CN105247044B - 腺相关病毒变体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供包含变体衣壳蛋白和异源核酸的感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子。本公开还提供变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白(和/或编码变体AAV衣壳蛋白的核酸)，其向感染性rAAV病毒粒子赋予对人AAV中和抗体的提高的抗性。本公开还提供包含感染性rAAV病毒粒子和/或编码所述变体AAV衣壳蛋白的核酸的宿主细胞。本公开还提供向靶细胞递送异源核酸的方法，其中使靶细胞与所述感染性rAAV病毒粒子接触。本公开还提供向个体递送基因产物的方法，所述方法一般涉及向需要其的个体施用有效量的所述rAAV病毒粒子。

Description

腺相关病毒变体及其使用方法
交叉引用
本申请要求2013年5月31日提交的美国临时专利申请号61/829,735的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是由国家卫生研究院(the National Institutes of Health)资助的HL081527号基金在政府支持下进行。政府对本发明享有某些权利。以文本文件提供的序列表以引用的方式并入
序列表在此以文本文件形式提供，“BERK-216WO_ST25.txt”于2014年5月28日生成且具有169KB的大小。所述文本文件的内容在本文中以引用的方式整体并入。
引言
已论证基于腺相关病毒(AAV)的基因递送载体在临床前疾病模型及最近在人临床试验中关于若干疾病靶的前景。基于AAV的载体是非常安全的，这是因为野生型AAV是非致病性的并且与任何已知疾病在病原学上无关。此外，AAV能高效递送基因并且在许多组织中可维持转基因的表达，包括肝脏、肌肉、肺脏、视网膜、以及脑。
AAV是含有两个开放阅读框rep和cap的单链DNA病毒。第一个基因编码基因组复制所必需的四个蛋白(Rep78、Rep68、Rep52、和Rep40)，且第二个表达装配以形成病毒衣壳的三个结构蛋白(VP1-3)。如其名字所示，AAV的活性复制依赖辅助病毒，如腺病毒或疱疹病毒的存在。无辅助病毒时，AAV呈潜伏状态，其基因组维持为游离体形式或整合进宿主染色体中。已经鉴别出多个同源的灵长类AAV血清型和许多非人的灵长类类型。AAV2被表征为最佳基因递送媒介物。
到2010年为止，存在使用AAV作为基因递送媒介物的75项正在进行的临床试验。然而，抗衣壳中和抗体的高度流行(由于人群中对许多AAV变体和血清型的广泛暴露)减弱AAV基因疗法的功效。此预先存在的免疫性以及后来由于载体施用而形成的免疫性可阻止AAV基因疗法的更广泛的实施。例如，迄今为止，AAV在涉及递送到免疫特许区域的临床研究中是最成功的。
近来的分析表明抗AAV IgG抗体在人中的发生率对于AAV2(72％)和AAV1(67％)是最高的，但AAV9(47％)、AAV6(46％)、AAV5(40％)、以及AAV8(38％)抗体也存在于所研究的大部分群体中。若干研究发现在基因疗法期间对AAV衣壳的体液免疫可通过减少递送的rAAV粒子的量来预防。令人遗憾的是，低载体剂量的施用导致低转导及由此低治疗性基因表达。
在本领域中存在对开发对由抗AAV抗体进行的中和有抗性的新型AAV变体的需要。
文献
Asuri等人,Mol Ther.2012 Feb；20(2):329-38；Bainbridge等人,N Engl JMed.2008 May 22；358(21):2231-9；Excoffon等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2009 Mar10；106(10):3865-70；Grimm等人,J Virol.2008 Jun；82(12):5887-911；Jang等人,MolTher.2011 Apr；19(4):667-75；Klimczak等人,PLoS One.2009 Oct 14；4(10):e7467；Koerber等人；Mol Ther.2008 Oct；16(10):1703-9；Koerber等人；Mol Ther.2009 Dec；17(12):2088-95；Maguire等人,N Engl J Med.2008 May 22；358(21):2240-8；Maguire等人,Lancet.2009 Nov 7；374(9701):1597-605；Maheshri等人,Nat Biotechnol.2006 Feb；24(2):198-204；Perabo等人,J Gene Med.2006 Feb；8(2):155-62；Yang等人,Proc NatlAcad Sci U S A.2009 Mar 10；106(10):3946-51；WO2012145601；美国专利公布号US20050053922
简述
本公开提供包含变体衣壳蛋白和异源核酸的感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子。本公开还提供变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白(和/或编码变体AAV衣壳蛋白的核酸)，其向感染性rAAV病毒粒子赋予对人AAV中和抗体的提高的抗性。本公开还提供包含感染性rAAV病毒粒子和/或编码所述变体AAV衣壳蛋白的核酸的宿主细胞。本公开还提供以上病毒粒子、衣壳蛋白、核酸和/或宿主细胞的文库；其中文库的至少一个成员的变体AAV衣壳蛋白包含具有至少一个相对于SEQ ID NO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列的氨基酸取代的氨基酸序列。
本公开还提供向靶细胞递送异源核酸的方法，其中使靶细胞与所述感染性rAAV病毒粒子接触。本公开还提供向个体递送基因产物的方法，所述方法一般涉及向需要其的个体施用有效量的所述rAAV病毒粒子。本文还提供用于实践所述方法的组合物和试剂盒。
特征
本公开的特征包括一种感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，其包含：(a)包含与在SEQ ID NO:11-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白；及(b)异源核酸。在一些情况下，变体AAV衣壳蛋白包含与在SEQ ID NO:11-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列具有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，变体AAV衣壳蛋白包含在SEQ ID NO:11-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列。
本公开的特征包括一种感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，其包含：(a)包含与在SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且包括相对于SEQ ID NO:2的氨基酸取代N312K、N449D、D472N、N551S、I698V、及L735Q的变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白；及(b)异源核酸。在一些情况下，变体AAV衣壳蛋白包含在SEQID NO:10中列出的氨基酸序列。在一些情况下，rAAV展现与由AAV2(野生型AAV血清型2)展现的抗性相比对人AAV中和抗体的提高的抗性。在一些情况下，rAAV展现与由AAV2展现的抗性相比至少约1.5倍(例如，至少约3倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约30倍等等)对人AAV中和抗体更大的抗性。在一些情况下，rAAV展现与由野生型AAV血清型2(AAV2)展现的哺乳动物细胞的转导相比在人AAV中和抗体存在下提高的哺乳动物细胞转导。在一些情况下，哺乳动物细胞是肝细胞、胰腺细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、滑膜关节细胞、肺细胞、T细胞、神经元、神经胶质细胞、干细胞(例如，造血干细胞、造血祖细胞、神经干细胞、神经祖细胞、神经嵴干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞(iPS细胞)、间充质干细胞、中胚层干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞、胰腺祖细胞、肌肉干细胞、视网膜干细胞等等)、内皮细胞、或癌细胞。在一些情况下，异源核酸包含RNA干扰剂。在一些情况下，异源核酸包含编码多肽的核苷酸序列。
本公开的特征包括一种分离的核酸，其包含编码变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列，所述衣壳蛋白包含与在SEQ ID NO:11-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所编码的变体AAV衣壳蛋白包含与在SEQ ID NO:11-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列具有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所编码的变体AAV衣壳蛋白包含在SEQ ID NO:11-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列。
本公开的特征包括一种分离的核酸，其包含编码变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列，所述衣壳蛋白包含与在SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且包括相对于SEQ ID NO:2的氨基酸取代N312K、N449D、D472N、N551S、I698V、及L735Q。
在一些情况下，所编码的变体AAV衣壳蛋白(由分离的核酸编码)向感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子赋予与由AAV2(野生型AAV血清型2)展现的抗性相比对人AAV中和抗体的提高的抗性。在一些情况下，提高的抗性是由AAV2展现的抗性的至少约1.5倍(例如，至少约3倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约30倍等等)大。在一些情况下，所编码的变体AAV衣壳蛋白(由分离的核酸编码)向感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子赋予与由AAV2展现的转导相比在人AAV中和抗体存在下提高的哺乳动物细胞转导。
本公开的特征包括分离的宿主细胞，其包含如上所述的核酸。在一些情况下，宿主细胞用核酸稳定地转染。在一些情况下，宿主细胞还包含一种核酸，其包含编码AAV rep蛋白的核苷酸序列。在一些情况下，宿主细胞还包含重组AAV载体。
本公开的特征包括一种向靶细胞递送异源核酸的方法，其包括使靶细胞与所述病毒粒子(如上所述)接触。在一些情况下，靶细胞是肝细胞、胰腺细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、滑膜关节细胞、肺细胞、T细胞、神经元、神经胶质细胞、干细胞(例如，造血干细胞、造血祖细胞、神经干细胞、神经祖细胞、神经嵴干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞(iPS细胞)、间充质干细胞、中胚层干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞、胰腺祖细胞、肌肉干细胞、或视网膜干细胞等等)、内皮细胞、或癌细胞。在一些情况下，靶细胞是在体外。在一些情况下，靶细胞是在体内。
本公开的特征包括一种向需要其的个体递送基因产物的方法，所述方法包括向个体施用有效量的所述感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子(如上所述)。在一些情况下，rAAV病毒粒子的异源核酸包含RNA干扰剂。在一些情况下，rAAV病毒粒子的异源核酸包含编码多肽的核苷酸序列。在一些情况下，施用步骤包括感染性rAAV病毒粒子的间接递送。在一些情况下，施用步骤包括感染性rAAV病毒粒子的直接递送。
本公开的特征包括一种变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包含与在SEQ ID NO:11-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，AAV衣壳蛋白包含与在SEQ ID NO:11-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列具有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，AAV衣壳蛋白包含在SEQ ID NO:11-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列。
本公开的特征包括一种变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包含与在SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且包括相对于SEQID NO:2的氨基酸取代N312K、N449D、D472N、N551S、I698V、及L735Q。在一些情况下，变体AAV衣壳蛋白包含在SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列。在一些情况下，变体AAV衣壳蛋白向感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子赋予与由AAV2展现的抗性相比对人AAV中和抗体的提高的抗性。在一些情况下，提高的抗性是由AAV2展现的抗性的至少约1.5倍(例如，至少约3倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约30倍等等)大。在一些情况下，变体AAV衣壳蛋白向感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子赋予与由AAV2展现的转导相比在人AAV中和抗体存在下提高的哺乳动物细胞转导。
本公开的特征包括一种包含以下至少一个的文库：(i)两个或更多个感染性rAAV病毒粒子，各自包含变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白及异源核酸；(ii)两个或更多个分离的核酸，各自包含编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列；(iii)两个或更多个宿主细胞，各自包含含有编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸；以及(iv)两个或更多个变体AAV衣壳蛋白；其中文库的至少一个成员的变体AAV衣壳蛋白包含具有至少一个相对于SEQ ID NO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列的氨基酸取代的氨基酸序列。
本公开的特征包括一种生成和鉴别修饰的感染性rAAV病毒粒子的方法，所述病毒粒子相对于包含起始衣壳蛋白的起始(亲代)病毒粒子展现改变的感染性质，所述方法包括：(a)由起始衣壳蛋白生成变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中起始衣壳蛋白包含在SEQID NO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列，且其中每个变体AAV衣壳蛋白包含至少一个相对于起始衣壳蛋白的氨基酸取代；(b)生成变体AAV病毒粒子，各自包含在步骤(a)中生成的变体衣壳AAV蛋白；以及(c)测定在步骤(b)中生成的变体AAV病毒粒子的改变的感染性质以鉴别修饰的感染性rAAV病毒粒子。在一些情况下，变体AAV衣壳蛋白文库的生成包括一种选自由以下组成的组的诱变方法：聚合酶链反应诱变、寡核苷酸指导的诱变、饱和诱变、环交换诱变、片段改组诱变、及其组合。在一些情况下，改变的感染性质是与由起始病毒粒子展现的抗性相比对人中和AAV抗体的提高的抗性。在一些情况下，改变的感染性质是与由起始病毒粒子展现的转导相比在人AAV中和抗体存在下提高的哺乳动物细胞转导。在一些情况下，修饰的感染性rAAV病毒粒子包含修饰的AAV衣壳蛋白，其包含与起始衣壳蛋白具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
本公开的特征包括一种由起始衣壳蛋白生成变体AAV衣壳蛋白的方法，所述方法包括：使包含编码起始衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸经受选自由以下组成的组的类型的诱变：聚合酶链反应诱变、寡核苷酸指导的诱变、饱和诱变、环交换诱变、片段改组诱变、及其组合；其中起始衣壳蛋白包含在SEQ ID NO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列。
附图简述
图1A-B描绘AAV的定向进化用于增强的抗体逃避。
图2A-B描绘使用人IVIG的抗体逃避变体的中和曲线。
图3A-C描绘使用从个体中获取的人血清的抗体逃避变体的中和曲线，所述个体由于存在针对AAV的高中和抗体滴度而被排除在B型血友病临床试验之外。
图4A-B描绘环交换/改组及饱和诱变克隆的氨基酸序列。
图5显示AAV变体的体外向性。
图6A-B示出新型AAV变体的体内定位及中和。
图7A-D显示人抗体逃避株的生成。
图8A-I描绘与AAV1-9(SEQ ID NO:1-9)的野生型衣壳蛋白序列对齐的改组100-1(SEQ ID NO:11)的衣壳蛋白序列。
图9A-I描绘与AAV1-9(SEQ ID NO:1-9)的野生型衣壳蛋白序列对齐的改组100-3(SEQ ID NO:12)的衣壳蛋白序列。
图10A-I描绘与AAV1-9(SEQ ID NO:1-9)的野生型衣壳蛋白序列对齐的改组100-7(SEQ ID NO:13)的衣壳蛋白序列。
图11示出文库克隆和在免疫的小鼠血清中的亲代血清型的中和抗体滴度。
定义
腺相关病毒是由在非包膜二十面体衣壳内的4.7kb单链DNA基因组构成的非致病性细小病毒，“AAV”是腺相关病毒的缩写，且可用于指代病毒本身或其衍生物。基因组含有侧接有用作病毒复制起点和包装信号的反向末端重复(ITR)的三个开放阅读框(ORF)。repORF编码四个非结构蛋白，这些蛋白在病毒复制、转录调控、位点特异性整合、及病毒粒子装配中发挥作用。cap ORF编码三个结构蛋白(VP1-3)，这些蛋白装配形成60聚体病毒衣壳。最终，作为cap基因内的替代阅读框存在的ORF产生装配活化蛋白(AAP)，这是一种将AAV衣壳蛋白定位在细胞核中并在衣壳装配过程中发挥作用的病毒蛋白。
存在若干个天然存在的血清型和超过100个AAV变体，其各自在氨基酸序列方面不同，特别是在衣壳蛋白的高变区内，且因此在其基因递送性质方面不同。AAV与任何人类疾病无关，这使得重组AAV对于临床应用是有吸引力的。
除非另外需要，否则如本文所用的术语“AAV”涵盖所有亚型及天然存在的和重组形式。术语“AAV”包括AAV 1型(AAV-1或AAV1)、AAV 2型(AAV-2或AAV2)、AAV 3型(AAV-3或AAV3)、AAV 4型(AAV-4或AAV4)、AAV 5型(AAV-5或AAV5)、AAV 6型(AAV-6或AAV6)、AAV 7型(AAV-7或AAV7)、AAV 8型(AAV-8或AAV8)、AAV9型(AAV-9或AAV9)、鸟AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV、以及羊AAV。“灵长类AAV”是指感染灵长类的AAV，“非灵长类AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”是指感染牛哺乳动物的AAV，等等。
AAV的各种血清型的基因组序列、以及天然末端重复(TR)、Rep蛋白、和衣壳亚基的序列在本领域中是已知的。所述序列可见于文献中或公共数据库如GenBank中。参见，例如GenBank登记号NC_002077.1(AAV-1)、AF063497.1(AAV-1)、NC_001401.2(AAV-2)、AF043303.1(AAV-2)、J01901.1(AAV-2)、U48704.1(AAV-3)、NC_001729.1(AAV-3)、NC_001829.1(AAV-4)、U89790.1(AAV-4)、NC_006152.1(AAV-5)、AF085716.1(AAV-5)、AF028704.1(AAV-6)、NC_006260.1(AAV-7)、AF513851.1(AAV-7)、AF513852.1(AAV-8)NC_006261.1(AAV-8)、以及AY530579.1(AAV-9)；为了教导AAV核酸及氨基酸序列，这些文献的公开内容以引用的方式并入本文。还参见，例如Srivistava等人(1983)J.Virology 45:555；Chiorini等人(1998)J.Virology 71:6823；Chiorini等人(1999)J.Virology 73:1309；Bantel-Schaal等人(1999)J.Virology 73:939；Xiao等人(1999)J.Virology 73:3994；Muramatsu等人(1996)Virology 221:208；Shade等人,(1986)J.Virol.58:921；Gao等人(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA99:11854；Moris等人(2004)Virology 33:375-383；国际专利公布WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；以及美国专利号6,156,303。
与AAV血清型有关的天然存在的cap(衣壳)蛋白的序列在本领域中是已知的且包括：AAV1(SEQ ID NO:1)、AAV2(SEQ ID NO:2)、AAV3(SEQ ID NO:3)、AAV4(SEQ ID NO:4)、AAV5(SEQ ID NO:5)、AAV6(SEQ ID NO:6)、AAV7(SEQ ID NO:7)、AAV8(SEQ ID NO:8)、以及AAV9(SEQ ID NO:9)。术语“变体AAV衣壳蛋白”是相对于在SEQ ID NO:1-9中列出的天然存在的AAV衣壳蛋白序列中的一个，包含包括至少一个取代(包括缺失、插入等等)的氨基酸序列的AAV衣壳蛋白。
“AAV病毒粒子(virion)”或“AAV病毒粒子(viral particle)”是指由至少一个AAV衣壳蛋白和衣壳化的AAV多核苷酸构成的病毒粒子。
“重组”当应用于多核苷酸时意味着多核苷酸是克隆、限制或连接步骤、及产生不同于自然界中出现的多核苷酸的构建体的其他工序的不同组合的产物。重组病毒是包含重组多核苷酸的病毒粒子。该术语分别包括原始多核苷酸构建体及原始病毒构建体的后代的复制。
如果AAV病毒粒子包含异源多核苷酸(即，不同于野生型AAV基因组的多核苷酸，例如，有待递送给靶细胞的转基因、有待递送给靶细胞的RNAi试剂或CRISPR试剂等等)，那么其通常被称为“重组AAV(rAAV)病毒粒子”或“rAAV病毒粒子”。一般说来，异源多核苷酸侧接有至少一个，且一般两个AAV反向末端重复序列(ITR)。
术语“rAAV载体”包括rAAV病毒粒子(即rAAV病毒粒子)(例如，感染性rAAV病毒粒子)，其根据定义包括rAAV多核苷酸；并且还包括编码rAAV的多核苷酸(例如，编码rAAV的单链多核苷酸(ss-rAAV))；编码rAAV的双链多核苷酸(ds-rAAV)，例如，编码rAAV的质粒；等等)。
“包装”是指引起AAV粒子的装配和衣壳化的一系列细胞内事件。
AAV“rep”和“cap”基因是指编码腺相关病毒的复制和衣壳化蛋白的多核苷酸序列。AAV rep和cap在本文中被称为AAV“包装基因”。
用于AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(例如野生型AAV)由哺乳动物细胞来复制和包装的病毒。用于AAV的多种这类辅助病毒在本领域中是已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒如牛痘。腺病毒包括许多不同的亚组，但最常使用C亚组的5型腺病毒。人、非人哺乳动物及鸟类来源的许多腺病毒是已知的且可从保藏机构如ATCC处获得。疱疹家族病毒包括例如单纯疱疹病毒(HSV)和埃-巴二氏病毒(EBV)以及巨细胞病毒(CMV)和假狂犬病毒(PRV)；其也可从保藏机构如ATCC处获得。
“辅助病毒功能物”是指在辅助病毒基因组中编码的功能，其允许AAV复制和包装(结合本文所述的用于复制和包装的其他需求)。如本文所述，“辅助病毒功能物”可以许多方式提供，包括通过提供辅助病毒或提供例如将编码所需功能物的多核苷酸序列以反式提供给生产者细胞。例如，将包含编码一种或多种腺病毒蛋白的核苷酸序列的质粒或其他表达载体随rAAV载体一起转染到生产者细胞中。
“感染性”病毒或病毒粒子是包含适当装配的病毒衣壳且能够递送多核苷酸组分到病毒物种所趋向的细胞中的那些。该术语不一定意味着病毒的任何复制能力。用于计数感染性病毒粒子的测定描述在本公开的别处和本领域中。病毒感染性可表示为感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率。测定感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率的方法在本领域中是已知的。参见，例如Grainger等人(2005)Mol.Ther.11:S337(描述TCID50感染滴度测定)；及Zolotukhin等人(1999)Gene Ther.6:973。还参见实施例。
如本文所用的术语“向性”是指由病毒(例如AAV)对特定的宿主物种或在宿主物种内的特定细胞类型的优先靶向。举例来说，可感染心、肺、肝、及肌细胞的病毒相对于仅可感染肺和肌细胞的病毒具有更宽(即提高)的向性。向性也可包括病毒对宿主的具体细胞表面分子类型的依赖。例如，一些病毒可仅感染具有表面糖胺聚糖的细胞，而其他病毒可仅感染具有唾液酸的细胞(这种依赖性可使用缺乏特定类别的分子的各种细胞系作为病毒感染的潜在宿主细胞来测试)。在一些情况下，病毒的向性描述病毒的相对偏好。举例来说，第一病毒将能感染所有细胞类型，但在感染具有表面糖胺聚糖的那些细胞方面成功得多。第二病毒可被认为具有与第一病毒类似(或相同的)向性，如果第二病毒也优选相同的特征(例如，第二病毒也在感染具有表面糖胺聚糖的那些细胞方面更成功)，即使绝对转导效率不相似也如此。举例来说，第二病毒也许比第一病毒在感染所测试的每个给定细胞类型上更有效，但如果相对偏好相似(或相同)，那么第二病毒仍可被认为具有与第一病毒相似(或相同的)向性。在一些实施方案中，包含所述变体AAV衣壳蛋白的病毒粒子的向性相对于天然存在的病毒粒子是不改变的。在一些实施方案中，包含所述变体AAV衣壳蛋白的病毒粒子的向性相对于天然存在的病毒粒子是扩展(即，变宽)的。在一些实施方案中，包含所述变体AAV衣壳蛋白的病毒粒子的向性相对于天然存在的病毒粒子是降低的。
“有复制能力的”病毒(例如，有复制能力的AAV)是指感染性的表型上野生型病毒，并且也能够在受感染细胞中(即，在辅助病毒或辅助病毒功能物存在下)复制。在AAV的情况下，复制能力一般需要功能性AAV包装基因的存在。一般说来，如本文所述的rAAV载体在哺乳动物细胞(特别是人细胞)中由于缺乏一个或多个AAV包装基因而没有复制能力。通常，这种rAAV载体缺乏任何AAV包装基因序列以便使有复制能力的AAV通过AAV包装基因与引入的rAAV载体之间的重组生成的可能性减到最低。在许多实施方案中，如本文所述的rAAV载体制剂是含有(即使有也极少的)有复制能力的AAV(rcAAV，也称为RCA)(例如，每102个rAAV粒子小于约1rcAAV、每104个rAAV粒子小于约1rcAAV、每108个rAAV粒子小于约1rcAAV、每1012个rAAV粒子小于约1rcAAV、或无rcAAV)的那些。
术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的多聚形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可含有修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，并且可插入非核苷酸组分。对核苷酸结构的修饰可以在聚合物装配之前或之后进行(如果存在的话)。如本文所用的术语多核苷酸可互换地指双链和单链分子。除非另有规定或需要，文中涉及多核苷酸的任何实施方案包括双链形式与已知的或预计要形成双链形式的两条互补单链形式的每一条。
多核苷酸或多肽与另一种多核苷酸或多肽具有某百分数的“序列同一性”是指，当比对时，在两条序列相比中此百分数的碱基或氨基酸相同。序列相似性可以许多不同的方式测定。为了测定序列同一性，可使用方法和计算机程序比对序列，计算机程序包括可由因特网址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得的BLAST。另一种比对算法是FASTA，可由Madison,Wisconsin,USA,a wholly owned subsidiary of Oxford Molecular Group,Inc的Genetics Computing Group(GCG)包装中获得。其他比对技术描述于Enzymology,第266卷:Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996),Doolittle编著,Academic Press,Inc.,a division of Harcourt Brace&Co.,San Diego,California,USA的方法中。特别关注的是容许序列中的缺口的对比程序。Smith-Waterman是容许序列比对中的缺口的一种类型的算法。参见Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997)。使用Needleman和Wunsch对比方法的GAP程序也可用于比对序列。参见J.Mol.Biol.48:443-453(1970)
“基因”是指在细胞中执行某种功能的多核苷酸。例如，基因可含有开放阅读框，其在被转录和翻译后，能够编码特定的蛋白质。另一方面，基因可编码不被翻译的功能性RNA产物(例如，适体、干扰RNA、核蛋白体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)等等)。
“基因表达产物”或“基因产物”是由如上所定义的特定基因表达产生的分子。基因表达产物包括例如多肽、适体、干扰RNA、信使RNA(mRNA)、rRNA、tRNA、非编码RNA(ncRNA)等等。
“RNA干扰剂”或“RNAi试剂”包括可用于改变基因(如上所定义)表达的任何试剂(或编码这种试剂的多核苷酸)。本领域普通技术人员已知的RNAi试剂的实例包括但不限于(i)siRNA试剂；(ii)反义RNA；(iii)CRISPR试剂；(iv)锌指核酸酶试剂；以及(v)转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)试剂。
(i)siRNA试剂(“小干扰”或“短干扰RNA”(或siRNA))是靶向所关注基因(“靶基因”)的核苷酸的RNA双链体。“RNA双链体”是指由RNA分子的两个区域之间的互补配对形成的结构，从而形成双链RNA的区域(dsRNA)。siRNA“靶向”基因是因为siRNA的双链体部分的核苷酸序列与靶基因的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，siRNA的双链体长度小于30个核苷酸。在一些实施方案中，双链体可以是29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸长度。在一些实施方案中，双链体的长度是19-25个核苷酸长度。siRNA的RNA双链体部分可以是发夹结构的一部分。含有发夹的siRNA试剂也可被称为“shRNA(短发夹RNA)试剂”。除双链体部分之外，发夹结构还可含有位于形成双链体的两条序列之间的环部分。环在长度方面可变化。在一些实施方案中，环的长度是5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。发夹结构还可含有3'或5'突出端部分。在一些实施方案中，突出端是0、1、2、3、4或5个核苷酸长度的3'或5'突出端。一般说来，靶基因的表达产物(例如，mRNA、多肽等等)水平通过siRNA试剂(例如，siRNA、shRNA等等)而降低，所述siRNA试剂含有至少与靶基因转录产物的19-25个核苷酸长度的区段(例如，20-21个核苷酸序列)互补的特定双链核苷酸序列，包括5'非翻译(UT)区、ORF、或3'UT区。在一些实施方案中，短干扰RNA的长度为约19-25nt。参见，例如PCT申请WO 0/44895、WO99/32619、WO01/75164、WO01/92513、WO01/29058、WO01/89304、WO02/16620、及WO02/29858；以及美国专利公布号20040023390(关于siRNA技术的描述)。siRNA和/或shRNA可由核酸序列编码，且该核酸序列还可包括启动子。该核酸序列还可包括聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号是合成的最小聚腺苷酸化信号。
(ii)反义RNA是与基因表达产物互补的RNA。举例来说，靶向特定mRNA的反义RNA是与mRNA互补的基于RNA的试剂(或可以是修饰的RNA)，其中反义RNA与mRNA的杂交改变mRNA的表达(例如，经由改变RNA的稳定性、改变RNA的翻译，等等)。编码反义RNA的核酸也包括在“反义RNA”中。
(iii)CRISPR试剂。CRISPR(簇规则间隔的短回文重复/CRISPR相关(Cas)系统提供通过使用CRISPR RNA(crRNA)来指导侵入核酸的沉默而对病毒和质粒具有适应性免疫的细菌和古细菌。Cas 9蛋白(或其功能等效物和/或变体，即，Cas9样蛋白)天然地含有DNA核酸内切酶活性，这取决于该蛋白与两个天然存在的或合成的RNA分子(称为crRNA和tracrRNA，也称为指导RNA)的结合。在一些情况下，这两个分子共价连接以形成单一分子(也称为单指导RNA(“sgRNA”))。因此，Cas9或Cas9样蛋白与靶向DNA的RNA(该术语包括双分子指导RNA构型和单分子指导RNA构型)结合，这活化了Cas9或Cas9样蛋白并将该蛋白导向靶核酸序列。如果Cas9或Cas9样蛋白保持其天然酶促功能，那么其将靶DNA裂解以形成双链断裂，这可导致基因组变化(即，编辑：缺失、插入(当存在供体多核苷酸时)、置换等)，由此改变基因表达。Cas9的一些变体(这些变体被术语Cas9样所涵盖)已经改变，以使得它们具有降低的DNA裂解活性(在一些情况下，它们裂解靶DNA的单链而不是双链，而在其他情况下，它们严重地降低至无DNA裂解活性)。具有降低的DNA裂解活性(甚至无DNA裂解活性)的Cas9样蛋白仍可被导向靶DNA并且可阻断RNA聚合酶活性。因此，无酶促活性的Cas9样蛋白可在靶DNA中通过靶向DNA的RNA而靶向特定位置以便阻断靶DNA的转录。关于CRISPR试剂的详细信息可见于例如以下文献中：(a)Jinek等人,Science.2012 Aug 17；337(6096):816-21:“Aprogrammable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterialimmunity”；(b)Qi等人,Cell.2013Feb 28；152(5):1173-83:“Repurposing CRISPR as anRNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression”；以及(c)美国专利申请号13/842,859和PCT申请号PCT/US13/32589；所有这些文献据此以引用的方式整体并入。因此，如本文所用的术语“CRISPR试剂”包括任何试剂(或编码这类试剂的核酸)，包含天然存在的和/或合成的序列，其可用于基于Cas9的系统(例如，Cas9或Cas9样蛋白；靶向DNA的RNA的任何组分，例如crRNA样RNA、tracrRNA样RNA、单指导RNA等；供体多核苷酸；等等)中。
(iv)锌指核酸酶(ZFN)试剂。锌指核酸酶(ZFN)是通过锌指DNA结合域与DNA裂解域的融合而生成的人工DNA核酸内切酶。ZFN可被改造以靶向所需的DNA序列并且这使得锌指核酸酶能够裂解独特的靶序列。当引入细胞中时，ZFN可用于在细胞(例如细胞基因组)中通过诱导双链断裂来编辑靶DNA。有关使用ZFN的更多信息，参见，例如：Asuri等人,MolTher.2012 Feb；20(2):329-38；Bibikova等人Science.2003 May 2；300(5620):764；Wood等人Science.2011 Jul 15；333(6040):307；Ochiai等人Genes Cells.2010 Aug；15(8):875-85；Takasu等人,Insect Biochem Mol Biol.2010 Oct；40(10):759-65；Ekker等人,Zebrafish 2008 Summer；5(2):121-3；Young等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2011 Apr26；108(17):7052-7；Goldberg等人,Cell.2010 Mar 5；140(5):678-91；Geurts等人,Science.2009 Jul 24；325(5939):433；Flisikowska等人,PLoS One.2011；6(6):e21045.doi:10.1371/journal.pone.0021045.Epub 2011 Jun 13；Hauschild等人,ProcNatl Acad Sci U S A.2011 Jul 19；108(29):12013-7；以及Yu等人,Cell Res.2011 Nov；21(11):1638-40；所有这些文献出于其有关ZFN的教导而以引用的方式并入本文。术语“ZFN试剂”包括锌指核酸酶和/或包含编码锌指核酸酶的核苷酸序列的多核苷酸。
(v)转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)试剂。转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)是通过TAL(转录激活因子样)效应子DNA结合域与DNA裂解域的融合而生成的人工DNA核酸内切酶。TALEN可迅速地被改造以结合几乎任何所需的DNA序列并且当被引入细胞中时，TALEN可用于在细胞(例如细胞基因组)中通过诱导双链断裂编辑靶DNA。有关使用TALEN的更多信息，参见，例如：Hockemeyer等人Nat Biotechnol.2011 Jul 7；29(8):731-4；Wood等人Science.2011 Jul 15；333(6040):307；Tesson等人Nat Biotechnol.2011 Aug5；29(8):695-6；以及Huang等人,Nat Biotechnol.2011 Aug 5；29(8):699-700；所有这些文献出于其有关TALEN的教导而以引用的方式并入本文。术语“TALEN试剂”包括TALEN和/或包含编码TALEN的核苷酸序列的多核苷酸。
“控制元件”或“控制序列”是涉及功能性调控多核苷酸的分子相互作用的核苷酸序列，包括该多核苷酸的复制、加倍、转录、剪接、翻译、或降解。调控可影响所述过程的频率、速度、或特异性，并且调控可以是天然地增强或抑制。本领域中已知的控制元件包括例如转录调控序列，如启动子和增强子。启动子是能够在一定条件下结合RNA聚合酶并引发通常位于启动子下游(在3'方向上)的编码区域的转录的DNA区域。
“可操作连接”或“操作性连接”指的是遗传元件的一种并列关系，其中这些元件是呈一种允许它们以预期方式行使功能的关系。例如，启动子可操作连接到编码区域，如果该启动子有助于引发编码序列的转录的话。在启动子和编码区域之间可以有间插残基，只要能维持这种功能性关系。
“表达载体”是含有编码感兴趣的多肽的区域的载体，并且用于实现预定靶细胞中该蛋白质的表达。表达载体还包含可操作连接到编码区域以促进蛋白质在靶标中的表达的控制元件。控制元件与其可操作连接以用于表达的一个或多个基因的组合有时被称为“表达盒”，其中许多都是本领域中已知和可获得的或可容易地由本领域中可获得组分来构建。
“异源的”意思是指来源于一种实体，该实体在基因型上截然不同于正被比较的实体的其余部分。例如，通过遗传工程技术引入来源于不同物种的质粒或载体中的多核苷酸是异源多核苷酸。从启动子的天然编码序列中去掉启动子，且可操作地连接到不是天然序列的编码序列上，这种启动子叫异源启动子。因此，例如，含有编码异源基因产物的异源核酸的rAAV是含有天然存在的野生型AAV中通常不含有的核酸的rAAV，且所编码的异源基因产物是天然存在的野生型AAV通常不编码的基因产物。
术语“遗传改变”或“遗传修饰”(及其语法上的变型)在本文中可互换使用来指不通过有丝分裂或减数分裂将遗传元件(例如，多核苷酸)引入细胞中的方法。所述元件对细胞可以是异源的，或者可以是早已存在于细胞中的元件的额外拷贝或改进形式。遗传改变可例如通过本领域已知的任何方法用重组质粒或其他多核苷酸转染细胞来实现，所述方法如电穿孔、磷酸钙沉淀或与多核苷酸脂质体复合物接触。遗传改变也可例如通过用DNA或RNA病毒或病毒载体转导或感染来实现。遗传元件通常引入细胞的染色体或微小染色体中；但任何改变细胞及其后代的表型和/或基因型的变化均被归入该术语。
当这种DNA已引入细胞内部时，细胞已由外源性DNA(例如，经由重组病毒)“遗传修饰”或“转化”或“转染”。外源性DNA的存在产生永久或暂时的遗传变化。转化的DNA可以或未必被整合(共价连接)到细胞的基因组中。“克隆”是通过有丝分裂来源于单细胞或共同祖先的细胞群。“细胞系”是能够在体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。
如果某基因序列在细胞的体外长期培养期间能被利用执行其功能或在体外持续延长的时间，就认为该细胞受到该基因序列“稳定地”改变、转导、遗传修饰或转化。这种细胞通常是“遗传上”受到改变的(遗传修饰的)，即引入的遗传改变也可遗传给所改变细胞的后代。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指示任何长度的氨基酸聚合物。该术语也包括被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、磷酸化、或与标记组分缀合。当向哺乳动物受试者递送基因产物多肽(如抗血管生成多肽、神经保护性多肽等等)及其组合物时，所述多肽及其组合物分别是指保留了完整蛋白质所需的生化功能的相应完整多肽、或其任何片段或其遗传工程改造的衍生物。类似地，编码抗血管生成多肽的核酸、编码神经保护性多肽的核酸、和用于递送基因产物至哺乳动物受试者(可被称为有待向受体细胞递送的“转基因”)的其他这种核酸包括编码拥有所需生化功能的完整多肽或任何片段或遗传工程改造的衍生物的多核苷酸。
“分离的”质粒、核酸、载体、病毒、病毒粒子、宿主细胞、蛋白质、或其他物质是指所述物质至少缺乏一些其他组分的制剂，这些组分也可存在于这些物质或类似物质天然存在时或最初从其制备时。因此，例如，分离的物质可使用纯化技术从来源混合物中富集而制备。可以在一个绝对的基础上测量富集，如每体积溶液的重量，或者可以相对于来源混合物中存在的第二潜在干扰物质来测量富集。在本公开的实施方案中，富集程度增加则分离程度也增加。分离的质粒、核酸、载体、病毒、宿主细胞、或其他物质在一些实施方案中是纯化的，例如约80％至约90％纯的、至少约90％纯的、至少约95％纯的、至少约98％纯的、或至少约99％或以上纯的。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等等是指获得所需药理和/或生理效果。该效果可以是完全或部分地抑制疾病或其症状的预防性效果，和/或可以是部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的副作用的治疗性效果。如本文所用，“治疗”包括在哺乳动物，特别是在人中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病(和/或由该疾病所引起的症状)在可能易感该疾病或处于患上该疾病的风险中但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中出现；(b)抑制疾病(和/或由该疾病所引起的症状)，即阻止其发展；以及(c)减轻疾病(和/或由该疾病所引起的症状)，即，引起疾病(和/或由该疾病所引起的症状)的消退。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”以及“患者”在本文中可互换地使用，且是指哺乳动物，包括但不限于人；非人灵长类动物，包括猿；哺乳动物运动动物(例如马)；哺乳动物农场动物(例如绵羊、山羊等等)；哺乳动物宠物(狗、猫等等)；以及啮齿动物(例如小鼠、大鼠等等)。
在一些实施方案中，个体是先前已自然暴露于AAV且因此具有抗AAV抗体(即，AAV中和抗体)的人。在一些实施方案中，个体是先前已施用AAV载体(且因此可具有抗AAV抗体)且需要再施用载体用于治疗不同病状或用于进一步治疗相同病状的人。基于涉及向例如肝、肌肉、及视网膜(所有组织都受到针对此媒介物的中和抗体的影响)递送AAV基因的临床试验中的积极结果，存在许多这类治疗性应用/疾病靶标。
如本文所用的术语“有效量”是足以实现有益的或所需临床结果的量。有效量可以在一次或多次施用中施用。出于本公开的目的，化合物(例如感染性rAAV病毒粒子)的有效量是足以减轻、改善、稳定、逆转、预防、减缓或延迟具体疾病状况(例如癌症)(和/或与所述具体疾病状况有关的症状)发展的量。因此，感染性rAAV病毒粒子的有效量是能逃避个体的抗AAV抗体的中和活性，由此有效地向个体的一个靶细胞递(或多个靶细胞)递送异源核酸的感染性rAAV病毒粒子的量。
在进一步描述本发明前，应理解本发明不限于所描述的具体实施方案，因为这些实施方案当然可以变化。还应该理解，本文所用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案，并不意味着限制，因为本发明的范围只受所附权利要求书的限制。
当提供一个数值范围时，应该理解的是介于该范围的上下限间的每一个中间值(除非文中另外清楚地指出，否则所述中间值是下限单位的十分之一)和任何其他所述的或者在所述范围中的中间值都被包括在本发明内。这些较小范围的上下限可独立地被包括在该较小的范围中，且在所述范围内明确地排除极限值的条件下也被包括在本发明内。当所述范围包括所述上下限中的一个或两个时，排除了那些所包括的上下限中的一个或两个的范围也包括在本发明范围内。
除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似于或等价于本文所述的那些的任何方法和材料还可用于实践或测试本发明，但现在描述示优选方法和材料。本文所提及的全部出版物以引用的方式并入本文，从而公开和描述了与出版物所引用的内容相关的方法和/或材料。
除非文中另外清楚指出，否则必须指出如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个(种)”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，“一个感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子”包括多个这种病毒粒子且“感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子”包括本领域技术人员已知的一个或多个这种病毒粒子及其等效物，诸如此类。还应注意，权利要求书可能撰写成排除了任何可选要素。因此，此声明旨在用作排除性术语如“单独”、“仅仅”等与权利要求要素的陈述相关联的前提基础，或采用“负”限制。
应当理解，为清楚起见在参照不同实施方案的上下文中所描述的本发明的某些特点也可在单个实施方案中以组合方式给出。相反，为简洁起见在参照单一实施方案的上下文中所描述的本发明的某些特点也可单独地或以任何适合的子组合方式给出。关于本发明的实施方案的所有组合具体地由本发明所涵盖并且在本文中公开就好象每个组合个别地且明确地公开一样。另外，各种实施方案及其要素的所有子组合也具体地由本发明所涵盖并且在本文中公开就好象每个这种子组合个别地且明确地在本文中公开一样。
本文所讨论的出版物只提供在本申请的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容都不能被解释为承认本发明无权使借助于在先发明的这种出版日期提前。此外，所提供的出版日期可能不同于真实的出版日期，真实的出版日期可能需要独立地进行确认。
详细说明
本公开提供包含变体衣壳蛋白和异源核酸的感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子。本公开还提供变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白(和/或编码变体AAV衣壳蛋白的核酸)，其向感染性rAAV病毒粒子赋予对人AAV中和抗体的提高的抗性。本公开还提供包含感染性rAAV病毒粒子和/或编码所述变体AAV衣壳蛋白的核酸的宿主细胞。本公开还提供以上病毒粒子、衣壳蛋白、核酸和/或宿主细胞的文库；其中文库的至少一个成员的变体AAV衣壳蛋白包含相对于SEQ ID NO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。
本公开还提供向靶细胞递送异源核酸的方法，其中使靶细胞与所述感染性rAAV病毒粒子接触。本公开还提供向个体递送基因产物的方法，所述方法一般涉及向需要其的个体施用有效量的所述rAAV病毒粒子。本文还提供用于实践所述方法的组合物和试剂盒。在许多实施方案中，所述感染性rAAV病毒粒子、所述核酸、所述变体AAV衣壳蛋白、所述宿主细胞等等是分离的。
变体AAV衣壳多肽
所述变体AAV衣壳多肽(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋白)向包含变体AAV衣壳多肽的感染性rAAV病毒粒子赋予与由野生型AAV(例如，AAV2(野生型AAV血清型2))或包含野生型衣壳蛋白的AAV展现的抗性相比对人AAV中和抗体的提高的抗性。在一些实施方案中，提高的抗性是由野生型AAV(例如，AAV2(野生型AAV血清型2))或包含野生型衣壳蛋白的AAV所展现的抗性的至少约1.5倍(例如，至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约7.5倍、至少约10倍、至少约12倍、至少约15倍、至少约17倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约250倍、至少约300倍等)大。
所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋白)可向感染性rAAV病毒粒子赋予与由野生型AAV(例如，AAV2(野生型AAV血清型2))或包含野生型衣壳蛋白的AAV展现的转导相比在人AAV中和抗体存在下提高的哺乳动物细胞转导。在一些实施方案中，提高的转导是由野生型AAV(例如，AAV2(野生型AAV血清型2))或包含野生型衣壳蛋白的AAV所展现的转导的至少约1.5倍(例如，至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约7.5倍、至少约10倍、至少约12倍、至少约15倍、至少约17倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约250倍、至少约300倍等)大。
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋白)展现与结合野生型AAV衣壳蛋白的中和抗体减少的结合。例如，所述变体AAV衣壳蛋白可展现与抗体和野生型AAV衣壳蛋白的结合亲和力相比与结合野生型衣壳AAV蛋白的中和抗体至少约1.5倍(例如，至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约7.5倍、至少约10倍、至少约12倍、至少约15倍、至少约17倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约250倍、至少约300倍等)减弱的结合(例如，降低的亲和力)。
在一些实施方案中，抗AAV中和抗体以小于约10-7M、小于约5×10-6M、小于约10-6M、小于约5×10-5M、小于约10-5M、小于约10-4M或更小的亲和力结合至所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋白)。
术语“变体衣壳蛋白”不包括野生型AAV衣壳蛋白。“变体AAV衣壳蛋白”不包含存在于天然存在的AAV衣壳蛋白中的氨基酸序列。例如，所述变体衣壳蛋白不包含与在SEQ IDNO:1-9中列出的任何序列具有100％序列同一性的氨基酸序列。换句话说，所述变体衣壳蛋白不包含在SEQ ID NO:1-9的任一个中列出的氨基酸序列。变体AAV衣壳蛋白在氨基酸序列方面与“起始”或“亲本”AAV衣壳蛋白不同，所述亲本AAV衣壳蛋白可以是野生型AAV衣壳蛋白或非野生型AAV衣壳蛋白。
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQ ID NO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列的氨基酸203-736具有至少约90％(例如，至少约92％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQ ID NO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列具有至少约90％(例如，至少约92％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列的氨基酸203-736具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且包括相对于AAV2(例如，SEQ ID NO:2)的AAV衣壳蛋白的氨基酸取代N312K、N449D、D472N、N551S、I698V、及L735Q，或在另一AAV亲本血清型中的相应位置。
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且包括相对于AAV2(例如，SEQ ID NO:2)的AAV衣壳蛋白的氨基酸取代N312K、N449D、D472N、N551S、I698V、及L735Q，或在另一AAV亲本血清型中的相应位置。
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQ ID NO:31中列出的氨基酸序列的氨基酸203-736具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且包括相对于AAV2(例如，SEQ ID NO:2)的AAV衣壳蛋白的氨基酸取代N312K、N449D、N551S、及I698V，或在另一AAV亲本血清型中的相应位置。
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQ ID NO:31中列出的氨基酸序列具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且包括相对于AAV2(例如，SEQ ID NO:2)的AAV衣壳蛋白的氨基酸取代N312K、N449D、N551S、及I698V，或在另一AAV亲本血清型中的相应位置。
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQ ID NO:32中列出的氨基酸序列的氨基酸203-736具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且包括相对于AAV2(例如，SEQ ID NO:2)的AAV衣壳蛋白的氨基酸取代D180N、N312K、Q385R、N449D、N551S、I698V、及S721T，或在另一AAV亲本血清型中的相应位置。
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQ ID NO:32中列出的氨基酸序列具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且包括相对于AAV2(例如，SEQ ID NO:2)的AAV衣壳蛋白的氨基酸取代D180N、N312K、Q385R、N449D、N551S、I698V、及S721T，或在另一AAV亲本血清型中的相应位置。
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQ ID NO:33中列出的氨基酸序列的氨基酸203-736具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且包括相对于AAV2(例如，SEQ ID NO:2)的AAV衣壳蛋白的氨基酸取代N312K、N449D、T450A、N551S、及I698V，或在另一AAV亲本血清型中的相应位置。
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQ ID NO:33中列出的氨基酸序列具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且包括相对于AAV2(例如，SEQ ID NO：2)的AAV衣壳蛋白的氨基酸取代N312K、N449D、T450A、N551S、及I698V，或在另一AAV亲本血清型中的相应位置。
示例性变体AAV衣壳蛋白包括但不限于(参见图8-10关于选定的示例性序列比对)：
SM 10-2(氨基酸序列)(SEQ ID NO：10)：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLKFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTDTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRNQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTSVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNQ；
SM 10-2(核苷酸序列)(SEQ ID NO：22)：
atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctatgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggaacgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaagttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggtaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacagacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcggaaccagtctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaagtgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaagttcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatcagtaa
改组100-1(氨基酸序列)(SEQ ID NO：11)：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQQRLQGDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEQAGETAPGKKRPLIESPQQPDSSTGIGKKGKQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL；
改组100-1(核苷酸序列)(SEQ ID NO：23)：
atggctgctgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaggccggtgacaacccctacctcaagtacaaccacgccgacgcggagttccagcagcggcttcagggcgacacatcgtttgggggcaacctcggcagagcagtcttccaggccaaaaagagggttcttgaacctcttggtctggttgagcaagcgggtgagacggctcctggaaagaagagaccgttgattgaatccccccagcagcccgactcctccacgggtatcggcaaaaaaggcaagcagccggctaaaaagagactcaattttggtcagactggcgactcagagtcagtccccgacccacaacctctcggagaacctccagcaacccccgctgctgtgggacctactacaatggcttcaggtggtggcgcaccaatggcagacaataacgaaggcgccgacggagtgggtaatgcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgcacctgggccttgcccacctacaataaccacctctacaagcaaatctccagtgcttcaacgggggccagcaacgacaaccactacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaattggggattccggcccaagagactcaacttcaaactcttcaacatccaagtcaaggaggtcacgacgaatgatggcgtcacaaccatcgctaataaccttaccagcacggttcaagtcttctcggactcagactatcagctcccgtacgtgctcgggtcggctcacgagggctgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacctgaacagaactcagaatcagtccggaagtgcccaaaacaaggacttgctgtttagccgggggtctccagctggcatgtctgttcagcccaaaaactggctacctggaccctgttatcggcagcagcgcgtttctaaaacaaaaacagacaacaacaacagcaactttacctggactggtgcttcaaaatataaccttaatgggcgtgaatctataatcaaccctggcactgctatggcctcacacaaagacgacaaagacaagttctttcccatgagcggtgtcatgatttttggaaaggagagcgccggagcttcaaacactgcattggacaatgtcatgatcacagacgaagaggaaatcaaagccactaaccccgtggccaccgaaagatttgggactgtggcagtcaatctccagagcagcagcacagaccctgcgaccggagatgtgcatgttatgggagccttacctggaatggtgtggcaagacagagacgtatacctgcagggtcccatttgggccaaaattcctcacacagatggacactttcacccgtctcctcttatgggcggctttggactcaagaacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacgcctgttcctgcgaatcctccggcggagttttcagctacaaagtttgcttcattcatcacccaatactccacaggacaagtgagtgtggaaattgaatgggagctgcagaaagaaaacagcaagcgctggaatcccgaagtgcagtacacatccaattatgcaaaatctgccaacgttgattttactgtggacaacaatggactttatactgagcctcgccccattggcacccgttacctcacccgtcccctgtaa；
改组100-3(氨基酸序列)(SEQ ID NO：12)：
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改组100-3(核苷酸序列)(SEQ ID NO：24)：
atggctgctgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaggccggtgacaacccctacctcaagtacaaccacgccgacgcggagttccagcagcggcttcagggcgacacatcgtttgggggcaacctcggcagagcagtcttccaggccaaaaagagggttcttgaacctcttggtctggttgagcaagcgggtgagacggctcctggaaagaagagaccgttgattgaatccccccagcagcccgactcctccacgggtatcggcaaaaaaggcaagcagccggctaaaaagagactcaattttggtcagactggcgactcagagtcagtccccgacccacaacctctcggagaacctccagcaacccccgctgctgtgggacctactacaatggcttcaggtggtggcgcaccaatggcagacaataacgaaggcgccgacggagtgggtaatgcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgcacctgggccttgcccacctacaataaccacctctacaagcaaatctccagtgcttcaacgggggccagcaacgacaaccactacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaattggggattccggcccaagagactcaacttcaaactcttcaacatccaagtcaaggaggtcacgacgaatgatggcgtcacaaccatcgctaataaccttaccagcacggttcaagtcttctcggactcagactatcagctcccgtacgtgctcgggtcggctcacgagggctgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacctgaacagaactcagaatcagtccggaagtgcccaaaacaaggacttgctgtttagccgggggtctccaactggcatgtctgttcagcccaaaaactggctacctggaccctgttatcggcagcagcgcgtttctaaaacaaaaacagacaacaacaacagcaactttacctggactggtgcttcaaaatataaccttaatgggcgtgaatctataatcaaccctggcactgctatggcctcacacaaagacgacaaagacaagttctttcccatgagcggtgtcatgatttttggaaaggagagcgccggagcttcaaacactgcattggacaatgtcatgatcacagacgaagaggaaatcaaagccactaaccccgtggccactgaaagatttgggactgtggcagtcaatctccagagcagcagcacagaccctgcgaccggagatgtgcatgccatgggagccttacctggaatggtgtggcaagacagagacgtatacctgcagggtcctatttgggccaaaattcctcacacggatggacactttcacccgtctcctctcatgggcggctttggactcaagaacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacgcctgttcctgcgaatcctccggcggagttttcagctacaaagtttgcttcattcatcacccagtattccacaggacaagtgagcgtggagattgaatgggagctgcagaaagaaaacagcaaacgctggaatcccgaagtgcagtatacatctaactatgcaaaatctgccaacgttgatttcactgtggacaacaatggactttatactgagcctcgccccattggcacccgttacctcacccgtcccctgtaa；
改组100-7(氨基酸序列)(SEQ ID NO：13)：
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改组100-7(核苷酸序列)(SEQ ID NO：25)：
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改组10-2(氨基酸序列)(SEQ ID NO：26)：
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改组10-2(核苷酸序列)(SEQ ID NO：34)：
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改组10-6(氨基酸序列)(SEQ ID NO：27)：
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改组10-6(核苷酸序列)(SEQ ID NO：35)：
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改组10-8(氨基酸序列)(SEQ ID NO：28)：
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改组10-8(核苷酸序列)(SEQ ID NO：36)：
atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgcgaatggtgggacttgaaacctggagccccgaaacccaaagtcaaccagcaaaagcaggacaacgctcggggtcttgtgcttccgggttacaaatacctcggacccttcaacggactcgacaagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaagcgggtgacaatccgtaccttcggtataaccacgccgacgccgagtttcaggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaaccttggacgagcagtcttccaggccaagaagagggttctcgaaccttttggtctggttgaggaaggtgctaagacggctcctggaaagaaacgtccggtagagcagtcgccacaagagccagactcctcctcgggcattggcaagacaggccagcagcccgctaaaaagagactcaattttggtcagactggcgactcagagtcagtccccgacccacaacctctcggagaacctccagcaacccccgctgctgtgggacctactacaatggcttcaggcggtggcgcaccaatggcagacaataacgaaggcgccgacggagtgggtaatgcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacatgggccttgcccacctataacaaccacctctacaagcaaatctccagtgcttcaacgggggccagcaacgacaaccactacttcggctacagcaccccctgggggtattttgatttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgactcatcaataacaattggggattccggcccaagagactcaacttcaaactcttcaacntccaagtcaaggaggnnacgacgaangatgncgtcacaaccatcgctaataaccttaccagcacggttcaagtcttctcggactcggagtaccagcttccgtacgtcctcggctctgcgcaccagggctgcctccctccgttcccggcggacgtgttcatgattccgcaatacggctacctgacgctcaacaatggcagccaggcagtgggacggtcatccttttactgcctggaatatttcccatcgcagatgctgagaacgggcaataactttacctncagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagcctggaccggctgatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacctgaacagaactcagaatcagtccggaagtgcccaaaacaaggacttgctgtttagccgtgggtctccaactggcatgtctgttcagcccaaaaactggctacctggaccctgttatcggcagcagcgcgtttctaaaacaaaaacagacaacaacaacagcaactttacctggactggtgcttcaaaatataaccttaatgggcgtgaatctataatcaaccctggcactgctatggcctcacacaaagacgacgaagacaagttctttcccatgagcggtgtcatgatttttggaaaggagagcgccggagcttcaaacactgcattggacaatgtcatgatcacagacgaagagannncnaagccactaaccccgtggccactgaaagatttgggactgtggcagtcaatctccaagcagcacannnaccctgcgaccgnagatgtgcatgccatgggagccttacctggaatggtgtggcaagacagagacgtatacctgcagggtcctatttgggccaaaattcctcacacggatggacactttcacccgtctcctctcatgggcggctttggacttaagcacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacgcctgttcctgcgaatcctccggcagagttttcggctacaaagtttgcttcattcatcacccagtattccacaggacaagtgagcgtggagattgaatgggagctgcagaaagaaaacagcaaacgctggaatcccgaagtgcagtatacatctaactatgcaaaatctgccaacgttgatttcactgtggacaacaatggactttatactgagcctcgccccattggcacccgttacctcacccgtccccngtaa；
改组100-2(氨基酸序列)(SEQ ID NO：29)：
MASDGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLRAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL；
改组100-2(核苷酸序列)(SEQ ID NO：37)：
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SM 10-1(氨基酸序列)(SEQ ID NO：30)：
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SM 10-1(核苷酸序列)(SEQ ID NO：38)：
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SM 10-8(氨基酸序列)(SEQ ID NO：31)：
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SM 10-8(核苷酸序列)(SEQ ID NO：39)：
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SM 100-3(氨基酸序列)(SEQ ID NO：32)：
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SM 100-3(核苷酸序列)(SEQ ID NO：40)：
atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctatgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcaaactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaagttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcgggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggtaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacagacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaagtgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacgaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaagttcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtatacagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaa；
SM 100-10(氨基酸序列)(SEQ ID NO：33)：
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SM 100-10(核苷酸序列)(SEQ ID NO：41)：
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核酸和宿主细胞
本公开提供包含编码变体AAV衣壳蛋白(如上所述)的核苷酸序列的核酸，以及包含所述核酸的宿主细胞。核酸和宿主细胞适用于生成rAAV病毒粒子(如下所述)。
本公开提供包含所述核酸的宿主细胞，例如分离的宿主细胞。所述宿主细胞可被称为“遗传修饰的宿主细胞”且通常是分离的细胞，例如，在体外培养中的细胞。所述宿主细胞适用于产生所述rAAV病毒粒子，如下所述。当所述宿主细胞用于产生所述rAAV病毒粒子时，其被称为“包装细胞”。在一些实施方案中，所述宿主细胞被所述核酸稳定地遗传修饰(即，稳定地转染)。在其他实施方案中，所述宿主细胞被所述核酸瞬时遗传修饰(即，瞬时转染)。
使用已建立的技术将所述核酸稳定地或瞬时引入宿主细胞中，所述技术包括(但不限于)电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染等等。为进行稳定的转化，所述核酸通常还包含可选择标记，例如，如新霉素抗性等几种众所周知的可选择标记中的任一种。
通过将所述核酸引入多种细胞的任一种中生成所述宿主细胞，所述多种细胞是例如包括例如鼠细胞和灵长类细胞(例如，人细胞)的哺乳动物细胞。适合的哺乳动物细胞包括但不限于原代细胞和细胞系，其中适合的细胞系包括但不限于293细胞、COS细胞、HeLa细胞、Vero细胞、3T3小鼠成纤维细胞、C3H10T1/2成纤维细胞、CHO细胞等等。
在一些实施方案中，所述宿主细胞除包含编码突变衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸之外还包括包含编码一种或多种AAV rep蛋白的核苷酸序列的核酸。在其他实施方案中，所述宿主细胞还包含rAAV载体，如下所述。如以下更详细地描述，rAAV病毒粒子是使用所述宿主细胞生成的。
感染性rAAV病毒粒子
所述感染性rAAV病毒粒子包含变体AAV衣壳蛋白和异源核酸(在下文中更详细地描述)，并且展现与由野生型AAV(例如，AAV2(野生型AAV血清型2))或包含野生型衣壳蛋白的AAV展现的抗性相比对人AAV中和抗体的提高的抗性。“提高的抗性”意味着所述感染性rAAV病毒粒子在人抗AAV抗体存在下展现提高的感染性。如上所述，病毒感染性可表示为感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率。因此，提高的感染性意味着感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率提高。为了测定AAV对人抗AAV抗体的抗性，AAV的感染性是在各种浓度的人抗AAV抗体的存在下测量以便获得降低基因递送效率(即感染性)至在人抗AAV抗体不存在下所述效率的50％所需的抗体浓度(例如，血清浓度、IVIG浓度等)(mg/mL)。需要更高的抗体浓度以降低基因递送效率至人抗AAV抗体不存在下的效率的50％的病毒据说对抗体中和具有提高的抗性。因此，抗性的两倍提高意味着降低基因递送效率至人抗AAV抗体不存在下的效率的50％所需的抗体浓度的两倍提高。在一些实施方案中，所述感染性rAAV病毒粒子展现与由野生型AAV(例如，AAV2(野生型AAV血清型2))或包含野生型衣壳蛋白的AAV展现的抗性相比至少约1.5倍(例如，至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约7.5倍、至少约10倍、至少约12倍、至少约15倍、至少约17倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约250倍、至少约300倍等)大的对人AAV中和抗体的抗性。
所述感染性rAAV病毒粒子据说在人AAV中和抗体存在下展现提高的哺乳动物细胞转导。在一些实施方案中，所述感染性rAAV病毒粒子展现与由野生型AAV(例如，AAV2(野生型AAV血清型2))或包含野生型衣壳蛋白的AAV展现的转导相比至少约1.5倍(例如，至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约7.5倍、至少约10倍、至少约12倍、至少约15倍、至少约17倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约250倍、至少约300倍等)大的在人AAV中和抗体存在下的哺乳动物细胞转导。
在一些实施方案中，所述感染性rAAV病毒粒子展现与结合野生型AAV衣壳蛋白的中和抗体减少的结合。例如，所述感染性rAAV病毒粒子可展现与抗体和野生型AAV衣壳蛋白的结合亲和力相比与结合野生型衣壳AAV蛋白的中和抗体至少约1.5倍(例如，至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约7.5倍、至少约10倍、至少约12倍、至少约15倍、至少约17倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约250倍、至少约300倍等)减弱的结合(例如，降低的亲和力)。
在一些实施方案中，抗AAV中和抗体以小于约10-7M、小于约5×10-6M、小于约10-6M、小于约5×10-5M、小于约10-5M、小于约10-4M或更小的亲和力结合至所述感染性rAAV病毒粒子。
在一些实施方案中，所述感染性rAAV病毒粒子展现与野生型AAV相比增加的体内停留时间。例如，所述感染性rAAV病毒粒子展现与野生型AAV的停留时间相比至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约100％、至少约3倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍或更多倍长的停留时间。
给定的所述感染性rAAV病毒粒子是否展现与中和抗体减弱的结合和/或对中和抗体提高的抗性可使用本领域普通技术人员已知的任何便利的测定来确定。
在一些实施方案中，所述感染性rAAV病毒粒子包含野生型Rep78、Rep68、Rep52、及Rep40蛋白。在其他实施方案中，所述感染性rAAV病毒粒子除一种或多种变体衣壳蛋白之外还包含在Rep78、Rep68、Rep52、及Rep40蛋白的一个或多个中的一个或多个突变。
异源核酸
供所述rAAV载体(例如，所述感染性rAAV病毒粒子)中使用的适合的异源DNA分子(在本文中也被称为“异源核酸”)可以是任何异源核酸。在一些实施方案中，异源核酸包含编码多肽(例如，向靶细胞赋予某些所需特征的蛋白质，例如，允许细胞示踪的荧光蛋白、提供靶细胞中丢失或改变的活性的酶，等等)的核苷酸序列。在一些实施方案中，异源核酸包含RNA干扰剂(如上所定义)。
所述异源核酸的大小一般小于约5千碱基(kb)且将包括例如编码受体个体或靶细胞中有缺陷或缺少的蛋白质的基因(核苷酸序列)；编码具有所需生物或治疗效果(例如，抗细菌、抗病毒或抗肿瘤/抗癌功能)的蛋白质的基因；编码抑制或减少有害或另外不希望有的蛋白质的产生的RNA的核苷酸序列(例如，编码如上所定义的RNA干扰剂的核苷酸序列)；和/或编码抗原蛋白的核苷酸序列。
适合的异源核酸包括但不限于编码用于治疗以下疾病的蛋白质的核酸：内分泌、代谢、血液、心血管、神经、肌肉骨骼、泌尿、肺和免疫病症，包括如炎性病症、自身免疫病症、慢性和感染性病症(如获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、癌症、高胆固醇血症；溶酶体贮积病，如激活因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷过多症、天冬氨酰基葡萄糖胺尿、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸过多症、Danon病、Fabry病、Farber病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸沉积症、戈谢病(Gaucher disease)、GM1神经节苷脂沉积症、细胞内含物病/II型粘脂病、婴儿游离唾液酸贮积病/ISSD、幼年型己糖胺酶A缺乏症、克腊比病、溶酶体酸脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、粘多糖症(包括假胡尔勒氏多种营养不良/IIIA型粘脂病、MPSI赫尔利综合征(MPSI Hurler Syndrome)、MPSI沙伊综合征(MPSIScheie Syndrome)、MPS I赫尔利-沙伊综合征(MPS I Hurler-Scheie Syndrome)、MPS II亨特综合征(MPS II Hunter syndrome)、A型圣菲力浦综合征(Sanfilippo syndrome)/MPSIII A、B型圣菲力浦综合征/MPS III B、C型圣菲力浦综合征/MPS III C、D型圣菲力浦综合征/MPS III D、A型Morquio/MPS IVA、B型Morquio/MPS IVB、MPS IX透明质酸酶缺乏症、MPSVI Maroteaux-Lamy、MPS VII Sly综合征、I型粘脂病/唾液酸沉积症、IIIC型粘脂病、及IV型粘脂病)、多发性硫酸脂酶缺乏症、尼-皮二氏病(Niemann-Pick Disease)、神经元蜡样脂褐质沉积症、蓬佩病(Pompe disease)/II型糖原贮积病、致密性成骨不全症、桑德霍夫病(Sandhoff disease)/成人发病/GM2神经节苷脂沉积症、桑德霍夫病/GM2神经节苷脂沉积症-婴儿型、桑德霍夫病/GM2神经节苷脂沉积症-幼年型、Schindler病、扎拉病(Salladisease)/唾液酸贮积病、Tay-Sachs/GM2神经节苷脂沉积症、及沃尔曼病(Wolmandisease)；胰岛素病症，如糖尿病、生长紊乱、各种血液病症，包括各种贫血症、地中海贫血和血友病；遗传缺陷，如囊性纤维化、高歇氏病(Gaucher's Disease)、胡尔勒病(Hurler'sDisease)、腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症、肺气肿等等。
适合的异源核酸包括但不限于编码包括但不限于以下的多种蛋白质中的任一种的那些：干扰素(例如，IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-τ)；胰岛素(例如，诺和灵、优泌林、优泌乐、来得时(Humalog)、优乐停(Lantus)等)；促红细胞生成素(“EPO”；例如，
Figure BDA0000846167780000481
或
Figure BDA0000846167780000482
(依泊汀-α)；
Figure BDA0000846167780000483
(达贝泊汀-α)；
Figure BDA0000846167780000484
Figure BDA0000846167780000485
(依泊汀-β)；等等)；抗体(例如，单克隆抗体)(例如，
Figure BDA0000846167780000486
(利妥昔单抗)；
Figure BDA0000846167780000487
(英夫利昔单抗)；
Figure BDA0000846167780000488
(曲妥单抗)；HumiraTM(阿达木单抗)；
Figure BDA0000846167780000489
(奥马佐单抗)；
Figure BDA00008461677800004810
(托西莫单抗)；RaptivaTM(依法珠单抗)；ErbituxTM(西妥昔单抗)；
Figure BDA00008461677800004811
(贝伐单抗)；等等)，包括单克隆抗体的抗原结合片段(例如，
Figure BDA00008461677800004812
(雷珠单抗))；血液因子(例如，
Figure BDA00008461677800004813
(阿替普酶)组织纤溶酶原活化蛋白；
Figure BDA00008461677800004814
(重组人因子VIIa)；因子VIIa；因子VIII(例如，
Figure BDA00008461677800004815
)；因子IX；β-球蛋白；血红蛋白；等等)；集落刺激因子(例如，
Figure BDA00008461677800004816
(非格司亭；G-CSF)；Neulasta(聚乙二醇化非格司亭)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞单核细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、巨核细胞集落刺激因子；等等)；生长激素(例如，生长激素(somatotropin)，例如，
Figure BDA00008461677800004817
Figure BDA00008461677800004818
等；人生长激素；等等)；白介素(例如，IL-1；IL-2，包括例如，
Figure BDA00008461677800004819
IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9；等)；生长因子(例如，
Figure BDA00008461677800004820
(beclapermin；PDGF)；
Figure BDA00008461677800004821
(曲弗明；bFGF)；
Figure BDA00008461677800004822
(安西司亭；干细胞因子)；角质细胞生长因子；酸性成纤维细胞生长因子、干细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子；等等)；可溶性受体(例如，TNF-α结合可溶性受体，如
Figure BDA00008461677800004823
(依那西普)；可溶性VEGF受体；可溶性白介素受体；可溶性γ/δT细胞受体；等等)；酶(例如，α-葡糖苷酶；
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(imiglucarase；β-葡糖脑苷脂酶、
Figure BDA00008461677800004825
(阿糖苷酶)；酶激活剂(例如，组织型纤溶酶原激活剂)；趋化因子(例如，IP-10；Mig；Groα/IL-8；RANTES；MIP-1α；MIP-1β；MCP-1；PF-4；等等)；血管生成剂(例如，血管内皮生长因子(VEGF)；抗血管生成剂(例如，可溶性VEGF受体)；蛋白疫苗；神经活性肽，如血管舒缓激肽、缩胆囊肽、胃泌素、分泌素、催产素、促性腺激素释放激素、β-内啡肽、脑啡肽、P物质、生长激素释放抑制因子、催乳素、甘丙肽、生长激素释放激素、韩蛙皮素、强啡肽、神经降压素、胃动素、促甲状腺激素、神经肽Y、黄体生成素、降血钙素、胰岛素、胰高血糖素、加压素、血管紧张素II、促甲状腺激素释放激素、血管活性肠肽、睡眠肽等；其他蛋白，如溶解血栓剂、心钠肽、骨形态发生蛋白、促血小板生成素、松弛素、胶质细胞原纤维酸性蛋白、促卵泡激素、人α-1抗胰蛋白酶、白血病抑制因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、黄体生成素、巨噬细胞活化因子、肿瘤坏死因子、嗜中性白细胞趋化因子、神经生长因子、金属蛋白酶的组织抑制剂；血管活性肠肽、血管生成素、促血管素、纤维蛋白；水蛭素；白血病抑制因子；IL-1受体拮抗剂(例如，
Figure BDA0000846167780000491
(阿那白滞素))；离子通道，例如，囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)；肌营养不良蛋白(dystrophin)；utrophin(一种肿瘤抑制剂)；溶酶体酶酸α-葡糖苷酶(GAA)；等等。适合的核酸还包括编码任何上述蛋白的功能性片段的那些；以及编码任何上述蛋白的功能性变体的核酸。
适合的异源核酸还包括编码抗原蛋白的那些。包含编码抗原蛋白的异源核酸的所述rAAV载体适用于在哺乳动物宿主中刺激对抗原蛋白的免疫应答。抗原蛋白来源于自身抗原、变应原、肿瘤/癌症相关抗原、致病病毒、致病细菌、致病原虫、致病蠕虫、或感染哺乳动物宿主的任何其他致病生物。如本文所用，术语“编码源自……的抗原蛋白的核酸”包括编码野生型抗原蛋白的核酸，例如，从编码病毒蛋白的致病病毒中分离的核酸；在实验室中生成的编码与天然存在的抗原蛋白在氨基酸序列方面相同的抗原蛋白的合成核酸；在实验室中生成的编码与天然存在的抗原蛋白在氨基酸序列方面不同(例如，1个氨基酸至约15个氨基酸)但仍诱导对相应的天然存在的抗原蛋白的免疫应答的抗原蛋白的合成核酸；在实验室中生成的编码抗原蛋白片段(例如，约5个氨基酸至约50个氨基酸的片段，该片段包含一个或多个抗原表位)的合成核酸，所述片段诱导对相应的天然存在的抗原蛋白的免疫应答；等等。
类似地，“源自于”自身抗原、变应原、肿瘤/癌症相关抗原、致病病毒、致病细菌、致病原虫、致病蠕虫、或感染哺乳动物宿主的任何其他致病生物的抗原蛋白包括与天然存在的抗原蛋白在氨基酸序列方面相同的蛋白、以及与天然存在的抗原蛋白在氨基酸序列方面不同(例如，1个氨基酸至约15个氨基酸)但仍诱导对相应的天然存在的抗原蛋白的免疫应答的蛋白；及抗原蛋白的片段(例如，约5个氨基酸至约100个氨基酸的片段，例如约5个至约50个氨基酸，该片段包含一个或多个抗原表位)，所述片段诱导对相应的天然存在的抗原蛋白的免疫应答。
在一些实施方案中，对由所述rAAV载体编码的抗原蛋白的免疫应答将在哺乳动物宿主中刺激对呈现抗原蛋白或抗原表位(或与编码rAAV的抗原蛋白或抗原表位有交叉反应的蛋白或表位)的致病生物的保护性免疫应答。在一些实施方案中，对编码rAAV的抗原蛋白的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答将在哺乳动物宿主中诱导。在其他实施方案中，对编码rAAV的抗原蛋白的体液应答将在哺乳动物宿主中诱导，以使得生成对抗原蛋白有特异性的抗体。在许多实施方案中，对编码rAAV的抗原蛋白的TH1免疫应答将在哺乳动物宿主中诱导。适合的抗原蛋白包括肿瘤/癌症相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、以及原虫抗原；及其抗原性片段。在一些实施方案中，抗原蛋白源自于细胞内病原体。在其他实施方案中，抗原蛋白是自体抗原。在其他实施方案中，抗原蛋白是变应原。
肿瘤/癌症特异性抗原包括但不限于各种MAGE(黑素瘤相关抗原E)中的任一种，包括MAGE 1(例如，GenBank登记号M77481)、MAGE 2(例如，GenBank登记号U03735)、MAGE 3、MAGE 4等；各种酪氨酸酶中的任一种；突变ras；突变p53(例如，GenBank登记号X54156和AA494311)；以及p97黑素瘤抗原(例如，GenBank登记号M12154)。其他肿瘤/癌症特异性抗原包括与晚期癌症有关的Ras肽和p53肽、与子宫颈癌有关的HPV 16/18和E6/E7抗原、与乳癌有关的MUCI1-KLH抗原(例如，GenBank登记号J03651)、与结肠直肠癌有关的CEA(癌胚抗原)(例如，GenBank登记号X98311)、与黑素瘤有关的gp100(例如，GenBank登记号S73003)或MART1抗原、以及与前列腺癌有关的PSA抗原(例如，GenBank登记号X14810)。p53基因序列是已知的(参见，例如Harris等人(1986)Mol.Cell.Biol.,6:4650-4656)且以GenBank登记号M14694保藏。因此，所述蛋白质、核酸和/或病毒粒子可用作用于包括但不限于以下癌症的免疫治疗剂：子宫颈癌、乳癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肺癌，以及用于黑素瘤。
病毒抗原源自于造成包括但不限于以下疾病的已知病原体：麻疹、腮腺炎、风疹、脊髓灰质炎、甲型肝炎、乙型肝炎(例如GenBank登记号E02707)和丙型肝炎(例如，GenBank登记号E06890)、以及其他肝炎病毒、流感、腺病毒(例如，4型和7型)、狂犬病(例如，GenBank登记号M34678)、黄热病、日本脑炎(例如，GenBank登记号E07883)、登革热(例如，GenBank登记号M24444)、汉坦病毒、以及人类免疫缺陷病毒(例如，GenBank登记号U18552)。
适合的细菌和寄生虫抗原包括源自于造成包括但不限于以下疾病的已知病原体的那些抗原：白喉、百日咳(例如，GenBank登记号M35274)、破伤风(例如，GenBank登记号M64353)、肺结核、细菌及真菌性肺炎(例如，流感嗜血杆菌、肺炎肺囊虫等)、霍乱、伤寒、瘟疫、志贺氏菌病、沙门氏菌病(例如，GenBank登记号L03833)、军团菌病(Legionnaire'sDisease)、莱姆病(例如，GenBank登记号U59487)、疟疾(例如，GenBank登记号X53832)、钩虫病、盘尾丝虫病(例如，GenBank登记号M27807)、血吸虫病(例如，GenBank登记号L08198)、锥虫病、利什曼病、贾第鞭毛虫病(例如，GenBank登记号M33641)、阿米巴病、丝虫病(例如，GenBank登记号J03266)、莱姆包柔螺旋体病、以及旋毛虫病。
编码异源基因产物的适合的异源核酸包括非翻译RNA，如RNAi试剂(如上文中更详细地描述)(例如，反义RNA；siRNA；shRNA；双链RNA(dsRNA)；CRISPR试剂，例如Cas9或Cas9样蛋白、crRNA样RNA、tracrRNA样RNA、单指导RNA和/或供体多核苷酸；等等)、核糖酶等。RNAi试剂可用于抑制基因表达。一些RNAi试剂提供可随后用于抑制基因表达的工具(例如，CRISPR试剂，如cas9或cas9样蛋白)。
靶基因包括编码有害的(例如病理的)靶基因产物(RNA或蛋白质)的任何基因，例如，功能障碍的靶基因产物(例如，由于在编码的蛋白质序列中的突变，由于在控制基因产物的稳态水平的非编码序列中的突变，等等)。靶基因产物包括但不限于：享延顿；丙型肝炎病毒；人类免疫缺陷病毒；淀粉状蛋白前体蛋白质；tau；包括聚谷氨酰胺重复的蛋白质；疱疹病毒(例如，水痘带状疱疹)；任何致病病毒；等等。
因此，包括编码RNAi试剂的异源核酸的所述rAAV适用于治疗包括但不限于以下的多种病症和病状：神经变性疾病，例如，三核苷酸重复疾病，如与聚谷氨酰胺重复有关的疾病，例如亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑共济失调、脊髓延髓肌萎缩(SBMA)、齿状核红核苍白球路易体萎缩(DRPLA)等；获得性病理现象(例如，由异常的生理、生化、细胞、结构、或分子生物状态所表现的疾病或综合征)，如病毒感染，例如，作为HCV感染结果或可能作为HCV感染结果的肝炎、作为HIV感染结果的获得性免疫缺陷综合征；癌症等等。
在许多实施方案中，编码RNAi试剂的异源核酸可操作地连接至启动子。适合的启动子为本领域技术人员已知且包括任何蛋白编码基因的启动子，例如内源性调节基因或组成型表达基因的启动子。例如，可将由细胞生理活动(例如，热休克、氧水平和/或一氧化碳水平，例如缺氧时)所调节的基因的启动子可操作地连接于siRNA编码核酸。
选择的异源核苷酸序列(如，编码EPO的或感兴趣的核酸)可操作地连接于指导该核苷酸序列的体内转录或表达的控制元件。这种控制元件可含有通常与所选择的基因(例如，内源性细胞控制元件)相连的控制序列。或者，可采用异源控制序列。有用的异源控制序列一般包括源自于编码哺乳动物或病毒基因序列的那些异源控制序列。实例包括但不限于SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复(LTR)启动子；腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、对于感兴趣的基因是异源的内源细胞启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子区域(CMVIE)、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、合成启动子、杂合启动子等等。另外，本文也使用源自于非病毒基因如鼠金属硫蛋白基因的序列。这种启动子序列可从例如Stratagene(San Diego,Calif.)商购获得。
在一些实施方案中，细胞类型特异性或组织特异性启动子将可操作连接至编码异源基因产物的异源核酸，以使得该基因产物在特定的细胞类型或组织中选择性地或优先地产生。在一些实施方案中，诱导性启动子将可操作连接至异源核酸。
例如，肌肉特异性和诱导性启动子、增强子等适用于将基因产物递送至肌细胞。这种控制元件包括但不限于：源自于肌动蛋白和肌球蛋白基因家族的那些控制元件，如来自myoD基因家族；肌细胞特异性增强子结合因子MEF-2；源自于人骨骼肌动蛋白基因和心脏肌动蛋白基因的控制元件；肌肉肌酸激酶序列元件及鼠肌酸激酶增强子(mCK)元件；源自于骨骼快收缩肌钙蛋白C基因、慢收缩心脏肌钙蛋白C基因及慢收缩肌钙蛋白I基因的控制元件；低氧诱导性核因子；类固醇诱导性元件及启动子，如糖皮质激素反应元件(GRE)；用于RU486诱导的融合一致元件；以及提供用于四环素调控基因表达的元件。
具有和AAV ITR相连的感兴趣的DNA分子(异源DNA)的AAV表达载体可通过将所选择的序列直接插入到切除了主要AAV开放阅读框(“ORF”)的AAV基因组来构建。AAV基因组的其他部分也可以缺失，只要保留足够部分的ITR以允许复制和包装功能。这种构建体可使用本领域中公知的技术来设计。参见，例如美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公布号WO92/01070(1992年1月23日公布)和WO 93/03769(1993年3月4日公布)；Lebkowski等人(1988)Molec.Cell.Biol.8:3988-3996；Vincent等人(1990)Vaccines 90(Cold SpringHarbor Laboratory Press)；Carter,B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka,N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129；Kotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5:793-801；Shelling和Smith(1994)GeneTherapy 1:165-169；以及Zhou等人(1994)J.Exp.Med.179:1867-1875。
或者，AAV ITR可以由病毒基因组或由AAV载体上切除获得，所述AAV载体包含病毒基因组且使用本领域技术人员已知的任何便利方法将其与存在于另一个载体中的选定核酸构建体的5'和3'端融合。例如，一种适合的手段使用标准连接技术，如描述于Sambrook等人,同上中的那些。例如，可在20mM Tris-Cl pH 7.5、10mM MgCl2、10mM DDT、33μg/ml BSA、10mM-50mM NaCl，和40μM ATP、0.01-0.02(Weiss)单位T4DNA连接酶在0℃至16℃(用于“粘性末端”连接)或1mM ATP、0.3-0.6(Weiss)单位T4DNA连接酶在14℃(用于“钝端”连接)下完成连接。分子间“粘性末端”连接通常在30-100μg/ml总DNA浓度(5-100nM总的终浓度)下进行。含有ITR的AAV载体已描述于例如美国专利号5,139,941中。具体说来，若干AAV载体描述于其中，它们是以登记号53222、53223、53224、53225及53226获自美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)。
另外，嵌合基因可合成地产生，以包括排列一个或多个选定的核酸序列5'和3'端的AAV ITR序列。可以使用哺乳动物肌细胞中用于表达嵌合基因序列的优选密码子。完全嵌合序列由通过标准方法制备的重叠寡聚核苷酸装配。参见，例如Edge,Nature(1981)292:756；Nambair等人Science(1984)223:1299；Jay等人J.Biol.Chem.(1984)259:6311。
所述感染性rAAV病毒粒子的生成
经由引入，通常采用宿主或“生产者”细胞用于rAAV载体复制和包装。这种生产者细胞(通常是哺乳动物宿主细胞)一般包含或被修饰以包含若干不同类型的组分用于rAAV产生。第一组分是可被宿主包装细胞复制并包装到载体粒子中的重组腺相关病毒(rAAV)载体基因组(或“rAAV原载体”)。既然将这种转基因包装到rAAV载体粒子中可有效地用于将转基因递送至多种哺乳动物细胞，rAAV原载体通常将包含在基因疗法中在遗传上改变另一种细胞所需的异源多核苷酸(或“转基因”)。转基因通常侧接有两个AAV反向末端重复序列(ITR)，该序列含有在AAV载体的切除、复制和包装过程中以及在该载体整合入宿主细胞基因组的过程中识别的序列。
第二组分是可提供用于AAV复制的辅助功能物的辅助病毒。虽然通常采用腺病毒，但是其他辅助病毒也可如本领域中已知来使用。或者，所需的辅助病毒功能物可从辅助病毒中遗传地分离并且编码基因可用于以反式提供辅助病毒功能物。AAV载体元件和辅助病毒(或辅助病毒功能物)可同时或依次以任何顺序引入宿主细胞中。
生产者细胞中有待提供的用于AAV产生的最终组分是“AAV包装基因”，如分别提供复制和衣壳化蛋白的AAV rep和cap基因。可提供几种不同形式的AAV包装基因(包括rep-cap表达盒与分开的rep和/或cap表达盒)，其中rep和/或cap基因可被置于天然启动子或可操作连接的异源启动子的控制下。可将这种AAV包装基因瞬时或稳定地引入宿主包装细胞，这是本领域已知的并详述于下文中。
1.rAAV载体
含有感兴趣的异源DNA的所述rAAV病毒粒子(其中“感兴趣的异源DNA”在本文还被称为“异源核酸”)可使用本领域技术人员已知的标准方法产生。这些方法通常涉及以下步骤：(1)将所述rAAV载体引入宿主细胞；(2)将AAV辅助构建体引入宿主细胞，其中辅助构建体包含的AAV编码区域能在宿主细胞中表达来补充AAV载体所缺乏的AAV辅助功能物；(3)将一种或多种辅助病毒和/或附属功能载体引入宿主细胞，其中辅助病毒和/或附属功能载体提供能在宿主细胞中支持重组AAV(“rAAV”)病毒粒子有效产生的附属功能物；以及(4)培养该宿主细胞来产生rAAV病毒粒子。AAV表达载体、AAV辅助构建体和辅助病毒或附属功能载体可使用标准转染技术同时或连续引入宿主细胞。
使用已知技术构建AAV表达载体来至少提供作为以转录方向操作性相连的组分的控制元件，所述元件包括转录起始区、感兴趣的DNA和转录终止区。选择在哺乳动物肌细胞中有功能的控制元件。包含操作性连接组分的所得构建体以功能性AAV ITR序列为边界(5'和3')。
AAV ITR区域的核苷酸序列是已知的。关于AAV-2序列，参见，例如Kotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5:793-801；Berns,K.I."Parvoviridae and theirReplication"in Fundamental Virology,第2版,(B.N.Fields和D.M.Knipe编著)。用于本发明载体中的AAV ITR不需要有野生型核苷酸序列，并且是可以改变的，例如，通过核苷酸的插入、缺失或取代。另外，AAV ITR可源自于几种AAV血清型中的任一种，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-7等。此外，AAV表达载体中侧接所选择的核苷酸序列的5'和3'ITR不一定是相同的或由相同的AAV血清型或分离株衍生，只要它们的功能是想要的，即允许由宿主细胞基因组或载体切除和挽救感兴趣的序列，并且当AAV Rep基因产物存在于细胞中时允许整合DNA分子到受体细胞基因组中。ITR允许在Rep蛋白的适当混合物存在下复制载体序列。ITR还允许载体序列并入到衣壳中以生成AAV粒子。
为了产生rAAV病毒粒子，使用已知的技术，如通过转染将AAV表达载体引入适合的宿主细胞中。许多转染技术一般在本领域中是已知的。参见，例如Graham等人(1973)Virology,52:456，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratories,New York，Davis等人(1986)Basic Methods in MolecularBiology,Elsevier，以及Chu等人(1981)Gene 13:197。特别适合的转染方法包括磷酸钙共沉淀(Graham等人(1973)Virol.52:456-467)、直接微量注射到培养细胞中(Capecchi,M.R.(1980)Cell 22:479-488)、电穿孔(Shigekawa等人(1988)BioTechnigues 6:742-751)、脂质体介导的基因转移(Mannino等人(1988)BioTechniques 6:682-690)、脂质介导的转导(Felgner等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417)、以及使用高速微粒的核酸递送(Klein等人(1987)Nature 327:70-73)。
出于本公开的目的，用于产生rAAV病毒粒子的适合的宿主细胞包括微生物、酵母细胞、昆虫细胞、以及哺乳动物细胞，其可以或已被用作异源DNA分子的受体。该术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，用于产生rAAV病毒粒子的“宿主细胞”一般是指用外源性DNA序列转染的细胞。来自稳定的人细胞系293(容易例如以登记号ATCC CRL1573获自美国典型培养物保藏中心)的细胞在许多实施方案中使用。具体来说，人细胞系293是用5型腺病毒DNA片段转化(Graham等人(1977)J.Gen.Virol.36:59)并且表达腺病毒E1a和E1b基因(Aiello等人(1979)Virology 94:460)的人胚肾细胞系。293细胞系是容易被转染的，并且提供特别便利的平台以在其中产生rAAV病毒粒子。
2.AAV辅助功能
包含上述AAV表达载体的宿主细胞必须有能力提供AAV辅助功能物，以便复制和使侧接有AAV ITR的核苷酸序列衣壳化以产生rAAV病毒粒子。AAV辅助功能物通常是AAV-衍生的编码序列，该序列可被表达来提供AAV基因产物，进而对生产性AAV复制起反式作用。本文使用AAV辅助功能以补充AAV表达载体失去的必要的AAV功能。因此，AAV辅助功能物包括主要AAV ORF(即rep和cap编码区域)中的一个或两个、或其功能同系物。在本公开的上下文中，cap功能物包括一种或多种突变的衣壳蛋白，其中至少一种衣壳蛋白含有至少一个如上所述的突变。
“AAV rep编码区域”是指本领域公认的编码复制蛋白Rep 78、Rep68、Rep 52及Rep40的AAV基因组的区域。这些Rep表达产物已显示拥有多种功能，包括AAV DNA复制的起点的识别、结合和产生切口、DNA解旋酶活性和调节AAV(或其他异源)启动子转录。Rep表达产物共同需要用于复制AAV基因组。关于AAV rep编码区域的描述，参见，例如Muzyczka,N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129；及Kotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5:793-801。AAV rep编码区域的适合的同系物包括人疱疹病毒6(HHV-6)rep基因，已知该基因也介导AAV-2DNA复制(Thomson等人(1994)Virology 204:304-311)。
AAV cap蛋白包括VP1、VP2、及VP3，其中VP1、VP2、及VP3中的至少一个包含至少一个如上所述的突变。
AAV辅助功能物通过在AAV表达载体转染之前或同时用AAV辅助构建体转染宿主细胞被引入宿主细胞。AAV辅助构建体由此用于至少提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达以补充生产性AAV感染所必需的丢失的AAV功能物。AAV辅助构建体缺少AAV ITR并且不能自我复制和包装。这些构建体可呈质粒、噬菌体、转位子、装配型质粒、病毒、或病毒粒子形式。已经描述编码Rep和Cap表达产物的许多AAV辅助构建体，如常用的质粒pAAV/Ad和pIM29+45。参见，例如Samulski等人(1989)J.Virol.63:3822-3828；及McCarty等人(1991)J.Virol.65:2936-2945。已经描述编码Rep和/或Cap表达产物的许多其他载体。参见，例如美国专利号5,139,941。
AAV表达载体和AAV辅助构建体都可被构建以含有一个或多个任选可选择标记。合适的标记包括当细胞在适当的选择性培养基中生长时，向使用包含可选择标记的核酸构建体转染的细胞赋予抗生素抗性或敏感性、赋予颜色或改变其抗原特征的基因。在本公开的实践方法中可用的几个可选择的标记基因包括潮霉素B抗性基因(编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH))，通过赋予潮霉素抗性允许在哺乳动物细胞中进行选择；新霉素磷酸转移酶基因(编码新霉素磷酸转移酶)，通过赋予抗G418抗性允许在哺乳动物细胞中进行选择；等等。其他适合的标记为本领域技术人员所知。
3.AAV附属功能物
宿主细胞(或包装细胞)必须也是具有提供非AAV-衍生功能物或“附属功能物”的能力，以便产生rAAV病毒体。附属功能物是AAV复制所依赖的非AAV衍生的病毒和/或细胞功能物。因此，附属功能物包括至少AAV复制需要的那些非AAV蛋白和RNA，包括涉及以下过程的那些：AAV基因转录的活化、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物的合成和AAV衣壳装配。基于病毒的附属功能物可源自于任何已知的辅助病毒。
具体来说，附属功能物可以通过本领域技术人员已知的方法引入并继而在宿主细胞中表达。附属功能物通常通过用无关的辅助病毒感染宿主细胞来提供。已知许多适合的辅助病毒，包括腺病毒；疱疹病毒如1型和2型单纯疱疹病毒；及牛痘病毒。本文还使用非病毒附属功能物，例如通过应用任何不同的已知试剂使细胞同步所提供的那些。参见，例如Buller等人(1981)J.Virol.40:241-247；McPherson等人(1985)Virology 147:217-222；Schlehofer等人(1986)Virology 152:110-117。
或者，附属功能物可使用附属功能载体来提供。附属功能载体包括提供一个或多个附属功能物的核苷酸序列。附属功能载体能够被引入适合的宿主细胞中以便支持在宿主细胞中有效产生AAV病毒粒子。附属功能载体可呈质粒、噬菌体、转位子、装配型质粒、或另一种病毒形式。附属载体的形式也可以是一种或多种线性化的DNA或RNA片段，当其与合适的控制元件或酶相连时，这些片段可在宿主细胞中转录或表达来提供附属功能物。
提供附属功能物的核酸序列可从天然来源处获得，如来自腺病毒粒子的基因组，或使用本领域中已知的重组或合成方法来构建。就此而言，已对腺病毒衍生的附属功能物进行广泛研究，并且附属功能物所涉及的许多腺病毒基因已得到鉴别并部分地表征。参见，例如Carter,B.J.(1990)"Adeno-Associated Virus Helper Functions,"CRC Handbookof Parvoviruses,第I卷(P.Tijssen编著)及Muzyczka,N.(1992)Curr.Topics.Microbiol.and Immun.158:97-129。具体来说，早期腺病毒基因区域E1a、E2a、E4、VAI RNA及(可能地)E1b被认为参与附属过程。Janik等人(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1925-1929。已对疱疹病毒衍生的附属功能物进行了描述。参见，例如Young等人(1979)Prog.Med.Virol.25:113。还对牛痘病毒衍生的附属功能物进行了描述。参见，例如Carter,B.J.(1990),同上，Schlehofer等人(1986)Virology 152:110-117。
作为用辅助病毒感染宿主细胞或用附属功能载体转染宿主细胞的结果，附属功能物表达反式激活AAV辅助构建体以产生AAV Rep和/或Cap蛋白。Rep表达产物从AAV表达载体上切除重组DNA(包括感兴趣的DNA，例如异源核酸)。Rep蛋白还用来复制AAV基因组。所表达的Cap蛋白装配成衣壳，并且重组AAV基因组被包装到衣壳中。因此，接着生产性AAV复制，并将DNA包装到rAAV病毒粒子中。
重组AAV复制后，可使用多种常规的纯化方法(如CsCl梯度)从宿主细胞中纯化rAAV病毒粒子。此外，如果用感染来表达附属功能，那么残余的辅助病毒可用已知方法灭活。例如，可通过加热至温度约60℃持续例如20分钟或更长时间使腺病毒失活。由于AAV是对热非常稳定的，而辅助腺病毒是热不稳定的，所以这样的处理仅对辅助病毒有效的灭活。
得到的rAAV病毒粒子然后可用于DNA递送(如用于基因疗法)或用于递送基因产物至哺乳动物宿主。
递送异源核酸
本公开还提供将异源核酸递送至靶细胞和/或需要其的个体的方法。在一些实施方案中，需要其的个体是先前已经天然地暴露于AAV且因此具有抗AAV抗体(即AAV中和抗体)的人。基于涉及向例如肝、肌肉、及视网膜(所有组织都受到针对此媒介物的中和抗体的影响)递送AAV基因的临床试验中的积极结果，存在许多这类治疗性应用/疾病靶标。
所述方法一般涉及：(i)施用有效量的所述rAAV病毒粒子至个体，和/或(ii)使靶细胞与所述病毒粒子接触。一般来说，使用体内(“直接”)或体外(“间接”)转导技术向受试者施用rAAV病毒粒子。如果在体外(“间接”)转导，那么可将所需的受体细胞(即“靶细胞”)从个体中除去，用rAAV病毒粒子转导并且再引入到个体中。或者，可使用同基因或异基因细胞，其中那些细胞不会在个体中产生不恰当的免疫应答。
已经描述适用于递送和引入所转导的靶细胞到个体中的方法。例如，可通过在合适的培养基中使重组AAV病毒粒子与细胞结合，并使用常规技术，如DNA印迹和/或PCR，或通过使用可选择的标记来筛选具有感兴趣的DNA的那些细胞来进行细胞体外转导。转导的细胞然后可被配制到药物组合物中，如下更充分地描述，并且组合物通过各种技术，如通过肌内、静脉内、皮下及腹膜内注射被引入受试者。
为进行体内(即“直接”)递送，rAAV病毒粒子可配制到药物组合物中并一般通过胃肠外(例如，通过肌内、皮下、肿瘤内、经皮、鞘内、静脉内等施用)途径施用。
药物组合物将包含足够量的遗传物质来产生治疗有效量的感兴趣的基因表达产物，即其量足以减轻或缓解所讨论的疾病状态的症状或足以带来所需的益处。药物组合物还含有药学上可接受的赋形剂。所述赋形剂包括任何这样的药剂，所述药剂本身不诱导产生对接受所述组合物的个体有害抗体，并且施用时没有不适当的毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体如水、盐水、甘油及乙醇。药学上可接受的盐也可包括在内，例如，无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。此外，这类媒介物中还可能存在辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。广泛多种药学上可接受的赋形剂在本领域中是已知的并且不必在本文中详述。药学上可接受的赋形剂已经充分地在多个出版物中描述，包括，例如A.Gennaro(2000)“Remington:The Science and Practice of Pharmacy,”第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人编著,第7版,Lippincott,Williams,&Wilkins；及Handbook of PharmaceuticalExcipients(2000)A.H.Kibbe等人编著,第3版Amer.Pharmaceutical Assoc。
适当的剂量将取决于除了其他因素之外所治疗的哺乳动物(例如，人或非人灵长类动物或其他哺乳动物)、有待治疗的受试者的年龄和一般状况、所治疗病状的严重性、所讨论的具体治疗性蛋白质、其施用方式。适当的有效量可容易由本领域技术人员确定。
因此，“治疗有效量”将落入相对较宽的范围，该范围可通过临床试验确定。例如，为进行体内注射(即直接注射至骨骼肌或心肌)，治疗有效剂量将大约为约106至约1015个rAAV病毒粒子，例如约108至1012个rAAV病毒粒子。为进行体外转导，有待递送到细胞的rAAV病毒粒子的有效量大约为约108至约1013个rAAV病毒粒子。本领域的普通技术人员可通过建立剂量反应曲线的常规试验来容易地确定其他有效剂量。
剂量治疗可以是单剂量方案或多次剂量方案。此外，受试者可适当地施用多次剂量。本领域技术人员容易确定适当的剂量数目。
当术语感兴趣的细胞(即“靶细胞”)是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农畜、以及动物园动物、实验室动物、运动或宠物动物，如狗、马、猫、奶牛、小鼠、大鼠、兔等时，感兴趣的细胞通常是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，靶细胞是人细胞。
感兴趣的靶细胞包括易受所述rAAV病毒粒子感染的任何细胞。在一些情况下，例如，当所述方法是向靶细胞递送异源核酸的方法时，靶细胞可以是从个体中除去的细胞(例如，“原代”细胞)，或靶细胞可以是组织培养细胞(例如，来自已建立的细胞系)。
示例性靶细胞包括但不限于肝细胞、胰腺细胞(例如，胰岛细胞：α细胞、β细胞、δ细胞、γ细胞和/或ε细胞)、骨骼肌细胞、心肌细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、滑膜关节细胞、肺细胞、T细胞、神经元、神经胶质细胞、干细胞、造血祖细胞、神经祖细胞、内皮细胞、以及癌细胞。示例性干细胞靶细胞包括但不限于造血干细胞、神经干细胞、神经嵴干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞(iPS细胞)、间充质干细胞、中胚层干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞、肌肉干细胞、以及视网膜干细胞。
文中使用的术语“干细胞”是指能自我更新并产生分化后代的哺乳动物细胞(参见，例如Morrison等人(1997)Cell 88:287-298)。干细胞通常也具有以下一种或多种性质：进行非同步或对称性复制的能力，如此分裂后产生的两个子细胞可具有不同的表型；广泛的自我更新能力；以有丝分裂静止形式存在的能力；以及其存在的所有组织中无性再生能力，例如造血干细胞重建所有造血谱系的能力。如本领域的普通技术人员所理解，“祖细胞”与干细胞的区别在于它们通常不具有广泛的自我更新能力并且经常可在它们所衍生的组织中产生谱系的更受限制的亚群，例如仅能产生造血系统中的淋巴谱系或红细胞谱系。如本文所用，术语“干细胞”包括如上所定义的“干细胞”和“祖细胞”两者。
干细胞的特征是存在与用抗体鉴定的特异性表位结合的标记，并且不存在通过缺乏与特异性抗体的结合而鉴定的某些标记。干细胞也可通过体外和体内的功能性测定来鉴定，特别是涉及干细胞产生多重分化后代能力的测定。
感兴趣的适合的干细胞包括但不限于：造血干细胞和由此衍生的祖细胞(美国专利号5,061,620)；神经嵴干细胞(参见Morrison等人(1999)Cell 96:737-749)；神经干细胞和神经祖细胞；胚胎干细胞；间充质干细胞；中胚层干细胞；肝脏干细胞、肌肉干细胞、视网膜干细胞、诱导的多能干细胞(iPS细胞)等。感兴趣的其他造血“祖”细胞包括属于淋巴细胞系的细胞，例如，未成熟的T细胞和B细胞群。
可使用干细胞或祖细胞的纯化群。例如，人造血干细胞可使用对CD34、thy-1有特异性的抗体来阳性选择；或者使用可包括血型糖蛋白A、CD3、CD24、CD16、CD14、CD38、CD45RA、CD36、CD2、CD19、CD56、CD66a、以及CD66b的谱系特异性标记、T细胞特异性标记、肿瘤/癌症特异性标记等来阴性选择。适用于分离中胚层干细胞的标记包括：FcγRII、FcγRIII、Thy-1、CD44、VLA-4α、LFA-1β、HSA、ICAM-1、CD45、Aa4.1、Sca-1等等。神经嵴干细胞可使用对低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)有特异性抗体来阳性选择，和使用标记硫苷脂、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、髓鞘蛋白Po、外周蛋白和神经丝来阴性选择。人间充质干细胞可使用标记SH2、SH3及SH4来阳性地分离。
所采用的靶细胞可以是新鲜的、冷冻的、或已经历先前培养。它们可以是胎儿、婴儿、成人。造血干细胞可得自胎儿肝脏、骨髓、血液、特别是G-CSF或GM-CSF动员的外周血或任何其他常规来源。使干细胞与造血谱系的其他细胞或其他谱系分离的方式对本公开而言不重要。如上所述，基本上同源的干细胞群或祖细胞群可通过选择性分离这样的细胞来获得，这些细胞不存在与分化细胞相关的标记但显示与干细胞相关的表位特征。
可递送给个体的核酸包括任何以上所定义的异源核酸。可使用所述方法递送的蛋白还包括上述蛋白中的任一种的功能性片段；及上述蛋白中的任一种的功能性变体。
在一些实施方案中，蛋白质的治疗有效量是在哺乳动物宿主中产生。使用所述方法是否在哺乳动物宿主中产生具体蛋白质的治疗有效量使用适合于具体蛋白质的测定来容易地确定。例如，当该蛋白质是EPO时，那么测量血细胞比容。
当rAAV编码抗原蛋白时，可使用所述方法递送至个体的合适的抗原蛋白包括但不限于：肿瘤/癌症相关抗原、自身抗原(“自体”抗原)、病毒抗原、细菌抗原、原虫抗原和过敏原；及其抗原片段。在一些实施方案中，对编码rAAV的抗原蛋白的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答将在哺乳动物宿主中诱导。在其他实施方案中，对编码rAAV的抗原蛋白的体液应答将在哺乳动物宿主中诱导，以使得生成对抗原蛋白有特异性的抗体。在许多实施方案中，对编码rAAV的抗原蛋白的TH1免疫应答将在哺乳动物宿主中诱导。使用建立好的方法可容易地确定针对抗原蛋白的免疫应答是否产生。例如，酶联免疫吸附测定可用于确定针对抗原蛋白的抗体是否产生。检测抗原特异性CTL的方法在本领域中是公知的。例如，可利用在其表面表达该抗原蛋白的含有可检测标记的靶细胞来测定血液样品中抗原特异性CTL的存在。
治疗有效量的异源核酸(例如，编码多肽的核酸、RNAi试剂等)是否可使用所述方法递送至哺乳动物宿主可使用任何合适的测定来容易地确定。例如，当基因产物是抑制HIV的RNAi试剂时，可测量病毒负荷量。
生成和鉴定修饰的rAAV病毒粒子的方法
本公开提供一种生成和鉴别修饰的感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子的方法，所述病毒粒子包含变体衣壳蛋白，该蛋白含有具有至少一个与起始AAV衣壳蛋白相比的氨基酸取代(包括缺失、插入等)的氨基酸序列。起始AAV衣壳蛋白包含在SEQ ID NO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列。
所述方法一般涉及生成突变的rAAV病毒粒子文库；以及选择相对于起始rAAV病毒粒子具有改变的性质的修饰的rAAV病毒粒子的文库。起始rAAV病毒粒子包含含有在SEQ IDNO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列的变体AAV衣壳蛋白。本公开还提供文库及包含所述文库的组合物。
在一些实施方案中，重复给定的选择步骤两次、三次、四次或更多次以就改变的病毒粒子性质富集所述AAV文库。在一些实施方案中，在AAV文库的选择之后，对个别克隆进行分离和测序。
突变AAV文库的生成
生成包含一个或多个相对于起始AAV cap基因的突变的突变AAV文库。起始cap基因是含有编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的cap，所述变体AAV衣壳蛋白包含在SEQ IDNO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列。使用任何已知的方法生成在rAAV cap基因中的突变。合适的诱变起始AAV cap基因的方法包括但不限于基于聚合酶链式反应(PCR)的方法、寡核苷酸定点诱变、饱和诱变、环交换诱变、片段改组诱变(即DNA改组)等。用于生成突变的方法在本领域中充分描述。参见，例如Zhao等人Nat Biotechnol.1998 Mar；16(3):234-5；Koerber等人；Mol Ther.2008 Oct；16(10):1703-9；Koerber等人；Mol Ther.2009Dec；17(12):2088-95；美国专利号6,579,678；美国专利号6,573,098；以及美国专利号6,582,914；所有这些文献出于其关于诱变的教导以引用的方式在此并入。
在一些实施方案中，包含在cap基因中的突变的突变AAV文库将使用交错延伸方法生成。交错延伸方法涉及使用基于PCR的方法的cap基因扩增。使用特异性PCR引物引发模板cap基因，然后重复多轮变性和极短时间退火/聚合酶催化的延伸。在每轮中，生长的片段基于序列互补性与不同模板退火并且进一步延伸。重复多轮变性、退火和延伸直至形成全长序列。相比于野生型AAV cap基因，得到的全长序列在cap基因中包括至少一个突变。
使包含包括一个或多个突变的AAV cap序列的PCR产物插入野生型AAV基因组的质粒。结果是AAV cap突变的文库。因此，本公开提供一种突变的AAV cap基因文库，其包含约10至约1010个成员并且在AAV cap基因中包含突变。文库中给定的成员在AAV cap基因中具有约1个至约50个突变。所述文库包含10至约109个不同的成员，各自在AAV cap基因中具有不同的突变。
一旦生成cap突变文库，便产生可基于改变的衣壳性质选择的病毒粒子。文库质粒DNA被转染到适合的宿主细胞(例如293细胞)中，然后引入到辅助病毒细胞中。收集由转染的宿主细胞产生的病毒粒子(rAAV文库粒子)。
文库选择
一旦生成文库，便就具体的病毒粒子性质(即，改变的感染性质)进行选择。病毒粒子如以上所论述地产生(由此产生修饰的rAAV病毒粒子的文库)，并且经受一个或多个选择步骤以鉴定具有改变的感染性质的修饰的rAAV病毒粒子(相对于包含变体衣壳蛋白的感染性rAAV病毒粒子，所述变体衣壳蛋白包含在SEQ ID NO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列)。选择所针对的感染性质可包括但不限于：1)与AAV中和抗体的结合改变(例如，结合减弱)；2)AAV中和抗体的逃避增加；3)对AAV感染有抗性的细胞的感染性提高；以及4)肝素结合的改变。
1.就与AAV中和抗体减少的结合进行选择
在一些实施方案中，就与这类抗体与野生型AAV病毒粒子的结合及野生型AAV病毒粒子的中和(或相对于包含含有在SEQ ID NO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列的变体衣壳蛋白的感染性rAAV病毒粒子)相比与结合至并中和野生型AAV病毒粒子的中和抗体的改变(例如减少)的结合对所述AAV文库进行选择。使AAV文库粒子(AAV文库病毒粒子)与中和抗体接触并且测试AAV文库粒子感染容许宿主细胞的能力。通常，AAV文库粒子与各种浓度的中和抗体接触。降低AAV文库粒子感染性所需的中和抗体浓度越高，AAV粒子对中和的抗性越大。本领域的普通技术人员已知的任何便利的测定都可用于直接测量AAV文库病毒粒子与中和抗AAV抗体的结合(例如，测量结合亲和力)。
2.就AAV中和抗体逃避的增加进行选择
在一些实施方案中，就中和抗体相对于包含含有在SEQ ID NO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列的变体衣壳蛋白的感染性rAAV中和抗体的逃避增加(即对人中和AAV抗体的抗性提高)对所述AAV文库进行选择。使AAV文库粒子在中和AAV抗体(通常是人中和抗AAV抗体)存在下与靶细胞接触。用AAV文库粒子感染细胞合适的时间量后，加入辅助病毒，并且收集成功感染细胞的AAV文库粒子。在一些实施方案中，测量展现成功感染的那些病毒粒子的感染性(例如如上所述)。在一些实施方案中，重复感染循环、辅助病毒的添加、以及AAV粒子的收获一次、两次、三次或更多次。选择可随着中和AAV抗体的变化量(浓度)而发生以就各种程度的逃避进行选择(例如，每个重复轮次都可利用相对于前一轮增加浓度的抗体)。
3.就非容许细胞的提高的感染性进行选择
在一些实施方案中，就非容许细胞(相对于包含含有在SEQ ID NO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列的变体衣壳蛋白的感染性rAAV病毒粒子)的感染性增加对所述AAV文库进行选择。使AAV文库粒子与非容许细胞(例如，非容许细胞群)接触。用AAV文库粒子感染细胞合适的时间量后，加入辅助病毒，并且收集成功感染非容许细胞的AAV文库粒子。在一些实施方案中，重复感染循环、辅助病毒的添加、以及AAV粒子的收获一次、两次、三次或更多次。
4.就改变的肝素结合进行选择
在一些实施方案中，就改变的肝素结合对所述文库进行选择，包括相对于野生型AAV病毒粒子肝素结合(或相对于包含含有在SEQ ID NO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列的变体衣壳蛋白的感染性rAAV病毒粒子)的增加的肝素结合及减少的肝素结合。使AAV文库粒子与肝素亲和基质接触。例如，在容许AAV文库粒子结合至肝素的条件下将AAV文库粒子加到肝素亲和层析柱上。示例性条件包括用0.15M NaCl和50mM Tris在pH 7.5下平衡柱。在允许AAV文库粒子与肝素亲和基质结合后，用几体积的缓冲液洗涤AAV文库粒子/肝素亲和基质复合物，所述缓冲液含有浓度渐增的NaCl并且收集在每个NaCl浓度处洗脱的AAV文库粒子。例如，AAV文库粒子与肝素亲和基质复合物结合后，用含有200mM NaCl的1体积50mM Tris缓冲液pH7.5洗涤AAV文库粒子/肝素亲和基质复合物，并且收集洗脱的AAV文库粒子。洗脱步骤是用含有以下的50mM Tris缓冲液pH 7.5重复进行：约250mM NaCl、约300mM NaCl、约350mM、约400mM NaCl、约450mM NaCl、约500mM NaCl、约550mM NaCl、约600mM NaCl、约650mM NaCl、约700mM NaCl、或约750mM NaCl。
在小于约450mM NaCl的NaCl浓度下洗脱的AAV文库粒子相对于野生型AAV展现减弱的肝素结合性质。在大于约550mM NaCl的NaCl浓度下洗脱的AAV文库粒子相对于野生型AAV展现增强的肝素结合性质。
在一些实施方案中，洗脱的AAV文库粒子通过容许细胞与辅助病毒的协同感染来扩增，并且在肝素亲和基质上再分级。此步骤可重复许多次以便富集具有改变的肝素结合性质的AAV文库粒子。
在本方法中，一个或多个选择步骤可在AAV文库粒子生成之后。例如，在一些实施方案中，所述方法包括选择肝素结合增加，然后选择与中和抗体的结合减少的病毒粒子。在其他实施方案中，所述方法包括选择与中和抗体的结合减少，然后选择肝素结合增加的病毒粒子。在其他实施方案中，所述方法包括选择肝素结合减少，然后选择与中和抗体的结合减少的病毒粒子。在其他实施方案中，所述方法包括选择与中和抗体的结合减少，然后选择肝素结合减少的病毒粒子。在其他实施方案中，所述方法包括选择与中和抗体的结合减少，然后选择干细胞感染性提高的病毒粒子。在其他实施方案中，所述方法包括选择与中和抗体的结合减少，然后选择中和抗体的逃避增加的病毒粒子。在其他实施方案中，所述方法包括选择中和抗体的逃避增加，然后选择与中和抗体的结合减少的病毒粒子。
因此，本公开提供一种包含多个核酸的腺相关病毒(AAV)文库，所述核酸各自包含编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。所编码的变体AAV衣壳蛋白包含至少一个相对于在SEQ ID NO:10-13及26-33的一个中列出的序列的氨基酸取代。本公开提供一种突变腺相关病毒(AAV)粒子的文库，包括多个AAV粒子，其各自包括AAV衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含至少一个相对于在SEQ ID NO:10-13及26-33的一个中列出的序列的氨基酸取代。编码突变AAV衣壳蛋白的核酸如上所述，所编码的突变AAV衣壳蛋白的性质也一样。
本公开还提供一种包含以下至少一个的文库：(i)两个或更多个感染性rAAV病毒粒子，各自包含变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白及异源核酸；(ii)两个或更多个分离的核酸，各自包含编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列；(iii)两个或更多个宿主细胞，各自包含含有编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸；以及(iv)两个或更多个变体AAV衣壳蛋白；其中文库的至少一个成员的变体AAV衣壳蛋白包含具有至少一个相对于在SEQ ID NO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列的氨基酸取代的氨基酸序列。
组合物和试剂盒
还提供供本公开的方法中使用的组合物和试剂盒。所述组合物和试剂盒包括以下至少一个：所述感染性rAAV病毒粒子、所述rAAV载体、包含编码所述变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的所述核苷酸、包含所述核酸(即，包含含有编码所述变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸的所述遗传修饰的宿主细胞)的分离的宿主细胞；所述文库(例如，任何上述文库)；以及所述变体AAV衣壳蛋白。组合物或试剂盒可包括以上的任何适宜组合。组合物或试剂盒还可包括辅助病毒和/或包含编码辅助病毒的核苷酸序列的核酸。试剂盒还可包括用于生成编码修饰的变体AAV衣壳蛋白的核酸(即“突变”核酸)的试剂。
除以上组分之外，所述试剂盒还可包括(在某些实施方案中)实践所述方法的说明。这些说明可以多种形式存在于所述试剂盒中，其中一个或多个可存在于试剂盒中。这些说明可呈现的一种形式是在适合的介质或基质上的印刷信息，例如，印刷有信息的一张或多张纸，在试剂盒的包装中、在包装说明书中等等。这些说明的另一种形式是其上记录有信息的计算机可读介质，例如，磁盘、高密度磁盘(CD)、闪存驱动器等等。可提供的又一种形式的这些说明是网站地址，可以利用该地址通过互联网从该站点远处读取所述信息。
现在已经对本发明作了充分的说明，本领域技术人员显而易见，可以在不偏离本发明的精神或范围的情况下作出许多改变和修改。
实施例
进行以下实施例以便为本领域普通技术人员提供关于如何实施和使用本发明的完整公开和描述，而非意图限定本发明人所认为的本发明的范围，也非意图将下面的实验作为所进行的所有或仅有的实验。已经努力确保所用数值(例如，量、温度等)的精确性，但是应说明某些实验误差和偏差。除非另外指出，份是重量份，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏温度，且压力为大气压或接近大气压。可使用以下标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；ml，毫升；μl，微升；nl，纳升；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌肉内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；i.v.，静脉内；等等。
实施例1：
腺相关病毒(AAV)基因疗法载体迄今为止在若干临床试验中已显示出相当不错的前景。然而，由儿童期暴露或在施用AAV载体之前产生的循环抗AAV抗体阻止AAV基因疗法推广用于许多潜在患者。已经分离了新型AAV变体，其能够在体外和体内增加抗AAV抗体逃避。由使用低和高效力人血清池和人IVIG的选择产生的严格压力进化AAV变体，其能够实现来自个体人血清、人IVIG、及小鼠血清的中和抗体的逃避，迄今为止最广泛的逃避性变体。
材料和方法
细胞系
将细胞系在37℃和5％CO2下培养，并且除非另作说明，否则是从美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)处获得。将HEK293T、HeLa、和HT1080细胞在补充有10％胎牛血清(Gibco,Carlsbad,CA)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的达尔伯克改良伊格尔培养基中培养。将CHO K1和CHO pgsA细胞在补充有10％胎牛血清(Gibco)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen)的F-12K培养基(ATCC)中培养。将Pro5和Lec1细胞在补充有10％胎牛血清(Gibco)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen)的MEM-α培养基(Gibco)中培养。
用于选择的人血清池
18份个体人血清样品是从Innovative Research,Inc.(Southfield,MI)处获得并且测定每份样品的野生型AAV2的中和抗体滴度(表2)。由于个体样品可能在抗体的亲和力和表位特异性两方面具有变化，所以通过混合相等体积的个体血清样品产生三个有效的血清池(α＝A+F+G，β＝B+H+M，且γ＝I+J+N)。在抗体的这些变化存在下的选择将会对许多预先存在的人抗体产生普遍提高的抗性。在Gamimune N、10％人IVIG(Bayer,Elkhart IN)存在下进行后来的选择以选择对甚至更宽范围的抗体的抗性。
表2：个体人血清样品的中和抗体滴度
每份样品的中和抗体(NAb)滴度被报道为降低感染性至在血清不存在下所测量的值的37％所必需的血清体积分数的倒数。然后通过混合等体积数量的三份个体血清样品产生三个血清池(α＝A+F+G，β＝B+H+M，且γ＝I+J+N)。
表2
Figure BDA0000846167780000731
文库生成及病毒产生
为了生成饱和诱变文库，AAV2cap文库是分别使用5’-GCGGAAGCTTCGATCAACTACGC-3’(SEQ ID NO:14)和5’-GGGGCGGCCGCAATTACAGATTACGAGTCAGGTATCTGGTG-3’(SEQ ID NO:15)作为正向和反向引物，通过易错PCR，接着是由Zhao等人所述的交错延伸方法而产生。使用汇集的个体人血清的选择显示含有四个点突变的变体(在结果部分中描述)，它们充当饱和诱变文库的基础。此变体的cap基因通过改变特异性位点处的氨基酸经受进一步诱变。引物5’-cattNNKgaccagtctaggaactgg-3’(SEQ ID NO:16)和相应的反向互补引物被用于诱变R471氨基酸位点。引物5’-gccacaaggacgatgaagaaNNKttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcaNNKaaaacaagtgtggacattg-3’(SEQ ID NO:17)和相应的反向互补引物被用于诱变K532和E548氨基酸位点。引物5’-ccaacctccagagaggcNNKagacaagcagctacc-3’(SEQID NO:18)和相应的反向互补引物被用于诱变N587氨基酸位点。引物5’-ccaactacaacaagtctNNKaatgtggactttactgtggacNNKaatggcgtgtatt-3’(SEQ ID NO:19)和相应的反向互补引物被用于诱变V708和T716氨基酸位点。由含有随机化的cap环区域的AAV2组成的文库和含有来自野生型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9cap基因的改组DNA的文库被包装和汇集用于初始选择步骤(Koerber等人；Mol Ther.2008 Oct；16(10):1703-9；及Koerber等人；Mol Ther.2009 Dec；17(12):2088-95；两篇文献都以引用的方式在此整体并入)。
为了进行第二轮和第三轮进化，随机诱变文库分别使用5’-CATGGGAAAGGTGCCAGACG-3’(SEQ ID NO:20)和5’-ACCATCGGCAGCCATACCTG-3’(SEQ ID NO:21)作为正向和反向引物通过使来自环交换/改组文库和饱和诱变文库的cap基因经受易错PCR而产生，如先前所描述。使用HEK293T细胞(ATCC)，使用磷酸钙转染方法包装有复制能力的AAV文库和在CMV启动子控制下表达GFP的重组AAV载体，并且通过威视派克(iodixonal)梯度离心纯化病毒。在CMV启动子控制下表达GFP或荧光素酶的重组AAV载体(供体内使用)通过Amicon过滤进一步纯化。DNA酶抗性基因组滴度经由定量PCR来测定。(Excoffon等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2009 Mar 10；106(10):3865-70；及Maheshri等人,NatBiotechnol.2006 Feb；24(2):198-204；两篇文献都以引用的方式在此整体并入)。
文库选择和进化
一轮选择被定义为使用AAV初始文库(对于汇集的个体人血清在室温下培养30分钟或在感染之前在37℃下用热灭活的IVIG培养1小时)的HEK293T细胞感染，然后是腺病毒挽救和收获成功的变体。每轮进化由为生成初始文库的cap基因诱变和三轮选择组成。用每个文库进行三轮进化，在每轮进化之间进行克隆分析。每轮进化的初始文库如上所述生成。在第三轮选择之后，将AAV cap基因从成功的AAV变体池中分离并且经由PCR扩增。使用NotI和HindIII将Cap基因插入pXX2重组AAV包装质粒中。然后在University of California,Berkeley DNA测序设备对Cap基因进行测序，并且使用Geneious软件(Biomatters,Auckland,New Zealand)来分析。AAV2衣壳(蛋白质数据库登记号1LP3)的三维模型是由Pymol(DeLano Scientific,San Carlos,CA)提供。
抗体逃避变体的体外转导分析
在感染之前24小时，将HEK293T以3×104个细胞/孔的密度接种。在感染之前，将变体在37℃下用热灭活的IVIG、个体人血清或个体小鼠血清培养1小时，然后用rAAV-GFP在2000的基因组MOI下感染细胞。在感染后48小时使用ImageXpress显微细胞成像和分析系统(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)以及MetaXpress图像分析软件，3.1.0版，多波长细胞评分应用模块(Molecular Devices)对GFP阳性细胞百分比进行评定。
体外转导分析
为了测定相对转导效率，将与亲本野生型AAV血清型相比所选的突变HEK293T、CHOK1、CHO pgsA(缺少所有表面糖胺聚糖)、CHO Pro5(几个糖基化突变的亲本系，包括Lec1细胞)、CHO Lec1(糖基化缺陷性)、HeLa、以及HT1080细胞(人纤维肉瘤细胞系)在感染之前24小时以2.5×104个细胞/孔的密度接种。用rAAV1-GFP、rAAV2-GFP、rAAV6-GFP、改组100.1-GFP、改组100.3-GFP、SM 10.2-GFP、或改组100.7-GFP在100-1000的MOI范围下感染细胞。使用Beckman-Coulter Cytomics FC500流式细胞仪(Beckman-Coulter,Brea,CA)在感染后48小时对GFP阳性细胞百分比进行评定。
抗体逃避变体的体内分析
对于在体内的基因表达分析，在施用重组的改组100-3(参见SEQ ID NO:12)、SM10-2(参见SEQ ID NO:10)、或AAV2载体之前24小时，经由尾静脉注射，用4mg IVIG/只小鼠或磷酸盐缓冲盐水(用于对照小鼠)引发八周龄的雌性Balb/c小鼠。经由尾静脉注射，用在CMV启动子控制下编码荧光素酶的重组AAV载体的1011病毒基因组感染小鼠。对于生物发光成像，用2％异氟烷和氧气麻醉小鼠。以500μg/g体重的剂量腹膜内注射D-荧光素底物(GOLDBiotechnology,St.Louis,MO)。使用VivoVision IVIS Lumina成像器(Xenogen,Alameda,CA)产生图像。针对每只小鼠，在底物注射之后7-10分钟获取腹部图像，每周一次，持续4周。感染后五周，经由心脏穿刺收集血清且然后用.9％盐溶液灌注小鼠。收集心脏、肝脏、肺、肾、脾脏、脑、脊髓及后肢并且冷冻。将冷冻的组织样品匀浆化并且再悬浮于报道基因裂解缓冲液(Promega,Mannheim,Germany)中用于体外荧光素酶分析。含有荧光素酶的裂解物通过在10,000g下离心10分钟来澄清。为了测定样品，将20μL裂解物添加至100μL荧光素酶测定缓冲液中，混合，培养5分钟，并且置于光度计中。以2秒延迟对信号进行积分30秒并以由TD 20/20光度计(Turner Designs,Sunnyvale,CA)检测的相对光度单位(RLU)来报道。将荧光素酶信号对由双金鸡纳酸测定(Pierce)所确定的总蛋白质含量标准化。
结果
结果表明AAV可进化以通过抗AAV抗体在体外和体内显著克服中和。在体外分离与野生型AAV相比需要2至35倍更高的中和抗体滴度(使用人IVIG)的新型AAV变体。抗体中和性质还被解释为在中和抗体存在下在体内增强的转导。对抗AAV抗体有抗性的这类新型克隆的分离允许更广泛的推行基于AAV作为核酸递送载体的治疗(包括目前不适用AAV基因疗法的具有高抗体滴度的个体)。
AAV文库生成和通过定向进化的选择
图1a示出用于分离能够逃避人抗体中和的新型AAV变体的定向进化手段的示意图。使用在以下段落中描述的DNA诱变技术生成病毒文库(图1a，步骤1和2)。在初始选择期间，在HEK293T细胞感染之前，在室温下将由易错PCR突变成AAV2cap基因开发的病毒文库池用低效α人血清池的各种稀释液培养30分钟(步骤3)。在针对低效α人血清池的三轮选择(图1a，步骤4和5)之后，获得对此中和血清池具有提高的抗性的几个变体(图1a，步骤6，图7a)。变体1.45含有两个点突变(N312K、N449D)，从而得到与野生型AAV2相比>10倍的对α池的中和的抗性。
来自变体1.45的cap基因经受另外的随机诱变且就平行针对β和γ池的另外三轮选择对得到的文库进行选择。因为仅在抗体逃避方面观察到微小的改善(数据未示出)，所以将回收的cap基因汇集并经受经由DNA改组和EP PCR的另外的多样化。针对增加量的来自β和γ池两者的血清的又三轮选择产生与野生型AAV2相比在从病毒文库回收的病毒量上的显著富集(图7b、c)。来自两个池的成功的cap基因的测序显示几个低频突变体和单一显性突变体，变体γ4.3，其含有四个点突变(N312K、N449D、N551S、及I698V)，存在于两个文库内。在人IVIG存在下，变体1.45显示对中和的抗性适度1.2倍的提高，而γ4.3显示对中和的抗性3.1倍的提高(图7d)。此观察结果证实以下假设：个体人血清池可用于分离能够具有一般人群中存在的抗体的提高逃避的AAV变体。
变体γ4.3在抵抗由抗AAV抗体的中和方面的一定成功促进了基于γ4.3cap基因的文库的发展。先前被确定为AAV2衣壳上的免疫原性位点的氨基酸位点R471、K532、E548、N587、V708、T716经受饱和诱变，以试图发现可改善γ4.3的抗体抗性的氨基酸突变。此“饱和诱变”文库，连同由7个亲代AAV血清型的随机cap嵌合体组成的“改组”文库和由具有取代的环区域的AAV2cap组成的“环交换”文库一起经受另外三轮选择，其中在HEK293T细胞的感染之前，在37℃下用人IVIG的各种稀释液培养病毒文库池1小时。在用AAV文库感染和经由腺病毒超感染扩增感染性AAV变体之后，对来自每个文库条件的病毒基因组数量或病毒滴度进行定量并且与野生型AAV2的滴度相比较作为用于确定选择成功的方法(图1b)。对于使用饱和诱变和环交换/改组文库的每轮选择，将与野生型AAV2相比产生更高病毒滴度的来自1:10和1:100IVIG稀释条件的病毒池用作后一轮选择的起始点。在三轮选择之后，对成功的病毒cap基因进行分离并且逐一测试以确定具有最高效的基因递送的病毒。另外，从第三轮选择分离的cap基因经受另外轮次的易错PCR诱变，并且重复所述过程以便反复提高病毒的适合度。
图1描绘就增加的抗体逃避对AAV的定向进化。(a)定向进化的示意图。1)通过使用若干互补途径使cap基因遗传多样化来生成病毒文库。2)病毒是使用质粒转染在HEK293T细胞中包装，然后收集并纯化。3)将病毒文库用在若干浓度下的人IVIG培养并且在体外引入HEK293T细胞中。4)扩增成功的病毒并且经由腺病毒超感染来回收。5)成功的克隆通过在降低的MOI下重复选择来富集。6)分离的病毒DNA显示成功的cap基因。7)成功的cap基因再次突变以用作用于选择的新的起始点。(b)从环交换/改组和饱和诱变文库选择抗体逃避突变体。HEK293T细胞用病毒文库感染24小时。高效地感染细胞的病毒粒子通过腺病毒感染扩增，并且挽救的AAV通过qPCR来定量。IVIG的1:10稀释液对应于10mg IVIG/mL的浓度。误差线表示标准偏差(n＝3)。
图7显示基于AAV2的人抗体逃避株的生成。(a)在针对低严格α池的三轮选择之后选出的四个病毒克隆显示在1的MOI下对1μLα血清的抗性提高。另外两轮多样化(即，诱变和DNA改组)和选择(3轮增加的血清量)引起在大量高效(b)β和(c)γ池存在下病毒回收的显著增加。(d)另外，两个病毒克隆(1.45和γ4.3)显示与野生型AAV2相比对预先存在的抗体的高度多样池的抗性提高1.23倍和3.10倍，所述抗体表现出从约100,000个个体汇集的人静脉内免疫球蛋白(IVIg)。
新型进化的AAV变体在体外增加的抗体逃避
在针对人IVIG的9轮筛选之后，在为来自饱和诱变和环交换/改组文库的单个分析所选出和包装的12个克隆中，所有十二个都需要比野生型AAV1和AAV2更高的中和抗体滴度(图2a和表1)。需要比野生型AAV2高35倍的针对中和的体外IVIG浓度的变体改组100-3(参见SEQ ID NO:12)仍能够在1mg/mL IVIG存在下转导大约10％细胞(图2b)。另外，来自AAV2饱和诱变文库的变体SM 10-2需要比野生型AAV2高7.5倍的针对中和的体外IVIG浓度。此外，变体改组100-3和SM 10-2(参见SEQ ID NO:10)示出在来自被排除在乙型血友病临床试验之外的单个患者的血清样品存在下增加的转导(图3)(Nathwani等人,N Engl JMed.2011 Dec 22；365(25):2357-65)。
图2描绘抗体躲避变体的中和曲线。在三轮进化之后分离的抗体躲避突变体的cap基因被用于包装编码GFP的重组AAV并且在HEK293T细胞的感染之前用人IVIG培养。剩余感染性粒子的分数使用高含量荧光成像来测定并且在IVIG不存在下对感染性滴度标准化。示出对IVIG具有抗性的每个文库的两个克隆。所分析的其他克隆的数据展现在表1中。(a)中和曲线。误差线表示标准偏差(n＝3)。(b)来自若干IVIG稀释液的代表性荧光图像显示突变体能够在高浓度的中和抗体存在下进行HEK293T转导。
图3描绘抗体躲避变体的中和曲线。从由于存在针对AAV的高中和抗体滴度而被排除在B型血友病临床试验之外的个体中获取人血清。在HEK293T细胞的感染之前将编码GFP的重组AAV用个体人血清培养。剩余感染性粒子的分数使用荧光显微术来测定并且在人血清不存在下对感染性滴度标准化。误差线表示标准偏差(n＝3)。
十二个克隆的序列分析显示具有最高中和抗体抗性的两个变体，改组100-3(参见SEQ ID NO:12)和改组100-1(参见SEQ ID NO:11)是含有AAV1-4、AAV6、及AAV9的片段的几乎相同的改组衣壳(图4)。在两个变体之间的氨基酸469(AAV6残基与AAV7残基)和598(AAV6残基与AAV1残基)的差异转化为对于改组100-3在中和抗体滴度方面几乎3倍的增加(参见SEQ ID NO:12)(表1)。具有第四最高中和抗体抗性(表1)的变体改组100-7(参见SEQ IDNO:13)也是含有AAV1、AAV6、及AAV8的片段的改组衣壳(图4)，其与显示野生型AAV1和AAV8在躲避抗AAV2抗体方面是有效的报道数据一致。有趣的是，变体SM 10-2(参见SEQ ID NO:10)保留由变体γ4.3获取的点突变并且还保留在饱和诱变位点处的野生型残基。变体SM10-2(参见SEQ ID NO:10)确实在表面残基D472N及内部残基L735Q处获取另外的点突变。
图4描绘环交换/改组及饱和诱变克隆的氨基酸序列。(a)衣壳蛋白示意图示出来自每个文库的具有最高中和IVIG浓度的两个克隆。每个区域根据其所源自的亲代血清型来以阴影示出。黑色箭头表示(从左至右)VP1、VP2、及VP3衣壳蛋白的起始密码子。灰色箭头表示(从左至右)基于AAV2衣壳的表面环区域I、II、III、IV、及V。(b)基于解出的结构的完整AAV2衣壳的分子模型示出来自每个文库的具有最高中和IVIG浓度的两个克隆。每个区域根据其所源自的亲代血清型来以阴影示出。对于变体改组100-3(参见SEQ ID NO:12)，黑色箭头表示与变体改组100-1的差异(参见SEQ ID NO:11)。对于变体SM 10-2(参见SEQ ID NO:10)，突变N449D、D472N、N551S、及I698V是表面突变(黑色)。
表1：文库克隆和亲代血清型的IVIG中和抗体滴度人IVIG被用于中和的具有来自野生型AAV1、AAV2、AAV8、及从环交换/改组和饱和诱变文库中回收的变体的衣壳的重组AAV-GFP载体。示出降低基因递送效率至在IVIG不存在下的50％所需的IVIG浓度(mg/mL)，并且与减少AAV2递送所需的浓度比较。分析的所有变体都需要比野生型AAV1和AAV2更高的IVIG浓度。通过将图2中的曲线拟合至指数曲线来测定中和抗体滴度。SEQ ID NO列为“氨基酸，核苷酸”。
表1
Figure BDA0000846167780000811
变体改组100-3(参见SEQ ID NO:12)、改组100-1(参见SEQ ID NO:11)、及改组100-7(参见SEQ ID NO:13)具有模拟亲代血清型AAV1和AAV6的转导曲线的转导曲线(图5)。另外，在SM 10-2中的突变(参见SEQ ID NO:10)不会阻止肝素依赖(如亲代血清型AAV2中所见)，从而产生类似于AAV2的曲线(图5)。
图5显示新型aav变体的体外向性。表达绿色荧光蛋白的重组AAV载体被用于转导一组细胞系：CHO、pgsA(缺少所有表面糖胺聚糖)、Pro5、Lec1(缺少唾液酸)、HEK293T、HeLa、及HT1080(人纤维肉瘤细胞系)以便概述新型AAV变体的转导性质。误差线表示标准偏差(n＝3)。
新型进化的AAV变体在体内增加的抗体逃避
为了确定变体改组100-3和改组100-7的定位模式，在用AAV2、改组100-3、或改组100-7注射的幼稚小鼠的各种组织中检查荧光素酶酶活性(图6a)。变体改组100-7呈现与AAV2相似的体内向性，但例外的是7倍更高的心脏转导、5倍更高的肺转导、以及4.5倍较低的肝转导。改组100-3变体展现与AAV2相比超过4倍更高的脑转导、超过3倍更高的肺转导、以及27倍更高的肌肉转导。来自这些小鼠的血清分析显示变体改组100-3与AAV1和AAV8相比对于来自给予AAV1、AAV2、AAV8或改组100-3基因递送载体的小鼠的血清来说需要等于或更高的用于中和的体外血清浓度(图11)。改组100-7与AAV1相比对于给予AAV1、AAV2、AAV8、改组100-3、或SM 10-2基因递送载体的小鼠的血清来说需要等于或更高的用于中和的体外血清浓度(图11)。此外，两个变体与测试的所有野生型AAV血清型相比被来自给予AAV2基因递送载体的小鼠的血清中和得更少。有趣的是，变体改组100-3与测试的任何其他血清型或变体相比被针对其免疫的小鼠的血清中和得也更少(图11)。此数据说明这些变体可与野生型AAV血清型组合使用或在需要多个载体施用的应用中与其他变体组合使用。
图11示出在免疫的小鼠血清中文库克隆和亲代血清型的中和抗体滴度。来自施用了文库克隆或野生型AAV的小鼠的血清被用于中和具有来自野生型AAV1、AAV2、AAV8、以及从环交换/改组和饱和诱变文库中回收的变体的衣壳的重组AAV-GFP载体。示出降低基因递送效率至在血清不存在下的50％所需的血清稀释。
为了确定变体改组100-7和改组100-3在体内躲避抗体中和的能力，在AAV注射之前用人IVIG对小鼠进行被动免疫。变体改组100-7与AAV2相比具有显著更强的心脏、肝脏、以及肌肉转导，如通过荧光素酶酶活性来测量(图6b)。变体改组100-3与AAV2相比具有显著更高的心脏和肌肉转导(图6b)。
图6显示新型AAV变体的体内定位及中和。(a)经由尾静脉注射向雌性BALB/c小鼠施用编码荧光素酶的重组AAV载体。5周以后，对于所分析的每份样品，测定荧光素酶活性水平并且对总蛋白质进行标准化。(b)在尾静脉注射4mg人IVIG之后24小时，经由尾静脉注射向雌性BALB/c小鼠施用表达荧光素酶的重组AAV载体。5周以后，将荧光素酶表达水平对所分析的每份样品的总蛋白质进行标准化。误差线表示标准偏差(n＝3)，*＝p<0.05。RLU表示相对荧光素酶单位。
从针对个体人血清池选出的基于AAV2的易错文库分离的变体γ4.3含有四个点突变(N312K、N449D、N551S、以及I698V)。有趣的是，这些位置中的两个(N449和N551)先前使用其他人血清池被鉴定为免疫原性残基，表明涉及这些位点的抗原表位是由许多不同的中和抗体所靶向的。因此，这些位点是感兴趣和有价值的突变的靶标。在饱和诱变文库中成对的定向进化和合理设计导致变体SM 10-2的分离，所述变体在体外能够具有比AAV1和AAV2两者更高的抗体抗性。变体SM 10-2将另外两个点突变(D472N和L735Q)并入在变体γ4.3上所见的那些中。先前显示D472N突变提高在HEK293细胞中衣壳的合成水平。类似地，用不带电的谷氨酰胺侧链置换氨基酸位置735处带正电的赖氨酸侧链可起到使衣壳稳定化的作用，其也可存在于变体改组100-7中，但位于装配衣壳的内部之中(图4)。
嵌合AAV衣壳的生成允许形成病毒变体的生成，所述病毒变体可合并来自多个AAV血清型的期望性质。虽然AAV8和AAV9也显示比AAV2对IVIG中和的抗性高得多，但对这些衣壳有特异性的氨基酸仅在选择期间分离的改组变体的表面上以小的间距存在(图4)。呈现更高效的体外抗体中和逃避的变体(改组100-3)呈现与其亲本血清型AAV1和AAV6相似的体外向性，但在比野生型血清型更高的感染速度下。在变体改组100-1与改组100-3之间的氨基酸469和598中的差异转化成对于改组100-3几乎3倍的中和抗体滴度增加。Lochrie等人的研究报道由人血清和IVIG识别的免疫原性残基是不同的，表明不同的人可针对AAV衣壳上的不同的表位集合产生各种中和抗体并且从中和中的完全逃脱是不容易的(Lochrie等人,J Virol.2006 Jan；80(2):821-34)。研究表明使用含有各种量和效力的抗AAV抗体的若干不同血清池的多轮定向进化的使用将导致新型AAV变体的分离，所述变体在多个抗AAV抗体池存在下在体外和在体内能够具有提高的细胞转导。
在动物和人中对AAV载体组分的适应性免疫应答经常阻止再施用相同血清型的AAV载体，使得需要多个载体施用的基因递送应用变得困难。使用来自用于生物分布研究中的小鼠的血清的体外中和测定显示，变体与野生型AAV相比被这些血清中和得更少(图11)，其可适用于其中必须再施用载体的基因疗法策略。例如，改组100-3不被来自用AAV2注射的小鼠的血清中和，且AAV2不被来自用改组100-3注射的小鼠的血清中和，提示此变体可与野生型AAV血清型组合使用或用于需要多个载体施用的应用中。总之，使用定向进化来分离新型AAV变体，所述变体在体外和体内具有减少的由源自于个体人患者、汇集的人血清、及小鼠血清的抗AAV抗体的中和。
尽管已参考其具体实施方案描述本发明，但是本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的实际精神和范围下，可以对本发明进行各种修改且用等价物替换。另外，可以进行很多修改，使特定的情形、材料、物质组成、方法、方法步骤适应本发明的目标、精神和范围。所有这类修改意欲落入所附权利要求的范围内。
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Claims (21)

1.一种感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，其包含：
(a)变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其(1)包含与在SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列的氨基酸203-736具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，且(2)如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:28的氨基酸序列所示；以及
(b)异源核酸，
其中所述感染性rAAV病毒粒子展现与由AAV2展现的抗性相比大至少5倍的对人AAV中和抗体的抗性。
2.根据权利要求1所述的感染性rAAV病毒粒子，其中所述感染性rAAV病毒粒子展现与由AAV2展现的抗性相比大至少10倍的对人AAV中和抗体的抗性。
3.根据权利要求1所述的感染性rAAV病毒粒子，其中所述感染性rAAV病毒粒子展现与由AAV2展现的抗性相比大至少30倍的对人AAV中和抗体的抗性。
4.根据权利要求1-3任一项所述的感染性rAAV病毒粒子，其中所述感染性rAAV病毒粒子展现与由AAV2展现的哺乳动物细胞转导相比在人AAV中和抗体存在下提高的哺乳动物细胞转导。
5.根据权利要求4所述的感染性rAAV病毒粒子，其中所述哺乳动物细胞是肝细胞、胰腺细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、滑膜关节细胞、肺细胞、T细胞、神经元、神经胶质细胞、干细胞、内皮细胞、或癌细胞。
6.根据权利要求5所述的感染性rAAV病毒粒子，其中所述干细胞是造血干细胞、造血祖细胞、神经干细胞、神经祖细胞、神经嵴干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞(iPS细胞)、间充质干细胞、中胚层干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞、胰腺祖细胞、肌肉干细胞、或视网膜干细胞。
7.根据权利要求1-6任一项所述的感染性rAAV病毒粒子，其中所述异源核酸选自：i)编码多肽的核苷酸序列；或ii)RNA干扰剂。
8.一种分离的核酸，其编码变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，所述衣壳蛋白(1)包含与在SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列的氨基酸203-736具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，且(2)如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:28的氨基酸序列所示，其中所编码的变体AAV衣壳蛋白向感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子赋予与由AAV2展现的抗性相比对人AAV中和抗体的提高的抗性，其中所述提高的抗性是由AAV2展现的抗性的至少5倍大。
9.根据权利要求8所述的分离的核酸，其中所述提高的抗性是由AAV2展现的抗性的至少10倍大。
10.根据权利要求8所述的分离的核酸，其中所述提高的抗性是由AAV2展现的抗性的至少30倍大。
11.根据权利要求8-10任一项所述的分离的核酸，其中所述变体AAV衣壳蛋白向感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子赋予与由AAV2展现的转导相比在人AAV中和抗体存在下提高的哺乳动物细胞转导。
12.一种分离的宿主细胞，其包含根据权利要求8-11任一项所述的核酸。
13.根据权利要求12所述的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞用所述核酸稳定地转染。
14.根据权利要求12或13所述的分离的宿主细胞，其还包含编码AAV rep蛋白的核酸。
15.根据权利要求12-14任一项所述的分离的宿主细胞，其还包含重组AAV载体。
16.根据权利要求1-7任一项所述的感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子在制备供一种向需要其的个体递送基因产物的方法使用的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述异源核酸选自：i)编码多肽的核苷酸序列；或ii)RNA干扰剂。
18.一种变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其(1)包含与在SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列的氨基酸203-736具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，且(2)如SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:28的氨基酸序列所示，其中所述变体AAV衣壳蛋白向感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子赋予与由AAV2展现的抗性相比对人AAV中和抗体的提高的抗性，其中所述提高的抗性是由AAV2展现的抗性的至少5倍大。
19.根据权利要求18所述的变体AAV衣壳蛋白，其中所述提高的抗性是由AAV2展现的抗性的至少10倍大。
20.根据权利要求18所述的变体AAV衣壳蛋白，其中所述提高的抗性是由AAV2展现的抗性的至少30倍大。
21.根据权利要求18-20任一项所述的变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白向感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子赋予与由AAV2展现的哺乳动物细胞转导相比在人AAV中和抗体存在下提高的哺乳动物细胞转导。
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