织中的持续和广泛表达，仍存在着需求。另外，对提供转入基因在不同靶组织中的持续和广泛表达，并结合对治疗性蛋白质的免疫耐受的诱导以获得安全有效的基因疗法，仍存在着需求。
发明内容
本发明提供了实施由本发明人为了在需要的对象中表达感兴趣的转入基因而设计的新的多组织选择性转录调控元件的遗传工程策略。
具体来说，本发明涉及一种核酸序列，其组合了融合在一起的具有不同组织选择性表达情况的至少两个不同的转录调控元件。取决于具体的需要，例如取决于特定疾病的需要，这种核酸序列可以提供所述感兴趣的转入基因在最少两种组织中或多种组织中的表达。当必需获得被免疫系统的免疫耐受时，所述被靶向的组织之一可能是耐受原性组织(例如肝)。这种多组织选择性遗传工程策略与聚焦于所述转入基因在仅仅一个组织中的表达的经典策略相比，导致基因表达效率提高。因此，本发明在基因疗法的情形中是特别有利的。在本发明中，多个组织选择性转录调控元件(例如多个组织选择性启动子)的组合具有以选择性方式在所需组织中驱动高转入基因表达的优点。
此外，与遍在启动子不同，本发明防止了在生理情况下不表达所述感兴趣的转入基因或不需要所述感兴趣的转入基因的表达的组织中异位的转入基因表达。本文公开的转录调控元件的组合还克服了对由遍在启动子引发的基因毒性的担忧(Chandler等，同上)，并且也可以防止最近在临床前研究中在非人类灵长动物中报道的可能的毒性(Hinderer等，同上)。
本发明的第一方面涉及一种核酸序列，其包含：
(i)能够在第一组织中驱动或增强组织选择性表达的第一转录调控元件；和
(ii)能够在第二组织中驱动或增强组织选择性表达的第二转录调控元件；
其中所述第一转录调控元件和第二转录调控元件被融合在一起；并且
其中所述第一转录调控元件和第二转录调控元件中的至少一者是组织选择性启动子。
在特定实施方式中，所述第一转录调控元件是能够在第一组织中驱动组织选择性表达的组织选择性启动子。在其他实施方式中，所述第二转录调控元件也是组织选择性启动子。
在特定实施方式中，一个转录调控元件选自肝选择性启动子、肌肉选择性启动子和神经元选择性启动子，特别是肝选择性启动子。在特定实施方式中，当所述转录调控元件是肝选择性启动子时，所述转录调控元件优选地选自α-1抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、ApoE增强子与hAAT启动子的组合、甲状腺素转运蛋白启动子、白蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子和LSP启动子。在另一个实施方式中，当所述转录调控元件是肌肉选择性启动子时，所述转录调控元件优选地选自spC5.12启动子、MHCK7启动子、E-syn启动子、肌肉肌酸激酶肌球蛋白轻链(MLC)启动子、肌球蛋白重链(MHC)启动子、结蛋白启动子、心肌肌钙蛋白C启动子、肌钙蛋白I启动子、myoD基因家族启动子、α肌动蛋白启动子、β肌动蛋白启动子、γ肌动蛋白启动子、位于眼型Pitx3的内含子1内的肌肉选择性启动子和CK6启动子。在另一个实施方式中，当所述转录调控元件是肌肉选择性启动子时，所述转录调控元件优选地选自spC5.12启动子、MHCK7启动子、E-syn启动子、肌肉肌酸激酶肌球蛋白轻链(MLC)启动子、肌球蛋白重链(MHC)启动子、心肌肌钙蛋白C启动子、肌钙蛋白I启动子、myoD基因家族启动子、α肌动蛋白启动子、β肌动蛋白启动子、γ肌动蛋白启动子、位于眼型Pitx3的内含子1内的肌肉选择性启动子和CK6启动子。在又一个特定实施方式中，当所述转录调控元件是神经元选择性启动子时，所述转录调控元件优选地选自突触蛋白-1(Syn)启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子、神经丝轻链基因启动子、神经元特异性vgf基因启动子、突触蛋白-2启动子、酪氨酸羟化酶启动子、多巴胺β-羟化酶启动子、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶启动子、低亲和性NGF受体启动子、胆碱乙酰基转移酶启动子、降钙素基因相关肽(CGRP)启动子、Hb9启动子、GFAP启动子、钙结合蛋白2启动子、Mnx1启动子、巢蛋白启动子、小清蛋白启动子、生长抑素启动子和Plp1启动子。
此外，在另一个实施方式中，所述肌肉选择性启动子选自spC5.12、结蛋白和肌肉肌酸激酶(MCK)启动子，特别是选自spC5.12和肌肉肌酸激酶(MCK)启动子；和/或所述神经元选择性启动子是Syn启动子。
在又一个实施方式中，所述核酸序列是：
(i)ApoE增强子与hAAT启动子的组合，并且(ii)是spC5.12启动子；或
(i)ApoE增强子与hAAT启动子的组合，并且(ii)是Syn启动子；或
(i)是ApoE增强子，并且(ii)是spC5.12启动子。
根据另一方面，本发明涉及一种表达盒，所述表达盒包含本文中公开的核酸序列和感兴趣的转入基因。所述感兴趣的转入基因更具体来说可以是感兴趣的治疗性转入基因。在特定实施方式中，所述感兴趣的治疗性转入基因是酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)。
另一方面，本发明涉及一种载体，所述载体包含本文中公开的表达盒。具体来说，所述载体可以是病毒载体。代表性的病毒载体包括但不限于腺病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体和AAV载体。在特定实施方式中，所述病毒载体是AAV载体，例如包含AAV8或AAV9衣壳的AAV载体。
本发明还涉及一种分离的细胞，其用本文中公开的核酸序列、表达盒或载体进行转化。
此外，本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明所述的表达盒、载体或细胞。就此而言，在所述表达盒、载体或细胞中包含的感兴趣的转入基因是治疗性转入基因。
此外，本发明还涉及本文中公开的表达盒、载体或细胞，其用作药物。在这方面，在所述表达盒、载体或细胞中包含的感兴趣的转入基因是治疗性转入基因。
另一方面，本发明涉及本文中公开的表达盒、载体或细胞，其用于通过治疗性转入基因在感兴趣的治疗组织中的表达，通过基因疗法来治疗障碍(disorder)的方法中。本发明可用于治疗大量障碍。在特定实施方式中，所述障碍选自：
溶酶体贮积病(LSD)，例如I型至VII型黏多糖贮积症(MPSI-VII)、Sandhoff病和Tay-Sachs；
代谢疾病，例如枫糖尿病(MSUD)、甲基丙二酸血症(MMA)、I型和III型糖原贮积病(GSDI和III)、尼曼-皮克病(NPC)、卡纳万病、苯丙酮尿症(PKU)；
神经肌肉障碍，例如肌营养不良症(例如肌强直性营养不良(Steinert病)、杜氏肌营养不良、贝氏型肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良、埃-德二氏肌营养不良)、运动神经元病(例如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌肉萎缩症(婴儿型进行性脊髓性肌肉萎缩症(1型，Werdnig-Hoffmann病)、中间型脊髓性肌肉萎缩症(2型)、幼年型脊髓性肌肉萎缩症(3型，Kugelberg-Welander病)、成年型脊髓性肌肉萎缩症(4型))、脊髓-延髓性肌肉萎缩症(肯尼迪病))、炎性肌病(例如多发性肌炎皮肌炎、包涵体肌炎)、肌肉神经接点的疾病(例如重症肌无力、Lambert-Eaton(肌无力)综合征、先天性肌无力综合征)、外周神经的疾病(例如腓骨肌萎缩症、弗立特里希氏共济失调、Dejerine-Sottas病)、肌肉的代谢疾病(例如磷酸化酶缺乏症(McArdle病)、酸性麦芽糖酶缺乏症(庞贝氏病)、磷酸果糖激酶缺乏症(Tarui病)、脱支酶缺乏症(Cori或Forbes病)、线粒体肌病、肉毒碱缺乏症、肉毒碱棕榈酰转移酶缺乏症、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症、乳酸脱氢酶缺乏症、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症)、由内分泌异常造成的肌病(例如甲亢性肌病、甲低性肌病)和其他肌病(例如先天性肌强直、先天性副肌强直、中央轴空病、线状体肌病、肌小管性肌病、周期性麻痹)；和
其他肌病，例如血友病A、MPSI、阿兹海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、图雷特综合症、精神分裂症、Sly病、亨特氏病、痴呆症、偏执狂、强迫症、学习障碍、ALS、腓骨肌萎缩症、肯尼迪病、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、孤独症、高雪氏病、赫尔勒氏病、克腊伯氏病和行为改变(例如睡眠、知觉或认知的障碍)。
更具体来说，所述障碍可以选自：
溶酶体贮积病(LSD)，例如I型至VII型黏多糖贮积症(MPSI-VII)、Sandhoff病和Tay-Sachs；
代谢疾病，例如枫糖尿病(MSUD)、甲基丙二酸血症(MMA)、I型和III型糖原贮积病(GSDI和III)、尼曼-皮克病(NPC)、卡纳万病、苯丙酮尿症(PKU)；
神经肌肉障碍，例如肌营养不良症(例如肌强直性营养不良(Steinert病)、杜氏肌营养不良、贝氏型肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良、埃-德二氏肌营养不良)、运动神经元病(例如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌肉萎缩症(婴儿型进行性脊髓性肌肉萎缩症(1型，Werdnig-Hoffmann病)、中间型脊髓性肌肉萎缩症(2型)、幼年型脊髓性肌肉萎缩症(3型，Kugelberg-Welander病)、成年型脊髓性肌肉萎缩症(4型))、脊髓-延髓性肌肉萎缩症(肯尼迪病))、炎性肌病(例如多发性肌炎皮肌炎、包涵体肌炎)、肌肉神经接点的疾病(例如重症肌无力、Lambert-Eaton(肌无力)综合征、先天性肌无力综合征)、外周神经的疾病(例如腓骨肌萎缩症、弗立特里希氏共济失调、Dejerine-Sottas病)。
在另一个特定实施方式中，所述障碍是糖原贮积病，特别是庞贝氏病，更特别是婴儿期发作型庞贝氏病或迟发型庞贝氏病，甚至更特别是婴儿期发作型庞贝氏病。
附图说明
图1.使用的表达盒的示意图
A：由巨细胞病毒(CMV)增强子和鸡β-肌动蛋白启动子(CBA)启动子构成的遍在启动子(CAG)和基础单一组织启动子。B(本发明)：杂合多组织选择性启动子。ITR：用于AAV包装的反向末端重复序列(inverted terminal repeats)；ApoE：载脂蛋白增强子；hAAT：人类α-1抗胰蛋白酶启动子；spC5.12：合成启动子C5.12；hSYN：人类突触蛋白启动子；内含子：HBB2 2.1(改良的合成人类β-珠蛋白来源的(HBB22.1)或SV40内含子；hGAA：后面跟有牛生长激素多腺苷化信号的人类酸性α-葡萄糖苷酶编码序列。
图2.杂合肝-肌肉启动子Enh.C5.12和LiMP在细胞系中的活性
在用质粒瞬时转染人类肝细胞细胞系HuH7(图2A)和成肌细胞细胞系C2(图2B)后72小时GAA表达的分析，所述质粒编码在肌肉选择性(C5.12)、肝细胞选择性(hAAT)或我们新产生的杂合肝-肌肉启动子(Enh.C5.12和LiMP)控制之下的高度可分泌的hGAA转入基因(sp7-Δ8-co，缩写为sec-hGAA，表1)。编码增强型绿色荧光蛋白的质粒(Ctrl)被用作阴性对照，并与作为转染的阳性对照的表达GAA的质粒共同转染。图A-B.左图：在72H时细胞培养基中的GAA活性(n＝4个独立实验)；右图：使用抗GAA抗体通过Western印迹分析评估的细胞裂解物中的GAA蛋白表达(n＝2个独立实验)。抗eGFP和抗微管蛋白抗体分别被用作转染对照和载样对照。描绘了GAA条带定量。统计分析通过单向ANOVA和Tukey事后检验来进行。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，#p<0.05，##p<0.01。
图3.杂合肝-神经元启动子LiNeuP在细胞系中的活性。
在用质粒瞬时转染人类肝细胞细胞系HuH7(图3A)或神经元细胞系NSC34(图3B)后72小时GAA表达的分析，所述质粒编码在神经元选择性人类突触蛋白启动子(hSYN)、肝细胞选择性(hAAT)或我们新产生的杂合肝-神经元启动子(LiNeuP)控制之下的高度可分泌的hGAA转入基因(sp7-Δ8-co，缩写为sec-hGAA，表1)。编码增强型绿色荧光蛋白的质粒(Ctrl)被用作阴性对照，并与作为转染的阳性对照的表达GAA的质粒共同转染。图A-B.左图：在72H时细胞培养基中的GAA活性(n＝2个独立实验)；右图：使用抗GAA抗体通过Western印迹分析评估的细胞裂解物中的GAA蛋白表达(n＝2个独立实验)。抗eGFP和抗微管蛋白抗体分别被用作转染对照和载样对照。描绘了GAA条带定量。统计分析通过单向ANOVA和Tukey事后检验来进行。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图4A.野生型C57BL/6小鼠中的循环GAA蛋白。
静脉内注射AAV9载体后4周GAA表达的分析，所述AAV9载体带有在遍在(CAG)、肝选择性(hAAT)和肌肉选择性(C5.12)启动子或我们新产生的肝-肌肉(Enh.C5.12，LiMP)和肝-神经元(LiNeuP)启动子控制之下的全长的密码子优化的GAA转入基因(缩写为hGAA)(AAV剂量：2x1012 vg/kg；小鼠n＝4/组)。上图：小鼠血浆的使用抗GAA抗体的代表性Western印迹；下图：GAA条带的定量。将所述GAA条带强度针对在血浆中检测到的并用作载样对照的非特异性条带的强度进行归一化。作为重组人类GAA蛋白的rhGAA(商品名Myozyme)被用作阳性对照；分子量标志物(kDa在左侧上)；未治疗的：来自于用作阴性对照的未注射的C57BL/6小鼠的血浆。统计分析通过单向ANOVA和Tukey事后检验来进行。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图4B.野生型C57BL/6小鼠中的人类GAA的RNA表达。
静脉内注射AAV9载体后5周GAA表达的分析，所述AAV9载体带有在遍在(CAG)、肝选择性(hAAT)和肌肉选择性(C5.12)启动子或我们新产生的肝-肌肉(Enh.C5.12，LiMP)和肝-神经元(LiNeuP)启动子控制之下的全长的密码子优化的GAA转入基因(缩写为hGAA)(AAV剂量：2x1012 vg/kg)。评估了在肝、心脏、四头肌、脊髓和脑中的人类GAA RNA表达，并将其针对内源小鼠肌动蛋白基因的表达进行归一化。描绘了表达的相对变化倍数。未治疗的：用作阴性对照的未注射的C57BL/6小鼠。为可以在其中进行RNA和DNA提取的组织描绘了归一化到每μg DNA的载体基因组拷贝数(VGCN)。统计分析：对于RNA表达来说单向ANOVA和Tukey事后检验，或对于VGCN来说双向ANOVA(启动子和组织)和Tukey事后检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图5.当使用在肌肉或肝-肌肉中有活性的启动子时成年Gaa-/-小鼠中针对GAA的体液免疫应答。
在Gaa-/-小鼠中，在静脉内注射编码本源(hGAA)的AAV8载体后抗GAA抗体的分析(免疫球蛋白G：IgG；图5A)，以及在静脉内注射编码在肌肉选择性(C5.12)或我们新产生的肝-肌肉启动子Enh.C5.12和LiMP控制之下的本源(hGAA)或高度可分泌的GAA(sec-hGAA)的AAV8载体后循环GAA酶活性的分析(图5B)(AAV8剂量：2x1012 vg/kg)。A.抗GAA IgG在静脉内注射AAV8载体后1至3个月测量。对5只小鼠/组进行治疗，在条上方的数字指示在每个时间点时活小鼠的数目，在条下方的数字指示注射后的月数。统计分析：双向ANOVA和Tukey事后检验。B.在静脉内注射编码本源GAA(hGAA)或高度可分泌的GAA(sec-hGAA)的AAV8载体后三个月循环GAA酶活性的分析。统计分析：单向ANOVA和Tukey事后检验。对照：来自于未治疗的Gaa-/-同窝仔畜小鼠的血浆。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图6：在重组hGAA注射后，在使用双重启动子进行hGAA的AAV基因转移后Gaa-/-小鼠中的抗hGAA体液免疫应答。
(A)实验设计：通过重组人类GAA蛋白(rhGAA)的静脉内注射对2月龄Gaa-/-小鼠进行免疫。6周后，将所述免疫的Gaa-/-小鼠通过静脉内注射带有双重肝-肌肉LiMP启动子或肝细胞特异性hAAT启动子的AAV9-hGAA载体(剂量：2x1012 vg/kg)进行治疗；使用编码萤光素酶的AAV9载体作为对照(AAV-Ctrl，剂量：2x1012 vg/kg)。如指示的测量抗hGAA IgG(W：周)。(B)在5.5和12周(参见图C)时Gaa-/-小鼠中抗hGAA IgG的分析。数据被描述为平均值±SD；AAV-hGAA n＝3只小鼠/组群；AAV-Ctrl n＝2只小鼠/组群。统计分析：双向ANOVA(AAV，周)和Sidak事后检验。*p<0.05，**p<0.01，##p<0.01。
图7.当使用在肝中活性非常高的杂合启动子(LIMP和LiNeuP)时成年Gaa-/-小鼠中的循环GAA蛋白和抗GAA的IgG。
在静脉内注射编码在遍在(CAG)启动子、肝选择性(hAAT)启动子和我们新产生的肝-肌肉(LiMP)和肝-神经元(LiNeuP)启动子控制之下的高度可分泌的GAA蛋白(sec-hGAA)的AAV9载体(AAV剂量：5x1011 vg/kg)后4周，循环GAA蛋白的分析。上图：小鼠血浆使用抗GAA抗体的Western印迹；在相同时间点在小鼠血浆中测量到的针对GAA的体液应答(IgG)被描绘在每个相应的道下方。rhGAA：用作阳性对照的重组人类GAA；分子量标志物(kDa在左侧)；neg：来自于用作阴性对照的未注射的Gaa-/-小鼠的小鼠血浆。每个组的小鼠数目描绘在条中。下图：GAA蛋白条带的定量。GAA条带强度针对在血浆中检测到的并用作载样对照的非特异性条带的强度进行归一化。统计分析：单向ANOVA和Tukey事后检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图8.当使用在肝中有活性的杂合启动子(LIMP和LiNeuP)时成年Gaa-/-小鼠中肌肉强度和呼吸功能的挽救。
在Gaa-/-小鼠中，在静脉内注射编码在我们新产生的肝-肌肉(LiMP)和肝-神经元(LiNeuP)启动子控制之下的高度可分泌的GAA(sec-hGAA)的AAV9载体(AAV9剂量：2x1012vg/kg)后，血浆GAA酶活性(A)、肌肉强度(B)和呼吸功能(C、D)的分析。(A)在静脉内注射AAV9载体后2个月循环GAA酶活性的分析。在静脉内注射AAV9载体后3个月通过4程握力测试进行的肌肉强度的分析(B)和通过全身体积描记术进行的呼吸功能的分析(C、D)。Te：呼气时间；EF50：(呼气中期流量)；Ctrl：用作对照治疗组的未治疗的Gaa-/-小鼠。Gaa+/+：野生型得未受影响的同窝仔畜小鼠。统计分析：A.单向ANOVA和Tukey事后检验；针对Ctrl的单向ANOVA和Dunnet’s事后检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图9.新生Gaa-/-小鼠中杂合肝-肌肉启动子LiMP的活性。
在静脉内注射编码在肌肉选择性(C5.12)、肝选择性(hAAT)或我们新产生的在肌肉和肝两者中具有提高的活性的杂合肝-肌肉启动子LiMP控制之下的高度可分泌的GAA蛋白(sec-hGAA)的AAV8载体(参见图2和4B，AAV剂量：3x1013 vg/kg)后3个月，GAA蛋白的分析。A-B：在治疗后3个月用抗GAA抗体进行的小鼠血浆的代表性Western印迹分析；rhGAA：用作阴性对照的重组人类GAA；Untr：来自于用作阴性对照的未治疗的Gaa-/-小鼠的血浆；分子量标志物(kDa)被描绘在左侧。在图B中示出了GAA条带的定量。统计分析：单向ANOVA和Tukey事后检验。C-F：在静脉内注射AAV8载体后3个月心肌、膈肌、三头肌和四头肌中GAA活性的分析。Ctrl：未治疗的Gaa-/-小鼠。统计分析：单向ANOVA和Tukey事后检验。Gaa+/+：野生型未受影响的同窝仔畜小鼠；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图10.在作为新生儿治疗的Gaa-/-小鼠中，在使用杂合肝-肌肉启动子LiMP的AAV基因疗法后肌肉和CNS中的GAA蛋白量的分析。
在新生Gaa-/-小鼠中，在静脉内注射编码在肌肉选择性(C5.12)、肝选择性(hAAT)或我们新产生的杂合肝-肌肉启动子LiMP控制之下的高度可分泌的GAA蛋白(sec-hGAA)的AAV8载体(AAV剂量：3x1013 vg/kg)后3个月，三头肌、脊髓和脑中GAA蛋白的分析。A-C：在治疗后3个月用抗GAA抗体进行的小鼠组织的Western印迹分析。抗微管蛋白抗体被用作载样对照；rhGAA：用作阳性对照的重组人类GAA；Untr：来自于用作阴性对照的未治疗的Gaa-/-小鼠的组织；分子量标志物(kDa)被描绘在左侧。示出了GAA条带的定量。将GAA条带强度针对用作载样对照的微管蛋白条带的强度进行归一化。D.在Gaa-/-小鼠的肝中通过RT-qPCR进行的sec-hGAA转入基因RNA的相对表达(变化倍数)。描绘了转入基因表达的变化倍数与hAAT的比较。E.在AAV治疗的Gaa-/-小鼠的腓肠肌中通过RT-qPCR进行的sec-hGAA转入基因RNA的相对表达(-ΔΔCt)。描绘了相对转入基因表达(-ΔΔCt)与C5.12的比较。A-E.统计分析：单向ANOVA和Tukey事后检验。Gaa+/+：野生型的未受影响的同窝仔畜小鼠；Untr：未治疗的Gaa-/-小鼠。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图11.在作为新生儿治疗的Gaa-/-小鼠中使用AAV-LiMP-sec-hGAA保护肌肉强度。
在Gaa+/+野生型未受影响的同窝仔畜小鼠和Gaa-/-小鼠中，在静脉内注射编码在肌肉选择性(C5.12)、肝选择性(hAAT)或我们新产生的在肌肉和肝两者中具有提高的活性的肝-肌肉启动子LiMP控制之下的高度可分泌的GAA蛋白(sec-hGAA)的AAV8载体(参见图2和4B，AAV剂量：3x1013 vg/kg)后3个月，通过握力测试进行的肌肉强度的分析。Gaa+/+：野生型未受影响的同窝仔畜小鼠；Ctrl：未治疗的Gaa-/-小鼠。统计分析：单向ANOVA和Tukey事后检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图12.在向新生Gaa-/-小鼠递送AAV-LiMP-sec-hGAA后缺少Rtl1 RNA的上调。
在静脉内注射编码在肌肉选择性(C5.12，n＝3小鼠)、肝选择性(hAAT，n＝4小鼠)或我们新产生的肝-肌肉启动子LiMP(n＝3小鼠)控制之下的高度可分泌的GAA蛋白(sec-hGAA)的AAV8载体后3个月，Gaa-/-小鼠中Rtl1 RNA表达的分析。AAV剂量：3x1013 vg/kg。Ctrl：未治疗的Gaa-/-小鼠(n＝4)。统计分析：单向ANOVA和Tukey事后检验，没有观察到显著差异。
图13.使用LiMP启动子利用低剂量AAV基因疗法挽救作为新生儿治疗的Gaa-/-小鼠的疾病表型。
通过静脉内注射编码在双重肝-肌肉LiMP启动子(n＝5)或作为比较的肝细胞特异性启动子(hAAT，n＝5)控制之下的密码子优化的高度可分泌的人类GAA(sec-hGAA)的AAV9载体(剂量：6x1012 vg/kg)，在作为新生儿治疗的4月龄Gaa-/-小鼠中hGAA转入基因表达的分析(A-G)和疾病表型的挽救(H-M)。未治疗的Gaa-/-小鼠被用作受影响的对照(Ctrl，n＝5)；同窝仔畜Gaa+/+小鼠被用作未受影响的对照(Gaa+/+，n＝6)。(A)使用抗人类GAA抗体进行的Gaa-/-血浆的代表性Western印迹。描绘了分子量标志物(kDa)；rhGAA：作为阳性对照载样的重组人类GAA。(B)Gaa-/-血浆中hGAA蛋白条带的定量。(C-E)肌肉中GAA酶活性的分析。(F-G)使用抗人类GAA抗体进行的Gaa-/-脊髓(F)和脑(G)的Western印迹分析；抗微管蛋白抗体被用作载样对照。描绘了分子量标志物(kDa)。(H-K)在肌肉(H-J)和中枢神经系统(K)中测量到的糖原积累。(L)针对体重进行归一化的心脏重量。(M)通过4肢握力测试测量的肌肉强度。(B-E，H-M)数据被描绘为平均值±SD；n＝如上所述的每个组群6-5只小鼠。统计分析：t-检验(B)，单向ANOVA和Tukey事后检验(C-E，H-M)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，#p<0.05，###p<0.001。条上的星号和散列标志示出了与图例说明中规定的小鼠组群相比的显著差异。
图14.在作为新生儿治疗的Gaa-/-小鼠中，在使用杂合肝启动子LiMP和LiNeuP的AAV基因疗法后肌肉中GAA蛋白量的分析。
在新生Gaa-/-小鼠中，在静脉内注射编码在遍在(CAG)启动子、肝特异性(hAAT)启动子或我们新产生的杂合肝-肌肉LiMP或肝-神经元LiNeuP启动子控制之下的高度可分泌的GAA蛋白(sec-hGAA)的AAV9载体(AAV剂量：2x1013 vg/kg)后4个月，三头肌中GAA蛋白的分析。上图：在治疗后4个月使用抗GAA抗体进行的三头肌的Western印迹分析。抗GAPDH抗体被用作载样对照；rhGAA：用作阳性对照的重组人类GAA；Ctrl：来自于用作阴性对照的未治疗的Gaa-/-小鼠的组织；在左侧描绘了分子量标志物(kDa)。下图：示出了溶酶体GAA条带的定量。描绘了每组小鼠的数目。将GAA条带强度针对用作载样对照的GAPDH条带的强度进行归一化。统计分析：单向ANOVA和Tukey事后检验。Gaa+/+：野生型未受影响的同窝仔畜小鼠；Ctrl：未治疗的Gaa-/-小鼠。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图15.在作为新生儿治疗的Gaa-/-小鼠中，在使用杂合肝启动子LiMP的AAV基因疗法后肌肉中GAA、p62和帕金蛋白量的分析。
在新生Gaa-/-小鼠中，在静脉内注射编码在肝特异性(hAAT)或我们新产生的杂合肝-肌肉LiMP启动子控制之下的高度可分泌的GAA蛋白(sec-hGAA)的AAV9载体(AAV剂量：2x1013 vg/kg)后4个月，三头肌中GAA、p62和帕金蛋白的分析。上图：在治疗后4个月使用抗GAA、抗p62、抗帕金抗体进行的三头肌的Western印迹分析。抗GAPDH抗体被用作载样对照；Ctrl：来自于用作阴性对照的未治疗的Gaa-/-小鼠的组织；在左侧描绘了分子量标志物(kDa)。下图：示出了溶酶体GAA条带、p62和帕金条带的定量。描绘了每组小鼠的数目。将条带强度针对用作载样对照的GAPDH条带的强度进行归一化。统计分析：单向ANOVA和Tukey事后检验。Gaa+/+：野生型不受影响的同窝仔畜小鼠；Ctrl：未治疗的Gaa-/-小鼠。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，##p<0.01，###p<0.001。
图16.在作为新生儿治疗的Gaa-/-小鼠的肝和三头肌中载体基因组拷贝数(VGCN)的分析。
在新生Gaa-/-小鼠中，在静脉内注射编码在遍在(CAG)、肝特异性(hAAT)或我们新产生的杂合肝-肌肉LiMP或肝-神经元LiNeuP启动子控制之下的高度可分泌的GAA蛋白(sec-hGAA)的AAV9载体(AAV剂量：2x1013 vg/kg)后4个月，在图14和15中描绘的小鼠的肝(A)和三头肌(B)中载体基因组拷贝数(VGCN)的分析。描绘了每组小鼠的数目。统计分析：单向ANOVA和Tukey事后检验。Gaa+/+：野生型未受影响的同窝仔畜小鼠；Ctrl：未治疗的Gaa-/-小鼠。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图17.在用AAV9载体系统性治疗的Gaa-/-小鼠中GAA转入基因mRNA表达的分析。
(A-B)在静脉内注射带有所指示的启动子的AAV9-hGAA载体(本源hGAA，剂量：2x1012 vg/kg)后，来自于Gaa-/-小鼠的组织中hGAA转入基因mRNA的相对表达(变化倍数)；n＝3只小鼠/组群。编码萤光素酶的AAV9载体被用作阴性对照(Ctrl)。描绘了与作为对照靶组织的肝相比转入基因mRNA表达的变化倍数。(D-E)图A-B中描绘的组织中的VGCN。数据被描绘为平均值±SD。统计分析：(A-D)双向ANOVA(组织、载体)和Tukey事后检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图18.在使用杂合启动子的hGAA的AAV基因转移后，成年Gaa-/-小鼠中的抗hGAA体液免疫应答。
在静脉内注射带有在杂合肝-肌肉(Enh.C5.12和LiMP)和肝-神经元(LiNeuP)启动子或作为比较的遍在(CAG)、肝细胞特异性(hAAT)和肌肉特异性(C5.12)启动子控制之下的本源密码子优化的人类GAA(hGAA)转入基因的AAV9载体(剂量：2x1012 vg/kg)后，在1.5(A)、3和5(B)个月时Gaa-/-小鼠中的抗hGAA抗体(免疫球蛋白G：IgG)和肝载体基因组拷贝数(C)的分析。Gaa-/-小鼠在3月龄时进行治疗。数据被描绘为平均值±SD；n＝3-5只小鼠/组群。未治疗的Gaa-/-小鼠被用作受影响的对照。统计分析：(A)单向ANOVA和Tukey事后检验。(B)双向ANOVA和Tukey事后检验(**p<0.01C5.12相比于CAG，***p<0.001C5.12相比于hAAT、Enh.C5.12、LiMP和LiNeuP)；(C)单向ANOVA和Tukey事后检验*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图19.杂合LiMP启动子在人类成肌细胞中的活性。
(A-B)在用含有肝-肌肉(Enh.C5.12和LiMP，图1A)启动子或对照肌肉特异性(C5.12)和肝细胞特异性(hAAT)启动子(图S1)的AAV9-hGAA载体感染(MOI：2x105 vg/细胞)人类成肌细胞后，hGAA蛋白表达的分析。编码增强型绿色荧光蛋白的AAV9载体被用作阴性对照(Ctrl)。(A)使用抗人类GAA抗体进行的细胞裂解物的代表性Western印迹分析。描绘了分子量标志物(kDa)。图片代表了n＝2个独立实验。(B)Western印迹定量。将GAA条带强度针对载样的蛋白质裂解物的量进行归一化。数据被显示为n＝2个独立实验的平均值±SD。统计分析通过单向ANOVA(相比于Ctrl)和Dunnet’s事后检验来进行。*p<0.05。
详细描述
定义
在本发明的情形中，“转录调控元件”是能够在组织或细胞中驱动或增强转入基因的表达的DNA序列。在本发明的情形中，转录调控元件选自组织选择性启动子和组织选择性增强子。在特定实施方式中，所述转录调控元件选自组织选择性或组织特异性基因的组织选择性启动子和组织选择性增强子。
在本发明的情形中，表述“组织选择性启动子”包括天然或合成启动子。具体来说，表述“组织选择性启动子”还表示包含组织选择性启动子和具有与所述启动子相同的组织选择性的增强子的合成启动子。被该表述涵盖的说明性启动子是例如ApoE增强子与hAAT启动子的融合，所述融合对应于符合本段落中提供的定义的肝选择性启动子。
根据本发明，“组织选择性”意味着与另一种组织中的表达相比，转录调控元件偏好性地在给定组织或一组组织中驱动(在启动子的情况下)或增强(在增强子的情况下)可操作连接到所述转录调控元件的基因的表达。“组织选择性”的这种定义不排除组织选择性转录调控元件(例如组织选择性启动子)在一定程度上泄漏的可能性。“泄漏”或其变化形式意味着对一种组织选择性的转录调控元件驱动或提高可操作连接到所述转录调控元件的转入基因在另一种组织中的表达的可能性，尽管表达水平较低。例如，肌肉选择性启动子可能在肝组织中泄漏，意味着从该启动子驱动的表达在肌肉组织中比在肝组织中更高。或者，所述组织选择性转录调控元件可能是“组织特异性”转录调控元件，意味着这个转录调控元件不仅以偏好性方式在给定组织或一组组织中驱动或增强表达，而且该调控元件在其他组织中不或仅仅最低限度地驱动或增强表达。
在本发明的情形中，“杂合转录调控元件”是指能够以组织依赖性方式在两种或更多种组织或一组组织中驱动转入基因表达的DNA序列。根据本发明，并且正如在下文中更详细解释的，每个转录调控元件是组织或细胞选择性的，即它可以以组织选择性方式驱动感兴趣的转入基因的表达，由此偏好性地将所述转入基因的表达限制在需要所述转入基因产物的组织中。
在本发明的情形中，“耐受原性组织”是当转入基因从该组织表达时可以实现针对所述转入基因的免疫耐受的组织，例如肝。
术语“免疫耐受”是指对正常情况下对象对其具有应答的特定抗原或一组抗原无应答的状态。或者，免疫耐受可以被定义为免疫系统通过例如调节性T细胞主动介导针对抗原的免疫应答的抑制的状态。在本发明的情形中，试图获得针对其的免疫耐受的“抗原”或“一组抗原”是所述感兴趣的转入基因。
根据本发明，“感兴趣的转入基因”是指编码RNA或蛋白质产物，可以出于所寻求的目的引入到细胞中，并且能够在适当条件下表达的多核苷酸序列。感兴趣的转入基因可以编码感兴趣的产物，例如感兴趣的治疗性或诊断性产物。“治疗性转入基因”被选择和使用以引起所需的治疗结果，特别是用于实现所述治疗性转入基因在需要所述治疗性转入基因的表达的细胞、组织或器官中的表达。疗法可以通过多种方式实现，包括通过将蛋白质在不表达所述蛋白质的细胞中表达，通过将蛋白质在表达所述蛋白质的突变形式的细胞中表达，通过表达对蛋白质在其中表达的靶细胞有毒的蛋白质(用于例如杀死不想要的细胞例如癌细胞的策略)，通过表达反义RNA以诱导基因阻遏或外显子跳跃，或通过表达目的是抑制蛋白质的表达的沉默RNA例如shRNA。
根据本发明，术语“治疗”包括治愈、缓解或预防效果。因此，治疗和预防性治疗包括障碍的症状改善或阻止或以其他方式降低发生特定障碍的风险。治疗可以被实施以延迟、减缓或逆转疾病和/或其一种或多种症状的进展。术语“预防”可以被认为是减少特定病症的严重性或发作。“预防”还包括阻止特定病症在以前被诊断为患有所述病症的患者中的复发。“治疗”也可以是指现有病症的严重性的降低。术语“治疗”在本文中被用于指称可以有益于动物、特别是哺乳动物、更特别是人类对象的任何疗法。在特定实施方式中，所述哺乳动物可以是婴儿或成年对象，例如人类婴儿或成年人类。
“治疗上感兴趣的细胞”或“治疗上感兴趣的组织”在本文中意味着所述治疗性转入基因在其中的表达将对障碍的治疗有用的主要细胞或组织。这些治疗上感兴趣的组织包括但不限于肌肉(例如骨骼肌、膈肌和心肌)、神经系统(例如脑或脊髓)、肾、肺和肠。治疗上感兴趣的细胞包括但不限于肝细胞、心肌细胞、肌纤维、神经元(例如运动神经元、感觉神经元)、神经胶质细胞和内皮细胞。
杂合转录调控元件
本发明人已设计了用于提高基因疗法功效的新的多组织选择性转录调控元件，其在本文中也被称为“杂合转录调控元件”具体来说，所述新的多组织选择性转录调控元件可以组合不同的组织选择性增强子和/或组织选择性启动子。
本发明的核酸序列涉及这种杂合转录调控元件。本发明的核酸分子包含：(i)能够在第一组织中驱动或增强组织选择性表达的第一转录调控元件(即第一组织选择性转录调控元件)；和(ii)能够在第二组织中驱动或增强组织选择性表达的第二转录调控元件(即第二组织选择性转录调控元件)，并且其中所述第一转录调控元件和第二转录调控元件被融合在一起。在本发明中，所述第一转录调控元件和第二转录调控元件具有不同的组织选择性，并且所述第一转录调控元件和第二转录调控元件中的至少一者是启动子。
包括在本发明的核酸序列中的转录调控元件的选择将取决于所述核酸序列和可操作连接到所述核酸序列的感兴趣的转入基因的具体目标。具体来说，在将本发明的核酸序列使用在用于基因疗法的载体中的情况下，它将取决于从业人员旨在治疗的疾病或障碍。根据情况，所述转录调控元件可以被选择成能够在大量组织或细胞中驱动表达，例如在肝、肌肉中，在中枢神经系统中例如在脑或脊髓中例如在神经元(例如在运动神经元、感觉神经元或中间神经元中)或神经胶质细胞中，在外周神经系统(PNS)中，在肾中，在眼中，或在肺中。其他感兴趣的组织或细胞可以包括循环细胞例如免疫系统的细胞如B细胞、T细胞或巨噬细胞、造血细胞或内皮细胞。
在特定实施方式中，寻求在肝中的表达，用于例如诱导针对感兴趣的转入基因的免疫耐受，但不仅仅如此。
在另一个特定实施方式中，寻求在肌肉中的表达。
在又一个实施方式中，寻求在神经元中的表达。
在其他特定实施方式中，选择用于在肝和肌肉中表达的转录调控元件。
在另一个实施方式中，选择用于在肝和神经元中表达的转录调控元件。
在另一个实施方式中，选择用于在肌肉和神经元中表达的转录调控元件。
在其他实施方式中，选择用于在肝、肌肉和神经元中表达的转录调控元件。
正如在上文定义中提到的，所述转录调控元件可以是组织选择性增强子或组织选择性启动子。
所述第一组织选择性转录调控元件在感兴趣的第一细胞或组织例如治疗上感兴趣的第一细胞或组织中驱动/增强转入基因的表达。在特定实施方式中，所述第一组织选择性转录调控元件在肝中驱动/增强转入基因的表达。在特定实施方式中，寻求在肝中的表达是因为这种组织的耐受原性特性。因此，在这个特定实施方式中，所述第一转录调控元件是肝选择性转录调控元件。复合或人工肝启动子通过组合肝表达的基因的启动子区来产生。说明性的肝选择性转录调控元件包括但不限于载脂蛋白E(ApoE——增强子序列示出在SEQID NO：4中)和A-I(Apo A-I)增强子(Van Linthout S,Hum Gene Ther.2002May1；13(7):829-40)，抗胰蛋白酶启动子——例如α-1抗胰蛋白酶启动子(hAAT——示出在SEQ ID NO：2中)，甲状腺素转运蛋白启动子(TTR)，白蛋白启动子(Alb)，甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子，LSP启动子(包含甲状腺激素结合球蛋白启动子序列、两个拷贝的α1-微球蛋白/bikunin增强子序列和前导序列——Ill，Charles R.等，1997，用于血友病A的基因疗法的人类因子VIII互补DNA表达质粒的优化(Optimization of the human factor VIII complementaryDNA expression plasmid for gene therapy of hemophilia A)，BloodCoag.Fibrinol.8:S23–S30)等。其他有用的肝选择性启动子在本领域中是已知的，例如在冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)编纂的肝特异性基因启动子数据库(http://rulai.cshl.edu/LSPD/)中列出的。具体来说能够增强基因的肝选择性表达的其他转录调控元件公开在WO2009130208中。在特定实施方式中，所述肝选择性转录调控元件包含ApoE增强子与肝选择性启动子的组合，所述肝选择性启动子选自抗胰蛋白酶启动子例如α-1抗胰蛋白酶启动子(hAAT——示出在SEQ ID NO：2中)、甲状腺素转运蛋白启动子(TTR)、白蛋白启动子(Alb)、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、上文定义的LSP启动子和任何其他肝选择性启动子例如在冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)编纂的肝特异性基因启动子数据库(http://rulai.cshl.edu/LSPD/)中列出的那些。在特定实施方式中，在本发明的情形中使用的肝选择性转录调控元件是选自α-1抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、ApoE增强子与hAAT启动子的组合、甲状腺素转运蛋白启动子、白蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子和LSP启动子的肝选择性启动子。在本发明的情形中使用的特定肝选择性转录调控元件是ApoE增强子(ApoE)与hAAT启动子的组合。
所述第二组织选择性转录调控元件在感兴趣的第二细胞或组织中驱动或增强转入基因的表达。具体来说，所述第二组织选择性转录调控元件可以在感兴趣的第二细胞或组织中驱动转入基因的表达。
在特定实施方式中，所述第二组织选择性转录调控元件是最终与肌肉选择性增强子偶联的肌肉选择性启动子。在另一个特定实施方式中，所述第二组织选择性转录调控元件是肌肉选择性增强子。
适合的肌肉选择性启动子的一个实例包括肌肉肌酸激酶(MCK)启动子。适合的肌肉肌酸激酶启动子的非限制性实例是人类肌肉肌酸激酶启动子和截短的鼠类肌肉肌酸激酶[(tMCK)启动子](Wang B等，用于AAV载体的紧凑的肌肉选择性启动子的构建和分析(Construction and analysis of compact muscle-selective promoters for AAVvectors)，Gene Ther.2008Nov；15(22):1489-99)(代表性GenBank登记号AF188002)。人类肌肉肌酸激酶具有Gene ID No.1158(代表性GenBank登记号NC_000019.9，在2012年12月26日访问)。肌肉选择性启动子的其他实例包括合成启动子C5.12(spC5.12，在本文中也被称为“C5.12”)，例如在SEQ ID NO：1中示出的spC5.12或spC5.12启动子(公开在Wang等，GeneTherapy volume 15，第1489–1499页(2008)中)、MHCK7启动子(Salva等，MolTher.2007Feb；15(2):320-9)、肌球蛋白轻链(MLC)启动子例如MLC2(Gene ID No.4633；代表性GenBank登记号NG_007554.1，在2012年12月26日访问)、肌球蛋白重链(MHC)启动子例如α-MHC(Gene ID No.4624；代表性GenBank登记号NG_023444.1，在2012年12月26日访问)、结蛋白启动子(Gene ID No.1674；代表性GenBank登记号NG_008043.1，在2012年12月26日访问)、心肌肌钙蛋白C启动子(Gene ID No.7134；代表性GenBank登记号NG_008963.1，在2012年12月26日访问)、肌钙蛋白I启动子(Gene ID Nos.7135、7136和7137；代表性GenBank登记号NG_016649.1、NG_011621.1和NG_007866.2，在2012年12月26日访问)、myoD基因家族启动子(Weintraub等，Science,251,761(1991)；Gene ID No.4654；代表性GenBank登记号NM_002478，在2012年12月26日访问)、α肌动蛋白启动子(Gene ID Nos.58、59和70；代表性GenBank登记号NG_006672.1、NG_011541.1和NG_007553.1，在2012年12月26日访问)、β肌动蛋白启动子(Gene ID No.60；代表性GenBank登记号NG_007992.1，在2012年12月26日访问)、γ肌动蛋白启动子(Gene ID No.71和2；代表性GenBank登记号NG_011433.1和NM_001199893，在2012年12月26日访问)、位于眼型Pitx3的内含子1中的肌肉选择性启动子(Gene ID No.5309)(Coulon等；所述肌肉选择性启动子对应于代表性GenBank登记号NG_008147的第11219-11527位残基，在2012年12月26日访问)和在美国专利出版物US 2003/0157064中描述的启动子和CK6启动子(Wang等，2008doi:10.1038/gt.2008.104)。在另一个特定实施方式中，所述肌肉选择性启动子是在Wang等，Gene Therapy volume 15，第1489–1499页(2008)中描述的E-Syn启动子(序列示出在SEQ ID NO：13中)，其包含MCK来源的增强子与spC5.12启动子的组合。在本发明的特定实施方式中，所述肌肉选择性启动子选自spC5.12启动子、MHCK7启动子、E-syn启动子、肌肉肌酸激酶肌球蛋白轻链(MLC)启动子、肌球蛋白重链(MHC)启动子、心肌肌钙蛋白C启动子、肌钙蛋白I启动子、myoD基因家族启动子、α肌动蛋白启动子、β肌动蛋白启动子、γ肌动蛋白启动子、位于眼型Pitx3的内含子1内的肌肉选择性启动子和CK6启动子。在特定实施方式中，所述肌肉选择性启动子选自spC5.12、结蛋白和MCK启动子。在其他实施方式中，所述肌肉选择性启动子选自spC5.12和MCK启动子。在特定实施方式中，所述肌肉选择性启动子是spC5.12启动子。在特定实施方式中，所述肌肉选择性启动子不是结蛋白启动子。
具体来说能够增强基因的肌肉选择性表达、特别是在心肌和/或骨骼肌中的表达的转录调控元件，是在WO2015110449中公开的那些。包含人工序列的核酸转录调控元件的具体实例包括通过将在WO2015110449中公开的序列中存在的转录因子结合位点(TFBS)进行重排而获得的转录调控元件。所述重排可以涵盖TFBS的顺序的变化和/或改变一个或多个TFBS相对于其他TFBS的位置和/或改变一个或多个TFBS的拷贝数。例如，用于增强肌肉选择性基因表达、特别是心肌和骨骼肌选择性基因表达的核酸转录调控元件可以包含用于E2A、HNH 1、NF1、C/EBP、LRF、MyoD和SREBP的结合位点，或用于E2A、NF1、p53、C/EBP、LRF和SREBP的结合位点，或用于E2A、HNH 1、HNF3a、HNF3b、NF1、C/EBP、LRF、MyoD和SREBP的结合位点，或用于E2A、HNF3a、NF1、C/EBP、LRF、MyoD和SREBP的结合位点，或用于E2A、HNF3a、NF1、CEBP、LRF、MyoD和SREBP的结合位点，或用于HNF4、NF1、RSRFC4、C/EBP、LRF和MyoD的结合位点，或用于NF1、PPAR、p53、C/EBP、LRF和MyoD的结合位点。在其他实例中，这些核酸转录调控元件包含前述一个或多个TFBS的至少2个，例如2、3、4个或更多个拷贝。
在又一个特定实施方式中，所述第二组织选择性转录调控元件是最终与神经元选择性增强子偶联的神经元选择性启动子。在另一个特定实施方式中，所述第二组织选择性转录调控元件是神经元选择性增强子。
神经元选择性启动子包括但不限于下述启动子：突触蛋白-1(Syn)启动子(示出在SEQ ID NO：3中)，神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen等，Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993))，神经丝轻链基因启动子(Piccioli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991))，和神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli等，Neuron,15:373-84(1995))，以及其他对专业技术人员来说显而易见的启动子。在特定实施方式中，所述神经元选择性启动子是Syn启动子。其他神经元选择性启动子包括但不限于突触蛋白-2启动子、酪氨酸羟化酶启动子、多巴胺β-羟化酶启动子、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶启动子、低亲和性NGF受体启动子和胆碱乙酰基转移酶启动子(Bejanin等，1992；Carroll等，1995；Chin和Greengard,1994；Foss-Petter等，1990；Harrington等，1987；Mercer等，1991；Patei等，1986)。对运动神经元具有选择性的代表性启动子包括但不限于降钙素基因相关肽(CGRP)这种已知的运动神经元衍生因子的启动子。在运动神经元中有功能的其他启动子包括胆碱乙酰基转移酶(ChAT)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、突触蛋白和Hb9的启动子。用于本发明中的其他神经元选择性启动子包括但不限于GFAP(用于星形胶质细胞)、钙结合蛋白2(用于中间神经元)、Mnx1(运动神经元)、巢蛋白(神经元)、小清蛋白(Parvalbumin)、生长抑素和Plp1(少突胶质细胞和施旺细胞)的启动子。
在本发明的实践中有用的CRM包括在Rincon等，Mol Ther.2015Jan；23(1):43-52，Chuah等，Mol Ther.2014Sep；22(9):1605-13或Nair等，Blood.2014May 15；123(20):3195-9中描述的那些。
在其他实施方式中，本发明的核酸序列包含超过两个组织选择性转录调控元件，例如3、4个或超过4个组织选择性转录调控元件。本发明的核酸的设计取决于试图治疗的具体障碍，例如所述障碍是否是其治疗将从所述治疗性转入基因在超过一种组织中的表达获益的多系统疾病。例如，本发明的核酸序列可以包含能够在耐受原性组织中例如在肝中驱动或增强转入基因的表达的第一组织选择性转录调控元件(例如启动子)、第二组织选择性转录调控元件(例如启动子)和第三组织选择性转录调控元件(例如一个启动子)，其中所述第一组织选择性转录调控元件、第二组织选择性转录调控元件和第三组织选择性转录调控元件能够在不同组织中驱动转入基因的表达。例如，所述第一组织选择性转录调控元件可以是肝选择性启动子，所述第二组织选择性转录调控元件可以是肌肉选择性启动子，并且所述第三组织选择性转录调控元件可以是神经元选择性启动子。或者，所述第二组织选择性转录调控元件和第三组织选择性转录调控元件两者可以具有相同的组织选择性，其与所述第一转录调控元件的组织选择性不同，以进一步提高所述治疗性转入基因在感兴趣的组织中的表达。
所述第一组织选择性转录调控元件、第二组织选择性转录调控元件和其他组织选择性转录调控元件(例如第一、第二和其他组织选择性启动子)彼此之间的相对顺序可以改变。在特定实施方式中，所述第一组织选择性转录调控元件位于所述第二组织选择性转录调控元件的5'或3'，特别是所述第二组织选择性转录调控元件的5'。在其中所述第一转录调控元件是肝选择性启动子的特定实施方式中，所述第一转录调控元件相对于本发明的核酸分子中引入的任何其他转录调控元件位于5’。例如，本发明的核酸分子可以以下述从5’至3’的顺序包含：
(i)-肝选择性启动子；和
-具有肝之外的组织选择性的任何其他转录调控元件；或
(ii)-肝选择性启动子；和
-肌肉选择性转录调控元件，例如肌肉选择性启动子；或
(iii)-肝选择性启动子；和
-神经元选择性转录调控元件，例如神经元选择性启动子；或
(iv)-肝选择性启动子；
-肌肉选择性转录调控元件，例如肌肉选择性启动子；和
-神经元选择性转录调控元件，例如神经元选择性启动子；或
(v)-肝选择性启动子；
-神经元选择性转录调控元件，例如神经元选择性启动子；和
-肌肉选择性转录调控元件，例如肌肉选择性启动子。
在本发明的情形中，引入到本发明的核酸分子中的转录调控元件可以被直接融合或通过连接物连接。例如，在具有两个不同启动子的设计的情况下，直接融合意味着所述第二启动子的第一个核苷酸直接跟在所述第一启动子的最后一个核苷酸之后。在通过连接物连接的情况下，在所述第一启动子的最后一个核苷酸与所述第二启动子的第一个核苷酸之间存在核苷酸序列。例如，所述连接物的长度可以在1至50个核苷酸之间，例如1至40个核苷酸，例如1至30个核苷酸，例如1至20个核苷酸，例如1至10个核苷酸。
在特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-肝选择性转录调控元件；和
-肌肉选择性和/或神经元选择性转录调控元件，特别是肌肉选择性或神经元选择性转录调控元件。
在其他特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-ApoE增强子；和
-spC5.12启动子。
在这个实施方式的变化形式中，本发明的核酸序列包含SEQ ID NO：4与SEQ IDNO：1的组合，例如在SEQ ID NO：5中示出的序列。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-能够在耐受原性组织中驱动/增强转入基因的表达的转录调控元件，特别是启动子；和
-肌肉选择性和/或神经元选择性转录调控元件，特别是启动子，更特别是肌肉选择性或神经元选择性启动子。
在其他特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-肝选择性启动子；和
-肌肉选择性和/或或神经元选择性启动子，特别是肌肉选择性或神经元选择性启动子。
在甚至更特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-hAAT启动子；和
-spC5.12启动子。
在这个实施方式的特定变化形式中，本发明的核酸序列包含SEQ ID NO：2与SEQID NO：1的组合。
在另一个更特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-ApoE增强子/hAAT启动子；和
-spC5.12启动子。
在这个实施方式的特定变化形式中，本发明的核酸序列包含SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：2与SEQ ID NO：1的组合，例如在SEQ ID NO：6中示出的序列。
在另一个更特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-hAAT启动子；和
-Syn启动子。
在这个实施方式的特定变化形式中，本发明的核酸序列包含SEQ ID NO：2与SEQID NO：3的组合。
在其他特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-ApoE增强子；和
-Syn启动子。
在这个实施方式的变化形式中，本发明的核酸序列包含SEQ ID NO：4与SEQ IDNO：3的组合。
在另一个更特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-ApoE增强子/hAAT启动子；和
-Syn启动子。
在这个实施方式的特定变化形式中，本发明的核酸序列包含SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：2与SEQ ID NO：3的组合，例如在SEQ ID NO：7中示出的序列。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-hAAT启动子；
-spC5.12启动子；和
-Syn启动子。
在这个实施方式的特定变化形式中，本发明的核酸序列包含SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：1与SEQ ID NO：3的组合。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-hAAT启动子；
-Syn启动子；和
-spC5.12启动子。
在这个实施方式的特定变化形式中，本发明的核酸序列包含SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3与SEQ ID NO：1的组合。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-ApoE增强子/hAAT启动子；
-spC5.12启动子；和
-Syn启动子。
在这个实施方式的特定变化形式中，本发明的核酸序列包含SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：3的组合。
在其他特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-ApoE增强子/hAAT启动子；
-Syn启动子；和
-spC5.12启动子。
在这个实施方式的特定变化形式中，本发明的核酸序列包含SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：1的组合。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-spC5.12启动子；和
-Syn启动子。
在其他特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-MHCK7启动子；和
-Syn启动子。
在又一个特定实施方式中，本发明的核酸序列具体来说以下述从5’至3’的顺序包含：
-CK启动子；和
-Syn启动子。
表达盒
本发明的核酸序列可以被引入到表达盒中，所述表达盒被设计用于提供感兴趣的转入基因在感兴趣的组织中的表达。
因此，本发明的表达盒包括上述核酸序列和感兴趣的转入基因。
所述表达盒可以包含至少一个另外的调控序列，所述另外的调控序列能够通过降低或抑制所述感兴趣的治疗性转入基因在某些不感兴趣的组织中的表达，或通过使由所述感兴趣的转入基因编码的感兴趣的蛋白质例如治疗性蛋白质的编码mRNA稳定，进一步控制所述感兴趣的治疗性转入基因的表达。这些序列包括例如沉默子(例如组织特异性沉默子)、microRNA靶序列、内含子和多腺苷化信号。
在另一个特定实施方式中，可以将内含子置于所述治疗性转入基因之前，特别是将内含子置于本发明的杂合启动子与所述治疗性转入基因之间。内含子的引入可以提高mRNA的稳定性和感兴趣的蛋白质例如感兴趣的治疗性蛋白质的生产。在其他实施方式中，所述内含子是人类β珠蛋白b2(或HBB2)内含子、凝血因子IX(FIX)内含子、SV40内含子或鸡β-珠蛋白内含子。在另一个其他实施方式中，所述内含子是修饰的内含子(特别是修饰的HBB2或FIX内含子)，其被设计用于减少所述内含子中存在的可选开放阅读框(ARF)的数目或甚至完全移除它们。本发明人以前已在WO2015/162302中显示，这种修饰的内含子、特别是修饰的HBB2或FIX内含子具有有利的性质，并且可以显著提高转入基因的表达。
在特定实施方式中，本发明的表达盒以下述从5’至3’的顺序包含：
-本发明的核酸序列；
-感兴趣的转入基因；和
-多腺苷化信号。
在其他特定实施方式中，本发明的表达盒以下述从5’至3’的顺序包含：
-本发明的核酸序列；
-内含子，例如HBB2或SV40内含子；
-感兴趣的转入基因；和
-多腺苷化信号。
载体、细胞和药物组合物
本发明的表达盒可以被引入到载体中。因此，本发明还涉及包含上述表达盒的载体。在本发明中使用的载体是适合于RNA/蛋白质表达并特别适合于基因疗法的载体。
在一个实施方式中，所述载体是质粒载体。
在另一个实施方式中，所述载体是非病毒载体，例如含有本发明的表达盒的纳米粒子、脂质纳米粒子(LNP)或脂质体。
在另一个实施方式中，所述载体是基于转座子的系统，允许将本发明的表达盒整合到靶细胞的基因组中，例如高活性睡美人(SB100X)转座子系统(Mates等，2009)。
在另一个实施方式中，所述载体是适用于基因疗法的病毒载体，靶向任何感兴趣的细胞或组织例如上述耐受原性组织(例如肝组织或细胞)和治疗上感兴趣的组织例如肌肉或CNS细胞(例如神经元或其他脊髓或脑细胞)。在这种情况下，正如在本领域中公知的，向本发明的表达盒添加适合于产生高效病毒载体的其他序列。在特定实施方式中，所述病毒载体源自于整合病毒。具体来说，所述病毒载体可以源自于腺病毒、反转录病毒或慢病毒(例如整合缺陷型慢病毒)。在特定实施方式中，所述慢病毒是具有能够靶向感兴趣的细胞/组织例如肝和/或肌肉细胞的包膜的假型慢病毒(正如在专利申请EP17306448.6和EP17306447.8中所描述的)。在所述病毒载体源自于反转录病毒或慢病毒的情况下，所述其他序列是在所述表达盒两侧的反转录病毒或慢病毒LTR序列。在另一个特定实施方式中，所述病毒载体是AAV载体，例如适合于转导耐受原性组织例如肝和治疗上感兴趣的另一种组织的AAV载体。在这个实施方式中，所述其他序列是在所述表达盒两侧的AAV ITR序列。
在优选实施方式中，所述载体是AAV载体。人类细小病毒腺相关病毒(AAV)是一种天然复制缺陷的依赖病毒，其能够整合到被感染的细胞的基因组中以建立潜伏感染。最后一种性质在哺乳动物病毒中似乎是独一无二的，因为整合发生在人类基因组中位于19号染色体上(19q13.3-qter)被称为AAVS1的特定位点处。
因此，作为用于人类基因疗法的潜在载体，AAV载体引起了相当大的兴趣。所述病毒的有利特性包括缺乏与任何人类疾病的关联性、感染分裂和非分裂细胞两者的能力以及源自可被感染的不同组织的广泛的细胞系。
在从人类或非人类灵长动物(NHP)分离并被良好表征的AAV血清型中，人类血清2型是被开发为基因转移载体的第一种AAV。其他目前使用的AAV血清型包括AAV-1、AAV-2变体(例如包含具有Y44+500+730F+T491V变化的工程化衣壳的四重突变的衣壳优化的AAV-2，其公开在Ling等，2016Jul 18,Hum Gene Ther Methods中)、AAV-3和AAV-3变体(例如包含具有两个氨基酸变化S663V+T492V的工程化AAV3衣壳的AAV3-ST变体，其公开在Vercauteren等，2016,Mol.Ther.Vol.24(6),p.1042中)、AAV-3B和AAV-3B变体、-4、-5、-6和AAV-6变体(例如包含三重突变的AAV6衣壳Y731F/Y705F/T492V形式的AAV6变体，其公开在Rosario等，2016,Mol Ther Methods Clin Dev.3,p.16026中)、-7、-8、-9、-2G9、-10例如cy10和-rh10、-rh74、-dj、Anc80、LK03、AAV2i8、猪AAV血清型例如AAVpo4和AAVpo6，以及AAV血清型的酪氨酸、赖氨酸和丝氨酸衣壳突变体等。此外，其他非天然的工程化的变体和嵌合AAV也可以是有用的。
AAV病毒可以使用常规的分子生物学技术进行工程化改造，使得可以优化这些粒子用于核酸序列的细胞特异性递送，用于最小化免疫原性，用于调节稳定性和粒子寿命，用于高效降解，用于精确递送到核。
组装成载体所需的AAV片段包括cap蛋白包括vp1、vp2、vp3和高变区，rep蛋白包括rep 78、rep 68、rep 52和rep 40，以及编码这些蛋白质的序列。这些片段可以被容易地用于各种不同的载体系统和宿主细胞中。
缺少Rep蛋白的基于AAV的重组载体以低效率整合在宿主的基因组中，并且主要作为稳定的环状游离体存在，其可以在靶细胞中存留几年。
代替使用AAV天然血清型，在本发明的情形中也可以使用人工AAV血清型，包括但不限于具有非天然存在的衣壳蛋白的AAV。这种人工衣壳可以通过任何适合的技术，使用所选的AAV序列(例如vp1衣壳蛋白的片段)与异源序列的组合来产生，所述异源序列可以从不同的所选AAV血清型、同一AAV血清型的非毗连部分、非AAV病毒来源或非病毒来源获得。人工AAV血清型可以是但不限于嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。
在本发明的情形中，所述AAV载体包含能够转导感兴趣的靶细胞、即耐受原性组织的细胞(例如干细胞)和治疗上感兴趣的组织的细胞例如肌肉细胞、CNS细胞或心脏细胞的AAV衣壳。
根据特定实施方式，所述AAV载体是AAV-1、-2、AAV-2变体(例如包含具有Y44+500+730F+T491V变化的工程化衣壳的四重突变的衣壳优化的AAV-2，其公开在Ling等，2016Jul18,Hum Gene Ther Methods[提前发布的电子版]中)、AAV-3和AAV-3变体(例如包含具有两个氨基酸变化S663V+T492V的工程化AAV3衣壳的AAV3-ST变体，其公开在Vercauteren等，2016,Mol.Ther.Vol.24(6),p.1042中)、AAV-3B和AAV-3B变体、-4、-5、-6和AAV-6变体(例如包含三重突变的AAV6衣壳Y731F/Y705F/T492V形式的AAV6变体，其公开在Rosario等，2016,Mol Ther Methods Clin Dev.3,p.16026中)、-7、-8、-9、-2G9、-10例如cy10和-rh10、-rh39，-rh43，-rh74、-dj、Anc80、LK03、AAV.PHP、AAV2i8、猪AAV例如AAVpo4和AAVpo6，以及AAV血清型的酪氨酸、赖氨酸和丝氨酸衣壳突变体等。在特定实施方式中，所述AAV载体是AAV8、AAV9、AAVrh74或AAV2i8血清型(即所述AAV载体具有AAV8、AAV9、AAVrh74或AAV2i8血清型的衣壳)。在其他特定实施方式中，所述AAV载体是假型载体，即它的基因组和衣壳源自于不同血清型的AAV。例如，所述假型AAV载体可以是其基因组源自于上述AAV血清型之一并且其衣壳源自于另一种血清型的载体。例如，所述假型载体的基因组可以具有源自于AAV8、AAV9、AAVrh74或AAV2i8血清型的衣壳，并且它的基因组可以源自于不同血清型。在特定实施方式中，所述AAV载体具有AAV8、AAV9或AAVrh74血清型、特别是AAV8或AAV9血清型、更特别是AAV8血清型的衣壳。
在其中所述载体用于将所述治疗性转入基因递送到肌肉细胞的特定实施方式中，所述AAV载体尤其可以在AAV8、AAV9和AAVrh74中选择。
在其中所述载体用于将所述转入基因递送到肝细胞的另一个特定实施方式中，所述AAV载体尤其可以在AAV1、AAV5、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAVrh74、AAV-LK03、AAV2G9、AAV.PHP、AAV-Anc80和AAV3B中选择。
在其中所述载体用于将所述转入基因递送到CNS的另一个特定实施方式中，所述AAV载体尤其可以在AAV9、AAV10和AAV2G9中选择。
在另一个实施方式中，所述衣壳是修饰的衣壳。在本发明的情形中，“修饰的衣壳”可以是嵌合衣壳或包含源自于一种或多种野生型AAV VP衣壳蛋白的一个或多个变体VP衣壳的衣壳。
在特定实施方式中，所述AAV载体是嵌合载体，即它的衣壳包含源自于至少两种不同AAV血清型的VP衣壳蛋白，或包含合并了源自于至少两种AAV血清型的VP蛋白区或结构域的至少一种嵌合VP蛋白。这种可用于转导肝细胞的嵌合AAV载体的实例被描述在Shen等，Molecular Therapy,2007和Tenney等，Virology,2014中。例如，嵌合AAV载体可以从AAV8衣壳序列与不同于AAV8血清型的AAV血清型例如上文具体提到的那些血清型的序列的组合产生。在另一个实施方式中，所述AAV载体的衣壳包含一种或多种变体VP衣壳蛋白，例如在WO2015013313中描述的那些，特别是表现出高度肝向性的RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4和RHM15-6衣壳变体。
在另一个实施方式中，所述修饰的衣壳也可以源自于通过易错PCR和/或肽插入而插入的衣壳修饰(例如在Bartel等，2011中所描述的)。此外，衣壳变体可以包括单氨基酸改变例如酪氨酸突变体(例如在Zhong等，2008中所描述的)。
此外，所述AAV载体的基因组可以是单链或自身互补的双链基因组(McCarty等，Gene Therapy,2003)。自身互补的双链AAV载体通过从AAV末端重复序列之一删除末端解链位点来产生。这些其复制的基因组为野生型AAV基因组的长度的一半的修饰的载体，具有包装DNA二聚体的倾向性。在优选实施方式中，在本发明的实践中使用的AAV载体具有单链基因组，并且此外优选地包含AAV8、AAV9、AAVrh74或AAV2i8衣壳，特别是AAV8、AAV9或AAVrh74衣壳，例如AAV8或AAV9衣壳，更特别是AAV8衣壳。正如本领域中已知的，可以将其他适合的序列引入到本发明的核酸构建物中，以获得有功能的病毒载体。适合的序列包括AAV ITR。
当然，在设计本发明的核酸序列和本发明的表达盒中，本领域技术人员应该注意遵守用于将所述构建物递送到细胞或器官的载体的尺寸限制。具体来说，在所述载体是AAV载体的情况下，本领域技术人员知道AAV载体的主要限制是其运载容量，运载容量可以随着AAV血清型而变，但据认为受限于母体病毒基因组的大约尺寸。例如，5kb是通常据认为被包装在AAV8衣壳中的最大尺寸(Wu Z.等，Mol Ther.,2010,18(1):80-86；Lai Y.等，MolTher.,2010,18(1):75-79；Wang Y.等，Hum Gene Ther Methods,2012,23(4):225-33)。因此，本领域技术人员在实践本发明中应该小心地选择本发明的核酸构建物的组分，以使得得到的包括编码AAV 5'-和3'-ITR的序列在内的核酸序列优选地不超过所使用的AAV载体的运载容量的110％，特别是优选地不超过5.5kb。
本发明还涉及用本发明的核酸序列或本发明的表达盒转化的分离的细胞，例如肝、肌肉或神经元细胞。本发明的细胞可以通过在需要的对象的感兴趣的组织或血流中注射，递送到所述对象。在特定实施方式中，本发明涉及将本发明的核酸序列或表达盒引入到待治疗的对象的细胞中，特别是待治疗的对象的肝、肌肉或神经元细胞中，并将其中已引入所述核酸或表达盒的所述细胞施用回到所述对象。
本发明还提供了包含本发明的核酸序列、载体或细胞的药物组合物。这些组合物包含治疗有效量的本发明的核酸序列、载体或细胞和可药用载体。术语“可药用”意味着得到联邦或州政府的管理部门批准或在美国或欧洲药典或其他公认的药典中列出的可用于动物和人类中。术语“载体”是指随同治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或介质。这些药用载体可以是无菌液体例如水和油类，包括石油、动物、植物或合成来源的油类，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
如果需要的话，所述组合物还可以含有少量润湿或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放剂型等的形式。口服剂型可以包括标准的载体例如制药级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的制药载体的实例描述在E.W.Martin的《Remington制药学》(Remington'sPharmaceutical Sciences)中。这些组合物将含有治疗有效量的优选地采取纯化形式的治疗剂以及适合量的载体，以便提供适合于施用到所述对象的形式。在特定实施方式中，本发明的核酸序列、表达盒、载体或细胞被配制在包含磷酸盐缓冲盐水并增补有0.25％人血清白蛋白的组合物中。在另一个特定实施方式中，本发明的载体被配制在包含林格乳酸盐和非离子型表面活性剂例如以总组合物的重量计终浓度为0.01-0.0001％、例如浓度为0.001％的pluronic F68的组合物中。所述剂型还可以包含血清白蛋白，特别是人血清白蛋白，例如0.25％的人血清白蛋白。其他适合用于储存或施用的剂型在本领域中是已知的，特别是从WO 2005/118792或Allay等，2011已知。
在优选实施方式中，所述组合物按照常规程序配制成适合于静脉内或肌肉内施用，优选为静脉内施用到人类的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。在必要时，所述组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利诺卡因，以缓解注射部位处的疼痛。
在一个实施方式中，本发明的核酸序列、表达盒或载体可以在囊泡、特别是脂质体中递送。在又一个实施方式中，本发明的核酸序列、表达盒或载体可以在受控释放系统中递送。
载体的使用方法
由于包含在本发明的核酸序列中的多选择性转录调控元件，可以在超过一种组织中表达感兴趣的转入基因，而不引发由遍在启动子引起的顾虑。具体来说，本发明的核酸序列可用于产生基因毒性较低的表达盒。具体来说，本发明的核酸序列可以有利地避免癌基因的不想要的上调。
本发明的核酸序列、表达盒或载体可用于通过基因疗法治疗障碍。同样地，本发明的细胞可用于通过细胞疗法治疗障碍。
因此，一方面，本发明涉及如上所述的核酸序列、表达盒、载体、细胞或药物组合物，其用作药物。
另一方面，本发明涉及如上所述的核酸序列、表达盒、载体、细胞或药物组合物，其用于通过基因疗法治疗障碍的方法中。
另一方面，本发明涉及如上所述的核酸序列、表达盒、载体、细胞或药物组合物的用途，其用于制造在通过基因疗法治疗癌症中使用的药物。
另一方面，本发明涉及一种通过基因疗法治疗障碍的方法，所述方法包括向需要的对象施用治疗有效量的本文中描述的核酸序列、表达盒、载体、细胞或药物组合物。
所述障碍可以是可以需要在至少两种不同组织中表达给定基因的任何障碍，特别是其治疗可能被抗转入基因免疫应答阻碍的障碍。具体来说，所述障碍是遗传或获得性障碍，例如遗传或获得性神经肌肉疾病。当然，将根据待治疗的障碍来选择治疗性转入基因和驱动其在治疗上感兴趣的组织中表达的启动子。
在特定实施方式中，所述障碍是溶酶体贮积病[(LSD)，例如I型至VII型黏多糖贮积症(MPSI-VII)、Sandhoff病和Tay-Sachs]，并且本发明的核酸序列包含肝选择性、肌肉选择性和/或神经元选择性转录调控元件，例如肝选择性和肌肉选择性转录调控元件、肝选择性和神经元选择性转录调控元件以及肝选择性、肌肉选择性和神经元选择性转录调控元件。
在特定实施方式中，所述障碍是代谢疾病[例如枫糖尿病(MSUD)、甲基丙二酸血症(MMA)、I型和III型糖原贮积病(GSDI和III)、尼曼-皮克病(NPC)、卡纳万病、苯丙酮尿症(PKU)]，并且本发明的核酸序列包含肝选择性、肌肉选择性和/或神经元选择性转录调控元件，例如肝选择性和肌肉选择性转录调控元件、肝选择性和神经元选择性转录调控元件以及肝选择性、肌肉选择性和神经元选择性转录调控元件。
在特定实施方式中，所述障碍是神经肌肉障碍。术语“神经肌肉障碍”涵盖了作为随意肌的病理直接地或作为神经或神经肌肉接点的病理间接地损害肌肉功能的疾病和病痛。说明性的神经肌肉障碍包括但不限于肌营养不良症(例如肌强直性营养不良(Steinert病)、杜氏肌营养不良、贝氏型肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良、埃-德二氏肌营养不良)、运动神经元病(例如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌肉萎缩症(婴儿型进行性脊髓性肌肉萎缩症(1型，Werdnig-Hoffmann病)、中间型脊髓性肌肉萎缩症(2型)、幼年型脊髓性肌肉萎缩症(3型，Kugelberg-Welander病)、成年型脊髓性肌肉萎缩症(4型))、脊髓-延髓性肌肉萎缩症(肯尼迪病))、炎性肌病(例如多发性肌炎皮肌炎、包涵体肌炎)、肌肉神经接点的疾病(例如重症肌无力、Lambert-Eaton(肌无力)综合征、先天性肌无力综合征)、外周神经的疾病(例如腓骨肌萎缩症、弗立特里希氏共济失调、Dejerine-Sottas病)、肌肉的代谢疾病(例如磷酸化酶缺乏症(McArdle病)、酸性麦芽糖酶缺乏症(庞贝氏病)、磷酸果糖激酶缺乏症(Tarui病)、脱支酶缺乏症(Cori或Forbes病)、线粒体肌病、肉毒碱缺乏症、肉毒碱棕榈酰转移酶缺乏症、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症、乳酸脱氢酶缺乏症、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症)、由内分泌异常造成的肌病(例如甲亢性肌病、甲低性肌病)和其他肌病(例如先天性肌强直、先天性副肌强直、中央轴空病、线状体肌病、肌小管性肌病、周期性麻痹)。在这个实施方式中，本发明的核酸序列包含肝选择性、肌肉选择性和/或神经元选择性转录调控元件，例如肝选择性和肌肉选择性转录调控元件、肝选择性和神经元选择性转录调控元件以及肝选择性、肌肉选择性和神经元选择性转录调控元件。
在特定实施方式中，所述障碍是糖原贮积病。表述“糖原贮积病”是指涉及负责糖原合成和降解的酶的一组遗传性代谢障碍。在更特定实施方式中，所述糖原贮积病可以是GSDI(von Gierke's病)、GSDII(庞贝氏病)、GSDIII(科里病)、GSDIV、GSDV、GSDVI、GSDVII、GSDVIII或心脏的致死性先天性糖原贮积病。更具体来说，所述糖原贮积病选自GSDI、GSDII和GSDIII，甚至更特别地选自GSDII和GSDIII。在甚至更特定实施方式中，所述糖原贮积病是GSDII。具体来说，本发明的核酸分子可以在治疗GAA缺陷性病症或与糖原的积累相关的其他病症例如GSDI(von Gierke's病)、GSDII(庞贝氏病)、GSDIII(科里病)、GSDIV、GSDV、GSDVI、GSDVII、GSDVIII和心脏的致死性先天性糖原贮积病，更特别是GSDI、GSDII或GSDIII，甚至更特别是GSDII和GSDIII的基因疗法中有用。在其他特定实施方式中，所述障碍是庞贝氏病，并且所述治疗性转入基因是编码酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)或其变体的基因。这些GAA的变体具体来说被公开在申请PCT/2017/072942、PCT/EP2017/072945和PCT/EP2017/072944中，所述申请整体通过引用并入本文。在这个实施方式中，本发明的核酸序列包含肝选择性、肌肉选择性和/或神经元选择性转录调控元件，例如肝选择性和肌肉选择性转录调控元件、肝选择性和神经元选择性转录调控元件、肌肉选择性和神经元选择性转录调控元件以及肝选择性、肌肉选择性和神经元选择性转录调控元件。在特定实施方式中，所述障碍是婴儿期发作型庞贝氏病(IOPD)或迟发型庞贝氏病(LOPD)。优选地，所述障碍是IOPD。
感兴趣的其他疾病包括但不限于血友病A、MPSI、阿兹海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、图雷特综合症、精神分裂症、Sly病、亨特氏病、痴呆症、偏执狂、强迫症、学习障碍、ALS、腓骨肌萎缩症、肯尼迪病、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、孤独症、高雪氏病、赫尔勒氏病、克腊伯氏病、行为改变(例如睡眠、知觉或认知的障碍)。
本领域技术人员将会认识到在通过基因疗法治疗这些和其他障碍中有用的感兴趣的转入基因。例如，所述治疗性转入基因是：用于血友病A的FVIII，用于MPSI的溶酶体酶α-L-艾杜糖醛酸酶[IDUA(α酶-L-艾杜糖醛酸酶)]，用于庞贝氏病的酸性-α-葡萄糖苷酶(GAA)，用于科里病(GSDIII)的糖原脱支酶(GDE)，用于GSDI的G6P，用于LGMD2D的α-肌聚糖(SGCA)，用于DMD的肌营养不良蛋白或其缩短的形式，和用于SMA的SMN1。所述感兴趣的转入基因也可以是除了提供丢失的蛋白质或抑制给定蛋白质的表达的RNA之外提供其他治疗特性的转入基因。例如，感兴趣的转入基因可以包括但不限于可以提高肌肉强度、可以减少CNS中的凋亡或可以特异性杀死癌细胞的转入基因。
本发明人已显示，使用包含在杂合转录调控元件控制之下的感兴趣的转入基因的载体，本发明具有在以前已经历使用由所述转入基因编码的治疗性蛋白(例如GAA)的ERT的对象中减少已存在的针对所述治疗性蛋白的抗体的有益效果。因此，在特定实施方式中，需要所述治疗的对象是以前已接受用于治疗疾病例如LSD的ERT的对象。在其他特定实施方式中，所述对象通过ERT来治疗LSD或GSD。在其他特定实施方式中，所述对象以前接受使用GAA的ERT用于治疗庞贝氏病。在这个实施方式的包括向以前已接受ERT治疗的对象施用的特定变化形式中，所述对象被进一步用根据本发明的表达盒、载体、细胞或药物组合物，特别是载体例如病毒载体，更特别是AAV载体施用。在特定变化形式中，本发明的核酸是杂合调控元件，其包含能够驱动或增强肝选择性表达的第一调控元件和能够驱动或增强肌肉选择性表达的第二调控元件，特别是包含(i)ApoE增强子与hAAT启动子的组合以及(ii)spC5.12启动子。
因此，本发明涉及本文中所描述的表达盒、载体、细胞或药物组合物，其包含可操作连接到感兴趣的基因的本发明的杂合调控元件，所述感兴趣的基因编码在通过基因疗法治疗疾病中使用的治疗性酶，其中所述对象以前已经历使用同一种酶的ERT。在特定实施方式中，所述对象以前已经历ERT并发展出针对所述被施用的酶的免疫应答。
此外，本文中所描述的表达盒、载体、细胞或药物组合物包含可操作连接到编码治疗性酶的基因的杂合调控元件，其可用于通过减少或消除由以前使用同一种酶施用到所述对象的ERT所诱导的免疫应答来治疗疾病的方法中。
在另一个实施方式中，本发明涉及本文中所描述的表达盒、载体、细胞或药物组合物，其包含可操作连接到编码治疗性酶的基因的本发明的杂合调控元件，与使用同一种酶的ERT相组合用于治疗疾病。在特定实施方式中，所述ERT在本文中所描述的表达盒、载体、细胞或药物组合物之前或之后，特别是之前施用到所述对象。
在其他特定实施方式中，本文中所描述的表达盒、载体、细胞或药物组合物包含可操作连接到编码GAA的基因的本发明的杂合调控元件，并被用于在以前已接受使用GAA的ERT的对象中治疗庞贝氏病的方法中。
应该理解，本发明的表达盒、载体、细胞和药物组合物的所有特定实施方式也包含了所述感兴趣的转入基因是本申请中具体公开的任何治疗性转入基因、优选为酸性-α-葡萄糖苷酶(GAA)的可能性。正如在本申请中别处提到的，GAA可用于治疗庞贝氏病，例如用于治疗婴儿期发作型庞贝氏病(IOPD)或迟发型庞贝氏病(LOPD)。在特定实施方式中，所述感兴趣的转入基因编码包含本源信号肽的野生型GAA蛋白。在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的转入基因编码截短的GAA多肽，其包含从亲代GAA多肽的N-端删除至少一个氨基酸，其中所述亲代多肽对应于不含信号肽的GAA多肽的前体形式。
其中所述截短的GAA多肽与所述亲代GAA多肽相比在其N-端末端具有1至75个连续氨基酸被删除，并且
其中所述截短的GAA多肽还包含融合到其N-端末端的信号肽。
在特定实施方式中，所述截短的GAA多肽与亲代GAA多肽相比在其N-端末端具有1至75个连续氨基酸被删除，特别是与亲代GAA多肽相比在其N-端末端具有6、7、8、9、10、40、41、42、43、44、45或46个连续氨基酸被删除，甚至更特别地与亲代GAA多肽相比在其N-端末端具有8、42或43个连续氨基酸被删除。在特定实施方式中，所述亲代多肽是人类GAA(hGAA)，特别是具有在SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15中、特别是SEQ ID NO：14中示出的氨基酸序列的hGAA，或作为具有在SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15中、特别是SEQ ID NO：14中示出的氨基酸序列的hGAA的有功能的变体的hGAA。在又一个实施方式中，所述截短的GAA多肽具有在SEQ ID NO：16中示出的氨基酸序列。被融合到所述截短的GAA多肽的信号肽可以是在SEQ ID NO：17中示出的GAA的天然信号肽，或选自SEQ ID NO：18至21的可选信号肽，特别是SEQ ID NO：18的信号肽。在特定实施方式中，所述截短的GAA多肽具有SEQ ID NO：16，并被融合到SEQ ID NO：18的信号肽(所述多肽在本申请中也被称为“高度可分泌的GAA蛋白”或“sp7-Δ8-co”或“sec-hGAA”)。这些截短形式的GAA被公开在申请PCT/EP2017/072944中。
本发明的载体的施用方法包括但不限于在WO2015158924中所描述的真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、局部区域施用和口服途径。在特定实施方式中，所述施用通过静脉内或肌肉内途径。本发明的载体可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或快速浓注，通过经上皮或粘膜皮肤衬(如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是系统性或局部的。
在特定实施方式中，可以希望将本发明的药物组合物局部施用到需要治疗的区域例如肝或肌肉。这可以例如利用植入物来实现，所述植入物是多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜例如硅橡胶膜或纤维。
在待治疗的障碍的治疗中有效的本发明的载体的量可以通过标准的临床技术来确定。此外，可以任选地使用体内和/或体外测定法来帮助预测最佳剂量范围。在制剂中使用的精确剂量也取决于施用途径和疾病的严重性，并且应该根据从业人员的判断和每位患者的情况来决定。施用到需要的对象的本发明的载体的剂量随着几种因素而变，所述因素包括但不限于施用途径、治疗的具体疾病、对象的年龄或获得治疗效果必需的表达水平。本领域技术人员可以在本领域知识的基础上，容易地确定基于这些和其他因素所需的剂量范围。在治疗包括向对象施用AAV载体的情况下，所述载体的典型剂量是至少1x108个载体基因组每千克体重(vg/kg)，例如至少1x109vg/kg、至少1x1010vg/kg、至少1x1011vg/kg、至少1x1012vg/kg、至少1x1013vg/kg、至少1x1014vg/kg或至少1x1015vg/kg。
在特定实施方式中，本发明的载体可以以比在基因疗法中使用的典型剂量更低的剂量施用。具体来说，在包括向需要的对象施用AAV载体的治疗中，所述载体可以以比上述典型剂量低至少2倍的剂量施用，特别是以比在基因疗法中通常使用的典型AAV剂量低至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍或甚至至少50倍的剂量施用。在特定实施方式中，这种较低的剂量减少被用于治疗LSD，特别是庞贝氏病。在其他特定实施方式中，所述较低的剂量与包含根据本发明的杂合调控元件的AAV载体一起使用，所述杂合调控元件包含能够驱动或增强肝选择性表达的第一调控元件和能够驱动或增强肌肉选择性表达的第二调控元件，特别是包含(i)ApoE增强子与hAAT启动子的组合以及(ii)spC5.12启动子。
实施例
材料和方法
GAA表达盒和AAV载体
在本研究中使用的GAA转入基因表达盒含有密码子优化的人类GAA(hGAA)编码序列[Puzzo&Colella等，Sci Transl Med.2017Nov29；9(418)]。密码子优化使用商业化算法(Thermo Fisher Scientific)来进行[Puzzo&Colella等，Sci Transl Med.2017Nov 29；9(418)]。使用的hGAA转入基因有两种：1.hGAA，其编码本源hGAA蛋白(hGAA)；或2.sec-hGAA，其编码工程化的高度可分泌的GAA，具有异源信号肽和前肽中8个氨基酸的删除(sp7-Δ8-hGAAco，在文本中简写为sec-hGAA)[Puzzo&Colella等，Sci Transl Med.2017Nov 29；9(418)]。将转入基因序列克隆到AAV载体骨架中，在载脂蛋白E(肝细胞控制区增强子)和人类α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、SPc5.12启动子或CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)的转录控制之下。在本研究中使用的所有DNA序列由GeneCust或Thermo FisherScientific合成。
在本研究中使用的AAV载体按照描述使用HEK293细胞的无腺病毒瞬时转染方法来生产[Puzzo&Colella等，Sci Transl Med.2017Nov29；9(418)]。AAV载体储用物的滴度使用定量实时PCR(qPCR)和SDS-PAGE以及随后的SYPRO Ruby蛋白质凝胶染色和条带光密度测定法来确定。在本研究中使用的所有载体制备物在使用前并排定量。将用于AAV基因组上的qPCR的引物退火到BGH polyA(Fw：tctagttgccagccatctgttgt(SEQ ID NO：8)；Rev：tgggagtggcaccttcca(SEQ ID NO：9)和密码子优化的hGAA(Fw：agatacgccggacattggactg(SEQ ID NO:10)；Rev：gcacgcccagcagattgaac(SEQ ID NO：11))。使用的AAV血清型是在系统性施用到小鼠后显示出相似转导特性的AAV8和AAV9(Zincarelli等，Mol Ther.2008Jun；16(6):1073-80)。
体外实验
将人类肝细胞瘤细胞(HuH7)、小鼠成肌细胞C2细胞(C2)和小鼠NSC34细胞接种在6孔板中(5x 105个细胞/孔)，并使用Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)按照制造商的说明书转染。在转染后72小时，收获细胞和调制的培养基，并进行GAA活性和Western印迹分析。将人类骨骼肌成肌细胞(CSC-C3196，Creative Bioarray)接种在胶原蛋白包被的12孔板上，并在OPTIMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)中用AAV9-hGAA或AAV9-EGFP载体以2x105 vg/细胞的感染复数(MOI)感染2小时。在感染后，将细胞维持在增补有10％胎牛血清和人类成纤维细胞生长因子-2(FGF-2，Miltenyi Biotec)的CreativeBiorray
骨骼肌细胞生长培养基试剂盒(Creative Bioarray)中。将感染重复两次，每次48H；在第二次感染后48小时收获细胞。
小鼠研究
野生型C57BL/6小鼠购自Charles River(Charles River,France)。Gaa-/-小鼠通过外显子6的定向破坏来产生(Raben N.等，J Biol Chem.1998Jul 24；273(30):19086-92)。使用C57BL/6J/129X1/SvJ背景(图5、6、8、9、10、11、12、13、16、17、18)或DBA/2J C57背景(图7、8、14、15)中的Gaa-/-小鼠。使用雄性同窝仔畜受影响的Gaa-/-和未受影响的Gaa+/+小鼠。将AAV载体递送到：1.成年小鼠，通过尾静脉在0.2ml体积中；2.出生后第1-2天的新生小鼠，通过颞静脉在0.03ml体积中。实验组的大小允许进行统计分析；所有动物都被包括在分析中，没有离群值被排除。将小鼠随机指派到实验组，并且进行载体递送和功能分析的操作人员对组的身份不知情。对于免疫根除研究来说，将14只小鼠通过每两周以20mg/kg的剂量静脉内注射rhGAA来处理，总共施用3次。如以前所述，每次rhGAA输注在腹膜内施用25mg/kg抗组胺药(盐酸苯拉海明)后15分钟进行。在最后一次rhGAA施用后2周，测量抗hGAAIgG。将免疫的Gaa-/-小鼠(n＝8)分配到3个AAV9治疗组(2x1012 vg/kg；AAV-Ctrl n＝2，AAV-hAAT n＝3，AAV-LiMP n＝3)。
GAA活性
在小鼠血浆(1/1000-1/2000稀释)和组织中测量GAA活性。将速冻组织在双UltraPureTM无DNase/RNase蒸馏水(Thermo Fisher Scientific)中匀浆。称出50-100mg组织并匀浆，然后以10000x g离心20分钟以手机上清液。使用10μl样品(血浆或组织匀浆液)和20μl底物4MUα-D-葡萄糖苷在96孔板中设立酶反应。将反应混合物在37℃温育1小时，然后通过添加150μl pH 10.5的碳酸钠缓冲液来终止反应。使用EnSpireα读板器(Perkin-Elmer)，在449nm(发射)和360nm(激发)下，使用标准曲线(0-2500pmol/μl的4MU)来计算从各个反应混合物释放的荧光4MU。澄清的上清液的蛋白质浓度通过BCA(Thermo FisherScientific)来定量。为了计算GAA活性，将释放的4MU浓度除以样品蛋白质浓度，并将活性报告为nmol/小时/mg蛋白质。
载体基因组拷贝数分析
使用Nucleospin 8(Macherey-Nagel,France)从组织匀浆液提取DNA并进行定量。使用100ng DNA、在密码子优化的hGAA上退火的引物和探针(Fw：agatacgccggacattggactg(SEQ ID NO：10)；Rev：gcacgcccagcagattgaac(SEQ ID NO：11)；探针gtgtggtcctcttgggagc(SEQ ID NO：12))，通过qPCR来确定载体基因组拷贝数。如以前所述使用Sybergreen或Taqman系统[Puzzo&Colella等，Sci Transl Med.2017Nov 29；9(418)]。将VGCN针对在qPCR中使用的DNA的毫克数进行归一化。为了定量每个二倍体基因组的VGCN，使用GentraPuregene组织试剂盒(Qiagen)从组织匀浆液提取DNA并进行定量。
RNA提取和表达分析
将速冻组织称重，并将50-100mg在Trizol试剂(Thermo Fisher Scientific)中匀浆。使用PureLink RNA小型试剂盒和PureLink DNAse组(Thermo Fisher Scientific)，从组织匀浆液提取总RNA。对RNA进行定量，并使用用于RT-qPCR的Maxima第一链cDNA合成试剂盒和dsDNase(Thermo Scientific)将2-5μg反转录成cDNA；进行RT-minus反应作为阴性对照。对于hGAA RNA表达来说，使用Sybergreen和在密码子优化的hGAA上退火的引物(Fw：agatacgccggacattggactg(SEQ ID NO：10)；Rev：gcacgcccagcagattgaac(SEQ ID NO：11))对cDNA进行qPCR分析；在小鼠肌动蛋白基因上退火的引物被用于归一化hGAA表达(mActinFw：ggctgtattcccctccatcg(SEQ ID NO：22)；mActin Rev：ccagttggtaacaatgccatgt(SEQID NO：23))；小鼠肌动蛋白和β-2微球蛋白(B2m；B2m正向：5’-ggtctttctggtgcttgtctca-3’；B2m反向：5’-gttcggcttcccattctcc-3’)被用于归一化hGAA表达，用于图17中描绘的数据。对于Rtl1表达分析来说，使用TaqMan方法、以前由Chandler和合作者报告的商业化探针和引物(Chandler等，JCI,2015Feb；125(2):870-80)和Maxima ROX qPCR主混合物(ThermoScientific)，对cDNA进行qPCR。TaqMan基因表达测定体系(#4331182，Thermo Scientific)如下：Rtl1(Mm02392620_s1)；Gapdh(Mm 99999915_g1)。
Western印迹分析
使用含有1％Triton-X100和蛋白酶抑制剂(Roche Diagnosis)的10mM PBS(pH7.4)，制备HuH7、C2和NSC34细胞裂解物。对小鼠血浆进行的Western印迹在蒸馏水中1:4稀释的样品上进行。小鼠组织如为GAA活性所指示的来制备。蛋白质浓度使用BCA蛋白质测定法(Thermo Fisher Scientific)来确定。SDS-page电泳在4-15％梯度聚丙烯酰胺凝胶中进行。SDS-page电泳在4-15％梯度聚丙烯酰胺凝胶中进行。在转移后，将膜用Odyssey缓冲液(Li-Cor Biosciences)阻断，并与抗GAA抗体(小鼠单克隆，SantaCruz Biotechnology，或兔单克隆，Abcam)、抗eGFP抗体(小鼠单克隆，Santa Cruz)或抗微管蛋白(小鼠单克隆，Sigma Aldrich)、抗p62抗体(小鼠单克隆，Abcam)、抗帕金抗体(兔多克隆，Abcam)、抗Gapdh抗体(兔多克隆，Thermo Fischer Scientific)温育。将膜清洗并与适合的第二抗体(Li-Cor Biosciences)温育，并通过Odyssey成像系统(Li-Cor Biosciences)可视化。
抗GAA抗体检测
抗GAA抗体测量按照已发表的流程进行。简单来说，将maxisorp 96孔板(ThermoFisher Scientific)用1μg/ml rhGAA包被。通过商品化小鼠(Sigma Aldrich)重组IgG的连续1至2倍稀释液制作IgG标准曲线，所述重组IgG被一式两份直接包被在孔上。使用抗小鼠(Southern biotech)IgG第二抗体作为第二抗体。
功能评估
握力按照已报道的方法来测量。使用握力计(Columbus instruments)，计算四肢强度的三个独立测量值。计算每只小鼠的握力的平均值。
平静呼吸期间的呼吸功能按照已报道的方法来评估[DeRuisseau等，PNAS,2009]。简单来说，使用通流(0.5L/min)体积描记仪(EMKA technologies)在治疗的Gaa-/-小鼠和对照中测量呼吸型态。在数据收集之前，将所述仪器用已知的空气流和压力信号校准。信号使用IOX2软件(EMKA technologies)进行分析。在测试之前允许动物在体积描记仪仓室中适应环境。在适应和数据获取两者期间，小鼠在常氧空气(21％O2，79％N2)中呼吸。
结果
1.多组织启动子在AAV质粒中的克隆
我们从文献选择了基础单一组织转录调控元件，用于评估产生多组织启动子的可能性。
对于肝来说，我们选择了肝细胞限制性载脂蛋白(ApoE)增强子(SEQ ID NO：4)和人类α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子(SEQ ID NO：2)。
对于肌肉来说，我们选择了合成spC5.12肌肉选择性启动子(SEQ ID NO：1)。
对于神经元来说，我们选择了泛神经元人类突触蛋白(hSYN)启动子(SEQ ID NO：3)。
在这些转录调控元件的基础上，我们产生了3种不同的多组织启动子(图1)。
肝增强的-肌肉启动子(被称为Enh.C5.12)，SEQ ID NO：5
这种启动子通过将ApoE肝细胞控制区/增强子克隆在合成spC.12肌肉选择性启动子的上游来产生。
肝-肌肉启动子(LiMP)，SEQ ID NO：6
这种启动子通过将ApoE肝细胞控制区和hAAT启动子克隆在合成spC5.12肌肉选择性启动子的上游来产生。
肝-神经元启动子(LiNeuP)，SEQ ID NO：7
这种启动子通过将ApoE肝细胞控制区和hAAT启动子克隆在hSYN启动子的上游来产生。
将密码子优化的人类GAA转入基因(hGAA)克隆在所有表达盒中(图1和表1)。使用了两种版本的hGAA：本源版本和具有异源信号肽的工程化的高度可分泌的版本(sp7-Δ8-co，被称为sec-hGAA；表1)[Puzzo&Colella等，Sci Transl Med.2017Nov 29；9(418)]。将改进的合成人类β-珠蛋白来源的(HBB2.1)内含子插入在所述启动子与GAA转入基因之间，以使转入基因mRNA稳定(Ronzitti等，Molecular therapy Methods&clinicaldevelopment.2016；3:16049)。在LiMP和LiNeuP表达盒中将HBB2内含子与短的SV40内含子交换(Trapani等，EMBO molecular medicine.2014；6(2):194-211)，以适合AAV DNA包装限制(表1)。
表1.使用的所有GAA表达盒的列表
2.在细胞系中多组织启动子的评估
首先，我们在细胞系中体外测试了所述多组织启动子，并与基础单一组织启动子进行比较(图2-3)。将GAA转入基因的高度可分泌的版本用作模型治疗性基因[Puzzo&Colella等，Sci Transl Med.2017Nov 29；9(418)]。
我们在肝细胞和肌肉细胞系两者中评估了Enh.C5.12和LiMP杂合肝-肌肉启动子驱动sec-hGAA表达的能力(图2A)。为此目的，我们瞬时转染了HuH7人类肝细胞细胞系(图2A)和C2小鼠成肌细胞细胞系(图2B)。然后我们评估了细胞培养基中的GAA酶活性，并通过Western印迹分析评估了细胞裂解物中的蛋白质表达(图2)。在肝细胞中，完整的肝-肌肉启动子LiMP(hAAT+C5.12)但不是Enh.C512与C5.12相比显示出明显更高的活性(图2A)。与C5.12相比，Enh.C512(ApoE+C5.12)事实上提供了酶活性的少量但不显著的提高(图2A)。在肌肉细胞中，LiMP和Enh.C5.12两者与C5.12和hAAT两者相比显示出明显更高的活性(图2A)。这些特点使LiMP成为用于肝-肌肉转入基因强表达的良好候选者。值得注意的是，基于肌肉选择性启动子(spC5.12)与肝细胞选择性调控元件(ApoE/hAAT)的组合，我们在肌肉细胞中使用Enh.C5.12和LiMP发现的提高的转录活性(图2A)是出人意料的。然后，我们评估了肝-神经元LiNeuP启动子(hAAT+hSYN)在肝细胞和神经元细胞系两者中驱动sec-hGAA表达的能力(图1E-H；图2C-D)。为此目的，我们瞬时转染了HuH7肝细胞和NSC34小鼠神经元细胞系(脊髓神经元x成神经细胞瘤杂交细胞系)(图3)。在肝细胞中，我们发现LiNeuP在培养基中产生显著的酶活性并在裂解物中产生显著的蛋白量(图3A)。在神经元细胞中，LiNeuP在培养基中产生显著的酶活性(图3B)，并在细胞裂解物中产生明显的GAA蛋白表达(图3B)。因此，LiNeuP可以在肝细胞和神经元细胞两者中诱导表达，而在这种新的杂合启动子中包含的每种单个启动子只能在肝细胞(对于hAAT来说)或神经元细胞(对于hSYN来说)中驱动表达。概括来说，LiNeuP在肝细胞和神经元细胞两者中驱动转入基因高效表达的能力使它成为有希望的杂合肝-神经元启动子。
3.在动物模型中多组织启动子的评估
为了在体内评估Enh.C5.12、LiMP和LiNeuP启动子的组织选择性和耐受原性特性，我们产生了AAV载体并在C57Bl/6小鼠模型中和庞贝氏病的小鼠模型中进行了基因转移。
I.在野生型B6小鼠中，在系统性AAV基因转移后启动子活性的评估。
为了评估新产生的Enh.C5.12、LiMP和LiNeuP启动子在不同组织中驱动表达的能力，正如设计的，我们产生了血清型9的AAV载体，其在静脉内施用到动物模型后能够感染肝、肌肉和神经元。我们使用本源人类GAA(hGAA)作为转入基因，其是密码子优化的全长GAA。在本研究中，我们将遍在CAG启动子、单一组织启动子(hAAT、C5.12和hSYN)两者与我们的多组织启动子(Enh.C5.12、LiMP和LiNeuP，表2)进行了比较。本研究提供了关于这些启动子向循环提供hGAA的能力和所有启动子在所需组织(肝、心脏、四头肌、脊髓和脑)中的活性的数据。
在静脉内注射编码本源GAA的AAV9载体后一个月，使用C5.12和hSYN启动子时循环GAA蛋白非常低或者勉强可检测，而在使用多组织启动子Enh.C5.12、LiMP和LiNeuP启动子时它被清楚地检测到(图4A)。结果在那些被产生以向循环提供hGAA蛋白用于治疗性交叉校正的启动子中，LiMP和LiNeuP是性能最好的杂合启动子(图4A)。
在治疗后6周从被治疗的小鼠收集小鼠组织，用于RNA表达分析(图4B)。在肝、心肌(心脏)、骨骼肌(四头肌)和CNS(脊髓和脑)中评估了hGAA RNA的表达。将hGAA表达针对参比小鼠基因(肌动蛋白)的表达进行归一化。图4B示出了在分析的所有组织中hGAA mRNA的相对表达。正如在体外观察到的(图2A-B)，hAAT启动子在肝中有活性但在肌肉(心脏和四头肌)中无活性，而C5.12启动子在在肌肉中有活性但在肝中无活性。值得注意的是，我们发现多组织启动子LiMP能够在肝和肌肉两者中驱动高效的转入基因表达，表明它是杂合肝-肌肉启动子(图4B)。不同的是，Enh.C5.12启动子能够在肌肉中驱动高表达，但在肝中驱动低表达。事实上，在肝中，Enh.C5.12与hAAT相比提供明显更低的转入基因表达，并且与C5.12启动子相比提供略微更高但不显著的表达(图4B)。因此，当需要在肌肉中强表达并在肝中弱表达时，可以使用Enh.C5.12。正如我们在体外观察到的(图3)，肝-神经元启动子LiNeuP能够在肝和CNS两者中驱动GAA的高表达(图4B)。重要的是。我们确认了基础hAAT和hSYN启动子分别在CNS和肝中无活性(图4B)。值得注意的是，LiMP和LiNeuP的组织选择性得以保留，因为它们分别在神经元和肌肉中仍然无活性(图4B)。总的来说，所述hGAA转入基因表达数据清楚地显示了能够驱动多组织选择性转入基因表达的杂合启动子的产生。正如预期，在被分析的组织中的载体基因组拷贝数(VGCN)分析显示，在静脉内注射到小鼠中之后，大多数AAV载体转导到肝(Zincarelli等，Mol Ther.2008Jun；16(6):1073-80)。在不同载体之间没有观察到VGCN的显著差异(图4B)。
表2.在研究I中体内评估的启动子
II.在庞贝氏病的小鼠模型(Gaa-/-)中，在系统性AAV基因转移后肝/肌肉启动子的活性和耐受原性特性的评估。
在本研究中，我们将肝和肌肉单一组织启动子(hAAT和C5.12)与我们的多组织肝+肌肉启动子(Enh.C5.12、LiMP)驱动本源(hGAA)和高度可分泌的(sec-hGAA)GAA蛋白两者的表达进行了比较(表3)。Gaa-/-小鼠被用于模拟庞贝氏病的病理生理学。我们和其他人以前报道了在Gaa-/-肌肉中本源GAA的表达诱导了针对所述蛋白质的强烈体液免疫应答[Puzzo&Colella等，Sci Transl Med.2017Nov 29；9(418)]，Zhang等，Hum GeneTher.2012May；23(5):460-72)。随后，我们最近报道了高度可分泌的GAA蛋白的免疫原性低于本源GAA[Puzzo&Colella等，Sci Transl Med.2017Nov 29；9(418)]。因此，本研究提供了关于新开发的杂合肝-肌肉启动子(Enh.C5.12和LiMP)在分别利用本源和高度可分泌的GAA形式提供的高和低免疫原性的背景中的耐受原性特性的数据。出于治疗目的还评估了所述启动子在循环中提供GAA的能力。当我们将表达具有免疫原性的本源GAA蛋白(hGAA)的AAV递送到Gaa-/-小鼠时，我们观察到由在研究I中显示的在肌肉中表达最高的启动子C5.12和Enh.C5.12(图4B)驱动的GAA表达，引起针对所述蛋白质的体液免疫应答(图5A)。值得注意的是，杂合肝-肌肉LiMP启动子的使用显著阻止了抗hGAA免疫应答的诱导(图5A)。这些数据证明由LiMP提供的强烈的GAA肝表达(正如在研究I中报道的，图4B)诱导了针对hGAA的免疫耐受(图5A)。小鼠血浆中的GAA酶活性证实了出于治疗性目的，杂合Enh.C5.12和LiMP启动子与C5.12相比向循环提供更高的GAA蛋白水平(图5B)。
接下来，肌肉作为具有高度免疫原性的组织，我们试验了使用LiMP启动子的AAV基因转移是否能够根除已存在的抗转入基因体液免疫应答。为此目的，我们通过三次以20mg/kg的剂量静脉内注射重组人类GAA(rhGAA)将Gaa-/-小鼠免疫(图6A)。随后，在两周后，我们测量了血浆中的抗GAA IgG，并用AAV9-LiMP-hGAA载体通过静脉内递送来治疗所述免疫的小鼠(图6B)。AAV9-hAAT-hGAA载体被用作耐受原性对照。在AAV治疗(剂量为2x1012vg/kg)后6周，在用LIMP和hAAT载体但不是用表达萤光素酶的对照AAV载体治疗的小鼠中，抗hGAAIgG显著减少(图6B)。
总的来说，这些结果表明使用具有强的肝表达组件的双重启动子的AAV基因转移导致占优势的转入基因免疫耐受。
表3.在研究II中体内评估的启动子
III.在通过系统性AAV基因转移的成年Gaa-/-小鼠中杂合肝-肌肉和肝/神经元启动子的耐受原性特性和治疗效能的评估。
基于我们以前的数据(图2-5)，在本研究中我们试验了使用性能最佳的耐受原性多组织启动子(LiMP和LiNeuP)来挽救Gaa-/-小鼠的全身疾病表型的优点。具体来说，我们评估了在肝选择性hAAT启动子、肝-肌肉LiMP启动子和肝-神经元LiNeuP启动子控制之下表达高度可分泌的GAA蛋白(sp7-Δ8-co，被称为sec-hGAA)的AAV载体的治疗效能(表4)。在遍在CAG启动子控制之下表达sec-hGAA的AAV载体被用作对照。在庞贝氏病的情形中，可分泌的GAA从肝表达进入循环将允许通过蛋白质摄取靶向其他组织。然而，在骨骼肌和神经元中GAA摄取受到下述因素限制：1.细胞表面上低水平的GAA受体，和2.损害GAA靶向溶酶体的自噬阻断；然后，由血脑屏障施加的尺寸限制显著限制了GAA向CNS的生物分布。
根据上文报道的我们的结果，我们预期，通过在肝和其他受影响的组织中共表达GAA，我们将实现比仅仅靶向肝更高的治疗效能。重要的是，我们在研究III中显示，由于我们新的多组织启动子，肝靶向提供了对所表达的GAA转入基因的免疫耐受(请参见图5A)。在研究III中，循环中的sec-hGAA蛋白水平和针对GAA的体液免疫应答的分析证实，在不存在体液免疫应答的情况下，LiMP和LiNeuP启动子与hAAT相比提供相近的GAA水平(图7，上图)(图7，抗GAA IgG水平指示在western印迹照片下方)。值得注意的是，当使用遍在CAG启动子时观察到针对GAA的强烈免疫应答(图7，上图)。与hAAT、LiMP和LiNeuP相比，CAG启动子也提供明显更少量的循环GAA(图7，下图)。这些数据证明，根据本发明的杂合的基于肝的多组织启动子优于遍在启动子。值得注意的是，由也引起在肝中的表达的CAG启动子驱动的遍在GAA表达不必然导致针对所述转入基因产物的免疫耐受，而接受LiMP和LiNeuP驱动的GAA载体的所有小鼠的血浆不含可检测的抗GAA IgG。上述结果令人吃惊地显示，仔细选择的多组织选择性启动子在几种感兴趣的组织中引起转入基因表达并引起免疫耐受，这与使用肌肉选择性启动子或遍在启动子可以实现的结果形成对比。
在这些有希望的结果的基础上，我们随后在Gaa-/-小鼠中评估了在LiMP和LiNeuP启动子控制之下表达sec-hGAA的AAV载体的治疗效能。循环中的GAA酶活性证实了GAA从所有试验的AAV表达(图8A)。与未受影响的Gaa+/+小鼠(Ctrl，图8B)相比，在未治疗的Gaa-/-小鼠中肌肉强度明显降低(Ctrl，图8B)。值得注意的是，用使用LiMP和LiNeuP的AAV-sec-hGAA基因疗法治疗的Gaa-/-小鼠与未受影响的Gaa+/+相比没有显示出肌肉强度的显著差异(图8B)。值得注意的是，与未治疗的Gaa-/-小鼠(Ctrl，图8B)相比，在用AAV-LiNeuP载体治疗的Gaa-/-小鼠中也观察到显著的挽救。与未治疗的Gaa-/-小鼠(Ctrl)相比，在用在LiMP和LineUP启动控制之下子表达sec-hGAA的AAV治疗的Gaa-/-小鼠中呼吸功能显著改善，并与Gaa+/+动物相当(图8C、D)。
表4.在研究III中体内评估的启动子
IV.在新生Gaa-/-小鼠中通过系统性AAV基因转移进行的肝/肌肉启动子LiMP的治疗效能的评估。
在本研究中，我们试验了使用肝-肌肉耐受原性多组织启动子LiMP的优点，以确定在可能引起来自于肝的AAV基因组和治疗效能的稀释的肝细胞增殖的条件下[Wang等，HumGene Ther.2012May；23(5):533-9]，是否可以实现持久的GAA表达和治疗效能。为此目的，我们用AAV载体注射Gaa-/-小鼠，模拟了在出生后早期阶段中庞贝氏病对象的治疗。在生命的第一个月中的治疗性干预，对表现出疾病的婴儿期形式[婴儿期发作型PD(IOPD)]的PD对象来说是重要的医学需要[Chien等，Pediatr Neonatol.2013Aug；54(4):219-27]。值得注意的是，在许多国家中PD的新生儿筛查已被批准，并且可以促进及时的治疗性干预。具体来说，我们在这里评估了从单一组织启动子[肌肉(C5.12)和肝(hAAT)]表达高度可分泌的GAA蛋白(sp7-Δ8-co，被称为sec-hGAA)与LiMP启动子相比的优点(表5)，后者在肝和肌肉两者中提供GAA表达(正如在研究I中所观察到的，图4B)并向循环提供治疗性酶(研究I，图4A)。
在用AAV-sec-hGAA载体治疗新生Gaa-/-小鼠后3个月循环中的GAA蛋白的分析显示，使用hAAT和LiMP启动子获得了相近的蛋白量，这与肝增殖对两种AAV基因组的影响相符(图9)。值得注意的是，由肌肉启动子C5.12提供的循环GAA明显低于由hAAT和LiMP启动子所提供的(图9A-B)。与AAV-C5.12或AAV-hAAT载体相比，在用AAV-LiMP治疗的Gaa-/-小鼠的心脏、膈肌、三头肌和四头肌中，心肌和骨骼肌中的GAA活性也明显更高(图9C-F)。值得注意的是，与C5.12和hAAT载体相比，在用LiMP载体治疗的Gaa-/-小鼠的肌肉(例如三头肌)和CNS(脊髓)中治疗性GAA蛋白的量明显更高(图10A-B)。与用C5.12载体治疗的Gaa-/-小鼠相比，在用LiMP载体治疗的Gaa-/-小鼠中观察到脑中(图10C)明显更高的GAA蛋白。这个结果反映出LiMP启动子的杂合转录活性，其允许转入基因从肝表达(图10D)，与肌肉中的内源转入基因表达一起用于交叉校正(图10E)。值得注意的是，由于hAAT和LiMP载体向循环提供相近量的酶(图9A-B)，因此在肌肉(图10A)和脊髓(图10B)中使用LiMP实现的较高表达是肌肉中内源转入基因表达的结果(图10E)。重要的是，仅仅通过用编码在LiMP启动子控制之下的sec-hGAA的AAV治疗，Gaa-/-小鼠中的肌肉强度得以显著保留(图11)。这是GAA分泌到循环中的结果(图9A-B)，并且肌肉中的高GAA表达(图9C-D-F和图10A)只能通过使用杂合LiMP启动子而不能通过使用单一组织C5.12和hAAT启动子来实现。
以前已报到，向新生小鼠的系统性AAV基因转移引起载体基因组的一部分整合在肝基因组DNA中(Chandler等，JCI,2015Feb；125(2):870-80)。只有在使用CAG和TBG但不是hAAT启动子时，大多数整合发生在小鼠特异性基因组热点(Rian基因座)中，促进肝基因毒性和肝细胞癌(HCC)的发生(Chandler等，JCI,2015Feb；125(2):870-80)。这是由于CAG和TBG启动子的强反式激活活性，其诱导接近Rian的HCC相关Rtl1基因的上调(Chandler等，JCI,2015Feb；125(2):870-80)。值得注意的是，我们发现与未治疗的和AAV-hAAT治疗的Gaa-/-小鼠两者相比，在作为新生儿用AAV-LiMP载体治疗的Gaa-/-小鼠中Rian RNA未被上调(图12)。与未治疗的Gaa-/-小鼠相比，在用AAV-C5.12载体治疗的Gaa-/-小鼠中也未观察到显著的Rtl1反式激活(图12)。因此，在我们的杂合LiMP和LiNeUP启动子中使用hAAT启动子和在LiMP中使用C5.12启动子，为我们的用于体内基因疗法的杂合调控元件提供了另外的有利特点。
随后，不同于遍在启动子，本发明阻止了在生理上不表达感兴趣的治疗性转入基因或不需要表达感兴趣的转入基因的组织中的异位转入基因表达。因此，本发明也可以阻止最近在临床前研究中，在通过以高剂量注射并含有遍在鸡β肌动蛋白启动子的AAV载体的系统性递送治疗的非人类灵长动物中报道的可能的毒性(Hinderer等，Hum GeneTher.2018Feb 12.)。
表5.在研究IV中体内评估的启动子
V.在低载体剂量下肝/肌肉启动子LiMP在新生Gaa-/-小鼠中提供持续治疗效能的能力的评估。
接下来，我们想知道在新生Gaa-/-小鼠中使用LiMP-sec-hGAA载体的AAV基因疗法是否可以在低载体剂量下产生治疗效能[1.2x1010vg/幼崽(6x1012vg/kg)；图13]。在研究结束时(治疗后4个月)，在用LiMP和hAAT载体治疗的Gaa-/-小鼠中血流中的酶量没有差异(图13A-B)。肝中的hGAA RNA表达的分析也显示出在LiMP与hAAT启动子之间没有显著差异。相反，与hAAT相比，在使用LiMP治疗的Gaa-/-小鼠的心脏(图13C)、膈肌(图13D)、四头肌(数据未示出)和三头肌(图13E)中GAA活性明显更高。LiMP启动子的使用也在AAV治疗的Gaa-/-小鼠中在三头肌(作为代表性肌肉)和脊髓(图13F)中产生更大量的hGAA蛋白。当使用LiMP和hAAT启动子时，没有发现脑hGAA量的差异(图13G)。
与未治疗的(Ctrl)和hAAT治疗的Gaa-/-小鼠两者相比，在用LiMP载体治疗后，在Gaa-/-小鼠的心脏(图13H)、膈肌(图13I)、四头肌(数据未示出)和三头肌(图13J)中糖原显著减少。与未治疗的Gaa-/-小鼠(Ctrl)相比，在所有AAV治疗的Gaa-/-小鼠中观察到脊髓和脑中显著的糖原减少，尽管水平仍然不同于未受影响的Gaa+/+(图13K)。值得注意的是，与未治疗的Gaa-/-小鼠相比，仅在用LiMP载体治疗的Gaa-/-小鼠中观察到心脏肥大(图13L)和肌肉强度(图13M)的显著挽救。肝和四头肌中的VGCN显示出相似水平的组织转导(数据未示出)。
在用过ELISA测定法每月分析的AAV治疗的Gaa-/-小鼠的血浆中，没有检测到针对hGAA的IgG(表6)。
表6：
aAAV剂量：6x1012vg/kg(1.2x1010vg/幼崽)
c平均值±SD
b小鼠的数目
正如在用AAV8载体治疗的Gaa-/-小鼠中观察到的(图12)，与未治疗的Gaa-/-小鼠相比，在用含有hAAT或LiMP启动子的AAV9载体治疗的Gaa-/-小鼠的肝中没有观察到对Rtl1癌基因的显著反式激活活性。
总的来说，这些结果显示在新生动物中，在以低剂量进行系统性AAV肝基因疗法后，双重肝-肌肉启动子LiMP与hAAT启动子相比允许实现优越的治疗效能。
VI.在新生Gaa-/-小鼠中，在系统性AAV基因转移后肝/肌肉启动子LiMP向肌肉提供的GAA的水平与强遍在启动子没有差异。
在本盐焗中，我们评估了在新生Gaa-/-小鼠中，在系统性AAV基因转移后，使用肝-肌肉LiMP和肝-神经元LiNeuP启动子与强遍在启动子相比向肌肉提供的GAA的量。如上所示，在这种设置中，肝细胞增殖引起来自于肝的AAV基因组和治疗效能的稀释[Wang等，HumGene Ther.2012May；23(5):533-9]。我们用编码来自于遍在启动子CAG[CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)启动子]的高度可分泌的GAA蛋白(sp7-Δ8-co，被称为sec-hGAA)的AAV载体注射Gaa-/-小鼠，并与LiMP和LiNeuP启动子进行比较(表7)；单一肝启动子hAAT被用作对照(表7)。
在用AAV-sec-hGAA载体治疗新生Gaa-/-小鼠后4个月骨骼肌(三头肌，图14)中GAA蛋白的分析显示，使用CAG和LiMP启动子获得了相近的蛋白量，它们均高于使用hAAT和LiNeuP获得的蛋白量。这与肝增殖对AAV基因组的影响(这在小鼠生长后显著丧失)和hAAT和LiNeuP在肌肉中缺少转录活性(图14)相一致。
表7.在研究VI和VII中体内评估的启动子
VII.在新生儿AAV基因转移后，肝/肌肉启动子LiMP使Gaa-/-小鼠的肌肉中的自噬和线粒体自噬恢复正常。
在本研究中，我们评估了作为新生儿通过系统性AAV基因转移治疗的Gaa-/-小鼠的肌肉中p62(自噬阻断的标志物)和帕金蛋白(线粒体自噬的标志物)的正常化。为此目的，我们用编码来自于肝-肌肉启动子LiMP的高度可分泌的GAA蛋白(sp7-Δ8-co，被称为sec-hGAA)的AAV载体注射Gaa-/-小鼠，并与单一肝启动子hAAT进行比较。正如从上文报道的数据预期的，在新生Gaa-/-小鼠治疗后4个月，与hAAT相比，在用LiMP治疗的小鼠的三头肌中GAA蛋白更高(图15A-B)。其次，与未受影响的Gaa+/+相比，在未治疗的Gaa-/-小鼠的三头肌中p62增加，反映出自噬阻断(图15C)。值得注意的是，在用LiMP但不是hAAT载体治疗的Gaa-/-小鼠的三头肌中p62含量恢复正常(图15A、B)。相反，与未受影响的Gaa+/+相比，在未治疗的Gaa-/-小鼠的三头肌中帕金蛋白量显著减少(图15A、C)，反映出线粒体自噬受损。值得注意的是，在用LiMP载体但不是hAAT载体治疗后，Gaa-/-小鼠的三头肌中帕金蛋白量恢复正常(图15A、C)。
图15和16中描绘的小鼠的肝和三头肌中载体基因组拷贝数(VGCN)的分析显示出没有显著差异，例外的是CAG载体，对于其来说在肝中存在明显更高的VCGN(图16A-B)。
VIII.在系统性AAV基因疗法后小鼠中LiMP和LiNeuP启动子的特异性
通过在非靶组织例如肾、肺和脾中观察到低活性或无活性，确认了肝-肌肉启动子LiMP和肝-神经元启动子LiNeuP的特异性(图17A-B)。在肺中，使用LiMP启动子时观察到的一些可检测的hGAA mRNA表达可能源自于在平滑肌细胞中的启动子活性(图17B)。正如预期的，与其他组织相比，在肝中VGCN更高(图17C-D)。
总的来说，hGAA mRNA表达数据显示杂合启动子LiMP和LiNeuP在靶组织中驱动高效且特异的转入基因表达(图17)。
IX.在Gaa-/-小鼠中具有强烈肝活性的杂合启动子阻止针对hGAA的免疫应答的发生。
已报道，由遍在或肌肉特异性启动子驱动的本源hGAA向Gaa-/-小鼠的基因转移诱导了针对hGAA蛋白的不想要的体液免疫应答[Falk等，Mol Ther Methods Clin Dev.2015,Mar 25；2:15007；Franco等，Mol Ther.2005Nov；12(5):876-84]。相反，我们[Puzzo等，SciTransl Med.2017Nov 29；9(418)]和其他人[Franco等，Mol Ther.2005Nov；12(5):876-84]显示了将本源hGAA转入基因表达局限到肝细胞阻止了抗hGAA免疫的发生，并提供了针对所述转入基因产物的稳定的免疫耐受。为了评估本发明的杂合肝-肌肉和肝-神经元启动子的免疫学特性，我们将编码本源hGAA的AAV9载体系统性递送到有免疫能力的Gaa-/-小鼠(载体剂量：2x1012 vg/kg)并评估抗hGAA体液免疫应答(图18)。在这些实验中特别使用了成年Gaa-/-小鼠，因为已报道新生动物更易于发生促耐受原性应答。在治疗后的早期时间点，在用Enh.C5.12载体以及对照CAG和C5.12载体治疗的小鼠中诱导了高的抗hGAA IgG(图18A)。相反，在用LiMP、LiNeuP和对照hAAT载体治疗的小鼠中在早期时间点测量到的抗hGAA IgG(图18A)是低或不存在的，并显著不同于在CAG组群中测量到的(图18A)。杂合启动子LiMP和LiNeuP的使用阻止了抗hGAA IgG的长期诱导(图18B)。相反，在C5.12组群中抗hGAA IgG随时间增加，产生与在其他组群中测量到的相比明显更高的水平(图18B)。与C5.12相比使用Enh.C5.12观察到的降低的体液免疫应答表明通过使用ApoE增强子在肝中实现的提高的转入基因表达(图4B，肝)允许长期降低抗GAA免疫力(图5A，图18)。有趣的是，这些数据表明由CAG和Enh.C5.12启动子决定的肝转入基因表达可能降低但不阻止抗hGAA体液免疫应答(图18A-B)。VGCN显示出载体基因组对肝转导没有重要影响(图18C)。
X.肝/肌肉LiMP启动子在人类成肌细胞中的体外转录活性
在人类成肌细胞中进一步体外证实了肝/肌肉启动子LiMP的转录活性(图19)。
VI.结论：
在本研究中，我们显示了杂合调控元件允许克服由AAV基因转移介导的转入基因表达的持久性限制。具体来说，我们证实了在作为新生儿治疗的Gaa-/-小鼠中，与单一组织启动子(肝特异性hAAT或肌肉特异性C5.12)相比，使用LIMP启动子的系统性AAV基因疗法产生了优越的治疗效能。在这个模型中，我们观察到包括全身病理性糖原积累的清除和心脏肥大和肌肉强度的显著挽救在内的疾病表型的长期完全挽救。这些结果是使用比目前在其他研究中在新生动物中使用的和在正在进行的其他致死性神经肌肉疾病的临床试验中使用的剂量低10-50倍的AAV载体剂量获得的。这些发现支持了这种AAV基因疗法将来向婴儿期发作型庞贝氏病的应用。在其有利的安全性和效能特性的基础上，双重启动子在用于治疗具有系统性多器官参与和早期致死的几种其他疾病的基于基因的疗法的开发中可能提供显著优势。
序列表
<110> 吉尼松公司（GENETHON）等
<120> 杂合调控元件
<130> B2684PC00
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 358
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> spC5.12启动子
<400> 1
caccgcggtg gcggccgtcc gccctcggca ccatcctcac gacacccaaa tatggcgacg 60
ggtgaggaat ggtggggagt tatttttaga gcggtgagga aggtgggcag gcagcaggtg 120
ttggcgctct aaaaataact cccgggagtt atttttagag cggaggaatg gtggacaccc 180
aaatatggcg acggttcctc acccgtcgcc atatttgggt gtccgccctc ggccggggcc 240
gcattcctgg gggccgggcg gtgctcccgc ccgcctcgat aaaaggctcc ggggccggcg 300
gcggcccacg agctacccgg aggagcggga ggcgccaagc tctagaacta gtggatct 358
<210> 2
<211> 397
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> hAAT启动子
<400> 2
gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag tgagagcaga gggccagcta 60
agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc ctccaccttg gacacaggac 120
gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca 180
ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact 240
tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct 300
cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct 360
cagcttcagg caccaccact gacctgggac agtgaat 397
<210> 3
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> hSYN启动子
<400> 3
tgcagagggc cctgcgtatg agtgcaagtg ggttttagga ccaggatgag gcggggtggg 60
ggtgcctacc tgacgaccga ccccgaccca ctggacaagc acccaacccc cattccccaa 120
attgcgcatc ccctatcaga gagggggagg ggaaacagga tgcggcgagg cgcgtgcgca 180
ctgccagctt cagcaccgcg gacagtgcct tcgcccccgc ctggcggcgc gcgccaccgc 240
cgcctcagca ctgaaggcgc gctgacgtca ctcgccggtc ccccgcaaac tccccttccc 300
ggccaccttg gtcgcgtccg cgccgccgcc ggcccagccg gaccgcacca cgcgaggcgc 360
gagatagggg ggcacgggcg cgaccatctg cgctgcggcg ccggcgactc agcgctgcct 420
cagtctgcgg tgggcagcgg aggagtcgtg tcgtgcctga gagcgcag 468
<210> 4
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ApoE增强子
<400> 4
aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60
ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120
tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180
cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240
tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300
ggtttaggta gtgtgagagg g 321
<210> 5
<211> 683
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Enh.C5.12
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(321)
<223> ApoE增强子
<220>
<221> misc_feature
<222> (322)..(325)
<223> 连接物
<220>
<221> misc_feature
<222> (326)..(683)
<223> spC5.12启动子
<400> 5
aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60
ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120
tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180
cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240
tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300
ggtttaggta gtgtgagagg ggtaccaccg cggtggcggc cgtccgccct cggcaccatc 360
ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt ttagagcggt 420
gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg gagttatttt 480
tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg tcgccatatt 540
tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct cccgcccgcc 600
tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag cgggaggcgc 660
caagctctag aactagtgga tct 683
<210> 6
<211> 1121
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LiMP
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(321)
<223> ApoE增强子
<220>
<221> misc_feature
<222> (322)..(330)
<223> 连接物
<220>
<221> misc_feature
<222> (331)..(727)
<223> hAAT启动子
<220>
<221> misc_feature
<222> (728)..(763)
<223> 连接物
<220>
<221> misc_feature
<222> (764)..(1121)
<223> spC5.12启动子
<400> 6
aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60
ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120
tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180
cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240
tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300
ggtttaggta gtgtgagagg ggtacccggg gatcttgcta ccagtggaac agccactaag 360
gattctgcag tgagagcaga gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc 420
acgccacccc ctccaccttg gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact 480
cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag 540
gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg 600
gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta 660
aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac 720
agtgaataga tcctgagaac ttcagggtga gtctatggga ccccaccgcg gtggcggccg 780
tccgccctcg gcaccatcct cacgacaccc aaatatggcg acgggtgagg aatggtgggg 840
agttattttt agagcggtga ggaaggtggg caggcagcag gtgttggcgc tctaaaaata 900
actcccggga gttattttta gagcggagga atggtggaca cccaaatatg gcgacggttc 960
ctcacccgtc gccatatttg ggtgtccgcc ctcggccggg gccgcattcc tgggggccgg 1020
gcggtgctcc cgcccgcctc gataaaaggc tccggggccg gcggcggccc acgagctacc 1080
cggaggagcg ggaggcgcca agctctagaa ctagtggatc t 1121
<210> 7
<211> 1231
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LiNeuP
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(321)
<223> ApoE增强子
<220>
<221> misc_feature
<222> (322)..(330)
<223> 连接物
<220>
<221> misc_feature
<222> (331)..(727)
<223> hAAT启动子
<220>
<221> misc_feature
<222> (728)..(763)
<223> 连接物
<220>
<221> misc_feature
<222> (764)..(1231)
<223> hSYN启动子
<400> 7
aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60
ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120
tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180
cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240
tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300
ggtttaggta gtgtgagagg ggtacccggg gatcttgcta ccagtggaac agccactaag 360
gattctgcag tgagagcaga gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc 420
acgccacccc ctccaccttg gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact 480
cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag 540
gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg 600
gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta 660
aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac 720
agtgaataga tcctgagaac ttcagggtga gtctatggga ccctgcagag ggccctgcgt 780
atgagtgcaa gtgggtttta ggaccaggat gaggcggggt gggggtgcct acctgacgac 840
cgaccccgac ccactggaca agcacccaac ccccattccc caaattgcgc atcccctatc 900
agagaggggg aggggaaaca ggatgcggcg aggcgcgtgc gcactgccag cttcagcacc 960
gcggacagtg ccttcgcccc cgcctggcgg cgcgcgccac cgccgcctca gcactgaagg 1020
cgcgctgacg tcactcgccg gtcccccgca aactcccctt cccggccacc ttggtcgcgt 1080
ccgcgccgcc gccggcccag ccggaccgca ccacgcgagg cgcgagatag gggggcacgg 1140
gcgcgaccat ctgcgctgcg gcgccggcga ctcagcgctg cctcagtctg cggtgggcag 1200
cggaggagtc gtgtcgtgcc tgagagcgca g 1231
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 8
tctagttgcc agccatctgt tgt 23
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 9
tgggagtggc accttcca 18
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 10
agatacgccg gacattggac tg 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 11
gcacgcccag cagattgaac 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 12
gtgtggtcct cttgggagc 19
<210> 13
<211> 612
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> E-Syn启动子
<400> 13
cactacgggt ctaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg 60
gttataatta accccaacac ctgctgcccc ccccccccca acacctgctg cctgagcctg 120
agcggttacc ccaccccggt gcctgggtct taggctctgt acaccatgga ggagaagctc 180
gctctaaaaa taaccctgtc cctggtggcg cgccgagctc caccgcggtg gcggccgtcc 240
gccctcggca ccatcctcac gacacccaaa tatggcgacg ggtgaggaat ggtggggagt 300
tatttttaga gcggtgagga aggtgggcag gcagcaggtg ttggcgctct aaaaataact 360
cccgggagtt atttttagag cggaggaatg gtggacaccc aaatatggcc caaatatggc 420
gacggttcct cacccgtcgc catatttggg tgtccgccct cggccggggc cgcattcctg 480
ggggccgggc ggtgctcccg cccgcctcga taaaaggctc cggggccggc ggcggcccac 540
gagctacccg gaggagcggg aggcgccaag ctctagaact agtggatccc ccgggctgca 600
ggaattcgat at 612
<210> 14
<211> 925
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hGAA多肽(wt w/o sp)
<400> 14
Gly His Ile Leu Leu His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser
1 5 10 15
Gly Ser Ser Pro Val Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly
20 25 30
Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro
35 40 45
Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp
50 55 60
Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly
65 70 75 80
Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly
85 90 95
Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu
100 105 110
Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr
115 120 125
Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val
130 135 140
Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala
145 150 155 160
Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg
165 170 175
Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly
180 185 190
Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr
195 200 205
Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser
210 215 220
Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu
225 230 235 240
Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu
245 250 255
Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu
260 265 270
Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser
275 280 285
Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg
290 295 300
Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro
305 310 315 320
Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met
325 330 335
Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser
340 345 350
Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His
355 360 365
Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg
370 375 380
Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met
385 390 395 400
Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp
405 410 415
Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp
420 425 430
Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro
435 440 445
Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr
450 455 460
Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His
465 470 475 480
Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser
485 490 495
Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu
500 505 510
Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala
515 520 525
Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu
530 535 540
His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu
545 550 555 560
Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe
565 570 575
Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser
580 585 590
Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn
595 600 605
Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly
610 615 620
Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe
625 630 635 640
Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu
645 650 655
Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu
660 665 670
Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln
675 680 685
Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe
690 695 700
Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly
705 710 715 720
Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val
725 730 735
Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro
740 745 750
Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu
755 760 765
Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu
770 775 780
Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln
785 790 795 800
Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu
805 810 815
Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp
820 825 830
Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln
835 840 845
Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg
850 855 860
Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu
865 870 875 880
Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val
885 890 895
Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val
900 905 910
Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys
915 920 925
<210> 15
<211> 925
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 变体hGAAwt w/o sp
<400> 15
Gly His Ile Leu Leu His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser
1 5 10 15
Gly Ser Ser Pro Val Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly
20 25 30
Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro
35 40 45
Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp
50 55 60
Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly
65 70 75 80
Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly
85 90 95
Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu
100 105 110
Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr
115 120 125
Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val
130 135 140
Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala
145 150 155 160
Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg
165 170 175
Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly
180 185 190
Val Ile Val His Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr
195 200 205
Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser
210 215 220
Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu
225 230 235 240
Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu
245 250 255
Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu
260 265 270
Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser
275 280 285
Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg
290 295 300
Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro
305 310 315 320
Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met
325 330 335
Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser
340 345 350
Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His
355 360 365
Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg
370 375 380
Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met
385 390 395 400
Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp
405 410 415
Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp
420 425 430
Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro
435 440 445
Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr
450 455 460
Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His
465 470 475 480
Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser
485 490 495
Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu
500 505 510
Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala
515 520 525
Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu
530 535 540
His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu
545 550 555 560
Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe
565 570 575
Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser
580 585 590
Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn
595 600 605
Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly
610 615 620
Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe
625 630 635 640
Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu
645 650 655
Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu
660 665 670
Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln
675 680 685
Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe
690 695 700
Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly
705 710 715 720
Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val
725 730 735
Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro
740 745 750
Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu
755 760 765
Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu
770 775 780
Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln
785 790 795 800
Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu
805 810 815
Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp
820 825 830
Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln
835 840 845
Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg
850 855 860
Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu
865 870 875 880
Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val
885 890 895
Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val
900 905 910
Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys
915 920 925
<210> 16
<211> 917
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hGAA-Δ-8
<400> 16
Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val Leu Glu Glu
1 5 10 15
Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp
20 25 30
Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp
35 40 45
Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr
50 55 60
Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln
65 70 75 80
Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro
85 90 95
Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly
100 105 110
Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp
115 120 125
Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu
130 135 140
His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu
145 150 155 160
Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val
165 170 175
Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp
180 185 190
Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp
195 200 205
Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly
210 215 220
Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg
225 230 235 240
Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala
260 265 270
His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln
275 280 285
Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val
290 295 300
Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu
305 310 315 320
Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe
325 330 335
His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val
340 345 350
Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn
355 360 365
Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp
370 375 380
Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly
385 390 395 400
Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro
405 410 415
Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe
420 425 430
Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly
435 440 445
Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp
450 455 460
Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met
465 470 475 480
Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp
485 490 495
Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val
500 505 510
Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln
515 520 525
Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu
530 535 540
Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro
545 550 555 560
Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly
565 570 575
His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser
580 585 590
Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly
595 600 605
Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val
610 615 620
Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn
625 630 635 640
Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala
645 650 655
Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro
660 665 670
His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val
675 680 685
Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr
690 695 700
Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val
705 710 715 720
Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr
725 730 735
Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro
740 745 750
Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln
755 760 765
Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg
770 775 780
Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu
785 790 795 800
Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly
805 810 815
Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val
820 825 830
Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn
835 840 845
Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu
850 855 860
Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln
865 870 875 880
Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp
885 890 895
Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe
900 905 910
Leu Val Ser Trp Cys
915
<210> 17
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> sp1
<400> 17
Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys
1 5 10 15
Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu
20 25
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> sp7
<400> 18
Met Ala Phe Leu Trp Leu Leu Ser Cys Trp Ala Leu Leu Gly Thr Thr
1 5 10 15
Phe Gly
<210> 19
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> sp2
<400> 19
Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys
1 5 10 15
Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala
20
<210> 20
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> sp6
<400> 20
Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val
1 5 10 15
Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly
20 25
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> sp8
<400> 21
Met Ala Ser Arg Leu Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Arg Ala Ser Ser
20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 22
ggctgtattc ccctccatcg 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 23
ccagttggta acaatgccat gt 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 24
ggtctttctg gtgcttgtct ca 22
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 25
gttcggcttc ccattctcc 19
Claims (16)
1.一种核酸序列，其包含：
(i)能够在第一组织中驱动或增强组织选择性表达的第一转录调控元件；和
(ii)能够在第二组织中驱动或增强组织选择性表达的第二转录调控元件；
其中所述第一转录调控元件和第二转录调控元件被融合在一起；并且
其中所述第一转录调控元件和第二转录调控元件中的至少一者是组织选择性启动子。
2.根据权利要求1所述的核酸序列，其中：
(i)所述第一转录调控元件是能够在第一组织中驱动组织选择性表达的组织选择性启动子；并且
(ii)所述第二转录调控元件是组织选择性启动子。
3.根据权利要求1或2所述的核酸序列，其中一个转录调控元件选自肝选择性启动子、肌肉选择性启动子和神经元选择性启动子，特别是肝选择性启动子；并且
其中具体来说，
(a)当所述转录调控元件是肝选择性启动子时，所述转录调控元件优选地选自α-1抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、ApoE增强子与hAAT启动子的组合、甲状腺素转运蛋白启动子、白蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子和LSP启动子；
(b)当所述转录调控元件是肌肉选择性启动子时，所述转录调控元件优选地选自spC5.12启动子、MHCK7启动子、E-syn启动子、肌肉肌酸激酶肌球蛋白轻链(MLC)启动子、肌球蛋白重链(MHC)启动子、结蛋白启动子、心肌肌钙蛋白C启动子、肌钙蛋白I启动子、myoD基因家族启动子、α肌动蛋白启动子、β肌动蛋白启动子、γ肌动蛋白启动子、位于眼型Pitx3的内含子1内的肌肉选择性启动子和CK6启动子；和/或
(c)当所述转录调控元件是神经元选择性启动子时，所述转录调控元件优选地选自突触蛋白-1(Syn)启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子、神经丝轻链基因启动子、神经元特异性vgf基因启动子、突触蛋白-2启动子、酪氨酸羟化酶启动子、多巴胺β-羟化酶启动子、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶启动子、低亲和性NGF受体启动子、胆碱乙酰基转移酶启动子、降钙素基因相关肽(CGRP)启动子、Hb9启动子、GFAP启动子、钙结合蛋白2启动子、Mnx1启动子、巢蛋白启动子、小清蛋白启动子、生长抑素启动子和Plp1启动子。
4.根据权利要求1或2所述的核酸序列，其中一个转录调控元件选自肝选择性启动子、肌肉选择性启动子和神经元选择性启动子，特别是肝选择性启动子；并且
其中具体来说：
(a)当所述转录调控元件是肝选择性启动子时，所述转录调控元件优选地选自α-1抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、ApoE增强子与hAAT启动子的组合、甲状腺素转运蛋白启动子、白蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子和LSP启动子；
(b)当所述转录调控元件是肌肉选择性启动子时，所述转录调控元件优选地选自spC5.12启动子、MHCK7启动子、E-syn启动子、肌肉肌酸激酶肌球蛋白轻链(MLC)启动子、肌球蛋白重链(MHC)启动子、心肌肌钙蛋白C启动子、肌钙蛋白I启动子、myoD基因家族启动子、α肌动蛋白启动子、β肌动蛋白启动子、γ肌动蛋白启动子、位于眼型Pitx3的内含子1内的肌肉选择性启动子和CK6启动子；和/或
(c)当所述转录调控元件是神经元选择性启动子时，所述转录调控元件优选地选自突触蛋白-1(Syn)启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子、神经丝轻链基因启动子、神经元特异性vgf基因启动子、突触蛋白-2启动子、酪氨酸羟化酶启动子、多巴胺β-羟化酶启动子、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶启动子、低亲和性NGF受体启动子、胆碱乙酰基转移酶启动子、降钙素基因相关肽(CGRP)启动子、Hb9启动子、GFAP启动子、钙结合蛋白2启动子、Mnx1启动子、巢蛋白启动子、小清蛋白启动子、生长抑素启动子和Plp1启动子。
5.根据权利要求3所述的核酸序列，其中：
-所述肌肉选择性启动子选自spC5.12、结蛋白和肌肉肌酸激酶(MCK)启动子；和/或
-所述神经元选择性启动子是Syn启动子。
6.根据权利要求3所述的核酸序列，其中：
-所述肌肉选择性启动子选自spC5.12和肌肉肌酸激酶(MCK)启动子；和/或
-所述神经元选择性启动子是Syn启动子。
7.根据权利要求1至4中的任一项所述的核酸序列，其中所述核酸序列：
(i)是ApoE增强子与hAAT启动子的组合，并且(ii)是spC5.12启动子；或
(i)是ApoE增强子与hAAT启动子的组合，并且(ii)是Syn启动子；或
(i)是ApoE增强子，并且(ii)是spC5.12启动子。
8.一种表达盒，其包含根据权利要求1至7中的任一项所述的核酸序列和感兴趣的转入基因，特别是感兴趣的治疗性转入基因，特别是包含酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)作为所述感兴趣的治疗性转入基因。
9.一种载体，其包含根据权利要求8所述的表达盒，特别是病毒载体例如腺病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体或AAV载体，特别是AAV载体，例如包含AAV8或AAV9衣壳的AAV载体。
10.一种分离的细胞，其用根据权利要求1至7中的任一项所述的核酸序列、根据权利要求8所述的表达盒或根据权利要求9所述的载体进行转化。
11.一种药物组合物，其包含根据权利要求9所述的载体或者对于从属于权利要求8至9的权利要求10的部分来说包含根据权利要求10所述的细胞，其中所述感兴趣的转入基因是治疗性转入基因。
12.根据权利要求8所述的表达盒、根据权利要求9所述的载体或者对于从属于权利要求8至9的权利要求10的部分来说根据权利要求10所述的细胞，其用作药物，其中所述感兴趣的转入基因是治疗性转入基因。
13.根据权利要求8所述的表达盒、根据权利要求9所述的载体或者对于从属于权利要求8至9的权利要求10的部分来说根据权利要求10所述的细胞，其用于通过所述治疗性转入基因在感兴趣的治疗组织中的表达，通过基因疗法来治疗障碍的方法中。
14.根据权利要求13所述的供使用的表达盒、载体或细胞，其中所述障碍选自：
溶酶体贮积病(LSD)，例如I型至VII型黏多糖贮积症(MPSI-VII)、Sandhoff病和Tay-Sachs；
代谢疾病，例如枫糖尿病(MSUD)、甲基丙二酸血症(MMA)、I型和III型糖原贮积病(GSDI和III)、尼曼-皮克病(NPC)、卡纳万病、苯丙酮尿症(PKU)；
神经肌肉障碍，例如肌营养不良症(例如肌强直性营养不良(Steinert病)、杜氏肌营养不良、贝氏型肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良、埃-德二氏肌营养不良、运动神经元病(例如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌肉萎缩症(婴儿型进行性脊髓性肌肉萎缩症(1型，Werdnig-Hoffmann病)、中间型脊髓性肌肉萎缩症(2型)、幼年型脊髓性肌肉萎缩症(3型，Kugelberg-Welander病)、成年型脊髓性肌肉萎缩症(4型))、脊髓-延髓性肌肉萎缩症(肯尼迪病))、炎性肌病(例如多发性肌炎皮肌炎、包涵体肌炎)、肌肉神经接点的疾病(例如重症肌无力、Lambert-Eaton(肌无力)综合征、先天性肌无力综合征)、外周神经的疾病(例如腓骨肌萎缩症、弗立特里希氏共济失调、Dejerine-Sottas病)、肌肉的代谢疾病(例如磷酸化酶缺乏症(McArdle病)、酸性麦芽糖酶缺乏症(庞贝氏病)、磷酸果糖激酶缺乏症(Tarui病)、脱支酶缺乏症(Cori或Forbes病)、线粒体肌病、肉毒碱缺乏症、肉毒碱棕榈酰转移酶缺乏症、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症、乳酸脱氢酶缺乏症、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症)、由内分泌异常造成的肌病(例如甲亢性肌病、甲低性肌病)和其他肌病(例如先天性肌强直、先天性副肌强直、中央轴空病、线状体肌病、肌小管性肌病、周期性麻痹)；和
其他疾病例如血友病A、MPSI、阿兹海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、图雷特综合症、精神分裂症、Sly病、亨特氏病、痴呆症、偏执狂、强迫症、学习障碍、ALS、腓骨肌萎缩症、肯尼迪病、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、孤独症、高雪氏病、赫尔勒氏病、克腊伯氏病和行为改变(例如睡眠、知觉或认知的障碍)。
15.根据权利要求13所述的供使用的表达盒、载体或细胞，其中所述障碍选自：
溶酶体贮积病(LSD)，例如I型至VII型黏多糖贮积症(MPSI-VII)、Sandhoff病和Tay-Sachs；
代谢疾病，例如枫糖尿病(MSUD)、甲基丙二酸血症(MMA)、I型和III型糖原贮积病(GSDI和III)、尼曼-皮克病(NPC)、卡纳万病、苯丙酮尿症(PKU)；
神经肌肉障碍，例如肌营养不良症(例如肌强直性营养不良(Steinert病)、杜氏肌营养不良、贝氏型肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良、埃-德二氏肌营养不良、运动神经元病(例如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌肉萎缩症(婴儿型进行性脊髓性肌肉萎缩症(1型，Werdnig-Hoffmann病)、中间型脊髓性肌肉萎缩症(2型)、幼年型脊髓性肌肉萎缩症(3型，Kugelberg-Welander病)、成年型脊髓性肌肉萎缩症(4型))、脊髓-延髓性肌肉萎缩症(肯尼迪病))、炎性肌病(例如多发性肌炎皮肌炎、包涵体肌炎)、肌肉神经接点的疾病(例如重症肌无力、Lambert-Eaton(肌无力)综合征、先天性肌无力综合征)、外周神经的疾病(例如腓骨肌萎缩症、弗立特里希氏共济失调、Dejerine-Sottas病)。
16.根据权利要求12所述的供使用的表达盒、载体或细胞，其中所述障碍是糖原贮积病，特别是庞贝氏病，更特别是婴儿期发作型庞贝氏病或迟发型庞贝氏病，甚至更特别是婴儿期发作型庞贝氏病。
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