CN1966082B

CN1966082B - 一种防治结直肠癌的基因药物及其制备方法和用途

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Publication number: CN1966082B
Application number: CN2006100973849A
Authority: CN
Inventors: 许瑞安; 冯戬云; 朱健华
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-11-03
Filing date: 2006-11-03
Publication date: 2010-06-30
Anticipated expiration: 2026-11-03
Also published as: CN1966082A

Abstract

本发明涉及基因药物领域，具体设计基于基因kallistatin和vasostatin的两种治疗结直肠癌的基因药物及制备工艺，和采用该药物进行结直肠癌的治疗，以及增强结直肠癌化疗或放疗疗效的应用。基因kallistatin和vasostatin的载体为杂合腺病毒相关病毒(AAV)，优选为AAV7/8。基因药物的剂型为注射剂或冻干粉针，给药途径优选为肌肉注射。

Description

一种防治结直肠癌的基因药物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及分子药物学、分子医学和疾病防治领域，具体涉及基于基因kallistatin和vasostatin的两种治疗结直肠癌的基因药物、制备工艺、以及采用该药物进行结直肠癌的治疗，以及增强结直肠癌化疗或放疗疗效的应用。

背景技术

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率占全球常见肿瘤的第3位。在欧洲和美国结直肠癌的发病率则排在第2位，仅次于肺癌(男性)和乳癌(女性)。目前结直肠癌的新发病例超过90万/年，死亡病例为50万/年。

结直肠癌的发病原因为遗传因素和环境因素的结合。遗传因素约占20％，主要为遗传性易发病，如家族性腺瘤性息肉，遗传性非息肉病性结肠癌，以及其它家族性肿瘤。环境因素约占80％，主要为饮食结构中低纤维，低蔬菜，低叶酸，高脂肪，高牛羊肉；抽烟，喝酒；体力活动缺乏等。尽管结直肠癌可以发生于不同的年龄，产生于不同的原因，但一个特点是共同的：即均经过从正常上皮细胞，转化为息肉，再变化为肿瘤细胞的过程。在这个过程中，可以发生一系列遗传基因的变化，如抑癌基因的失活，致癌基因的活化；分子生物学研究发现有p53，Apc和k-ras基因的突变，APC蛋白的变化，微卫星DNA的不稳定，基因杂合性丢失等。遗传性生殖细胞缺陷，或环境因素引起的体细胞的突变，都可以促进结直肠癌的的发展。

手术治疗是目前结直肠癌最主要的治疗手段。但结肠直肠癌的手术治疗预后与其所处阶段密切相关。在20世纪80年代，Dukes’A期、Dukes’B期、Dukes’C期的肿瘤病人5年生存率分别为82％、73％、40％。随着诊疗技术上的进步，新的治疗策略使得结肠直肠癌病人的手术治疗后5年生存率均得到了一定的提高，发达国家Dukes’A期提高为90％，Dukes’B期提高为75％。但在国内，由于早期发现、早期诊断率很低，往往确诊后即为肿瘤晚期或已转移，手术治疗的效果非常不理想，术后总体的五年生存率仅在50％-60％。对于肿瘤晚期病人和术后肿瘤转移病人，特别需要其它辅助性手段，在肿瘤细胞长大并危害病人身体之前，将潜在的肿瘤细胞加以彻底消灭。放疗和化疗作为的常规辅助性治疗手段，虽然可以取得明显的效果，但由于其固有的严重不良反应，临床上迫切需要新的结直肠癌治疗药物的开发。

肿瘤的生长浸润依赖于肿瘤内新生血管的形成，以肿瘤新生血管为靶点的抗血管生成治疗已成为抗肿瘤研究的热点。

在众多血管生成抑制因子中，Kallistatin是一新型的具有抗血管生成作用的内源性蛋白(Miao RQ，et al.Blood 2002；100：3245-52)，其抗血管生成作用与内皮抑素类似。内皮抑素通过其肝素结合活性介导其对血管生成的抑制作用。各种生长因子必须结合细胞表面两种不同的受体，才能引发一个信号。硫酸肝素糖蛋白(HSPGs)是最普通的低吸附受体，在调节多种生长因子的作用时，发挥关键作用。许多生长因子，如VEGF和bFGF是肝素结合生长因子，VEGF和bFGF与内皮细胞表面的HSPGs结合，可以调节它们与专属受体的结合。Kallistatin是肝素结合蛋白，可以与VEGF和bFGF，以及其它含有肝素结合区的生长因子竞争结合HSPGs，因此阻断了这些生长因子与HSPGs的结合，阻断了这些生长因子引发的血管生成事件。另外，kallistatin还是丝氨酸蛋白酶抑制剂的一员，最初被认为是组织胰激肽原酶结合蛋白。越来越多的证据显示，组织胰激肽原酶在肿瘤相关事件中非常重要，其中包括肿瘤生长调节，血管生成，侵入和转移等。

Vasostatin因可以显著抑制内皮细胞的增殖和小鼠肿瘤的生长(Pike SE，et al.J ExpMed 1998；188：2349-56)，也是肿瘤抗血管生成的良好候选对象。

Kallistatin和vasostatin通过循环系统分布后，可以靶向性作用于肿瘤活化的内皮细胞。因为宿主的大部分内皮细胞处于静息状态，仅在伤口愈合和再生等生理性血管生成过程中，内皮细胞才处于活化状态。肿瘤生成血管的内皮细胞增殖活跃，分化度低，而成人组织的大部分内皮细胞增殖非常迟缓，为高分化表型。因此在循环系统的kallistatin和vasostatin，可以选择性作用于应用肿瘤新生成血管。

抗血管生成治疗肿瘤被赋予了极大的希望，但已进行的有关临床实验却未取得预期的效果。其中最关键的原因是瘤体内难以达到有效药物浓度，或不能长时间维持有效药物浓度。

基因治疗药物，可以实现目的蛋白在人体内的长期稳定的表达，为解决上述问题提供了思路。AAV(腺相关病毒)作为基因治疗的载体，具有可以同时感染分裂和非分裂细胞，无明显致病性，表达时间长等优点，是非常具备应用前景的载体之一，本课题组在先期的专利申请(CN1836732A)中公开了rAAV(重组腺相关病毒)介导的kallistatin和vasostatin基因药物，其在体内和体外均可以高效表达kallistatin和vasostatin，可以显著抑制肿瘤血管的生成。

AAV作为基因治疗的载体，具有可以同时感染分裂和非分裂细胞，无明显致病性，表达时间长等优点，是非常具备应用前景的载体之一，但病毒滴度低，转染效率差等缺点，限制了其进一步的应用。目前已发现多种血清型的AAV，对不同的组织和细胞有不同的感染效率，原因在于不同血清型AAV的衣壳蛋白的差别。对AAV载体的选择和优化，将是提高感染效率的有效手段。

对于结直肠癌中晚期病人，肿瘤已侵入黏膜肌层，以及肠壁全层，甚至已经发生了淋巴结转移，现有的治疗方法已经难以有效治疗。迄今，尚无人采用rAAV杂合载体介导kallistatin或vasostatin进行结直肠癌的治疗报导，我们的研究为结直肠癌的治疗提供了新手段。

发明内容

本发明的目的是提供可以治疗结直肠癌的新的基因药物。该基因药物为杂合rAAV载体介导的kallistatin或vasostatin，该载体的基因表达框依次含有AAV2 ITR(invertedterminal repeat sequence)，CMV增强子/鸡β-actin启动子，WPRE(woodchuck hepatitisvirus post-transcriptional regulatory element)，polyA，和AAV2 ITR；含kallistatin或vasostatin cDNA的PCR产物经酶切后，插入上述AAV2载体中，构成rAAV2-kallistatin或AAV2-vasostatin重组载体，经无辅助病毒多质粒法制备重组病毒，得到基因药物。本发明所进行的实验证明，无论在体外还是在体内，本发明的基因药物rAAV-kallistatin或rAAV-vasostatin均可以高效表达kallistatin或vasostatin，荷瘤小鼠在应用本发明的基因药物后，可以显著地抑制肿瘤血管的生成、肿瘤细胞的增殖和肿瘤生长。本发明以30余个血管抑制基因为候选对象，通过荷瘤小鼠的体内抑瘤试验，筛选出kallistatin和vasostatin两种基因，对人结肠癌细胞株HCT116具有明显的抑瘤作用。kallistatin和vasostatin两种基因通过rAAV介导，可以在小鼠体内长期稳定的高表达，从而发挥抑制/治疗肿瘤的效果。本发明中所用的AAV皆为重组AAV即rAAV。

与以前所有的报道的有关抗血管形成因子不同，这些已报道的抗血管形成因子，包括angiostatin，没有抑制内上皮细胞分裂的功能。本发明首次采用一种可以抑制内上皮细胞分裂的kallistatin基因直接于直肠癌防治。

AAV感染细胞，必须首先与细胞相应的表面受体结合，然后被摄入胞内，转运至细胞核，才能进行复制和表达。不同血清型的AAV，其衣壳蛋白虽然具有高度的同源性，但氨基酸序列的细微差异，决定了其细胞趋向性(tropism)的差别，即它们可以结合的细胞表面受体或共受体各有不同。细胞趋向性的差别，导致不同血清型的AAV转染细胞的类型和感染效率各有差异。如将AAV衣壳蛋白的结构和组成加以改变，则有可能产生细胞趋向性迥然不同的新rAAV载体，其可以结合的受体种类，对某种细胞的感染效率也会发生变化。本发明在组装rAAV载体时，将原来单一的AAV辅助质粒，改为两种不同的AAV辅助质粒，结果在得到的rAAV的衣壳中，含有不同血清型的衣壳蛋白，试验发现，这样新的杂合rAAV的细胞趋向性，不仅继承了两种亲代AAV的细胞趋向性，并且感染效率得到大大提高。

我们将AAV1，AAV7和AAV8进行杂合试验，发现所生成的不同的杂合衣壳蛋白对肌肉的感染效率均较亲代有明显提高。我们以eGFP为报导基因，利用杂合rAAV介导，比较了杂合rAAV和亲代rAAV以及常用载体rAAV2的感染效率。所采用的制备工艺与实施例一致。试验所采用的感染复数(MOI)为5×10⁴。通过流式细胞仪分析转染效率。

其结果为rAAV7/8-eGFP＞rAAV1/8-eGFP＞rAAV1/7-eGFP＞rAAV8-eGFP≥rAAV7-eGFP≈rAAV1-eGFP＞rAAV2-eGFP。

rAAV1/7表示杂合的衣壳蛋白组合为AAV1和AAV7(rAAV1/8、rAAV7/8同)。

可见杂合rAAV的转染效率均有所提高，其中rAAV7/8在所有的实验载体中，转染效率最高，可作为kallistatin和vasostatin携带载体，可望在循环系统中长期维持较高的kallistatin或vasostatin的药物浓度水平。

下面是本发明的基因药物的部分药理学试验：

一、取7-8周龄裸鼠，皮下接种2×10⁶人结肠癌细胞HCT116。一周后将实验动物分为3组：a)rAAV7/8-eGFP对照组；b)rAAV7/8-kallistatin治疗组；c)r AAV7/8-vasostatin治疗组。每组5只，瘤内注射给药，剂量为2×10¹¹病毒滴度/鼠，所用药物分别为实施例1和2所制备。

在不同的时间，测定动物肿瘤体积。肿瘤体积按照公式V＝LW²/2计算，式中V为肿瘤体积，L为肿瘤长度，W为肿瘤宽度。不同组动物肿瘤体积变化情况见图1，可见治疗组肿瘤体积增加速率明显慢于对照组。

给药28天后将小鼠处死，比较典型病例肿瘤的体积(见图2)，可见治疗组肿瘤的体积明显小于对照组。

二、取7-8周龄裸鼠，皮下接种2×10⁶人结肠癌细胞HCT116。一周后将实验动物分为3组：a)r AAV7/8-eGFP对照组；b)rAAV7/8-kallistatin治疗组；c)rAAV7/8-vasostatin治疗组。每组5只，肌肉注射给药，剂量为2×10¹¹病毒滴度/鼠，所用药物分别为实施例1和2所制备。观察不同组动物肿瘤生长情况。给药28天后将小鼠处死，进行肿瘤组织切片，测定微血管密度。

将小鼠肿瘤进行病理切片，经HE染色，结果见图3。

将小鼠肿瘤进行肿瘤组织切片，通过内皮细胞抗原CD34染色，测定微血管密度，结果见图4。可见两组治疗组的肿瘤微血管密度，明显低于对照组。

以上结果说明rAAV7/8-kallistatin和rAAV7/8-vasostatin经肌肉注射后，可以产生具有血管抑制作用的蛋白kallistatin和vasostatin，并发挥了明显的肿瘤血管抑制作用。

三、取7-8周龄裸鼠20只，分为4组：a)rAAV7/8-eGFP对照组；b)rAAV7/8-kallistatin实验组；c)rAAV7/8-vasostatin实验组；d)正常组(无病毒注射)。rAAV肌肉注射给药，剂量为2×10¹¹病毒滴度/鼠，给药28天后将小鼠处死。观察所有动物的行为变化。

结果显示病毒注射组与无病毒注射其动物的行为变化没有明显差异。表明杂合rAAV病毒注射不影响动物的行为变化。

四、取7-8周龄小鼠，分为2组，每组5只：a)rAAV2-vasostatin组；b)rAAV7/8-vasostatin组。rAAV肌肉注射给药，剂量为2×10¹¹病毒滴度/鼠，在给药后2和4周尾静脉取血，W-blotting法测定vasostatin蛋白表达。结果见图5，可见rAAV7/8-vasostatin组vasostatin表达水平较rAAV2-vasostatin组高。

本发明的基因药物的制备方法包括无辅助病毒多质粒法，即采用磷酸钙法将表达质粒与辅助质粒共转染293细胞，60-72小时后收获重组病毒，经层析纯化后备用，其特征在于：rAAV重组表达质粒的基因表达框中依次含有AAV2 ITR，CMV增强子/鸡β-actin启动子，kallistatin或vasostatin cDNA，WPRE，polyA，和AAV2 ITR；AAV辅助质粒为两种，分别表达不同血清型rAAV的衣壳蛋白。

本发明提供一种新的给药途径，采用杂合rAAV载体直接肿瘤注射方法，取得良好的治疗效果。

本发明还公开了一种药物组合物，含有本发明的基因药物及药学上可以接受的载体。所述组合物可以是药学上常用的剂型，优选注射剂或冻干粉针。

本发明提供了基因药物kallistatin或vasostatin一种最方便的给药途径。本发明发现杂合rAAV可以高效率地转染肌肉细胞，因而肌肉注射rAAV-kallistatin或rAAV-vasostatin后，可望在循环系统中长期维持较高的kallistatin或vasostatin的药物浓度水平。

本发明可以与放疗和化疗相结合应用，增强现有结直肠癌医治手段的疗效，降低毒副作用。同时本发明结果显示病毒注射组与无病毒注射其动物的行为变化没有明显差异。表明杂合rAAV病毒注射不影响动物的行为变化。采用杂合rAAV载体直接肿瘤注射方法是安全可行的。

附图说明

图1.荷瘤裸鼠瘤内注射不同的rAAVs(剂量为2×10¹¹病毒滴度/鼠，每组5只)后肿瘤的生长曲线。

图2.荷瘤裸鼠瘤内注射不同的rAAVs后的代表病例。裸鼠皮下接种HCT 116，7天后瘤内注射rAAVs(剂量为2×10¹¹病毒滴度/鼠)，28天后处死，测定肿瘤体积。左：rAAV7/8-eGFP对照组；中：rAAV7/8-kallistatin治疗组；右：rAAV7/8-vasostatin治疗组。rAAV7/8-eGFP肿瘤体积明显大于rAAV7/8-kallistatin和rAAV7/8-vasostatinr治疗组。

图3.荷瘤裸鼠肌肉注射不同的rAAVs后，肿瘤的病理切片。

肿瘤组织切片后，进行HE染色。(上图)rAAV7/8-kallistatin；(下图)治疗组rAAV7/8-vasostatin。

图4.荷瘤裸鼠肌肉注射不同的rAAVs后，肿瘤的微血管密度比较。

肿瘤组织切片后，进行CD34免疫组化染色。(上图)对照组rAAV-EGFP；(中图)治疗组rAAV-kallistatin；(下图)治疗组rAAV-vasostatin。

图5.荷瘤裸鼠肌肉注射rAAV7/8-vasostatin和rAAV2-vascstatin后，在2周和4周后取血，Western-blot法测定vasostatin的表达。

1.rAAV2-vasostatin(2周)；2.rAAV7/8-vasostatin(2周)；3.rAAV2-vasostatin(4周)；4.rAAV7/8-vasostatin(4周)。

以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。

具体实施方式

实施例1

rAAV7/8-kallistatin的制备

人kallistatin全长cDNA通过PCR由人肝第一链cDNA扩增。扩增kallistatin的专属引物为Kalli-F(5’-AAGAATTCGAGGATGCATCTTATCGAC)和Kalli-R(5’-AAGGTA CCAAGCTTCTATGGTTTCGTGGGGTC)。限制性酶切位点(下划线部分)被引入以方便亚克隆。PCR条件为94℃，50℃和68℃各45秒，共36循环。PCR产物经测序验证其正确性，并亚克隆至AAV-2表达载体上，获得rAAV2-kallistatin表达质粒。该表达质粒的启动子为CMV增强子/鸡β-actin启动子。为加强表达，在插入基因后，还引入了WPRE元件。

采用磷酸钙钙无辅助病毒多质粒法制备重组病毒：将该表达质粒，AV辅助质粒，与AAV7辅助质粒和AAV8辅助质粒共转染293细胞，60-72小时后收获重组病毒，层析纯化后即得。

实施例2

rAAV7/8-vasostatin的制备

人vasostatin全长cDNA通过PCR由人肝第一链cDNA扩增。扩增vasostatin的专属引物为Vas-F(5’-AACTCGAGCC CGCCATGCTG CTATCC)和Vas-R(5’-AAAAGCTTCTAGTTGTCTGG CCGCACAAT)。限制性酶切位点(下划线部分)被引入以方便亚克隆，在引物Vas-R中引入了终止密码子(加粗部分)。PCR条件为94℃，50℃和68℃各45秒，共36循环。PCR产物经测序验证其正确性，并亚克隆至AAV-2表达载体上，获得rAAV2-kallistatin表达质粒。该表达质粒的启动子为CMV增强子/鸡β-actin启动子。为加强表达，在插入基因后，还引入了WPRE元件。

实施例3

重组病毒注射剂的制备

取实施例1方法制得的重组病毒rAAV7/8-kallistatin 2×10¹⁵病毒滴度，加入注射用生理盐水至1000ml，无菌过滤，分装至2ml西林瓶中，即得。

实施例4

注射用重组病毒的制备

取甘露醇50克，加入注射用生理盐水800ml溶解，加入实施例2方法制得的重组病毒rAAV7/8-vasostatin 2×10¹⁵病毒滴度，再加入注射用生理盐水至1000ml，无菌过滤，分装至5ml西林瓶中，每瓶1ml，冻干即得。

Claims

1.一种用于防治结直肠癌的基因药物，其特征在于：治疗基因为kallistatin或vasostatin；基因表达框中依次含有AAV2 ITR，CMV增强子/鸡β-actin启动子，kallistatin或vasostatin cDNA，WPRE，polyA，和AAV2 ITR；基因载体为重组杂合腺病毒相关病毒rAAV，其中杂合腺病毒相关病毒rAAV的衣壳蛋白由AAV1和AAV7、AAV1和AAV8、或AAV7和AAV8组成。

2.权利要求1的基因药物，其中杂合腺病毒相关病毒rAAV的衣壳蛋白由AAV7和AAV8组成。

3.权利要求1或2的基因药物的制备方法，包括无辅助病毒多质粒法，即采用磷酸钙法将表达质粒与辅助质粒共转染293细胞，60-72小时后收获重组病毒，经层析纯化后备用，其特征在于：rAAV重组表达质粒的基因表达框中依次含有AAV2 ITR，CMV增强子/鸡β-actin启动子，kallistatin或vasostatin cDNA，WPRE，polyA，和AAV2 ITR；AAV辅助质粒为两种，分别表达不同血清型AAV的衣壳蛋白。

4.一种药物组合物，含有权利要求1或2中的基因药物及药学上可以接受的载体。

5.权利要求4的药物组合物，剂型是注射液或粉针。

6.权利要求1或2的基因药物用于制备防治结、直肠癌的药物的用途。

7.权利要求1或2的基因药物用于制备增强结、直肠癌化疗或放疗疗效、降低副作用的药物的用途。