TW202006141A

TW202006141A - 使用編碼具有增加表現的重組fviii變異體之病毒載體的a型血友病之基因療法

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Publication number: TW202006141A
Application number: TW108124947A
Authority: TW
Inventors: 翰斯彼得羅特斯登能; 威那霍爾里格
Original assignee: 美商巴克斯歐塔公司; 瑞士商巴克斯歐塔有限公司
Priority date: 2018-07-16
Filing date: 2019-07-15
Publication date: 2020-02-01
Also published as: CA3106590A1; MX2021000582A; WO2020018419A1; BR112021000695A2; JP2021530524A; CO2021000468A2; US20220333135A1; AU2019306194A1; KR20210034013A; CN112449640A; EP3823985A1

Abstract

本發明尤其提供編碼在哺乳動物細胞中表現之因子VIII變異體之密碼子經更改的多核苷酸。在一些具體實例中，本發明亦提供用於治療A型血友病之哺乳動物基因療法載體及方法。在一些具體實例中，本發明提供用於向A型血友病患者給予編碼因子VIII多肽之多核苷酸(例如密碼子經更改的多核苷酸)的方法。

Description

使用編碼具有增加表現的重組FVIII變異體之病毒載體的A型血友病之基因療法

本發明係關於編碼在哺乳動物細胞中表現之因子VIII變異體之密碼子經更改的多核苷酸。本發明亦關於哺乳動物基因療法載體、用於治療A型血友病之方法及向A型血友病患者給予編碼因子VIII多肽之多核苷酸(例如密碼子經更改的多核苷酸)的方法。

血液凝固經由稱為凝固級聯(cascade)之相互依賴生物化學反應之複雜及動態生物路徑進行。在級聯中凝血因子VIII (FVIII)為關鍵組分。因子VIII補充出血位點，且形成具有活化因子IX (FIXa)及因子X (FX)之Xase複合物。Xase複合物活化FX，其轉而將凝血酶原活化成凝血酶，該凝血酶隨後活化凝固級聯中之其他組分以生成穩定凝塊(在Saenko等人,Trends Cardiovasc. Med. , 9:185-192 (1999)；Lenting等人,Blood , 92:3983-3996 (1998)中綜述)。

A型血友病為先天性X連鎖出血病症，其特徵在於缺乏因子VIII活性。減弱之因子VIII活性抑制凝固級聯中之正反饋迴路。此造成不完全凝固，其顯示為持續時間增加之出血發作、大面積淤血、口腔及鼻部自發性出血、關節僵硬及慢性疼痛，且在嚴重情況下可能顯示為內部出血及貧血(Zhang等人,Clinic. Rev. Allerg. Immunol. , 37:114-124 (2009))。

習知地，A型血友病由因子VIII代替療法來治療，該療法由向患有A型血友病之個體投予因子VIII蛋白(例如血漿源性或以重組方式產生之因子VIII)組成。預防性投予因子VIII以回應於急性出血發作而預防出血發作或減少出血發作之頻率，及/或在手術前後投予因子VIII以控制手術期間之出血。然而，因子VIII代替療法存在若干非所需特徵。

首先，因子VIII代替療法用以治療或控制A型血友病，但不治癒潛在因子VIII缺乏。歸因於此，患有A型血友病之個體在其生命週期裏需要因子VIII代替療法。連續治療為昂貴的且需要個體維持嚴格的順應性，因為對於患有嚴重A型血友病之個體而言，僅少量預防性劑量之遺漏就可具有嚴重後果。

第二，因為因子VIII具有相對較短活體內半衰期，習知預防性因子VIII代替療法需要每兩天或三天投予。此為個體帶來在其全部生命中維持順應性之負擔。雖然第三代「長效」因子VIII藥物可降低投予頻率，但使用此等藥物之預防性因子FVIII代替療法仍然需要永久地每月、每週或更頻繁地投予。舉例而言，使用ELOCTATE™ [抗血友病因子(重組型)，Fc融合蛋白]之預防性治療需要每三至五天投予(ELOCTATE™處方資訊，Biogen Idec公司，(2015))。此外，尚未完全理解經化學修飾之生物製劑(例如聚乙二醇化多肽)之長期作用。

第三，所有接受因子VIII代替療法之個體的15%與30%之間形成抗因子VIII抑制子抗體，使得該療法效率低下。因子VIII旁路療法(例如投予血漿源性或以重組方式產生之凝血酶原複合濃縮物)可用於治療形成抑制子抗體之個體的血友病。然而，因子VIII旁路療法不如因子VIII代替療法有效(Mannucci P.M., J Thromb Haemost., 1(7):1349-55 (2003))且可能與增加之心血管併發症風險相關(Luu及Ewenstein, Haemophilia, 增刊10 2:10-16(2004))。

體細胞基因療法對於治療A型血友病具有較大前景，因為其彌補潛在低表現功能性因子VIII活性(例如歸因於誤義或無意義突變)，而非向個體提供因子VIII活性之單次劑量。由於作用機制方面之此差異，相較於因子VIII代替療法，單次投予因子VIII基因療法載體可為個體提供因子VIII若干年，降低了治療成本且排除持續患者順應性之需要。

已有效使用凝固因子IX (FIX)基因療法來治療患有B型血友病之個體(特徵為減弱之因子IX活性的相關血液凝固病況) (Manno C.S., 等人, Nat Med., 12(3):342-47 (2006))。然而，因子VIII基因療法呈現若干獨特之難題。舉例而言，全長野生型因子VIII多肽(2351個胺基酸；UniProt寄存編號P00451)比全長野生型因子IX多肽(461個胺基酸；UniProt寄存編號P00740)大五倍。因而，野生型因子VIII之編碼序列為7053個鹼基對，其太大而不能封裝於習知AAV基因療法載體中。此外，因子VIII之B域刪除變異體(BDD-FVIII)之所報告重組表現較差。因而，若干群組已嘗試更改BDD-FVIII構築體之密碼子使用，但成果有限。

因此，需要因子VIII變異體，其編碼序列更有效封裝於基因療法載體中且經由基因療法載體傳遞。亦需要更有效地表現因子VIII的合成密碼子經更改的核酸。此等因子VIII變異體及密碼子經更改的核酸可改良因子VIII缺乏(例如A型血友病)之治療。上文缺乏及與因子VIII缺乏(例如A型血友病)之治療相關之其他問題由本發明之密碼子經更改的因子VIII變異體減少或消除。

根據一些具體實例，本發明提供編碼因子VIII變異體之核酸，該等核酸與本發明之因子VIII重鏈(例如CS04-HC-NA)及輕鏈(例如CS04-LC-NA)之密碼子經更改序列具有高序列一致性。在一些具體實例中，此等核酸在編碼因子VIII重鏈及輕鏈之序列之間進一步包括編碼代替天然因子VIII B域之連接子序列(例如包含弗林蛋白酶(furin)裂解位點之連接子序列)的序列。

在一個態樣中，本發明提供一種包括編碼因子VIII多肽之核苷酸序列之多核苷酸。因子VIII多肽包括輕鏈、重鏈及接合重鏈之C端與輕鏈之N端的多肽連接子。因子VIII多肽之重鏈由與CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3)具有至少95%一致性之第一核苷酸序列編碼。因子FVIII多肽之輕鏈由與CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4)具有至少95%一致性之第二核苷酸序列編碼。多肽連接子包含弗林蛋白酶裂解位點。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，多肽連接子由與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有至少95%一致性之第三核苷酸序列編碼。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，編碼因子VIII多肽之重鏈的第一核苷酸序列與對應重鏈序列(例如CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3))具有至少96%一致性，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈的第二核苷酸序列與對應輕鏈序列(例如CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4))具有至少96%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，編碼因子VIII多肽之重鏈的第一核苷酸序列與對應重鏈序列(例如CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3))具有至少97%一致性，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈的第二核苷酸序列與對應輕鏈序列(例如CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4))具有至少97%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，編碼因子VIII多肽之重鏈的第一核苷酸序列與對應重鏈序列(例如CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3))具有至少98%一致性，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈的第二核苷酸序列與對應輕鏈序列(例如CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4))具有至少98%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，編碼因子VIII多肽之重鏈的第一核苷酸序列與對應重鏈序列(例如CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3))具有至少99%一致性，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈的第二核苷酸序列與對應輕鏈序列(例如CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4))具有至少99%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，編碼因子VIII多肽之重鏈的第一核苷酸序列與對應重鏈序列(例如CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3))具有至少99.5%一致性，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈的第二核苷酸序列與對應輕鏈序列(例如CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4))具有至少99.5%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，編碼因子VIII多肽之重鏈的第一核苷酸序列與對應重鏈序列(例如CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3))具有至少99.9%一致性，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈的第二核苷酸序列與對應輕鏈序列(例如CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4))具有至少99.9%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，編碼因子VIII多肽之重鏈的第一核苷酸序列為CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3)，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈的第二核苷酸序列為CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4)。

在一個態樣中，本發明提供一種包含與CS04-FL-NA具有至少95%一致性之核苷酸序列之多核苷酸，其中該多核苷酸編碼因子VIII多肽。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，核苷酸序列與對應全長多核苷酸序列(例如CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1))具有至少96%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，核苷酸序列與對應全長多核苷酸序列(例如CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1))具有至少97%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，核苷酸序列與對應全長多核苷酸序列(例如CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1))具有至少98%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，核苷酸序列與對應全長多核苷酸序列(例如CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1))具有至少99%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，核苷酸序列與對應全長多核苷酸序列(例如CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1))具有至少99.5%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，核苷酸序列與對應全長多核苷酸序列(例如CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1))具有至少99.9%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，核苷酸序列為CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，多核苷酸編碼包含與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少95%一致性之胺基酸序列的因子VIII多肽。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，多核苷酸編碼包含與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少96%一致性之胺基酸序列的因子VIII多肽。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，多核苷酸編碼包含與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少97%一致性之胺基酸序列的因子VIII多肽。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，多核苷酸編碼包含與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少98%一致性之胺基酸序列的因子VIII多肽。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，多核苷酸編碼包含與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少99%一致性之胺基酸序列的因子VIII多肽。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，多核苷酸編碼包含與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少99.5%一致性之胺基酸序列的因子VIII多肽。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，多核苷酸編碼包含與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少99.9%一致性之胺基酸序列的因子VIII多肽。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，多核苷酸編碼包含CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)之胺基酸序列的因子VIII多肽。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，核苷酸序列與選自由CS04-FL-NA、CS04-HC-NA及CS04-LC-NA組成之群的序列具有至少95%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，核苷酸序列與選自由CS04-FL-NA、CS04-HC-NA及CS04-LC-NA組成之群的序列具有至少96%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，核苷酸序列與選自由CS04-FL-NA、CS04-HC-NA及CS04-LC-NA組成之群的序列具有至少97%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，核苷酸序列與選自由CS04-FL-NA、CS04-HC-NA及CS04-LC-NA組成之群的序列具有至少98%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，核苷酸序列與選自由CS04-FL-NA、CS04-HC-NA及CS04-LC-NA組成之群的序列具有至少99%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，核苷酸序列與選自由CS04-FL-NA、CS04-HC-NA及CS04-LC-NA組成之群的序列具有至少99.5%一致性。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，核苷酸序列選自由CS04-FL-NA、CS04-HC-NA及CS04-LC-NA組成之群。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，多核苷酸亦包括可操作地連接至編碼因子VIII多肽之多核苷酸的啟動子元件。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，多核苷酸亦包括可操作地連接至編碼因子VIII多肽之多核苷酸的強化子元件。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，多核苷酸亦包括可操作地連接至編碼因子VIII多肽之多核苷酸的多腺苷酸化元件。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，多核苷酸亦包括以操作方式連接至編碼因子VIII多肽之核苷酸序列的內含子。

在上文所描述之多核苷酸之一個具體實例中，內含子位於編碼因子VIII多肽之核苷酸序列的啟動子元件與轉譯起始位點(例如，第一編碼ATG)之間。

在另一態樣中，本發明提供一種包括如上文所描述之多核苷酸之哺乳動物基因療法載體。

在上文所描述之哺乳動物基因療法載體之一個具體實例中，哺乳動物基因療法載體為腺相關病毒(AAV)載體。

在上文所描述之哺乳動物基因療法載體之一個具體實例中，AAV載體為AAV-8載體。

在另一態樣中，本發明提供一種用於治療A型血友病之方法，其包括向有需要之患者投予如上文所描述之哺乳動物基因療法載體。

在另一態樣中，本發明提供一種如上文所描述之哺乳動物基因療法載體，其用於治療A型血友病。

在另一態樣中，本發明提供如上文所描述之哺乳動物基因療法載體之用途，其係用於製造用於治療A型血友病之醫藥品。

I.引言

基於AAV之基因療法對於治療血友病患者具有較大前景。對於B型血友病，第一臨床資料令人鼓舞地為可在至少一些患者中維持約10%之FIX水平超過1年。然而對於A型血友病，出於各種原因獲得AAV載體之5-10%治療表現水平仍然具挑戰性。首先，對於習知基於AAV之載體而言因子VIII編碼序列過大。第二，經工程改造之B域刪除或截短之因子VIII構築體受活體內較差表現之影響，即使當密碼子最佳化時亦如此。第三，此等B域刪除或截短之因子VIII變異體構築體在活體內具有短半衰期，加重了較差表現之影響。第四，即使當表現時，FVIII亦不如其他凝血因子(諸如因子IX)般有效地自細胞分泌。因此，對於A型血友病患者而言，需要改良FVIII表現之策略來使得FVIII基因療法成為切實可行之治療選擇。

本發明係關於對解決此等及與因子VIII基因療法相關之其他問題之密碼子經更改的因子VIII變異體編碼序列的發現。舉例而言，本文所揭示之多核苷酸在哺乳動物細胞中提供明顯改良之表現，且歸因於穩定化之填充相互作用，顯示改良之病毒粒子封裝。在一些實施方案中，此等優勢藉由使用與密碼子經更改CS04構築體具有高序列一致性(例如與CS04-HC重鏈編碼序列具有高序列一致性且與CS04-LC輕鏈編碼序列具有高序列一致性)之因子VIII的重鏈及輕鏈之編碼序列實現。

在一些實施方案中，由本文中所描述之多核苷酸編碼之因子VIII分子已藉由截短、刪除或代替野生型B域而縮短。因而，多核苷酸更適合於經由習知基因療法載體表現因子VIII，該等習知基因療法載體低效地表現較大多肽，諸如野生型因子VIII。

有利地，本文展示CS04密碼子經更改的因子VIII變異體編碼序列提供B域刪除之因子VIII構築體的活體內優良表現。舉例而言，實施例2及表4中證實，在因子VIII基因敲除小鼠中靜脈內投予具有CS04 (SEQ ID NO: 1)編碼序列之基於AAV之基因療法載體相對於用野生型多核苷酸序列(SEQ ID NO: 10)編碼的對應CS40構築體提供因子VIII表現之74倍增加(表4)。

此外，本文亦展示CS04密碼子經更改的因子VIII變異體編碼序列提供優良的病毒粒子封裝及病毒產生。舉例而言，實施例1中證實當自相同量之細胞小球分離時，相對於用野生型多核苷酸序列編碼之對應CS40構築體，含有CS04構築體之AAV載體構築體提供大5至7倍之病毒產量。 II.定義

如本文所用，除非另外規定，否則以下術語具有歸屬於其之含義。

如本文所用，術語「因子VIII」及「FVIII」可互換使用，且係指具有因子VIII活性之任何蛋白(例如活性FVIII，通常稱為FVIIIa)或具有因子VIII活性、尤其因子IXa輔因子活性之蛋白之蛋白前體(例如原蛋白或前原蛋白)。在一例示性具體實例中，因子VIII多肽係指具有與野生型因子VIII多肽之重鏈及輕鏈具有高序列一致性(例如至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更高)的序列之多肽。在一些具體實例中，因子VIII多肽之B域經刪除、截短或經連接子多肽代替以減小編碼因子VIII多肽之多核苷酸的大小。在一例示性具體實例中，CS04-FL-AA之胺基酸20-1457構成因子VIII多肽。

野生型因子VIII多肽之非限制性實例包括人類前原因子VIII (例如GenBank寄存編號AAA52485、CAA25619、AAA58466、AAA52484、AAA52420、AAV85964、BAF82636、BAG36452、CAI41660、CAI41666、CAI41672、CAI43241、CAO03404、EAW72645、AAH22513、AAH64380、AAH98389、AAI11968、AAI11970或AAB61261)、對應原因子VIII及其天然變異體；豬科前原因子VIII (例如UniProt寄存編號F1RZ36或K7GSZ5)、對應原因子VIII及其天然變異體；小鼠前原因子VIII (例如GenBank寄存編號AAA37385、CAM15581、CAM26492或EDL29229)、對應原因子VIII及其天然變異體；大鼠前原因子VIII (例如Genbank寄存編號AAQ21580)、對應原因子VIII及其天然變異體；大鼠前原因子VIII；及其他哺乳動物因子VIII同源物(例如猴、猿、倉鼠、天竺鼠等)。

如本文所用，因子VIII多肽包括具有因子IX輔因子活性之天然變異體及人工構築體。如本發明中所用，因子VIII涵蓋保留一些基本因子IX輔因子活性(例如對應野生型活性之至少5%、10%、25%、50%、75%或更大)之任何天然變異體、替代序列、同功異構物或突變蛋白。存在於人類群體中之因子VIII胺基酸變異體(相對於FVIII-FL-AA (SEQ ID NO: 12))之實例包括(但不限於)：S19R、R22T、Y24C、Y25C、L26P/R、E30V、W33G、Y35C/H、G41C、R48C/K、K67E/N、L69P、E72K、D75E/V/Y、P83R、G89D/V、G92A/V、A97P、E98K、V99D、D101G/H/V、V104D、K108T、M110V、A111T/V、H113R/Y、L117F/R、G121S、E129V、G130R、E132D、Y133C、D135G/Y、T137A/I、S138R、E141K、D145H、V147D、Y155H、V159A、N163K、G164D/V、P165S、C172W、S176P、S179P、V181E/M、K185T、D186G/N/Y、S189L、L191F、G193R、L195P、C198G、S202N/R、F214V、L217H、A219D/T、V220G、D222V、E223K、G224W、T252I、V253F、N254I、G255V、L261P、P262L、G263S、G266F、C267Y、W274C、H275L、G278R、G280D、E284K、V285G、E291G/K、T294I、F295L、V297A、N299I、R301C/H/L、A303E/P、I307S、S308L、F312S、T314A/I、A315V、G323E、L326P、L327P/V、C329F、I331V、M339T、E340K、V345A/L、C348R/S/Y、Y365C、R391C/H/P、S392L/P、A394S、W401G、I405F/S、E409G、W412G/R、K427I、L431F/S、R437P/W、I438F、G439D/S/V、Y442C、K444R、Y450D/N、T454I、F455C、G466E、P470L/R/T、G474E/R/V、E475K、G477V、D478N、T479R、F484C、A488G、R490G、Y492C/H、Y492H、I494T、P496R、G498R、R503H、G513S/V、I522Y、K529E、W532G、P540T、T541S、D544N、R546W、R550C/G/H、S553P、S554C/G、V556D、R560T、D561G/H/Y、I567T、P569R、S577F、V578A、D579A/H、N583S、Q584H/K/R、I585R/T、M586V、D588G/Y、L594Q、S596P、N601D/K、R602G、S603I/R、W604C、Y605H/S、N609I、R612C、N631K/S、M633I、S635N、N637D/I/S、Y639C、L644V、L650F、V653A/M、L659P、A663V、Q664P、F677L、M681I、V682F、Y683C/N、T686R、F698L、M699T/V、M701I、G705V、G710W、N713I、R717L/W、G720D/S、M721I/L、A723T、L725Q、V727F、E739K、Y742C、R795G、P947R、V1012L、E1057K、H1066Y、D1260E、K1289Q、Q1336K、N1460K、L1481P、A1610S、I1698T、Y1699C/F、E1701K、Q1705H、R1708C/H、T1714S、R1715G、A1720V、E1723K、D1727V、Y1728C、R1740G、K1751Q、F1762L、R1768H、G1769R、L1771P、L1775F/V、L1777P、G1779E/R、P1780L、I1782R、D1788H、M1791T、A1798P、S1799H、R1800C/G/H、P1801A、Y1802C、S1803Y、F1804S、L1808F、M1842I、P1844S、T1845P、E1848G、A1853T/V、S1858C、K1864E、D1865N/Y、H1867P/R、G1869D/V、G1872E、P1873R、L1875P、V1876L、C1877R/Y、L1882P、R1888I、E1894G、I1901F、E1904D/K、S1907C/R、W1908L、Y1909C、A1939T/V、N1941D/S、G1942A、M1945V、L1951F、R1960L/Q、L1963P、S1965I、M1966I/V、G1967D、S1968R、N1971T、H1973L、G1979V、H1980P/Y、F1982I、R1985Q、L1994P、Y1998C、G2000A、T2004R、M2007I、G2013R、W2015C、R2016P/W、E2018G、G2022D、G2028R、S2030N、V2035A、Y2036C、N2038S、2040Y、G2045E/V、I2051S、I2056N、A2058P、W2065R、P2067L、A2070V、S2082N、S2088F、D2093G/Y、H2101D、T2105N、Q2106E/P/R、G2107S、R2109C、I2117F/S、Q2119R、F2120C/L、Y2124C、R2135P、S2138Y、T2141N、M2143V、F2145C、N2148S、N2157D、P2162L、R2169C/H、P2172L/Q/R、T2173A/I、H2174D、R2178C/H/L、R2182C/H/P、M2183R/V、L2185S/W、S2192I、C2193G、P2196R、G2198V、E2200D、I2204T、I2209N、A2211P、A2220P、P2224L、R2228G/L/P/Q、L2229F、V2242M、W2248C/S、V2251A/E、M2257V、T2264A、Q2265R、F2279C/I、I2281T、D2286G、W2290L、G2304V、D2307A、P2319L/S、R2323C/G/H/L、R2326G/L/P/Q、Q2330P、W2332R、I2336F、R2339T、G2344C/D/S及C2345S/Y。因子VIII蛋白亦包括含有轉譯後修飾之多肽。

一般而言，編碼因子VIII之多核苷酸編碼無活性單鏈多肽(例如前原蛋白)，其經歷轉譯後處理以形成活性因子VIII蛋白(例如FVIIIa)。舉例而言，參考圖1，野生型人類因子VIII前原蛋白首先經裂解以釋放經編碼訊號肽(未展示)，形成第一單鏈原蛋白(展示為「人類野生型FVIII」)。隨後原蛋白在B域與A3域之間裂解以形成包括因子VIII重鏈(例如A1及A2域)及B域之第一多肽，及包括因子VIII輕鏈(例如包括A3、C1及C3域)之第二多肽。第一多肽進一步裂解以移除B域，且亦分離A1與A2域，其在成熟因子VIIIa蛋白中保持與因子VIII輕鏈相關聯。對於因子VIII成熟方法之綜述，參見Graw等人, Nat Rev Genet., 6(6):488-501 (2005)，出於所有目的其內容以全文引用之方式併入本文中。

然而，在一些具體實例中，因子VIII多肽為單鏈因子VIII多肽。單鏈因子VIII多肽經工程改造以移除天然裂解位點，且視需要移除、截短或代替因子VIII之B域。因而，其因裂解(除視需要選用之訊號及/或前導肽之裂解以外)而不成熟，且作為單鏈為活性的。單鏈因子VIII多肽之非限制性實例描述於Zollner等人(Thromb Res, 134(1):125-31 (2014))及Donath等人(Biochem J., 312(1):49-55 (1995))中，出於所有目的其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

如本文所用，術語「因子VIII重鏈」或單純地「重鏈」係指因子VIII多肽之A1及A2域之聚集體。在一例示性具體實例中，CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)之胺基酸20-759構成因子VIII重鏈。

如本文所用，術語「因子VIII輕鏈」或單純地「輕鏈」係指因子VIII多肽之A3、C1及C2域之聚集體。在一例示性具體實例中，CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)之胺基酸774-1457構成因子VIII輕鏈。在一些具體實例中，因子VIII輕鏈不包括在成熟期間在活體內釋放之酸性a3肽。

一般而言，因子VIII重鏈及輕鏈表現為單一多肽鏈，例如連同視需要選用之B域或B域經取代連接子一起。然而，在一些具體實例中，因子VIII重鏈及因子VIII輕鏈表現為單獨的多肽鏈(例如共表現的)，且經重建以形成因子VIII蛋白(例如活體內或試管內)。

如本文所用，術語「B域經取代連接子」及「因子VIII連接子」可互換使用，且係指野生型因子VIII B域之截短型式(例如FVIII-FL-AA (SEQ ID NO: 12)之胺基酸760-1667)，或經工程改造以代替因子VIII多肽的B域之肽。如本文所用，在根據一些具體實例之因子VIII變異體多肽中，因子VIII連接子位於因子VIII重鏈之C端與因子VIII輕鏈之N端之間。B域經取代連接子之非限制性實例揭示於以下各者中：美國專利第4,868,112號、第5,112,950號、第5,171,844號、第5,543,502號、第5,595,886號、第5,610,278號、第5,789,203號、第5,972,885號、第6,048,720號、第6,060,447號、第6,114,148號、第6,228,620號、第6,316,226號、第6,346,513號、第6,458,563號、第6,924,365號、第7,041,635號及第7,943,374號；美國專利申請公開案第2013/024960號、第2015/0071883號及第2015/0158930號；及PCT公開案第WO 2014/064277號及第WO 2014/127215號，出於所有目的其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

除非本文另外規定，否則因子VIII胺基酸之編號係指全長野生型人類因子VIII序列(FVIII-FL-AA) (在圖13中呈現為SEQ ID NO: 12)中之對應胺基酸。因而，當提及本文所揭示之因子VIII變異體蛋白中之胺基酸取代時，所列舉的胺基酸編號係指全長野生型因子VIII序列中之類似(例如結構上或功能上等效)及/或同源(例如在一級胺基酸序列中進化保守的)胺基酸。舉例而言，T2105N胺基酸取代係指在全長野生型人類因子VIII序列(FVIII-FL-AA；SEQ ID NO: 12)之位置2105處之T至N取代基及在由CS04 (CS04-FL-AA；SEQ ID NO: 2)編碼之因子VIII變異體蛋白的位置1211處之T至N取代基。

如本文所描述，因子VIII胺基酸編號系統取決於是否包括因子VIII訊號肽(例如全長野生型人類因子VIII序列之胺基酸1至19)。在包括訊號肽時，編號稱為「訊號肽入選」或「SPI」。在不包括訊號肽時，編號稱為「訊號肽排除」或「SPE」。舉例而言，對於與SPE編號中之F309S相同之胺基酸，F328S為SPI編號。除非另有指示，否則所有胺基酸編號係指全長野生型人類因子VIII序列(FVIII-FL-AA) (在圖13中呈現為SEQ ID NO: 12)中之對應胺基酸。

如本文所描述，相較於由天然編碼之因子VIII構築體(例如使用野生型人類密碼子編碼相同因子VIII構築體之多核苷酸)提供之因子VIII表現水平，密碼子經更改的多核苷酸提供活體內基因轉殖因子VIII的增加之表現(例如當作為基因療法載體之部分投予時)。如本文所用，術語「增加之表現」係指相較於投予天然編碼之因子VIII構築體之動物血液中的基因轉殖因子VIII活性水平，投予編碼因子VIII之密碼子經更改的多核苷酸之動物血液中的基因轉殖因子VIII活性的增加的水平。可使用此項技術中已知之任何因子VIII活性量測活性水平。用於確定因子VIII活性之例示性分析為Technochrome FVIII分析(澳大利亞，維也納(Vienna)，Technoclone，)。

在一些具體實例中，增加之表現係指相較於投予天然編碼之因子VIII多核苷酸之動物血液中的基因轉殖因子VIII活性水平，投予密碼子經更改的因子VIII多核苷酸之動物血液中大至少25%的基因轉殖因子VIII活性。在一些具體實例中，增加之表現係指相較於投予天然編碼之因子VIII多核苷酸之動物血液中的基因轉殖因子VIII活性水平，投予密碼子經更改的因子VIII多核苷酸之動物血液中大至少50%、大至少75%、大至少100%、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大至少10倍、大至少15倍、大至少20倍、大至少25倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍、大至少100倍、大至少125倍、大至少150倍、大至少175倍、大至少200倍、大至少225倍或大至少250倍的基因轉殖因子VIII活性。

如本文所描述，相較於由天然編碼之因子VIII構築體(例如使用野生型人類密碼子編碼相同因子VIII構築體之多核苷酸)提供之載體產生水平，密碼子經更改的多核苷酸提供增加之載體產生。如本文所用，術語「增加之病毒產生」係指相較於接種有天然編碼之因子VIII構築體之細胞培養物中的載體產量，接種有編碼因子VIII之密碼子經更改的多核苷酸之細胞培養物中的增加之載體產量(例如效價（titer）/公升培養物)。可使用此項技術中已知之任何載體效價分析量測載體產量。用於確定載體產量(例如AAV載體之載體產量)之一例示性分析為靶向AAV2反向末端重複序列之qPCR (Aurnhammer, Human Gene Therapy Methods: Part B 23:18-28 (2012))。

在一些具體實例中，增加之病毒產生係指在相同類型培養物中，相較於天然編碼之因子VIII構築體之產量，大至少25%之密碼子經更改載體產量。在一些具體實例中，增加之載體產生係指在相同類型之培養物中，相較於天然編碼之因子VIII構築體之產量，大至少50%、大至少75%、大至少100%、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大至少10倍、大至少15倍或大至少20倍之密碼子經更改載體產量。

如本文所用，術語「血友病」係指大致特徵為減少之血液凝結或凝固之疾病病況群。血友病可指A型、B型或C型血友病，或指所有三種疾病類型之複合。A型血友病(A型血友病(hemophilia A))由因子VIII (FVIII)活性之降低或缺失造成且為最重要之血友病子類型。B型血友病(B型血友病(hemophilia B))由因子IX (FIX)凝結功能之缺失或降低引起。C型血友病(C型血友病(hemophilia C))為因子XI (FXI)凝結活性之缺失或降低之後果。A型及B型血友病為X連鎖疾病，而C型血友病為常染色體的。針對血友病之習知治療包括預防性及按需求投予凝結因子，諸如FVIII、FIX (包括Bebulin®-VH)及FXI，以及FEIBA-VH、去氨加壓素及血漿輸注。

如本文所用，術語「FVIII基因療法」包括向患者提供編碼因子VIII之核酸以緩解、減弱或預防與血友病相關之一或多種症狀(例如臨床因素)的復發之任何治療方法。該術語涵蓋投予包含編碼因子VIII分子(包括因子VIII之任何修飾形式(例如因子VIII變異體))之核酸的任何化合物、藥物、程序或方案，以維持或改善患有血友病之個體之健康狀態。熟習此項技術者應瞭解可例如基於根據本發明獲得之結果來改變FVIII療法之過程或FVIII治療劑之劑量。

如本文所用，術語「旁路療法」包括向患者提供非因子VIII止血劑、化合物或凝血因子以緩解、減輕或預防與血友病相關之一或多種症狀(例如臨床因素)的復發之任何治療方法。非因子VIII化合物及凝血因子包括(但不限於)因子VIII抑制子旁路活性(FEIBA)、重組活化之因子VII (FVIIa)、凝血酶原複合濃縮物及活化凝血酶原複合濃縮物。此等非因子VIII化合物及凝血因子可為重組或血漿源性。熟習此項技術者應瞭解可例如基於根據本發明獲得之結果改變旁路療法之過程或旁路療法之劑量。

如本文所用，包括投予編碼因子VIII分子之核酸及習知A型血友病治療劑之「組合療法」包括向患者提供編碼因子VIII分子之核酸與因子VIII分子及/或非因子VIII止血劑(例如旁路治療劑)以緩解、減輕或預防與血友病相關之一或多種症狀(例如臨床因素)的復發之任何治療方法。該術語涵蓋投予包括編碼因子VIII分子(包括因子VIII之任何修飾形式)之核酸的任何化合物、藥物、程序或方案，其適用於維持或改善患有血友病之個體之健康狀態且包括本文所描述之任一治療劑。

術語「治療有效量或劑量」或「治療足夠量或劑量」或「有效或足夠量或劑量」係指產生投予其所欲產生的治療效果之劑量。舉例而言，適用於治療血友病之藥物之治療有效量可為能夠預防或緩解與血友病相關之一或多種症狀的量。精確劑量將取決於治療之目的，且將可由熟習此項技術者使用已知技術來確定(參見例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms (第1卷至第3卷, 1992)；Lloyd,The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Pickar,Dosage Calculations (1999)；及Remington: The Science and Practice of Pharmacy ,第20版, 2003, Gennaro編, Lippincott, Williams & Wilkins)。

如本文所用，術語「基因」係指編碼多肽鏈之DNA分子之片段(例如編碼區)。在一些具體實例中，基因藉由緊接在編碼區之前、在編碼區之後及/或插入編碼區之區域定位，該等區域涉及產生多肽鏈(例如調節元件，諸如啟動子、強化子、多腺苷酸化序列、5'非轉譯區、3'非轉譯區或內含子)。

如本文所用，術語「調節元件」係指提供細胞中編碼序列之表現的核苷酸序列，諸如啟動子、強化子、終止子、多腺苷酸化序列、內含子等。

如本文所用，術語「啟動子元件」係指幫助控制編碼序列之表現之核苷酸序列。一般而言，啟動子元件位於基因之轉譯起始位點之5'。然而，在某些具體實例中，啟動子元件可位於內含子序列內或編碼序列之3'。在一些具體實例中，適用於基因療法載體之啟動子來源於目標蛋白之內源基因(例如因子VIII啟動子)。在一些具體實例中，適用於基因療法載體之啟動子對目標生物體之特定細胞或組織中之表現具有特異性(例如肝臟特異性啟動子)。在又其他具體實例中，複數個充分表徵之啟動子元件中之一者用於本文所描述之基因療法載體。充分表徵之啟動子元件之非限制性實例包括CMV早期啟動子、β-肌動蛋白啟動子及甲基CpG結合蛋白2 (MeCP2)啟動子。在一些具體實例中，啟動子為組成型啟動子，其實質上驅動目標蛋白之恆定表現。在其他具體實例中，啟動子為誘導型啟動子，其驅動響應於特定刺激(例如曝露於特定治療或藥劑)之目標蛋白之表現。對於針對AAV介導之基因療法設計啟動子的綜述，參見Gray等人(Human Gene Therapy 22:1143-53 (2011))，出於所有目的其內容明確地以全文引用之方式併入。

如本文所用，術語「載體」係指用以將核酸(例如編碼因子VIII基因療法構築體)轉移至宿主細胞中之任何媒劑。在一些具體實例中，載體包括複製子，其用於連同目標核酸一起複製媒劑。適用於基因療法之載體之非限制性實例包括質體、噬菌體、黏質體、人工染色體及病毒，其在活體內用作複製之自主單元。在一些具體實例中，載體為用於引入目標核酸(例如編碼因子VIII變異體之密碼子經更改的多核苷酸)之病毒媒劑。許多適用於基因療法之經修飾真核病毒為此項技術中已知的。舉例而言，腺相關病毒(AAV)尤其較適用於人類基因療法，因為人類為該病毒之天然宿主，尚不知該天然病毒促成任何疾病，且該病毒引起輕度免疫反應。

如本文所用，術語「CpG島」係指具有統計學上較高密度之CpG二核苷酸之多核苷酸內的區域。如本文所用，若在200個鹼基對窗內：(i) 區域具有大於50%之GC含量，及(ii)如藉由以下關係所定義，所觀測的CpG二核苷酸/預期CpG二核苷酸之比率為至少0.6，則多核苷酸(例如編碼密碼子經更改的因子VIII蛋白之多核苷酸)之區域為CpG島：

對於用於鑑別CpG島之方法之額外資訊，參見Gardiner-Garden M.等人, J Mol Biol., 196(2):261-82 (1987)，出於所有目的其內容明確地以全文引入之方式併入本文中。

如本文所用，術語「核酸」係指呈單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物以及其互補序列。術語涵蓋含有合成的、天然存在的及非天然存在的已知核苷酸類似物或經修飾主鏈殘基或鍵之核酸，其具有與參考核酸相似之結合特性，且其以與參考核苷酸相似之方式代謝。此等類似物之實例包括(但不限於)硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、膦酸甲酯、對掌性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸及肽核酸(PNA)。

術語「胺基酸」係指天然存在及非天然胺基酸，包括以與天然存在之胺基酸相似的方式起作用之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸包括彼等由遺傳密碼編碼之胺基酸，以及彼等稍後經修飾之胺基酸，例如羥基脯胺酸、y-羧基麩胺酸及O-磷酸絲胺酸。天然存在之胺基酸可包括例如D-胺基酸及L-胺基酸。本文所用之胺基酸亦可包括非天然胺基酸。胺基酸類似物係指具有與天然存在之胺基酸相同的基本化學結構(亦即與氫、羧基、胺基及R基團結合之任何碳)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸或甲硫胺酸甲基鋶。此等類似物具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽主鏈，然而保留與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模擬物係指具有不同於胺基酸之一般化學結構之結構但以與天然存在之胺基酸相似的方式起作用之化學化合物。胺基酸在本文中可由其通常已知之三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名法委員會(Biochemical Nomenclature Commission)所推薦之單字母符號來指稱。同樣，核苷酸可由其通常可接受之單字母代碼提及。

關於胺基酸序列，一般熟習此項技術者應認知到更改、添加或刪除編碼序列中之單個胺基酸或較小百分比之胺基酸的核酸或肽序列之個別取代、刪除或添加為「經保守修飾之變異體」，其中該更改使得胺基酸經化學上相似之胺基酸取代。提供功能上相似之胺基酸的保守取代表為此項技術中所熟知。此等經保守修飾之變異體另外為且不排除本發明之多形性變異體、種間同源物及對偶基因。

提供功能上相似之胺基酸之保守胺基酸取代為此項技術中所熟知。取決於特定胺基酸(例如催化、結構或空間重要胺基酸)之功能性，胺基酸之不同分組可視為彼此保守取代的。表 1 基於胺基酸之電荷及極性、胺基酸之疏水性、胺基酸之表面曝露/結構性質及胺基酸之二級結構傾向提供視為保守取代之胺基酸之分組。表 1 .基於蛋白中之殘基之功能性的保守胺基酸取代之分組。

在兩個或更多個核酸或肽序列之情形下，術語「一致」或「一致性」百分比係指如使用例如具有下文所描述之預設參數的BLAST或BLAST 2.0序列比較演算法或藉由人工比對及目視檢查所量測為相同或具有指定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸(亦即當比較及比對比較窗或指定區內之最大對應性時，指定區內約60%一致性，較佳地65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性)之兩個或更多個序列或子序列。

如此項技術中已知，多種不同程式可用以鑑別蛋白(或如下文所論述之核酸)與已知序列是否具有序列一致性或相似性。使用此項技術中已知之標準技術、較佳使用預設設定或藉由檢查來確定序列一致性及/或相似性，該等標準技術包括(但不限於) Smith及Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)之局部序列一致性演算法；Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)之序列一致性比對演算法；Pearson及Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444 (1988)之相似性方法之檢索；此等演算法之電腦化實施方案(Wisconsin Genetics套裝軟體中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI)；由Devereux等人, Nucl. Acid Res., 12:387-395 (1984)所描述之Best Fit序列程式。較佳地，一致性百分比係藉由FastDB基於以下參數計算：錯配罰分1；空隙罰分1；空隙大小罰分0.33；及接合罰分30，「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis」, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, 第127-149頁(1988), Alan R. Liss, 公司，以上所有以引用之方式併入。

適用演算法之一實例為PILEUP。PILEUP使用漸進式逐個成對比對自一組相關序列產生多序列比對。其亦可繪製展示用以產生比對之叢集關係之樹形圖。PILEUP使用Feng及Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)之漸進式比對方法之簡化；該方法與由Higgins及Sharp CABIOS 5:151-153 (1989)所描述之方法相似，兩者均以引用之方式併入。適用PILEUP參數包括預設空隙權重3.00、預設空隙長度權重0.10及加權末端空隙。

適用演算法之另一實例為BLAST演算法，其描述於以下者中：Altschul等人, J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990)；Altschul等人, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)；及Karlin等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787 (1993)，兩者均以引用之方式併入。尤其適用之BLAST程式為WU-BLAST-2程式，其獲自Altschul等人, Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)；[http://blast.wustl/edu/blast/ README.html]。WU-BLAST-2使用若干檢索參數，其中大部分設定成預設值。使用以下值設定可調節參數：重疊間隔= 1、重疊分數= 0.125、詞臨限值(T) = 11。HSP S及HSP S2參數為動態值且藉由程式本身根據特定序列之組成及檢索相關序列所對照的特定資料庫之組成而確立；然而可調節該等值以提高敏感性。

如由以引用之方式併入之Altschul等人, Nucl. Acids Res., 25:3389-3402所報告，其他適用演算法為空隙BLAST。空隙BLAST使用BLOSUM-62取代得分；臨限T參數設定為9；二擊法用於觸發無空隙延伸部分，加入空隙長度k，代價為10+k；Xu設定為16，且Xg對於資料庫檢索階段設定為40且對於演算法之輸出階段設定為67。空隙比對藉由對應於約22位元（bit）之得分觸發。

藉由相配一致殘基之數量除以比對區域中「更長」序列之殘基的總數量來確定胺基酸序列一致性%值。「更長」序列為比對區域中具有大多數實際殘基之一者(忽略藉由WU-Blast-2引入以最大化比對得分之空隙)。以相似方式，關於所鑑別之多肽之編碼序列，「核酸序列一致性百分比(%)」定義為與細胞循環蛋白的編碼序列中之核苷酸殘基一致之候選序列中的核苷酸殘基之百分比。較佳方法利用設定為預設參數之WU-BLAST-2之BLASTN模塊，其中重疊間隔及重疊分數分別設定為1及0.125。

比對可包括將空隙引入待比對之序列中。此外，對於含有比由圖2之序列(SEQ ID NO: 1)編碼之蛋白更多或更少胺基酸的序列，應理解在一個具體實例中，序列一致性百分比將基於一致胺基酸或核苷酸之數量相對於胺基酸或核苷酸之總數量而確定。因此，舉例而言，在一個具體實例中，如下文所論述比圖2中所展示之序列(SEQ ID NO: 1)更短之序列的序列一致性將使用更短序列中之核苷酸之數量確定。在一致性百分比計算中，未將相對權重賦予序列變型之各種表現，諸如插入、刪除、取代等。

在一個具體實例中，僅一致性得正分(+1)且包括空隙之序列變型之所有形式賦值為「0」，其避免對用於序列相似性計算之如下文所描述的加權評分或參數的需要。可例如藉由相配一致殘基之數量除以比對區域中「更短」序列之殘基的總數量且乘以100來計算序列一致性百分比。「更長」序列為比對區域中具有大多數實際殘基之一者。

術語「對偶基因變異體」係指特定基因座處之基因之多形性形式以及來源於基因之mRNA轉錄物的cDNA及由其編碼之多肽。術語「較佳哺乳動物密碼子」係指編碼最常用於哺乳動物細胞中所表現之蛋白之胺基酸的密碼子集合當中之密碼子子集，如選自以下清單：Gly (GGC, GGG)；Glu (GAG)；Asp (GAC)；Val (GTG, GTC)；Ala (GCC, GCT)；Ser (AGC, TCC)；Lys (AAG)；Asn (AAC)；Met (ATG)；Ile (ATC)；Thr (ACC)；Trp (TGG)；Cys (TGC)；Tyr (TAT, TAC)；Leu (CTG)；Phe (TTC)；Arg (CGC, AGG, AGA)；Gln (CAG)；His (CAC)；及Pro (CCC)。

如本文所用，術語密碼子經更改係指編碼多肽(例如因子VIII變異體蛋白)之多核苷酸序列，其中編碼多肽之天然多核苷酸之至少一個密碼子已經更改以改良多核苷酸序列之特性。在一些具體實例中，經改良特性促進編碼多肽之mRNA之轉錄增加，mRNA之穩定性增加(例如mRNA半衰期增加)、多肽之轉譯增加及/或載體內之多核苷酸封裝增加。可用於達成改良特性之更改之非限制性實例包括改變用於特定胺基酸的密碼子之使用及/或分佈、調整整體及/或局部GC含量、移除富AT序列、移除重複序列元件、調整整體及/或局部CpG二核苷酸含量、移除隱性調節元素(例如TATA框及CCAAT框元件)、移除內含子/外顯子拼接位點、提高調節序列(例如引入Kozak共同序列)及移除能夠在經轉錄mRNA中形成二級結構(例如莖-環)之序列元件。

如本文所論述，本文存在各種命名法來指代本發明之組分。「CS-編號」(例如「CS04」)係指編碼FVIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸及/或經編碼多肽，包括變異體。舉例而言，CS04-FL係指由CS04多核苷酸序列編碼之全長密碼子經更改CS04多核苷酸序列或胺基酸序列(有時在本文中對於胺基酸序列而言稱為「CS04-FL-AA」而對於核酸序列而言稱為「CS04-FL-NA」)。相似地，「CS04-LC」係指編碼FVIII多肽之輕鏈的密碼子經更改的核酸序列(「CS04-LC-NA」)或由CS04多核苷酸序列編碼之FVIII輕鏈的胺基酸序列(在本文中有時亦稱為「CS04-LC-AA」)。同樣，對於FVIII重鏈而言CS04-HC、CS04-HC-AA及CS04-HC-NA為相同的。如將由此項技術者所瞭解，對於僅密碼子經更改之構築體，諸如CS04 (例如其相較於Refacto不含有其他胺基酸取代)，胺基酸序列將一致，因為胺基酸序列不因密碼子最佳化而更改。因此，本發明之序列構築體包括(但不限於)CS04-FL-NA、CS04-FL-AA、CS04-LC-NA、CS04-LC-AA、CS04-HC-AA及CS04-HC-NA。 III.密碼子經更改的因子 VIII 變異體

在一些具體實例中，本發明提供編碼因子VIII變異體之密碼子經更改的多核苷酸。當在基於AAV之基因療法構築體中投予時，此等密碼子經更改的多核苷酸提供明顯改良之因子VIII表現。相較於習知密碼子最佳化構築體，密碼子經更改的多核苷酸亦展現改良之AAV病毒粒子封裝。如實施例2及表4中所展現，申請人已經由編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸(CS04-FL-NA)之發現達成此等優勢，該因子VIII多肽具有人類野生型因子VIII重鏈及輕鏈以及含有弗林蛋白酶裂解位點以促進活性FVIIIa蛋白活體內成熟之短的、14個胺基酸、B域經取代連接子(「SQ」連接子)。

在一個具體實例中，本文所提供之密碼子經更改的多核苷酸具有與至少編碼因子VIII重鏈及因子VIII輕鏈之CS04 (SEQ ID NO: 1)內的序列具有高序列一致性之核苷酸序列。如此項技術中已知，因子VIII之B域對於活體內活性非必需。因此，在一些具體實例中，本文中所提供之密碼子經更改的多核苷酸完全缺少因子VIII B域。在一些具體實例中，天然因子VIII B域經含有弗林蛋白酶裂解位點之短胺基酸連接子代替，該短胺基酸連接子例如由CS04 (SEQ ID NO 2)構築體之胺基酸760-773組成之「SQ」連接子。「SQ」連接子亦稱為BDLO04 (對於胺基酸序列而言為BDLO04-AA，而對於核苷酸序列而言為BDLO04-NA)。

在一個具體實例中，由密碼子經更改的多核苷酸編碼之因子VIII重鏈及輕鏈分別為人類因子VIII重鏈及輕鏈。在其他具體實例中，由密碼子經更改的多核苷酸編碼之因子VIII重鏈及輕鏈為來自另一哺乳動物之重鏈及輕鏈序列(例如豬因子VIII)。在又其他具體實例中，因子VIII重鏈及輕鏈為嵌合重鏈及輕鏈(例如人類及第二哺乳動物序列之組合)。在又其他具體實例中，因子VIII重鏈及輕鏈為來自另一哺乳動物之重鏈及輕鏈之人類化型式，例如來自其中人類殘基在選擇位置處經取代以在向人類投予時減少所得肽之免疫原性的另一哺乳動物之重鏈及輕鏈序列。

人類基因之GC含量自低於25%至高於90%廣泛變化。然而，一般而言，具有更高GC含量之人類基因以更高水平表現。舉例而言，Kudla等人(PLoS Biol., 4(6):80 (2006))證實增加基因之GC含量主要藉由增加轉錄且實現更高穩態水平之mRNA轉錄而增加經編碼多肽之表現。一般而言，密碼子最佳化基因構築體之所需GC含量為等於或高於60%。然而，天然AAV基因組之GC含量為大約56%。

因此，在一些具體實例中，本文中所提供之密碼子經更改的多核苷酸之CG含量更接近地符合天然AAV病毒粒子之GC含量(例如，大約56% GC)，其低於習知密碼子經最佳化以用於哺乳動物細胞中表現的多核苷酸之較佳CG含量(例如處於或高於60% GC)。如實施例1中所概述，相較於具有更高GC含量之相似密碼子經更改編碼序列，GC含量為約56%之CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有改良之病毒粒子封裝。

因此，在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量低於60%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量低於59%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量低於58%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量低於57%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量不超過56%。

在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為54%至59%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為55%至59%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為56%至59%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為54%至58%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為55%至58%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為56%至58%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為54%至57%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為55%至57%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為56%至57%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為54%至56%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為55%至56%。

在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為56±0.5%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為56±0.4%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為56±0.3%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為56±0.2%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為56±0.1%。在一些具體實例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸之總GC含量為56%。A. 因子 VIII B 域 經取代連接子

在一些具體實例中，進一步更改FVIII重鏈與輕鏈之間的連接(例如野生型因子VIII中之B域)。歸因於AAV封裝能力之大小限制，B域刪除、截短及或連接子經取代之變異體應提高FVIII基因療法構築體之功效。最習知使用之B域經取代連接子為SQ FVIII之連接子，其僅保留B域之14個胺基酸作為連接子序列。豬科VIII之另一變異體(描述於美國專利第6,458,563號中之「OBI-1」)在CHO細胞中良好表現，且具有24個胺基酸之稍微更長的連接子。在一些具體實例中，由本文所描述之密碼子經更改的多核苷酸編碼之因子VIII構築體包括SQ型B域連接子序列。在其他具體實例中，由本文所描述之密碼子經更改的多核苷酸編碼之因子VIII構築體包括OBI-1型B域連接子序列。

在一些具體實例中，本文所描述之經編碼因子VIII多肽包括SQ型B域連接子(SFSQNPPVLKRHQR；BDL-SQ-AA；SEQ ID NO: 13)，該SQ型B域連接子包括野生型人類因子VIII B域之胺基酸760-762/1657-1667 (FVIII-FL-AA；SEQ ID NO: 12) (Sandberg等人 Thromb. Haemost. 85:93 (2001))。在一些具體實例中，相對於對應野生型序列，SQ型B域連接子具有一個胺基酸取代。在一些具體實例中，相對於對應野生型序列，SQ型B域連接子具有兩個胺基酸取代。

在一些具體實例中，本文所描述之經編碼因子VIII多肽包括Greengene型B域連接子，該Greengene型B域連接子包括野生型人類因子VIII B域之胺基酸760/1582-1667 (FVIII-FL-AA；SEQ ID NO: 12) (Oh等人, Biotechnol. Prog., 17:1999 (2001))。在一些具體實例中，相對於對應野生型序列，Greengene型B域連接子具有一個胺基酸取代。在一些具體實例中，相對於對應野生型序列，Greengene型B域連接子具有兩個胺基酸取代。

在一些具體實例中，本文所描述之經編碼因子VIII多肽包括延長之SQ型B域連接子，該延長之SQ型B域連接子包括野生型人類因子VIII B域的胺基酸760-769/1657-1667 (FVIII-FL-AA；SEQ ID NO: 12) (Thim等人, Haemophilia, 16:349 (2010))。在一些具體實例中，相對於對應野生型序列，延長之SQ型B域連接子具有一個胺基酸取代。在一些具體實例中，相對於對應野生型序列，延長之SQ型B域連接子具有兩個胺基酸取代。

在一些具體實例中，本文所描述之經編碼因子VIII多肽包括豬科OBI-1型B域連接子，該OBI-1型B域連接子包括來自野生型豬科因子VIII B域之胺基酸SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (SEQ ID NO: 14) (Toschi等人, Curr. Opin. Mol. Ther. 12:517 (2010))。在一些具體實例中，相對於對應野生型序列，豬科OBI-1型B域連接子具有一個胺基酸取代。在一些具體實例中，相對於對應野生型序列，豬科OBI-1型B域連接子具有兩個胺基酸取代。

在一些具體實例中，本文所描述之經編碼因子VIII多肽包括人類OBI-1型B域連接子，該人類OBI-1型B域連接子包括野生型人類因子VIII B域之胺基酸760-772/1655-1667 (FVIII-FL-AA；SEQ ID NO: 12)。在一些具體實例中，相對於對應野生型序列，人類OBI-1型B域連接子具有一個胺基酸取代。在一些具體實例中，相對於對應野生型序列，人類OBI-1型B域連接子具有兩個胺基酸取代。

在一些具體實例中，本文所描述之經編碼因子VIII多肽包括O8型B域連接子，該O8型B域連接子包括來自野生型豬科因子VIII B域之胺基酸SFSQNSRHQAYRYRRG (SEQ ID NO: 15) (Toschi等人, Curr. Opin. Mol. Ther. 12:517 (2010))。在一些具體實例中，相對於對應野生型序列，豬科OBI-1型B域連接子具有一個胺基酸取代。在一些具體實例中，相對於對應野生型序列，豬科OBI-1型B域連接子具有兩個胺基酸取代。

B. 編碼具有可裂解連接子之因子 VIII 變異體之密碼子經更改的多核苷酸 CS04 密碼子經更改的多核苷酸

在一個具體實例中，本文中所提供之密碼子經更改的多核苷酸包括編碼具有活體內可裂解之連接子的因子VIII變異體多肽之核苷酸序列。因子VIII多肽包括因子VIII輕鏈、因子VIII重鏈及接合重鏈之C端與輕鏈之N端的多肽連接子。因子VIII多肽之重鏈由與CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3)具有高序列一致性之第一核苷酸序列編碼，該CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3)為編碼因子VIII重鏈之CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)之部分。因子VIII多肽之輕鏈由與CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4)具有高序列一致性之第二核苷酸序列編碼，該CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4)為編碼因子VIII輕鏈之CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)之部分。多肽連接子包括弗林蛋白酶裂解位點，其引起活體內成熟(例如在活體內表現或投予前體多肽之後)。

在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)具有至少95%序列一致性。在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)具有至少96%序列一致性。在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)具有至少97%序列一致性。在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)具有至少98%序列一致性。在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)具有至少99%序列一致性。在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)具有至少99.5%序列一致性。在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)具有至少99.9%序列一致性。在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)一致。

在一些具體實例中，因子VIII構築體之多肽連接子由與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有高序列一致性之第三核苷酸序列編碼，該BDLO04 (SEQ ID NO: 5)編碼對應於CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)之胺基酸760-773之14胺基酸連接子。在一些具體實例中，第三核苷酸序列與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有至少95%一致性。在一些具體實例中，第三核苷酸序列與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有至少96%一致性。在一些具體實例中，第三核苷酸序列與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有至少97%一致性。在一些具體實例中，第三核苷酸序列與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有至少98%一致性。在一些具體實例中，第三核苷酸序列與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)一致。

在一些具體實例中，密碼子經更改的多核苷酸具有與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有高序列一致性之核苷酸序列。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少95%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少96%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少97%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少98%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少99%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少99.5%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少99.9%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)一致。

在一些具體實例中，由密碼子經更改的多核苷酸編碼之因子VIII變異體具有與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些具體實例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少97%一致性。在一些具體實例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少98%一致性。在一些具體實例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少99%一致性。在一些具體實例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少99.5%一致性。在一些具體實例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少99.9%一致性。在一些具體實例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)一致。C. 因子 VIII 表現載體

在一些具體實例中，本文所描述之密碼子經更改的多核苷酸整合於表現載體中。表現載體之非限制性實例包括病毒載體(例如適用於基因療法之載體)、質體載體、噬菌體載體、黏接質體、噬菌粒、人工染色體及其類似物。

病毒載體之非限制性實例包括：反轉錄病毒，例如莫洛尼(Moloney)鼠類白血病病毒(MMLV)、哈維(Harvey)鼠類肉瘤病毒、鼠類乳腺腫瘤病毒及勞斯(Rous)肉瘤病毒；腺病毒、腺相關病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；艾巴氏(Epstein-Barr)病毒；乳頭狀瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒及脊髓灰質炎病毒。

在一些具體實例中，本文所描述之密碼子經更改的多核苷酸整合於基因療法載體中。在一些具體實例中，基因療法載體為反轉錄病毒，且尤其為複製缺陷型反轉錄病毒。用於產生複製缺陷型反轉錄病毒之方案為此項技術中已知。關於綜述，參見Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990)及Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, 第7卷, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991)。

在一個具體實例中，基因療法載體為基於腺相關病毒(AAV)之基因療法載體。AAV系統先前已描述且一般為此項技術所熟知(Kelleher及Vos,Biotechniques , 17(6): 1110-17 (1994)；Cotten等人,Proc Natl Acad Sci USA , 89(13):6094-98 (1992)；Curiel,Nat Immun, 13(2-3):141-64 (1994)；Muzyczka,Curr Top Microbiol Immunol , 158:97-129 (1992)；及Asokan A等人, Mol. Ther., 20(4):699- 708 (2012)，出於所有目的各自以全文引用之方式併入本文中)。關於rAAV載體之產生及使用之細節描述於例如美國專利第5,139,941號及第4,797,368號中，出於所有目的各自以全文引用之方式併入本文中。在一特定具體實例中，AAV載體為AAV-8載體。

在一些具體實例中，本文所描述之密碼子經更改的多核苷酸整合於反轉錄病毒表現載體中。此等系統先前已描述且一般為此項技術中所熟知(Mann等人,Cell , 33:153-159, 1983；Nicolas及Rubinstein, 於：Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses中, Rodriguez及Denhardt編, Stoneham: Butterworth, 第494-513頁, 1988；Temin, 於：Gene Transfer中, Kucherlapati (編), New York: Plenum Press, 第149-188頁, 1986)。在一特定具體實例中，反轉錄病毒載體為豆狀病毒載體(參見例如Naldini等人,Science , 272(5259):263-267, 1996；Zufferey等人,Nat Biotechnol , 15(9):871-875, 1997；Blomer等人,J Virol. , 71(9):6641-6649, 1997；美國專利第6,013,516號及第5,994,136號)。

廣泛多種載體可用於在細胞培養物中自密碼子經更改多肽表現因子VIII多肽，包括真核及原核表現載體。在某些具體實例中，涵蓋質體載體以用於在細胞培養物中表現因子VIII多肽。一般而言，將含有來源於與宿主細胞相容之物種之複製子及控制序列的質體載體與此等宿主結合使用。載體可攜帶複製位點以及能夠在轉型細胞中提供表型選擇之標記序列。質體將包括可操作地連接至一或多個控制序列(例如啟動子)之編碼因子VIII多肽之密碼子經更改的多核苷酸。

用於原核表現之載體之非限制性實例包括質體，諸如pRSET、pET、pBAD等，其中用於原核表現載體之啟動子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。用於真核表現之載體之實例包括：(i)用於在酵母菌中表現，使用諸如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等之啟動子的載體，諸如pAO、pPIC、pYES、pMET；(ii)用於在昆蟲細胞中表現，使用諸如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等之啟動子的載體，諸如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等；及(iii)用於在哺乳動物細胞中表現，使用諸如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV及β-肌動蛋白之啟動子的諸如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等之載體及來源於病毒系統之載體，病毒系統為諸如牛痘病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、反轉錄病毒等。D. 給藥

本發明提供向已診斷患有A型血友病之人類患者(「A型血友病患者」或「患者」)投予本發明之密碼子最佳化構築體。一般而言，如本文所概述，投予係使用含有本發明之密碼子最佳化構築體之AAV顆粒進行。此外，如下文所更全面描述，投予本發明之構築體可藉由也投予潑尼松龍(prednisolone)或潑尼松(prednisone)擴充。2×10¹² 個腺相關病毒 (AAV) 顆粒 / 公斤體重

在一個態樣中，本發明提供一種用於治療A型血友病之方法，該方法包括向A型血友病患者靜脈內輸注(例如藉由周邊靜脈內輸注) 2×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤人類患者體重之劑量，其中AAV顆粒包括編碼因子VIII多肽且與SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)具有高序列一致性的密碼子經更改的多核苷酸。

在一個具體實例中，以2×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤人類患者體重之劑量向人類患者投予之與SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)具有高序列一致性的密碼子經更改的多核苷酸編碼因子VIII變異體多肽，該因子VIII變異體多肽具有活體內可裂解之連接子。因子VIII多肽包括因子VIII輕鏈、因子VIII重鏈及接合重鏈之C端與輕鏈之N端的多肽連接子。因子VIII多肽之重鏈由與CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3)具有高序列一致性之第一核苷酸序列編碼，該CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3)為編碼因子VIII重鏈之CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)之部分。因子VIII多肽之輕鏈由與CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4)具有高序列一致性之第二核苷酸序列編碼，該CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4)為編碼因子VIII輕鏈之CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)之部分。多肽連接子包括弗林蛋白酶裂解位點，其引起活體內成熟(例如在活體內表現或投予前體多肽之後)。

在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)具有至少95%序列一致性。在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)具有至少96%序列一致性。在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)具有至少97%序列一致性。在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)具有至少98%序列一致性。在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)具有至少99%序列一致性。在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)具有至少99.5%序列一致性。在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)具有至少99.9%序列一致性。在一些具體實例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3及4)一致。在此等具體實例中，由此等核苷酸序列編碼之胺基酸序列與CS04-HC-AA及CS04-LC-AA一致。

在一些具體實例中，因子VIII構築體之多肽連接子由與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有高序列一致性之第三核苷酸序列編碼，該BDLO04 (SEQ ID NO: 5)編碼對應於CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)之胺基酸760-773之14胺基酸連接子。在一些具體實例中，第三核苷酸序列與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有至少95%一致性。在一些具體實例中，第三核苷酸序列與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有至少96%一致性。在一些具體實例中，第三核苷酸序列與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有至少97%一致性。在一些具體實例中，第三核苷酸序列與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有至少98%一致性。在一些具體實例中，第三核苷酸序列與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)一致。在此等具體實例中，由此等核苷酸序列編碼之胺基酸序列與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)之胺基酸760-773一致。在一些具體實例中，以2×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤人類患者體重之劑量向人類患者投予之密碼子經更改的多核苷酸具有與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有高序列一致性的核苷酸序列。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少95%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少96%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少97%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少98%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少99%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少99.5%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少99.9%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)一致。在此等具體實例中，由此等核苷酸序列編碼之胺基酸序列與CS04-FL-AA一致。

在一些具體實例中，由密碼子經更改的多核苷酸編碼之因子VIII變異體具有與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些具體實例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少97%一致性。在一些具體實例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少98%一致性。在一些具體實例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少99%一致性。在一些具體實例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少99.5%一致性。在一些具體實例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)具有至少99.9%一致性。在一些具體實例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)一致。

因此，在一個具體實例中，本發明提供一種用於治療A型血友病之方法，該方法包括向A型血友病患者靜脈內輸注2×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤人類患者體重之劑量，其中AAV顆粒包括具有SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列的多核苷酸。

在一些具體實例中，藉由靜脈內輸注(例如至患者之手臂中之靜脈中)以單次劑量投予AAV顆粒。在一些具體實例中，投予單次劑量之部分，監測患者對投予之不良反應體徵短暫時間週期(例如30分鐘)，且隨後(例如若未出現不良反應體徵)向患者投予單次劑量之剩餘部分。

在一些具體實例中，投予AAV顆粒之人類患者患有嚴重A型血友病。舉例而言，在一些具體實例中，當未接受因子VIII代替療法時，患者在其血流中具有低於參考血液樣品中所存在之因子VIII活性量之2%或複數個確定未患有A型血友病的個體之血液樣品中所存在之平均因子VIII活性之因子VIII活性水平，該參考血液樣品為例如具有正常因子VIII活性之血液樣品(例如來自確定未患有A型血友病的個體之血液樣品)。在一些具體實例中，當未接受因子VIII代替療法時，個體在其血流中具有低於參考血液樣品中所存在之因子VIII活性量之2%的因子VIII活性水平。

在一些具體實例中，投予AAV顆粒之人類患者不具有FVIII抑制子(例如因子VIII抑制子抗體)、不具有除嚴重A型血友病以外之止血缺陷、不具有慢性肝功能障礙及/或不具有嚴重腎損傷。

因此，在一些具體實例中，本文所描述之方法包括鑑定患者以便投予2×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤人類患者體重之劑量的步驟，其中AAV顆粒包括編碼因子VIII多肽且與SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)具有高序列一致性的密碼子經更改的多核苷酸。該方法包括在患者未接受因子VIII代替療法時測定之血流中因子VIII活性水平，及鑑定患者以便在患者之血流中因子VIII活性水平低於參考樣品中因子VIII水平的約2%或低於參考樣品中因子VIII水平的約1%時投予AAV顆粒。在一些具體實例中，該方法包括確定患者是否具有一或多個FVIII抑制子(例如因子VIII抑制子抗體)、除嚴重A型血友病以外的止血缺陷、慢性肝功能障礙及嚴重腎損傷，及若患者具有所列舉病況中之任一者則淘汰該患者。6×10¹² 個腺相關病毒 (AAV) 顆粒 / 公斤體重

在一個態樣中，本發明提供一種用於治療A型血友病之方法，該方法包括向A型血友病患者靜脈內輸注(例如藉由周邊靜脈內輸注) 6×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤人類患者體重之劑量，其中AAV顆粒包括編碼因子VIII多肽且與SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)具有高序列一致性的密碼子經更改的多核苷酸。

在一個具體實例中，以6×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤人類患者體重之劑量向人類患者投予之與SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)具有高序列一致性的密碼子經更改的多核苷酸編碼因子VIII變異體多肽，該因子VIII變異體多肽具有活體內可裂解之連接子。因子VIII多肽包括因子VIII輕鏈、因子VIII重鏈及接合重鏈之C端與輕鏈之N端的多肽連接子。因子VIII多肽之重鏈由與CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3)具有高序列一致性之第一核苷酸序列編碼，該CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3)為編碼因子VIII重鏈之CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)之部分。因子VIII多肽之輕鏈由與CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4)具有高序列一致性之第二核苷酸序列編碼，該CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4)為編碼因子VIII輕鏈之CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)之部分。多肽連接子包括弗林蛋白酶裂解位點，其引起活體內成熟(例如在活體內表現或投予前體多肽之後)。

在一些具體實例中，因子VIII構築體之多肽連接子由與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有高序列一致性之第三核苷酸序列編碼，該BDLO04 (SEQ ID NO: 5)編碼對應於CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)之胺基酸760-773之14胺基酸連接子。在一些具體實例中，第三核苷酸序列與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有至少95%一致性。在一些具體實例中，第三核苷酸序列與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有至少96%一致性。在一些具體實例中，第三核苷酸序列與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有至少97%一致性。在一些具體實例中，第三核苷酸序列與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)具有至少98%一致性。在一些具體實例中，第三核苷酸序列與BDLO04 (SEQ ID NO: 5)一致。在此等具體實例中，由此等核苷酸序列編碼之胺基酸序列與CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2)之胺基酸760-773一致。

在一些具體實例中，以6×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤人類患者體重之劑量向人類患者投予之密碼子經更改的多核苷酸具有與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有高序列一致性的核苷酸序列。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少95%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少96%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少97%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少98%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少99%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少99.5%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)具有至少99.9%一致性。在一些具體實例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)一致。在此等具體實例中，由此等核苷酸序列編碼之胺基酸序列與CS04-FL-AA一致。

因此，在一個具體實例中，本發明提供一種用於治療A型血友病之方法，該方法包括向A型血友病患者靜脈內輸注6×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤人類患者體重之劑量，其中AAV顆粒包括具有SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列的多核苷酸。

因此，在一些具體實例中，本文所描述之方法包括鑑定患者以便投予6×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤人類患者體重之劑量的步驟，其中AAV顆粒包括編碼因子VIII多肽且與SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)具有高序列一致性的密碼子經更改的多核苷酸。該方法包括在患者未接受因子VIII代替療法時測定之血流中因子VIII活性水平，及鑑定患者以便在患者之血流中因子VIII活性水平低於參考樣品中因子VIII水平的約2%或低於參考樣品中因子VIII水平的約1%時投予AAV顆粒。在一些具體實例中，該方法包括確定患者是否具有一或多個FVIII抑制子(例如因子VIII抑制子抗體)、除嚴重A型血友病以外的止血缺陷、慢性肝功能障礙及嚴重腎損傷，及若患者具有所列舉病況中之任一者則淘汰該患者。與潑尼松龍或潑尼松共投予

在一些具體實例中，上文所描述之藉由以任一劑量投予AAV顆粒治療A型血友病之方法亦包括向人類患者給予潑尼松龍或潑尼松的療程(例如)以例如藉由降低個體之細胞因子及/或趨化因子產生來降低發炎反應水平。與基因療法共投予潑尼松龍或潑尼松之實例方法描述於例如國際專利申請公開案第WO 2008/069942號中，出於所有目的其內容以全文引用之方式併入本文中。

在一些具體實例中，在投予具有多核苷酸之腺相關病毒(AAV)顆粒之前向人類患者投予潑尼松龍或潑尼松，該多核苷酸與SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)具有高序列一致性且編碼因子VIII多肽。舉例而言，在一些具體實例中，在向患者投予AAV顆粒之前約一週或約一或兩天投予潑尼松龍或潑尼松。在一些具體實例中，在投予AAV顆粒之前約一週或約一或兩天開始給予潑尼松龍或潑尼松之療程，且在投予AAV顆粒之後繼續。

在一些具體實例中，當投予具有多核苷酸之腺相關病毒(AAV)顆粒時向人類個體共投予潑尼松龍或潑尼松，該多核苷酸編碼因子VIII多肽且與SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)具有高序列一致性。舉例而言，在一些具體實例中，在同一天(例如在投予AAV顆粒之前或之後立即)投予潑尼松龍或潑尼松。在一些具體實例中，在投予AAV顆粒之同一天給予潑尼松龍或潑尼松之療程，且在投予AAV顆粒之後繼續。

在一些具體實例中，在投予具有多核苷酸之腺相關病毒(AAV)顆粒之後向患者投予潑尼松龍或潑尼松，該多核苷酸編碼因子VIII多肽且與SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)具有高序列一致性。舉例而言，在一些具體實例中，在向患者投予AAV顆粒之後約一或兩天第一次投予潑尼松龍或潑尼松。

應注意潑尼松龍或潑尼松為經口投予(但其亦可靜脈內投予)之小分子藥物，且因此在此情形下「共投予」不需要含有兩種藥物之單一溶液。

在一些具體實例中，在至少兩週之時間段內(例如)每天或每兩天向患者給予潑尼松龍或潑尼松之療程。在一些具體實例中，在至少三週之時間段內給予潑尼松龍或潑尼松之療程。在一些具體實例中，在療程期間潑尼松龍或潑尼松之劑量減少。舉例而言，在一個具體實例中，療程以投予約60 mg潑尼松龍或潑尼松/天開始，且隨著療程進行減少。

在一個具體實例中，療程包括在療程之第一週期間向人類患者投予約60 mg潑尼松龍或潑尼松/天，在療程之第二週期間向患者投予約40 mg潑尼松龍或潑尼松/天及在輸注AAV顆粒後緊接著第三週期間向患者投予約30 mg潑尼松龍或潑尼松/天。

在一些具體實例中，療程包括在第三週之後進一步逐漸減少潑尼松龍或潑尼松之投予，例如投予逐漸減少劑量之潑尼松龍或潑尼松。在一個具體實例中，逐漸減少劑量之潑尼松龍或潑尼松包括依次投予約20 mg潑尼松龍或潑尼松/天、約15 mg潑尼松龍或潑尼松/天、約10 mg潑尼松龍或潑尼松/天及約5 mg潑尼松龍或潑尼松/天之劑量(例如一或多個各濃度之劑量)。

在一個具體實例中，逐漸減少劑量之潑尼松龍或潑尼松包括在完成潑尼松龍或潑尼松之初始療程後連續5天(例如緊接著)向患者投予約20 mg潑尼松龍或潑尼松/天，向患者投予20 mg潑尼松龍或潑尼松5天後連續3天(例如緊接著)向患者投予約15 mg潑尼松龍或潑尼松/天，向患者投予15 mg潑尼松龍或潑尼松3天後連續3天(例如緊接著)向患者投予約10 mg潑尼松龍或潑尼松/天及向患者投予10 mg潑尼松龍或潑尼松後3天連續3天(例如緊接著)連續3天向患者投予約5 mg潑尼松龍或潑尼松/天。

在一個具體實例中，逐漸減少劑量之潑尼松龍或潑尼松包括在完成潑尼松龍或潑尼松之初始療程後緊接著連續7天向患者投予約30 mg潑尼松龍或潑尼松/天，向患者投予30 mg潑尼松龍或潑尼松7天後緊接著連續7天向患者投予約20 mg潑尼松龍或潑尼松/天，向人類個體投予20 mg潑尼松龍或潑尼松後7天緊接著連續5天向患者投予約15 mg潑尼松龍或潑尼松/天，向患者投予15 mg潑尼松龍或潑尼松5天後緊接著連續5天向患者投予約10 mg潑尼松龍或潑尼松/天及向患者投予10 mg潑尼松龍或潑尼松5天後緊接著連續5天向患者投予約5 mg潑尼松龍或潑尼松/天。

在一些具體實例中，向患者投予逐漸減少劑量之潑尼松龍或潑尼松之時長係基於，在潑尼松龍或潑尼松之初始療程結束時，患者是否仍然顯示肝炎體徵(例如如由因子VIII水平(例如因子VIII效價或因子VIII活性)降低或肝酵素增加所指示)而確定。

舉例而言，在一個具體實例中，在向患者投予包括編碼因子VIII蛋白之多核苷酸腺相關病毒(AAV)顆粒後，測定患者之血流中(例如自患者收集之血液樣品中)的因子VIII第一水平(例如效價或活性)且同時患者接受糖皮質激素類固醇治療之初始療程。在完成糖皮質激素類固醇治療之初始療程之後，測定患者之血流中的因子VIII第二水平(例如效價或活性)。隨後將因子VIII第二水平與因子VIII第一水平比較。當因子VIII第二水平未降低時(例如當因子VIII第二水平不低於因子VIII第一水平或不低於小於因子VIII第一水平之臨限量時)，向患者投予第一逐漸減少劑量之糖皮質激素類固醇不超過三週之時間週期。當因子VIII第二水平降低時(例如當因子VIII第二水平低於因子VIII第一水平或低於小於因子VIII第一水平之臨限量時)，向患者投予第二逐漸減少劑量之糖皮質激素類固醇超過三週之時間週期。

相似地，在一些具體實例中，在向患者投予包括編碼因子VIII蛋白之多核苷酸的腺相關病毒(AAV)顆粒之前(例如或之後不久)測定患者之血流中之肝酵素第一水平(例如肝酵素效價或活性)。在完成糖皮質激素類固醇治療之初始療程之後，測定患者之血流中的肝酵素水平之第二水平(例如肝酵素效價或活性)。隨後將肝酵素第二水平與肝酵素第一水平比較。當肝酵素第二水平未增加時(例如當肝酵素第二水平不超過肝酵素第一水平或不超過大於肝酵素第一水平之臨限量時)，向患者投予第一逐漸減少劑量之糖皮質激素類固醇不超過三週之時間週期。當肝酵素第二水平增加時(例如當肝酵素第二水平超過肝酵素第一水平或超過大於肝酵素第一水平之臨限量時)，向患者投予第二逐漸減少劑量之糖皮質激素類固醇超過三週之時間週期。

在一些具體實例中，第一逐漸減少劑量之潑尼松龍或潑尼松包括在完成潑尼松龍或潑尼松之初始療程後連續5天(例如緊接著)向患者投予約20 mg潑尼松龍或潑尼松/天，向患者投予20 mg潑尼松龍或潑尼松5天後連續3天(例如緊接著)向患者投予約15 mg潑尼松龍或潑尼松/天，向人類個體投予15 mg潑尼松龍或潑尼松3天後連續3天(例如緊接著)向患者投予約10 mg潑尼松龍或潑尼松/天及向患者投予10 mg潑尼松龍或潑尼松後3天連續3天(例如緊接著)連續3天向患者投予約5 mg潑尼松龍或潑尼松/天。

在一些具體實例中，第二逐漸減少劑量之潑尼松龍或潑尼松包括在完成潑尼松龍或潑尼松之初始療程後緊接著連續7天向患者投予約30 mg潑尼松龍或潑尼松/天，向患者投予30 mg潑尼松龍或潑尼松7天後緊接著連續7天向患者投予約20 mg潑尼松龍或潑尼松/天，向患者投予20 mg潑尼松龍或潑尼松後7天緊接著連續5天向患者投予約15 mg潑尼松龍或潑尼松/天，向患者投予15 mg潑尼松龍或潑尼松5天後緊接著連續5天向患者投予約10 mg潑尼松龍或潑尼松/天及向患者投予10 mg潑尼松龍或潑尼松5天後緊接著連續5天向患者投予約5 mg潑尼松龍或潑尼松/天。

在一些具體實例中，在投予AAV顆粒後在患者中偵測到免疫反應的跡象之後給予潑尼松龍或潑尼松之療程。在一些具體實例中，在患者中偵測到肝炎之跡象之後給予潑尼松龍或潑尼松之療程。舉例而言，在一些具體實例中，在投予AAV顆粒後監測患者之肝炎，且在偵測到肝炎後向患者給予潑尼松龍或潑尼松之療程。

在一些具體實例中，患者之血流中因子VIII表現或因子VIII活性之迅速或較大降低指示個體之肝炎。在一些具體實例中，有可能可觀測到因子VIII活性之早期峰值隨後少量及/或逐漸降低，其後在稍微更低水平下形成因子VIII蛋白，而不需要給予潑尼松龍或潑尼松之療程。舉例而言，在一些具體實例中，在投予AAV顆粒後監測患者血流中因子VIII之量(例如因子VIII效價或因子VIII活性水平)，且若偵測到因子VIII之量迅速或較大降低(例如相較於投予AAV顆粒後患者血流中之水平超過因子VIII效價或因子VIII活性水平之臨限降低)，則向個體給予潑尼松龍或潑尼松之療程。

在一些具體實例中，患者中之肝酵素水平增加指示個體之肝炎。舉例而言，在一些具體實例中，在投予AAV顆粒後監測患者中之肝酵素水平，且若偵測到肝酵素水平之增加（例如，(例如)相較於投予AAV顆粒之前或投予AAV顆粒之後不久患者中之肝酵素基線水平，超過肝酵素之量的臨限增加），則向患者給予潑尼松龍或潑尼松之療程。投予後監測

在一些具體實例中，提供用於在投予腺相關病毒(AAV)顆粒後監測患者之不良反應及/或治療功效之方法，該等腺相關病毒(AAV)顆粒具有編碼因子VIII多肽之多核苷酸，例如與SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)具有高序列一致性的多核苷酸。在一些具體實例中，針對以下中之一或多者監測患者：(a)肝炎之跡象(例如經由因子VIII水平(例如效價或活性)的迅速或較大降低及/或肝酵素(例如效價或活性)之增加)，(b)患者之血流中因子VIII抑制子抗體之增加，(c)患者之血流中衣殼蛋白之增加，(d)患者之血流中抗衣殼蛋白抗體之增加，及(e)患者之血流中編碼因子VIII多肽的多核苷酸或其片段之增加。在一些具體實例中，在偵測到一或多個不良反應及/或治療無效後進一步治療個體。

舉例而言，在一個具體實例中，提供用於監測使用腺相關病毒(AAV)顆粒之A型血友病之因子VIII基因療法的功效之方法，該等腺相關病毒(AAV)顆粒包括編碼因子VIII多肽之多核苷酸。該方法包括在向患者投予AAV顆粒之後，確定在患者之血流中(例如在自患者收集之血液樣品中)是否存在因子VIII抑制子抗體。在一些具體實例中，當在患者之血流中偵測到因子VIII抑制子抗體時（例如，當相較於投予AAV顆粒之前患者中之水平，偵測到因子VIII抑制子抗體水平之增加時），該方法包括向患者投予替代性藥劑用於治療A型血友病。

在一些具體實例中，用於治療A型血友病之替代性藥劑為因子VIII之替代形式(例如不包括或藉由所偵測到之因子VIII抑制子抗體掩蔽靶向表位中之一或多者的一種替代形式)。在一些具體實例中，因子VIII之替代形式為經化學修飾因子VIII蛋白(例如經化學修飾人類或豬科因子VIII蛋白)。在一些具體實例中，因子VIII之替代形式為來源於非人類因子VIII蛋白之因子VIII蛋白，例如豬科因子VIII蛋白。在一些具體實例中，用於治療A型血友病之替代性藥劑為因子VIII旁路療法，例如包括因子II、因子IX及因子X之治療劑。舉例而言，在一些具體實例中，因子VIII旁路療法為因子VIII抑制子旁路活性(FEIBA)複合物、重組活化因子VII (FVIIa)、凝血酶原複合濃縮物或活化凝血酶原複合濃縮物。

在一個具體實例中，提供用於在投予AAV顆粒後監測患者之血流中編碼因子VIII多肽之多核苷酸或其片段的水平之方法。在一個具體實例中，該方法包括在第一時間點向A型血友病患者投予腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤患者體重之劑量，其中AAV顆粒包括編碼因子VIII蛋白之多核苷酸。該方法亦包括在稍後時間點量測患者之血流中編碼因子VIII蛋白之多核苷酸或其片段之水平，其中該稍後時間點為7天或更長。在一個具體實例中，該方法包括在第一時間點向A型血友病患者投予2×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤患者體重之劑量，其中AAV顆粒包括具有SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列的多核苷酸。該方法亦包括在稍後時間點量測患者之血流中SEQ ID NO: 1之核酸或其片段的水平，其中稍後時間點為7天或更長。在一個具體實例中，該方法包括在第一時間點向A型血友病患者投予6×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤患者體重之劑量，其中AAV顆粒包括具有SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列的多核苷酸。該方法亦包括在稍後時間點量測患者之血流中SEQ ID NO: 1之核酸或其片段的水平，其中稍後時間點為7天或更長。在方法之一些具體實例中，稍後時間點為稍後至少14天或稍後至少21天。在一些具體實例中，稍後時間點為投予AAV顆粒之後7天、14天或21天時。

在一個具體實例中，提供用於在投予AAV顆粒後監測患者之血流中衣殼蛋白水平之方法。在一個具體實例中，該方法包括在第一時間點向A型血友病患者投予2×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤該患者體重之劑量，其中AAV顆粒包括衣殼蛋白及多核苷酸，該多核苷酸包括SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列。該方法亦包括在稍後時間點量測該患者之血流中之衣殼蛋白水平，其中稍後時間點為7天或更長。在一個具體實例中，該方法包括在第一時間點向A型血友病患者投予6×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤患者體重之劑量，其中AAV顆粒包括衣殼蛋白及多核苷酸，該多核苷酸包括SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列。該方法亦包括在稍後時間點量測該患者之血流中之衣殼蛋白水平，其中稍後時間點為7天或更長。在一個具體實例中，該方法包括在第一時間點向A型血友病患者投予腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤該患者體重之劑量，其中AAV顆粒包括衣殼蛋白及編碼因子VIII蛋白之多核苷酸。該方法亦包括在稍後時間點量測該患者之血流中之衣殼蛋白水平，其中稍後時間點為7天或更長。在方法之一些具體實例中，稍後時間點為稍後至少14天或稍後至少21天。在一些具體實例中，稍後時間點為投予AAV顆粒之後7天、14天或21天時。

在一個具體實例中，提供用於在投予AAV顆粒後監測患者之血流中之因子VIII抑制子抗體水平的方法。在一個具體實例中，該方法包括在第一時間點向A型血友病患者投予2×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤患者體重之劑量，其中AAV顆粒包括多核苷酸，該多核苷酸包括SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列。該方法亦包括在稍後時間點量測患者之血流中之抗因子VIII抗體水平，其中稍後時間點為7天或更長。在一個具體實例中，該方法包括在第一時間點向A型血友病患者投予6×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤患者體重之劑量，其中AAV顆粒包括多核苷酸，該多核苷酸包括SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列。該方法亦包括在稍後時間點量測患者之血流中之抗因子VIII抗體水平，其中該稍後時間點為7天或更長。在一個具體實例中，該方法包括在第一時間點向A型血友病患者投予腺相關病毒(AAV)顆粒之劑量，其中AAV顆粒包括編碼因子VIII蛋白之多核苷酸。該方法亦包括在稍後時間點量測患者之血流中之抗因子VIII抗體水平，其中該稍後時間點為7天或更長。在方法之一些具體實例中，稍後時間點為稍後至少14天或稍後至少21天。在一些具體實例中，稍後時間點為投予AAV顆粒之後7天、14天或21天時。

在一個具體實例中，提供用於在投予AAV顆粒後監測個體之血流中之抗衣殼蛋白抗體水平的方法。在一個具體實例中，該方法包括在第一時間點向A型血友病患者投予2×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤該患者體重之劑量，其中AAV顆粒包括衣殼蛋白及多核苷酸，該多核苷酸包括SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列。該方法亦包括在稍後時間點量測患者之血流中之抗衣殼蛋白抗體水平，其中稍後時間點為7天或更長。在一個具體實例中，該方法包括在第一時間點向A型血友病患者投予6×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤患者體重之劑量，其中AAV顆粒包括衣殼蛋白及多核苷酸，該多核苷酸包括SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列。該方法亦包括在稍後時間點量測該患者之血流中之抗衣殼蛋白抗體水平，其中稍後時間點為7天或更長。在一個具體實例中，該方法包括在第一時間點向A型血友病患者投予腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤該患者體重之劑量，其中AAV顆粒包括衣殼蛋白及編碼因子VIII蛋白之多核苷酸。該方法亦包括在稍後時間點量測該患者之血流中之抗衣殼蛋白抗體水平，其中稍後時間點為7天或更長。在方法之一些具體實例中，稍後時間點為稍後至少14天或稍後至少21天。在一些具體實例中，稍後時間點為投予AAV顆粒之後7天、14天或21天時。IV. 實施例 實施例 1 - 構築密碼子經更改的因子 VIII 變異體表現序列

必須克服兩個障礙以創造出對A型血友病之基因療法有效之因子VIII編碼序列。第一，歸因於習知基因療法遞送載體(例如AAV病毒粒子)之基因組大小限制，必須大大縮短經編碼因子VIII多肽。第二，必須更改編碼序列以：(i)穩定化遞送載體內之封裝相互作用，(ii)穩定化mRNA中間物，及(iii)改良mRNA之轉錄/轉譯之穩固性。

為實現第一目標，申請人以在本文中稱為「FVIII-BDD-SQ」之B域刪除之因子VIII變異體構築體開始。在此構築體中，用稱為「SQ」序列之十四胺基酸序列代替B域。重組FVIII-BDD-SQ以商標名REFACTO®出售，且已展示為對控制A型血友病有效。然而，包括因子VIII重鏈及輕鏈之人類野生型核酸序列的FVIII-BDD-SQ之天然編碼序列不能在基因療法載體中有效表現。

為解決天然FVIII-BDD-SQ之較差表現，將如Ward等人(Blood, 117:798 (2011))及McIntosh等人(Blood, 121, 3335-3344 (2013))中所描述而修改之描述於Fath等人(PLoS ONE, 6:e17596 (2011))中的密碼子最佳化演算法應用於FVIII-BDD-SQ序列以形成第一中間編碼序列CS04a。然而，申請人認知到使用經修改演算法形成之CS04a序列可藉由進一步修飾該序列而改良。因此，申請人重新引入CpG二核苷酸，重新引入精胺酸之CGC密碼子，改變白胺酸及絲胺酸密碼子分佈，重新引入高度保守之密碼子對，且移除隱性TATA框、CCAAT框及拼接位點元件，同時避免CpG島及富AT及富GC伸長段之局部過表現。

第一，經修改演算法用非CpG二核苷酸密碼子系統地代替含有CpG二核苷酸之密碼子(例如精胺酸密碼子)，且消除/避免由相鄰密碼子形成之CpG二核苷酸。通常進行對CpG二核苷酸之此嚴格避免以防止在肌肉內注射DNA疫苗之後TLR誘導的免疫。然而，如此進行限制密碼子最佳化之可能性。舉例而言，經修改演算法排除使用CGX精胺酸密碼子之完整集合。此在用於人類細胞中之表現之基因編碼中尤其具有破壞性，因為在高度表現之人類基因中CGC為最常使用的精胺酸密碼子。另外，避免由相鄰密碼子形成CpG進一步限制最佳化可能性(例如限制可共同使用之密碼子對的數量)。

由於不預期TLR誘導之免疫為與基於AAV之肝臟定向基因療法相關的問題，因此將包括CpG之密碼子及形成CpG之相鄰密碼子重新引入中間編碼序列CS04a中，較佳地引入編碼因子VIII輕鏈之序列中(例如在FVIII-BDD-SQ編碼序列之3'端處)。此允許更頻繁地使用較佳人類密碼子，尤其用於精胺酸之密碼子。然而注意避免形成CpG島，其為具有高頻率CpG位點之編碼序列之區域。此與Krinner等人(Nucleic Acids Res., 42(6):3551-64 (2014))之教示相反，其提出轉錄起始位點下游之CpG域促進高水平之基因表現。

第二，經修改演算法排他性地應用某些密碼子，諸如用於白胺酸之CTG、用於纈胺酸之GTG及用於麩醯胺酸之CAG。然而，例如如Haas等人(Current Biology, 6(3):315-24 (1996))所提議，此違犯了平衡密碼子使用之原則。考慮到因經修改演算法過度使用較佳密碼子，在由應用於密碼子更改(例如CpG頻率及GC含量)之其他法則允許時重新引入替代性白胺酸密碼子。

第三，當符合某些準則(例如存在CG二核苷酸)時，經修改演算法代替密碼子對而不考慮其在自然界中如何保守。考慮對可能已因進化而保留之有益特性，在由應用於密碼子更改(例如CpG頻率及GC含量)之其他法則允許時，分析且調整由演算法代替之大部分保守密碼子對及大部分保守較佳密碼子對，例如如Tats等人(BMC Genomics 9:463(2008))中所描述。

第四，亦重新工程改造用於中間編碼序列之絲胺酸密碼子。具體而言，將AGC、TCC及TCT絲胺酸密碼子以更高頻率引入經修飾編碼序列中以更好地整體匹配以供人類密碼子使用(Haas等人，見上文)。

第五，篩選且自經修飾編碼序列移除TATA框、CCAAT框元件及內含子/外顯子拼接位點。當修飾編碼序列時，注意避免富AT或富GC伸長段之局部過表現。

最後，除在編碼序列內最佳化密碼子使用以外，當進一步優化中間編碼序列CS04a時考慮潛在AAV病毒粒子之結構要求。AAV載體(例如AAV病毒粒子之核酸部分)作為單股DNA分子封裝於其衣殼中(對於綜述，參見Daya及Berns, Clin. Microbiol Rev., 21(4):583-93 (2008))。因而載體之GC含量可能影響基因組之封裝且因此在產生期間影響載體產量。如許多演算法，本文使用之經修改演算法形成GC含量為至少60%的最佳化基因序列(參見Fath等人, PLoS One, 6(3):e17596 (2011) (勘誤於： PLoS One, (6)3 (2011)中)。然而，AAV8衣殼蛋白由具有約56%之更低GC含量之核苷酸序列編碼。因此，為更好地模擬天然AAV8衣殼蛋白編碼序列，將中間編碼序列CS04a之GC含量減少至56%。

圖2中所展示之所得CS04編碼序列之總GC含量為56%。該序列之CpG二核苷酸含量為適中的。然而，CpG二核苷酸主要在編碼序列之下游部分(例如編碼因子VIII輕鏈之部分)中。CS04序列與野生型因子VIII (Genbank寄存號M14113)中之對應編碼序列具有79.77%核苷酸序列一致性。

出於比較目的，製備若干其他密碼子最佳化ReFacto構築體。如Radcliff P.M.等人, Gene Therapy, 15:289-97 (2008)中所描述，將CS08 ReFacto構築體密碼子最佳化，出於所有目的該文獻之內容特此明確地以全文引用之方式併入本文中。CS10密碼子最佳化ReFacto構築體獲自Eurofins Genomics (德國，埃伯斯貝格(Ebersberg))。CS11密碼子最佳化ReFacto構築體獲自Integrated DNA Technologies公司(美國，珊瑚鎮(Coralville))。CH25密碼子最佳化ReFacto構築體獲自ThermoFischer Scientific之GeneArt服務(德國，雷根斯堡(Regensburg))。CS40 ReFacto構築體由野生型因子VIII編碼序列組成。ReFacto編碼序列中之每一者之間共有的序列一致性展示於下表2中。表 2 - 密碼子經更改的因子VIII構築體之一致性百分比矩陣。

各構築體之質體藉由將不同合成DNA片段選殖至相同載體主鏈質體(pCh-BB01)中來構築。由ThermoFischer Scientific (德國，雷根斯堡)進行具有側接AscI及NotI酶限制位點之Refacto型BDD-FVIII片段之DNA合成。載體主鏈含有兩個側接AAV2源性反向末端重複序列(ITR)，其涵蓋來源於肝臟特異性鼠類甲狀腺素運載蛋白基因之啟動子/強化子序列；用於插入相應Refacto型BDD-FVIII之AscI及NotI酶限制位點及合成polyA位點。接合所製備載體主鏈且經由AscI及NotI位點插入後，以毫克規模擴增所得質體。藉由直接定序(瑞士，巴爾加赫(Balgach)，Microsynth)驗證構築體之Refacto型BDD-FVIII序列。選殖產生命名為pCS40、pCS04、pCS08、pCS10、pCS11及pCh25之七種不同的質體構築體(圖14)。構築體具有相同載體主鏈且編碼相同B域刪除之FVIII蛋白(Refacto型BDD-FVIII)，但其FVIII編碼序列不同。

如Grieger JC等人(Virus Vectors Using Suspension HEK293 Cells and Continuous Harvest of Vector From the Culture Media for GMP FIX and FLT1 Clinical Vector, Mol Ther., 10月6日(2015) doi: 10.1038/mt.2015.187. [列印之前電子出版])中所描述，藉由三種質體轉染方法製備基於AAV8之載體，出於所有目的該文獻之內容特此明確地以全文引用之方式併入本文中。將HEK293懸浮液細胞用於使用對應FVIII載體質體、輔助質體pXX6-80(攜帶腺病毒輔助基因)及封裝質體pGSK2/8 (貢獻rep2及cap8基因)的質體轉染。為分離AAV8構築體，如Grieger等人(2015，見上文)中所描述，使用碘克沙醇梯度處理一公升培養物之細胞小球。程序產生稱為vCS04、vCS08、vCS10、vCS11及vCH25之載體製品。藉由qPCR使用靶向AAV2反向末端重複序列之通用qPCR程序定量載體(Aurnhammer, HUMAN GENE THERAPY METHODS: Part B 23:18-28 (2012))。攜帶AAV2反向末端重複序列之對照載體質體用於製備標準曲線。所得vCS04構築體在圖7A-7C中呈現為SEQ ID NO: 8。

藉由AAV瓊脂糖凝膠電泳分析載體基因組之完整性。如Fagone等人, Human Gene Therapy Methods 23:1-7 (2012)中所描述執行電泳。簡言之，在75℃下在0.5% SDS存在下培育AAV載體製品10分鐘且隨後將其冷卻至室溫。在1% 1xTAE瓊脂糖凝膠上每色帶負載大致1.5E10個載體基因組(vg)，且在7 V/cm凝膠長度下電泳60分鐘。隨後將凝膠在2x GelRed (Biotium目錄號41003)溶液中染色且藉由ChemiDocTMMP (Biorad)成像。藉由5kb範圍內之相異條帶所指示，圖15中所展示之結果證實vCS04及vCS40病毒載體具有相同大小之基因組(圖15，色帶2-4)。儘管載體大小為大致5.2 kb，但基因組為確認稍微過大基因組(相對於4.7 kb之AAV野生型基因組)之正確封裝的均勻條帶。所有其他vCS載體製品展示相同的基因組大小(資料未展示)。

為了確認衣殼蛋白之預期模式，用載體vCS04及vCS40執行SDS PAGE繼而銀染色(圖16)。如圖中所展示，下游純化程序產生呈現VP1、VP2及VP3之預期蛋白模式之高度純化物質(圖16，色帶2-4)。在所有其他病毒製品下看到相同模式(未展示)。根據標準程序進行AAV製品之SDS-PAGE程序。各色帶含有1E10個相應病毒構築體之vg，且在4-12% Bis-Tris (NuPAGE® Novex，Life Technologies)凝膠上按照製造商之說明分離。用SilverQuestTM套組(Novex，Life Technologies)根據製造商之說明執行銀染色。

出人意料地，相較於vCS40野生型編碼構築體及其他密碼子最佳化構築體，藉由AAV病毒產生中之更高產量量測，AAV載體vCS04具有更高病毒粒子封裝。如表 3 中所展示，vCS04載體實質上比vCS40複製地更好，在AAV效價方面提供5-7倍之產量增加。表 3- 如自細胞小球純化，用AAV載體構築體vCS04及vCS40獲得之產量/公升細胞培養物。

實施例 2- 密碼子經更改的因子 VIII 變異體表現序列之活體內表現

為測試密碼子經更改的因子VIII變異體序列之生物效能，向缺乏因子VIII之小鼠投予實施例1中所描述之ReFacto型FVIII構築體。簡言之，在C57BL/6 FVIII基因敲除(ko)小鼠(每組6-8隻動物)中藉由尾部靜脈注射4E12個載體基因組(vg)/公斤小鼠體重來執行分析。注射後14天藉由眶後穿刺抽出血液，且使用標準程序製備並冷凍血漿。選擇第14天時之表現水平，因為此時抑制性抗體之影響最小，其在稍後時間在此小鼠模型之一些動物中可見。如製造商(奧地利，維也納，Technoclone)所建議，使用僅執行微小修改之Technochrome FVIII分析來測定小鼠血漿中之FVIII活性。為了分析，將血漿樣品適當稀釋且與含有凝血酶、活化因子IX (FIXa)、磷脂、因子X及鈣之分析試劑混合。藉由凝血酶活化FVIII後，形成具有FIXa、磷脂及鈣之複合物。此複合物將FX活化成活化FX (FXa)，其轉而自發色受質裂解對硝基苯胺(pNA)。在405 nm下量測pNA形成之動力學。速率與樣品中之FVIII濃度成正比。自參考曲線讀取FVIII濃度且結果以IU FVIII/毫升形式提供。

呈現於下表 4 中之結果證實相較於野生型BDD-因子VIII構築體(CS40)，使用商業演算法設計之密碼子經更改序列(CS10、CS11及CH25)僅使BDD-因子VIII適度增加(3-4倍)。相似地，如Radcliffe等人中所描述製備之密碼子經更改BDD-因子VIII構築體(CS08)僅使BDD-FVIII表現增加3-4倍。此結果與Radcliff等人中所報告之結果一致。出人意料地，在活體內生物效能分析中CS04構築體提供高得多的BDD-FVIII表現(例如增加74倍)。表 4- 藉由不同AAV載體構築體誘導之FVIII基因敲除小鼠之血漿中的FVIII表現。

實施例 3- 小鼠中人類 FVIII 基因療法載體之非臨床功效及毒理學評估

A型血友病為由缺少因子VIII (FVIII)或缺陷性因子VIII (FVIII)所引起之遺傳性出血病症且其用血漿源性或重組因子濃縮物治療。此等濃縮物需要定期輸注以維持適當FVIII水平來控制及預防出血現象。鑒於蛋白代替療法之難題，基因療法可提供用於患A型血友病之患者的替代性治療方法。藉由將功能性F8基因複本引入目標肝細胞中以誘導內源性FVIII表現，可不再需要頻繁輸注凝血因子。

基於腺相關病毒(AAV)之基因療法可能在患A型血友病之患者中提供臨床益處。設計含有CS04因子VIII密碼子最佳化構築體之基於重組(r)AAV8的基因療法載體以在肝臟特異性甲狀腺素運載蛋白啟動子之控制下遞送人類密碼子最佳化B域刪除之FVIII (BDDFVIII)轉基因。此構築體用於檢驗F8基因敲除(ko)小鼠中FVIII活性之劑量-反應關係且用於評估單次靜脈內投予後之毒性。

簡言之為了測試治療之功效，向每組12個雄性FVIII基因敲除小鼠投予3.0×10¹¹ 、1.2×10¹² 或3.0×10¹² 個載體衣殼顆粒(cp)/kg或10 mL/kg緩衝液之單次靜脈內劑量。在8週內每隔一週採集眶後血液樣品且使用發色分析來分析該等血液樣品。獲自最終生命中血液取樣之血漿樣品亦用於FVIII結合及中和抗體之分析。在觀測週期結束時，使用尾尖出血分析評估止血控制。

在研究結束時，除結合及中和抗體測試為陽性的4隻動物(用3.0×10¹² 個cp/kg載體處理)之外所有樣品之抗BDD-FVIII結合抗體均為陰性。此等動物自FVIII活性水平之統計分析及尾尖出血中之失血量分析排除。投予1.2×10¹² 或3.0×10¹² 個cp/kg載體引起平均血漿FVIII活性之劑量依賴型增加，分別增加至在研究週期內所計算的0.6及1.9 IU/mL，但在用緩衝液或3.0×10¹¹ 個cp/kg載體處理之小鼠中FVIII活性低於定量之下限(LLOQ) (圖17)。

在第63天在尾尖出血分析中評估功效。以mg/g體重為單位之60分鐘內之失血量呈現於圖18中。用緩衝液或3.0×10¹¹ 個cp/kg基因療法載體處理之動物展示相似失血量(分別為6.1 mg/g及7.5 mg/g)，與不存在可偵測FVIII活性一致。更高劑量之基因療法載體以劑量依賴型方式顯著減少失血量(1.2×10¹² ：0.6 mg/g，3.0×10¹² ：0.4 mg/g；瓊克希爾-特普斯特拉(Jonckheere-Terpstra)測試：1-邊P值＜0.001)。

為了測試構築體之毒理學，向雄性C57BL/6J小鼠(n=20/組)靜脈內注射1×10¹³ 、3×10¹³ 或5×10¹³ 個cp/kg載體之單次劑量或調配物緩衝液(表 5 )。基於臨床體徵、體重、食物攝取、眼科學以及臨床及解剖病理學評估毒性。對5隻來自各群組之動物執行完整屍體剖檢，且記錄肉眼可見結果、器官重量及顯微檢驗結果。自另外5隻來自各群組的動物收集組織用於藉由定量聚合酶鏈反應評估生物分佈。在給藥之前及屍體解剖時收集血液。分析FVIII活性、BDD-FVIII抗原、結合抗BDD-FVIII抗體、中和抗BDD-FVIII抗體及結合抗AAV8抗體。表 5- 毒性研究之設計。

發現以至多5×10¹³ 個cp/kg單次靜脈內推注投予基因療法載體具有良好耐受性。在研究期間未發生死亡且無臨床體徵或給藥後觀測結果視為與投予載體相關。未觀測到陰性眼科結果。未觀測到對體重或食物攝取之影響。未觀測到臨床化學、血液學或尿分析參數之改變。且無毒理學相關肉眼可見或顯微結果與投予基因療法載體相關。

FVIII活性及BDD-FVIII抗原評估有廣泛變異傾向，最可能由於生成人類BDD-FVIII之中和抗體。然而，在第3天以及第3週及第18週所有載體組中之單獨動物均具有高於一般基線水平的活性(資料未展示)。在所採集的組織樣品中，載體DNA主要在肝臟中偵測到。肝臟及其他組織之生物分佈為劑量相關，且一般在最早時間點最高並隨時間推移而降低。腦部及睪丸中載體DNA之存在度隨時間推移顯著降低，且在第18週在許多動物中低於分析之LLOQ (圖19)。

綜合而言，結果展示當以劑量≥1.2×10¹² 個cp/kg向FVIII基因敲除小鼠投予時密碼子最佳化BDD-FVII基因療法為有效的。無觀測到之不良影響水平視為5.0×10¹³ 個cp/kg，毒性研究中所測試之最高劑量。

在一些具體實例中，向小鼠投予之劑量可根據「成年健康志願者之治療劑初始臨床試驗中的最大安全起始劑量之行業估算指南(Guidance for Industry - Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)」，美國衛生和公共服務部(U.S. Department of Health and Human Services)，食品與藥物管理局(Food and Drug Administration)，藥物評估及研究中心(Center for Drug Evaluation and Research，CDER)，2005年7月，藥理學及毒理學(Pharmacology and Toxicology)中所提供之引導轉化成人類劑量，出於所有目的其內容以全文引用之方式併入本文中。

應理解，本文中所述之實施例及具體實例僅出於說明性目的，且根據其之各種修飾或變化將由熟習此項技術者建議且包括在本申請案之精神及範圍內及所附申請專利範圍之範疇內。出於所有目的，本文所引用之所有公開案、專利及專利申請案均以全文引用之方式併入本文中。

無

圖1展示野生型及ReFacto型人類因子VIII蛋白構築體之示意性說明。

圖2A及2B展示根據一些具體實例之編碼因子VIII變異體之CS04密碼子經更改的核苷酸序列(SEQ ID NO: 1) (對於全長編碼序列，「CS04-FL-NA」)。

圖3展示根據一些具體實例之由CS04密碼子經更改的核苷酸序列編碼之因子VIII變異體胺基酸序列(SEQ ID NO: 2) (對於全長胺基酸序列，「CS04-FL-AA」)。

圖4展示根據一些具體實例之編碼因子VIII變異體之重鏈的CS04密碼子經更改的核苷酸序列(SEQ ID NO: 3) (「CS04-HC-NA」)之部分。

圖5展示根據一些具體實例之編碼因子VIII變異體之輕鏈的CS04密碼子經更改的核苷酸序列(SEQ ID NO: 4) (「CS04-LC-NA」)之部分。

圖6展示根據一些具體實例之B域經取代連接子之例示性編碼序列(SEQ ID NO: 5)。BDLO04 (SEQ ID NO: 5)為編碼B域經取代連接子之CS04密碼子經更改的核苷酸序列之對應部分。

圖7A、7B及7C展示根據一些具體實例之含有CS04密碼子經更改的核苷酸序列之AAV載體序列(SEQ ID NO: 8) (「CS04-AV-NA」)。

圖8A及8B展示根據一些具體實例之編碼因子VIII變異體之CS08密碼子經更改的核苷酸序列(SEQ ID NO: 7) (「CS08-FL-NA」)。

圖9A及9B展示根據一些具體實例之編碼因子VIII變異體之CS10密碼子經更改的核苷酸序列(SEQ ID NO: 8) (「CS10-FL-NA」)。

圖10A及10B展示根據一些具體實例之編碼因子VIII變異體之CS11密碼子經更改的核苷酸序列(SEQ ID NO: 9) (「CS11-FL-NA」)。

圖11A及11B展示根據一些具體實例之CS40野生型ReFacto編碼序列(SEQ ID NO: 10) (「CS40-FL-NA」)。

圖12A及12B展示根據一些具體實例之編碼因子VIII變異體之CH25密碼子經更改的核苷酸序列(SEQ ID NO: 11) (「CH25-FL-NA」)。

圖13展示根據一些具體實例之野生型人類因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO: 12) (「FVIII-FL-AA」)。

圖14說明藉由將合成Refacto型BDD-FVIII DNA序列經由AscI及NotI限制位點插入載體主鏈pCh-BB01中選殖pCS40、pCS04、pCS08、pCS10、pCS11及pCh25構築體之流程。

圖15展示如藉由瓊脂糖凝膠電泳所分析AAV載體基因組製品之完整性。色帶1，DNA標記；色帶2，vCS40；色帶4，vCS04。AAV載體均具有相同大小之基因組，遷移於大約5 kb處(右側箭頭)。左側上之刻度指示以千鹼基(kb)為單位之DNA片段之大小。

圖16展示藉由PAGE及銀染色之AAV載體製品之蛋白分析。色帶1，蛋白標記(M)；色帶2，vCS40；及色帶4，vCS04。構築體均具有相同之由VP1、VP2及VP3(右側箭頭)組成之AAV8衣殼。左側上之刻度指示以千道爾頓(kDa)為單位之蛋白標記之大小。

圖17展示全身性投予如實施例3中所描述之基於(r)AAV8之基因療法載體後之FVIII活性，該基因療法載體含有CS04因子VIII密碼子最佳化構築體。cp，載體衣殼顆粒；FVIII，因子VIII；LLOQ，定量之下限。14、28、42及56天時間點展示於圖示中之左側至右側。

圖18展示在尾尖出血分析中，在全身性投予如實施例3中所描述之基於(r)AAV8之基因療法載體之後失血量減少，該基因療法載體含有CS04因子VIII密碼子最佳化構築體。cP，載體衣殼顆粒。

圖19A、19B及19C展示在全身性投予之後含有CS04因子VIII密碼子最佳化構築體DNA的基於(r)AAV8之基因療法載體之生物分佈。1902 =肝臟；1904 =淋巴結；1906 =骨胳肌肉；1908 =心臟；1910 =腎臟；1912 =脾臟；1914 =肺；1916 =睪丸；1918 =腦部。

Claims

一種用於治療A型血友病之方法，該方法包含向經診斷患有A型血友病的人類個體靜脈內輸注2×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤該人類個體體重之劑量，其中該等AAV顆粒包含多核苷酸，該多核苷酸包含SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列。
一種用於治療A型血友病之方法，該方法包含向經診斷患有A型血友病的人類個體靜脈內輸注6×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤該人類個體體重之劑量，其中該等AAV顆粒包含多核苷酸，該多核苷酸包含SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列。
如請求項1或2所述之方法，其進一步包含向該經診斷患有A型血友病的人類個體給予潑尼松龍(prednisolone)或潑尼松(prednisone)之療程。
如請求項3所述之方法，其中潑尼松龍或潑尼松之療程係在輸注該等AAV顆粒之後給予。
如請求項3或4所述之方法，其中給予潑尼松龍或潑尼松之療程包含：在輸注該等AAV顆粒後，緊接著第一週的期間向該人類個體投予60 mg潑尼松龍或潑尼松/天；在輸注該等AAV顆粒後，緊接著第二週的期間向該人類個體投予40 mg潑尼松龍或潑尼松/天；及在輸注該等AAV顆粒後，緊接著第三週的期間向該人類個體投予30 mg潑尼松龍或潑尼松/天。
如請求項5所述之方法，其進一步包含在輸注該等AAV顆粒後，緊接著第三週之後投予逐漸減少劑量之潑尼松龍或潑尼松。
如請求項6所述之方法，其中投予該逐漸減少劑量之潑尼松龍或潑尼松包含：在完成潑尼松龍或潑尼松之初始療程後，緊接著連續5天向該人類個體投予20 mg潑尼松龍或潑尼松/天；向該人類個體投予20 mg潑尼松龍或潑尼松5天後，緊接著連續3天向該人類個體投予15 mg潑尼松龍或潑尼松/天；向該人類個體投予15 mg潑尼松龍或潑尼松3天後，緊接著連續3天向該人類個體投予10 mg潑尼松龍或潑尼松/天；及向該人類個體投予10 mg潑尼松龍或潑尼松3天後，緊接著連續3天向該人類個體投予5 mg潑尼松龍或潑尼松/天。
如請求項6所述之方法，其中投予該逐漸減少劑量之潑尼松龍或潑尼松包含：在完成潑尼松龍或潑尼松之初始療程後，緊接著連續7天向該人類個體投予30 mg潑尼松龍或潑尼松/天；向該人類個體投予30 mg潑尼松龍或潑尼松7天後，緊接著連續7天向該人類個體投予20 mg潑尼松龍或潑尼松/天；向該人類個體投予20 mg潑尼松龍或潑尼松7天後，緊接著連續5天向該人類個體投予15 mg潑尼松龍或潑尼松/天；向該人類個體投予15 mg潑尼松龍或潑尼松5天後，緊接著連續5天向該人類個體投予10 mg潑尼松龍或潑尼松/天；及向該人類個體投予10 mg潑尼松龍或潑尼松5天後，緊接著連續5天向該人類個體投予5 mg潑尼松龍或潑尼松/天。
一種方法，其包含：在向人類個體投予包含編碼因子VIII蛋白之多核苷酸的腺相關病毒(AAV)顆粒後，測定自經診斷患有A型血友病的人類個體收集之血液樣品中之因子VIII活性的第一水平，且同時該人類個體接受糖皮質激素類固醇治療之初始療程；在完成糖皮質激素類固醇治療之該初始療程之後，測定自該人類個體收集之血液樣品中之因子VIII活性的第二水平；比較該因子VIII活性的第二水平與該因子VIII活性的第一水平；及投予逐漸減少劑量之該糖皮質激素類固醇，其中：當該因子VIII活性的第二水平不低於該因子VIII活性的第一水平時，投予第一逐漸減少劑量之該糖皮質激素類固醇不超過三週之時間週期；及當該因子VIII活性的第二水平低於該因子VIII活性的第一水平時，投予第二逐漸減少劑量之該糖皮質激素類固醇超過三週之時間週期。
一種方法，其包含：在向人類個體投予包含編碼因子VIII蛋白之多核苷酸的腺相關病毒(AAV)顆粒之前測定自經診斷患有A型血友病的人類個體收集之血液樣品中之肝酵素活性的第一水平；在向該人類投予包含編碼因子VIII蛋白之多核苷酸的AAV顆粒之後且在完成糖皮質激素類固醇治療之初始療程之後，測定自該人類個體收集之血液樣品中之肝酵素活性的第二水平；比較該肝酵素活性的第二水平與該肝酵素活性的第一水平；及投予逐漸減少劑量之該糖皮質激素類固醇，其中：當該肝酵素活性的第二水平不超過該肝酵素活性的第一水平時，投予第一逐漸減少劑量之該糖皮質激素類固醇不超過三週之時間週期；及當該肝酵素活性的第二水平超過該因子VIII活性的第一水平時，投予第二逐漸減少劑量之該糖皮質激素類固醇超過三週之時間週期。
如請求項9或10所述之方法，其中投予該第一逐漸減少劑量之該糖皮質激素類固醇包含：在完成糖皮質激素類固醇治療之該初始療程後，緊接著連續5天向該人類個體投予20 mg潑尼松龍或潑尼松/天；向該人類個體投予20 mg潑尼松龍或潑尼松5天後，緊接著連續3天向該人類個體投予15 mg潑尼松龍或潑尼松/天；向該人類個體投予15 mg潑尼松龍或潑尼松3天後，緊接著連續3天向該人類個體投予10 mg潑尼松龍或潑尼松/天；及向該人類個體投予10 mg潑尼松龍或潑尼松3天後，緊接著連續3天向該人類個體投予5 mg潑尼松龍或潑尼松/天。
如請求項9至11中任一項所述之方法，其中投予該第二逐漸減少劑量之該糖皮質激素類固醇包含：在完成糖皮質激素類固醇治療之該初始療程後，緊接著連續7天向該人類個體投予30 mg潑尼松龍或潑尼松/天；向該人類個體投予30 mg潑尼松龍或潑尼松7天後，緊接著連續7天向該人類個體投予20 mg潑尼松龍或潑尼松/天；向該人類個體投予20 mg潑尼松龍或潑尼松7天後，緊接著連續5天向該人類個體投予15 mg潑尼松龍或潑尼松/天；向該人類個體投予15 mg潑尼松龍或潑尼松5天後，緊接著連續5天向該人類個體投予10 mg潑尼松龍或潑尼松/天；及向該人類個體投予10 mg潑尼松龍或潑尼松5天後，緊接著連續5天向該人類個體投予5 mg潑尼松龍或潑尼松/天。
一種用於監測A型血友病之因子VIII基因療法功效的方法，該因子VIII基因療法使用包含編碼因子VIII多肽之多核苷酸的腺相關病毒(AAV)顆粒，該方法包含：在向人類個體投予該等AAV顆粒之後，確定在自該人類個體收集之血液樣品中是否存在因子VIII抑制子抗體；及在偵測到該人類個體之血液中存在因子VIII抑制子時，向該人類個體投予用於治療A型血友病的替代性藥劑。
如請求項13所述之方法，其中該替代性藥劑包含經化學修飾之人類因子VIII蛋白。
如請求項13所述之方法，其中該替代性藥劑包含豬科因子VIII蛋白。
如請求項13所述之方法，其中該替代性藥劑為包含因子II、因子IX及因子X之因子VIII旁路治療劑。
一種方法，其包含： a) 在第一時間點向A型血友病患者投予2×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤該患者體重之劑量，其中該等AAV顆粒包含多核苷酸，該多核苷酸包含SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列；及 b) 在稍後時間點量測該患者之血流中SEQ ID NO: 1或其片段之水平，其中該稍後時間點為7天或更長。
一種方法，其包含： a) 在第一時間點向A型血友病患者投予6×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤該患者體重之劑量，其中該等AAV顆粒包含多核苷酸，該多核苷酸包含SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列；及 b) 在稍後時間點量測該患者之血流中SEQ ID NO: 1或其片段之水平，其中該稍後時間點為7天或更長。
一種方法，其包含： a) 在第一時間點向A型血友病患者投予腺相關病毒(AAV)顆粒之劑量，其中該等AAV顆粒包含編碼因子VIII蛋白之多核苷酸；及 b) 在稍後時間點量測該患者之血流中編碼該因子VIII蛋白的多核苷酸或其片段之水平，其中該稍後時間點為7天或更長。
如請求項17至19中任一項所述之方法，其中該稍後時間點為7天時。
如請求項17至19中任一項所述之方法，其中該稍後時間點為14天時。
如請求項17至19中任一項所述之方法，其中該稍後時間點為21天時。
一種方法，其包含： a) 在第一時間點向A型血友病患者投予2×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤該患者體重之劑量，其中該等AAV顆粒包含衣殼蛋白及多核苷酸，該多核苷酸包含SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列；及 b) 在稍後時間點量測該患者之血流中該衣殼蛋白之水平，其中該稍後時間點為7天或更長。
一種方法，其包含： a) 在第一時間點向A型血友病患者投予6×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤該患者體重之劑量，其中該等AAV顆粒包含衣殼蛋白及多核苷酸，該多核苷酸包含SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列；及 b) 在稍後時間點量測該患者之血流中該衣殼蛋白之水平，其中該稍後時間點為7天或更長。
一種方法，其包含： a) 在第一時間點向A型血友病患者投予腺相關病毒(AAV)顆粒之劑量，其中該等AAV顆粒包含衣殼蛋白及編碼因子VIII蛋白之多核苷酸；及 b) 在稍後時間點量測該患者之血流中該衣殼蛋白之水平，其中該稍後時間點為7天或更長。
如請求項23至25中任一項所述之方法，其中該稍後時間點為7天時。
如請求項23至25中任一項所述之方法，其中該稍後時間點為14天時。
如請求項23至25中任一項所述之方法，其中該稍後時間點為21天時。
一種方法，其包含： a) 在第一時間點向A型血友病患者投予2×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤該患者體重之劑量，其中該等AAV顆粒包含多核苷酸，該多核苷酸包含SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列；及 b) 在稍後時間點量測該患者之血流中抗因子VIII抗體之水平，其中該稍後時間點為7天或更長。
一種方法，其包含： a) 在第一時間點向A型血友病患者投予6×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤該患者體重之劑量，其中該等AAV顆粒包含多核苷酸，該多核苷酸包含SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列；及 b) 在稍後時間點量測該患者之血流中抗因子VIII抗體之水平，其中該稍後時間點為7天或更長。
一種方法，其包含： a) 在第一時間點向A型血友病患者投予腺相關病毒(AAV)顆粒之劑量，其中該等AAV顆粒包含編碼因子VIII蛋白之多核苷酸；及 b) 在稍後時間點量測該患者之血流中抗因子VIII抗體之水平，其中該稍後時間點為7天或更長。
如請求項29至31中任一項所述之方法，其中該稍後時間點為7天時。
如請求項29至31中任一項所述之方法，其中該稍後時間點為14天時。
如請求項29至31中任一項所述之方法，其中該稍後時間點為21天時。
一種方法，其包含： a) 在第一時間點向A型血友病患者投予2×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤該患者體重之劑量，其中該等AAV顆粒包含衣殼蛋白及多核苷酸，該多核苷酸包含SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列；及 b) 在稍後時間點量測該患者之血流中抗衣殼蛋白抗體之水平，其中該稍後時間點為7天或更長。
一種方法，其包含： a) 在第一時間點向A型血友病患者投予6×10¹² 個腺相關病毒(AAV)顆粒/公斤該患者體重之劑量，其中該等AAV顆粒包含衣殼蛋白及多核苷酸，該多核苷酸包含SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA)之核酸序列；及 b) 在稍後時間點量測該患者之血流中抗衣殼蛋白抗體之水平，其中該稍後時間點為7天或更長。
一種方法，其包含： a) 在第一時間點向A型血友病患者投予腺相關病毒(AAV)顆粒之劑量，其中該等AAV顆粒包含衣殼蛋白及編碼因子VIII蛋白之多核苷酸；及 b) 在稍後時間點量測該患者之血流中抗衣殼蛋白抗體之水平，其中該稍後時間點為7天或更長。
如請求項35至37中任一項所述之方法，其進一步包含： c) 在向該患者投予該等腺相關病毒(AAV)顆粒之該劑量之前，量測該患者之血流中抗衣殼蛋白抗體的基線水平；及 d) 視需要，比較在稍後時間點該患者之血流中抗衣殼蛋白抗體之量測水平與該患者之血流中抗衣殼蛋白抗體之該基線水平。
如請求項35至38中任一項所述之方法，其中該稍後時間點為7天時。
如請求項35至38中任一項所述之方法，其中該稍後時間點為14天時。
如請求項35至38中任一項所述之方法，其中該稍後時間點為21天時。