TW202140791A

TW202140791A - 治療苯酮尿症之方法

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Publication number: TW202140791A
Application number: TW110101092A
Authority: TW
Inventors: 歐瑪弗蘭肯; 德博拉金契; 戴安娜蘭普; 阿爾伯特西摩爾; 特瑞莎賴特
Original assignee: 美商霍蒙拉奇醫藥公司
Priority date: 2020-01-13
Filing date: 2021-01-12
Publication date: 2021-11-01
Also published as: WO2021146260A1; AU2021207468A1; US20210261983A1; CA3164341A1; EP4090749A4; EP4090749A1; US11952585B2

Abstract

本文提供了治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法。該等方法通常包括向該個體施用治療有效劑量之重組腺相關病毒（rAAV），該rAAV可在細胞中表現苯丙胺酸羥化酶（PAH）多肽，從而恢復該個體之PAH基因功能。

Description

治療苯酮尿症之方法

以電子方式提交之序列表之引用

ASCII文字檔案（名稱：「713280_HMW-039PC_SL.txt」；大小：39,896位元組；及創建日期：2020年12月29日）中以電子方式提交之序列表之內容以全文引用之方式併入本文中。

苯酮尿症（PKU）為體染色體隱性遺傳病症，其中大部分病例係由苯丙胺酸羥化酶（PAH）基因之突變引起。PAH基因之突變導致PAH活性之降低或喪失，PAH活性為表現於肝細胞中之一種酶，其在多聚化時催化L-苯丙胺酸（Phe）向L-酪胺酸（Tyr）的羥基化。PAH活性之降低或喪失會導致苯丙胺酸積聚且將其轉化為苯丙酮酸鹽（亦稱為苯酮）。若不加以治療，則PAH缺乏會在嬰兒期及幼兒期導致進展性的不可逆神經功能障礙。無法達到正常濃度之Phe會導致神經學問題及代謝問題。

目前，PKU尚無法治癒。標準照護為藉由將含有大量苯丙胺酸之食物減至最少來進行膳食管理。利用低苯丙胺酸配方自出生起進行之膳食管理在很大程度上預防該病症之智力殘疾的發展。然而，即使是低苯丙胺酸膳食，兒童仍會遭受生長遲滯的困擾，而成年人通常會患有骨質疏鬆症和維生素缺乏症。此外，堅持終生膳食治療是困難的，尤其在兒童達到學齡後。

最近出現了新的治療策略，包含大型中性胺基酸（large neutral amino acid，LNAA）補充、輔因子四氫生物蝶呤療法、酶替代療法及經基因修飾益生菌療法。然而，此等策略存在缺點。LNAA補充僅適合於不堅持低Phe膳食之成年人。輔因子四氫生物喋呤僅能以一些溫和的PKU形式使用。通過施用PAH之替代物（例如苯丙胺酸氨解酶（PAL））進行酶替代會引起免疫反應，從而降低功效及/或引起副作用。對於經基因修飾益生菌療法，表現PAL之大腸桿菌的病原性一直是人們關注的問題。

基因療法提供治癒PKU之獨特機會。反轉錄病毒載體（包含慢病毒載體）能夠將核酸整合至宿主細胞基因體中，從而由於其對基因體之非靶向插入而產生安全性問題。舉例而言，存在載體破壞腫瘤抑制基因或活化致癌基因，從而引起惡性病之風險。實情為，在藉由用γ反轉錄病毒載體轉導CD34⁺ 骨髓前驅體來進行之用於治療X性聯嚴重複合免疫缺乏症（SCID）之臨床試驗中，十名患者中之四名罹患白血病（Hacein-Bey-Abina等人, 《臨床研究雜誌（J Clin Invest.）》 (2008) 118(9):3132-42）。另一方面，非整合載體通常在活體內經歷表現量不足或表現持續時間不足。

因此，本領域中需要經改良之基因療法組成物及方法，其可有效及安全地恢復PKU患者之PAH基因功能。

本文提供了治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法。該方法通常包括向該個體施用治療有效劑量之重組腺相關病毒（rAAV），該rAAV可在細胞中表現PAH多肽，從而恢復該個體之PAH基因功能。

因此，在一個態樣中，本文提供了一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以如下劑量向該個體施用rAAV：約2e13 vg/kg、3e13 vg/kg、4e13 vg/kg、5e13 vg/kg、6e13 vg/kg、7e13 vg/kg、8e13 vg/kg、9e13 vg/kg、1e14 vg/kg、1.1e14 vg/kg、1.2e14 vg/kg、1.3e14 vg/kg、1.4e14 vg/kg、1.5e14 vg/kg、1.6e14 vg/kg、1.7e14 vg/kg、1.8e14 vg/kg、1.9e14 vg/kg或2e14 vg/kg（例如劑量為2e13 vg/kg、3e13 vg/kg、4e13 vg/kg、5e13 vg/kg、6e13 vg/kg、7e13 vg/kg、8e13 vg/kg、9e13 vg/kg、1e14 vg/kg、1.1e14 vg/kg、1.2e14 vg/kg、1.3e14 vg/kg、1.4e14 vg/kg、1.5e14 vg/kg、1.6e14 vg/kg、1.7e14 vg/kg、1.8e14 vg/kg、1.9e14 vg/kg或2e14 vg/kg），其中該rAAV包括：(a) AAV衣殼，其包括衣殼蛋白；(b)轉移基因體，其包括以緘默方式改變之PAH編碼序列，其中該以緘默方式改變之PAH編碼序列包括SEQ ID NO: 1之核苷酸序列。

在某些實施例中，該轉移基因體進一步包括與該以緘默方式改變之PAH編碼序列可操作地連接的轉錄調節元件。

在某些實施例中，該轉錄調節元件能夠介導肝細胞、腎細胞或腦、腦下垂體、腎上腺、胰腺、膀胱、膽囊、結腸、小腸或乳房中之細胞中的轉錄。

在某些實施例中，該轉錄調節元件包括人類肝控制區1（HCR1），其包括SEQ ID NO: 2之核苷酸序列。在某些實施例中，該轉錄調節元件包括人類α1-抗胰蛋白酶（hAAT）啟動子，其包括SEQ ID NO: 3之核苷酸序列。在某些實施例中，該轉錄調節元件包括SV40內含子，其包括SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。在某些實施例中，該轉錄調節元件包括SEQ ID NO: 5之核苷酸序列。

在某些實施例中，該轉移基因體進一步包括在該PAH編碼序列之3'端的SV40聚腺苷酸化序列，其中該SV40聚腺苷酸化序列包括SEQ ID NO: 6之核苷酸序列。

在某些實施例中，該轉移基因體包括SEQ ID NO: 7之核苷酸序列。

在某些實施例中，該轉移基因體進一步包括該於基因體5’之5’反向末端重複（5’ ITR）核苷酸序列，及於該基因體3’之3’反向末端重複（3’ ITR）核苷酸序列。在某些實施例中，該5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 8具有至少95%序列一致性，且該3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 9具有至少95%序列一致性。

在某些實施例中，該轉移基因體包括SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。

在某些實施例中，該AAV衣殼包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R。

在某些實施例中，該AAV衣殼包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R。

在某些實施例中，該AAV衣殼包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括SEQ ID NO:11之胺基酸203至736的胺基酸序列；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括SEQ ID NO:11之胺基酸138至736的胺基酸序列；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括SEQ ID NO:11之胺基酸1至736的胺基酸序列。

在某些實施例中，該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列組成，該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列組成，及/或該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列組成。

在另一態樣中，本文提供一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括向該個體施用如下劑量之rAAV：約2e13 vg/kg、3e13 vg/kg、4e13 vg/kg、5e13 vg/kg、6e13 vg/kg、7e13 vg/kg、8e13 vg/kg、9e13 vg/kg、1e14 vg/kg、1.1e14 vg/kg、1.2e14 vg/kg、1.3e14 vg/kg、1.4e14 vg/kg、1.5e14 vg/kg、1.6e14 vg/kg、1.7e14 vg/kg、1.8e14 vg/kg、1.9e14 vg/kg或2e14 vg/kg（例如劑量為2e13 vg/kg、3e13 vg/kg、4e13 vg/kg、5e13 vg/kg、6e13 vg/kg、7e13 vg/kg、8e13 vg/kg、9e13 vg/kg、1e14 vg/kg、1.1e14 vg/kg、1.2e14 vg/kg、1.3e14 vg/kg、1.4e14 vg/kg、1.5e14 vg/kg、1.6e14 vg/kg、1.7e14 vg/kg、1.8e14 vg/kg、1.9e14 vg/kg或2e14 vg/kg），其中該rAAV包括：(a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及(b)轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。

在某些實施例中，該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列組成；該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列組成；及/或該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列組成。

以下實施例適用於每一前述態樣。

在某些實施例中，該劑量為約2e13 vg/kg。在某些實施例中，該劑量為約6e13 vg/kg。在某些實施例中，該劑量為約8e13 vg/kg。在某些實施例中，該劑量為約1e14 vg/kg。在某些實施例中，該劑量為約2e14 vg/kg。

在某些實施例中，rAAV係以單次劑量施用。在某些實施例中，該rAAV係以多次劑量施用。在某些實施例中，該rAAV係靜脈內施用。

在某些實施例中，該個體為小兒個體。在某些實施例中，該個體為成人個體。

在某些實施例中，該與PAH基因突變相關之疾病或病症為苯酮尿症（PKU）。

在另一態樣中，本揭露提供一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約2e13 vg/kg之劑量向該個體施用rAAV，其中該rAAV包括：(a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及(b)轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。

在另一態樣中，本揭露提供一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約6e13 vg/kg之劑量向該個體施用rAAV，其中該rAAV包括：(a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及(b)轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。

在另一態樣中，本揭露提供一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約8e13 vg/kg之劑量向該個體施用rAAV，其中該rAAV包括：(a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及(b)轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。

在另一態樣中，本揭露提供一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約1e14 vg/kg之劑量向該個體施用rAAV，其中該rAAV包括：(a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及(b)轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。

在另一態樣中，本揭露提供一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約2e14 vg/kg之劑量向該個體施用rAAV，其中該rAAV包括：(a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及(b)轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。

以下實施例適用於每一前述態樣。

在某些實施例中，在施用該rAAV之前向該個體施用第一免疫抑制劑。在某些實施例中，在施用該rAAV之前一天施用該第一免疫抑制劑。在某些實施例中，該第一免疫抑制劑係向該個體持續施用約20或約21週。

在某些實施例中，該第一免疫抑制劑係根據以下依序給藥方案施用：(1) 60毫克/天之潑尼松龍（prednisolone）當量，持續兩週；(2) 40毫克/天之潑尼松龍當量，持續六週；(3) 30毫克/天之潑尼松龍當量，持續三週；(4) 20毫克/天之潑尼松龍當量，持續三週；(5) 10毫克/天之潑尼松龍當量，持續五週；以及(6) 5毫克/天之潑尼松龍當量，持續一週或兩週。

在某些實施例中，若該個體在該依序給藥方案期間之任何時候展現的肝轉胺酶水準為ULN之至少約2倍，則將自步驟(1)重新開始該依序給藥方案。

在某些實施例中，若該個體在完成步驟(6)之後展現的肝轉胺酶水準為ULN之至少約2倍，則根據以下依序給藥方案進一步向該個體施用該第一免疫抑制劑：(7) 60毫克/天之潑尼松龍當量，持續兩週至四週；(8) 40毫克/天之潑尼松龍當量，持續兩週；(9) 30毫克/天之潑尼松龍當量，持續兩週；(10) 20毫克/天之潑尼松龍當量，持續兩週；(11) 10毫克/天之潑尼松龍當量，持續兩週；以及(12) 5毫克/天之潑尼松龍當量，持續兩週。在某些實施例中，執行步驟(7)，直至該肝轉胺酶水準下降至該個體之肝轉胺酶基線位準左右或低於該基線位準為止。

在某些實施例中，該個體之肝轉胺酶基線位準為在接受該rAAV之前，該個體中之肝轉胺酶水準。在某些實施例中，該個體之肝轉胺酶基線位準在正常範圍內。在某些實施例中，該個體之肝轉胺酶基線位準處於肝轉胺酶之正常上限（ULN）左右。在某些實施例中，該肝轉胺酶為丙胺酸胺基轉移酶（ALT）或天冬胺酸胺基轉移酶（AST）。

在某些實施例中，ALT之正常範圍為0至約63 U/L。在某些實施例中，AST之正常範圍為0至約57 U/L。在某些實施例中，ALT之ULN為約30至約63 U/L。在某些實施例中，AST之ULN為約34至約57 U/L。

在某些實施例中，該第一免疫抑制劑為糖皮質類固醇。在某些實施例中，該第一免疫抑制劑為潑尼松龍。

本文提供了治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法。該等方法通常包括向個體施用治療有效劑量之重組腺相關病毒（rAAV），該rAAV可在細胞中表現苯丙胺酸羥化酶（PAH）多肽，從而恢復個體之PAH基因功能。I. 定義

如本文所用，術語「AAV」為腺相關病毒之標準縮寫。

如本文所用，術語「重組腺相關病毒」或「rAAV」係指包括缺乏功能rep及cap基因之基因體的AAV。

如本文所用，術語「cap基因」係指編碼衣殼蛋白之核酸序列。

如本文所用，術語「rep基因」係指編碼複製及產生AAV所需之非結構蛋白（例如rep78、rep68、rep52及rep40)的核酸序列。

如本文所用，術語「PAH基因」係指苯丙胺酸羥化酶基因。人類PAH基因係由Entrez Gene ID 5053鑑別。PAH mRNA之例示性核苷酸序列提供為SEQ ID NO: 12。PAH多肽之例示性胺基酸序列提供為SEQ ID NO: 13。

如本文所用，術語「轉移基因體」係指包括可操作地連接於外源性轉錄調節元件之編碼序列的重組AAV基因體，該外源性轉錄調節元件在將轉移基因體引入細胞中時介導編碼序列之表現。在某些實施例中，轉移基因體未整合於細胞之染色體DNA中。熟習此項技術者應瞭解，轉移基因體中包括可操作地連接於PAH編碼序列之轉錄調節元件之部分相對於PAH編碼序列之轉錄方向可為有義或反義定向。

如本文所用，兩個核苷酸序列之間或兩個胺基酸序列之間的「一致性百分比」係藉由將所比對之序列對之間的匹配數目乘以100且除以所比對區域之長度（包含內部空位）來計算。一致性評分僅對完美匹配進行計數，且不考慮胺基酸彼此之間的類似性程度。應注意，長度中僅包含內部空位，而不包含序列末端處之空位。

如本文所用，術語「與PAH基因突變相關之疾病或病症」係指由PAH基因之突變引起、由PAH基因之突變加劇或在遺傳學上與PAH基因之突變相關之任何疾病或病症。在某些實施例中，該與PAH基因突變相關之疾病或病症為苯酮尿症（PKU）。

如本文所用，術語「編碼序列」係指互補DNA（cDNA）中編碼多肽之部分，在起始密碼子處開始且在終止密碼子處終止。基因可由於替代性剪接、替代性轉譯起始及群體內之變化而具有一或多個編碼序列。編碼序列可為野生型或密碼子改變型。例示性野生型PAH編碼序列闡述於SEQ ID NO: 12中。

如本文所用，術語「以緘默方式改變」係指在不改變由編碼序列或經填充子插入之編碼序列編碼的多肽之胺基酸序列之情況下，基因之編碼序列或經填充子插入之編碼序列之變化（例如藉由核苷酸取代）。此緘默改變是有利的，因為其可提高編碼序列之轉譯效率。

在本文中，相對於起始密碼子之第一核苷酸指定PAH基因中之核苷酸位置。起始密碼子之第一核苷酸為位置1；在起始密碼子之第一核苷酸之5'端的核苷酸具有負數；在起始密碼子之第一核苷酸之3'端的核苷酸具有正數。人類PAH基因之例示性核苷酸1為NCBI參考序列之核苷酸5,473：NG_008690.1，且人類PAH基因之例示性核苷酸3為NCBI參考序列之核苷酸5,475：NG_008690.1。與起始密碼子之5'端相鄰之核苷酸為核苷酸-1。

在本文中，相對於涵蓋起始密碼子之第一核苷酸之外顯子指定PAH基因中之外顯子及內含子，該第一核苷酸為NCBI參考序列之核苷酸5473：NG_008690.1。涵蓋起始密碼子之第一核苷酸之外顯子為外顯子1。在外顯子1之3'端之外顯子自5'至3'為：外顯子2、外顯子3等。在外顯子1之3'端之內含子自5'至3'為：內含子1、內含子2等。因此，PAH基因自5'至3'包括：外顯子1、內含子1、外顯子2、內含子2、外顯子3等。人類PAH基因之例示性外顯子1為NCBI參考序列之核苷酸5001-5532：NG_008690.1。人類PAH基因之例示性內含子1為NCBI參考序列之核苷酸5533-9704：NG_008690.1。

如本文所用，術語「轉錄調節元件」或「TRE」係指順式作用核苷酸序列，例如DNA序列，其藉由RNA聚合酶調節（例如控制、增加或減少）可操作地連接之核苷酸序列之轉錄以形成RNA分子。TRE依賴於一或多個反式作用分子（諸如轉錄因子）來調節轉錄。因此，一個TRE在其與不同的反式作用分子接觸時（例如當其位於不同類型的細胞中時）可以不同方式調節轉錄。TRE可包含一或多個啟動子元件及/或強化子元件。熟習此項技術者應瞭解，基因中之啟動子及強化子元件可在位置上靠近，且術語「啟動子」可指代包括啟動子元件及強化子元件之序列。因此，術語「啟動子」不排除序列中之強化子元件。啟動子及強化子元件無需來源於相同基因或物種，且每個啟動子或強化子元件之序列可與基因體中之對應內源序列一致或實質上一致。

如本文所用，術語「可操作地連接」用於描述TRE與待轉錄之編碼序列之間的連接。通常，將基因表現置於包括一或多個啟動子及/或強化子元件之TRE之控制下。若編碼序列之轉錄由TRE控制或影響，則編碼序列「可操作地連接」至TRE。TRE之啟動子及強化子元件可自編碼序列呈任何定向及/或距離，只要獲得所需轉錄活性即可。在某些實施例中，TRE位於編碼序列之上游。

如本文所用，術語「聚腺苷酸化序列」係指在轉錄至RNA中時構成聚腺苷酸化信號序列之DNA序列。聚腺苷酸化序列可為原生的（例如來自PAH基因）或外源性的。外源性聚腺苷酸化序列可為哺乳動物或病毒聚腺苷酸化序列（例如SV40聚腺苷酸化序列）。

如本文所用，「外源性聚腺苷酸化序列」係指與PAH基因（例如人類PAH基因）之內源性聚腺苷酸化序列不一致或實質上一致之聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，外源性聚腺苷酸化序列為相同物種（例如人類）中之非PAH基因之聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，外源性聚腺苷酸化序列為不同物種（例如病毒）之聚腺苷酸化序列。

如本文所用，在向個體施用AAV之情形下，術語「有效量」係指實現所需預防或治療作用之AAV之量。

如本文所用，術語「約」或「大約」在指代諸如劑量之可量測值時，涵蓋既定值或範圍之±20%或±10%、±5%、±1%或±0.1%之變化，以適合於執行本文中所揭示之方法。

如本文所用，在肝功能測試之結果（例如個體血液中肝轉胺酶位準）之情形下，術語「正常範圍」係指針對健康個體預期之參考範圍（亦即非病理生理學參考範圍）。本領域中熟習此項技術者應瞭解，參考範圍在實驗室測試點之間變化。如此，當測定測試值是否在正常範圍內時，應使用獲得測試值之實驗室測試點供應之參考範圍。此外，在本領域中已知，某一肝功能測試的參考範圍對於男性及女性可能是不同的。常見的肝功能測試包含測定丙胺酸胺基轉移酶（ALT）、天冬胺酸胺基轉移酶（AST）、鹼性磷酸酯（ALP）、γ-麩胺醯基轉移酶（GGT）、膽紅素及白蛋白的水準。肝功能測試亦包含測定凝血酶原時間（PT），其為量測血液凝結時間之測試。在某些實施例中，ALT之參考範圍為0至約45 IU/L、約3至約30 U/L、約1至約45 U/L、約17至約63 U/L、約14至約54 U/L。在某些實施例中，AST之參考範圍為0至約35 IU/L、約2至約40 U/L、約1至約35 U/L、約18至約57 U/L、約5至約34 U/L、約15至約41 U/L。在某些實施例中，ALP之參考範圍為約30至約120 IU/L、約38至約126 U/L、約69至約318 U/L、約53至約212 U/L、約34至約104 U/L。在某些實施例中，直接膽紅素之參考範圍為約2至約17 µmol/L、約0至約0.4 mg/dL、約0至約0.8 mg/dL、約0至約0.3 mg/dL、約0至約0.2 mg/dL。在某些實施例中，總膽紅素之參考範圍為約0.3至約1.2 mg/dL、約0.1至約1.2 mg/dL、約0.2至約1.2 mg/dL。在某些實施例中，凝血酶原時間之參考範圍為約10.9至約12.5秒。在某些實施例中，白蛋白之參考範圍為約40至約60 g/L。

如本文所用，在肝功能測試之結果（例如個體血液中肝轉胺酶位準）之情形下，「基線值」係指在施用本文中所描述之治療（例如向個體施用基因療法）之前獲得的肝功能測試之結果。在某些實施例中，肝功能測試之基線值為在施用基因療法（例如肝定向基因療法）之前自個體獲得的肝功能測試之結果。舉例而言，ALT及/或AST之基線值為在施用基因療法之前自個體獲得的ALT及/或AST之值。

在某些實施例中，肝功能測試之結果可報告為某一參考值之倍數。舉例而言，肝功能測試之結果可報告為正常上限之倍數。如本文所用，術語「正常上限」或「ULN」係指參考範圍之上限值。舉例而言，ALT之ULN為ALT之參考範圍之上限值。在某些實施例中，ALT之ULN為約45 IU/L、約30 U/L、約45 U/L、約63 U/L、約54 U/L。在某些實施例中，ALT之ULN為約30 U/L至約63 U/L。在某些實施例中，AST之ULN為約35 IU/L、約40 U/L、約57 U/L、約34 U/L、約41 U/L。在某些實施例中，AST之ULN為約34 U/L至約57 U/L。在某些實施例中，ALP之ULN為約120 IU/L、約126 U/L、約318 U/L、約212 U/L、約104 U/L。在某些實施例中，ALP之ULN為約104 U/L至約318 U/L。在某些實施例中，直接膽紅素之ULN為約17 μol/L、約0.4 mg/dL、約0.8 mg/dL、約0.3 mg/dL、約0.2 mg/dL。在某些實施例中，直接膽紅素之ULN為約0.2 mg/dL至約0.8 mg/dL。在某些實施例中，總膽紅素之ULN為約1.2 mg/dL。在某些實施例中，凝血酶原時間之ULN為約12.5秒。在某些實施例中，白蛋白之ULN為約60 g/L。如此，肝功能測試之結果可報告為例如ULN之至少約1.5倍、ULN之至少約2倍、ULN之至少約2.5倍、ULN之至少約3倍、ULN之至少約4倍、ULN之至少5倍、ULN之至少20倍等等。

諸如ALT升高之事件可藉由某一等級描述。如本文所用，術語「等級」在用於事件之情形下時，係指如常見不良事件術語評定標準（Common Terminology Criteria for Adverse Events；CTCAE）所提供之等級指定。舉例而言，ALT升高水準可描述為等級1（若基線正常，則大於ULN之約1至約3倍；若基線異常，則大於基線之約1.5至約3倍）、等級2（若基線正常，則大於ULN之約3至約5倍；若基線異常，則大於基線之約3至約5倍）、等級3（若基線正常，則大於ULN之約5至約20倍；若基線異常，則大於基線之約5至約20倍）及等級4（若基線正常，則大於ULN之約20倍；若基線異常，則大於基線之約20倍）。II. 重組腺相關病毒

本文提供治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法。方法一般包括以約2e13 vg/kg至約2e14 kg/vg之劑量向個體施用治療有效劑量之本文中所揭示之重組腺相關病毒（rAAV）。適合用於此等方法之rAAV在下文予以詳細描述。

在某些實施例中，本文中所揭示之方法中採用的rAAV包括：AAV衣殼，其包括衣殼蛋白；以及轉移基因體，其包括可操作地連接於PAH編碼序列（例如以緘默方式改變之PAH編碼序列）的轉錄調節元件，從而允許PAH在經AAV轉導之細胞中的染色體外表現。

在某些實施例中，AAV衣殼包括以下中之一或多者：(a)衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，其中衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；(b)衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，其中衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及(c)衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，其中衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R。

在某些實施例中，AAV衣殼包括以下中之一或多者：(a)衣殼蛋白，其包括SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736之胺基酸序列；(b)衣殼蛋白，其包括SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736之胺基酸序列；及(c)衣殼蛋白，其包括SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736之胺基酸序列。

在某些實施例中，AAV衣殼包括以下中之兩者或更多者：(a)衣殼蛋白，其包括SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736之胺基酸序列；(b)衣殼蛋白，其包括SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736之胺基酸序列；及(c)衣殼蛋白，其包括SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736之胺基酸序列。

在某些實施例中，AAV衣殼包括：(a)衣殼蛋白，其具有由SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736組成之胺基酸序列；(b)衣殼蛋白，其具有由SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736組成之胺基酸序列；及(c)衣殼蛋白，其具有由SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736組成之胺基酸序列。

在某些實施例中，衣殼蛋白之胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列組成；衣殼蛋白之胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列組成，及/或衣殼蛋白之胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列組成。

適用於rAAV之轉移基因體通常包括可操作地連接於PAH編碼序列之轉錄調節元件（TRE）。在某些實施例中，轉移基因體包括於TRE及PAH編碼序列5’之5'反向末端重複（5' ITR）核苷酸序列及於TRE及PAH編碼序列3’之3'反向末端重複（3' ITR）核苷酸序列。

在某些實施例中，PAH編碼序列包括PAH基因之全部或實質上全部編碼序列。在某些實施例中，轉移基因體包括編碼SEQ ID NO: 13之核苷酸序列且可視情況進一步包括於PAH編碼序列3’之外源性聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，編碼SEQ ID NO: 13之核苷酸序列為野生型（例如具有SEQ ID NO: 12之序列）。在某些實施例中，編碼SEQ ID NO: 13之核苷酸序列為密碼子改變型（例如具有SEQ ID NO: 1之序列）。

在某些實施例中，PAH編碼序列編碼包括PAH蛋白之全部或實質上全部胺基酸序列之多肽。在某些實施例中，PAH編碼序列編碼野生型PAH蛋白（例如人類PAH蛋白）之胺基酸序列。在某些實施例中，PAH編碼序列編碼突變型PAH蛋白（例如人類PAH蛋白）之胺基酸序列，其中突變型PAH多肽為野生型PAH多肽之功能等效物，亦即，可充當野生型PAH多肽。在某些實施例中，功能上等效之PAH多肽進一步包括至少一個未發現於野生型PAH多肽中之特性，例如使PAH蛋白（例如二聚體或四聚體）穩定之能力或抵抗蛋白質降解之能力。

轉移基因體可用於表現任何哺乳動物細胞（例如人類細胞）中之PAH。因此，TRE可在任何哺乳動物細胞（例如人類細胞）中具有活性。在某些實施例中，TRE在廣泛範圍之人類細胞中具有活性。此類TRE可包括組成型啟動子及/或強化子元件，包含

或者，TRE可為組織特異性TRE，亦即，其在特定組織及/或器官中具有活性。組織特異性TRE包括一或多個組織特異性啟動子及/或強化子元件，及視情況選用之一或多個組成型啟動子及/或強化子元件。熟習此項技術者應瞭解，可藉由本領域中熟知之方法自特異性表現於組織中之基因分離組織特異性啟動子及/或強化子元件。在某些實施例中，TRE為肝特異性TRE（例如肝細胞特異性TRE）。例示性肝特異性TRE可包括一或多個元件，該一或多個元件包含人類APOE/C-I肝控制區（HCR）1或2（例如包括與SEQ ID NO: 2或14至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列）及人類SERPINA1（hAAT）啟動子（例如包括與SEQ ID NO: 3或15至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列）。

在某些實施例中，轉移基因體包括兩個或更多個TRE，視情況包括上文揭示之TRE中之至少一者。本領域中熟習此項技術者應瞭解，此等TRE中之任一者可以任何次序組合，且組成型TRE及組織特異性TRE之組合可驅動有效及組織特異性轉錄。

類似地，兩個或更多個組織特異性TRE之組合可驅動有效及組織特異性轉錄。舉例而言，在某些實施例中，轉移基因體包括人類HCR1（例如包括與SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列）及hAAT啟動子（例如包括與SEQ ID NO: 3至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列），視情況其中人類HCR1在hAAT啟動子之5'端。在某些實施例中，轉移基因體包括與SEQ ID NO: 5之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列。在某些實施例中，轉移基因體包括人類HCR1（例如包括SEQ ID NO: 2之核苷酸序列）及hAAT啟動子（例如包括SEQ ID NO: 3之核苷酸序列），視情況其中人類HCR1在hAAT啟動子的5'端。在某些實施例中，轉移基因體包括SEQ ID NO: 5之核苷酸序列。

在某些實施例中，轉移載體進一步包括在PAH編碼序列之5'端或插入PAH編碼序列中之內含子。此類內含子可增加轉殖基因表現，例如藉由減少轉錄緘默及增強自細胞核至細胞質之mRNA輸出。在某些實施例中，轉移基因體自5'至3'包括：非編碼外顯子、內含子及PAH編碼序列。在某些實施例中，將內含子序列插入PAH編碼序列中，視情況其中在連接兩個原生外顯子之核苷酸間鍵處插入內含子。在某些實施例中，在連接原生外顯子1及外顯子2之核苷酸間鍵處插入內含子。

內含子可包含PAH基因之原生內含子序列、來自不同物種之內含子序列或來自相同物種之不同基因及/或合成內含子序列。熟悉此項技術者應瞭解，合成內含子序列可經設計以藉由引入本領域中已知的任何共同剪接基序來介導RNA剪接（例如Sibley等人, (2016) 《自然綜述遺傳學（Nature Reviews Genetics）》, 17, 407-21，其以全文引用之方式併入本文中）。例示性內含子序列提供於Lu等人 (2013) 《分子療法（Molecular Therapy）》 21(5): 954-63及Lu等人 (2017) 《人類基因療法（Hum. Gene Ther.）》 28(1): 125-34中，其以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，轉移基因體包括SV40內含子（例如包括與SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列）。

在某些實施例中，本文中所揭示之轉移基因體進一步包括轉錄終止子（例如聚腺苷酸化序列）。在某些實施例中，轉錄終止子在PAH編碼序列之3'端。轉錄終止子可為任何有效終止轉錄之序列，且熟習此項技術者應瞭解，可自任何表現於需要PAH編碼序列之轉錄的細胞中之基因分離此類序列。在某些實施例中，轉錄終止子包括聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，聚腺苷酸化序列與人類PAH基因之內源性聚腺苷酸化序列一致或實質上一致。在某些實施例中，聚腺苷酸化序列為外源性聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，聚腺苷酸化序列為SV40聚腺苷酸化序列（例如包含SEQ ID NO: 6之核苷酸序列，或與其互補之核苷酸序列）。在某些實施例中，聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 6之序列。

在某些實施例中，轉移基因體自5'至3'包括：TRE、視情況選用之非編碼外顯子及內含子、PAH編碼序列及聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，TRE與SEQ ID NO: 2、3及5中之任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；內含子與SEQ ID NO: 4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；PAH編碼序列與SEQ ID NO: 1具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；及/或聚腺苷酸化序列與SEQ ID NO: 6中之任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些實施例中，TRE包括選自由SEQ ID NO: 2、3及5組成之群組的核苷酸序列；內含子包括選自由SEQ ID NO: 4組成之群組的核苷酸序列；PAH編碼序列包括SEQ ID NO: 1之序列；及/或聚腺苷酸化序列包括選自由SEQ ID NO: 6組成之群組的核苷酸序列。在某些實施例中，TRE自5'至3'包括：SEQ ID NO: 2之序列及SEQ ID NO: 3之序列（例如TRE包括SEQ ID NO: 5之序列）；內含子包括SEQ ID NO: 4之序列；PAH編碼序列包括SEQ ID NO: 1之序列；及/或聚腺苷酸化序列包括SEQ ID NO: 6之序列。

在某些實施例中，轉移基因體包括與SEQ ID NO: 7至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，轉移基因體包括SEQ ID NO: 7之核苷酸序列。在某些實施例中，轉移基因體由SEQ ID NO: 7之核苷酸序列組成。

在某些實施例中，本文中所揭示之轉移基因體進一步包括於TRE5’之5'反向末端重複（5' ITR）核苷酸序列，及於PAH編碼序列3’之3'反向末端重複（3' ITR）核苷酸序列。來自任何AAV血清型或其變異體之ITR序列皆可用於本文中所揭示之轉移基因體中。5'及3' ITR可來自相同血清型之AAV或不同血清型之AAV。用於本文中所揭示之轉移基因體中的例示性ITR闡述於本文中之SEQ ID NO: 8、9及16至19中。

在某些實施例中，5' ITR或3' ITR係來自AAV2。在某些實施例中，5' ITR及3' ITR皆來自AAV2。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 16具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性，或3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 17具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 16具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 17具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性。在某些實施例中，轉移基因體包括SEQ ID NO: 7中之任一者之核苷酸序列、具有SEQ ID NO: 16之序列之5' ITR核苷酸序列及具有SEQ ID NO: 17之序列之3' ITR核苷酸序列。

在某些實施例中，5' ITR或3' ITR係來自AAV5。在某些實施例中，5' ITR及3' ITR皆來自AAV5。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性，或3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 19具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 19具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性。在某些實施例中，轉移基因體包括SEQ ID NO: 7中之任一者之核苷酸序列、具有SEQ ID NO: 18之序列之5' ITR核苷酸序列及具有SEQ ID NO: 19之序列之3' ITR核苷酸序列。

在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列及3' ITR核苷酸序列彼此實質上互補（例如除在5'或3' ITR中之1、2、3、4或5個核苷酸位置處之失配以外彼此互補）。

在某些實施例中，5' ITR或3' ITR經修飾以減少或消除由Rep蛋白進行之解析（「不可解析之ITR」）。在某些實施例中，不可解析之ITR包括末端解析位點之核苷酸序列中之插入、缺失或取代。此類修飾使得能夠於在經感染之細胞中複製轉移基因體之後形成AAV之自互補、雙股DNA基因體。例示性不可解析之ITR序列為本領域中已知的（參見例如美國專利案第7,790,154號及第9,783,824號中提供之序列，其以全文引用之方式併入本文中）。在某些實施例中，5' ITR包括與SEQ ID NO: 8至少95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，5' ITR由與SEQ ID NO: 8至少95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列組成。在某些實施例中，5' ITR由SEQ ID NO: 8之核苷酸序列組成。在某些實施例中，3' ITR包括與SEQ ID NO: 9至少95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，5' ITR包括與SEQ ID NO: 9至少95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，3' ITR由SEQ ID NO: 9之核苷酸序列組成。在某些實施例中，5' ITR由SEQ ID NO: 8之核苷酸序列組成，且3' ITR由SEQ ID NO: 9之核苷酸序列組成。在某些實施例中，5' ITR由SEQ ID NO: 8之核苷酸序列組成，且3' ITR由SEQ ID NO: 17之核苷酸序列組成。

在某些實施例中，3' ITR由來源於野生型AAV2基因體序列之額外核苷酸序列側接。在某些實施例中，3' ITR由來源於與野生型AAV2 ITR相鄰的野生型AAV2序列之額外37 bp序列側接。參見例如Savy等人,《人類基因療法方法（ Human Gene Therapy Methods ）》 (2017) 28(5): 277-289 （其藉此以全文引用之方式併入本文中）。在某些實施例中，該額外37 bp序列在3' ITR內部。在某些實施例中，37 bp序列由SEQ ID NO: 20之序列組成。在某些實施例中，3' ITR包括與SEQ ID NO: 21至少95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，3' ITR包括SEQ ID NO: 21之核苷酸序列。在某些實施例中，3' ITR之核苷酸序列由與SEQ ID NO: 21至少95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列組成。在某些實施例中，3' ITR之核苷酸序列由SEQ ID NO: 21之核苷酸序列組成。

在某些實施例中，轉移基因體自5'至3'包括：5' ITR；內部元件，其自5'至3'包括：TRE、視情況選用之非編碼外顯子及內含子、PAH編碼序列及聚腺苷酸化序列，如本文中所揭示；不可解析之ITR；與內部元件互補之核苷酸序列；及3' ITR。此類轉移基因體可在感染之後及複製之前形成AAV之自互補、雙股DNA基因體。

在某些實施例中，轉移基因體自5'至3'包括：5' ITR、TRE、視情況選用之非編碼外顯子及內含子、PAH編碼序列、聚腺苷酸化序列及3' ITR。在某些實施例中，5'ITR與SEQ ID NO: 8、16或18具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；TRE與SEQ ID NO: 2、3或5中之任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；內含子與SEQ ID NO: 4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；PAH編碼序列與SEQ ID NO: 1具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；聚腺苷酸化序列與SEQ ID NO: 6中之任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；及/或3' ITR與SEQ ID NO: 9、17或19具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些實施例中，5' ITR包括選自由SEQ ID NO: 8、16或18組成之群組的核苷酸序列或由該核苷酸序列組成；TRE包括選自由SEQ ID NO: 2、3或5組成之群組的核苷酸序列；內含子包括選自由SEQ ID NO: 4組成之群組的核苷酸序列；PAH編碼序列包括SEQ ID NO: 1之序列；聚腺苷酸化序列包括選自由SEQ ID NO: 6組成之群組的核苷酸序列；及/或3' ITR包括選自由SEQ ID NO: 9、17或19組成之群組的核苷酸序列或由該核苷酸序列組成。在某些實施例中，5' ITR包括SEQ ID NO: 8之序列或由該序列組成；TRE自5'至3'包括SEQ ID NO: 2之序列及SEQ ID NO: 3之序列（例如TRE包括SEQ ID NO: 5之序列）；內含子包括SEQ ID NO: 4之序列；PAH編碼序列包括SEQ ID NO: 1之序列；聚腺苷酸化序列包括SEQ ID NO: 6之序列；及/或3' ITR包括SEQ ID NO: 9之序列或由該序列組成。

在某些實施例中，轉移基因體包括與SEQ ID NO: 10之序列至少至少80%（例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）一致的序列。在某些實施例中，轉移基因體包括SEQ ID NO: 10之序列。在某些實施例中，轉移基因體由SEQ ID NO: 10之序列組成。

在某些實施例中，rAAV包括： (a) AAV衣殼蛋白，該AAV衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列；及轉移基因體，該轉移基因體自5'至3'包括以下基因元件：5' ITR元件（例如SEQ ID NO: 8之5' ITR）、人類HCR1（例如SEQ ID NO: 2之HCR1）、hAAT啟動子（例如SEQ ID NO: 3之hAAT啟動子）、SV40內含子（例如SEQ ID NO: 4之SV40內含子）、以緘默方式改變之人類PAH編碼序列（例如SEQ ID NO: 1之PAH編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如SEQ ID NO: 6之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如SEQ ID NO: 9之3' ITR）；(b) AAV衣殼蛋白，該AAV衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列；及轉移基因體，該轉移基因體自5'至3'包括以下基因元件：5' ITR元件（例如SEQ ID NO: 8之5' ITR）、人類HCR1（例如SEQ ID NO: 2之HCR1）、hAAT啟動子（例如SEQ ID NO: 3之hAAT啟動子）、SV40內含子（例如SEQ ID NO: 4之SV40內含子）、以緘默方式改變之人類PAH編碼序列（例如SEQ ID NO: 1之PAH編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如SEQ ID NO: 6之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如SEQ ID NO: 9之3' ITR）；及/或(c) AAV衣殼蛋白，該AAV衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列；及轉移基因體，該轉移基因體自5'至3'包括以下基因元件：5' ITR元件（例如SEQ ID NO: 8之5' ITR）、人類HCR1（例如SEQ ID NO: 2之HCR1）、hAAT啟動子（例如SEQ ID NO: 3之hAAT啟動子）、SV40內含子（例如SEQ ID NO: 4之SV40內含子）、以緘默方式改變之人類PAH編碼序列（例如SEQ ID NO: 1之PAH編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如SEQ ID NO: 6之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如SEQ ID NO: 9之3' ITR）。

在某些實施例中，rAAV包括：(a) AAV衣殼蛋白，該AAV衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列；及轉移基因體，該轉移基因體包括SEQ ID NO: 7或10中之任一者之核苷酸序列；(b) AAV衣殼蛋白，該AAV衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列；及轉移基因體，該轉移基因體包括SEQ ID NO: 7或10中之任一者之核苷酸序列；及/或(c) AAV衣殼蛋白，該AAV衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列；及轉移基因體，該轉移基因體包括SEQ ID NO: 7或10中之任一者之核苷酸序列。

在某些實施例中，rAAV存在於醫藥組合物中，該醫藥組合物包括如本文中所揭示之rAAV以及醫藥學上可接受之賦形劑、佐劑、稀釋劑、媒劑或載劑，或其組合。「醫藥學上可接受之載劑」包含任何在與組合物之活性成分組合時使該成分保留生物活性且不引起破壞性生理學反應（諸如不希望的免疫反應）的物質。醫藥學上可接受之載劑包含水、磷酸鹽緩衝生理鹽水、乳液（諸如油/水乳液）及潤濕劑。包括此類載劑之組合物係藉由熟知的習知方法調配，諸如《雷明頓氏醫藥科學（Remington's Pharmaceutical Sciences）》, 最新版, Mack Publishing Co., Easton Pa. 18042, USA；A. Gennaro (2000) 《雷明頓：藥劑學之科學及實踐（Remington: The Science and Practice of Pharmacy）》, 第20版, Lippincott, Williams, & Wilkins；《醫藥劑型及藥物遞送系統（Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems）》 (1999) H. C. Ansel等人, 第7版, Lippincott, Williams, & Wilkins；及《醫藥賦形劑手冊（Handbook of Pharmaceutical Excipients）》 (2000) A. H. Kibbe等人, 第3版, Amer. Pharmaceutical Assoc中所闡述之方法。

在某些實施例中，活性成分（例如rAAV）、醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何其他成分的相對量是變化的。在某些實施例中，相對量可取決於各種因素，包含但不限於個體之體型（例如體重）及個體之整體健康狀況。在某些實施例中，本發明之醫藥組合物含有約0.1%至約100%（w/w）之活性成分。舉例而言，本發明之醫藥組合物包括約0.1%至約10.0%（w/w）、約5.0%至約15.0%（w/w）、約10.0%至約20.0%（w/w）、約15.0%至約25.0%（w/w）、約20.0%至約30.0%（w/w）、約25.0%至約35.0%（w/w）、約30.0%至約40.0%（w/w）、約35.0%至約45.0%（w/w）、約40.0%至約50.0%（w/w）、約45.0%至約55.0%（w/w）、約50.0%至約60.0%（w/w）、約55.0%至約65.0%（w/w）、約60.0%至約70.0%（w/w）、約65.0%至約75.0%（w/w）、約70.0%至約80.0%（w/w）、約75.0%至約85.0%（w/w）、約80.0%至約90.0%（w/w）、約85.0%至約95.0%、約90.0%至約100.0% (w/w)或其之間的相對量。

在某些實施例中，醫藥組合物適合於向有需要之個體（例如患有與PAH缺乏症相關之疾病或病症的個體）施用。有需要之個體可為任何動物。舉例而言，動物可為哺乳動物，諸如靈長類動物（例如人類或猴）或非靈長類動物（例如小鼠、大鼠、貓、狗、奶牛、豬或馬等）。舉例而言，個體可為非哺乳動物，例如雞或鴨等。本領域中熟習此項技術者應能夠確定對調配物或醫藥組合物之常規修改，以使其適合於施用於各種動物。在某些實施例中，且本文提供之醫藥組合物適合於施用於人類個體。

在某些實施例中，醫藥組合物可藉由任何本領域中熟習此項技術者已知之方法來製備。醫藥組合物可包含但不限於鹽、緩衝液、碳水化合物、糖、蛋白質、肽及本領域中已知之其他組分。III. 使用方法

本文提供治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法。方法通常包括以約2e13 vg kg至約2e14 kg/vg之劑量向個體施用本文中所揭示之重組腺相關病毒（rAAV）。

本文中所揭示之方法可應用於任何含有PAH基因之突變的細胞。熟習此項技術者應瞭解，對在Phe代謝中具有活性之細胞尤其感興趣。因此，在某些實施例中，方法應用於肝、腎、腦、腦下垂體、腎上腺、胰腺、膀胱、膽囊、結腸、小腸或乳房中之細胞。在某些實施例中，方法應用於肝細胞及/或腎細胞。

在某些實施例中，待轉導之細胞在哺乳動物個體中，且以可有效轉導個體中之細胞之量向個體施用AAV。因此，在某些實施例中，本文提供一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法通常包括向個體施用有效量之如本文中所揭示之rAAV。個體可為具有PAH突變的人類個體、非人類靈長類動物個體（例如食蟹獼猴）或嚙齒動物個體（例如小鼠），或含有PAH突變型人類肝細胞之非人類靈長類動物個體（例如食蟹獼猴）或嚙齒動物個體（例如小鼠）。適合之小鼠個體包含但不限於已植入人類肝臟細胞（例如人類肝細胞）的小鼠。可使用本文中所揭示之方法治療任何與PAH基因突變相關之疾病或病症。適合之疾病或病症包含但不限於苯酮尿症。

在某些實施例中，前述方法採用rAAV，其包括： (a) AAV衣殼蛋白，該AAV衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列；及轉移基因體，該轉移基因體自5'至3'包括以下基因元件：5' ITR元件（例如SEQ ID NO: 8之5' ITR）、人類HCR1（例如SEQ ID NO: 2之HCR1）、hAAT啟動子（例如SEQ ID NO: 3之hAAT啟動子）、SV40內含子（例如SEQ ID NO: 4之SV40內含子）、以緘默方式改變之人類PAH編碼序列（例如SEQ ID NO: 1之PAH編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如SEQ ID NO: 6之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如SEQ ID NO: 9之3' ITR）；(b) AAV衣殼蛋白，該AAV衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列；及轉移基因體，該轉移基因體自5'至3'包括以下基因元件：5' ITR元件（例如SEQ ID NO: 8之5' ITR）、人類HCR1（例如SEQ ID NO: 2之HCR1）、hAAT啟動子（例如SEQ ID NO: 3之hAAT啟動子）、SV40內含子（例如SEQ ID NO: 4之SV40內含子）、以緘默方式改變之人類PAH編碼序列（例如SEQ ID NO: 1之PAH編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如SEQ ID NO: 6之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如SEQ ID NO: 9之3' ITR）；及/或(c) AAV衣殼蛋白，該AAV衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列；及轉移基因體，該轉移基因體自5'至3'包括以下基因元件：5' ITR元件（例如SEQ ID NO: 8之5' ITR）、人類HCR1（例如SEQ ID NO: 2之HCR1）、hAAT啟動子（例如SEQ ID NO: 3之hAAT啟動子）、SV40內含子（例如SEQ ID NO: 4之SV40內含子）、以緘默方式改變之人類PAH編碼序列（例如SEQ ID NO: 1之PAH編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如SEQ ID NO: 6之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如SEQ ID NO: 9之3' ITR）。

在某些實施例中，前述方法採用rAAV ，其包括：(a) AAV衣殼蛋白，該AAV衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列；及轉移基因體，該轉移基因體包括SEQ ID NO: 7或10中之任一者之核苷酸序列；(b) AAV衣殼蛋白，該AAV衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列；及轉移基因體，該轉移基因體包括SEQ ID NO: 7或10中之任一者之核苷酸序列；及/或(c) AAV衣殼蛋白，該AAV衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列；及轉移基因體，該轉移基因體包括SEQ ID NO: 7或10中之任一者之核苷酸序列。

本文中所揭示之方法的有利之處尤其在於其能夠活體內及活體外在細胞中以高效率表現PAH蛋白。在某些實施例中，PAH蛋白之表現量為PAH基因不具有突變之相同類型的細胞中之內源性PAH蛋白之表現量的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在某些實施例中，PAH蛋白之表現量比PAH基因不具有突變之相同類型的細胞中之內源性PAH蛋白之表現量高至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。可採用任何測定PAH蛋白之表現量之方法，包含但不限於ELISA、西方墨點法（Western blotting）、免疫染色及質譜法。

在某些實施例中，用本文中所揭示之AAV組合物轉導細胞可如本文中所提供來執行或藉由任何本領域中一般熟習此項技術者已知的轉導方法來執行。在某些實施例中，可使細胞在以下感染倍率（MOI）下與AAV接觸：50,000；100,000；150,000；200,000；250,000；300,000；350,000；400,000；450,000；或500,000，或任何提供細胞之最佳轉導之MOI。

可藉由任何適當途徑向個體施用本文中所揭示之AAV組合物，包含但不限於靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、鼻內、局部或皮內途徑。在某些實施例中，組合物經調配以用於經由靜脈內注射或皮下注射來施用。

在另一態樣中，本文提供向有需要之個體施用如本文中所揭示之rAAV的方法。可使用任何向個體遞送rAAV的有效預防、管控、治療或診斷與PAH基因突變相關之疾病或病症的施用途徑。可向個體遞送任何有效量之rAAV，以有效預防、管控、治療或診斷與PAH基因突變相關之疾病或病症。本領域中熟習此項技術者應理解，rAAV之適當量及施用途徑可由主治醫療專業人員（例如醫師）決定。待施用之rAAV之特定量可取決於各種因素，包含但不限於個體之年齡、性別、體重及總體健康狀況，以及其他本領域中熟習此項技術者已知的因素。

在某些實施例中，rAAV係以多次劑量施用。在某些實施例中，rAAV係作為多劑量方案之部分以一或多次劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次劑量施用。在某些實施例中，一或多次劑量構成足以引起醫藥作用（例如減輕PKU之一或多個症狀）的總劑量。

在某些實施例中，一或多次劑量係經由單個施用途徑（例如靜脈內）施用。在某些實施例中，一或多次劑量係經由多個施用途徑施用。在某些實施例中，一或多次劑量係經由一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個施用途徑施用。

在某些實施例中，rAAV係以單次劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約2e13 vg/kg至約2e14 vg/kg（亦即約2×10¹³ vg/kg至約2×10¹⁴ vg/kg）之劑量施用，其中vg表示病毒基因體之數目。在某些實施例中，rAAV係以約1e13 vg/kg至約3e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約1e13 vg/kg至約3e13 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約2e13 vg/kg至約4e13 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約3e13 vg/kg至約5e13 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約4e13 vg/kg至約6e13 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約5e13 vg/kg至約7e13 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約6e13 vg/kg至約8e13 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約7e13 vg/kg至約9e13 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約8e13 vg/kg至約1e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約9e13 vg/kg至約1.21e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約1e14 vg/kg至約1.2e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約1.1e14 vg/kg至約1.3e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約1.2e14 vg/kg至約1.4e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約1.3e14 vg/kg至約1.5e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約1.4e14 vg/kg至約1.6e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約1.5e14 vg/kg至約1.7e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約1.6e14 vg/kg至約1.8e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約1.7e14 vg/kg至約1.9e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約1.8e14 vg/kg至約2e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約1.9e14 vg/kg至約2.1e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約2e14 vg/kg至約2.2e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約2.1e14 vg/kg至約2.3e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約2.2e14 vg/kg至約2.4e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約2.3e14 vg/kg至約2.5e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約2.4e14 vg/kg至約2.6e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約2.5e14 vg/kg至約2.7e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約2.6e14 vg/kg至約2.8e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約2.7e14 vg/kg至約2.9e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約2.8e14 vg/kg至約3e14 vg/kg之劑量施用。

在某些實施例中，rAAV係以約2e13 vg/kg、3e13 vg/kg、4e13 vg/kg、5e13 vg/kg、6e13 vg/kg、7e13 vg/kg、8e13 vg/kg、9e13 vg/kg、1e14 vg/kg、1.1e14 vg/kg、1.2e14 vg/kg、1.3e14 vg/kg、1.4e14 vg/kg、1.5e14 vg/kg、1.6e14 vg/kg、1.7e14 vg/kg、1.8e14 vg/kg、1.9e14 vg/kg或2e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以2e13 vg/kg、3e13 vg/kg、4e13 vg/kg、5e13 vg/kg、6e13 vg/kg、7e13 vg/kg、8e13 vg/kg、9e13 vg/kg、1e14 vg/kg、1.1e14 vg/kg、1.2e14 vg/kg、1.3e14 vg/kg、1.4e14 vg/kg、1.5e14 vg/kg、1.6e14 vg/kg、1.7e14 vg/kg、1.8e14 vg/kg、1.9e14 vg/kg或2e14 vg/kg之劑量施用。

在某些實施例中，rAAV係以約9e12 vg/kg、約9.5e12 vg/kg、約1e13 vg/kg、約1.5e13 vg/kg、約2e13 vg/kg、約2.5e13 vg/kg、約3e13 vg/kg、約3.5e13 vg/kg、約4e13 vg/kg、約4.5e13 vg/kg、約5e13 vg/kg、約5.5e13 vg/kg、約6e13 vg/kg、約6.5e13 vg/kg、約7e13 vg/kg、約7.5e13 vg/kg、約8e13 vg/kg、約8.5e13 vg/kg、約9e13 vg/kg、約9.5e13 vg/kg、約1e14 vg/kg、約1.5e14 vg/kg、約2e14 vg/kg或約2.5e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約2e13 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約1e13 vg/kg、約1.2e13 vg/kg、約1.4e13 vg/kg、約1.6e13 vg/kg、約1.8e13 vg/kg、約2e13 vg/kg、約2.2e13 vg/kg、約2.4e13 vg/kg、約2.6e13 vg/kg、約2.8e13 vg/kg或約3e13 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約6e13 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約5e13 vg/kg、約5.2e13 vg/kg、約5.4e13 vg/kg、約5.6e13 vg/kg、約5.8e13 vg/kg、約6e13 vg/kg、約6.2e13 vg/kg、約6.4e13 vg/kg、約6.6e13 vg/kg、約6.8e13 vg/kg或約7e13 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約8e13 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約7e13 vg/kg、約7.2e13 vg/kg、約7.4e13 vg/kg、約7.6e13 vg/kg、約7.8e13 vg/kg、約8e13 vg/kg、約8.2e13 vg/kg、約8.4e13 vg/kg、約8.6e13 vg/kg、約8.8e13 vg/kg或約9e13 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約1e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約9e13 vg/kg、約9.2e13 vg/kg、約9.4e13 vg/kg、約9.6e13 vg/kg、約9.8e13 vg/kg、約1e14 vg/kg、約1.2e14 vg/kg、約1.4e14 vg/kg、約1.6e14 vg/kg、約1.8e14 vg/kg或約2e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約2e14 vg/kg之劑量施用。在某些實施例中，rAAV係以約1e14 vg/kg、約1.2e14 vg/kg、約1.4e14 vg/kg、約1.6e14 vg/kg、約1.8e14 vg/kg、約2e14 vg/kg、約2.2e14 vg/kg、約2.4e14 vg/kg、約2.6e14 vg/kg、約2.8e14 vg/kg或約3e14 vg/kg之劑量施用。

在某些實施例中，向有需要之個體施用如本文所描述之rAAV使得不良事件之發生率最低。在某些實施例中，向有需要之個體施用rAAV使得嚴重不良事件之發生率最低。在某些實施例中，不良事件可能為施用rAAV之結果。因此，在某些實施例中，向有需要之個體施用rAAV使得可能為施用rAAV之結果的不良事件及/或嚴重不良事件之發生率最低。在某些實施例中，向有需要之個體施用rAAV使得治療中出現之不良事件（TEAE）及嚴重TEAE之發生率及嚴重度降低。

在某些實施例中，向有需要之個體施用如本文中所描述之rAAV緩解一或多個與苯酮尿症（PKU）相關的症狀。PKU之症狀可包含但不限於呼吸、皮膚或尿液中有黴味；可包含癲癇發作之神經學症狀；皮疹（例如濕疹）；皮膚蒼白及眼睛發藍；頭部異常小（亦即小腦症）；過動症；智力殘疾；發育延遲；行為、情感及社交問題；以及精神病症。因此，在某些實施例中，向有需要之個體施用如本文中所描述之rAAV緩解一或多個選自由以下組成之群組的PKU之症狀：呼吸、皮膚或尿液中有黴味；可包含癲癇發作之神經學症狀；皮疹（例如濕疹）；皮膚蒼白及眼睛發藍；頭部異常小（亦即小腦症）；過動症；智力殘疾；發育延遲；行為、情感及社交問題；以及精神病症。

在某些實施例中，無高苯丙胺酸血症之個體（HPA；例如未患與PAH基因突變相關之疾病或病症的個體）的血液苯丙胺酸（Phe）（例如血漿Phe）之正常範圍為58±14 µmol/L。在某些實施例中，患有不需要根據本領域中可用之標準治療指南進行治療的與PAH基因突變相關之疾病或病症（例如PAH缺乏症）的個體的血液Phe（例如血漿Phe）的範圍為約120 µmol/L至約360 µmol/L（例如血液Phe（例如血漿Phe）為約100 µmol/L、約110 µmol/L、約120 µmol/L、約130 µmol/L、約140 µmol/L、約150 µmol/L、約160 µmol/L、約170 µmol/L、約180 µmol/L、約190 µmol/L、約200 µmol/L、約210 µmol/L、約220 µmol/L、約230 µmol/L、約240 µmol/L、約250 µmol/L、約260 µmol/L、約270 µmol/L、約280 µmol/L、約290 µmol/L、約300 µmol/L、約310 µmol/L、約320 µmol/L、約330 µmol/L、約340 µmol/L、約350 µmol/L、約360 µmol/L、約370 µmol/L、約380 µmol/L、約390 µmol/L或約400 µmol/L。在某些實施例中，患有不需要根據本領域中可用之標準治療指南進行治療的PAH缺乏症（例如PKU）的個體的血液Phe（例如血漿Phe）的範圍為約120 µmol/L至約360 µmol/L。在某些實施例中，患有不需要根據本領域中可用之標準治療指南進行治療的PKU的個體之血液Phe（例如血漿Phe）的範圍為約120 µmol/L至約360 µmol/L。

在某些實施例中，患有適合於用本文之rAAV治療的與PAH基因突變相關之疾病或病症（例如高苯丙胺酸血症，PKU）的個體之血液Phe（例如血漿Phe）大於約600 µmol/L。在某些實施例中，適合於用本文之rAAV治療的個體具有間隔至少48小時抽取的兩個血漿Phe值，濃度≥600 µmol/L，且在過去12個月中具有至少一個≥600 µmol/L之歷史值。在某些實施例中，患有適合於用本文之rAAV治療的與PAH基因突變相關之疾病或病症（例如高苯丙胺酸血症，PKU）的個體之血液Phe（例如血漿Phe）為大於約450 µmol/L、大於約500 µmol/L、大於約450 µmol/L、大於約600 µmol/L、大於約650 µmol/L、大於約700 µmol/L、大於約750 µmol/L、大於約800 µmol/L、大於約900 µmol/L、大於約1000 µmol/L、大於約1100 µmol/L、大於約1200 µmol/L、大於約1300 µmol/L、大於約1400 µmol/L、大於約1500 µmol/L或更大。

在某些實施例中，適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體已診斷患有由PAH缺乏引起之典型苯酮尿症（PKU）。在某些實施例中，適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體具有間隔至少48小時抽取的兩個濃度大於約600 µmol/L之血漿Phe值，且在前12個月具有至少一個大於約600 µmol/L之歷史值。在某些實施例中，適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體能夠在採用本文之方法之後維持基線膳食（例如平均總蛋白質攝入量（完整及醫用）之±25%，無論是Phe限制型或非限制型）。在某些實施例中，若適用，適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體能夠在本文之方法開始之前±8週維持穩定劑量之用於注意力不足/過動症（ADHD）、抑鬱、焦慮或其他精神病症的藥物，且能夠在整個治療過程中維持穩定劑量。在某些實施例中，若適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體具有生育可能性，則其將在採用本文之方法之後12個月使用有效避孕，包含在治療之後的6個月期間使用屏障避孕。

在某些實施例中，適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體患有並非由PAH缺乏引起的PKU。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體存在可偵測的針對如本文中所描述之AAV衣殼蛋白之AAV中和抗體。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體具有人類免疫缺乏病毒（HIV）歷史或其陽性測試結果。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體具有C型肝炎病毒抗體或B型肝炎病毒歷史或其陽性測試結果（定義為B型肝炎表面抗原及B型肝炎核心抗體陽性），或正接受針對B型或C型肝炎之抗病毒療法。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體具有明顯基礎肝病、肝臟移植、遺傳性肝病、肝硬化、NASH或其他肝病之病史。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體具有藥物濫用或酗酒史，此將限制個體參與治療。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體具有＞ 1.5×正常上限（ULN）之ALT及＞ 1.5×ULN之AST。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體具有≥ 1.5×ULN之鹼性磷酸酶值。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體具有≥ 1.5×ULN之總膽紅素值及/或≥1.5×ULN之直接膽紅素值。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體具有≥1.5×ULN之血清肌酐水準。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體具有超出正常範圍的血液學值（例如男性血紅素＜ 11.0g /dL或女性血紅素＜ 10.0 g/dL；白血球＜ 3,000/µL；絕對嗜中性白血球＜ 1,500/µL；血小板＜ 100,000/µL）。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體具有＞ 7.9%之血紅素A1c值或＞ 200 mg/dL之空腹血糖。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體患有類固醇使用禁忌症或在皮質類固醇存在下將惡化的病況。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體先前已接受用於治療任何病況之基因療法。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體在過去30天內使用了左旋多巴（levodopa）。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體存在未經治療或未充分呢治療之活動性感染或需要全身性抗病毒或抗微生物療法之感染。在某些實施例中，不適合於採用本文之方法（包括施用本文中所描述之rAAV）的個體在治療開始之前30天內使用過任何打算治療PKU之藥物，包含使用大型中性胺基酸（large neutral amino acids，LNAA）。

因此，在某些實施例中，本文之方法（包括以本文中所描述之劑量向患有與PAH基因突變相關之疾病或病症的個體施用本文中所描述之rAAV）可使得血漿Phe濃度降低至小於約360 µmol/L（例如小於約340 µmol/L、小於約320 µmol/L、小於約300 µmol/L、小於約280 µmol/L、小於約260 µmol/L、小於約240 µmol/L、小於約220 µmol/L、小於約200 µmol/L、小於約180 µmol/L、小於約160 µmol/L、小於約140 µmol/L或小於約120 µmol/L）。在某些實施例中，本文之方法（包括以本文中所描述之劑量向患有與PAH基因突變相關之疾病或病症的個體施用本文中所描述之rAAV）可使得血漿Phe濃度降低至小於約120 µmol/L（例如小於約110 µmol/L、小於約100 µmol/L、小於約90 µmol/L、小於約80 µmol/L、小於約70 µmol/L、小於約60 µmol/L、小於約50 µmol/L、小於約40 µmol/L、小於約30 µmol/L、小於約20 µmol/L或小於約10 µmol/L。

在某些實施例中，施用如本文中所描述之rAAV的個體之血漿Phe位準的降低可持續至少2週、4週、6週、8週、10週、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、15年或大於15年。免疫抑制劑方案

在某些實施例中，向個體遞送肝定向rAAV可引起對rAAV之免疫反應。在某些實施例中，對rAAV之免疫反應係藉由肝功能測試之提高證明。肝功能測試包含檢定血液中某些酶及蛋白質之水準。本領域中已知各種肝功能測試，包含例如檢定丙胺酸轉胺酶（ALT）、天冬胺酸轉胺酶（AST）、鹼性磷酸酶（ALP）、白蛋白及總蛋白質、膽紅素、γ-麩胺醯基轉移酶（GGT）以及L-乳酸脫氫酶（LD）之水準；及檢定血液凝結時間（在本領域中亦稱為凝血酶原時間（PT））。在某些實施例中，對rAAV之免疫反應係藉由周邊血液中AAV衣殼特異性T細胞之增加證明。如本領域中已知，衣殼特異性CD8+ T細胞反應在4至8週內達到峰值，且與血清ALT及AST之升高及經AAV轉導之細胞之消除同時發生。此外，已顯示對AAV衣殼之體液免疫發生在病毒遞送之2至4週內。在某些實施例中，在個體中觀測到轉胺酶升高（例如ALT及AST之水準升高），且其可為自限性的並且不伴隨額外肝毒性徵象。轉胺酶之升高（例如ALT及AST；稱為轉胺酶升高（transaminitis））可藉由施用抗炎性療法及/或免疫抑制療法（例如免疫抑制劑方案）予以控制。

在某些實施例中，預防性免疫抑制劑方案（例如預防性潑尼松龍方案）係在施用本文之rAAV之前向個體施用。在某些實施例中，預防性免疫抑制劑方案係在施用本文之rAAV之前一天向個體施用。在某些實施例中，預防性免疫抑制劑方案療法係在施用本文之rAAV期間向個體施用。在某些實施例中，預防性免疫抑制劑方案係在施用本文之rAAV之後向個體施用。在某些實施例中，預防性免疫抑制劑方案係在施用本解案之rAAV之前、期間及/或之後向個體施用。本文中所描述之預防性免疫抑制劑方案可限制肝中之免疫反應且維持PAH表現及防止載體損失。

在某些實施例中，免疫抑制劑方案之持續時間及劑量打算覆蓋預期之峰值免疫反應週期（例如病毒遞送之後約8週），之後逐漸減量。本領域中熟習此項技術者（例如主治醫師）將顯而易見，免疫抑制劑方案之施用（包含其逐漸減量）將取決於個體對免疫抑制劑方案之總體耐受性。

本領域熟習此項技術者將能夠容易地確定免疫抑制劑方案之施用途徑。在某些實施例中，免疫抑制劑方案將口服施用。在某些實施例中，免疫抑制劑方案將全身施用（例如經由靜脈內或非經腸途徑）。

適合之免疫抑制劑方案為本領域中已知的，且包含使用皮質類固醇。因此，在某些實施例中，皮質類固醇（例如潑尼松龍）係在施用本文之rAAV之前、期間及/或之後向個體施用。在某些實施例中，皮質類固醇為糖皮質類固醇。皮質類固醇之實例包含但不限於氫化可的松（hydrocortisone）、可的松（cortisone）、倍他米松（ethamethasoneb）、潑尼松（prednisone）、潑尼松龍、曲安西龍（triamcinolone）、甲基潑尼松龍及地塞米松（dexamathasone）。在某些實施例中，潑尼松龍係在施用本文之rAAV之前、期間及/或之後向個體施用。

在某些實施例中，免疫抑制劑方案（例如潑尼松龍方案）係在施用本文之rAAV之前向個體施用。在某些實施例中，免疫抑制劑方案（例如潑尼松龍方案）係在施用本文之rAAV之前至少一天、至少兩天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天、至少七天、至少八天、至少九天或至少十天向個體施用。在某些實施例中，免疫抑制劑方案（例如潑尼松龍方案）係在施用本文之rAAV之前一天向個體施用。

在某些實施例中，免疫抑制劑方案（例如潑尼松龍方案）係持續約20或約21週向個體施用。在某些實施例中，免疫抑制劑方案（例如潑尼松龍方案）係持續至少約一週、至少約兩週、至少約三週、至少約四週、至少約五週、至少約六週、至少約七週、至少約八週、至少約九週、至少約十週、至少約十一週、至少約十二週、至少約十三週、至少約十四週、至少約十五週、至少約十六週、至少約十七週、至少約十八週、至少約十九週、至少約二十週、至少約二十一週或至少約二十二週向個體施用。本領域中熟習此項技術者應瞭解，本文中所描述之免疫抑制劑方案之持續時間可取決於個體對療法之耐受性及或取決於療法時程期間之臨床發展。舉例而言，在某些實施例中，若在免疫抑制劑方案期間之任何時候，個體之肝功能測試展現異常結果（例如展現一或多種肝臟酶之異常血清水準），則免疫抑制劑方案可重新開始及/或經修改以包含持續額外持續時間之額外劑量。在此類實施例中，免疫抑制劑方案之持續時間將延長，例如超出約20週之持續時間。

在某些實施例中，免疫抑制劑方案（例如潑尼松龍方案）係在以潑尼松龍當量描述之劑量下施用。如本文所用，術語「潑尼松龍當量」係指皮質類固醇在向個體施用時產生與某一劑量之潑尼松龍之作用（例如某一劑量之潑尼松龍之免疫抑制作用）實質上相同之作用的劑量。舉例而言，此項技術中已知5 mg劑量之潑尼松龍在向個體施用時引發與0.75 mg之地塞米松實質上相同的作用。如此，本領域中熟習此項技術者容易理解，潑尼松龍當量之5 mg劑量涵蓋5 mg劑量之潑尼松龍或0.75 mg劑量之地塞米松。皮質類固醇當量轉換表可由本領域中熟習此項技術者使用及存取，且可容易地自例如臨床決策支援資源（諸如UpToDate）存取。在某些實施例中，根據如表1中所示之皮質類固醇當量轉換值計算免疫抑制劑方案之持續時間及劑量。表 1 ：皮質類固醇當量劑量

皮質類固醇	當量劑量（mg）
氫化可的松（皮質醇）	20
乙酸可的松	25
潑尼松	5
潑尼松龍	5
甲基潑尼松龍	4
曲安西龍	4
地塞米松	0.75
倍他米松	0.6

在某些實施例中，免疫抑制劑方案（例如潑尼松龍方案）係以某一劑量/天施用。例如，療法可包括以毫克/天計的劑量。在某些實施例中，免疫抑制劑方案（例如潑尼松龍或地塞米松方案）係每天根據基於體重之劑量，例如以根據個體之體重之某一劑量施用。舉例而言，療法可包括以毫克/公斤個體/天計之劑量。

在某些實施例中，免疫抑制劑方案（例如潑尼松龍方案）係以約1毫克/天至約100毫克/天施用。在某些實施例中，免疫抑制劑方案（例如潑尼松龍方案）係以約1毫克/天至約100毫克/天之潑尼松龍當量施用。在某些實施例中，免疫抑制劑方案（例如潑尼松龍方案）係以約1毫克/天、約5毫克/天、約10毫克/天、約15毫克/天、約20毫克/天、約25毫克/天、約30毫克/天、約35毫克/天、約40毫克/天、約45毫克/天、約50毫克/天、約55毫克/天、約60毫克/天、約65毫克/天、約70毫克/天、約75毫克/天、約80毫克/天、約85毫克/天、約90毫克/天、約95毫克/天或約100毫克/天施用。在某些實施例中，免疫抑制劑方案（例如潑尼松龍方案）係以約1毫克/天、約5毫克/天、約10毫克/天、約15毫克/天、約20毫克/天、約25毫克/天、約30毫克/天、約35毫克/天、約40毫克/天、約45毫克/天、約50毫克/天、約55毫克/天、約60毫克/天、約65毫克/天、約70毫克/天、約75毫克/天、約80毫克/天、約85毫克/天、約90毫克/天、約95毫克/天或約100毫克/天之潑尼松龍當量施用。

在某些實施例中，特定劑量之免疫抑制劑方案係根據依序給藥方案施用。在某些實施例中，免疫抑制劑方案係根據依序給藥方案施用。在某些實施例中，免疫抑制劑方案係根據以下依序給藥方案施用：約60毫克/天之潑尼松龍當量，持續約兩週；約40毫克/天之潑尼松龍當量，持續約六週；約30毫克/天之潑尼松龍當量，持續約三週；約20毫克/天之潑尼松龍當量，持續約三週；約10毫克/天之潑尼松龍當量，持續約五週；以及約5毫克/天之潑尼松龍當量，持續約一週。在某些實施例中，持續約一週的約5毫克/天之潑尼松龍當量之最終步驟可持續總共約兩週。在某些實施例中，特定劑量之免疫抑制劑方案係根據依序給藥方案施用。在某些實施例中，潑尼松龍係根據依序給藥方案施用。在某些實施例中，潑尼松龍係根據以下依序給藥方案施用：約60毫克/天，持續約兩週；約40毫克/天，持續約六週；約30毫克/天，持續約三週；約20毫克/天，持續約三週；約10毫克/天，持續約五週；及約5毫克/天，持續約一週。在某些實施例中，持續約一週的約5毫克/天之最終步驟可持續總共約兩週。

在某些實施例中，個體在本文中所描述之預防性免疫抑制劑方案期間經歷AST及/或ALT位準升高，該等位準大於正常上限（ULN）之2倍。在此類實施例中，免疫抑制劑方案將重新遞增或以某一劑量重新開始。

因此，在某些實施例中，其中個體在預防性潑尼松龍依序給藥方案（例如約60毫克/天，持續兩週；約40毫克/天，持續六週；約30毫克/天，持續三週；約20毫克/天，持續三週；約10毫克/天，持續五週；及約5毫克/天，持續一週或兩週）期間經歷AST及/或ALT之位準升高，該等位準大於正常上限（ULN）之2倍，潑尼松龍將根據相同依序給藥方案重新遞增或以60毫克/天重新開始且隨後再次減量，該相同依序給藥方案為例如約60毫克/天，持續兩週；約40毫克/天，持續六週；約30毫克/天，持續三週；約20毫克/天，持續三週；約10毫克/天，持續五週；及約5毫克/天，持續一週或兩週。

在某些實施例中，個體在本文中所描述之預防性免疫抑制劑方案結束之後經歷AST及/或ALT位準升高，該等位準大於正常上限之2倍。在此類實施例中，免疫抑制劑方案將根據修改方案重新開始。

因此，在某些實施例中，其中個體在預防性潑尼松龍依序給藥方案（例如約60毫克/天，持續兩週；約40毫克/天，持續六週；約30毫克/天，持續三週；約20毫克/天，持續三週；約10毫克/天，持續五週；及約5毫克/天，持續一週或兩週）結束之後經歷AST及/或ALT之位準升高，該等位準大於正常上限（ULN）之2倍，潑尼松龍將根據以下給藥方案重新開始：約60毫克/天，持續兩週或直至ALT及/或AST位準下降至個體基線位準以下或左右為止；約40毫克/天，持續兩週；約30毫克/天，持續兩週；約20毫克/天，持續兩週；約10毫克/天，持續兩週；及約5毫克/天，持續兩週。在某些實施例中，直至ALT及/或AST位準下降至個體基線位準才開始持續兩週的低於約60毫克/天潑尼松龍之減量，其限制條件為個體對該方案耐受。在某些實施例中，約60毫克/天潑尼松龍劑量之持續時間不超過四週。在其中ALT及/或AST水準在60毫克/天或40毫克/天下持續上升的某些實施例中，可靜脈內施用甲基潑尼松龍。其他伴隨療法

在某些實施例中，個體將繼續其往常之膳食方案。在某些實施例中，將建立基線膳食，且可將其定義為平均總蛋白質攝入量（完整及醫用）之±25%，無論是Phe限制型或非限制型。在某些實施例中，將在施用本文之rAAV後維持基線膳食。在某些實施例中，可基於以下修改膳食：(1)在第8週，當前8週中之三個Phe值≤ 360 µmol/L時；及/或(2)在第8週前，當前8週中之三個Phe值（間隔至少一週量測）＜ 120 µmol/L時。

在某些實施例中，在研究記入時服用用於治療ADHD、抑鬱、焦慮或其他精神病症之藥物的個體必須在施用本文之rAAV之前≥8週維持穩定劑量，且可在整個研究中保持相同劑量方案，除非醫師由於醫學原因而另有判定。

在某些實施例中，除非認為血漿Phe濃度對於個體而言不安全，且確定此治療為修改膳食之後在醫學上仍必要，否則可禁止使用任何用於PKU之藥物，包含Kuvan®、LNAA及Palynziq™。IV. 製備 rAAV 之系統及方法

用於本文中所揭示之方法中之rAAV可使用任何本領域公認之方法產生。下文描述適用於產生rAAV之封裝系統。使用此類封裝系統之方法為本領域眾所周知。

在某些實施例中，適用於產生rAAV之封裝系統包括：編碼一或多種AAV Rep蛋白的第一核苷酸；編碼如本文中所揭示之AAV中之任一者之衣殼蛋白的第二核苷酸；及包括如本文中所揭示之rAAV基因體序列中之任一者的第三核苷酸序列，其中封裝系統在細胞中具操作性以將轉移基因體包裹於衣殼中而形成AAV。在某些實施例中，封裝系統包括第一載體，其包括編碼一或多種AAV Rep蛋白之第一核苷酸序列及編碼AAV衣殼蛋白之第二核苷酸序列，以及第二載體，其包括有包括rAAV基因體之第三核苷酸序列。如在如本文中所描述之封裝系統之情形下所使用，「載體」係指一種核酸分子，其為用於將核酸引入細胞之媒劑（例如質體、病毒、黏質體、人工染色體等）。

任何AAV Rep蛋白皆可用於本文中所揭示之封裝系統中。在封裝系統之某些實施例中，Rep核苷酸序列編碼AAV2 Rep蛋白。適合之AAV2 Rep蛋白可包含但不限於Rep 78/68或Rep 68/52。在封裝系統之某些實施例中，編碼AAV2 Rep蛋白之核苷酸序列包括編碼與SEQ ID NO: 22之AAV2 Rep胺基酸序列具有最小序列一致性百分比之蛋白質的核苷酸序列，其中跨AAV2 Rep蛋白之胺基酸序列之長度的最小序列一致性百分比為至少70%（例如至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%）。在封裝系統之某些實施例中，AAV2 Rep蛋白具有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。

在封裝系統之某些實施例中，封裝系統進一步包括第四核苷酸序列，其包括一或多種輔助病毒基因。在某些實施例中，第四核苷酸序列包括腺病毒E2、E4及VA基因。在封裝系統之某些實施例中，封裝系統進一步包括第三載體（例如輔助病毒載體），其包括第四核苷酸序列。第三載體可為獨立的第三載體、與第一載體整合在一起或與第二載體整合在一起。

在封裝系統之某些實施例中，輔助病毒係選自由以下組成之群組：腺病毒、疱疹病毒（包含單純疱疹病毒（HSV））、痘病毒（諸如痘瘡病毒）、巨細胞病毒（CMV）及桿狀病毒。在封裝系統之某些實施例中，其中輔助病毒為腺病毒，腺病毒基因體包括一或多種選自由以下組成之群組之腺病毒RNA基因：El、E2、E4及VA。在封裝系統之某些實施例中，其中腺病毒基因體包括一或多種選自由以下組成之群組之腺病毒RNA基因：E2、E4及VA。在封裝系統之某些實施例中，其中輔助病毒為HSV，HSV基因體包括選自由以下組成之群組之HSV基因中之一或多者：UL5/8/52、ICPO、ICP4、ICP22及UL30/UL42。

在封裝系統之某些實施例中，第一、第二及/或第三載體包含於一或多個質體內。在某些實施例中，第一載體及第三載體包含於第一質體內。在某些實施例中，第二載體及第三載體包含於第二質體內。

在封裝系統之某些實施例中，第一、第二及/或第三載體包含於一或多種重組輔助病毒內。在某些實施例中，第一載體及第三載體包含於重組輔助病毒內。在某些實施例中，第二載體及第三載體包含於重組輔助病毒內。

在某些實施例中，封裝系統包括：編碼一或多種AAV Rep蛋白之第一核苷酸序列；編碼本文中所描述之AAV中之任一者之衣殼蛋白的第二核苷酸序列；包括本文中所描述之AAV中之任一者之rAAV基因體序列的第三核苷酸序列；及視情況選用之包括一或多種輔助病毒基因（例如腺病毒E2、E4及VA基因）之第四核苷酸序列。

在某些實施例中，rAAV可使用如下方法產生，該方法包括在可操作以將rAAV基因體包裹於AAV衣殼中以形成rAAV的條件下用如本文中所描述之封裝系統轉染或轉導細胞。用於rAAV之重組製備之例示性方法包含瞬時轉染（例如用一或多種轉染質體，其含有如本文中所描述之第一及第二以及視情況選用之第三載體）、病毒感染（例如用一或多種重組輔助病毒，諸如腺病毒、痘病毒（諸如痘瘡病毒）、疱疹病毒（包含HSV、巨細胞病毒或桿狀病毒，其含有如本文中所描述之第一及第二以及視情況選用之第三載體）及穩定的生產細胞株轉染或感染（例如用穩定生產細胞，諸如哺乳動物或昆蟲細胞，其含有如本文中所描述之編碼一或多種AAV Rep蛋白之Rep核苷酸序列及/或編碼一或多種衣殼蛋白之Cap核苷酸序列，及用以質體或重組輔助病毒形式遞送的如本文中所描述之轉移基因體）。V. 額外實施例

亦藉由以下實施例描述本文。實施例1. 一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約2e13 vg/kg至約2e14 kg/vg之劑量向個體施用rAAV，其中該rAAV包括：(a) AAV衣殼，其包括衣殼蛋白；及(b)轉移基因體，其包括以緘默方式改變之PAH編碼序列，其中該以緘默方式改變之PAH編碼序列包括SEQ ID NO: 1之核苷酸序列。實施例2. 如實施例1之方法，其中轉移基因體進一步包括與以緘默方式改變之PAH編碼序列可操作地連接的轉錄調節元件。實施例3. 如實施例2之方法，其中該轉錄調節元件能夠介導肝細胞、腎細胞或腦、腦下垂體、腎上腺、胰腺、膀胱、膽囊、結腸、小腸或乳房中之細胞中的轉錄。實施例4. 如實施例2之方法，其中該轉錄調節元件包括人類肝控制區1（HCR1），其包括SEQ ID NO: 2之核苷酸序列。實施例5. 如實施例2之方法，其中該轉錄調節元件包括人類α1-抗胰蛋白酶（hAAT）啟動子，其包括SEQ ID NO: 3之核苷酸序列。實施例6. 如實施例2之方法，其中該轉錄調節元件包括SV40內含子，其包括SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。實施例7. 如實施例2之方法，其中該轉錄調節元件包括SEQ ID NO: 5之核苷酸序列。實施例8. 如前述實施例中任一項之方法，其中該轉移基因體進一步包括在該PAH編碼序列之3'端的SV40聚腺苷酸化序列，其中該SV40聚腺苷酸化序列包括SEQ ID NO: 6之核苷酸序列。實施例9. 如前述實施例中任一項之方法，其中轉移基因體包括SEQ ID NO: 7之核苷酸序列。實施例10. 如前述實施例中任一項之方法，其中轉移基因體進一步包括該於基因體5’之5’反向末端重複（5’ ITR）核苷酸序列，及於該基因體3’之3’反向末端重複（3’ ITR）核苷酸序列。實施例11. 如實施例10之方法，其中該5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 8具有至少95%序列一致性，且該3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 9具有至少95%序列一致性。實施例12. 如前述實施例中任一項之方法，其中轉移基因體包括SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。實施例13. 如前述實施例中任一項之方法，其中該AAV衣殼包括：衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R。實施例14. 如前述實施例中任一項之方法，其中該AAV衣殼包括：衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R。實施例15. 如前述實施例中任一項之方法，其中該AAV衣殼包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列。實施例16. 如前述實施例中任一項之方法，其中該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列組成，該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列組成，及/或該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列組成。實施例17. 一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約2e13 vg/kg至約2e14 kg/vg之劑量向該個體施用rAAV，其中該rAAV包括：(a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及(b)轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。實施例18. 如實施例17之方法，其中該AAV衣殼包括：衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R。實施例19. 如實施例17之方法，其中該AAV衣殼包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列。實施例20. 如實施例17之方法，其中：該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列組成；該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列組成；及/或該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列組成。實施例21. 如前述實施例中任一項之方法，其中該劑量為約2e13 vg/kg。實施例22. 如前述實施例中任一項之方法，其中該劑量為約6e13 vg/kg。實施例23. 如前述實施例中任一項之方法，其中該劑量為約8e13 vg/kg。實施例24. 如前述實施例中任一項之方法，其中該劑量為約1e14 vg/kg。實施例25. 如前述實施例中任一項之方法，其中該劑量為約2e14 vg/kg。實施例26. 如前述實施例中任一項之方法，其中該rAAV係以單次劑量施用。實施例27. 如實施例1至25中任一項之方法，其中該rAAV係以多次劑量施用。實施例28. 如前述實施例中任一項之方法，其中該rAAV係靜脈內施用。實施例29. 如前述實施例中任一項之方法，其中該個體為小兒個體。實施例30. 如實施例1至28中任一項之方法，其中該個體為成人個體。實施例31. 如前述實施例中任一例之方法，其中在施用該rAAV之前、期間及/或之後向該個體施用預防性抗發炎療法。實施例32. 如實施例31之方法，其中在施用該rAAV之前，視情況在施用該rAAV之前向該個體施用預防性抗發炎療法1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。實施例33. 如實施例31之方法，其中向該個體持續施用預防性抗發炎療法至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20週。實施例34. 如實施例31至33中任一項之方法，其中該抗發炎療法為糖皮質類固醇。實施例35. 如實施例34之方法，其中該糖皮質類固醇為潑尼松龍。實施例36. 如實施例35之方法，其中潑尼松龍係以約1至約100毫克/天，視情況約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100毫克/天施用。實施例37. 如實施例35之方法，其中潑尼松龍係根據以下依序給藥方案施用：60毫克/天，持續兩週；40毫克/天，持續六週；30毫克/天，持續三週；20毫克/天，持續三週；10毫克/天，持續五週；及5毫克/天，持續一週。實施例38. 如前述實施例中任一項之方法，其中該與PAH基因突變相關之疾病或病症為苯酮尿症（PKU）。實施例39. 一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約2e13 vg/kg之劑量向個體靜脈內施用rAAV，其中該rAAV包括：(a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及(b)轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。實施例40. 一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約6e13 vg/kg之劑量向個體靜脈內施用rAAV，其中該rAAV包括：(a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及(b)轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。實施例41. 一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約8e13 vg/kg之劑量向個體靜脈內施用rAAV，其中該rAAV包括：(a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及(b)轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。實施例42. 一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約1e14 vg/kg之劑量向個體施用rAAV，其中該rAAV包括：(a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及(b)轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。實施例43. 一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約2e14 vg/kg之劑量向個體施用rAAV，其中該rAAV包括：(a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及(b)轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。VI. 實例

以下實例係以說明而非限制之方式提供。實例 1 ：人類 PAH 轉移載體

如圖 1 中所示之AAV基因轉移載體pHMI-hPAH-TC-025自5'至3'包括以下基因元件：截短5' ITR元件、人類肝控制區1（HCR1）、人類α1-抗胰蛋白酶（hAAT）啟動子、SV40內含子、以緘默方式改變之人類PAH編碼序列、SV40聚腺苷酸化序列及經修飾3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表2中。截短5' ITR允許載體在轉導至細胞中之後形成雙股AAV基因體。此載體能夠將人類PAH蛋白表現於人類肝細胞中。表 2 ：人類 PAH 轉移載體 pHMI-hPAH-TC-025 中之基因元件

基因元件	SEQ ID NO:
截短的5' ITR元件	8
人類HCR1	2
人類α1-抗胰蛋白酶（hAAT）啟動子	3
SV40內含子	4
包括人類HCR1及hAAT啟動子的轉錄調節區	5
密碼子改變之人類PAH編碼序列	1
SV40聚腺苷酸化序列	6
經修飾3' ITR元件	9
轉移基因體（自HCR1至聚腺苷酸化序列）	7
轉移基因體（自5' ITR至3' ITR）	10
轉移載體之完整序列	23

實例 2 ： PAH 轉移載體在 PKU 之小鼠模型中的功效

將Pah^-/- （ PAH^enu2 ）小鼠圈養於在隔離件中具有接觸性墊料的透明聚碳酸酯籠子。隨意向動物提供Picolab小鼠飲食5058。隨意提供用1 N HCl酸化至2.5至3.0之目標pH的泉水或自來水。在補充有35 mM NaCl、1%蔗糖及0.05%Pluronic F-68之PBS（含Ca及Mg）中製備封裝於AAVHSC15衣殼中的載體。經由尾部靜脈靜脈內注射調配物。

在施用PAH轉移載體之後（0週：施用之前）的每週藉由臉部靜脈穿刺或剪尾收集血液樣本。使樣本在室溫凝結至少30分鐘，在環境溫度以最低1000×g離心10分鐘，且提取血清樣本。將血清樣本儲存於-70℃。藉由串聯質譜法量測血清苯丙胺酸及酪胺酸位準。

為了收集組織樣本，對動物進行生理鹽水心臟灌注。將肝（尾葉）、腎（左）、腦、心臟及肌肉（四頭肌）組織在液氮中速凍且儲存於-70℃。將經速凍組織在研缽及研杵中之液氮中研磨成粉末，且分成等分試樣以藉由qPCR測試PAH表現，以用於載體基因體生物分佈。

為了檢查包括封裝在AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025的rAAV之長期功效，將每公斤體重2.6×10¹³ 個載體基因體之單次劑量施用於雄性Pah^-/- （ PAH^enu2 ）小鼠，且將每公斤體重6×10¹³ 個載體基因體之單次劑量施用於雌性Pah^-/- （ PAH^enu2 ）小鼠。如圖 2A 及圖 2B 中所示，施用含pHMI-hPAH-TC-025之rAAV使得Phe水準在一週內顯著降低。此降低在雄性小鼠中持續至少48週，且在雌性小鼠中持續至少46週。相對於未施用rAAV載體之小鼠，藉由ddPCR在注射後4週收集的此等小數之肝樣本中觀測到PAH mRNA之增加。亦藉由質譜法在肝樣本中偵測到PAH酶活性之增加。

進一步評定不同劑量之上文所描述之含pHMI-hPAH-TC-025之rAAV的功效。將每公斤體重2.6×10¹¹ 個、2.6×10¹² 個或2.6×10¹³ 個載體基因體之單次劑量施用於雄性小鼠及雌性Pah ^-/- （PAH ^enu2 ）小鼠，且量測Phe及Tyr之血清水準。如圖 3A 至圖 3D 中所示，相比兩個較低劑量，每公斤體重2.6×10¹³ 個載體基因體之劑量更顯著地降低Phe位準及提高Tyr位準，且維持男性個體及女性個體兩者之檢查時間期間血清Phe位準之完全降低。實例 3 ： PAH 轉移載體之臨床研究

此實例描述用於1期/2期隨機化、並行控制、劑量累增研究之流程，其用以評估包括封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體的rAAV在患有PAH缺乏症之成人苯酮尿症（PKU）個體中的安全性及功效。

個體將在研究記入之前經歷篩選評定，篩選週期長達45天。在施用封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體之前，個體將獲准進入臨床研究單位，且將開始預防性類固醇施用。將在臨床研究單位環境中進行一次大約120分鐘的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體的施用。個體可在於臨床研究單位中施用封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體後觀測至少24小時之後回家，限制條件為其在臨床上穩定。在篩選週期期間及施用封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體之後，個體將繼續其往常之膳食方案（無論是Phe限制型或非限制型膳食）。

在施用封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體後，個體將在此研究中經歷52週之安全性及功效觀測。將研究至多三個劑量水準之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體。預期所有劑量均提供血漿Phe濃度之臨床上相關之降低。在既定劑量水準下，最初將徵選2名個體並進行給藥。每組中的前2名個體之給藥將錯開，每一個體之給藥之間間隔至少21天。在向彼組中之後續個體給藥之前，將審查每一個體之至少21天安全性隨訪及Phe濃度資料。

在評估組中前2名個體之至少21天的資料後，可做出以下任一決策：(1)遞增到下一劑量位準，(2)將另一個體加入同一組中，或(3)擴大所選劑量之組，以徵選至多9名額外個體。隨機分配6名個體以接受封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體，且將3名個體隨機分配至同時存在的延遲治療對照組。

關於劑量遞增及擴展的決策將基於血漿Phe濃度相對於PKU治療指南之安全性及變化。治療指南將120-360 μmol/L之範圍描述為不需要治療之PAH缺乏症，且無高苯丙胺酸血症（HPA）或PKU之個體的血液Phe（例如血漿Phe）之正常範圍為58 ± 14 （SD） μmol/L。納入及排除準則

將根據表3中所闡述之納入及排除準則徵選適合於研究之個體。表 3 ：納入及排除準則

納入準則：

● 個體能夠理解研究之目的及風險，願意提供知情同意書，且能夠遵守所有研究程序及4年之長期隨訪。 ● 在知情同意時為18至55歲的成年人。 ● 診斷患有典型PKU（由PAH缺乏引起）。 ● 在篩選週期期間間隔至少48小時抽取兩個濃度≥600 μmol/L的血漿Phe值，且過去12個月中具有至少一個≥ 600 μmol/L之歷史值。 ● 個體具有在施用封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體之後維持其基線膳食（平均總蛋白質攝入量（完整及醫學）之±25%，無論是Phe限制型或非限制型，如在45天篩選週期期間所建立）的能力及意願，除非另有指導。 ● 若適用，在納入之前能夠維持＞ 8週的穩定劑量之用於注意力不足/過動症（ADHD）、抑鬱、焦慮或其他精神病症的藥物，且願意在整個研究中維持穩定劑量，除非醫學上指示進行改變。 ● 具有生育能力之男性及女性必須願意在施用封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體後12個月使用有效避孕，包含在施用後6個月期間使用屏障避孕（男用或女用保險套）。

排除準則：

● 個體患有並非由PAH缺乏引起之PKU。 ● 存在抗AAVHSC15中和抗體（滴度＞1:5）。 ● 具有人類免疫缺乏病毒（HIV）歷史或其陽性測試結果。 ● 具有C型肝炎病毒抗體或B型肝炎病毒歷史或其陽性測試結果（定義為B型肝炎表面抗原及B型肝炎核心抗體陽性），或當前正用針對B型或C型肝炎之抗病毒療法進行治療。 ● 具有將如研究人員確定排除參與研究的顯著基礎肝病、肝移植、遺傳性肝病、肝硬化、NASH或其他肝病之病史。 ● 具有將如研究人員確定限制參與研究的藥物濫用史或酗酒史，或超過定義如下之飲酒程度的個體：男性任何單日飲酒＞ 4杯或每週飲酒＞ 14杯；女性任何單日飲酒＞ 3杯或每週飲酒＞ 7杯 ● ALT ＞ 1.5×ULN，且AST ＞ 1.5×ULN。 ● 鹼性磷酸酶＞ 1.5×ULN。 ● 總膽紅素＞ 1.5×ULN，直接膽紅素≥ 1.5×ULN。 ● 血清肌酐＞ 1.5×ULN。 ● 血液學值超出正常範圍（男性血紅素＜ 11.0 g/dL或女性血紅素＜ 10.0 g/dL；白血球（WBC）＜ 3,000/μL；絕對嗜中性白血球＜ 1500/μL；血小板＜ 100,000/μL）。 ● 血紅素A1c ＞ 7.9%或空腹血糖＞ 200 mg/dL。 ● 在篩選時研究人員認為具有任何臨床上顯著異常之實驗室結果。 ● 如由研究人員評定及確定，具有皮質類固醇使用禁忌症或在皮質類固醇存在下可能惡化之病況。 ● 先前接受過治療任何病況之基因療法。 ● 個體在研究週期期間已懷孕、哺乳或受孕。 ● 預定或預期在針對此研究之研究性基因療法輸注之後12週內進行大手術。 ● 在過去30天使用左旋多巴。 ● 在篩選之前30天內使用任何研究性產品。 ● 當前已納入任何其他研究性研究。 ● 在篩選週期期間的任何時候存在未治療或未充分治療之活動性感染或需要全身性抗病毒或抗微生物療法之感染。 ● 在施用研究藥物之前30天內使用任何旨在治療PKU之藥物，包含使用大型中性胺基酸（LNAA）。 ● 當前身體質量指數（BMI）≥ 35 kg/m² （排除II類及III類肥胖症）。 ● 體重＞ 100 kg。 ● 具有臨床上顯著之醫學病況，研究人員認為其將帶來不必要之風險（包含諸如HIV之慢性感染或其他慢性疾病的病史）、限制個體參與研究或影響解釋研究結果之能力。 ● 患有惡性病或惡性病史，但成功治療皮膚之基底細胞癌或鱗狀細胞癌。 ● 患有將不允許潛在個體在研究過程期間完成隨訪檢查或研究人員認為使潛在個體不適合進行研究的任何其他病況。

研究產品、劑量及施用模式

將在臨床研究單位環境中經大約2至4小時靜脈內施用封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體。要在研究中研究的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體的3組劑量水準為：(1) 2e13 vg/kg；(2) 6e13 vg/kg；(3)8e13 vg/kg；及(4)1e14 vg/kg。劑量之上限將為2e14 vg/kg。圖 4 為展示劑量組1至3的研究設計示意圖。

在施用封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體之前一天，個體將開始預防性口服潑尼松龍療法，該療法將如下施用20週： - 潑尼松龍60毫克/天×2週 - 潑尼松龍40毫克/天×6週 - 潑尼松龍30毫克/天×3週 - 潑尼松龍20毫克/天×3週 - 潑尼松龍10毫克/天×5週 - 潑尼松龍5毫克/天×1週（研究人員可基於臨床判斷酌情使5毫克/天劑量持續總共2週（亦即再延長1週））

若個體在預防性潑尼松龍方案期間經歷升高之AST及/或ALT ＞ 2×ULN，則將根據上文之時程使類固醇重新遞增或以60毫克/天重新開始，且隨後再次減量。

若個體在預防性潑尼松龍方案結束後經歷升高之AST及/或ALT ＞ 2×ULN，則將根據以下時程重新開始使用類固醇，其中研究人員（諮詢試驗委託者之醫學監測人員或指定人員）允許基於實驗室參數、個體病史及臨床病程及/或個體對方案之耐受進行修改。 - 潑尼松龍60毫克/天×2週或直至ALT及AST水準下降至≤個體之基線位準為止 - 潑尼松龍40毫克/天×2週 - 潑尼松龍30毫克/天×2週 - 潑尼松龍20毫克/天×2週 - 潑尼松龍10毫克/天×2週 - 潑尼松龍5毫克/天×2週

直至ALT及AST下降至基線（施用前）位準之前不應開始低於60毫克/天之潑尼松龍減量，限制條件為個體對該方案耐受。60毫克/天之劑量可持續至多4週，或若ALT/AST再次上升及/或研究人員諮詢試驗委託者之醫學監測人員或指定人員進行判斷來另外確定有所需要，則劑量再次遞增至彼位準。在ALT/AST再次降低及/或臨床情況得到控制之後，則可繼續進行後續減量。60毫升/天之劑量不應超過4週。

由研究人員諮詢試驗委託者之醫學監測人員或指定人員而酌情考慮，認為轉胺酶值在60毫克/天或40毫克/天繼續上升之個體應用靜脈內甲基潑尼松龍代替口服潑尼松龍進行治療。

若研究人員確定應代替口服潑尼松龍而施用口服潑尼松，則研究人員必須與試驗委託者之醫學監測人員或指定人員討論基本原則且獲得試驗委託者之醫學監測人員或指定人員允許使用此替代類固醇的批准。預期潑尼松之給藥及減量時程應與潑尼松龍相同。潑尼松代替潑尼松龍之基本原則、批准及施用必須記載於該個體之研究記錄。

若個體在接受5毫克/天或10毫克/天之潑尼松龍時發生伴隨發熱之急性疾病，則應將劑量加倍，保持48小時，隨後恢復先前之劑量及減量時程。

在個體接受類固醇（及類固醇停用之後至多6個月）經歷大手術或經歷重大外傷或疾病之任何時候，應根據標準照護施用應激類固醇。將告知個體類固醇之風險，包含HPA軸抑制及其他類固醇相關副作用。

目的在於使研究人員及個體能夠遵循如流程中所描述之類固醇方案。然而，已認識到可能發生不常見之情況，其中降低或停用類固醇劑量對個體而言最為有利。類固醇方案旨在抑制或控制對基因療法之免疫反應，從而保留肝細胞中之基因表現。解決LFT增加之類固醇方案之另一個潛在目標在於藉由應對肝炎（在嚴重時）來保護肝細胞。若研究人員考慮在臨床重要事件（諸如類固醇相關之精神病或疱疹性角膜潰瘍）中降低類固醇之劑量或停用類固醇，則需要考慮此等因素。若研究人員發現需要降低或停用類固醇，則在研究人員修改類固醇給藥之前必須諮詢試驗委託者之醫學監測人員或指定人員（除非在立即危及生命之情形中，時間不允許）。伴隨療法

在篩選週期期間，個體將繼續其往常之膳食方案。將在篩選週期期間建立基線膳食，將其定義為平均總蛋白質攝入量（完整及醫用）之±25%，無論是Phe限制型或非限制型。將在施用封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體後維持基線膳食。可由研究人員、現場營養師酌情且諮詢試驗委託者之醫學監測人員或被指派者而基於以下指南提出修改膳食之建議： - 在第8週，當前8週期間之三個Phe值≤ 360 µmol/L時 - 在第8週之前，當前8週期間之三個Phe值（間隔至少一週量測）＜ 120 µmol/L時

在研究記入時服用藥物以治療ADHD、抑鬱、焦慮或其他精神病症之個體必須在施用封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體之前保持穩定劑量≥ 8週，且必須在整個研究中繼續保持相同劑量方案，除非確定出於醫學原因而應作出改變。

除非認為血漿Phe濃度對於個體而言不安全，且確定此治療為修改膳食之後在醫學上仍必要，否則可禁止使用任何用於PKU之藥物，包含Kuvan®、LNAA及Palynziq™。目標及試驗指標

研究之主要目標在於評估單次劑量之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體在向患有苯丙胺酸羥化酶（PAH）缺乏症之個體施用時的安全性、耐受性及功效。

主要安全性評估指標為治療中出現之不良事件（TEAE）及嚴重TEAE之發生率及嚴重度。主要功效評估指標為在施用封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體後24週持續血漿Phe濃度≤ 360 μmol/L的發生率。持續血漿Phe濃度定義為16週與24週之間的至少兩個血漿Phe量測值≤ 360 μmol/L。

研究之次要目標在於評估封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體相對於PKU治療指南對血漿苯丙胺酸（Phe）濃度之效應，以評定反應之耐久性，且表徵在施用封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體之後載體及免疫反應之存在。

關鍵次要評估指標為處理後24週時血漿Phe濃度之量測。額外次要評估指標包含： - 在研究期間之每一時刻達到≤ 360 μmol/L之血漿Phe濃度的發生率 - 在研究期間之每一時刻達到≤ 120 μmol/L之血漿Phe濃度的發生率 - 血液中載體DNA之存在的評定 - 尿液、糞便及唾液中之載體脫落的評定 - 抗AAVHSC15抗體（IgG及中和抗體）、抗PAH轉殖基因抗體滴度及細胞毒性T淋巴球反應（ELISPOT）之量測。 - 安全性及耐受性（包含劑量限制性毒性之發生率）結果

第1組（低劑量）中之兩名患者及第2組（中等劑量）中之一名患者接受封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體。來自第1組及第2組之初步安全性資料顯示，封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體之施用具有良好耐受性。圖 5A 至圖 5C 展示三名經給藥患者之資料。第2組中之第一患者指示了劑量-反應效應，其中觀測到苯丙胺酸（Phe）水準相對於基線之降低（圖 5A ）、酪胺酸（Tyr）之增加（圖 5B ）及Phe/Tyr比之降低（圖 5C ），暗示酶活性之增加。Phe為PKU之可註冊評估指標，Tyr為Phe代謝之產物及神經傳遞素之前驅體，且Phe/Tyr比為PKU之臨床上相關診斷性量測。

未觀測到治療中出現之不良事件（TEAE）或嚴重TEAE。所有患者之ALT（丙胺酸胺基轉移酶）及AST（天冬胺酸胺基轉移酶）水準仍保持在正常範圍內。第1組之安全性概況使得劑量累增至第2組。

相較於第1組，第2組中給藥之第一患者分別在第1週及第4週經歷相對於基線35%及48%之Phe降低，其通常不會在第10週及第12週顯示Phe降低（圖 5A ）。在圖5A中，患者1之平均治療前空腹Phe濃度以µmol/L計為1,187（n=7次量測）；患者2為1,178（n=4次量測）；且患者3為779（n=5次量測）。結果與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體之施用的劑量-反應效應一致。根據流程，患者基線定義為給藥之前一天。第2組中給藥之第一患者亦分別在第1週及第4週顯示72%及85%之Tyr位準增加，表明PAH酶活性增加（圖 5B ）。在圖5B中，患者1之平均治療前空腹Tyr濃度以µmol/L計為36.54（n=7次量測）；患者2為77.08（n=4次量測）；且患者3為49.00（n=5次量測）。另外，患者分別自基線至第1週及第4週經歷Phe/Tyr比之62%降低及72%降低（圖 5C ）。所有患者均報告治療前及治療後維持一致之蛋白質攝入量。在圖5C中，患者1之平均治療前空腹Phe/Tyr比例位準為32.8（n=7次量測）；患者2為22.1（n=4次量測）；且患者3為16.3（n=5次量測）。結果

對上述流程進行修改，使得第3組經施用1e14 vg/kg之劑量之AAV載體，而非8e13 vg/kg。因此，根據如下三個給藥組（每組兩名患者）將封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體靜脈內施用於六名患者：(1)低劑量組：2e13 vg/kg；(2)中等劑量組：6e13 vg/kg；及(3)高劑量組：1e14 vg/kg。

表4展示每一患者之基線特性之概述。表 4 ：患者基線特性

組別（劑量水準）	患者編號	性別	年齡	基線Phe（µmol / L）	給藥後週數	預先存在之基礎免疫病況
第1組（低劑量）	1	F	36	1140	52 （研究結束）
2	M	49	1020	52 （研究結束）
第2組（中等劑量）	3	M	24	1010	48
4	F	21	1060	44	哮喘、季節性過敏
第3組（高劑量）	5	F	31	1660	28	哮喘、濕疹、食物過敏、環境過敏
6	M	33	1060	13

圖6至圖11展示每一個別患者之資料。圖6、圖7、圖8、圖9、圖10及圖11為分別展示患者1、2、3、4、5及6的血漿Phe隨時間變化之位準的圖表。如下得出Phe、Tyr及Phe與Tyr比（P/T）相對於基線之平均變化百分比（CFB%）值：對於每一個體，藉由對所有基線後值求和及除以訪視總數目來得出每一分析物的平均基線後值。隨後藉由自每一分析物之平均基線後值減去基線值來計算平均基線後變化。對於每一分析物，藉由用平均基線後值除以基線值且乘以100來得出相對於基線之平均變化百分比（CFB%）。如下得出完整蛋白質、總蛋白質、Phe攝入量及Tyr攝入量之膳食平均CFB%值：對於每一個體，藉由對所有基線後值求和及除以訪視總數目來得出每一營養素的平均基線後值。隨後藉由自每一營養素之平均基線後值減去基線值來計算平均基線後變化。對於每一營養素，藉由將平均基線後改變值除以基線值且乘以100來得出平均CFB%。

如圖6及圖7中所示，未分別觀測到患者1及2之血漿Phe之有意義降低。

如圖8中所示，患者3之平均CFB%顯示血漿Phe之48.6%降低、酪胺酸之81.1%增加及Phe與Tyr比之70.8%降低。不受任何理論束縛，此指示具有PAH酶活性及更正常之代謝。

如圖9中所示，未觀測到患者4的血漿Phe位準之降低。儘管平均CFB%顯示血漿Phe之13%增加，但此患者經歷131.1%之酪胺酸之急劇平均CFB%增加及45.5%之Phe與Tyr比之降低。不受任何理論束縛，此指示PAH酶活性足以提高酪胺酸，但不足以降低Phe。**指示此患者在第36週之後開始使用額外PKU藥物。

如圖10中所示，患者5之平均CFB%顯示血漿Phe之10.8%降低、酪胺酸之22.6%增加及Phe與Tyr比之25.4%降低。

如圖11中所示，觀測到患者6之血漿Phe之明顯降低。患者6之平均CFB%顯示血漿Phe之31.4%降低、酪胺酸之40.3%增加及Phe與Tyr比之52.4%降低。不受任何理論束縛，此指示具有PAH酶活性及更正常之代謝。**指示患者6為等級1，此係基於高於ULN之基線ALT值。

在圖6至圖11中，WNL表示在參考實驗室之丙胺酸胺基轉移酶（ALT）水準正常範圍內，且ULN表示參考實驗室之ALT水準之正常上限。P/T表示Phe/Tyr比，CFB表示後一值相對於基線之變化，且*指示患者預先存在免疫病況。ALT等級係基於常見不良事件術語評定準則（CTCAE）版本5。

圖12為展示患者3及6之血漿Phe隨時間變化之位準的圖表，且展示此等患者之Phe降低具有類似軌跡。

圖13為展示第1組中之患者血漿Phe位準隨時間相對於基線的變化百分比（CFB%）的圖表。

圖14為展示第2組及第3組中之患者之血漿Phe位準隨時間相對於基線的變化百分比（CFB%）的圖表。第1組之患者與第2組及第3組之患者之間的平均CFB%比較顯示，在較高劑量下觀測到顯著血漿Phe降低（p＜0.004；使用重複量測MANOVA/回歸分析進行第1組與第2組及第3組之事後比較）。

在圖13及圖14中，藉由首先計算所有個體每次訪視時之CFB PHE%來進行分析。隨後使用考慮到由多個隨訪引起的個體相關性之重複量測回歸比較各組之間的CFB%，其中CFB%作為因變數且包含訪視之組、基線PHE值及研究天數作為自變數。

相較於低劑量之第1組，在中等劑量及高劑量組中觀測到血漿Phe位準之顯著降低（p＜ 0.004；使用重複量測MANOVA/回歸分析進行第1組與第2組及第3組之事後比較）。在第2組中及第3組中達成低於360 μmol/L之血漿Phe位準（美國醫學遺傳學與基因體學學會（American College of Medical Genetics；ACMG）目標Phe水準），在第2組中，患者3在施用後48週出現五個值；且在第3組中，患者6在施用後13週出現一個值。Phe降低、Tyr增加及Phe/Tyr比降低指示PAH酶活性。

大部分患者會自行放寬膳食中之完整蛋白質，例如增加其天然蛋白質之膳食攝入量及/或Phe攝入量。表5展示每一患者之蛋白質攝入量變化之概述。對於每一個體，藉由對所有基線後值求和且除以訪視總數目來得出每一營養素之平均基線後值。隨後藉由自每一營養素之平均基線後值減去基線值來計算平均基線後變化。對於每一營養素，藉由將平均基線後改變值除以基線值且乘以100來得出平均CFB%。表 5 ：患者膳食蛋白質攝入量之變化

組別（劑量水準）	患者	相對於基線之平均變化%
完整蛋白質	總蛋白質	Phe攝入量	Tyr攝入量
第1組（低劑量）	1	+14.2	+4.5	+0.4	-10.8
2	+66.0	-3.9	+78.5	-14.7
第2組（中等劑量）	3	-30.0	-4.8	+100.6	-1.9
4	+140.5	-9.6	+289.0	-75.6
第3組（高劑量）	5	-16.9	-16.9	-18.5	-21.0
6	+45.4	+8.8	+41.8	+3.4

發現封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體通常具有良好耐受性。六名給藥患者未報告治療相關嚴重不良事件（SAE）。罹患帶狀疱疹之患者中觀測到一個非治療相關SAE。

五名患者出現轉胺酶升高，如由ALT升高所證明。按需要，用增加之類固醇管控第2組及第3組之ALT升高。患者4及5中觀測到兩個等級3 ALT升高，兩名患者皆預先存在免疫病況。在計劃之高劑量預防性類固醇療法期間，在患者4中觀測到正常皮質醇水準。發現ALT增加之嚴重度與預先存在之免疫病況相關。不受任何理論束縛，ALT增加可能會影響封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hPAH-TC-025載體之功效。在第2組及第3組中，發現具有等級1 ALT升高之患者的Phe降低比具有等級3 ALT升高之患者更多（p＜ 0.05；使用重複量測MANOVA/回歸分析進行患者3及6與患者4及5之事後比較）。表6概述每一患者之ALT升高狀態。ALT等級係基於常見不良事件術語評定準則（CTCAE）版本5。表 6 ：患者 ALT 升高狀態

患者編號	峰值ALT等級（ULN之倍數）
1	WNL
2	等級1（1.4×ULN）
3	等級1（1.73×ULN）
4	等級3（11.02×ULN）
5	等級3（5.1×ULN）
6	等級1（3.2×ULN）*

*等級1基於高於ULN之基線ALT值。 * * *

本發明之範疇不受本文中所描述之特定實施例限制。實際上，根據前文描述及附圖，除所描述之修改之外，本發明之各種修改對本領域中熟習此項技術者而言將變得顯而易見。此等修改意欲屬於隨附申請專利範圍之範疇內。

本文中所引用之所有參考文獻（例如公開案或專利或專利申請案）均以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中，其併入程度如同每一個別參考文獻（例如公開案或專利或專利申請案）特別地且個別地指示為出於所有目的而以全文引用之方式併入一般。其他實施例屬於以下申請專利範圍內。

無

圖 1 為pHMI-hPAH-TC-025載體之載體圖。

圖 2A 至圖 2B 為展示施用所指示劑量之rAAV的雄性（圖2A）或雌性（圖2B）小鼠的血清中苯丙胺酸隨時間變化之水準的圖表，該rAAV包括pHMI-hPAH-TC-025載體。

圖 3A 至圖 3D 為展示施用所指示劑量之rAAV的雄性（圖3A及圖3B）或雌性（圖3C及圖3D）小鼠的血清中苯丙胺酸（圖3A及圖3C）或酪胺酸（圖3B及圖3D）隨時間變化之水準的圖表，該rAAV包括pHMI-hPAH-TC-025載體。

圖 4 為展示患有PAH缺乏症的成人中單次遞增劑量之rAAV之開放標記、隨機化、並行控制、劑量累增研究的設計，該rAAV包括封裝於AAVHSC15衣殼中的pHMI-hPAH-TC-025載體。

圖 5A 至圖 5C 展示三名用rAAV給藥之患者的空腹Phe濃度（圖5A）、空腹Tyr濃度（圖5B）及空腹Phe/Tyr比例位準（圖5C），該rAAV包括封裝於AAVHSC15中之HMI-hPAH-TC-025載體。

圖 6 為展示患者1隨時間變化的血漿Phe位準的圖表。

圖 7 為展示患者2隨時間變化之血漿Phe位準的圖表。

圖 8 為展示患者3隨時間變化之血漿Phe位準的圖表。

圖 9 為展示患者4隨時間變化之血漿Phe位準的圖表。

圖 10 為展示患者5隨時間變化之血漿Phe位準的圖表。

圖 11 為展示患者6隨時間變化之血漿Phe位準的圖表。

圖 12 為展示患者3及患者6隨時間變化之血漿Phe位準的圖表。

圖 13 為展示第1組中之患者之血漿Phe位準隨時間相對於基線的變化百分比的圖表。

圖 14 為展示第2組及第3組中之患者之血漿Phe位準隨時間相對於基線的變化百分比的圖表。

Claims

一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約2e13 vg/kg至約2e14 kg/vg之劑量向該個體施用rAAV，其中該rAAV包括： (a) AAV衣殼，其包括衣殼蛋白；及 (b) 轉移基因體，其包括以緘默方式改變之PAH編碼序列，其中該以緘默方式改變之PAH編碼序列包括SEQ ID NO: 1之核苷酸序列。
如請求項1之方法，其中該轉移基因體進一步包括與該以緘默方式改變之PAH編碼序列可操作地連接的轉錄調節元件。
如請求項2之方法，其中該轉錄調節元件能夠介導肝細胞、腎細胞或腦、腦下垂體、腎上腺、胰腺、膀胱、膽囊、結腸、小腸或乳房中之細胞中的轉錄。
如請求項2之方法，其中該轉錄調節元件包括人類肝控制區1（HCR1），其包括SEQ ID NO: 2之核苷酸序列。
如請求項2之方法，其中該轉錄調節元件包括人類α1-抗胰蛋白酶（hAAT）啟動子，其包括SEQ ID NO: 3之核苷酸序列。
如請求項2之方法，其中該轉錄調節元件包括SV40內含子，其包括SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。
如請求項2之方法，其中該轉錄調節元件包括SEQ ID NO: 5之核苷酸序列。
如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因體進一步包括在該PAH編碼序列之3'端的SV40聚腺苷酸化序列，其中該SV40聚腺苷酸化序列包括SEQ ID NO: 6之核苷酸序列。
如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因體包括SEQ ID NO: 7之核苷酸序列。
如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因體進一步包括該於基因體5’之5’反向末端重複（5’ ITR）核苷酸序列，及於該基因體3’之3’反向末端重複（3’ ITR）核苷酸序列。
如請求項10之方法，其中該5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 8具有至少95%序列一致性，且該3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 9具有至少95%序列一致性。
如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因體包括SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。
如前述請求項中任一項之方法，其中該AAV衣殼包括：衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R。
如前述請求項中任一項之方法，其中該AAV衣殼包括：衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R。
如前述請求項中任一項之方法，其中該AAV衣殼包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之方法，其中該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列組成，該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列組成，及/或該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列組成。
一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約2e13 vg/kg至約2e14 kg/vg之劑量向該個體施用rAAV，其中該rAAV包括： (a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及 (b) 轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。
如請求項17之方法，其中該AAV衣殼包括：衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R。
如請求項17之方法，其中該AAV衣殼包括：衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列；衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列；及/或衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列。
如請求項17之方法，其中：該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列組成；該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列組成；及/或該衣殼蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列組成。
如前述請求項中任一項之方法，其中該劑量為約2e13 vg/kg。
如前述請求項中任一項之方法，其中該劑量為約6e13 vg/kg。
如前述請求項中任一項之方法，其中該劑量為約8e13 vg/kg。
如前述請求項中任一項之方法，其中該劑量為約1e14 vg/kg。
如前述請求項中任一項之方法，其中該劑量為約2e14 vg/kg。
如前述請求項中任一項之方法，其中該rAAV係以單次劑量施用。
如請求項1至25中任一項之方法，其中該rAAV係以多次劑量施用。
如前述請求項中任一項之方法，其中該rAAV係靜脈內施用。
如前述請求項中任一項之方法，其中該個體為小兒個體。
如請求項1至28中任一項之方法，其中該個體為成人個體。
如前述請求項中任一項之方法，其中該與PAH基因突變相關之疾病或病症為苯酮尿症（PKU）。
一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約2e13 vg/kg之劑量向該個體靜脈內施用rAAV，其中該rAAV包括： (a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及 (b) 轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。
一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約6e13 vg/kg之劑量向該個體靜脈內施用rAAV，其中該rAAV包括： (a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及 (b) 轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。
一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約8e13 vg/kg之劑量向該個體靜脈內施用rAAV，其中該rAAV包括： (a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及 (b)轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。
一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約1e14 vg/kg之劑量向該個體施用rAAV，其中該rAAV包括： (a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及 (b) 轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。
一種用於治療患有與PAH基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包括以約2e14 vg/kg之劑量向該個體施用rAAV，其中該rAAV包括： (a) AAV衣殼，其包括：衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸203至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸138至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；及/或衣殼蛋白，其包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸1至736的胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸346的胺基酸為A，且其中該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 11之胺基酸505的胺基酸為R；以及 (b)轉移基因體，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。
如前述請求項中任一項之方法，其中在施用該rAAV之前向該個體施用第一免疫抑制劑。
如請求項37之方法，其中在施用該rAAV之前一天施用該第一免疫抑制劑。
如請求項37或38之方法，其中該第一免疫抑制劑係向該個體持續施用約20或約21週。
如請求項37至39中任一項之方法，其中該第一免疫抑制劑係根據以下依序給藥方案施用： (1) 60毫克/天之潑尼松龍（prednisolone）當量，持續兩週； (2) 40毫克/天之潑尼松龍當量，持續六週； (3) 30毫克/天之潑尼松龍當量，持續三週； (4) 20毫克/天之潑尼松龍當量，持續三週； (5) 10毫克/天之潑尼松龍當量，持續五週；以及 (6) 5毫克/天之潑尼松龍當量，持續一週或兩週。
如請求項40之方法，其中若該個體在該依序給藥方案期間之任何時候所展現的肝轉胺酶水準為ULN之至少約2倍，則將自步驟(1)重新開始該依序給藥方案。
如請求項40之方法，其中若該個體在完成步驟(6)之後所展現的肝轉胺酶水準為ULN之至少約2倍，則根據以下依序給藥方案進一步向該個體施用該第一免疫抑制劑： (7) 60毫克/天之潑尼松龍當量，持續兩週至四週； (8) 40毫克/天之潑尼松龍當量，持續兩週； (9) 30毫克/天之潑尼松龍當量，持續兩週； (10) 20毫克/天之潑尼松龍當量，持續兩週； (11) 10毫克/天之潑尼松龍當量，持續兩週；以及 (12) 5毫克/天之潑尼松龍當量，持續兩週。
如請求項42之方法，其中執行步驟(7)，直至該肝轉胺酶水準下降至該個體之該肝轉胺酶之基線位準左右或低於該基線位準左右為止。
如請求項43之方法，其中該個體之該肝轉胺酶之基線位準為在接受該rAAV之前，該個體中之該肝轉胺酶位準。
如請求項43或44之方法，其中該個體之該肝轉胺酶之基線位準在正常範圍內。
如請求項43或44之方法，其中該個體之該肝轉胺酶之基線位準處於該肝轉胺酶之正常上限（ULN）左右。
如請求項41至46中任一項之方法，其中該肝轉胺酶為丙胺酸胺基轉移酶（ALT）或天冬胺酸胺基轉移酶（AST）。
如請求項47之方法，其中ALT之正常範圍為0至約63 U/L。
如請求項47之方法，其中AST之正常範圍為0至約57 U/L。
如請求項47之方法，其中ALT之ULN為約30至約63 U/L。
如請求項47之方法，其中AST之ULN為約34至約57 U/L。
如請求項37至51中任一項之方法，其中該第一免疫抑制劑為糖皮質類固醇。
如請求項37至52中任一項之方法，其中該第一免疫抑制劑為潑尼松龍。