JP5797551B2 - 肝特異的核酸調節要素ならびにその方法および用途 - Google Patents
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Description
・本明細書に記載されている核酸調節要素がプロモーターおよびトランスジーンに機能的に連結された核酸発現カセットを肝細胞内に導入し、
・トランスジーン産物を該肝細胞内で発現させる工程を含む、肝細胞においてトランスジーン産物を発現させるための方法を提供する。
もう1つの特定の実施形態においては、該トランスジーン産物はタンパク質である。もう1つの実施形態においては、該トランスジーン産物はRNAである。もう1つの特定の実施形態においては、該方法をインビトロで行う。もう1つの特定の実施形態においては、該方法をエクスビボ(ex vivo)で行う。もう1つの特定の実施形態においては、該方法をインビボで行う。
・核酸発現カセット(該核酸発現カセットにおいては、本明細書に記載されている核酸調節要素が、プロモーター、および治療用タンパク質をコードするトランスジーンに機能的に連結されている)を対象の肝臓内に導入し、
・治療量の該(治療用)タンパク質を肝臓内で発現させる工程を含む。
・核酸発現カセット(該核酸発現カセットにおいては、本明細書に記載されている核酸調節要素が、プロモーター、および凝固因子、特に因子IXをコードするトランスジーンに機能的に連結されている)またはそのような核酸発現カセットを含むベクターを対象の肝臓内に導入し、
・治療量の該凝固因子(特に因子IX)を肝臓内で発現させるさせる工程を含む。
定義
本発明は特定の実施形態に関して及び或る図面を参照して以下に説明されるが、本発明はそれらに限定されるものではなく、特許請求のみによって限定される。特許請求の範囲におけるいずれの引用表示も本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。記載されている図面は概要図に過ぎず、限定的なものではない。図面においては、該要素の幾つかのサイズは誇張されていることがあり、例示を目的として、実物大では描かれていないことがある。「含む」なる語が本明細書および特許請求の範囲において用いられている場合、それは他の要素または工程を除外しない。単数形が用いられている場合、特に示されていない限り、これは複数形のその名詞を含む。
肝特異的調節配列の特定
序論
組織特異的エンハンサー/調節モジュールを発見し特徴づけるための計算的アプローチを用いた。そららが含有するモチーフの予備知識は不要である。該アプローチは以下の工程から実質的になる:
(1)正常組織のマイクロアレイ発現データの統計解析に基づいて高度に発現される組織特異的遺伝子の特定。
(2)公的に利用可能なゲノムデータベースからの対応プロモーター配列の抽出。
(3)新規距離差行列(DDM)アプローチ(De Bleserら,2007)を用いる、調節モジュールおよびそれらが含有するモチーフの特定。DDMアプローチにより、調節要素、エンハンサーおよびサイレンサーの両方を検出した。ついでこれらの要素を、それらが含有するモチーフのセットとしてモデル化した。
(4)つぎに、高発現組織特異的遺伝子のゲノムコンテクストを、これらのセットの一部であるモチーフのクラスターに関して検索した。これらのクラスターが、幾つかの種において高度に保存された領域に一致する場合、これらの領域を推定エンハンサーモジュールとみなした。低発現組織特異的遺伝子および推定サイレンサーモジュールに関して、同じことが行われうることに注目されたい。
DDM法のための入力として、59個の高(過剰)発現肝特異的遺伝子の転写開始部位の上流の配列のセット、および59個の過少発現肝特異的遺伝子の転写開始部位の上流の配列の等サイズのセットを使用した。参照配列番号(RefSeq;公開2008年3月28日;配列修正に関してはhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/sutils/girevhist.cgiを参照されたい)により示されている該肝特異的遺伝子の一覧を表1に示す。該DDM法の目的は、過剰または過少発現に強く関連している転写因子結合部位を特定することであった。
肝特異的調節エンハンサー配列のインビボ妥当性評価
材料および方法
pAAV−TTRmin−FIXIAの構築
まず、DNAeasy Tissueキット(Qiagen)を該製造業者の説明に従い使用して、正常マウス肝ゲノムDNAを抽出した。ついで、トランスチレチンマウス遺伝子の5’配列のPubmed配列(BC024702/M19524)に基づいて設計された以下のプライマーを使用して、このマウス肝ゲノムDNAからTTR最小(TTRmin)プロモーターとその5’UTRの部分とを増幅した。
フォワードプライマー:AAGCGGCCGCGGTACCGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTC(配列番号15)(NotIおよびAcc65I制限部位を含有する)。
リバースプライマー:AGCGCTAGCCAGGAGCTTGTGGATCTGTGTGACGGC(配列番号16)(NheI部位を含有する)。
上流エンハンサー配列を欠くTTRminプロモーターはCostaら(Costaら,1986,1989)により記載されている。TTRminの開始位置は−202(Cap部位に対するもの)に位置し、該配列はTTRエキソン1における翻訳開始部位の前の5’非翻訳領域において終結する(配列番号17を参照されたい;NCBI配列BC024702およびM19524を参照されたい)。
対照目的に使用するpAAV−プラスミドを作製するために、pAAV−MCSプラスミド(Stratagene,La JoIIa,CA,USA)をNotIで制限処理し、pBS−HCRHP−FIXIAプラスミドをSpeIで制限処理した。付着末端をクレノウフラグメントで埋めた後、それらの2つの断片を平滑末端連結により連結した。pBS−HCRHP−FIXIAはUniversity of WashingtonのC.Miao博士から快く贈呈された(Miaoら,2001)。より短いAATプロモーター断片は、より大きなAATプロモーター断片に関して報告されているものより大きな特異性で発現を肝臓に標的化するため(Yullら,1995)、347bpの短いAATプロモーター断片を使用して本発明者らの構築物にクローニングした。
エンハンサー(表IIIを参照されたい)をAcc65Iに隣接させ、Acc65IでのpAAV−TTRmin−FIXIAの制限処理の後、TTRminの上流にクローニングした。該TTRminの上流に複数のエンハンサーのクローニングが可能となるよう、AscIおよびMluI部位(アイソシゾマー)をAcc65I部位の直前または直後にエンハンサー含有断片内に組込んだ。これらの制限部位に隣接する調節要素は配列番号18〜31として示されている。これは、該ベクターのMluI制限処理、およびMluI/AscI制限処理エンハンサー含有断片への連結の後で達成された。得られた構築物の概要図を図1に示す。また、該エンハンサーの幾つか(Serp(配列番号3)、A1(配列番号4)、S2(配列番号2))に関しては、TTRminプロモーターの上流に複数のエンハンサー反復を挿入した(図2に示されているとおり)。全ての得られた構築物はDNA配列決定により実証された。
肝細胞系における発現構築物のインビトロ発現レベルはそのインビボ性能を予測しないことが十分に確認されている。実際、ある与えられたトランスジーンの肝臓内発現レベルを直接的に評価するためには、インビボでの流体力学的肝遺伝子運搬により、種々の発現カセットを比較することが、より適切である(Miaoら,2000)。成体C57/Bl6系統を使用した。動物実験はK.U.Leuvenの動物倫理委員会により承認された。動物を生物安全性レベルII条件下で収容した。記載されているとおりに(Liuら,1999)、流体力学的遺伝子運搬によりマウスに注射した。簡潔に説明すると、マウスを拘束ホルダー内に配置し、赤外線灯下で尾部を加熱した後、体積2mlのダルベッコリン酸緩衝食塩水(該マウスの体重の10%と等価)中の種々の用量(0.5−1−2μg)のそれぞれのプラスミドを5〜7秒の短い時間枠で尾静脈内に注射した。この方法は、肝細胞の効率的なインビボトランスフェクションをもたらすことが示されている。Qiagen EndoFreeキット(Hilden,Germany)を該製造業者の説明に従い使用して、内毒素非含有プラスミドDNAを抽出した。全身麻酔下、レトロオービタル(retro−orbital)採血により血液を集めた。20% 0.1Mクエン酸ナトリウム(凝血を防ぐためのもの)を含有する血漿サンプル中のヒトFIXの存在を、酵素結合イムノソルベントアッセイ(Asserachrome FIX ELISA,Diagnostica Stago,Parsippany,NJ,USA)を用いて判定した。各コホートはベクター当たり用量当たり5匹のマウスを含んでいた。
インシリコ(in silico)で特定された肝細胞特異的調節エンハンサー要素の、インビボ発現に対する効果を評価するために、hFIXを発現する発現構築物を流体力学的遺伝子運搬(2μg DNA)により肝細胞内にトランスフェクトした。これらの構築物においては、TTRminプロモーターによりhFIX発現を駆動し、あるいはDDMアルゴリズムおよび多次元尺度法により特定された、TFBSに非常に富む進化的に保存された肝細胞特異的エンハンサーと組合されたTTRminプロモーターにより、hFIX発現を駆動した。図3に示されている結果は、試験されたエンハンサーの大多数(AL、A1、A2、Aldo、Apo、F、S1、Serp、S2、T1およびT2)が、hFIX発現を駆動するためにTTRminプロモーターを使用した場合に得られたレベルと比較してレシピエントマウスの血漿中のhFIX発現レベルにおける有意な増加(>40%)をもたらしたことを示している(図3)。したがって、試験したエンハンサーの約80%(11/14)は、有意に改善されたhFIX発現レベルをもたらしており、このことは該DDM予測アルゴリズムの妥当性を更に証明している。特筆すべきことに、特に、より短い特定された配列が発現の増強において効率的である。すなわち、試験された400ヌクレオチドより長い2つの配列(A3、H)は、この実験においては、有意に増加したFIXレベルを与えなかった。しかし、これは、これらの配列の生理的役割を除外するものではない。pAAV−TTRmSerp−FIXIA構築物でのインビボ肝トランスフェクションの後で、最高のFIXレベルが得られた。これらのレベルは、該TTRminプロモーターを使用した場合と比較して7倍増加した。注目すべきことに、因子IX発現は全ての構築物に関して肝臓に限局されており、(例えば脾臓における)発現の「漏出(leakage)」は観察されなかった。
幾つかの肝特異性調節エンハンサー配列のモジュールのインビボ妥当性評価
これらのエンハンサー/調節要素の効力の妥当性を更に評価するために、複数のエンハンサー反復をTTRminプロモーターの上流に組込んだ(例えば、A1:反復2×、S2:反復6×またはSerp:反復3×;図2を参照されたい)。該結果は、複数のエンハンサーの組込みが循環hFIXレベルにおける付加的な増加をもたらしたことを示している(図3および4)。実際、Serp3エンハンサーの三重反復を含有するpAAV−TTRmSerp3−FIXIA構築物でのインビボ肝トランスフェクションの後で、最高のFIXレベルが得られた(図4)。これは、試験した全ての用量(0.5−1−2μg DNA)で確認された。その構築物で得られたFIXレベルは、pAAV−TTRmin−FIX構築物で得られたレベルより約20〜25倍高く、公知の最も強固(ロウバスト)な肝細胞特異的発現カセットの1つ(すなわち、pAAV−Apo−HCR−AAT−FIX)で得られたものより有意に高い(図4)。僅か2μgのDNAを使用して、ほぼ生理的なFIXレベルを得ることができた(正常FIXレベル:5000ng/ml=100%)。注目すべきことに、pAAV−Apo−HCR−AAT−FIXプラスミドで得られたFIX濃度は、この構築物での生理的FIXレベルの10〜40%の既に報告されている濃度(Miaoら,2000)と良く合致しており、これは該データの信頼性を証明している。総合すると、これらの結果は、肝細胞特異的プロモーター/エンハンサーの新規作製が強固(ロウバスト)なFIX発現レベルをもたらしたことを示しており、これにより、該エンハンサー修飾構築物の優秀性を証明している。
調節要素の更なる組合せ
同一エンハンサーの幾つかのコピーを使用する代わりに該エンハンサーの種々の組合せをつくることにより、該エンハンサーの妥当性を更に評価する。相補的TFBSを有するエンハンサーを使用する組合せとして類似した転写因子結合部位を有するエンハンサーを使用する両方の組合せをTTR最小プロモーターとの組合せにおいて試験する。特定された調節要素の一部分を使用して、例えば、配列番号1〜14の或る領域のみ、特に、転写因子結合部位を有するそれらの領域を使用して(必ずしもそれらに限定されるわけではない)、更なる組合せをつくる。そのようにすることにより、新たなより一層強力な調節/増強配列が得られうる。
AAVベクター遺伝子運搬による肝特異的調節エンハンサー配列のインビボ妥当性評価
材料および方法
細胞系および培養条件
2mM L−グルタミン(Gln)、100 IU/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシンおよび10% 熱不活性化ウシ胎児血清(FBS,Invitrogen,Merelbeke,Belgium)で補足されたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)内で細胞を培養した。
実施例2と同じ肝細胞特異的発現構築物(pAAV−TTRmin−FIXIA)から因子IXを発現する、AAVに基づくベクターを作製した。特に、エンハンサーSerp(配列番号3;表IIIを参照されたい)の組込みを有する構築物をAAVウイルスベクター内へのパッケージングに使用した。一例としては、該構築物をパッケージングするために、遺伝子治療のための有望なベクターであることが知られているAAV血清型9ウイルスベクター(Vandendriesscheら 2007)を選択して、AAV9−TTRminSerp−FIXIAを得た。Gaoら(2002)、Mingozziら(2003)およびGehrke(2003)に記載されているとおり、AAV9血清型の製造のために、製造業者の説明(リン酸カルシウムトランスフェクションキット,Invitrogen)に従うリン酸カルシウムトランスフェクションによりAAV2−ベクターDNA(26μg/10cmディッシュ)、アデノウイルスヘルパープラスミド(52μg/10cmディッシュ)ならびにRep2およびCap9を発現するAAVヘルパープラスミド(26μg/10cmディッシュ)で293細胞をトランスフェクトすることにより、ヒトFIXを発現するAAVベクターが高力価で製造された。
動物実験手法はK.U.Leuvenの動物倫理委員会により承認された。動物を生物安全性レベルII条件下で収容した。Vandendriesscheら(2007)に記載されているとおりに、AAV9−TTRmin−FIXIAまたはAAV9−TTRminSerp−FIXIAベクターをマウスに注射した。簡潔に説明すると、3×109または3×1012 AAVベクターゲノム(vg)を成体C57Bl6マウス(2〜5マウス/群)の尾静脈内に注射(i.v.)した。全身麻酔下、レトロオービタル(retro−orbital)採血により血液を集めた。ヒトFIX特異的ELISA(Asserachrome/Diagnostica Stago,Parsippany,NJ,USA)を用いて、クエン酸化マウス血漿中でヒトFIX発現を測定した。
前記実施例においては、ウイルスベクターに頼らずに高圧裸DNA遺伝子運搬(流体力学的トランスフェクション)により、DNAを肝臓に運搬した。ここでは、pAAV−TTRmin−FIXIAおよびpAAV−TTRminSerp−FIXIA構築物をAAVウイルスベクター内にパッケージングした。これらのベクターは、高圧流体力学的トランスフェクションに頼ることなく、遺伝子を肝臓内に直接的に導入しうる。肝臓内へのAAV遺伝子運搬は臨床的に重要なアプローチであり、それらはウイルス遺伝子を欠き、長期的遺伝子発現の可能性を有する。一例として、AAV血清型9を使用した(Vandendriessche 2007)。
Claims (19)
- 配列番号3の配列、配列番号3の配列に対して95%の同一性を有する配列、または配列番号3の機能性断片を含む、肝特異的遺伝子発現を増強するための150ヌクレオチドまたはそれ未満の核酸調節要素。
- プロモーターおよびトランスジーンに機能的に連結された請求項1に記載の核酸調節要素を含む核酸発現カセット。
- 配列番号3、配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号7、配列番号11、配列番号14、これらの配列のいずれかに対して95%の同一性を有する配列、またはそれらの機能性断片からなる群から選ばれる2つ以上の核酸調節要素を含み、2つ以上の核酸調節要素のうち一つが配列番号3の配列、配列番号3に対して95%の同一性を有する配列、または配列番号3の配列の機能性断片を含む、請求項2に記載の核酸発現カセット。
- それらの2つ以上の調節要素が同一である、請求項3に記載の核酸発現カセット。
- 該プロモーターが肝特異的プロモーターである、請求項2〜4のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
- 該プロモーターがトランスチレチン(TR)遺伝子由来である、請求項5に記載の核酸発現カセット。
- 該プロモーターが最小プロモーターである、請求項2〜6のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
- 該トランスジーンが治療用タンパク質をコードしている、請求項2〜7のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
- 該治療用タンパク質が凝固因子である、請求項8に記載の核酸発現カセット。
- 該治療用タンパク質が因子IXである、請求項9に記載の核酸発現カセット。
- 請求項1に記載の調節要素を含むベクター。
- 請求項2〜10のいずれか一項に記載の核酸発現カセットを含む、請求項11に記載のベクター。
- ウイルスベクターである、請求項11または12に記載のベクター。
- ウイルスベクターがレンチウイルスまたはAAVベクターである、請求項13に記載のベクター。
- 請求項1に記載の核酸調節要素を含む、遺伝子治療のための医薬組成物。
- 請求項2〜10のいずれか一項に記載の核酸発現カセットを含む、遺伝子治療のための医薬組成物。
- 請求項2〜10のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、肝細胞においてタンパク質を発現させるための医薬組成物であって、前記発現が、
・請求項2〜10のいずれか一項に記載の核酸発現カセットを肝細胞内に導入し、
・トランスジーンタンパク質産物を該肝細胞内で発現させること
を含む医薬組成物。 - 請求項8に記載の核酸発現カセットまたは請求項8に記載の核酸発現カセットを含むベクターを含む、遺伝子治療を要する対象に対する遺伝子治療のための医薬組成物であって、前記遺伝子治療が、
・請求項8に記載の核酸発現カセット、または請求項8に記載の核酸発現カセットを含むベクターを対象の肝臓内に導入し、
・治療量のタンパク質を肝臓内で発現させること
を含む、医薬組成物。 - ・請求項9もしくは10に記載の核酸発現カセット、または請求項9もしくは10に記載の核酸発現カセットを含むベクターを対象の肝臓内に導入し、
・治療量の凝固因子を肝臓内で発現させること
を含む、血友病Bを治療するための、請求項18に記載の医薬組成物。
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