JP2023539219A - 糖原病ｉｉｉの治療のためのｃ末端切断ｇｄｅ - Google Patents

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Abstract

本発明は、グリコーゲン蓄積疾患IIIの治療のための機能的なC末端切断GDEポリペプチドに関する。

Description

本発明は、糖原病III(GSDIII)の治療に関する。
AGL遺伝子における変異は、グリコーゲン脱分枝酵素(GDE)、すなわちグリコーゲンの分解に関与する酵素である、「アミロ-α-1,6-グルコシダーゼ、4-α-グルカノトランスフェラーゼ」の遺伝的欠損を引き起こす。GDEは、タンパク質の異なる場所において生じる二つの独立した触媒作用:4-α-グルコトランスフェラーゼ活性及びアミロ-1,6-グルコシダーゼ活性を有する。GDEの遺伝的欠損は、糖原病III(GSDIII)における不完全なグリコーゲン分解を引き起こし、様々な器官、主に肝臓及び筋肉における、短い外鎖を有する異常なグリコーゲンの蓄積をもたらす。疾患は、肝腫大、低血糖、低身長、可変性のミオパチー及び心筋症により特徴づけられる。ほとんどの患者は、肝臓及び筋肉の両方に関与するGSDIII(IIIa型)を有する一方で、肝臓の関与のみ(IIIb型)を有する患者もいる(～15%)。肝臓の症状は、通常、幼児期に生じる。肝硬変及び肝細胞癌は、いくつかのケースにおいて報告されている(Chenら、2009、Scriver’s Online Metabolic & Molecular Bases of inherited Disease、New York: McGraw-Hill; Kishnaniら、2010、Genet Med 12、446-463)。筋力低下は、幼児期の間に存在する可能性がある。それは、20代又は30代において発症する成人においてよりも多く見られる。進行性の筋力低下に由来する著しい病的状態があり、後期の患者は車椅子生活になる可能性がある。患者は、心筋症もまた発症する可能性がある。これらの患者が発症する症状の重症度における、著しい臨床的な可変性が存在する。進行性のミオパチー及び/又は心筋症及び/又は末梢神経障害は、成人における病的状態の主な原因である(Kishnaniら、2010、Genet Med 12、446-463; Cornelioら、1984、Arch Neurol 41、1027-1032; Colemanら、1992、Ann Intern Med 116、896-900)。疾患に関連する可能性のある神経学的な症状の報告は、GSDIII患者と共に働く臨床医に由来し、その臨床医は、注意力の変動、実行機能の欠損及び感情的なスキルの障害を報告した(Michonら、2015、J Inherit Metab Dis、38(3): 573-580)。その結果、疾患のGDE-/-マウスモデルにおいて、神経系を通したグリコーゲンの広範囲の蓄積が記述された(Pagliaraniら、2014、Biochim Biophys Acta、1842(11): 2318-2328; Liuら、2014、Mol Genet Metab、111(4): 467-476)が、グリコーゲンの蓄積に関連する表現型の注意深い特徴づけは、未だ欠いている。現在の治療は、対症的であり、疾患のための効果的な療法は存在しない。低血糖は、コーンスターチの栄養補助食品を用いた炭水化物が豊富に含まれる頻繁な食事又は夜間の経胃点滴栄養により制御されることができる。ミオパチーの患者は、日中のタンパク質が豊富に含まれる食事に加えて終夜の経腸注入で治療される。何名かの患者において、症状の一過性の改善が記述されているが、高タンパク質な食事が進行性のミオパチーを妨げる又は治療することを証明する体系的な研究又は長期間のデータは存在しない(Kishnaniら、2010、Genet Med 12、446-463)。これらのアプローチは、これらの疾患の長期間の経過及び病的状態を変化させる効果がほとんどない。
従って、GSDIIIの長期間の治療の必要性はまだ存在する。影響を受ける組織においてGDEタンパク質を安定して置換することを目的とする遺伝子療法が、可能性のある治療的アプローチとして考えられている。しかしながら、大きなサイズのGDE導入遺伝子は、主要な障害を構成する。なぜならば、それは、ほとんどの遺伝子療法のベクターのサイズの制限に適合することができないからである。実際に、ヒトAGL遺伝子は、長さ85kbであり、35個のエキソンから構成され、175 kDaのGDEタンパク質を発現する、4596bpのコード領域及び2371bpの3’非翻訳配列を含む7.4kbのmRNAをコードする(Bao Yら、1996、Genomics.、38(2):155-65)。これは、実際の問題を構成する。なぜならば、GDE発現カセットの最小サイズ(例えば、AAVベクターのために、少なくともプロモーター、GDEコード配列、ポリAシグナル及び二つのITRを含む)は、in vivo遺伝子送達のためのAAV遺伝子療法ベクターに収納されることのできるゲノムサイズの制限である、5kbより大きいからである。本発明者は、このサイズの制限を克服するデュアルAAVベクターの使用を、過去に提案した。このアプローチに従って、それぞれが大きな導入遺伝子コード配列部分を含む、二つのベクターが、同じ細胞に形質導入するために使用される。デュアルAAVベクターの使用は有望であるが、経済的な及び実用的な理由の両方のために、一つのウイルスベクターのみを実施する遺伝子療法の戦略を提供することが好ましい。特許出願である国際公開第2020/030661号において、本発明者は、シングルウイルスベクターに適合する「ミニGDEポリペプチド(mini GDE polypeptide)」の使用に基づいたもう一つのアプローチを記載した。さらに、過去に国際公開第2020/030661号において記載されたミニGDEポリペプチドの代替物は、望ましい。
本発明は、機能的な切断GDEポリペプチドであって、機能的なリファレンス全長ヒトGDE配列に関して、少なくとも1個のアミノ酸、例えば少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105又は少なくとも110個のアミノ酸並びに多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失を含み、配列番号59において示される配列を含まない、機能的な切断GDEポリペプチドに関する。
特定の実施形態において、機能的なリファレンス全長ヒトGDEは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号61、配列番号62若しくは配列番号63において示されるアミノ酸配列を有し、又は配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号61、配列番号62若しくは配列番号63と少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは少なくとも99パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
特定の実施形態において:
(i)機能的なリファレンス全長ヒトGDE配列は、配列番号1若しくは配列番号61に示されるアミノ酸配列を有し、前記切断GDEポリペプチドは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸を欠失しており;
(ii)機能的なリファレンス全長ヒトGDE配列は、配列番号2若しくは配列番号62に示されるアミノ酸配列を有し、前記切断GDEポリペプチドは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸を欠失しており;又は
(iii)機能的なリファレンス全長ヒトGDE配列は、配列番号3若しくは配列番号63に示されるアミノ酸配列を有し、前記切断GDEポリペプチドは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸を欠失している。
更なる特定の実施形態において、
(i)機能的なリファレンス全長ヒトGDE配列は、配列番号1若しくは配列番号61において示されるアミノ酸配列を有し、前記切断GDEポリペプチドは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸を欠失している;
(ii)機能的なリファレンス全長ヒトGDE配列は、配列番号2若しくは配列番号62において示されるアミノ酸配列を有し、前記切断GDEポリペプチドは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸を欠失している;又は
(iii)機能的なリファレンス全長ヒトGDE配列は、配列番号3若しくは配列番号63において示されるアミノ酸配列を有し、前記切断GDEポリペプチドは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸を欠失している。
特定の実施形態において、機能的な切断GDEポリペプチドは、更に、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号61、配列番号62又は配列番号63に関して、欠失又は欠失の組み合わせを含み、(複数の)欠失は、表2におけるΔ1、Δ2、Δ3、Δ4、Δ5、Δ6、Δ7、Δ8、Δ9、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13、特にはΔ9、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13として参照される任意の欠失から選択される。
特定の実施形態において、機能的な切断GDEポリペプチドは、配列番号7～14、配列番号25～33若しくは配列番号64～66において示されるアミノ酸配列を有し、又は配列番号7～14、配列番号25～33若しくは配列番号64～66に対して少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは少なくとも99パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
更なる特定の実施形態において、機能的な切断GDEポリペプチドは、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号64、配列番号65若しくは配列番号66、特には配列番号7、配列番号8若しくは配列番号9、特には配列番号7から選択されるアミノ酸配列を有し、又は配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号64、配列番号65若しくは配列番号66、特には配列番号7、配列番号8若しくは配列番号9、特には配列番号7に対して少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは少なくとも99パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
本発明は、上記で定義される、機能的な切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子にもまた関する。
本発明に対する更なる態様は、発現カセットであって、好ましくはこの順序において:
- プロモーター;
- 任意選択で、イントロン;
- 上記で定義される、機能的な切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子;及び
- ポリアデニル化シグナル
を含む、発現カセットに関する。
本発明は、上記に記載される、核酸分子又は発現カセットを含む、ベクター、特にはウイルスベクター、例えばAAVベクターにもまた関する。
本発明は、上記で定義される、核酸分子、発現カセット又はベクターにより形質転換される単離された細胞であって、前記細胞は、特には肝細胞、筋細胞、心臓細胞又はCNS細胞である、細胞にもまた関する。
本発明のもう一つの態様は、医薬としての使用のための、上記で定義される、機能的な切断GDEポリペプチド、核酸分子、発現カセット、ベクター又は細胞に関する。
本発明は、GDEをコードするAGL遺伝子における変異により引き起こされる疾患を治療するための方法における使用のための、上記で定義される、機能的な切断GDEポリペプチド、核酸分子、発現カセット、ベクター又は細胞にもまた関する。
更なる特定の実施形態において、本発明は、GSDIII(コーリ病)を治療するための方法における使用のための、上記で定義される、機能的な切断GDEポリペプチド、核酸分子、発現カセット、ベクター又は細胞に関する。
C末端欠失ΔCter-1-GDEは、GSDIIIマウスにおける筋力のレスキューにおいて、全長GDEと同様の効果を有する。GDEノックアウト(KO)マウスは、PBS(KO、PBS)を、又は、C末端切断GDE(KO、ΔCter-1)若しくは全長GDE(KO、FS)を発現するAAVベクターを1×1012 vg/マウスの量で注射された。PBSを注射された野生型のマウスは、コントロールとして使用された(WT、PBS)。ワイヤーハングのパフォーマンスは、ベクターの注射の1週間前(D-7)又は5週間後(D35)に測定され、一分当たりの降下として表現された。統計解析は、two-way ANOVAにより実施された(*=p＜0.05 vs. WT、PBS;#=p＜0.05 vs. KO、PBS;群当たりn=3～5)。 C末端が欠失したΔCter-1-GDEは、GSDIIIマウスの心臓及び四頭筋におけるグリコーゲンクリアランスにおいて、全長GDEと同等の効果を有する。GDEノックアウト(KO)マウスは、PBS(KO、PBS)、又は、C末端切断GDE(KO、ΔCter-1)若しくは全長GDE(KO、FS)を発現するAAVベクターを1×1012 vg/マウスの量で注射された。PBSを注射された野生型のマウスは、コントロールとして使用された(WT、PBS)。ベクター注射の5週間後、動物は屠殺され、心臓及び四頭筋においてグリコーゲンの蓄積が測定された。統計解析は、ANOVAにより実施された(*=p＜0.05 vs. WT、PBS;#=p＜0.05 vs. KO、PBS;群当たりn=3)。 C末端欠失ΔCter-1-GDEは、注射後3ヶ月の、GSDIIIマウスにおける筋力のレスキューにおいて、全長GDEよりと同等の効果を有する。GDEノックアウト(KO)マウスは、PBS(KO_PBS);C末端切断GDE(ΔCter-1)を発現するAAVベクター(3.3×1012 vg/マウス若しくは9.9×1012 vg/マウス(高用量));又は全長GDE(GDE FS)を発現するAAVベクター(3.3×1012 vg/マウス)を注射された。PBSを注射された野生型のマウスは、コントロールとして使用された(WT_PBS)。ワイヤーハングのパフォーマンスは、ベクターの注射の1週間前(図3A)及び3ヶ月後(図3B)に測定され、一分当たりの降下として表現された。統計解析は、two-way ANOVAにより実施された(群当たりn=3～5)。 ウェスタンブロットは、心臓、横隔膜、三頭筋及び四頭筋におけるGDEの存在を明らかにする。GDEノックアウト(KO)マウスは、PBS(KO_PBS);C末端切断GDE(ΔCter-1)を発現するAAVベクター(3.3×1012 vg/マウス若しくは9.9×1012 vg/マウス(高用量));又は全長GDE(GDE FS)を発現するAAVベクター(3.3×1012 vg/マウス)を注射された。PBSを注射された野生型のマウスは、コントロールとして使用された(WT_PBS)。Agl-/-マウスに注射された異なるコンストラクションは、ΔCter-1、ΔCter-1高用量と表され、PBSを注射されたGDE FS. KOマウスはネガティブコントロールとして使用された。
GDEタンパク質の三次元構造に関する知識の不足にも関わらず、本発明者は、そのコード配列が、GDEの機能性を保存しながら、遺伝子療法ベクターに、特にはシングルAAVベクターに収納されるほどに小さい、C末端切断GDEポリペプチドを同定した。
本発明は、従って、機能的なC末端切断GDEポリペプチドに関する。このポリペプチドは、GDEをコードするAGL遺伝子における変異により引き起こされる疾患を治療するための方法において、特にはGSDIII(コーリ病)を治療するための方法において有利に使用されることができる。
1- C末端切断GDEポリペプチド
本発明によるC末端切断GDEポリペプチドは、そのコード配列が遺伝子療法ベクター、特にはシングルAAVベクターに効率的に収納されるほどに小さな、機能的なGDEポリペプチドである。
「機能的な(functional)」GDEポリペプチドとは、GDEタンパク質の酵素活性の少なくとも一部、少なくとも一つを、好ましくはGDEタンパク質の酵素活性の全てを保持するポリペプチドを意味する。結果として、本発明において実施される機能的なGDEポリペプチドは、in vivoでグリコーゲンの蓄積及び筋力をレスキューすることができる。上記で定義される、GDE酵素活性は、グリコーゲンの分解に関与する、4-α-グルコトランスフェラーゼ活性及びアミロ-1,6-グルコシダーゼ活性である。GDEのトランスフェラーゼ活性は、ある鎖から別の鎖へ、グリコーゲンの三つのグルコースユニットを再配置する。これは、枝分かれ部位に一つのグルコースユニットを残し、それは、グルコシダーゼ活性によりグルコースとしてその後放出される。特定の実施形態において、本発明の機能的なGDEポリペプチドは、全長GDEポリペプチドと、特には全長ヒトGDEポリペプチドと同じ機能性を有する。例えば、本発明の機能的なGDEポリペプチドは、全長ヒトGDEタンパク質、特には配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号61、配列番号62又は配列番号63の全長ヒトGDEタンパク質と比較して、上記で記載される一つの、好ましくは両方の酵素活性に関連する、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%又は少なくとも99%の活性を有することができる。本発明のGDEタンパク質の活性は、全長ヒトGDEタンパク質の、特には配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号61、配列番号62又は配列番号63の全長ヒトGDEタンパク質の100%超、例えば、110%超、120%超、130%超、140%超、150%超、200%超、500%超、700%超、又は更に1000%超であることさえできる。特定の実施形態において、本発明の機能的なGDEポリペプチドは、筋組織、例えば心臓又は四頭筋において、全長GDEポリペプチド、特には全長ヒトGDEポリペプチドと同じ機能性を有する。例えば、本発明の機能的なGDEポリペプチドは、全長ヒトGDEタンパク質、特には配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号61、配列番号62又は配列番号63の全長ヒトGDEタンパク質と比較して、上記に記載の酵素活性の一つ、好ましくは両方に関連する、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%若しくは少なくとも99%、又は少なくとも100%の、筋組織、例えば心臓又は四頭筋における活性を有することができる。本発明のGDEタンパク質の、筋組織、例えば心臓又は四頭筋における活性は、全長ヒトGDEタンパク質、特には配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号61、配列番号62又は配列番号63の全長ヒトGDEタンパク質の活性の、100%超、例えば110%超、120%超、130%超、140%超、150%超、200%超、500%超、700%超、又は更に1000%超であることさえできる。
「機能的な」GDEポリペプチドは、病理学的でないGDEポリペプチドを意味する。特には、本発明の機能的なGDEポリペプチドは、GSDIII(コーリ病)、例えばGSDIIIa又はGSDIIIbの患者において見られるGDEポリペプチドではない。
当業者は、ポリペプチドが機能的なGDEポリペプチドであるかどうかを容易に判断することができる。適切な方法は、当業者に明らかである。例えば、一つの適切なin vitroの方法は、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターにポリペプチドをコードする核酸を挿入すること、宿主細胞、例えば293T若しくはHeLa細胞、又は他の細胞、例えばHuh7を、ベクターでトランスフェクトすること又は形質導入すること及びGDE活性を分析することを含む。適切な方法は、以下の実施例の部分においてより詳細に記載される。例えば、GDE活性は、限界デキストリンを用いて、均一化されたマウスの組織をインキュベートした後で産生されるグルコースを測定することにより決定されることができる。GDE KO動物の組織におけるGDE発現を決定することにより、例えばウェスタンブロットにより、グリコーゲンホスホリラーゼ消化グリコーゲンから産生されるグルコースを追跡することにより、治療されたGDE-KO動物の筋力を評価することにより、ベクターの投与後、例えば投与後1、2若しくは3ヶ月後のワイヤーハングにより、又は筋肉及び/若しくは心臓組織におけるグリコーゲンの蓄積のレスキューを評価することにより、GDE活性を試験することを含む。
「C末端切断GDEポリペプチド(C-terminal truncated GDE polypeptide)」は、リファレンス全長GDE配列に関して、C末端において切断されるGDEポリペプチドを意味する。特定の実施形態において、「C末端(C-terminal end)」は、最後の112個のアミノ酸から成る領域、すなわち、前記リファレンス全長ヒトGDE配列の最もC末端の112個のアミノ酸から成る領域に相当する。
特定の実施形態において、C末端切断GDEポリペプチドは、機能的な切断ヒトGDEポリペプチドであり、それはリファレンス全長ヒトGDEタンパク質に関して切断される。用語「切断ヒトGDEポリペプチド(truncated human GDE polypeptide)」は、切断ヒトGDEの由来するリファレンス全長ヒトGDE配列に関して、アミノ酸欠失により、より短い状態になる任意のヒトGDEポリペプチドを包含する。特には、C末端切断ヒトGDEポリペプチドは、リファレンス全長ヒトGDE配列に関して、C末端における少なくとも1つのアミノ酸を欠失する。好ましくは、C末端切断ヒトGDEポリペプチドは、リファレンス全長ヒトGDE配列に関して、C末端における、少なくとも約10、20、30、40、50、60、75、90、100個又は少なくとも110個及び多くとも約112個のアミノ酸を欠失する。好ましい実施形態において、機能的な切断ヒトGDEポリペプチドは、リファレンス全長ヒトGDE配列に関して、C末端における少なくとも約50、60、65、70、80、90又は100個のアミノ酸を欠失する。
特定の実施形態において、C末端切断GDEポリペプチドは、リファレンス全長ヒトGDE配列に関して、C末端における1個から112個の連続するアミノ酸を欠失し、1個から112個の欠失したアミノ酸は、前記リファレンス全長ヒトGDE配列の最もC末端のアミノ酸である。
特には、C末端切断GDEポリペプチドは、リファレンス全長ヒトGDE配列に関して、C末端において少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個又は少なくとも110個及び多くとも112個の連続するアミノ酸を欠失することができ、欠失したアミノ酸は、前記リファレンス全長ヒトGDE配列の最もC末端のアミノ酸である。例えば、C末端切断GDEポリペプチドは、リファレンス全長ヒトGDE配列に関して、C末端において5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110又は112個の連続したアミノ酸を欠失することができ、欠失したアミノ酸は、前記リファレンス全長ヒトGDE配列の最もC末端のアミノ酸である。
明確性のために、「5個のアミノ酸が欠失したC末端欠失GDEポリペプチドであって、欠失したアミノ酸は最もC末端のアミノ酸である」とは、C末端から始まる5個の連続するアミノ酸、すなわちC末端から始まる1、2、3、4、5個のアミノ酸を切断したポリペプチドに相当する。
任意の公開された値又は範囲に関して本明細書で使用される、用語「約(about)」は、記載された数値がわずかな不正確さ、例えば、値にかなり又はほぼ近い、例えば、記載された値又は範囲のプラス又はマイナス10%、特には例えばプラス又はマイナス5%を許容することを示す。
以下で更に記載される、本発明によるC末端切断GDEポリペプチドは、リファレンス全長ヒトGDE配列に関して、少なくともC末端において切断されているが、リファレンス全長GDE配列に関して、他の(複数の)部分において切断されることもまたできる。従って、C末端切断GDEポリペプチドは、リファレンス全長ヒトGDE配列に関して、少なくとも約10、20、30、40、50、60、75、90、100、125、150、175、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500個又は少なくとも約525個のアミノ酸を欠失することができる。好ましい実施形態において、C末端切断GDEポリペプチドは、リファレンス全長ヒトGDE配列に関して、少なくとも約50、100個又は150個のアミノ酸を欠失する。
好ましい実施形態において、機能的なC末端切断GDEポリペプチドの大きさは、前記GDEポリペプチドをコードする核酸分子が、適切なコントロール配列と共にAAVベクターに収納されることができるのに十分小さい。好ましくは、機能的なC末端切断GDEポリペプチドの大きさは、1480個のアミノ酸よりも小さく、例えば1475、1470、1465、1460、1455、1450、1445個よりも少なく、又は1440アミノ酸よりも小さい。好ましくは、C末端切断GDEポリペプチドの大きさは、1472アミノ酸よりも小さい。
特定の実施形態において、機能的なC末端切断GDEポリペプチドの大きさは、少なくとも650個のアミノ酸、例えば少なくとも700個、又は少なくとも750個のアミノ酸である。
特定の実施形態において、機能的なC末端切断GDEポリペプチドの大きさは、少なくとも650個のアミノ酸であり、多くとも1480個のアミノ酸である。特定の実施形態において、機能的なC末端切断GDEポリペプチドの大きさは、少なくとも700個のアミノ酸であり、多くとも1472個のアミノ酸である。
特定の実施形態において、リファレンス全長ヒトGDE配列に関して、切断されるC末端切断GDEポリペプチドは、前記リファレンス全長ヒトGDE配列に関して、一以上の追加のアミノ酸修飾を含むことができる。特には、更に以下で記載される(複数の)欠失に加えて、機能的な切断GDEポリペプチドは、リファレンス全長ヒトGDE配列と比較して、一以上のアミノ酸修飾、例えばアミノ酸の挿入、欠失及び/又は置換を含むことができる。例えば、機能的な切断GDEポリペプチドは、切断GDEポリペプチドの機能性が保存される限り、1個から10個まで(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個)の追加的なアミノ酸修飾、特には1個から5個まで(例えば、1、2、3、4又は5個)の追加的なアミノ酸修飾を含むことができる。
特定の実施形態において、C末端切断GDEポリペプチドが更にN末端欠失を含むとき、メチオニンはN末端に追加されることができる。
本発明の文脈において、「リファレンス全長ヒトGDE配列(a reference full-length human GDE sequence)」は、病理学的なGDEポリペプチドをコードしない。特には、リファレンス全長ヒトGDE配列は、野生型の非病理学的な全長ヒトGDE配列と比較して(複数の)変異、(複数の)欠失又は(複数の)挿入を含む、GSDIIIの患者において見られる病理学的なバリアントをコードしない。
例えば、Okuboら(Hum Genet (1998) 102 :1-5)は、野生型のコントロール(Okuboらの図4を参照)とは異なる15個のアミノ酸(配列番号59において示される)を含む病理学的なGDEポリペプチドを記載する(野生型のコントロールは、代わりに配列番号60において示される配列を含む)。
Okuboらの公開とは反対に、本発明において記載される「リファレンス全長ヒトGDE配列」は、配列番号60において示される配列を含む。従って、本発明において記載される「リファレンス全長ヒトGDE配列」は、配列番号59において示される配列を含まない。結果として、本発明のC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号59において示される配列を含まない。
本発明の文脈において、「リファレンス全長ヒトGDE配列」は、ヒトGDEの全ての天然のアイソフォームを包含する。Bao及び同僚ら(Genomics、1997、38、155-165)は、三つのGDEタンパク質のアイソフォームをコードする六つの転写バリアントの存在を同定した。転写バリアント1～4は、同じタンパク質、すなわちGDEアイソフォーム1をコードする。転写バリアント5及び6は、それぞれGDEアイソフォーム5及び6をコードする。
用語「リファレンス全長ヒトGDEポリペプチド(reference full-length human GDE polypeptide)」は、従って、前駆体の形態を含むヒトGDEの全ての天然のアイソフォーム、並びに、GDEの機能的な誘導体である、(複数の)挿入、(複数の)欠失及び/若しくは(複数の)置換により修飾された又は変異したGDEタンパク質又はそのフラグメントを含む。特には、リファレンス全長ヒトGDE配列は、配列番号61(野生型GDEアイソフォーム1に相当する、UniProtKB identifier : P35573-1)、配列番号1(GDEアイソフォーム1のバリアントに相当する)、配列番号62(野生型GDEアイソフォーム5に相当する、UniProtKB identifier : P35573-2)、配列番号2(GDEアイソフォーム5のバリアントに相当する)、配列番号63(野生型GDEアイソフォーム6に相当する、UniProtKB identifier : P35573-3)及び配列番号3(GDEアイソフォーム6のバリアントに相当する)から成る群から選択される。
特定の実施形態において、リファレンス全長ヒトGDEは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号61、配列番号62又は配列番号63、特には配列番号1、配列番号2又は配列番号3に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。特定の実施形態において、リファレンス全長ヒトGDEは、配列番号1又は配列番号61に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は少なくとも99％の配列同一性を有し、アミノ酸の数に関して、配列番号1又は配列番号61と同じ長さを有する。特定の実施形態において、リファレンス全長ヒトGDEは、配列番号2又は配列番号62に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は少なくとも99％の配列同一性を有し、アミノ酸の数に関して、配列番号2又は配列番号62と同じ長さを有する。特定の実施形態において、リファレンス全長ヒトGDEは、配列番号3又は配列番号63に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は少なくとも99％の配列同一性を有し、アミノ酸の数に関して、配列番号3又は配列番号63と同じ長さを有する。
特定の実施形態において、リファレンス全長ヒトGDE配列は、配列番号1又は配列番号61、特にはGDEアイソフォーム1に相当する配列番号1において示されるアミノ酸配列を有する。
本発明のC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失を含む。特定の実施形態において、C末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個又は少なくとも110個のアミノ酸のC末端欠失を含む。
特定の実施形態において、C末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個又は少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失を含む。
好ましい実施形態において、C末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸由来の、112個の連続したアミノ酸のC末端欠失を含む。明確性のために、この実施形態において、欠失は、言及される位置の範囲における全ての連続したアミノ酸の欠失に関する。配列番号1又は配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸由来の、112個の連続したアミノ酸のこのC末端欠失は、今後、欠失「ΔCter-1」と呼ばれる。
特定の実施形態において、上述のC末端欠失を含む、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に関して、少なくとも一つのアミノ酸を更に欠失しており、欠失した(複数の)アミノ酸は、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1～428、668～769、895～1087及び/又は1195～1232における少なくとも1つのアミノ酸である。更なる特定の実施形態において、上述のC末端欠失を含む、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、少なくとも約10、20、30、40、50、60、75、90、100、125、150、175、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500個又は少なくとも約525個のアミノ酸を更に欠失しており、欠失した(複数の)アミノ酸は、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1～428、668～769、895～1087及び/又は1195～1232における任意のアミノ酸から選択される。この実施形態において、欠失したアミノ酸は、それらが、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1～428、668～769、895～1087及び/又は1195～1232における任意のアミノ酸から選択される限り、連続したアミノ酸又は連続していないアミノ酸であることができる。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に関して、位置429～666、770～892、1088～1194、1235～1420におけるアミノ酸残基を少なくとも含む。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に関して、位置429～667、770～894、1088～1194、1233～1420におけるアミノ酸残基を少なくとも含む。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個又は少なくとも110個の連続したアミノ酸を欠失しており、更に:
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から428までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から428までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、250、300、350個若しくは少なくとも400個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置668から769までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置668から769までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20、30、40、50、80個若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置895から1087までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置895から1087までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20、30、40、50、80、100、125、150、175個若しくは少なくとも190個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1195から1232までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1195から1232までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20個若しくは少なくとも30個の連続したアミノ酸
を欠失している。
更なる特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個又は少なくとも110個の連続したアミノ酸を欠失しており;更に:
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から428までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から428までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20、30、40、50、60、80、100、110個若しくは少なくとも120個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置668から769までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置668から769までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20、30、40、50、80個若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置895から1087までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置895から1087までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20、30、40、50、80、100、125、150、175個若しくは少なくとも190個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1195から1232までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1195から1232までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20個若しくは少なくとも30個の連続したアミノ酸
を欠失している。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個又は少なくとも110個の連続したアミノ酸を欠失しており、更に:
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から156までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から156までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置361から428までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置361から428までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置668から769までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置668から769までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置895から1087までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置895から1087までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも150個の連続したアミノ酸、少なくとも175個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも190個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1195から1232までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1195から1232までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置223から320までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置223から320までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置360から428までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置360から428までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置669から720までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置669から720までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から280までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から280までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から425までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から425までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から230までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から230までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から15までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から15までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも10個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から30までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から30までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも25個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から81までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から81までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から103までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から103までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;並びに/又は
- 配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から129までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から129までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸
を欠失している。
更なる特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、
以下:
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置1から156までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置361から428までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置668から769までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置895から1087までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置1195から1232までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置223から320までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置360から428までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置669から720までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置1から280までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置1から425までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置1から230までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置1から15までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置1から30までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置1から81までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置1から103までのアミノ酸の欠失;及び
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置1から129までのアミノ酸の欠失;
からなる群から選択される少なくとも一つの更なる欠失と組み合わせて、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失を含む。
更なる特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、
以下:
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置1から15までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置1から30までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置1から81までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置1から103までのアミノ酸の欠失;及び
- 配列番号1又は配列番号61に関して、位置1から129までのアミノ酸の欠失;
からなる群から選択される一つの更なる欠失と組み合わせて、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失を含む。
明確性のために、この実施形態において、欠失は、言及される位置の範囲における全ての連続したアミノ酸の欠失に関する。例えば、配列番号1に関して、位置1から156までにおけるアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1に関して、位置1から156までの全ての連続したアミノ酸を欠失するGDEポリペプチドに相当する。
また、明確性のために、例えば、以下:
- 配列番号1に関して、位置1から156までのアミノ酸の欠失;及び
- 配列番号1に関して、位置1から280までのアミノ酸の欠失
を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、位置1から280までの全ての連続したアミノ酸を欠失するGDEポリペプチドに相当する。なぜならば、範囲1～156は、範囲1～280に含まれるからである。
加えて、例えば、以下:
- 配列番号1に関して、位置1から280までのアミノ酸の欠失;及び
- 配列番号1に関して、位置223から320までのアミノ酸の欠失
を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、位置1から320までの全ての連続したアミノ酸を欠失するGDEポリペプチドに相当する。なぜならば、範囲1～280は、範囲223～320と重複するからである。
もう一つの実施形態において、リファレンス全長ヒトGDE配列は、配列番号2又は配列番号62に示されるアミノ酸配列を有し、それはGDEアイソフォーム5に相当する。
本発明のC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に関して、位置1404 から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失を含む。特定の実施形態において、C末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個又は少なくとも110個のアミノ酸のC末端欠失を含む。
特定の実施形態において、C末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個又は少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失を含む。
好ましい実施形態において、C末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸由来の、112個の連続したアミノ酸のC末端欠失を含む。明確性のために、この実施形態において、欠失は、言及される位置の範囲における全ての連続したアミノ酸の欠失に関する。配列番号2又は配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸由来の、112個の連続したアミノ酸のこのC末端欠失は、今後、欠失「ΔCter-2」と呼ばれる。
特定の実施形態において、上述のC末端欠失を含む、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に関して、少なくとも1個のアミノ酸を更に欠失しており、欠失した(複数の)アミノ酸は、配列番号2又は配列番号62に関して、位置1～411、651～752、878～1070及び/又は1178～1215における少なくとも1個のアミノ酸である。更なる特定の実施形態において、上述のC末端欠失を含む、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、少なくとも約10、20、30、40、50、60、75、90、100、125、150、175、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500個又は少なくとも約525個のアミノ酸を更に欠失しており、欠失した(複数の)アミノ酸は、配列番号2又は配列番号62に関して、位置1～411、651～752、878～1070及び/又は1178～1215における任意のアミノ酸から選択される。この実施形態において、欠失したアミノ酸は、それらが、配列番号2又は配列番号62に関して、位置1～411、651～752、878～1070及び/又は1178～1215における任意のアミノ酸から選択される限り、連続したアミノ酸又は連続していないアミノ酸であることができる。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に関して、位置412～649、753～875、1071～1177、1218～1515におけるアミノ酸残基を少なくとも含む。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に関して、位置412～650、753～877、1071～1177、1216～1515におけるアミノ酸残基を少なくとも含む。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2又は配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個又は少なくとも110個の連続したアミノ酸を欠失しており;更に以下:
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から411までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から411までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、250、300、350個若しくは少なくとも400個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置651から752までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置651から752までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20、30、40、50、80個若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置878から1070までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置878から1070までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20、30、40、50、80、100、125、150、175個若しくは少なくとも190個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1178から1215までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1178から1215までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20個若しくは少なくとも30個の連続したアミノ酸
を欠失している。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2又は配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個又は少なくとも110個の連続したアミノ酸を欠失しており;更に以下:
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から139までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から139までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置344から411までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置344から411までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置651から752までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置651から752までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置878から1070までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置878から1070までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも150個の連続したアミノ酸、少なくとも175個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも190個の連続したアミノ酸、;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1178から1215までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1178から1215までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置206から303までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置206から303までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置343から411までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置343から411までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置652から703までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置652から703までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から263までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から263までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から408までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から408までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から213までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から213までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から13までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から13までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも10個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から64までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から64までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から86までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から86までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から112までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から112までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸
を欠失している。
更なる特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、以下:
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置1から139までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置344から411までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置651から752までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置878から1070までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置1178から1215までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置206から303までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置343から411までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置652から703までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置1から263までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置1から408までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置1から213までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置1から13までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置1から64までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置1から86までのアミノ酸の欠失;及び
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置1から112までのアミノ酸の欠失
からなる群から選択される少なくとも一つの更なる欠失と組み合わせて、配列番号2又は配列番号62に関して、位置1404から1515までのアミノ酸のC末端欠失を含む。
更なる特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、
以下:
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置1から13までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置1から64までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置1から86までのアミノ酸の欠失;及び
- 配列番号2又は配列番号62に関して、位置1から112までのアミノ酸の欠失
からなる群から選択される一つの更なる欠失と組み合わせて、配列番号2又は配列番号62に関して、位置1404から1515までのアミノ酸のC末端欠失を含む。
明確性のために、この実施形態において、欠失は、言及される位置の範囲における全ての連続したアミノ酸の欠失に関する。例えば、配列番号2に関して、位置1から139までにおけるアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2に関して、位置1から139までの全ての連続したアミノ酸を欠失するGDEポリペプチドに相当する。
また、明確性のために、例えば、以下:
- 配列番号2に関して、位置1から139までのアミノ酸の欠失;及び
- 配列番号2に関して、位置1から263までのアミノ酸の欠失
を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、位置1から263までの全ての連続したアミノ酸を欠失するGDEポリペプチドに相当する。なぜならば、範囲1～139は、範囲1～263に含まれるからである。
加えて、例えば、以下:
- 配列番号2に関して、位置1から263までのアミノ酸の欠失;及び
- 配列番号2に関して、位置206から303までのアミノ酸の欠失
を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、位置1から303までの全ての連続したアミノ酸を欠失するGDEポリペプチドに相当する。なぜならば、範囲1～263は、範囲206～303と重複するからである。
もう一つの実施形態において、リファレンス全長ヒトGDE配列は、配列番号3又は配列番号63に示されるアミノ酸配列を有し、それはGDEアイソフォーム6に相当する。
本発明のC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失を含む。特定の実施形態において、C末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個又は少なくとも110個のアミノ酸のC末端欠失を含む。
特定の実施形態において、C末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個又は少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失を含む。
好ましい実施形態において、C末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸由来の、112個の連続したアミノ酸のC末端欠失を含む。明確性のために、この実施形態において、欠失は、言及される位置の範囲における全ての連続したアミノ酸の欠失に関する。配列番号3又は配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸由来の、112個の連続したアミノ酸のこのC末端欠失は、今後、欠失「ΔCter-3」と呼ばれる。
特定の実施形態において、上述のC末端欠失を含む、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に関して、少なくとも1個のアミノ酸を更に欠失し、欠失した(複数の)アミノ酸は、配列番号3又は配列番号63に関して、位置1～412、652～753、879～1071及び/又は1179～1216における少なくとも1個のアミノ酸である。更なる特定の実施形態において、上述のC末端欠失を含む、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、少なくとも約10、20、30、40、50、60、75、90、100、125、150、175、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500個又は少なくとも約525個のアミノ酸を更に欠失しており、欠失した(複数の)アミノ酸は、配列番号3又は配列番号63に関して、位置1～412、652～753、879～1071及び/又は1179～1216における任意のアミノ酸から選択される。この実施形態において、欠失したアミノ酸は、それらが、配列番号3又は配列番号63に関して、位置1～412、652～753、879～1071及び/又は1179～1216における任意のアミノ酸から選択される限り、連続したアミノ酸又は連続していないアミノ酸であることができる。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に関して、位置413～650、754～876、1072～1178、1219～1516におけるアミノ酸残基を少なくとも含む。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に関して、位置413～651、754～878、1072～1178、1217～1516におけるアミノ酸残基を少なくとも含む。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3又は配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個又は少なくとも110個の連続したアミノ酸を欠失しており;更に以下:
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から412までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から412までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、250、300、350個若しくは少なくとも400個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置652から753までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置652から753までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20、30、40、50、80個若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置879から1071までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置879から1071までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20、30、40、50、80、100、125、150、175個若しくは少なくとも190個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1179から1216までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1179から1216までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10、15、20個若しくは少なくとも30個の連続したアミノ酸
を欠失している。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3又は配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個又は少なくとも110個の連続したアミノ酸を欠失しており;更に以下:
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から140までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から140までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置345から412までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置345から412までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置652から753までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置652から753までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置879から1071までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置879から1071までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも150個の連続したアミノ酸、少なくとも175個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも190個の連続したアミノ酸、;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1179から1216までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1179から1216までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置207から304までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置207から304までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置344から412までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置344から412までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置653から704までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置653から704までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から264までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から264までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から409までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から409までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から214までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から214までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から14までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から14までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも10個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から65までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から65までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から87までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から87までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも50個の連続したアミノ酸;及び/又は
- 配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から113までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から113までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、50個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも100個の連続したアミノ酸
を欠失している。
更なる特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、以下:
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置1から140までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置345から412までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置652から753までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置879から1071までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置1179から1216までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置207から304までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置344から412までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置653から704までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置1から264までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置1から409までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置1から214までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置1から14までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置1から65までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置1から87までのアミノ酸の欠失;及び
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置1から113までのアミノ酸の欠失
からなる群から選択される少なくとも一つの更なる欠失と組み合わせて、配列番号3に関して、位置1405から1516までのアミノ酸のC末端欠失を含む。
更なる特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、
以下:
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置1から14までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置1から65までのアミノ酸の欠失;
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置1から87までのアミノ酸の欠失;及び
- 配列番号3又は配列番号63に関して、位置1から113までのアミノ酸の欠失
からなる群から選択される一つの更なる欠失と組み合わせて、配列番号3又は配列番号63に関して、位置1405から1516までのアミノ酸のC末端欠失を含む。
明確性のために、この実施形態において、欠失は、言及される位置の範囲における全ての連続したアミノ酸の欠失に関する。例えば、配列番号3に関して、位置1から140までにおけるアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3に関して、位置1から140までの全ての連続したアミノ酸を欠失するGDEポリペプチドに相当する。
また、明確性のために、例えば、以下:
- 配列番号3に関して、位置1から140までのアミノ酸の欠失;及び
- 配列番号3に関して、位置1から264までのアミノ酸の欠失
を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、位置1から264までの全ての連続したアミノ酸を欠失するGDEポリペプチドに相当する。なぜならば、範囲1～140は、範囲1～264に含まれるからである。
加えて、例えば、以下:
- 配列番号3に関して、位置1から264までのアミノ酸の欠失;及び
- 配列番号3に関して、位置207から304までのアミノ酸の欠失
を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、位置1から304までの全ての連続したアミノ酸を欠失するGDEポリペプチドに相当する。なぜならば、範囲1～264は、範囲207～304と重複するからである。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号61、配列番号62又は配列番号63に関するC末端欠失を含み、C末端欠失は、表１:
におけるΔCter-1、ΔCter-2又はΔCter-3として参照される。
明確性のために、表１は以下のように理解されるべきである。リファレンス全長GDE配列が配列番号1又は配列番号61であるとき、ΔCter-1欠失を含む機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に由来する機能的なC末端切断GDEポリペプチドに相当し、それは、配列番号1又は配列番号61に関して、位置1421から1532までの全ての連続したアミノ酸を欠失している。従って、リファレンス全長GDE配列が配列番号2又は配列番号62であるとき、ΔCter-2欠失を含む機能的なC末端欠失GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に由来する機能的な切断GDEポリペプチドに相当し、それは、配列番号2又は配列番号62に関して、位置1404から1515までの全ての連続したアミノ酸を欠失している。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、C末端欠失、例えばΔCter-1、ΔCter-2又はΔCter-3の欠失に加えて、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号61、配列番号62又は配列番号63に関する欠失又は欠失の組み合わせを含み、(複数の)欠失は、表２:
においてΔ1、Δ2、Δ3、Δ4、Δ5、Δ6、Δ7、Δ8、Δ9、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13として参照される任意の欠失から選択される。
特定の実施形態において、本発明の機能的な切断GDEポリペプチドは、C末端欠失、例えばΔCter-1、ΔCter-2又はΔCter-3の欠失に加えて、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個又は13個の欠失の組み合わせを含むことができ、(複数の)欠失は、表２においてΔ1、Δ2、Δ3、Δ4、Δ5、Δ6、Δ7、Δ8、Δ9、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13として参照される任意の欠失から選択される。
特定の実施形態において:
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に由来し、以下:
(i)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表２におけるΔ1、Δ2、Δ3、Δ4、Δ5、Δ6、Δ7、Δ8、Δ9、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13として参照される任意の欠失から選択される1つ以上の欠失
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に由来し、以下:
(i)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表２におけるΔ1、Δ2、Δ3、Δ4、Δ5、Δ6、Δ7、Δ8、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13として参照される任意の欠失から選択される1つ以上の欠失
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に由来し、以下:
(i)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表２におけるΔ1、Δ2、Δ3、Δ4、Δ5、Δ6、Δ7、Δ8、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13として参照される任意の欠失から選択される1つ以上の欠失
を含む。
特定の実施形態において:
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に由来し、以下:
(i)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表２におけるΔ1、Δ2、Δ3、Δ4、Δ5、Δ6、Δ7、Δ8、Δ9、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13として参照される任意の欠失から選択される1つ以上の欠失
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に由来し、以下:
(i)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表２におけるΔ1、Δ2、Δ3、Δ4、Δ5、Δ6、Δ7、Δ8、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13として参照される任意の欠失から選択される1つ以上の欠失
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に由来し、以下:
(i)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表２におけるΔ1、Δ2、Δ3、Δ4、Δ5、Δ6、Δ7、Δ8、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13として参照される任意の欠失から選択される1つ以上の欠失
を含む。
更なる特定の実施形態において:
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1若しくは配列番号61に由来し：以下
(i)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表１において参照されるΔCter-1欠失;並びに
(ii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表２におけるΔ1、Δ2、Δ3、Δ4、Δ5、Δ6、Δ7、Δ8、Δ9、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13として参照される任意の欠失から選択される1つ以上の欠失;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2若しくは配列番号62に由来し：以下
(i)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表１において参照されるΔCter-2欠失;並びに
(ii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表２におけるΔ1、Δ2、Δ3、Δ4、Δ5、Δ6、Δ7、Δ8、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13として参照される任意の欠失から選択される1つ以上の欠失;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3若しくは配列番号63に由来し：以下
(i)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表１において参照されるΔCter-3欠失;及び
(ii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表２におけるΔ1、Δ2、Δ3、Δ4、Δ5、Δ6、Δ7、Δ8、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13として参照される任意の欠失から選択される1つ以上の欠失;
を含む。
更なる特定の実施形態において:
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1若しくは配列番号61に由来し、以下:
(i)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から132までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも132個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から132までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも30個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも81個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも103個の連続したアミノ酸、少なくとも125個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも132個の連続したアミノ酸のN末端欠失
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2若しくは配列番号62に由来し、以下:
(i)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から115までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも115個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から115までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10個の連続したアミノ酸、少なくとも13個の連続したアミノ酸、少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも60個の連続したアミノ酸、少なくとも64個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも85個の連続したアミノ酸、少なくとも86個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも110個の連続したアミノ酸、少なくとも112個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも115個の連続したアミノ酸のN末端欠失
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3若しくは配列番号63に由来し、以下:
(i)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から116までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも116個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から116までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10個の連続したアミノ酸、少なくとも14個の連続したアミノ酸、少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも60個の連続したアミノ酸、少なくとも65個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも85個の連続したアミノ酸、少なくとも87個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも110個の連続したアミノ酸、少なくとも113個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも116個の連続したアミノ酸のN末端欠失
を含む。
もう一つの特定の実施形態において:
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1若しくは配列番号61に由来し、以下:
(i)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から132までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも132個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から132までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも30の連続したアミノ酸、少なくとも50の連続したアミノ酸、少なくとも75の連続したアミノ酸、少なくとも80の連続したアミノ酸、少なくとも81の連続したアミノ酸、少なくとも100の連続したアミノ酸、少なくとも103の連続したアミノ酸、少なくとも125の連続したアミノ酸若しくは少なくとも132個の連続したアミノ酸のN末端欠失
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2若しくは配列番号62に由来し、以下:
(i)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から115までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも115個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から115までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10個の連続したアミノ酸、少なくとも13個の連続したアミノ酸、少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも60個の連続したアミノ酸、少なくとも64個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも85個の連続したアミノ酸、少なくとも86個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも110個の連続したアミノ酸、少なくとも112個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも115個の連続したアミノ酸のN末端欠失
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3若しくは配列番号63に由来し、以下:
(i)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から116までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも116個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から116までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10個の連続したアミノ酸、少なくとも14個の連続したアミノ酸、少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも60個の連続したアミノ酸、少なくとも65個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも85個の連続したアミノ酸、少なくとも87個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも110個の連続したアミノ酸、少なくとも113個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも116個の連続したアミノ酸のN末端欠失
を含む。
もう一つの特定の実施形態において:
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に由来し、以下:
(i)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表１において参照されるΔCter-1欠失;及び
(ii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から132までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも132個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から132までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも30個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも81個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも103個の連続したアミノ酸、少なくとも125個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも132個の連続したアミノ酸のN末端欠失;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に由来し、以下:
(i)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表１において参照されるΔCter-2欠失;及び
(ii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から115までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも115個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から115までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10個の連続したアミノ酸、少なくとも13個の連続したアミノ酸、少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも60個の連続したアミノ酸、少なくとも64個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも85個の連続したアミノ酸、少なくとも86個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも110個の連続したアミノ酸、少なくとも112個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも115個の連続したアミノ酸のN末端欠失;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に由来し、以下:
(i)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表１において参照されるΔCter-3欠失;及び
(ii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から116までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも116個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から116までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10個の連続したアミノ酸、少なくとも14個の連続したアミノ酸、少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも60個の連続したアミノ酸、少なくとも65個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも85個の連続したアミノ酸、少なくとも87個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも110個の連続したアミノ酸、少なくとも113個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも116個の連続したアミノ酸のN末端欠失
を含む。
特定の実施形態において:
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に由来し、以下:
(i)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表２において参照されるΔ9、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に由来し、以下:
(i)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表２において参照されるΔ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に由来し、以下:
(i)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表２において参照されるΔ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ;
を含む。
もう一つの特定の実施形態において、
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に由来し、以下:
(i)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表２において参照されるΔ9、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に由来し、以下:
(i)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表２において参照されるΔ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に由来し、以下:
(i)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失;並びに
(ii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表２において参照されるΔ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ;
を含む。
もう一つの特定の実施形態において:
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に由来し、以下:
(i)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表１において参照されるΔCter-1欠失;並びに
(ii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表２において参照されるΔ9、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に由来し、以下:
(i)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表１において参照されるΔCter-2欠失;並びに
(ii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表２において参照されるΔ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に由来し、以下:
(i)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表１において参照されるΔCter-3欠失;並びに
(ii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表２において参照されるΔ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ;
を含む。
特定の実施形態において:
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に由来し、以下:
(i)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失;
(ii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ;並びに
(iii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から132までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも132個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から132までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも30個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも81個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも103個の連続したアミノ酸、少なくとも125個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも132個の連続したアミノ酸のN末端欠失;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に由来し、以下:
(i)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失;
(ii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ;並びに
(iii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から115までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも115個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から115までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10個の連続したアミノ酸、少なくとも13の連続したアミノ酸、少なくとも15の連続したアミノ酸、少なくとも25の連続したアミノ酸、少なくとも50の連続したアミノ酸、少なくとも60の連続したアミノ酸、少なくとも64の連続したアミノ酸、少なくとも75の連続したアミノ酸、少なくとも80の連続したアミノ酸、少なくとも85の連続したアミノ酸、少なくとも86の連続したアミノ酸、少なくとも100の連続したアミノ酸、少なくとも110の連続したアミノ酸、少なくとも112の連続したアミノ酸若しくは少なくとも115の連続したアミノ酸のN末端欠失;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に由来し、以下:
(i)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失;
(ii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ;並びに
(iii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から116までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも116個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から116までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10個の連続したアミノ酸、少なくとも14個の連続したアミノ酸、少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも60個の連続したアミノ酸、少なくとも65個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも85個の連続したアミノ酸、少なくとも87個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも110個の連続したアミノ酸、少なくとも113個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも116個の連続したアミノ酸のN末端欠失;
を含む。
もう一つの特定の実施形態において:
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に由来し、以下:
(i)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失;
(ii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ;並びに
(iii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から132までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも132個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から132までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも30個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも81個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも103個の連続したアミノ酸、少なくとも125個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも132個の連続したアミノ酸のN末端欠失
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に由来し、以下:
(i)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失;
(ii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ;並びに
(iii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から115までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも115個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から115までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10個の連続したアミノ酸、少なくとも13個の連続したアミノ酸、少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも60個の連続したアミノ酸、少なくとも64個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも85個の連続したアミノ酸、少なくとも86個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも110個の連続したアミノ酸、少なくとも112個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも115個の連続したアミノ酸のN末端欠失;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に由来し、以下:
(i)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失;
(ii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ;並びに
(iii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から116までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも116個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から116までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10個の連続したアミノ酸、少なくとも14個の連続したアミノ酸、少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも60個の連続したアミノ酸、少なくとも65個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも85個の連続したアミノ酸、少なくとも87個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも110個の連続したアミノ酸、少なくとも113個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも116個の連続したアミノ酸のN末端欠失
を含む。
もう一つの特定の実施形態において:
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に由来し、以下:
(i)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表１において参照されるΔCter-1欠失;並びに
(ii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ、並びに
(iii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から132までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも132個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1から132までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも30個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも81個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも103個の連続したアミノ酸、少なくとも125個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも132個の連続したアミノ酸のN末端欠失;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に由来し、以下:
(i)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表１において参照されるΔCter-2欠失;
(ii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ;並びに
(iii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から115までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも115個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1から115までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10個の連続したアミノ酸、少なくとも13個の連続したアミノ酸、少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも60個の連続したアミノ酸、少なくとも64個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも85個の連続したアミノ酸、少なくとも86個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも110個の連続したアミノ酸、少なくとも112個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも115個の連続したアミノ酸のN末端欠失;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に由来し、以下:
(i)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表１において参照されるΔCter-3欠失;
(ii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ;並びに
(iii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から116までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも116個のアミノ酸のN末端欠失、特には、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1から116までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも10個の連続したアミノ酸、少なくとも14個の連続したアミノ酸、少なくとも15個の連続したアミノ酸、少なくとも25個の連続したアミノ酸、少なくとも50個の連続したアミノ酸、少なくとも60個の連続したアミノ酸、少なくとも65個の連続したアミノ酸、少なくとも75個の連続したアミノ酸、少なくとも80個の連続したアミノ酸、少なくとも85個の連続したアミノ酸、少なくとも87個の連続したアミノ酸、少なくとも100個の連続したアミノ酸、少なくとも110個の連続したアミノ酸、少なくとも113個の連続したアミノ酸若しくは少なくとも116個の連続したアミノ酸のN末端欠失;
を含む。
特定の実施形態において:
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に由来し、以下:
(i)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失;
(ii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ、並びに
(iii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表２において参照されるΔ9、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に由来し、以下:
(i)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失;
(ii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ;並びに
(iii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表２において参照されるΔ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に由来し、以下:
(i)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失;
(ii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ;並びに
(iii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表２において参照されるΔ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ
を含む。
もう一つの特定の実施形態において:
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に由来し、以下:
(i)配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個若しく少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失;
(ii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ、並びに
(iii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表２において参照されるΔ9、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に由来し、以下:
(i)配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個若しく少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失;
(ii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ、並びに
(iii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表２において参照されるΔ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に由来し、以下:
(i)配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸、好ましくは、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105個若しく少なくとも110個の連続したアミノ酸のC末端欠失;
(ii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ;並びに
(iii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表２において参照されるΔ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ
を含む。
もう一つの特定の実施形態において:
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号1又は配列番号61に由来し、以下:
(i)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表１において参照されるΔCter-1欠失;
(ii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ、並びに
(iii)配列番号1若しくは配列番号61に関して、表２において参照されるΔ9、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号2又は配列番号62に由来し、以下:
(i)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表１において参照されるΔCter-2欠失;
(ii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ;並びに
(iii)配列番号2若しくは配列番号62に関して、表２において参照されるΔ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ;
を含み、又は
- 機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号3又は配列番号63に由来し、以下:
(i)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表１において参照されるΔCter-3欠失;
(ii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表２において参照される欠失若しくは欠失の組み合わせ;並びに
(iii)配列番号3若しくは配列番号63に関して、表２において参照されるΔ10、Δ11、Δ12及びΔ13の欠失から選択される欠失若しくは欠失の組み合わせ
を含む。
更なる特定の実施形態において、本発明による機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号7又は配列番号64、特には配列番号7の配列を含む又はから成る。機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号7又は配列番号64、特には配列番号7と比較して、1又は複数個のアミノ酸の変更、例えばアミノ酸の挿入、欠失及び/又は置換を含むことができる。特には、機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号7若しくは配列番号64、特には配列番号7と比較して、1、2、3、4又は5個のアミノ酸の変更を含むことができる。特には、機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号7又は配列番号64、特には配列番号7に対して、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は少なくとも99%の配列同一性を有することができる。
更なる特定の実施形態において、本発明による機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号8又は配列番号65、特には配列番号8の配列を含む又はから成る。機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号8又は配列番号65、特には配列番号8と比較して、1又は複数個のアミノ酸の変更、例えばアミノ酸の挿入、欠失及び/又は置換を含むことができる。特には、機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号8若しくは配列番号65、特には配列番号8と比較して、1、2、3、4又は5個のアミノ酸の変更を含むことができる。特には、機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号8又は配列番号65、特には配列番号8に対して、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は少なくとも99%の配列同一性を有することができる。
更なる特定の実施形態において、本発明による機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号9又は配列番号66、特には配列番号9の配列を含む又はから成る。機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号9又は配列番号66、特には配列番号9と比較して、1又は複数個のアミノ酸の変更、例えばアミノ酸の挿入、欠失及び/又は置換を含むことができる。特には、機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号9若しくは配列番号66、特には配列番号9と比較して、1、2、3、4又は5個のアミノ酸の変更を含むことができる。特には、機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、配列番号9又は配列番号66、特には配列番号9に対して、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は少なくとも99%の配列同一性を有することができる。
もう一つの特定の実施形態において、本発明の機能的な切断GDEポリペプチドは、以下:
－ 配列番号25:配列番号1に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失;及び位置1から156までのアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチド;
－ 配列番号26:配列番号1に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失;及び位置361から428までのアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチド;
－ 配列番号27:配列番号1に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失;及び位置668から769までのアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチド;
－ 配列番号28:配列番号1に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失;位置361から428までのアミノ酸の欠失;及び位置668から769までのアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチド;
－ 配列番号29:配列番号1に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失;及び位置895から1087までのアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチド;
－ 配列番号30:配列番号1に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失;位置223から320までのアミノ酸の欠失;位置360から428までのアミノ酸の欠失;及び位置669から720までのアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチド;
－ 配列番号31:配列番号1に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失;及び位置1から280までのアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチド;
－ 配列番号32:配列番号1に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失;及び位置1から425までのアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチド;
－ 配列番号33:配列番号1に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失;及び位置1から230までのアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチド;
－ 配列番号10:配列番号1に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失及び位置1～15のアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチド;
－ 配列番号11:配列番号1に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失及び位置1～30のアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチド;
－ 配列番号12:配列番号1に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失及び位置1～81のアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチド;
－ 配列番号13:配列番号1に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失及び位置1～103のアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチド;並びに
－ 配列番号14:配列番号1に関して、位置1421から1532までのアミノ酸のC末端欠失及び位置1～129のアミノ酸の欠失を含む、機能的なC末端切断GDEポリペプチド
から成る群から選択される。
欠失がN末端欠失であるとき、メチオニンは、配列のN末端に追加されることができる。例えば、配列番号32は、配列番号1に関して、位置1から425までのアミノ酸の欠失及びこの欠失により生じる配列のN末端におけるメチオニンの付加を含む。
更なる特定の実施形態において、本発明の機能的な切断GDEポリペプチドは、配列番号25から33及び配列番号10から14から選択される配列、特には配列番号10から14から選択される配列、特には配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13及び配列番号14から選択される配列を含む又はから成る。機能的な切断GDEポリペプチドは、配列番号25から33及び配列番号10から14、特には配列番号10から14から選択される配列、特には配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13及び配列番号14から選択される配列と比較して、1又は複数個のアミノ酸の変更、例えばアミノ酸の挿入、欠失及び/又は置換を含むことができる。特には、機能的な切断GDEポリペプチドは、配列番号25から33及び配列番号10から14、特には配列番号10から14から選択される配列、特には配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13及び配列番号14から選択される配列と比較して、1、2、3、4又は5個のアミノ酸の変更を含むことができる。特には、機能的な切断GDEポリペプチドは、配列番号25から33及び配列番号10から14、特には配列番号10から14から選択される配列、特には配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13及び配列番号14から選択される配列に対して、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は少なくとも99%の配列同一性を有することができる。
2- C末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子
もう一つの態様において、本発明は、上記で定義される機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
用語「核酸分子(nucleic acid molecule)」(又は核酸配列(nucleic acid sequence))は、一本鎖又は二本鎖の形態のDNA又はRNA分子、特には本発明による機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードするDNAを指す。
本発明によると、機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子は、遺伝子療法ベクターに収納されることができるほど十分に小さい。
「遺伝子療法ベクター(gene therapy vector)」は、遺伝子療法に適切な任意のベクターを意味する。特には、遺伝子療法ベクターは、プラスミド又はリコンビナントウイルス、例えばレトロウイルス又はレンチウイルスに由来するウイルスベクターであることができる。好ましくは、ウイルスベクターは、AAVベクター、例えば肝臓組織又は筋細胞に形質導入するのに適切なAAVベクターである。筋疾患の臨床試験及び前臨床モデルにおける広範な経験は、アデノ関連ウイルス(AAV)を、GSDIIIのためのin vivoでの遺伝子療法のための選択のベクターとして示す。これらのベクターは、肝臓及び筋肉に効率的に形質導入し、それらの産生は、拡張可能であり、他の遺伝子療法ベクターと比較して、それらは比較的低い免疫原性のプロファイルを有する。しかしながら、遺伝子置換のためのAAVの使用における最も大きな制限の一つは、それらの制限されたキャプシド形成サイズの制限(約5kb)である。実際に、リコンビナントAAVの産生の間に、5kbよりも大きなゲノムは、低い効率でキャプシド形成され、結果として生じるAAVは、遺伝子トランスファーの効率を減少させる断片化されたゲノムを含む可能性がある。
好ましい実施形態において、機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子は、AAVベクターに収納されることができるほど十分に小さい。好ましくは、機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子のサイズは、約4.5kb未満、例えば4.4、4.3、4.2、4.1、4、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1又は3kb未満である。好ましくは、機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子は、約4.4kb未満、例えば4.3、4.2又は4.1kb未満である。
特定の実施形態において、機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子のサイズは、少なくとも1.8kb、例えば少なくとも1.9、2、2.1又は2.2kbである。特定の実施形態において、機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子のサイズは、少なくとも1.8kbであり、多くとも4.5kbである。好ましくは、機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子のサイズは、少なくとも2kbであり、多くとも4.4kbである。特定の実施形態において、機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子のサイズは、少なくとも2.2kbであり多くとも4.3kbである。
機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする、本発明の核酸分子の配列は、in vivoでのGDEポリペプチドの発現のために最適化されることができる。配列の最適化は、コドンの最適化、GC含量の増加、CpGアイランドの数の減少、代替的なオープンリーディングフレーム(ARF)の数の減少及びスプライス供与及びスプライス受容の部位の数の減少を含む、核酸配列の多くの変更を含むことができる。遺伝子コードの縮重により、異なる核酸分子は、同じタンパク質をコードすることができる。異なる生物の遺伝子コードは、同じアミノ酸をコードするいくつかのコドンの一つを、他のコドンよりも使用することへとしばしば偏っていることもまたよく知られている。コドンの最適化を通して、結果として生じるコドン最適化ヌクレオチド配列が、非コドン最適化配列と比較して比較的高いレベルで、所与の細胞の構成においてより発現しやすいように、所与の細胞の構成に存在するコドンの偏りを利用する変更が、ヌクレオチド配列において導入される。本発明の好ましい実施形態において、機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードするそのような最適化されたヌクレオチド配列は、同じ機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする非コドン最適化ヌクレオチド配列と比較して、ヒト細胞においてその発現を改善させるために、例えば、ヒト特異的なコドンの利用の偏りを利用することで、コドン最適化される。全長ヒトGDEアイソフォーム1をコードする核酸配列は、配列番号4又は配列番号58に示される通りである。対応するコドン最適化配列の例は、配列番号5、配列番号6又は配列番号67において示される通りである。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号7に示されるアミノ酸配列を有する機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号56に示される配列を含み又はから成る。
上記で定義される機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号56のヌクレオチド配列に対して、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有することができる。特定の実施形態において、上記で定義される機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号56のヌクレオチド配列に対して、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有することができる。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号56のヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の同一性、例えば少なくとも96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有する。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号8に示されるアミノ酸配列を有する機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号9に示されるアミノ酸配列を有する機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号57に示される配列を含む又はから成る。
上記で定義される機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号57のヌクレオチド配列に対して、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有することができる。特定の実施形態において、上記で定義される機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号57のヌクレオチド配列に対して、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有することができる。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号57のヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の同一性、例えば少なくとも96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有する。
用語「同一な(identical)」及びその類語は、二つの核酸分子間の又は二つのポリペプチド分子間の配列同一性を指す。二つの比較される配列の両方における位置が同じ塩基又は同じアミノ酸により占められているとき、分子はその位置において同一である。二つの配列間の同一性の割合は、二つの配列により共有されるマッチする位置の数を、位置の数により割りX 100で比較する、関数である。例えば、二つの配列における位置の10個の内6個がマッチする場合、二つの配列は、60%同一である。一般的には、比較は、二つの配列が整列して最大の同一性を与えるときに行われる。当業者に知られる多様なバイオインフォマティクスのツールが核酸配列を整列されるために使用されることができ、それは、例えばBLAST又はFASTAである。
既に言及したように、上記の配列は、コドン最適化されることができる。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、以下:
－ 配列番号25に示されるアミノ酸配列を有する機能的な切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号34に示される配列;
－ 配列番号26に示されるアミノ酸配列を有する機能的な切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号36に示される配列;
－ 配列番号27に示されるアミノ酸配列を有する機能的な切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号37に示される配列;
－ 配列番号28に示されるアミノ酸配列を有する機能的な切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号38に示される配列;
－ 配列番号29に示されるアミノ酸配列を有する機能的な切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号40に示される配列;
－ 配列番号30に示されるアミノ酸配列を有する機能的な切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号42に示される配列;
－ 配列番号31に示されるアミノ酸配列を有する機能的な切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号43に示される配列;
－ 配列番号32に示されるアミノ酸配列を有する機能的な切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号44に示される配列;
－ 配列番号33に示されるアミノ酸配列を有する機能的な切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号45に示される配列;
－ 配列番号10に示されるアミノ酸配列を有する機能的な切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号15若しくは配列番号20に示される配列;
－ 配列番号11に示されるアミノ酸配列を有する機能的な切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号16若しくは配列番号21に示される配列;
－ 配列番号12に示されるアミノ酸配列を有する機能的な切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号17若しくは配列番号22に示される配列;
－ 配列番号13に示されるアミノ酸配列を有する機能的な切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号18若しくは配列番号23に示される配列;又は
－ 配列番号14に示されるアミノ酸配列を有する機能的な切断GDEポリペプチドをコードする、配列番号19若しくは配列番号24に示される配列
を含む又はから成る。
上記で定義される機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号34から45及び配列番号15から24の任意のヌクレオチド配列に対して、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有することができる。特定の実施形態において、上記で定義される機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号34から45、配列番号15から24の任意のヌクレオチド配列に対して、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有することができる。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号34から45及び配列番号15から24の任意のヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の同一性、例えば少なくとも96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有する。
3- 核酸分子コンストラクト
本発明は、上述の本発明の核酸分子を含む、核酸コンストラクトにもまた関する。核酸コンストラクトは、1つ以上の発現制御配列及び/又は発現を改善させる他の配列と操作可能に接続される、本発明の核酸配列を含む発現カセットに相当することができる。本明細書において使用される、用語「操作可能に接続される(operably linked)」は、機能的な関係におけるポリヌクレオチドの要素の接続を指す。核酸は、それがもう一つの核酸配列と機能的な関係に置かれる場合に、「操作可能に接続される」。例えば、プロモーター、又はもう一つの転写制御配列は、それがコード配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に操作可能に接続される。そのような発現制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー(例えば、cis-制御モジュール(CRM))、イントロン、ポリAシグナル等は、当該技術分野において公知である。
特定の実施形態において、発現カセットはプロモーターを含むことができる。プロモーターは、遍在する又は組織特異的なプロモーター、特には、GDEの発現が望ましい細胞又は組織、例えばGDE欠失患者におけるGDE発現が望ましい細胞又は組織における発現を促進することのできるプロモーターであることができる。
特定の実施形態において、プロモーターは筋肉特異的なプロモーターである。筋肉特異的なプロモーターの制限されない例は、筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーターを含む。適切な筋肉クレアチンキナーゼプロモーターの制限されない例は、ヒト筋肉クレアチンキナーゼプロモーター及び切断マウス筋肉クレアチンキナーゼ[(tMCK)プロモーター]である(Wang Bら、Construction and analysis of compact muscle-selective promoters for AAV vectors. Gene Ther. 2008 Nov;15(22):1489-99) (代表的なGenBank Accession No. AF188002)。ヒト筋肉クレアチンキナーゼは、遺伝子ID No.1158を有する(代表的なGenBank Accession No. NC_000019.9、December 26, 2012にアクセス)。筋肉特異的なプロモーターの他の例は、合成プロモーターC5.12(spC5.12、代替的に、本明細書で「C5.12」として参照される)、例えばspC5.12又はspC5.12プロモーター(Wangら、Gene Therapy volume 15、pages 1489-1499 (2008)において公開される)、MHCK7プロモーター(Salvaら、Mol Ther. 2007 Feb;15(2):320-9)、ミオシン軽鎖(MLC)プロモーター、例えばMLC2(Gene ID No. 4633;代表的なGenBank Accession No. NG_007554.1、December 26, 2012にアクセス);ミオシン重鎖(MHC)プロモーター、例えばアルファ-MHC(Gene ID No. 4624;代表的なGenBank Accession No. NG_023444.1、December 26, 2012にアクセス);デスミンプロモーター(Gene ID No. 1674;代表的なGenBank Accession No. NG_008043.1、December 26, 2012にアクセス);心臓トロポニンCプロモーター(Gene ID No. 7134;代替的なGenBank Accession No. NG_008963.1、December 26, 2012にアクセス);トロポニンIプロモーター(Gene ID Nos. 7135、7136及び7137;代表的なGenBank Accession Nos. NG_016649.1、NG_011621.1及びNG_007866.2、December 26, 2012にアクセス);myoD遺伝子ファミリープロモーター(Weintraubら、Science、251、761 (1991); Gene ID No. 4654;代表的なGenBank Accession No. NM_002478、December 26, 2012にアクセス);アルファアクチンプロモーター(Gene ID Nos. 58、59及び70;代表的なGenBank Accession Nos. NG_006672.1, NG_011541.1及びNG_007553.1,December 26, 2012にアクセス);ベータアクチンプロモーター(Gene ID No. 60;代表的なGenBank Accession No. NG_007992.1、December 26, 2012にアクセス);ガンマアクチンプロモーター(Gene ID No. 71及び72;代表的なGenBank Accession No. NG_011433.1及びNM_001199893、December 26, 2012にアクセス);Pitx3の視覚的な形態のイントロン1内に存在する筋肉特異的なプロモーター(Gene ID No. 5309)(Coulonら;代表的なGenBank Accession No. NG_008147の残基11219～11527に相当する筋肉選択的なプロモーター、December 26, 2012にアクセス);並びに米国特許第2003/0157064号明細書において記載されるプロモーター、及びCK6プロモーター(Wangら、2008 doi: 10.1038/gt.2008.104)を含む。もう一つの特定の実施形態において、筋肉特異的なプロモーターは、Wangら、Gene Therapy volume 15、pages 1489-1499 (2008)において記載されるE-Synプロモーターであり、MCK-由来エンハンサー及びspC5.12プロモーターの組み合わせを含む。本発明の特定の実施形態において、筋肉特異的なプロモーターは、spC5.12プロモーター、MHCK7プロモーター、E-synプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼミオシン軽鎖(MLC)プロモーター、ミオシン重鎖(MHC)プロモーター、心臓トロポニンCプロモーター、トロポニンIプロモーター、myoD遺伝子ファミリープロモーター、アルファアクチンプロモーター、ベータアクチンプロモーター、ガンマアクチンプロモーター、Pitx3の視覚的な形態のイントロン1内に存在する筋肉特異的なプロモーター、CK6プロモーター、CK8プロモーター及びActa1プロモーターから成る群から選択される。特定の実施形態において、筋肉特異的なプロモーターは、spC5.12、デスミン及びMCKプロモーターから成る群から選択される。更なる実施形態において、筋肉特異的なプロモーターは、spC5.12及びMCKプロモーターから成る群から選択される。特定の実施形態において、筋肉特異的なプロモーターはspC5.12プロモーターである。
特定の実施形態において、プロモーターは肝臓特異的なプロモーターである。肝臓特異的なプロモーターの制限されない例は、アルファ-1抗トリプシンプロモーター(hAAT)、トランスチレチンプロモーター、アルブミンプロモーター、サイロキシン結合グロブリン(TBG)プロモーター、LSPプロモーター(甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター配列、アルファ1マイクログロブリン/ビクニンエンハンサー配列の2つのコピー及びリーダー配列を含む－-Ill、C. R.ら、(1997) Optimization of the human factor VIII complementary DNA expression plasmid for gene therapy of hemophilia A. Blood Coag. Fibrinol. 8: S23-S30.)等を含む。他の有用な肝臓特異的なプロモーターは、当該技術分野において知られており、例えばコールドスプリングハーバー研究所で編集された肝臓特異的な遺伝子プロモーターデータベースにおいて列挙されるものである(http://rulai.cshl.edu/LSPD/)。本発明の文脈における好ましい肝臓特異的なプロモーターは、hAATプロモーターである。
もう一つの特定の実施形態において、プロモーターはニューロン特異的なプロモーターである。ニューロン特異的なプロモーターの制限されない例は、以下:シナプシン-1(Syn)プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)プロモーター(Andersenら、Cell. Mol. Neurobiol.、13:503-15 (1993))、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター(Piccioliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991))及びニューロン特異的vgf遺伝子プロモーター(Piccioliら、Neuron、15:373- 84 (1995))を含むがそれらに限定されず、とりわけそれらは当業者に明らかである。特定の実施形態において、ニューロン特異的なプロモーターは、Synプロモーターである。他のニューロン特異的なプロモーターは、以下:シナプシン-2プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼプロモーター、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼプロモーター、低アフィニティーNGF受容体プロモーター及びコリンアセチルトランスフェラーゼプロモーター(Bejaninら、1992;Carrollら、1995;Chin及びGreengard、1994;Foss-Petterら、1990;Harringtonら、1987;Mercerら、1991;Pateiら、1986)を含むが制限されない。運動ニューロンに特異的な代表的なプロモーターは、公知の運動ニューロン由来因子である、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)のプロモーターを含むが制限されない。運動ニューロンにおいて機能的な他のプロモーターは、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、シナプシン及びHb9のプロモーターを含む。本発明において有用な他のニューロン特異的なプロモーターは、以下:GFAP(星状細胞のため)、カルビンジン2(介在ニューロンのため)、Mnx1(運動ニューロン)、ネスチン(ニューロン)、パルブアルブミン、ソマトスタチン及びPlp1(オリゴデンドロサイト及びシュワン細胞)を含むが制限されない。
もう一つの特定の実施形態において、プロモーターは遍在するプロモーターである。代表的な遍在するプロモーターは、サイトメガロウイルスエンハンサー/チキンベータアクチン(CAG)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/プロモーター(CMV)(任意にCMVエンハンサーと共に)[例えば、Boshartら、Cell、41:521-530 (1985)を参照]、PGKプロモーター、SV40初期プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター(任意にRSVエンハンサーと共に)、ジヒドロフォレートレダクターゼプロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモーター及びEF1アルファプロモーターを含む。
加えて、プロモーターは、内因性のプロモーター、例えばアルブミンプロモーター又はGDEプロモーターであることもまたできる。
特定の実施形態において、プロモーターは、エンハンサー配列、例えばcis制御モジュール(CRM)又は人工的なエンハンサー配列に連結している。本発明の実施において有用なCRMは、Rinconら、Mol Ther. 2015 Jan;23(1):43-52、Chuahら、Mol Ther. 2014 Sep;22(9):1605-13又はNairら、Blood. 2014 May 15;123(20):3195-9に記載されるものを含む。特には、遺伝子の筋肉特異的な発現、特には心臓の筋肉及び/又は骨格筋における発現を高めることのできる、他の制御要素は、国際公開第2015/110449号において公開されるものである。人工的な配列を含む核酸制御要素の特定の例は、国際公開第2015/110449号において公開される配列に存在する転写因子結合部位(TFBS)を再編成することにより得られる制御要素を含む。前記再編成は、TFBSの順序を変更すること及び/又は他のTFBSと比較して1つ以上のTFBSの位置を変更すること及び/又は1つ以上のTFBSのコピー数を変更することを包含することができる。例えば、筋肉特異的な遺伝子発現、特には心臓及び骨格筋特異的な遺伝子発現を高めるための核酸制御要素は、E2A、HNH1、NF1、C/EBP、LRF、MyoD及びSREBPのための;又はE2A、NF1、p53、C/EBP、LRF及びSREBPのための;又はE2A、HNH1、HNF3a、HNF3b、NF1、C/EBP、LRF、MyoD及びSREBPのための;又はE2A、HNF3a、NF1、C/EBP、LRF、MyoD及びSREBPのための;又はE2A、HNF3a、NF1、CEBP、LRF、MyoD及びSREBPのための;又はHNF4、NF1、RSRFC4、C/EBP、LRF及びMyoD若しくはNF1、PPAR、p53、C/EBP、LRF及びMyoDのための結合部位を含むことができる。例えば、筋肉特異的な遺伝子発現、特には骨格筋特異的な遺伝子発現を高めるための核酸制御要素は、E2A、NF1、SRFC、p53、C/EBP、LRF及びMyoDのための;又はE2A、NF1、C/EBP、LRF、MyoD及びSREBPのための;又はE2A、HNF3a、C/EBP、LRF、MyoD、SEREBP及びTal1_bのための;又はE2A、SRF、p53、C/EBP、LRF、MyoD及びSREBPのための;又はHNF4、NF1、RSRFC4、C/EBP、LRF及びSREBPのための;又はE2A、HNF3a、HNF3b、NF1、SRF、C/EBP、LRF、MyoD及びSREBPのための;又はE2A、CEBP及びMyoDのための結合部位を含むこともまたできる。更なる例において、これらの核酸制御要素は、上記の1つ以上のTFBSの少なくとも2つ、例えば2、3、4つ以上のコピーを含む。特には、遺伝子の肝臓特異的な発現を高めることのできる他の制御要素は、国際公開第2009/130208号において公開されるものである。
もう一つの特定の実施形態において、核酸コンストラクトは、イントロン、特にはプロモーター及びGDEコード配列の間に位置するイントロンを含む。イントロンは、mRNAの安定性及びタンパク質の産生を増加させるために導入されることができる。更なる実施形態において、イントロンは、ヒトベータグロビンb2(又はHBB2)イントロン、凝固因子IX(FIX)イントロン、SV40イントロン、hCMVイントロンA(hCMVI)、TPLイントロン(TPLI)、CHEF1遺伝子イントロン1(CHEFI)、MVMイントロン(Wuら、2008)、FIX切断イントロン1(Wuら、2008、Mol Ther、16(2):280-289 ; Kurachiら、1995、J Biol Chem.、270(10):5276-5281)、β-グロビン/免疫グロビン重鎖ハイブリッドイントロン(ヒトβ-グロビンイントロン由来の5’-供与部位及び免疫グロブリン重鎖可変領域イントロン由来の3’-受容部位、Wuら、2008、Mol Ther、16(2):280-289;Kurachiら、1995、J Biol Chem.、270(10):5276-5281)、アデノウイルススプライスドナー及び免疫グロブリンGスプライスから成るハイブリッドイントロン(Wongら、1985、Chromosoma、92(2):124-135;Yewら、1997、Hum Gene Ther、8(5):575-584;Choi T.ら、1991、Mol Cell Biol、11(6):3070-3074;Huangら、1990、Mol Cell Biol.、10(4):1805-1810)、ハイブリッド19S/16S SV40イントロン(19Sイントロン由来の5’-供与部位及び16Sイントロン由来の3’-受容部位、Yewら、1997、Hum Gene Ther、8(5):575-584)又はチキンベータ-グロビンイントロンである。もう一つの更なる実施形態において、イントロンは、前記イントロンにおいて見られる代替的なオープンリーディングフレーム(ARF)の数を減少させる又は更に全体的に取り除くためにデザインされる、変更されたイントロン(特には変更されたHBB2又はFIXイントロン)である。好ましくは、ARFは、50bp超に及ぶ長さのものは取り除かれ、開始コドンと同じフレームで終止コドンを有する。ARFは、イントロンの配列を変更することにより取り除かれることができる。例えば、変更は、ヌクレオチドの置換、挿入又は欠失により、好ましくはヌクレオチドの置換により、実施されることができる。説明として、対象とするイントロンの配列において存在するATG又はGTG開始コドンにおける1又は複数個のヌクレオチド、特には1個のヌクレオチドは、置換され、非開始コドンを生じることができる。例えば、対象とするイントロンの配列内で、ATG又はGTGは、開始コドンではないCTGにより置換されることができる。
古典的なHBB2イントロンは、配列番号46に示される。例えば、このHBB2イントロンは、前記イントロン内の開始コドン(ATG及びGTGコドン)を取り除くことにより変更されることができる。特定の実施形態において、変更されたHBB2イントロンは、配列番号47に示される配列を有する。古典的なFIXイントロンは、ヒトFIXの第一のイントロンに由来し、配列番号48に示される。FIXイントロンは、前記イントロン内の開始コドン(ATG及びGTGコドン)を取り除くことにより変更されることができる。特定の実施形態において、変更されたFIXイントロンは、配列番号49に示される配列を有する。核酸コンストラクトにおいて使用される古典的なチキン-ベータグロビンイントロンは、配列番号50に示される。チキン-ベータグロビンイントロンは、前記イントロン内の開始コドン(ATG及びGTGコドン)を取り除くことにより変更されることができる。特定の実施形態において、変更されるチキン-ベータグロビンイントロンは、配列番号51に示される配列を有する。
本発明者は、過去に国際公開第2015/162302において、そのような変更されたイントロン、特には変更されたHBB2又はFIXイントロンが、有利な特性を有し、導入遺伝子の発現を著しく改善させることができることを示した。
特定の実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、5'から3'方向で、エンハンサーに任意に先行されるプロモーター、本発明のコード配列(すなわち、機能的なC末端欠失GDEポリペプチドをコードする核酸分子)及びポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(bGH polyA)、SV40ポリアデニル化シグナル又はもう一つの天然に発生する若しくは人工的なポリアデニル化シグナルを含む、発現カセットである。好ましくは、ポリアデニル化シグナルは、bGH polyAである。特定の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号53に示されるbGH polyAである。特定の実施形態において、非常に短いポリAシグナルが使用される。例えば、20個未満のヌクレオチドを含む非常に短いpolyAシグナルが使用される。特定の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ヒト可溶性ニューロピリン-1(sNRP)ポリアデニル化シグナル(sNRP polyA;配列番号52)である。もう一つの特定の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号54に示されるpA58ポリアデニル化シグナルである。
特定の実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、5'から3'方向で、エンハンサーに任意に先行されるプロモーター、イントロン、本発明のコード配列及びポリアデニル化シグナルを含む、発現カセットである。もう一つの実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、5'から3'方向で、プロモーター、本発明のコード配列及びポリアデニル化シグナルを含む、発現カセットである。もう一つの実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、5'から3'方向で、エンハンサー、プロモーター、本発明のコード配列及びポリアデニル化シグナルを含む、発現カセットである。もう一つの実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、5'から3'方向で、SpC5-12プロモーター又はCMVプロモーター、例えばミニ-CMVプロモーター、本発明のコード配列及びポリアデニル化シグナル(例えばbGH polyA又はsNRP polyA、特にはbGH polyA)を含む、発現カセットである。もう一つの実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、5'から3'方向で、エンハンサー、SpC5-12プロモーター又はCMVプロモーター、例えばミニ-CMVプロモーター、本発明のコード配列及びポリアデニル化シグナル(例えばbGH polyA又はsNRP polyA、特にはbGH polyA)を含む、発現カセットである。更なる特定の実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、5'から3'方向で、エンハンサー、プロモーター、イントロン、本発明のコード配列及びポリアデニル化シグナルを含む、発現カセットである。本発明の更なる特定の実施形態においては、発現カセットは、5'から3'方向で、プロモーター、任意のイントロン、本発明のコード配列及びpolyAシグナルを含む。更なる特定の実施形態において、発現カセットは、5'から3'方向で:SpC5-12プロモーター;SV40イントロン;配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号64、配列番号65又は配列番号66、特には配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号64、配列番号65又は配列番号66、特には配列番号7、配列番号8又は配列番号9、より特には配列番号7のアミノ酸配列をコードする配列;及びbGH polyAを含む。更なる特定の実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、5'から3'方向で、プロモーター、本発明のコード配列及びポリアデニル化シグナルを含む、発現カセットである。本発明の更なる特定の実施形態において、発現カセットは、5'から3'方向で、エンハンサー、プロモーター、本発明のコード配列及びpolyAシグナルを含む。更なる特定の実施形態において、発現カセットは、5'から3'方向で:SpC5-12プロモーター;配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又は配列番号14、配列番号64、配列番号65又は配列番号66、特には配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号64、配列番号65又は配列番号66、特には配列番号7、配列番号8又は配列番号9、より特には、配列番号7のアミノ酸配列をコードする配列;及びbGH polyA又はsNRP polyA、特にはbGH polyAを含む。もう一つの実施形態において、発現カセットは、5'から3'方向で:CMVプロモーター;SV40イントロン;配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号64、配列番号65又は配列番号66、特には配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号64、配列番号65又は配列番号66、特には配列番号7、配列番号8又は配列番号9、より特には配列番号7のアミノ酸配列をコードする配列;及びbGH polyAを含む。もう一つの実施形態において、発現カセットは、5'から3'方向で:CMVプロモーター;配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号64、配列番号65又は配列番号66、特には配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号64、配列番号65又は配列番号66、特には配列番号7、配列番号8又は配列番号9、より特には配列番号7のアミノ酸配列をコードする配列;及びbGH polyA又はsNRP polyA、特にはbGH polyAを含む。
特定の実施形態において、発現カセットは、5'から3'方向で:CMVプロモーター、例えばミニ-CMVプロモーター;上記で定義される機能的なC末端欠失GDEポリペプチドをコードする配列、例えば配列番号7、配列番号8、配列番号9、特には配列番号7のアミノ酸配列をコードする配列;及びbGH polyA又はsNRP polyA、特にはbGH polyAを含む。
特定の実施形態において、発現カセットは、配列番号55に示される配列を含む又はから成る。
本発明の核酸コンストラクトのデザインにおいて、当業者は、前記コンストラクトを細胞又は器官に送達するために使用されるベクターのサイズの制限を配慮することを重視するであろう。特には、当業者は、AAVベクターの主な制限が、AAV血清型によって多様であることができる、そのカーゴ容量であるが、それは親ウイルスのゲノムのサイズ周辺に制限されると考えられていることを知っている。例えば、5kbは、AAV8キャプシドに収納されると通常考えられる最大のサイズである(Wu Z.ら、Mol Ther.、2010、18(1): 80-86;Lai Y.ら、Mol Ther.、2010、18(1): 75-79;Wang Y.ら、Hum Gene Ther Methods、2012、23(4): 225-33)。加えて、リコンビナントAAVの産生の間に、5kbよりも大きなゲノムは、低い効率でキャプシド形成され、結果として生じるAAVは、遺伝子トランスファーの効率を減少させる断片化されたゲノムを含む可能性がある。従って、当業者は、本発明を実施するとき、結果として生じる核酸配列が、好ましくは実施されるAAVベクターのカーゴ容量の110%を超えないように、特には好ましくは5kbを超えないように、AAV5’-及び3’-ITRをコードする配列を含む、本発明の核酸コンストラクトの要素を選択するように留意するであろう。より大きなカーゴ容量を有するAAVベクターもまた、本発明の文脈において使用されることができる。例えば、Vp2サブユニットを欠くAAV粒子は、より大きなゲノム(すなわち、6kb)を上手く収納しながら、キャプシド形成されたゲノムの完全性を保存することが示される(Griegerら、2005、J Virol.、79(15):9933-9944)。
4- ベクター
本発明は、本明細書で公開される核酸分子又はコンストラクトを含む、ベクターにもまた関する。特定の実施形態において、ベクターは、上記で定義される機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子又はコンストラクトを含む。
特には、本発明のベクターは、タンパク質の発現のために、好ましくは遺伝子療法における使用のために、適切なベクターである。一つの実施形態において、ベクターはプラスミドベクターである。もう一つの実施形態において、ベクターは、本発明の核酸分子、特には本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードするメッセンジャーRNAを含むナノ粒子である。もう一つの実施形態において、ベクターは、トランスポゾンに基づくシステムであり、標的細胞のゲノムにおける本発明の核酸分子又はコンストラクトの統合を可能にし、例えば機能亢進性のSleeping Beauty (SB100X) transposon system (Matesら、2009)である。もう一つの実施形態において、ベクターは、遺伝子療法のために適切なウイルスベクターであり、任意の対象とする細胞、例えば肝臓組織若しくは細胞、筋細胞、CNS細胞(例えば脳細胞)、又は造血幹細胞、例えば赤血球系列の細胞(例えば赤血球)を標的とする。この場合において、本発明の核酸コンストラクトは、効率的なウイルスベクターを産生するために適切な配列もまた含み、当該技術分野において公知である。
ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターのように、本発明の核酸分子又はコンストラクトを送達するために好ましく、例えばレンチウイルスベクター又は非病原性のパルボウイルス、より好ましくはAAVベクターである。ヒトパルボウイルスアデノ関連ウイルス(AAV)は、複製を天然に欠損しているディペンドウイルスであり、感染された細胞のゲノムに統合し、潜伏感染を確立することができる。前記の特性は哺乳類のウイルスの中でも独特であると考えられる。なぜならば、統合は、染色体19(19q13.3-qter)に位置する、AAVS1と呼ばれる、ヒトゲノムにおける特定の部位において生じるからである。
従って、AAVベクターは、ヒト遺伝子療法のための潜在的なベクターとしての多くの関心を生じた。ウイルスの好ましい特性として、任意のヒトの疾患との関連の欠如、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力、並びに感染することができる、異なる組織に由来する広い範囲の細胞系列が挙げられる。
ヒト又は非ヒトの霊長類(NHP)から単離され、上手く特徴づけられたAAVの血清型の中で、ヒト血清型2は、遺伝子トランスファーベクターとして開発された最初のAAVである。他の現在使用されるAAV血清型は、AAV-1、AAV-2バリアント(例えば、Lingら、2016 Jul 18、Hum Gene Ther Methods.において公開された、Y44+500+730F+T491Vの変異を有する操作されたキャプシドを含む、四重変異キャプシド最適化AAV-2)、-3及びAAV-3バリアント(例えば、Vercauterenら、2016、Mol. Ther. Vol. 24(6)、p.1042において公開された、S663V+T492Vの2つのアミノ酸変異を有する操作されたAAV3キャプシドを含む、AAV3-STバリアント)、-3B及びAAV-3Bバリアント、-4、-5、-6及びAAV-6バリアント(例えば、Rosarioら、2016、Mol Ther Methods Clin Dev. 3、p.16026において公開された、三重変異AAV6キャプシドY731F/Y705F/T492V形態を含むAAV6バリアント)、-7、-8、-9、-2G9、-10例えばcy10及び-rh10、-rh74、-dj、Anc80、LK03、AAV2i8、ブタAAV血清型、例えばAAVpo4及びAAVpo6、並びにAAV血清型のチロシン、リシン及びセリンキャプシド変異体等を含む。加えて、他の非天然の操作されたバリアント及びキメラAAVもまた有用であることができる。
AAVウイルスは、従来の分子生物学の技術を使用して操作されることができ、核酸配列の細胞特異的な送達のために、免疫原性を最小化するために、安定性及び粒子の寿命を調整するために、効率的な分解のために、核への正確な送達のために、これらの粒子を最適化することを可能にする。
ベクターへのアセンブリのために望ましいAAVフラグメントは、vp1、vp2、vp3及び超可変領域を含むcapタンパク質、rep 78、rep 68、rep 52及びrep 40を含むrepタンパク質、並びにこれらのタンパク質をコードする配列を含む。これらのフラグメントは、多様なベクターシステム及び宿主細胞において容易に利用されることができる。
Repタンパク質を欠くAAVをベースとするリコンビナントベクターは、低い効率で宿主ゲノムへと統合し、標的細胞において何年もの間持続することのできる安定な環状エピソームとして主に存在する。
AAVの天然の血清型の使用に代えて、人工的なAAV血清型は、本発明の文脈において使用されることができ、限定されることなく、非天然に生じるキャプシドタンパク質を有するAAVを含む。そのような人工的なキャプシドは、異なる選択されたAAV血清型から、同じAAV血清型の非近接部分から、非AAVウイルスのソースから、又は非ウイルスのソースから得られる異種配列と組み合わせて、選択されたAAV配列(例えば、vp1キャプシドタンパク質のフラグメント)を使用して、任意の適切な技術により産生されることができる。人工的なAAV血清型は、限定されることなく、キメラAAVキャプシド、リコンビナントAAVキャプシド又は「ヒト化の(humanized)」AAVキャプシドであることができる。
本発明の文脈において、AAVベクターは、対象とする標的細胞、すなわち免疫寛容原性の組織の細胞(例えば肝細胞)及び治療的対象とする(複数の)組織の細胞、例えば筋細胞、CNS細胞又は心臓細胞に形質導入することができるAAVキャプシドを含む。特定の実施形態において、AAVベクターは、筋細胞又は心臓細胞に遺伝子導入することのできるAAVキャプシドを含む。特定の実施形態によると、AAVベクターは、AAV-1、-2、AAV-2バリアント(例えば、Lingら、2016 Jul 18、Hum Gene Ther Methods.[印刷前の電子出版]において公開された、Y44+500+730F+T491Vの変異を有する操作されたキャプシドを含む、四重変異キャプシド最適化AAV-2)、-3及びAAV-3バリアント(例えば、Vercauterenら、2016, Mol. Ther. Vol. 24(6), p. 1042において公開された、S663V+T492Vの二つのアミノ酸変異を有する操作されたAAV3キャプシドを含む、AAV3-STバリアント)、-3B及びAAV-3Bバリアント、-4、-5、-6及びAAV-6バリアント(例えば、Rosarioら、2016、Mol Ther Methods Clin Dev. 3、p.16026において公開された、三重変異AAV6キャプシドY731F/Y705F/T492V形態を含む、AAV6バリアント)、-7、-8、-9、-9P1、-2G9、-10例えば-cy10及び-rh10、-rh39、-rh43、-rh74、-dj、Anc80、LK03、AAV.PHP、AAV2i8、ブタAAV、例えばAAVpo4及びAAVpo6、並びにAAV血清型のチロシン、リシン及びセリンキャプシド変異体のAAVベクターである。特定の実施形態において、AAVベクターは、AAV6、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVrh74又はAAV2i8血清型(すなわち、AAVベクターは、AAV6、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVrh74又はAAV2i8血清型のキャプシドを有する)のAAVベクターである。更なる特定の実施形態において、AAVベクターは、シュードタイプ化したベクターであり、すなわち、そのゲノム及びキャプシドは、異なる血清型のAAVに由来する。例えばシュードタイプ化したAAVベクターは、そのゲノムが上記で言及されるAAV血清型の一つに由来し、そのキャプシドはもう一つの血清型に由来することができる。例えば、シュードタイプ化したベクターのゲノムは、AAV6、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVrh74又はAAV2i8血清型に由来するキャプシドを有することができ、そのゲノムは異なる血清型に由来することができる。特定の実施形態において、AAVベクターは、AAV6、AAV8、AAV9又はAAVrh74血清型の、特にはAAV6、AAV8、AAV9又はAAV9P1血清型の、より特にはAAV6、AAV9又はAAV9P1血清型のキャプシドを有する。
特定の実施形態において、ベクターは治療的な導入遺伝子を筋細胞に送達することにおける使用のためのベクターであり、AAVベクターは、とりわけ、AAV8、AAV9及びAAVrh74から成る群において選択されることができる。
もう一つの特定の実施形態において、ベクターは肝臓細胞への導入遺伝子の送達における使用のためのベクターであり、AAVベクターは、とりわけ、AAV1、AAV5、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAVrh74、AAV-LK03、AAV2G9、AAV.PHP、AAV-Anc80及びAAV3Bから成る群において選択されることができる。
更なる特定の実施形態において、ベクターはCNSへの導入遺伝子の送達における使用のためのベクターであり、AAVベクターは、とりわけ、AAV9、AAV9P1、AAV10及びAAV2G9から成る群において選択されることができる。
もう一つの実施形態において、キャプシドは、修飾されたキャプシドである。本発明の文脈において、「修飾されたキャプシド(modified capsid)」は、キメラのキャプシド又は1又は複数個の野生型AAV VPキャプシドタンパク質に由来する1又は複数個のバリアントVPキャプシドタンパク質を含むキャプシドであることができる。
特定の実施形態において、AAVベクターはキメラベクターであり、すなわち、そのキャプシドは少なくとも二つの異なるAAV血清型に由来するVPキャプシドタンパク質を含み、又は少なくとも二つのAAV血清型に由来するVPタンパク質領域又はドメインを組み合わせた少なくとも一つのキメラVPタンパク質を含む。肝臓細胞に形質導入するために有用であるそのようなキメラAAVベクターの例は、Shenら、Molecular Therapy、2007及びTenneyら、Virology、2014において記載される。例えば、キメラAAVベクターは、AAV8キャプシド配列とAAV8血清型とは異なるAAV血清型、例えば特に上記で言及される任意の血清型の配列との組み合わせに由来することができる。もう一つの実施形態において、AAVベクターのキャプシドは、1又は複数個のバリアントVPキャプシドタンパク質、例えば国際公開第2015/013313号において記載されるもの、特にはRHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4及びRHM15-6キャプシドバリアントを含み、それは高い肝臓向性を示す。
もう一つの実施形態において、修飾されたキャプシドは、エラープローンPCR及び/又はペプチド挿入により挿入されたキャプシド修飾に由来することができる(例えば、Bartelら、2011において記載されるように)。特定の実施形態において、キャプシドは、PCT/EP2019/058560に記載されるP1修飾を含む。加えて、キャプシドバリアントは、一つのアミノ酸の変異、例えばチロシン変異を含むことができる(例えば、Zhongら、2008に記載されるように)。特定の実施形態において、ベクターは、P1挿入を含むAAVrh74である。
特定の実施形態において、AAVベクターは、EP2019/058560に記載されるAAVベクター又はEP2019/076958に記載されるAAVベクターである。
加えて、AAVベクターのゲノムは、一本鎖又は自己相補的な二本鎖ゲノムのいずれかであることができる(McCartyら、Gene Therapy、2003)。自己相補的な二本鎖AAVベクターは、AAV末端リピートの一つから末端分解部位(terminal resolution site)を削除することにより産生される。複製ゲノムが野生型AAVゲノムの半分の長さであるこれらの修飾されたベクターは、DNAダイマーを収納する傾向を有する。好ましい実施形態において、本発明の実施において使用されるAAVベクターは、一本鎖ゲノムを有し、更に好ましくはAAV8、AAV9、AAVrh74又はAAV2i8キャプシド、特にはAAV8、AAV9又はAAVrh74キャプシド、例えばAAV8又はAAV9キャプシド、より特にはAAV9キャプシドを含む。
本発明のGDE配列を収納するために使用されるAAVベクターは、そのカーゴ容量を増加させるために修飾されることもまたできる。例えば、Vp2サブユニットを欠失するAAVベクターは、より大きなゲノム(すなわち6kb)を上手く収納しながら、キャプシド形成されたゲノムの完全性を保存すると示される(Griegerら、2005)。
当該技術分野において公知であるように、追加の適切な配列は、機能的なウイルスベクターを得るために本発明の核酸コンストラクトにおいて導入されることができる。適切な配列は、AAV ITRを含む。
特定の実施形態において、AAVベクターは、上記の筋肉特異的なプロモーター、特には肝臓細胞への発現のリークを示す筋肉特異的なプロモーターを含む。
本発明のもう一つの特定の実施形態において、AAVベクターは、上記の肝臓特異的なプロモーターを含む。肝臓の前免疫寛容原性及び代謝性の特性は、この実施形態の結果、肝細胞においてGDEを発現し、タンパク質への免疫耐性を誘導する、高効率及び最適化されたベクターを開発するために有利に使用される。
特定の実施形態において、国際公開第2018/162748号に記載される二つのAAVベクターを含むデュアルリコンビナントAAVベクターシステムは、上記に定義される機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子又はコンストラクトを送達するために使用される。特には、デュアルAAVベクターシステムは、以下:
－ 5’及び3’AAV ITRの間に、上記で定義されるC末端切断GDEポリペプチドのN末端部分をコードする第一の核酸配列を含む第一のAAVベクター、及び
－ 5’及び3’AAV ITRの間に、上記で定義されるC末端切断GDEポリペプチドのC末端部分をコードする第二の核酸配列を含む第二AAVベクター
を含み、前記GDEをコードする第一及び第二の核酸配列は、上記で定義される全長C末端切断GDEポリペプチドの産生を可能にするポリヌクレオチド領域を含む。
もう一つの特定の実施形態において、AAVベクターは、上記で定義される機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子又はコンストラクトを含む、シングルAAVベクターである。
5- 細胞
本発明は、本発明の核酸分子、コンストラクト又はベクターで形質転換又は形質導入された、細胞、特には単離された細胞、例えば肝臓細胞、心臓細胞、CNS細胞又は筋細胞にもまた関する。特定の実施形態において、細胞は単離されたヒトの細胞である。更なる特定の実施形態において、細胞は、ヒトの胚幹細胞ではない。本発明の細胞は、上記の機能的なC末端切断GDEポリペプチドを発現する。本発明の細胞は、任意の適切な投与経路、例えば対象の肝臓における、CNSにおける、心臓における、(複数の)筋肉における又は血流における注射を介して、その必要とする対象、例えばGDE欠失患者に送達されることができる。特定の実施形態において、本発明は、肝臓又は筋細胞、特には治療されるべき対象の肝臓又は筋細胞の形質導入をすること、及び核酸が導入される前記形質導入された肝臓及び/又は筋細胞を、対象に投与することを含む。特定の実施形態において、肝臓細胞は、治療される患者由来の肝細胞であり、又は更に形質転換される肝臓幹細胞であり、患者へのその後の投与のために、in vitroで肝臓細胞へと分化される。もう一つの実施形態において、細胞は、治療される患者由来の筋細胞であり、又は更に形質転換される筋肉幹細胞であり、患者へのその後の投与のために、in vitroで筋細胞へと任意に分化される。
6- 医薬組成物
本発明は、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド又は細胞を含む医薬組成物もまた提供する。そのような組成物は、治療的に有効量の治療薬(本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド又は細胞)、及び薬学的に許容される担体を含むことができる。特定の実施形態において、用語「薬学的に許容される(pharmaceutically acceptable)」は、動物、及びヒトにおける使用のために、連邦性の若しくは州政府の規制機関により承認され又はアメリカ若しくはヨーロッパの薬局方又は他の一般的に認識される薬局方においてリスト化されていることを意味する。用語「担体(carrier)」は、治療薬と共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。そのような医薬の担体は、滅菌した液体、例えば、水、及び、石油、動物、植物又は合成起源のものを含む油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等であることができる。水は、医薬組成物が静脈内に投与されるときに好ましい担体である。生理食塩水及び水性ブドウ糖及びグリセロール溶液は、特には注射用の溶液のために、液体の担体として使用されることもまたできる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ナトリウムステアレート、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を含む。
組成物は、望ましい場合、少ない量の湿潤剤又は乳化剤又はpH緩衝剤もまた含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放製剤等の形態をとることができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、マグネシウムステアレート、サッカリンナトリウム、セルロース、マグネシウムカルボネート等を含むことができる。適切な医薬担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」において記載される。そのような組成物は、対象への適切な投与のための形態を提供するために、治療的な有効量の治療薬を、好ましくは精製された形態において、適切な量の担体と共に含む。特定の実施形態において、本発明の核酸、ベクター又は細胞は、リン酸緩衝食塩水を含み、0.25%ヒト血清アルブミンを補充された組成物において処方される。もう一つの特定の実施形態において、本発明の核酸、ベクター又は細胞は、乳酸リンゲル及び非イオン性界面活性剤、例えば最終濃度が組成物全体の0.01～0.0001重量%、例えば濃度が0.001重量%のプルロニックF68を含む組成物において処方される。処方は、血清アルブミン、特にはヒト血清アルブミン、例えば0.25%のヒト血清アルブミンを更に含むことができる。保存又は投与のいずれかのための他の適切な処方は、特には国際公開第2005/118792号又はAllayら、2011から、当該技術分野において公知である。
好ましい実施形態において、組成物は、ヒトへの静脈内投与のために適応される医薬組成物として、通常の手順に従って処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張性水性緩衝液における溶液である。必要な場合、組成物は、注射の部位における痛みを和らげるために、可溶化剤及び局所麻酔剤、例えばリグノカインもまた含むことができる。
実施形態において、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド又は細胞は、ベシクル、特にはリポソームにおいて送達されることができる。更にもう一つの実施形態において、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド又は細胞は、制御された放出システムにおいて送達されることができる。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドをコードする転写物に相当する核酸分子は、mRNAとして送達される。特には、本発明のmRNAは、リポソーム、例えば脂質ナノ粒子(LNP)を使用して送達されることができる。
本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド又は細胞の投与方法は、皮内の、筋肉内の、腹腔内の、静脈内の、皮下の、鼻腔内の、硬膜外の及び経口の経路を含むがこれらに制限されない。特定の実施形態において、投与は、静脈内又は筋肉内の経路を介する。本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド又は細胞は、ベクトル化されようとそうでなかろうと、任意の都合の良い経路、例えば注入又はボーラス注入により、上皮の又は皮膚粘膜の裏層(例えば口腔粘膜、直腸の及び腸の粘膜等)を通した吸収により投与されることができ、他の生物学的な活性剤と共に投与されることができる。投与は、全身性又は局所性であることができる。
特定の実施形態において、本発明の医薬組成物を、治療を必要とする範囲、例えば肝臓又は筋肉に、局所的に投与することが望ましい可能性がある。それは、例えば、移植の手段により達成されることができ、前記移植は、膜、例えばシラスティックな膜、又は繊維を含む、多孔性の、非多孔性の又はゼラチン状の物質の移植である。
特定の実施形態において、本発明の機能的なC末端切断GDEポリペプチドは、特にはGSDIIIを治療するために、酵素置換療法(ERT)において使用される。用語「酵素置換療法(enzyme replacement therapy)」又は「ERT」は、一般的には、そのような酵素を欠失している個体に精製された酵素を導入することを指す。本発明の投与されるポリペプチドは、リコンビナント発現により、天然のソースから得られ、in vitroで産生され又は単離された組織又は流体から精製されることができる。特には、ERTにおいて使用されるとき、本発明のポリペプチドは、非経口的に、例えば腹腔内の、筋肉内の、血管内の(すなわち、静脈内の又は動脈内の)投与を介して、投与されることができる。特には、ポリペプチドは、静脈内注射により投与される。前記投与は、頻繁に、例えば毎日、毎週、隔週又は毎月、特には毎週又は隔週、繰り返されることができる。
GSDIIIの治療薬において効果的である、本発明の治療薬(すなわち、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド又は細胞)の量は、標準的な臨床技術により決定されることができる。加えて、in vivo及び/又はin vitroの解析は、最適な用量範囲を予測する手助けをするために任意に使用されることができる。処方において使用されるべき正確な用量は、投与経路、及び疾患の重篤度にもまた依存し、医師の判断及びそれぞれの患者の状況によって決定されるべきである。それを必要とする対象に投与される、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド又は細胞の用量は、限定されることなく、投与経路、治療される特定の疾患、対象の年齢又は治療的効果を達成するために必要な発現レベルを含むいくつかの因子に基づいて多様である。当業者は、この分野における知識に基づいて、これらの因子及び他のものに基づいて必要とされる用量範囲を容易に決定することができる。ウイルスベクター、例えばAAVベクターを対象へ投与することを含む治療の場合において、ベクターの典型的な用量は、体重1キログラム当たり少なくとも1x108個のベクターゲノム(vg/kg)、例えば少なくとも1x109 vg/kg、少なくとも1x1010 vg/kg、少なくとも1x1011 vg/kg、少なくとも1x1012 vg/kg、少なくとも1x1013 vg/kg又は少なくとも1x1014 vg/kgである。
7- 治療方法
本発明は、GSDIIIを治療するための方法であって、治療的な有効量の、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド、医薬組成物又は細胞をその必要とする対象に送達する工程を含む方法にもまた関する。
肝硬変及び肝細胞癌もまた、GSDIIIの患者において発生する可能性がある。従って、本発明は、GSDIII患者において肝硬変及び肝細胞癌を治療するための方法であって、治療的な有効量の、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド、医薬組成物又は細胞をその必要とする対象に送達する工程を含む方法にもまた関する。
本発明は、GSDIIIを治療するための方法であって、導入遺伝子への(すなわち、核酸分子によりコードされる機能的なC末端切断GDEポリペプチドへの)免疫応答を誘導せず、又は導入遺伝子への減少した免疫応答を誘導する方法であって、治療的な有効量の、本発明の核酸、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド、医薬組成物又は細胞をその必要とする対象に送達する工程を含む方法にもまた関する。本発明は、GSDIIIを治療するための方法であって、治療的な有効量の、本発明の核酸、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド、医薬組成物又は細胞をその必要とする対象に繰り返し投与する工程を含む方法にもまた関する。この態様において、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト又はベクターは、肝臓細胞において機能的であるプロモーターを含み、それによって、そこから産生される、発現される機能的なC末端切断GDEポリペプチドへの免疫耐性を可能にする。その上、この態様において、この態様で使用される医薬組成物は、肝臓細胞において機能的であるプロモーターを含む、核酸分子、核酸コンストラクト又はベクターを含む。細胞、特には肝臓、心臓、CNS又は筋肉細胞の送達の場合において、前記細胞は、治療を必要とする対象から過去に回収された細胞であり、そこに本発明の核酸分子、核酸コンストラクト又はベクターを導入することにより操作され、それによって、それらが機能的なC末端切断GDEポリペプチドを産生するようになる細胞であることができる。実施形態によると、繰り返しの投与を含む態様において、前記投与は、少なくとも1回以上繰り返されることができ、周期的なスケジュールに従って、例えば一週間、一ヵ月又は一年に一回、行われると考えることもできる。周期的なスケジュールは、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10年、又は10年超毎に一回の投与もまた含むことができる。もう一つの特定の実施形態において、本発明のウイルスベクターのそれぞれの投与は、それぞれの連続的な投与のための異なるウイルスを使用して行われ、それによって、過去に投与されたウイルスベクターに対して可能性のある免疫応答が原因の、効率の減少を避ける。例えば、AAV8キャプシドを含むAAVベクターの最初の投与には、その後、AAV9キャプシドを含むベクターの投与が続くことができる。
本発明によると、治療は、治療的な、軽減の又は予防的な効果を含むことができる。従って、治療的な及び予防的な治療は、GSDIIIの症状の回復、又は特定のグリコーゲン蓄積疾患を発症するリスクを防ぐ又はそうでなければ減少させることを含む。用語「予防的な(prophylactic)」は、特定の状態の重症度又は発生を減少させると考えることができる。「予防的な」は、状態を過去に診断された患者における特定の状態の再発を防ぐこともまた含む。「治療(therapeutic)」は、存在する状態の重症度を減少させることもまたできる。用語「治療(treatment)」は、動物、特には哺乳類、より特にはヒトの対象に恩恵を与えることのできる任意の処置計画を指すために本明細書において使用される。
本発明は、GSDIIIの治療のためのex vivoの遺伝子療法の方法であって、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト又はベクターを、その必要とする患者の単離された細胞、例えば単離された造血幹細胞に導入する工程、及びその必要とする前記患者に前記細胞を導入する工程を含む方法にもまた関する。
本発明は、医薬としての使用のための、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド、細胞又は医薬組成物にもまた関する。
本発明は、GDEをコードするAGL遺伝子における変異により引き起こされる疾患を治療するための方法における、特にはGSDIII(コーリ病)、例えば、GSDIIIa及びGSDIIIb、特には特定のGSDIIIaを治療するための方法における使用のための、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド、細胞又は医薬組成物にもまた関する。
本発明は、GSDIII(コーリ病)を治療するために有用な医薬の製造における、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド、細胞又は医薬組成物の使用に更に関する。
本発明は、影響を受ける組織における、特には筋肉及び肝臓組織における、特には筋肉におけるGDEタンパク質の送達のための方法における使用のための、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、機能的なC末端切断GDEポリペプチド、細胞又は医薬組成物にもまた関する。
本発明は、以下の実験的な実施例及び添付された図面の参照により、更に詳細に記載される。これらの実施例は、説明の目的のみのために提供され、制限することは意図されていない。
1- 実施例1
材料及び方法
C末端切断GDE(ΔCter-1、配列番号7)の活性を評価するために、ΔCter-1-GDE(AAV-ΔCter-1-GDE)又は全長タンパク質(AAV-FS-GDE)を発現するAAVベクターが産生された。導入遺伝子は、筋肉発現のために最適化された導入遺伝子発現カセットにおいてクローン化され、ミニCMVプロモーター及びbGHポリアデニル化シグナルで構成された。二つのベクターは、2x1012 vg/マウスの用量において4～6月齢のGSDIIIマウスに注射された。PBSを注射された野生型(WT、PBS)又はノックアウトマウス(KO、PBS)はコントロールとして使用された。ワイヤーハングによる筋肉の機能の測定は、以下に記載されるように、ベクターの注射の1週間前(D-7)及び5週間後(D35)に実施された。C末端切断GDE又は全長サイズのGDEを発現するAAVベクターを注射されたマウスは、心臓及び四頭筋におけるグリコーゲン含量を測定するために、注射の後5週間で屠殺された。
グリコーゲン含量の測定
グリコーゲン含量は、Aspergillus nigerアミログルコシダーゼ(Sigma Aldrich、Saint Louis、MO)による全体的な消化の後に放出されたグルコースとして、組織破砕物において間接的に測定された。サンプルは、95℃で5分間インキュベートされ、その後4℃で冷却された;0.1MのカリウムアセテートpH5.5において1:50で希釈されたアミログルコシダーゼ25μlは、その後それぞれのサンプルに追加された。アミログルコシダーゼなしのコントロール反応液は、それぞれのサンプルのために調製された。サンプル及びコントロール反応液の両方が、37℃で90分間インキュベートされた。反応は、サンプルを95℃で5分間インキュベートすることにより停止された。放出されたグルコースは、市販のグルコースアッセイキット(Sigma Aldrich、Saint Louis、MO)で決定され、結果として生じる吸光度は、540nmの波長においてEnSpireアルファプレートリーダー(Perkin-Elmer、Waltham、MA)において得られた。
筋肉の機能の試験
平均のハング時間を測定するために、4mmのワイヤーにおける3分間の持続ハング試験が実施された。試験の開始時に、10の「落下(falling)」スコアがそれぞれの動物に与えられた。マウスは尾で扱われ、ワイヤーの近くに持って来られた。操作者は、前肢のみで動物を吊るす。動物が適切に吊るされるとすぐに、180秒間のタイマーが開始される。動物が落下する場合、タイマーは停止され、落下スコアが1減少し、経過タイムが記録される。動物は、その後前肢で吊るされ、タイマーが再度開始される。試験は、タイマー又は落下スコアのいずれかが0に到達する場合に停止される。結果は、一分当たりに落下する数として表される。
結果
ワイヤーハングによる筋肉の機能の測定は、ベクターの注射の1週間前(D-7)及び5週間後(D35)に実施された。AAVを処理されたマウスは、一分当たりの落下の数の部分的な減少を示した(図１)。グリコーゲンの蓄積は、AAVベクターを処理されたGDE-KO動物の心臓及び四頭筋においてその後評価された。興味深いことには、グリコーゲン含量の有意な減少は、2つのベクターで処理されたマウスの心臓及び四頭筋において測定された(図２)。
2- 実施例2
材料及び方法
C末端切断GDE(ΔCter-1)の活性は、注射後3ヵ月のワイヤーハングのパフォーマンスを評価することにより、より長い期間でもまた評価された。この実験のために、GDEノックアウト(KO)マウスは、PBS(KO_PBS);3.3x1012 vg/マウス若しくは9.9x1012 vg/マウス(高用量)のC末端切断GDE(ΔCter-1)をコードするAAVベクター;又は3.3x1012 vg/マウスの全長GDE(GDE FS)をコードするAAVベクターを注射された。PBSを注射された野生型のマウスは、コントロール(WT_PBS)として使用された。ワイヤーハングのパフォーマンスは、上記のように、ベクターの注射の一週間前(D-7)及び3ヵ月後に測定された。
マウスは、筋肉の機能を評価した後で、屠殺され、筋肉でのGDE発現が、心臓、横隔膜、三頭筋及び四頭筋におけるウェスタンブロットにより評価された。マウスの組織は、RIPA緩衝液(#10017003、FisherBioblock scientific)においてホモジナイズされ、タンパク質の濃度はBCAタンパク質アッセイ(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA)を使用して決定された。1レーン当たり75μgのタンパク質がロードされた。タンパク質は、SDS-PAGE電気泳動(4～12%勾配、NuPAGE Novex Bis-Tris Gel 1.0 mm、Life Technologies)により分離され、ニトロセルロースブロッティング膜0.2 μm(GE Healthcare)にトランスファーされた。GDEタンパク質(1:1000;16582-1-AP、Proteintech)のヒトC-ter部分(1182から1533aaまで)に対するウサギポリクローナル抗体が一次抗体として使用され、その後、製造業者の指示(Li-COR Biosciences)により、対応するIRDye-800CW-コンジュゲート抗体(1:10,000)が続いた。二次抗体の赤外蛍光は、Odyssey CLXイメージングシステム(Li-COR Biosciences)において視覚化された。プレシジョンPlusプロテインスタンダード(Bio-Rad)が分子量マーカーとして使用された。
結果
C末端切断GDE(ΔCter-1)の効率は、ベクター注射の3ヵ月後に、筋肉強度のレスキューのために、評価され、全長GDEの効率と比較された(図３)。注射の前に(図３Ａ)、機能的な評価は、GSDIIIマウスの群間で同様の落下の数(一分当たり～20回の落下)を示し、WTマウス(一分当たり5回の落下)よりもはるかに高かった。注射の3ヵ月後(図３Ｂ)、ΔCter-1 GDE又は全長GDEのいずれかをコードするベクターで処理されたマウスの群は、有意な機能的改善を示した。わずかな改善は、ΔCter-1 GDEの用量を増加されることにより観察された。
ウェスタンブロットによるGDE発現の解析(図４)は、ΔCter-1タンパク質が異なる組織においてよく発現されることを示した。
まとめると、これらのデータは、筋肉において全長GDEタンパク質と比較して、C末端切断ΔCter-1-GDE酵素の類似した活性を示す。

Claims (16)

  1. 機能的な切断GDEポリペプチドであって、機能的なリファレンス全長ヒトGDE配列に関して、少なくとも1個のアミノ酸、例えば少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105又は少なくとも110個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸のC末端欠失を含み、配列番号59において示される配列を含まない、機能的な切断GDEポリペプチド。
  2. 機能的なリファレンス全長ヒトGDEが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号61、配列番号62若しくは配列番号63において示されるアミノ酸配列を有し、又は配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号61、配列番号62若しくは配列番号63と少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは少なくとも99パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の機能的な切断GDEポリペプチド。
  3. (i)機能的なリファレンス全長ヒトGDE配列が、配列番号1若しくは配列番号61に示されるアミノ酸配列を有し、前記切断GDEポリペプチドが、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸を欠失しており;
    (ii)機能的なリファレンス全長ヒトGDE配列が、配列番号2若しくは配列番号62に示されるアミノ酸配列を有し、前記切断GDEポリペプチドが、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸を欠失しており;又は
    (iii)機能的なリファレンス全長ヒトGDE配列が、配列番号3若しくは配列番号63に示されるアミノ酸配列を有し、前記切断GDEポリペプチドが、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも1個のアミノ酸及び多くとも112個のアミノ酸を欠失している、
    請求項１又は２に記載の機能的な切断GDEポリペプチド。
  4. (i)機能的なリファレンス全長ヒトGDE配列が、配列番号1若しくは配列番号61において示されるアミノ酸配列を有し、前記切断GDEポリペプチドが、配列番号1若しくは配列番号61に関して、位置1421から1532までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸を欠失している;
    (ii)機能的なリファレンス全長ヒトGDE配列が、配列番号2若しくは配列番号62において示されるアミノ酸配列を有し、前記切断GDEポリペプチドが、配列番号2若しくは配列番号62に関して、位置1404から1515までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸を欠失している;又は
    (iii)機能的なリファレンス全長ヒトGDE配列が、配列番号3若しくは配列番号63において示されるアミノ酸配列を有し、前記切断GDEポリペプチドが、配列番号3若しくは配列番号63に関して、位置1405から1516までにおけるアミノ酸から選択される、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105若しくは少なくとも110個の連続したアミノ酸を欠失している、
    請求項１から３のいずれか一項に記載の機能的な切断GDEポリペプチド。
  5. 機能的な切断GDEポリペプチドが、更に、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号61、配列番号62又は配列番号63に関して、欠失又は欠失の組み合わせを含み、欠失は、表2におけるΔ1、Δ2、Δ3、Δ4、Δ5、Δ6、Δ7、Δ8、Δ9、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13、特にはΔ9、Δ10、Δ11、Δ12及びΔ13として参照される任意の欠失から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の機能的な切断GDEポリペプチド。
  6. 機能的な切断GDEポリペプチドが、配列番号7～14、配列番号25～33若しくは配列番号64～66において示されるアミノ酸配列を有し、又は配列番号7～14、配列番号25～33若しくは配列番号64～66に対して少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは少なくとも99パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の機能的な切断GDEポリペプチド。
  7. 機能的な切断GDEポリペプチドが、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号64、配列番号65若しくは配列番号66、特には配列番号7から選択されるアミノ酸配列を有し、又は配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号64、配列番号65若しくは配列番号66、特には配列番号7に対して少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは少なくとも99パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の機能的な切断GDEポリペプチド。
  8. 機能的な切断GDEポリペプチドが、配列番号7のアミノ酸配列を有し、又は配列番号7に対して少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは少なくとも99パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の機能的な切断GDEポリペプチド。
  9. 請求項１から８のいずれか一項に記載の機能的な切断GDEポリペプチドをコードする核酸分子。
  10. 好ましくはこの順序において:
    - プロモーター;
    - 任意選択で、イントロン;
    - 請求項９に記載の核酸分子;及び
    - ポリアデニル化シグナル
    を含む、発現カセット。
  11. 請求項９に記載の核酸分子又は請求項１０に記載の発現カセットを含む、ベクター、特にはウイルスベクター。
  12. AAVベクターである、請求項１１に記載のベクター。
  13. 請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載の発現カセット又は請求項１１若しくは１２に記載のベクターにより形質転換された単離された細胞であって、特には肝臓細胞、筋細胞、心臓細胞又はCNS細胞である、細胞。
  14. 医薬としての使用のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の機能的な切断GDEポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載の発現カセット、請求項１１若しくは１２に記載のベクター又は請求項１３に記載の細胞。
  15. GDEをコードするAGL遺伝子における変異により引き起こされる疾患を治療するための方法における使用のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の機能的な切断GDEポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載の発現カセット、請求項１１若しくは１２に記載のベクター又は請求項１３に記載の細胞。
  16. GSDIII(コーリ病)を治療するための方法における使用のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の機能的な切断GDEポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載の発現カセット、請求項１１若しくは１２に記載のベクター又は請求項１３に記載の細胞。
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