JP2022544237A - ヒト神経膠芽腫細胞をターゲティングするためのａａｖカプシドバリアント - Google Patents

ヒト神経膠芽腫細胞をターゲティングするためのａａｖカプシドバリアント Download PDF

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Abstract

本明細書において記載されるのは、神経膠腫細胞についてのアフィニティーおよびその形質導入の増大をもたらすアミノ酸置換を有するカプシドタンパク質を有するＡＡＶ粒子である。開示されるカプシドタンパク質は、がんの処置のための任意の治療用導入遺伝子と組み合わせて用いてもよく、これは、ＡＡＶ粒子の製造におけるものを含む。また記載されるのは、特定の腫瘍細胞型についてのアフィニティーおよびその形質導入が増大されたＡＡＶバリアントを同定するための方法である。

Description

関連出願
本願は、２０１９年８月９日に出願された米国仮出願シリアル番号６２／８８４，７１６の出願日の、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下における利益を主張し、当該仮出願は、本明細書において参照して援用される。
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所により付与された助成金番号ＣＡ２２８８７５下において、政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
発明の背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、小さい（２０ｎｍ）複製欠損の非エンベロープウイルスである。ＡＡＶは、分裂していない細胞に感染することができ、宿主細胞ゲノム中に安定に組み込む能力を有する。ＡＡＶは、一般に非病原性であるため、それは、in vivoで遺伝子を細胞に送達するための魅力的なツールである。in vivoで異なる細胞について異なるアフィニティーを有する、天然に存在するおよび人工のＡＡＶのいくつかの血清型が知られている。これらの血清型は、ＡＡＶカプシドタンパク質により決定される。ＡＡＶは、典型的には約１：１：１０の比において存在する３つのカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３（それぞれ８７、７２および６２キロダルトン）を含む。異なるＡＡＶ血清型は、遺伝子ベースの治療を標的臓器にターゲティングするために利用され得る、特定の臓器向性を有する（例えば、Surace et al., Vision Res. 2008, 48(3):353-9；Zincarelli et al., Mol Ther. 2008,16(6):1073-80を参照）が、一方で、特定の臓器または組織を標的とするためのＡＡＶにおける効率の増大は、多大な利益となるであろう。かかる組織または細胞型の一例は、神経膠腫である。
発明の要旨
本明細書において提供されるのは、神経膠芽腫などのがんの処置のための、ウイルスベクター、および特に組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。本明細書においてさらに提供されるのは、神経膠芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫幹細胞様細胞（ＧＳＣ）および神経膠腫幹細胞様細胞の形質導入の改善を示す、新規のｒＡＡＶカプシドタンパク質バリアントである。開示されるカプシドバリアントは、がんの処置のためのＡＡＶ粒子の製造において、任意の治療用導入遺伝子と組み合わせて用いてもよい。したがって、本開示は、ｒＡＡＶ粒子、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物、および神経膠芽腫または神経膠腫を罹患しているかまたはこれを診断されている対象におけるがんの処置のための方法を提供する。本明細書においてさらに提供されるのは、特定の腫瘍細胞型についてのアフィニティーおよびその形質導入が増大しているＡＡＶバリアントを同定する方法である。
本明細書においてさらに開示されるのは、腫瘍細胞型に特異的な結合が増強されたｒＡＡＶカプシドを作製するための方法である。いくつかの側面において、これらの方法は、定向進化スクリーニングにおけるもののような、複数の進化の相互作用を含む。いくつかの側面において、方法は、ｒＡＡＶカプシドバリアントのライブラリーを作製することを含む。方法は、ＡＡＶライブラリー試薬の動的な投与の様式の使用を含む。ＡＡＶライブラリーの送達を、少なくとも部分的に、マウスモデル腫瘍などの対象腫瘍における腫瘍進行と同期させてもよい。
したがって、いくつかの側面において、異なるｃａｐタンパク質を含むＡＡＶライブラリーが、腫瘍を保有するマウスに投与される。腫瘍は、移植されたものであっても（腫瘍細胞の注射などにより）、自然発症的に生じたものであっても、または誘導したものであってもよい。ＡＡＶライブラリーは、注入により腫瘍に投与してもよい。腫瘍が発達して増殖するにつれて、注入のレベルを増大させる。いくつかの態様において、ＡＡＶライブラリーの腫瘍内注入は、持続的である。初めは注入速度はゆっくりである。腫瘍が増殖するにつれて、注入速度を、腫瘍増殖の早期および後期と同期させる。ＡＡＶライブラリーの腫瘍内注入速度を、腫瘍増殖の早期および後期と同期させることにより、単回腫瘍内注射と比較して、ＡＡＶの腫瘍細胞に対する結合および遺伝子送達のほぼ１０倍の増大が観察され得る。
神経膠腫は、脳および脊髄における膠細胞の腫瘍である。３つの型の膠細胞が、腫瘍を生じ得る。神経膠腫は、腫瘍に関与する膠細胞の型、ならびに腫瘍の遺伝的特徴に従って分類され、これは、腫瘍が経時的にどのように挙動するか、および効く可能性が最も高い処置を予測するために役立つ。神経膠腫の型として、以下が挙げられる：星細胞腫（星状膠細胞の腫瘍）（これは、星細胞腫、未分化星状細胞腫および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）を含む）；上衣腫；および乏突起神経膠腫。ＤＮＡ修復遺伝子ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ２（ＸＰＤ）およびＸＲＣＣ１の遺伝子多型は、神経膠腫のリスクを増大させる。外科手技は、しばしば、神経膠腫のための好ましい初期処置である。ＧＢＭは、星細胞腫の最も高悪性度の形態である。成人においては、ＧＢＭは、最も頻繁には大脳半球において、特に脳の前頭葉および側頭葉において生じる。ＧＢＭは、典型的に診断後の最初の１５か月以内に死亡をもたらす壊滅的な（devastating）がんである。
外科的切除、アジュバント化学療法、および放射線照射を含む現在の治療の標準は、患者の大多数について寛解をもたらさない。最近では、神経膠腫および神経膠芽腫を処置するための遺伝子治療および免疫療法アプローチが開発されている。しかし、神経膠芽腫についての臨床治験に到達した遺伝子治療処置は、失敗した。特に、ウイルスベクターベースの処置は、ウイルスによる送達に伴う問題、不十分な腫瘍浸透、および限定された効力のせいで、ＦＤＡの承認を達成していない。腫瘍細胞などの特定の細胞型への遺伝子送達のためのウイルスベクターベースのコンストラクトについての必要性は、なお存在している。
本開示は、少なくとも部分的に、いくつかの態様においては野生型カプシドタンパク質を含む野生型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ２など）粒子と比較してより高い程度まで、神経膠腫に形質導入することについての向性を示す、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質およびバリアントカプシドタンパク質を含む粒子の同定に基づく。本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶタンパク質の同定は、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質におけるアミノ酸置換または変異を有するカプシドバリアントを含むｒＡＡＶ２カプシドライブラリーの、マウスモデルにおけるin vivoでのスクリーニングに基づいたものである。
本明細書において提供される例において開示されるとおり、周期が遅いまたは早い神経膠芽腫幹細胞様細胞（ＧＳＣ）集団に対して特異的なバリアントについての定向進化スクリーニングにおける、ＡＡＶライブラリー試薬の同期的送達は、標的細胞の感染をもたらした。そして、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）集団に対して特異的なバリアントについての定向進化スクリーニングにおける、ＡＡＶライブラリー試薬の同期的送達は、標的細胞の感染をもたらした。したがって、本開示は、ＧＢＭ細胞に対して、およびＧＳＣ細胞に対して特異的なバリアントについてのスクリーニングにおける、ＡＡＶライブラリー試薬の同期的送達の方法を提供する。
記載されるのは、ＧＢＭおよびＧＳＣの結合および／または形質導入について増大した特異性を有するｒＡＡＶカプシドバリアントである。バリアント、改変されたカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１アミノ酸配列の、アミノ酸２６３～２６７、アミノ酸４４４～４６１、アミノ酸４９０～５０７、アミノ酸５２７～５３２、アミノ酸５４５～５５６、およびアミノ酸５８５～５９６に対応する領域におけるアミノ酸置換、または他の野生型血清型ＶＰ１配列（ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９など）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含んでもよい。
いくつかの側面において、開示されるｒＡＡＶカプシドおよびこれらのカプシドを含む粒子は、特定の細胞マーカー、例えば神経膠芽腫または神経膠腫に関連する細胞マーカーに対して、増大した認識および／または結合を有する。いかなる理論にも拘束されることなく、認識の増大は、これらの細胞マーカーを示す腫瘍細胞に対する結合およびその形質導入の改善を付与し得る。この結合および形質導入の改善は、これらの細胞の増殖の抑制または死を含む、かかる細胞における治療効果の増大をもたらし得る。これらの細胞マーカーは、糖タンパク質を含んでもよい。いくつかの態様において、細胞マーカーは、ＣＤ１３３およびＣＤ４４を含む。いくつかの態様において、ＣＤ１３３＋ＧＳＣ細胞、ＣＤ４４＋ＧＳＣ細胞、ＣＤ４４＋／ＣＤ１３３＋ＧＳＣ細胞、およびＣＤ４４－／ＣＤ１３３－ＧＢＭ細胞の認識が増大したＡＡＶ粒子が記載される。ＧＳＣおよび／またはＧＢＭの形質導入についての特異性の増大に寄与し得るかまたはこれを与え得るＡＡＶカプシドタンパク質におけるアミノ酸置換を、表１～９において示す。
いくつかの態様において、本開示は、神経膠芽腫細胞（ＧＢＭ）および／または神経膠腫幹細胞様細胞（ＧＳＣ）に形質導入するためのｒＡＡＶカプシドおよびウイルス粒子を提供し、これらは、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、または表９のうちのいずれかにおいて記載されるようなアミノ酸置換を含むカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、開示される粒子のうちのいずれかのカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドのアミノ酸配列（配列番号１）の、以下のアミノ酸位置の組み合わせ：
Ｑ２６３、Ｓ２６４、Ｙ４４４、Ｔ４５０、Ｐ４５１、Ｓ４５２、Ｔ４５４、Ｑ４５７、Ｒ４５９、Ｑ４６１、Ｓ４９２、Ａ４９３、Ｄ４９４、Ｅ４９９およびＹ５００Ｆ、もしくは
Ｅ５３１、Ｋ５３２、Ｓ５４７、Ｅ５４８、Ｄ５５３、Ｒ５８５およびＲ５８８；
のうちの１つ、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型の野生型ＶＰ１カプシド配列の相同なアミノ酸位置において、置換を含む。カプシドは、配列番号１に記載されるような野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシド配列のＥ５３０、Ｅ５３１およびＫ５３２における置換をさらに含んでもよい。
これらのｒＡＡＶカプシド粒子のうちのいずれかのアミノ酸置換は、ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドのアミノ酸配列（配列番号１）に対するＱ２６３Ｇ、Ｓ２６４Ｔ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４５０Ａ、Ｐ４５１Ｅ、Ｓ４５２Ｇ、Ｔ４５４Ｌ、Ｔ４５５Ｋ、Ｑ４５７Ｍ、Ｒ４５９Ｈ、Ｑ４６１Ｌ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９ＤおよびＹ５００Ｆのうちの１つ以上、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型の野生型ＶＰ１カプシド配列の相同なアミノ酸を含んでもよい。
いくつかの側面において、本開示は、腫瘍細胞型に対するアフィニティーを有するｒＡＡＶバリアントを同定する方法をさらに提供し、該方法は、腫瘍中へのウイルスベクターライブラリーの持続的腫瘍内勾配注入（graded infusion）を提供することを含む。いくつかの態様において、注入の速度は、腫瘍増殖の速度に対して比例する。
いくつかの側面において、本明細書において提供されるのは、組成物、および記載されるｒＡＡＶ粒子組成物のうちのいずれかをそれを必要とする対象に投与することを含む、処置の方法である。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象などの哺乳動物対象である。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある側面をさらに実証するために含められる。本開示のある側面は、本明細書において提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせた、これらの図面のうちの１つ以上への参照により、より良好に理解され得る。図面において図示されるデータは、決して本開示の範囲を限定しないことが、理解されるべきである。
腫瘍進行と同期したＡＡＶ送達は、単回の腫瘍内注射または脳室内注射と比較して、腫瘍への感染において優れていた。 解離したＧＰＰ＋腫瘍細胞を、Antares発現について選別した。 Antares発現細胞の画分は、同期的持続的注入を用いた場合に、１桁高かった。Ｔ検定ｐ＜０．０１。
ＡＡＶ２ライブラリーによる定向進化スクリーニングにおける、神経膠芽腫（ＧＢＭ）患者由来異種移植片（Patient derived Xenograft：ＰＤＸ）。ＧＦＰ＋腫瘍細胞を、ＣＤ１３３およびＣＤ４４について選別し、典型的な頻度を示した。 ３ラウンドの定向進化スクリーニングの後の、多様なＧＳＣ集団および非ＧＳＣ－ＧＢＭ細胞に形質導入するカプシドバリアント配列のベン図。 全ＧＳＣ集団および非ＧＳＣ－ＧＢＭ細胞集団において濃縮された２３の変異体（Ｍｕｔ）配列（図３を参照）。変異体９、１０、１８、１９および２３が、最も広いオーバーラップを有した。 Antares BLIにより測定されるとおり、バリアント１０および１８は、ＷＴ ＡＡＶ２と比較して、ＧＢＭについての非常に高い効率および特異性を示した。*Ｔ検定ｐ≦０．０５。
図６Ａ：選択の第１ラウンドの後のＣＤ４４＋／１３３＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ１３３＋変異体のオーバーラップ。図６Ｂ：全ＣＤ陽性（ＣＤ４４＋／１３３＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ１３３＋からのＤＮＡのプールされたライブラリー）および全ＣＤ陰性（ＣＤ４４－／１３３－）のプールされたライブラリーのオーバーラップ。 選択の第２ラウンドの後の変異体を有する、全ＣＤ陽性（注射混合物）：ＣＤ４４＋／１３３＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ１３３＋のプールされたライブラリーのオーバーラップ。
図８Ａ：例に従ったＡＡＶのスクリーニングおよび検証のための３Ｄ灌流ニューロスフェア形成アッセイの図。図８Ｂ：マイクロゲル（ＰＥＧμゲル）粒子の間のＡＡＶ灌流（通過）の図。図８Ｃ：オリジナルのＤＥスクリーンにおいて変異体＃９を用いたＡＡＶ形質導入の動態学。変異体＃９は、Antaresを発現するように操作される。細胞における蛍光を、ｎＭＦＩにおいて測定する。図８Ｄ：オリジナルのＤＥスクリーンにおいて選択された上位４つのＧＢＭ特異的なＡＡＶ２変異体のＧＢＭ向性のランク付け。
図９Ａ－９Ｃ：ＡＡＶの評価のためのｐＮＳＡアッセイ。図９Ａ：スクランブルされたショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（Ｘ）、Ｎｋｘ６－２およびＡｓｃｌ－１遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡ（Ｙ）、およびＮｋｘ６－２のみを標的とするｓｈＲＮＡ（Ｚ）（示さず）のうちの１つと共にまたはこれを伴わずに、ＧＦＰ発現カセットを含むＡＡＶ２変異体９（オリジナルのＤＥスクリーンにおいて評価される）は、ＣＡ７ ＧＳＣ細胞に効率的に形質導入した。図９Ｂ：細胞死の増大をもたらすこれらの遺伝子のｓｈＲＮＡ枯渇の程度を、専門の共焦点アルゴリズムを用いて、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取り込み（暗色化した正方形）により捕捉した。ＧＦＰ発現は、より明るく網掛けされた正方形により示される。図９Ｃは、ｐＮＳＡにより測定される、３つのｓｈＲＮＡの差次的な殺傷動態学を示すチャートであって、これが、ｓｈＲＮＡカセットを標的とするリードＡＡＶバリアントの動的スクリーニングを可能にする。
詳細な説明
本明細書において提供されるのは、神経膠芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫幹細胞様細胞（ＧＳＣ）および神経膠腫幹細胞様細胞の形質導入の改善を示す、ウイルスのカプシドタンパク質バリアントである。開示されるカプシドバリアントは、がんの処置のための任意の治療用導入遺伝子と組み合わせて用いてもよい。本開示は、これらのカプシドバリアントのうちのいずれかであって、既存のウイルス粒子による腫瘍のための処置と比較して改善された腫瘍浸透を有するものを含む、ウイルス粒子を提供する。本開示はまた、改善された効力を達成するか、および／または既存のウイルス粒子処置より低いベクター力価（量）において、同等もしくは改善された効力を達成する、ウイルス粒子を提供する。特定の態様において、カプシドタンパク質バリアントは、ＡＡＶバリアントである。
したがって、本開示はまた、変異体カプシドタンパク質を有する、ｒＡＡＶ粒子およびｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供する。本開示は、変異体カプシドタンパク質を有するｒＡＡＶ粒子を中枢神経系（ＣＮＳ）組織などの神経組織に送達するための方法および組成物を提供する。特定の態様において、脳組織（例えばヒト脳組織）などのＣＮＳ組織への送達のための方法が提供される。本開示は、神経膠芽腫または神経膠腫を罹患しているかまたはこれを診断されている対象におけるがんの処置のための方法を、さらに提供する。本開示は、これらのｒＡＡＶ粒子または組成物のうちの１つ以上を投与することによる、それを必要とする対象（ヒト対象など）の処置の方法を、さらに提供する。いくつかの態様において、これらの方法は、異種遺伝子またはターゲティングコンストラクトを、神経膠腫細胞に送達することを含み、これは、開示されるＡＡＶ粒子のうちのいずれかに、異種遺伝子またはターゲティングコンストラクトを挿入すること、および神経膠腫細胞をＡＡＶと接触させることを含む。神経膠腫細胞を接触させるステップは、単回ＡＡＶ粒子投与または多回ＡＡＶ投与（多回投与のレジメンなど）を含んでもよい。いくつかの態様において、開示される処置の方法のうちのいずれかは、神経膠腫腫瘍の、部分的または完全な縮小を提供する。いくつかの態様において、開示される処置の方法は、神経膠腫において、アポトーシスまたは細胞死を誘導する。
本明細書において提供されるのは、ＧＢＭおよびＧＳＣの細胞および組織に形質導入する方法である。いくつかの態様において、ＧＢＭおよびＧＳＣに形質導入する方法は、本明細書において開示されるようなバリアントｒＡＡＶ粒子の組成物のうちのいずれか１つを細胞に提供することを含み、ここで、組成物中のｒＡＡＶ粒子は、異種の核酸を含む核酸を含む。本開示はまた、これらの粒子または組成物のうちのいずれかを含む、宿主細胞（哺乳動物細胞など）を提供する。いくつかの態様において、これらの宿主細胞は、ＧＢＭまたはＧＳＣを含む。本明細書においてさらに提供されるのは、特定の腫瘍細胞型についてのアフィニティーおよびその形質導入が増大しているＡＡＶバリアントを同定する方法である。
多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、原発性脳腫瘍の最も一般的かつ致死的な形態であり、全ての神経膠腫の症例のうちの約６０％を占め、グレードＩＶの神経膠腫として分類される。局所浸潤性、血管新生および腫瘍内不均一性が、ＧＢＭの高悪性度の最も重要な特徴のうちのものである。ＧＢＭ腫瘍は、神経膠芽腫幹細胞様細胞（ＧＳＣ）と称される細胞の機能的なサブセットを含み、これは、放射線照射療法および化学療法に対して耐性であり、最終的に腫瘍再発をもたらす。最近の研究は、ＧＳＣが、特に、それらの挙動を支持するために必要な腫瘍の微小環境（血管周囲の微小環境など）に存在することを示した。ＧＳＣの存在は、初めに、in vivoで腫瘍を惹起することができるＣＤ１３３＋細胞部分集団の同定により示された（Singh et al., 2004）。正常な神経幹細胞の糖タンパク質細胞表面マーカーであるＣＤ１３３は、ＧＳＣを識別するために一般的に用いられる。ＣＤ１３３＋細胞のパーセンテージは、放射線療法および化学療法の後の再発ＧＢＭにおいて、原発腫瘍と比較して、著しくより高い場合がある。ＣＤ１３３の他にも、ＳＳＥＡ－１およびＣＤ４４などの他の細胞表面マーカーが、ＧＢＭ中の幹細胞様集団を濃縮または識別するために用いられてきた。特に、ＣＤ４４は、ＧＢＭの間葉系のサブタイプにおいて高度に発現され、その発現は、幹細胞様細胞について濃縮するために用いられてきた（Anido et al., 2010）。Ｃｄ４４－／－およびＣｄ４４＋／－マウスが、Ｃｄ４４＋／＋マウスよりも長くＰＤＧＦ由来神経膠腫と共に生存したことが報告されており、このことは、ＣＤ４４が、能動的に寄与することを示している（Pietras et al., Cell Stem Cell. 2014）。最近になって、患者由来の神経膠腫幹細胞様細胞が、区別し得るＣＤ１３３＋およびＣＤ４４＋部分集団の特徴的な平衡を示すことが示された（本明細書において参考として援用されるBrown et al., PLoS One. 2017; 12(2): e0172791）。ＧＳＣ集団は、それらの増殖および移動の速度、すなわち、周期が速い（fast-cycling）（速く分裂して速く移動する、または単純に「速い」）および周期が遅い（slow-cycling）（ゆっくり分裂してゆっくり移動する、または単純に「遅い」）集団によりさらに特徴づけられる（前掲を参照）。
いくつかの態様において、記載される粒子のうちのいずれかのカプシドにおけるアミノ酸置換は、置換を伴わないカプシドタンパク質（野生型カプシドタンパク質など）を含むＡＡＶ粒子と比較して、ＧＢＭまたはＧＳＣの形質導入を増大させる。
いくつかの側面において、開示されるＡＡＶ粒子は、ポリヌクレオチドを含む組み換えＡＡＶゲノム（またはベクター）を含む。このポリヌクレオチドは、少なくとも１つの異種核酸領域をコードしてもよい。いくつかの態様において、異種核酸領域は、ペプチドまたはタンパク質をコードする。ある態様において、異種核酸領域は、治療用ペプチドまたはタンパク質をコードする。ある態様において、異種核酸領域は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする。いくつかの態様において、異種核酸領域は、主要調節遺伝子などの神経変性に関与する転写因子をコードする遺伝子を標的とする、ショートヘアピンＲＮＡをコードする。ある態様において、異種核酸領域は、Ａｓｃｌ－１またはＮｋｘ６－２遺伝子のうちの１つ以上、例えばヒトＡＳＣＬ－１またはＮＫＸ６－２遺伝子を標的とするショートヘアピンＲＮＡをコードする。いくつかの側面において、治療用のペプチドまたはタンパク質は、修復酵素、チェックポイント阻害剤、転写因子、増殖因子受容体、増殖因子リガンド、または腫瘍サプレッサータンパク質を含む。いくつかの態様において、治療用ペプチドは、ＧＢＭにおける重要な予後の指標であることが知られている、修復酵素ＭＧＭＴである。したがって、本開示は、酵素ＭＧＭＴをコードするｒＡＡＶベクターを含むＡＡＶ粒子を提供する。
いくつかの態様において、記載されるｒＡＡＶ粒子のうちのいずれかは、配列番号４～７および９～７０１０のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するカプシドを含む。いくつかの態様において、記載されるｒＡＡＶ粒子のうちのいずれかは、配列番号４～７および９～２８のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するカプシドを含む。いくつかの態様において、記載されるｒＡＡＶ粒子のうちのいずれかは、配列番号４～７および９～２８のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８５％または少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するカプシドを含む。いくつかの態様において、記載されるｒＡＡＶ粒子のうちのいずれかは、配列番号４～７および９～２８のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を有するカプシドを含む。いくつかの態様において、記載されるｒＡＡＶ粒子のうちのいずれかは、配列番号４～７のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するカプシドを含む。特定の態様において、ｒＡＡＶカプシドは、配列番号４～７のうちのいずれか１つの配列を含む。ある態様において、ｒＡＡＶカプシドは、配列番号４を含む。
いくつかの態様において、開示されるカプシドは、配列番号４～７および９～２８のうちのいずれか１つの配列と比較して異なる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８のアミノ酸を有する配列を含んでもよい。これらの差異は、配列番号４～７および９～２８のうちのいずれか１つの配列と比較して、挿入されているか、欠失しているか、または置換されているアミノ酸を含んでもよい。いくつかの態様において、開示されるカプシドは、配列番号４～７のうちのいずれか１つの配列と比較して異なる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８のアミノ酸を有する配列を含んでもよい。
これらのｒＡＡＶカプシド粒子のうちのいずれかのアミノ酸置換は、ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドのアミノ酸配列（配列番号１）に対するＱ２６３Ｇ、Ｓ２６４Ｔ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４５０Ａ、Ｐ４５１Ｅ、Ｓ４５２Ｇ、Ｔ４５４Ｌ、Ｔ４５５Ｋ、Ｑ４５７Ｍ、Ｒ４５９Ｈ、Ｑ４６１Ｌ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９Ｄ、およびＹ５００Ｆ、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型の野生型ＶＰ１カプシド配列（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．７４、およびＡＡＶｒｈ．１０）の相同なアミノ酸のうちの１つ以上を含んでもよい。いくつかの態様において、記載されるｒＡＡＶ粒子のうちのいずれかのカプシドタンパク質のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドのアミノ酸配列に対して、Ｅ５３１Ｇ、Ｋ５３２Ｒ、Ｓ５４７Ａ、Ｅ５４８Ｇ、Ｔ５５０Ｎ、Ｖ５５２Ａ、Ｄ５５３Ａ、Ｅ５５５Ｇ、Ｋ５５６Ｑ、Ｒ５８５Ａ、およびＲ５８８Ａを含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、Ｓ２６４Ａ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４５０Ｄ、Ｐ４５１Ｒ、Ｓ４５２Ｇ、Ｔ４５４Ｓ、Ｑ４５７Ｔ、Ｒ４５９Ａ、Ｑ４６１Ｓ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９Ｄ、およびＹ５００Ｆを含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、Ｑ２６３Ａ、Ｓ２６４Ａ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４５０Ｄ、Ｐ４５１Ｒ、Ｓ４５２Ｇ、Ｔ４５４Ｓ、Ｑ４５７Ｔ、Ｒ４５９Ａ、Ｑ４６１Ｓ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９Ｄ、およびＹ５００Ｆを含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、Ｅ５３０Ｎ、Ｅ５３１Ｄ、Ｋ５３２Ｒ、Ｓ５４７Ａ、Ｅ５４８Ｋ、Ｋ５４９Ｇ、Ｄ５５３Ａ、Ｉ５５４Ｖ、Ｒ５８５Ａ、およびＲ５８８Ａを含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、Ｑ２６３Ｅ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４５０Ａ、Ｐ４５１Ｓ、Ｓ４５２Ａ、Ｔ４５４Ｓ、Ｑ４５７Ｔ、Ｒ４５９Ｔ、Ｑ４６１Ｇ、Ｔ４９１Ｑ、Ｓ４９２Ｐ、Ａ４９３Ｇ、Ｅ４９９Ｄ、Ｙ５００Ｆ、Ｅ５３０Ｄ、Ｅ５３１Ｄ、およびＫ５３２Ｒを含む。
いくつかの態様において、開示されるカプシドのうちのいずれかは、Ｔ４９１の置換を含む。いくつかの態様において、これらのカプシドは、Ｔ４９１ＱまたはＴ４９１Ｖの置換を含む。いくつかの態様において、開示されるカプシドのうちのいずれかは、野生型ＡＡＶ２カプシドＶＰ１（配列番号１）のアミノ酸位置４５０～４５７においてＤＺＧＸＳＵＸＴモチーフを含み、ここで、Ｘは野生型の位置であり、Ｚは、ＴまたはＲから選択される変異でり、Ｕは、ＫまたはＴである。いくつかの態様において、開示されるカプシドのうちのいずれかは、配列番号１のアミノ酸位置５３０～５３２においてＤＤＲモチーフを含む。いくつかの態様において、開示されるカプシドのうちのいずれかは、Ｋ５２７Ｒ変異を含む。
いくつかの側面において、本明細書において提供されるのは、カプシドおよびゲノムを含むｒＡＡＶベクターであり、ここで、カプシドは、表１～９のうちのいずれかにおいて記載されるようなアミノ酸置換を有するＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３タンパク質を含み、ここで、これらの置換は、置換を伴わないカプシドタンパク質（野生型カプシドタンパク質など）を含むＡＡＶ粒子と比較して、ＧＢＭ細胞またはＧＳＣの形質導入を増大させる。いくつかの態様において、カプシドは、表１～８のうちのいずれかにおいて記載されるようなアミノ酸置換を有する。ある態様において、カプシドは、配列番号４を含む。
神経膠腫細胞型特異的ＡＡＶの作製．
いくつかの態様において、腫瘍細胞型に特異的な結合および形質導入が増強されたＡＡＶを作製するための方法が記載される。方法は、動的なＡＡＶライブラリー試薬の投与の様式の使用を含む。ＡＡＶライブラリーの送達は、マウスモデル腫瘍において、腫瘍進行と少なくとも部分的に同期される。異なるｃａｐタンパク質を含有するＡＡＶライブラリーが、腫瘍を保有するマウスに投与される。腫瘍は、移植されたものであっても（腫瘍細胞の注射などにより）、自然発症的に生じたものであっても、または誘導したものであってもよい。ＡＡＶライブラリーは、注入により腫瘍に投与される。腫瘍が発症し、増殖するにつれて、注入レベルを増大させる。いくつかの態様において、ＡＡＶライブラリーの腫瘍内注入は、持続的である。初めは注入速度はゆっくりである。腫瘍が増殖するにつれて、注入速度は、腫瘍増殖の早期および後期と同期する。ＡＡＶライブラリーの腫瘍内注入速度を腫瘍増殖の早期および後期と同期させることにより、単回腫瘍内注射と比較して、ＡＡＶの腫瘍細胞に対する結合および遺伝子送達のほぼ１０倍の増大が観察され得る。
いくつかの態様において、遅いＧＳＣおよび速いＧＳＣの集団、ならびに非ＧＳＣ ＧＢＭ細胞集団に対して特異的なバリアントについての定向進化スクリーニングにおける、ＡＡＶライブラリー試薬の同期的送達は、標的細胞の感染をもたらした。
ＧＳＣおよび非ＧＳＣ ＧＢＭ細胞についての特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶ．
いくつかの態様において、ＧＢＭおよびＧＳＣについての特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶバリアントが記載される。かかるＡＡＶバリアントは、改変されたカプシドタンパク質を含有する。改変されたカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドタンパク質（配列番号１）のアミノ酸２６３～２６７、アミノ酸４４４～４６１、アミノ酸４９０～５０７、アミノ酸５２７～５３２、アミノ酸５４５～５５６およびアミノ酸５８５～５９６に対応する領域（すなわち、可変領域Ｉ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩ）において、アミノ酸置換を含有する。これらのアミノ酸のグループ分けは、ＡＶ２ ＶＰ１の可変領域を示す。上の領域の野生型アミノ酸配列を、下に示す（配列番号８に対応する）：
Figure 2022544237000002
ＡＡＶバリアントは、ＶＰ１のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を有する、改変されたＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質を含んでもよい。下の配列番号１において、カプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸２６３～２６７、４４４～４６１、４９０～５０７、５２７～５３２、５４５～５５６および５８５～５９６に下線を付す。それぞれ配列番号２および配列番号３において示されるカプシドタンパク質ＶＰ２およびＶＰ３における、対応するアミノ酸位置に下線を付す。
野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１アミノ酸配列：
Figure 2022544237000003
 野生型ＡＡＶ２ ＶＰ２アミノ酸配列：
Figure 2022544237000004
 野生型ＡＡＶ２ ＶＰ３アミノ酸配列：
Figure 2022544237000005
ＧＢＭおよびＧＳＣに対する特異性および／またはその形質導入が増強されたＡＡＶバリアントの、例示的なカプシドタンパク質におけるアミノ酸置換を、表１～９において示す。ある態様において、表９において示されるカプシドタンパク質は、ＧＢＭおよびＧＳＣ細胞の形質導入の増強のための、したがって神経膠腫を罹患する対象における神経膠腫の処置における使用のための、開示される方法、ｒＡＡＶ粒子およびその組成物において使用される。
ＧＢＭおよびＧＳＣについての特異性および／またはそれらの形質導入の増大を提供するＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３（集合的にＶＰＸ）カプシドタンパク質アミノ酸置換を、表１～８において列記する。表中の各々の行は、コンビナトリアルライブラリー定向進化スクリーニングにおいてＧＳＣに対する結合および／または形質導入について選択されたＡＡＶバリアントにおけるカプシドタンパク質アミノ酸置換を代表する。
いくつかの態様において、ＡＡＶ粒子は、改変されたＶＰ１カプシドタンパク質を有していてもよく、ここで、ＶＰ１カプシドタンパク質は、配列番号１に対して、７５％より高く、８０％より高く、８５％より高く、９０％より高く、９５％より高く、９６％より高く、９７％より高く、９８％より高く、９９％より高くまたは１００％同一のアミノ酸配列を有し、表１～８のうちのいずれかにおいて記載されるようなアミノ酸置換のうちの１つ以上を有する、カプシドタンパク質を含む。
いくつかの態様において、ＡＡＶ粒子は、改変されたＶＰ２カプシドタンパク質を有していてもよく、ここで、ＶＰ２カプシドタンパク質は、配列番号２に対して、７５％より高く、８０％より高く、８５％より高く、９０％より高く、９５％より高く、９６％より高く、９７％より高く、９８％より高く、９９％より高くまたは１００％同一または類似するアミノ酸配列を有し、表１～８のうちのいずれかにおいて記載されるようなアミノ酸置換のうちの１つ以上を有する、カプシドタンパク質を含む。
いくつかの態様において、ＡＡＶ粒子は、改変されたＶＰ３カプシドタンパク質を有していてもよく、ここで、ＶＰ３カプシドタンパク質は、配列番号３に対して、７５％より高く、８０％より高く、８５％より高く、９０％より高く、９５％より高く、９６％より高く、９７％より高く、９８％より高く、９９％より高くまたは１００％同一または類似するアミノ酸配列を有し、表１～８のうちのいずれかにおいて記載されるようなアミノ酸置換のうちの１つ以上を有する、カプシドタンパク質を含む。
いくつかの態様において、ＡＡＶ粒子は、改変されたＶＰ１カプシドタンパク質、改変されたＶＰ２カプシドタンパク質、改変されたＶＰ３カプシドタンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを有していてもよく、各々は、上記のとおりである。
いくつかの態様において、ＡＡＶバリアントは、ＣＤ１３３＋ＧＳＣ、ＣＤ４４＋ＧＳＣ、ＣＤ４４－／ＣＤ１３３＋ＧＳＣ、ＣＤ４４＋／ＣＤ１３３－ＧＳＣ、ＣＤ４４＋／ＣＤ１３３＋ＧＳＣおよび／またはＣＤ４４－／ＣＤ１３３－ＧＢＭ細胞に対して、増大した特異性および／またはその形質導入を有する。ＣＤ１３３＋ＧＳＣは、遅いＧＳＣである傾向があり；ＣＤ４４＋ＧＳＣは、速いＧＳＣである傾向がある。いくつかの態様において、ＣＤ１３３＋および／またはＣＤ４４＋細胞はＧＳＣであり、ＣＤ１３３－／ＣＤ４４－（ダブルネガティブ）細胞はＧＢＭ細胞である。いくつかの態様において、ＧＢＭ細胞は、ＧＳＣおよび非ＧＳＣの両方のＧＢＭ癌細胞を含む。いくつかの態様において、ＧＳＣは、ＣＤ１３３－／ＣＤ４４－であってよい。
いくつかの態様において、ＣＤ１３３＋ＧＳＣに対する特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶバリアントが記載される。ＣＤ１３３＋ＧＳＣは、ＣＤ４４＋またはＣＤ４４－であってよい。かかるＡＡＶバリアントは、表１および／または表２において記載されるようなアミノ酸置換を有する１つ以上のＶＰＸカプシドタンパク質を含む。
いくつかの態様において、ＣＤ４４＋ＧＳＣに対する特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶバリアントが記載される。ＣＤ４４＋ＧＳＣは、ＣＤ１３３＋またはＣＤ１３３－であってよい。かかるＡＡＶバリアントは、表７および／または表８において記載されるようなアミノ酸置換を有する１つ以上のＶＰＸカプシドタンパク質を含む。
いくつかの態様において、ＣＤ４４－／ＣＤ１３３－ＧＢＭ細胞に対する特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶバリアントが記載される。かかるＡＡＶバリアントは、表３および／または表４において記載されるようなアミノ酸置換を有する１つ以上のＶＰＸカプシドタンパク質を含む。
いくつかの態様において、ＣＤ４４＋／ＣＤ１３３＋ＧＳＣに対する特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶバリアントが記載される。かかるＡＡＶバリアントは、表５および／または表６において記載されるようなアミノ酸置換を有する１つ以上のＶＰＸカプシドタンパク質を含む。
ある態様において、ＧＳＣおよび／または非ＧＳＣ－ＧＢＭ細胞に対する結合特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列に対してアミノ酸置換Ｅ５３１Ｇ、Ｋ５３２Ｒ、Ｓ５４７Ａ、Ｅ５４８Ｇ、Ｔ５５０Ｎ、Ｖ５５２Ａ、Ｄ５５３Ａ、Ｅ５５５Ｇ、Ｋ５５６Ｑ、Ｒ５８５Ａ、およびＲ５８８Ａを有するカプシドタンパク質を有するＡＡＶを含む。
いくつかの態様において、ＧＳＣおよび／または非ＧＳＣ－ＧＢＭ細胞に対する結合特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列に対してアミノ酸置換Ｑ２６３Ｇ、Ｓ２６４Ｔ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４５０Ａ、Ｐ４５１Ｅ、Ｓ４５２Ｇ、Ｔ４５４Ｌ、Ｔ４５５Ｋ、Ｑ４５７Ｍ、Ｒ４５９Ｈ、Ｑ４６１Ｌ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９Ｄ、およびＹ５００Ｆを有するカプシドタンパク質を有するＡＡＶを含む。
いくつかの態様において、ＧＳＣおよび／または非ＧＳＣ－ＧＢＭ細胞に対する結合特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列に対してアミノ酸置換Ｓ２６４Ａ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４５０Ｄ、Ｐ４５１Ｒ、Ｓ４５２Ｇ、Ｔ４５４Ｓ、Ｑ４５７Ｔ、Ｒ４５９Ａ、Ｑ４６１Ｓ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９Ｄ、およびＹ５００Ｆを有するカプシドタンパク質を有するＡＡＶを含む。いくつかの態様において、ＧＳＣおよび／または非ＧＳＣ－ＧＢＭ細胞に対する結合特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列に対してアミノ酸置換Ｑ２６３Ａ、Ｓ２６４Ａ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４５０Ｄ、Ｐ４５１Ｒ、Ｓ４５２Ｇ、Ｔ４５４Ｓ、Ｑ４５７Ｔ、Ｒ４５９Ａ、Ｑ４６１Ｓ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９Ｄ、およびＹ５００Ｆを有するカプシドタンパク質を有するＡＡＶを含む。
いくつかの態様において、ＧＳＣおよび／または非ＧＳＣ－ＧＢＭ細胞に対する結合特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列に対してアミノ酸置換Ｅ５３０Ｎ、Ｅ５３１Ｄ、Ｋ５３２Ｒ、Ｓ５４７Ａ、Ｅ５４８Ｋ、Ｋ５４９Ｇ、Ｄ５５３Ａ、Ｉ５５４Ｖ、Ｒ５８５Ａ、およびＲ５８８Ａを有するカプシドタンパク質を有するＡＡＶを含む。いくつかの態様において、ＧＳＣおよび／または非ＧＳＣ－ＧＢＭ細胞に対する結合特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列に対してアミノ酸置換Ｑ２６３Ｅ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４５０Ａ、Ｐ４５１Ｓ、Ｓ４５２Ａ、Ｔ４５４Ｓ、Ｑ４５７Ｔ、Ｒ４５９Ｔ、Ｑ４６１Ｇ、Ｔ４９１Ｑ、Ｓ４９２Ｐ、Ａ４９３Ｇ、Ｅ４９９Ｄ、Ｙ５００Ｆ、Ｅ５３０Ｄ、Ｅ５３１Ｄ、およびＫ５３２Ｒを有するカプシドタンパク質を有するＡＡＶを含む。
配列同一性は、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.）におけるBESTFIT、FASTAおよびTFASTAなどのアルゴリズムを用いて、デフォルトのギャップパラメーターを用いて、または目視により配列をアラインメントし、最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウ全体にわたり最も高い配列類似性のパーセンテージをもたらすもの）を得ることにより、決定することができる。配列同一性のパーセンテージは、２つの最適にアラインメントされた配列を比較ウィンドウ全体にわたり比較して、両方の配列において同一の残基が生じる位置の数を決定してマッチする位置の数を得て、ギャップをカウントしないで比較ウィンドウ（すなわち、ウィンドウのサイズ）中のマッチする位置の数を、マッチする位置およびミスマッチの位置の総数で除算して、結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることにより、計算する。２つの配列の最適なアラインメントのために、比較ウィンドウ中の１つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の部分は、他の配列（付加または欠失を含まないもの）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。別段に示されない限り、２つの配列の間の比較のウィンドウは、２つの配列のうちの短い方の全長により定義される。
タンパク質に関する配列同一性のパーセントについて、同一でないアミノ酸は、保存的置換により異なっていてもよく、ここで、アミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有するアミノ酸残基に対して置換することが理解されるべきである。かかる置換は、タンパク質の機能的特性に変化を変化させる可能性が低い。配列が、保存的置換において異なる場合、置換の保存的性質について補正するために、配列同一性のパーセントを上方に調整してもよい。かかる保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。かかる分析は、当該分野において周知である。保存的置換は、完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコア付けすることができ、それにより、配列同一性（または類似性）のパーセンテージを増大させることができる。保存的置換のスコア付けは、例えば、プログラムPC/GENE（Intelligenetics, Mountain View, California）において実行されるように、計算される。
配列同一性／類似性の値は、GAP Version 10を用いて、以下のパラメーターを用いて得られる値を指す：５０のGAP Weightおよび３のLength Weight、ならびにnwsgapdna.cmpスコア付けマトリックスを用いたヌクレオチド配列についての％同一性および％類似性；８のGAP Weightおよび２のLength Weight、ならびにBLOSUM62スコア付けマトリックスを用いたアミノ酸配列についての％同一性および％類似性；またはこれらの任意の同等のプログラム。類似性を決定する他の方法として、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCHおよびFASTAが挙げられる。
本明細書において用いられる場合、「特異性」とは、ＡＡＶ粒子が、ＧＢＭ細胞またはＧＳＣなどの標的細胞を認識してこれに結合する能力を指す。ＧＢＭ細胞またはＧＳＣに対する特異性の増大とは、ＡＡＶバリアントが、アミノ酸置換を伴わない類似のＡＡＶ（野生型ＡＡＶカプシドなど）よりも強い結合アフィニティーでＧＢＭ細胞またはＧＳＣに結合することを意味する。
本明細書において用いられる場合、ＧＢＭ細胞またはＧＳＣの「形質導入が増大した」とは、ＡＡＶバリアントが、アミノ酸置換を伴わない類似のＡＡＶよりも高い効率で、ＧＢＭ細胞またはＧＳＣが、形質導入することを指す。本明細書において用いられる場合、「形質導入」とは、ＡＡＶなどのウイルスまたはウイルスベクターによる、細胞中への、ポリヌクレオチドの細胞内導入を指す。
いくつかの態様において、記載されるＡＡＶカプシドタンパク質のうちのいずれかをコードする核酸分子が企図される。いくつかの態様において、記載されるＡＡＶバリアントのうちのいずれかを含む遺伝子送達ベクター、または記載されるＡＡＶカプシドタンパク質のうちのいずれかを含むＡＡＶ粒子が企図される。
いくつかの態様において、記載されるＡＡＶバリアントのうちのいずれかまたは記載されるＡＡＶカプシドタンパク質のうちのいずれかを含むＡＡＶ粒子を含む、宿主細胞が企図される。多様な態様において、宿主細胞は、ＧＢＭまたはＧＳＣ細胞を含む。いくつかの態様において、宿主細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ４４のシングルポジティブ、ＣＤ１３３／ＣＤ４４ダブルポジティブならびにＣＤ１３３／ＣＤ４４ダブルネガティブＧＢＭ細胞、またはＣＤ１３３およびＣＤ４４のシングルポジティブ、ＣＤ１３３／ＣＤ４４ダブルポジティブならびにＣＤ１３３／ＣＤ４４ダブルネガティブＧＳＣ細胞のうちのいずれか１つを含む。
いくつかの態様において、記載されるＡＡＶバリアントのうちのいずれかを、遺伝子治療ベクターとして用いることができる。記載されるＡＡＶバリアントは、異種の核酸領域導入遺伝子（または異種遺伝子または導入遺伝子）をＧＢＭまたはＧＳＣ細胞に送達することにおいて、特に有用である。記載されるＡＡＶ粒子のうちのいずれかまたは記載されるカプシドタンパク質のうちのいずれかを含むＡＡＶ粒子は、異種核酸領域を含むゲノムを含んでもよい。異種核酸配列は、タンパク質またはリボヌクレオチドをコードしていてもよい。タンパク質またはリボヌクレオチドは、治療用のタンパク質またはリボヌクレオチドであってもよい。異種遺伝子は、遺伝子配列全体または部分的な遺伝子配列またはこれらの機能的フラグメントを含んでもよい。いくつかの態様において、異種遺伝子は、機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの態様において、異種遺伝子は、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする。
いくつかの態様において、異種遺伝子をＧＢＭ細胞またはＧＳＣに送達する方法が記載され、該方法は、ＧＢＭ細胞またはＧＳＣ細胞を、記載されるＡＡＶバリアントのうちのいずれかまたは記載されるカプシドタンパク質のうちのいずれかを含むＡＡＶと接触させることを含む。
組み換えＡＡＶ粒子
本明細書において提供されるのは、バリアントｒＡＡＶ（例えば、バリアントｒＡＡＶ２）粒子である。いくつかの態様において、粒子は、空の粒子（例えば、異種遺伝子を含む核酸ベクターを含まないもの）である。いくつかの態様において、ＡＡＶ２粒子は、異種の核酸または異種遺伝子を含む核酸ベクターを含む。異種遺伝子とは、目的のＲＮＡまたはタンパク質をコードする遺伝子である。
いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えば、バリアントｒＡＡＶ２）カプシドタンパク質のうちのいずれか１つを含むｒＡＡＶ２粒子は、血清型２のＩＴＲおよび／またはｒｅｐ ＯＲＦを含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ２粒子は、シュードタイピングされたｒＡＡＶ粒子であり、これは、（ａ）血清型２に由来するカプシドタンパク質を含んでなるカプシド、および（ｂ）別の血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０）からのＩＴＲを含む核酸ベクターを含む。例えば、粒子は、血清型５のＩＴＲおよび血清型２のカプシドを有していてもよい。かかるシュードタイプ化ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５／２と指定されるであろう。
目的のタンパク質は、検出可能マーカーまたは治療用タンパク質であってよい。検出可能マーカーは、可視化することができる分子である（例えば、裸眼を用いて、または顕微鏡下において）。いくつかの態様において、検出可能マーカーは、蛍光分子、生物発光分子、また色を与える分子（例えば、β－ガラクトシダーゼまたはAntares）である。いくつかの態様において、検出可能マーカーは、蛍光タンパク質またはその機能的ペプチドまたは機能的ポリペプチドである。
いくつかの態様において、異種遺伝子は、治療用タンパク質をコードし、「治療用遺伝子」として言及される。治療用遺伝子は、それが送達される細胞、組織または臓器において、治療効果を提供することができる。いくつかの態様において、治療用遺伝子は、それが送達されるものとは別の細胞、組織または臓器に対して治療的利益を提供する。例えば、脳組織（例えば、側頭葉または前頭葉）に送達される遺伝子は、神経膠腫または神経膠芽腫細胞に到達し得る。いくつかの態様において、治療用遺伝子は、抗体、ぺプチボディー、増殖因子、凝固因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体またはイオンチャネルに対して作用する活性化性または阻害性のペプチド、細胞内プロセスを標的とする細胞浸透性ペプチド、血栓溶解剤、酵素、骨形成性タンパク質、ヌクレアーゼまたは遺伝子編集のために用いられる他のタンパク質、Ｆｃ－融合タンパク質、抗凝固剤、ヌクレアーゼ、ショートヘアピンＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、または遺伝子編集のための他の核酸もしくはタンパク質をコードする。
いくつかの態様において、異種遺伝子は、治療用ＲＮＡ、例えば、小分子干渉ＲＮＡまたはショートヘアピンＲＮＡをコードする。ある態様において、異種遺伝子は、主要調節遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡをコードする。ある態様において、異種遺伝子は、Ａｓｃｌ－１またはＮｋｘ６－２遺伝子のうちの１つ以上を標的とするｓｈＲＮＡ、例えばヒトＡＳＣＬ－１またはＮＫＸ６－２遺伝子のうちの１つ以上を標的とするｓｈＲＮＡをコードする。いくつかの態様において、治療用遺伝子は、修復酵素（例えば、ＭＧＭＴ）、チェックポイント阻害剤、転写因子、増殖因子受容体、増殖因子リガンド、または腫瘍サプレッサータンパク質をコードする。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子中に含まれる核酸ベクターは、以下の１つ以上を含む：（ａ）異種遺伝子を含む１つ以上の異種核酸領域、および（ｂ）１つ以上の核酸領域（例えば、異種核酸領域）に隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む１つ以上の領域（例えば、野生型ＩＴＲ配列または操作されたＩＴＲ配列）。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子中の核酸ベクターは、異種核酸領域（例えば、プロモーター）の発現を促進する制御配列を含む１つ以上の核酸領域を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子中の核酸ベクターは、対象のゲノム中への異種核酸領域の組み込み（任意に、発現を促進する配列を含む１つ以上の核酸領域と共に）を促進する配列を含む１つ以上の核酸領域を含む。
発現制御配列の非限定的な例として、プロモーター、インスレーター、サイレンサー、応答エレメント、イントロン、エンハンサー、開始部位、終結シグナル、およびポリ（Ａ）テイルが挙げられる。かかる制御配列の任意の組み合わせが、本明細書において企図される（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）。
いくつかの態様において、１つ以上のプロモーターは、異種の核酸中のコードヌクレオチド配列に作動的に連結されていてもよい。プロモーターは、プロモーター配列が、ヌクレオチド配列の転写を制御および／または調節する場合、当該ヌクレオチド配列に「作動的に連結されている」。プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターであってよい。
例えば、異なる強度の構成的プロモーターを用いることができる。本明細書において記載される核酸ベクターは、転写を促進することにおいて一般に活性である、ウイルスプロモーターまたは哺乳動物遺伝子からのプロモーターなどの１つ以上の構成的プロモーターを含んでもよい。構成的ウイルスプロモーターの非限定的な例として、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、Ａｄ Ｅ１Ａサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが挙げられる。構成的哺乳動物プロモーターの非限定的な例として、β－アクチンプロモーター（例えば、ニワトリβ－アクチンプロモーター）およびヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーターにより例示されるような多様なハウスキーピング遺伝子プロモーターが挙げられる。いくつかの態様において、キメラウイルス／哺乳動物プロモーターは、キメラＣＭＶ／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ、ＣＢまたはＣＡＧ）プロモーターを含んでもよい。いくつかの態様において、短縮化またはトランケーションされたプロモーターが用いられる。
誘導性プロモーターおよび／または調節エレメントもまた、目的のタンパク質またはポリペプチドの適切な発現レベルを達成するために企図され得る。好適な誘導性プロモーターの非限定的な例として、チトクロームＰ４５０遺伝子、ヒートショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、およびエストロゲン遺伝子プロモーターなどのホルモン誘導性遺伝子などの遺伝子からのものが挙げられる。誘導性プロモーターの別の例は、テトラサイクリンに対して応答性であるｔｅｔＶＰ１６プロモーターである。
組織特異的プロモーターおよび／または調節エレメントもまた、本明細書において企図される。いくつかの態様において、本明細書において開示されるようなバリアントｒＡＡＶ（例えば、バリアントｒＡＡＶ２）粒子を、バリアントｒＡＡＶ（例えば、バリアントｒＡＡＶ２）粒子と同じ細胞、組織または臓器を標的とするプロモーターと組み合わせることが、有益な場合がある。例えば、神経膠腫または神経膠腫幹細胞様細胞を標的とするバリアントｒＡＡＶ（例えば、バリアントｒＡＡＶ２）粒子が、神経細胞または神経幹細胞を標的とするプロモーターを含む核酸にカプシド形成してもよい。
合成プロモーターもまた、本明細書において企図される。合成プロモーターは、例えば、既知のプロモーター、調節エレメント、転写因子結合部位、エンハンサーエレメント、リプレッサーエレメントなどの領域を含んでもよい。
プロモーターは、本明細書において開示されるプロモーターのうちのいずれか１つのフラグメント、または完全なプロモーターの部分的なプロモーター活性（例えば、活性の１０～９０、３０～６０、５０～８０、８０～９９もしくは９０～９９．９％）を保持するものであってもよいことが、理解されるべきである。
本明細書において記載される任意の核酸ベクターは、ウイルスのカプシドによりカプシド形成されてもよい。いくつかの態様において、ｃａｐ遺伝子は、検出可能マーカーおよびＡＡＶ血清型２のＶＰタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように修飾される。いくつかの態様において、ペプチドは、カプシドＶＰ２の位置５８７／５８８においてまたはＣ末端においてタンパク質中に挿入される。いくつかの態様において、核酸ベクターは、環状である。いくつかの態様において、核酸ベクターは、一本鎖である。いくつかの態様において、核酸ベクターは、二本鎖である。いくつかの態様において、二本鎖核酸ベクターは、例えば、核酸ベクターの別の領域に対して相補的であり、それにより核酸ベクターの二本鎖性（double-strandedness）の形成を開始する、当該核酸ベクターの領域を含む、自己相補的ベクターであってもよい。
ｒＡＡＶ粒子を作製する方法
ｒＡＡＶ粒子および核酸ベクターを生成する多様な方法が、知られている（例えば、本明細書において参考として援用されるZolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167；および米国特許公開番号２００７／００１５２３８および２０１２／０３２２８６１；ならびにATCCおよびCell Biolabs, Inc.から入手可能なプラスミドおよびキットを参照）。いくつかの態様において、異種遺伝子を含むベクター（例えばプラスミド）は、１つ以上のヘルパープラスミド、例えばｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする）ならびにｃａｐ遺伝子（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードし、これは、本明細書において記載されるような修飾されたＶＰ領域を含む）を含むものと組み合わせて、核酸ベクターがカプシド内部にパッケージングまたはカプシド形成され、その後精製されるように、ヘルパーまたは産生株（producer）細胞と称される組み換え細胞中に導入してもよい。
哺乳動物ヘルパー細胞の非限定的な例として、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞またはＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６５１（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６５０（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１０（商標）、またはＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－６１（商標））が挙げられる。昆虫ヘルパー細胞の非限定的な例は、Ｓｆ９細胞である（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１７１１（商標）を参照）。ヘルパー細胞は、Ｒｅｐタンパク質および／またはＣａｐタンパク質をコードするｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を含んでもよい。いくつかの態様において、パッケージングは、in vitro（例えば、細胞の外側）で行われる。
いくつかの態様において、異種遺伝子を含む核酸ベクター（例えばプラスミド）１つ以上のヘルパープラスミド、例えば、第１の血清型のｒｅｐ遺伝子、および同じ血清型または異なる血清型のｃａｐ遺伝子を含むものと組み合わされて、ｒＡＡＶ粒子がパッケージングされるように、ヘルパー細胞中に遺伝子導入される。いくつかの態様において、１つ以上のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含む第１のヘルパープラスミド、および以下のヘルパー遺伝子：Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、およびＶＡ遺伝子のうちの１つ以上を含む第２のヘルパープラスミドを含む。明確性のために、ヘルパー遺伝子とは、ヘルパータンパク質Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ４、Ｅ２ａおよびＶＡをコードする遺伝子である。ヘルパープラスミド、およびかかるプラスミドを作製する方法は、当該分野において公知であり、市販されている（例えば、PlasmidFactory, Bielefeld, Germany製のｐＤＦ６、ｐＲｅｐ、ｐＤＭ、ｐＤＧ、ｐＤＰ１ｒｓ、ｐＤＰ２ｒｓ、ｐＤＰ３ｒｓ、ｐＤＰ４ｒｓ、ｐＤＰ５ｒｓ、ｐＤＰ６ｒｓ、ｐＤＧ（Ｒ４８４Ｅ／Ｒ５８５Ｅ）およびｐＤＰ８．ａｐｅプラスミド；Vector Biolabs, Philadelphia, PA；Cellbiolabs, San Diego, CA；Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；およびAddgene, Cambridge, MAから入手可能な他の製品およびサービス；ｐｘｘ６；Grimm et al. (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adeno associated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760；Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081.；Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy,Vol. 7, 839-850；Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capside Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303；およびMoullier, P. and Snyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188を参照）。特定の血清型についての野生型ＡＡＶコード領域をコードするプラスミドもまた、公知であり、入手可能である。例えば、ｐＳｕｂ２０１は、野生型ＡＡＶ２ゲノムのコード領域を含むプラスミドである（Samulski et al. (1987), J Virology, 6:3096-3101）。
ＩＴＲ配列およびＩＴＲ配列を含むプラスミドは、当該分野において公知であり、市販されている（例えば、Vector Biolabs, Philadelphia, PA；Cellbiolabs, San Diego, CA；Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；およびAddgene, Cambridge, MAから入手可能な製品およびサービス；ならびにGene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein. Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byrne BJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24):14082-7；およびCurtis A. Machida. Methods in Molecular Medicine（商標）. Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols. 10.1385/1-59259-304-6:201（著作権）Humana Press Inc. 2003. Chapter 10. Targeted Integration by Adeno-Associated Virus. Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni Cathomen and Richard Jude Samulski；米国特許第５，１３９，９４１号および同第５，９６２，３１３号を参照；これらの全ては本明細書において参考として援用される）。ＡＡＶ血清型１、２、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の配列についてのGenebank参照番号は、特許公開ＷＯ ２０１２／０６４９６０において列記され、これは本明細書において参考として援用される。
ｒＡＡＶ粒子生成方法の非限定的な方法を、次に説明する。所望されるＡＡＶ血清型についてのｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦ、ならびにアデノウイルスのＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）およびＥ４遺伝子を、それらのネイティブのプロモーターの転写制御下においてを含む、１つ以上のヘルパープラスミドを、生成するか取得する。いくつかの態様において、１つ以上のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、ならびに任意にアデノウイルスのＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）およびＥ４遺伝子のうちの１つ以上を、それらのネイティブのプロモーターの転写制御下において含む。いくつかの態様において、１つ以上のヘルパープラスミドは、所望されるＡＡＶ血清型についてのｃａｐ ＯＲＦ（および任意にｒｅｐ ＯＲＦ）、ならびにアデノウイルスのＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）およびＥ４遺伝子を、それらのネイティブのプロモーターの転写制御下において含む。ｃａｐ ＯＲＦはまた、本明細書において記載されるような修飾されたカプシドタンパク質を生成するために、１つ以上の修飾を含んでもよい。例として、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）から入手可能）を、ＣａＰＯ４媒介性トランスフェクション、脂質またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリマー性分子を介して、ヘルパープラスミドおよび核酸ベクターを含有するプラスミドにより、遺伝子導入する。ＨＥＫ２９３細胞を、次いで、少なくとも６０時間にわたりインキュベートして、ｒＡＡＶ粒子を生成させる。あるいは、ＨＥＫ２９３細胞を、上記の方法を介して、１つ以上の目的の遺伝子を含有するＡＡＶ－ＩＴＲ、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする遺伝子を含むヘルパープラスミドにより遺伝子導入し、ヘルパーウイルスにより共導入する。ヘルパーウイルスとは、ＡＡＶの複製を可能にするウイルスである。ヘルパーウイルスの例は、アデノウイルスおよびヘルペスウイルスである。
あるいは、別の例において、Ｓｆ９ベースの産生株安定細胞株を、核酸ベクターを含む単一の組み換えバキュロウイルスに感染させる。さらなる代替として、別の例において、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞株を、核酸ベクターを含むＨＳＶ、および任意に本明細書において記載されるようなｒｅｐおよびｃａｐのＯＲＦならびにアデノウイルスのＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）およびＥ４遺伝子を、それらのネイティブのプロモーターの転写制御下において含む１つ以上のヘルパーＨＳＶに感染させる。ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、またはＳｆ９細胞を、次いで、少なくとも６０時間にわたりインキュベートして、ｒＡＡＶ粒子を生成させる。ＲＡＡＶ粒子を、次いで、当該分野において公知であるかまたは本明細書において記載される任意の方法を用いて、例えば、イオジキサノール段階的勾配、ＣｓＣｌ勾配、クロマトグラフィー、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿により、精製してもよい。
ヘルペスウイルスベースの系を用いたＡＡＶのラージスケール生成のための方法もまた、公知である。例えば、Clementら（Hum Gene Ther. 2009, 20(8):796-806）を参照。中和性の抗ＡＡＶ抗体に対してより耐性であり得るエキソソーム関連ＡＡＶを生成する方法もまた、もまた、公知である（Hudry et al., Gene Ther. 2016, 23(4):380-92；Macguire et al., Mol Ther. 2012, 20(5):960-71）。
シュードタイピングされたｒＡＡＶベクターを生成してこれを用いるための方法もまた、当該分野において公知である（例えば、Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001；Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000；Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002；およびAuricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001を参照）。
組成物
ｒＡＡＶ粒子の使用を促進するために、多様な処方物が、開発されてきた。例えば、ｒＡＡＶ粒子の注射可能な水溶液の投与のために、溶液を、必要であれば好適に緩衝化してもよく、液体の希釈剤を、初めに十分な食塩水またはグルコースで等張化してもよい。いくつかの態様において、本明細書において提供されるような組成物は、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えば、バリアントｒＡＡＶ２）粒子のうちのいずれか１つを複数含む。いくつかの態様において、組成物は、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ（例えば、バリアントｒＡＡＶ２）粒子のうちの１つより多くを複数含む。いくつかの態様において、「投与すること」または「投与」は、薬理学的に有用な様式において材料を対象に提供することを意味する。
したがって、いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ粒子の組成物は、薬学的に受入可能なキャリアを含む。用語「キャリア」とは、それと共にｒＡＡＶ粒子が投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。かかる医薬用キャリアは、無菌の液体（例えば、水、油脂、食塩水溶液、水性デキストロースおよびグリセロール溶液）、懸濁剤、保存剤（例えば、メチル－、エチル－、およびプロピル－ヒドロキシ－ベンゾエート）、ならびにｐＨ調整剤（無機および有機の酸および塩基など）であってよい。いくつかの態様において、キャリアは、緩衝化食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝化食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝化食塩水）を含む。ＵＳＰグレードのキャリアおよび賦形剤は、ｒＡＡＶ粒子のヒト対象への送達のために、特に有用である。かかる組成物は、さらに任意に、リポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、またはナノ粒子を含んでもよく、あるいは、それを必要とする対象の細胞、組織、臓器または身体への投与のために、別段に処方されてもよい。かかる組成物を作製するための方法は、周知であり、例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy、第２２版、Pharmaceutical Press（２０１２年）において見出すことができる。
いくつかの態様において、本明細書において開示されるｒＡＡＶ粒子のうちのいずれか１つを含む組成物は、０．０１４％のTween 20を添加した平衡化塩溶液（ＢＳＳ）（ポリソルベート20）を含む。いくつかの態様において、本明細書において開示されるｒＡＡＶ粒子のうちのいずれか１つを含む組成物は、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に０．００１％のPluronic F-68を添加したものを含む。
いくつかの態様において、宿主細胞に投与されるｒＡＡＶ粒子の数は、５００～５，０００ベクターゲノム（ｖｇｓ）／細胞の範囲の桁であってよい。特定の態様において、開示される方法は、約５００ｖｇｓ／細胞、１０００ｖｇｓ／細胞、２０００ｖｇｓ／細胞、３０００ｖｇｓ／細胞、４０００ｖｇｓ／細胞、５０００ｖｇｓ／細胞、６０００ｖｇｓ／細胞または７０００ｖｇｓ／細胞の用量におけるｒＡＡＶ粒子の投与を含む。
いくつかの態様において、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の数は、１０６～１０１４粒子／ｍＬまたは１０３～１０１３粒子／ｍＬの範囲の桁、またはいずれかの範囲におけるその間の任意の値、例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３または１０１４粒子／ｍＬなどであってよい。一態様において、１０１３粒子／ｍＬよりも高いｒＡＡＶ粒子が投与される。いくつかの態様において、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の数は、１０６～１０１４ｖｇｓ／ｍＬまたは１０３～１０１５ｖｇｓ／ｍＬの範囲の桁、またはいずれかの範囲におけるその間の任意の値、例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３または１０１４ｖｇｓ／ｍＬなどであってよい。ある態様において、開示される方法は、３×１０３～１×１０４ｖｇｓ／ｍＬの用量におけるｒＡＡＶ粒子組成物の投与を含む。一態様において、１０１３ｖｇｓ／ｍＬよりも高いｒＡＡＶ粒子が投与される。
ｒＡＡＶ粒子は、処置されている特定の疾患または障害の治療を達成するために必要とされる場合は、単回用量として投与しても、または２回以上の投与に分けて投与してもよい。いくつかの態様において、０．０００１ｍＬ～１０ｍＬが、対象に送達される。
いくつかの態様において、本開示は、単独で、または１つ以上の他の治療のモダリティーと組み合わせての、細胞または動物への投与のための、および特にヒトの細胞、組織、ヒトに影響を及ぼす疾患の治療のための、本明細書において開示される組成物の、薬学的に受入可能な溶液中の処方物を提供する。
所望される場合、ｒＡＡＶ粒子または調製物および核酸セグメントは、また例えばタンパク質またはポリペプチドまたは多様な薬学的に活性な剤などの他の剤と組み合わせて投与してもよく、これは、治療用ポリペプチド、生体活性フラグメント、またはこれらのバリアントの、１回以上の全身または局所投与を含む。実際に、標的細胞または宿主組織との接触の際にさらなる剤が顕著な有害効果を引き起こさないことを前提として、また含まれてもよい他の構成成分について実質的に制限はない。ＲＡＡＶ粒子または調製物および核酸セグメントは、したがって、特定の場合において必要とされる場合は、多様な他の剤と共に送達してもよい。かかる組成物は、宿主細胞または他の生物学的ソースから精製してもよく、あるいは代替的に、本明細書において記載されるように化学的に合成してもよい。本明細書において用いられる場合、用語「ベクター」は、核酸セグメント（例えば、プラスミドもしくは組み換えウイルスゲノム）またはウイルスベクター（例えば、組み換えゲノムを含むｒＡＡＶ粒子）を指してもよい。
典型的には、組成物は、治療剤（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のうちの少なくとも約０．１％またはそれより多くを含んでもよいが、活性成分のパーセンテージは、変化してもよく、便利に、全処方物の重量または容積の約１または２％～約７０％または８０％またはそれより多くの間であってよい。当然のことながら、各々の治療上有用な組成物中の治療剤（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の量は、化合物の任意の所与の単位用量において好適な投与量が得られるであろう方法において調製してもよい。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与の経路、製品の有効期間、ならびに他の薬理学的配慮などの要因が、かかる医薬処方物を調製する当業者により企図され、したがって、多様な投与量および処置レジメンが望ましい場合がある。
注射可能な使用のために好適なｒＡＡＶ粒子組成物の薬学的形態として、無菌の水溶液または分散が挙げられる。いくつかの態様において、形態は、無菌であり、容易な通針性（syringability）が存在する程度まで液体である。いくつかの態様において、形態は、製造および貯蔵の条件下において安定であり、細菌および真菌などの微生物の混入作用に対して保存される。いくつかの態様において、形態は、無菌である。キャリアは、例えば、水、食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および／または植物油を含む、溶媒または分散媒であってよい。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。
対象への投与のための組成物の調製は、当該分野において公知である。例えば、１投与量を、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解して、１０００ｍｌの皮下点滴液に添加するか、または提案される注入の部位において注射してもよい（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１５版、1035～1038および1570～1580を参照）。いくつかの投与量のバリエーションは、処置されている対象の状態に依存して、必然的に生じるであろう。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象のために適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトの投与のために、調製物は、例えば、FDA Office of Biologicsの標準により必要とされるような、無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性および純度の標準を満たすべきである。
いくつかの態様において、細胞、組織または臓器は、例えば、疾患を処置する目的のために、in vivoで形質導入される。いくつかの態様において、ＣＮＳの細胞、組織または臓器が、in vivoで形質導入される。いくつかの態様において、脳組織または脳細胞が、in vivoで形質導入される。いくつかの態様において、ＣＮＳに関連する疾患が、開示されるｒＡＡＶ粒子または組成物のうちの１つ以上の投与により処置される。特定の態様において、神経膠腫または神経膠芽腫に関連する疾患が処置される。
いくつかの態様において、「投与すること」または「投与」とは、材料を、薬理学的に有用な様式において対象に提供することを意味する。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、対象に経腸投与される。いくつかの態様において、必須金属元素の経腸投与は、経口である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、対象に非経口投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、対象腫瘍内に、眼内に、皮下に、静脈内に（ＩＶ）、動脈内に、脳内に、脳室内に、筋肉内に、クモ膜下内に（ＩＴ）、大槽内に、腹腔内に、吸入を介して、局所に、または直接注射により、１つ以上の細胞、組織または臓器（例えば脳）に投与される。ある態様において、ｒＡＡＶ粒子送達は、腫瘍内である。
いくつかの態様において、細胞、組織または臓器が形質導入される対象は、脊椎動物（例えば、哺乳動物または爬虫類）である。いくつかの態様において、哺乳動物対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ハムスター、マウス、ラット、ブタ、ウマ、ウシ、ラバまたはウサギである。非ヒト霊長類対象の非限定的な例として、マカク（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）、マーモセット、タマリン、クモザル、ヨザル、サバンナモンキー、リスザル、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジーおよびオランウータンが挙げられる。いくつかの態様において、対象は、特定の疾患のための、あるいは薬物動態学および／または異種遺伝子によりコードされるタンパク質もしくはｓｉＲＮＡの薬物動態学を研究するために用いられるモデルである。
疾患を「処置する」とは、当該用語が本明細書において用いられる場合、対象により経験される疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重篤度を軽減することを意味する。上または本明細書において他の場所で記載される組成物は、典型的には、望ましい結果を提供することができる量である有効量において、対象に投与される。望ましい結果は、投与されている活性剤に依存するであろう。例えば、ｒＡＡＶ粒子の有効量は、発現コンストラクトを、宿主細胞、組織または臓器に移送できる粒子の量であってよい。治療的に受入可能な量とは、疾患、例えば脳卒中を処置することができる量であってよい。医学および獣医学の分野において周知であるとおり、任意の１つ対象のための投与量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与されるべき特定の組成物、組成物中の活性成分、投与の時間および経路、一般的健康、および同時に投与されている他の薬物を含む、多くの要因に依存する。
例
例１．ＡＡＶ２送達．
腫瘍進行と同期されたライブラリー試薬の投与の動的様式を評価した。ＡＡＶベクターは、評価下において、シアンを励起可能な橙色の蛍光レポーター遺伝子であるAntaresを発現した。Antares遺伝子は、CyOFP1とNanoLucルシフェラーゼとの最適化された融合物からなり、高感度生物発光レポーターとしてin vivoで機能し、深組織から、ホタルルシフェラーゼおよび他の生物発光タンパク質よりも実質的により明るいシグナルを生成する（本明細書において参考として援用されるChu et al., Nat Biotechnol. 2016 Jul; 34(7): 760-767を参照）。腫瘍進行と同期させたAAV2-Antaresベクター試薬の持続的腫瘍内勾配注入（すなわち、腫瘍増殖の早期および後期と同期して、遅い注入速度から速い注入速度へ）は、単回腫瘍内注射と比較して、Antares遺伝子送達のほぼ１０倍の増大をもたらした。遅いおよび速いＧＳＣ集団および非ＧＳＣ ＧＢＭ細胞集団に対して特異的なバリアントについての定向進化スクリーニングにおけるＡＡＶ試薬の同期送達は、標的細胞の感染をもたらした（図１Ａ～１Ｃ）。
例２．ＡＡＶ２ライブラリーの定向進化スクリーニング．
３つのＧＦＰ／ルシフェラーゼ標識ＧＳＣ株、および各々の群において少なくとも５個体の動物において、ＡＡＶ２ライブラリー（約１０７のバリアントの複雑度）を用いた、３ラウンドの定向進化スクリーニング。生物発光イメージング（ＢＬＩ）により、腫瘍増殖をモニタリングした。各々のラウンドについて、動物の背中に皮下移植（ｓ．ｑ．）したAlzetポンプを用いて、ＡＡＶ２注入を腫瘍増殖と同期させた。カテーテルを腫瘍内に挿入した。ＡＡＶ２ライブラリーは、少なくとも２週間の期間にわたり注入し、第２週において腫瘍増殖が加速した場合、注入速度を２倍にし、その後、１週間の期間、ウイルスによる最大の形質導入を可能にするために静置した。腫瘍を採取し、ＦＡＣＳにより分析した；ＧＦＰについてゲーティングし、ＣＤ１３３およびＣＤ４４のシングルポジティブ、ＣＤ１３３／ＣＤ４４ダブルポジティブならびにＣＤ１３３／ＣＤ４４ダブルネガティブ集団についてソートした（図２）。各々の細胞集団において２ラウンドの定向進化スクリーニングを行い、表１～８において示す結果を得た。その後、第３ラウンドの評価を行って、４つ全ての細胞型にわたり最も高い形質導入の増大（またはこれにおける改善）を与えた、２３のバリアントを得た。これらの定向進化（ＤＥ）実験は、カプシドバリアントがＡＡＶ２ウイルスライブラリーの中で均一に分布することを前提とする。
例３．次世代シークエンシング（ＮＧＳ）およびバイオインフォマティクス．
定向進化の各々のラウンドの後で、各々の細胞集団からウイルスＤＮＡを単離し、専用のソフトウェアを用いる次世代シークエンシング（ＮＧＳ）およびバイオインフォマティクス分析に供した。クラスタリング分析は、ＧＳＣおよび非ＧＳＣ－ＧＢＭ細胞各々の集団の増大した認識および形質導入を示す、いくつかの濃縮されたＡＡＶカプシドバリアントを同定した。２３のＡＡＶバリアント（Ｍｕｔ）は、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ１３３（＋）およびダブルネガティブ細胞を含む、試験された全ての型を認識し、これに形質導入した（図３および４）。
次世代シークエンシングを用いて、定向進化スクリーニングにおいて同定されたＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質におけるアミノ酸置換であって形質導入を増大させるものを同定した。これらのシークエンシング評価の結果を、表１～８において示す。バリアントを、各々のバリアントと関連するｒＡＡＶベクター（またはゲノム）の「濃縮因数」と共に示す。濃縮因数（「％」）とは、全ヌクレオチド配列の読み値（read）（または「コピー」）のパーセンテージであって、特定のスクリーニングのラウンドにおいて、特定のバリアントと関連するゲノムにより表されるものを指す。（読み値は、ゲノムの次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を通して決定される。）このパーセンテージの値が高いほど、バリアントが、ｒＡＡＶゲノムを組み込むためにこれらの特定の細胞型を標的としてこれに感染するために好適である。単一のスクリーニングのラウンドの後で、より高い配列読み値のパーセンテージを生じるバリアントを、より良好な（または最良の候補として選択することができる。そのシナリオにおいて、示される％は、（個々の変異体ゲノムの読み値のカウント）／（ＤＮＡ試料中の全ての変異体ゲノムの読み値のカウント）の分率に等しい。例えば、合計１０００，０００コピーのＤＮＡ（その試料について）の分析をスクリーニングした後で１０，０００コピーの変異体＃１が回収された場合、変異体＃１についての％は、（１０，０００／１０００，０００）*１００％、または１％として計算される。
スクリーニングの２つのラウンドの間（例えば、ＣＤ１３３＋ＧＳＣ細胞におけるラウンド１および２の選択）の濃縮を説明する変化率の値は、以下のとおり計算することができる：
Figure 2022544237000006
したがって、いくつかの態様において、開示されるｒＡＡＶ粒子のうちのいずれかのカプシドバリアントは、ＧＢＭおよび／またはＧＳＣ細胞において、０．０１、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、２０．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０または９５．０より大きい、任意に１０．０または２０．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０または９０．０より大きい、濃縮因数（％）を示すポリペプチド配列を含む。特定の態様において、カプシドバリアントは、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０または２０．０より大きい濃縮因数を示す。例えば、カプシドは、配列番号８（例えば、配列番号４～７および９～２８の変異）と比較して、配列番号４、５、６、７または９～７０１０のうちのいずれかの変異を含み、上記のような濃縮因数を示す配列を含んでもよい。
表についてのキーは、以下のとおりである：
・表１は、野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドタンパク質の可変領域Ｉ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩに対応する配列番号８に対する、ＣＤ１３３＋ＧＳＣ細胞におけるラウンド１選択の後のバリアントのプールのアミノ酸配列のアラインメントを表す。
・表２は、ＣＤ１３３＋ＧＳＣ細胞におけるラウンド２選択の後のバリアントのプールのアミノ酸配列のアラインメントを表す。
・表３は、ＣＤ４４－／ＣＤ１３３－ＧＢＭ細胞におけるラウンド１選択の後のバリアントのプールのアミノ酸配列のアラインメントを表す。
・表４は、ＣＤ４４－／ＣＤ１３３－ＧＢＭ細胞におけるラウンド２選択の後のバリアントのプールのアミノ酸配列のアラインメントを表す。
・表５は、ＣＤ４４＋／ＣＤ１３３＋ＧＳＣ細胞におけるラウンド１選択の後のバリアントのプールのアミノ酸配列のアラインメントを表す。
・表６は、ＣＤ４４＋／１３３＋ＧＳＣ細胞におけるラウンド１選択の後のバリアントのプールのアミノ酸配列のアラインメントを表す。
・表７は、ＣＤ４４＋ＧＳＣ細胞におけるラウンド１選択の後のバリアントのプールのアミノ酸配列のアラインメントを表す。
・表８は、ＣＤ４４＋ＧＳＣ細胞におけるラウンド２選択の後のバリアントのプールのアミノ酸配列のアラインメントを表す。
・表９は、配列番号８に対する、４つ全てのＧＳＣおよびＧＢＭ細胞集団を標的とする３ラウンドの定向進化により選択された上位２３のカプシドバリアントの配列のアミノ酸配列のアラインメントを表す。
表１．ＣＤ１３３＋ＧＳＣ（ラウンド１選択のプール）についての特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶカプシドタンパク質。アミノ酸数は、ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号１）に対応する。最後から２番目カラムにおけるパーセンテージ値は、「濃縮因数」を示す。下の配列は、上から下へ、配列番号８および２９～２９５に対応する。
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表２．ＣＤ１３３＋ＧＳＣ（ラウンド２選択のプール）についての特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶカプシドタンパク質。アミノ酸数は、ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号１）に対応する。下の配列は、上から下へ、配列番号８および２９６～５２３に対応する。
Figure 2022544237000020
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表３．ＣＤ４４－／１３３－ＧＢＭ細胞（ラウンド１選択のプール）についての特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶカプシドタンパク質。アミノ酸数は、ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号１）に対応する。下の配列は、上から下へ、配列番号８および５２４～３６９１に対応する。
Figure 2022544237000024
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表４．ＣＤ４４－／１３３－ＧＢＭ細胞（ラウンド２選択のプール）についての特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶカプシドタンパク質。アミノ酸数は、ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号１）に対応する。下の配列は、上から下へ、配列番号８および３６９２～３７３０に対応する。
Figure 2022544237000073
Figure 2022544237000074
表５．ＣＤ４４＋／１３３＋ＧＳＣ（ラウンド１選択のプール）についての特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶカプシドタンパク質。アミノ酸数は、ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号１）に対応する。下の配列は、上から下へ、配列番号８および３７３１～４６６７に対応する。
Figure 2022544237000075
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表６．ＣＤ４４＋／１３３＋ＧＳＣ（ラウンド２選択のプール）についての特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶカプシドタンパク質。アミノ酸数は、ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号１）に対応する。下の配列は、上から下へ、配列番号８および４６６８～４７０５に対応する。
Figure 2022544237000090
Figure 2022544237000091
表７．ＣＤ４４＋ＧＳＣ（ラウンド１選択のプール）についての特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶカプシドタンパク質。アミノ酸数は、ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号１）に対応する。下の配列は、上から下へ、配列番号８および４７０６～６９８１に対応する。
Figure 2022544237000092
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Figure 2022544237000126
表８．ＣＤ４４＋ＧＳＣ（ラウンド２選択のプール）についての特異性および／またはその形質導入が増大したＡＡＶカプシドタンパク質。アミノ酸数は、ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号１）に対応する。下の配列は、上から下へ、配列番号８および６９８２～６９８６に対応する。
Figure 2022544237000127
例４．ＧＢＭ特異的な変異体の検証
１、９、１９および２３番のバリアント（または変異体）（図４）および対照ＷＴ ＡＡＶ２を、レポーター遺伝子Antaresを発現するように合成した。同等の力価の変異体、および２倍高い力価のＷＴを、Ｄ－ルシフェラーゼでタグ付けされた多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）患者由来の異種移植（ＰＤＸ）動物のコホート中に、１回注射した。Antares生物発光（フリマジンを用いる）を、注射の４日後に測定した。Antares生物発光を、基線のＤ－ルシフェラーゼ生物発光（Ｄ－ルシフェリンを用いたもの）に対して正規化した。図５において示される変異体９および１９からの結果は、効率およびＧＢＭについての特異性において、選択されていないＷＴ ＡＡＶ２対照と比較して、著しく上昇したことは、ＮＧＳ分析により予測されたとおりであった
図６Ａ、６Ｂおよび７において示されるとおり、異なる細胞集団からの２ラウンドの選択の後で細胞に対するアフィニティーおよびこれにおける形質導入を増大させる、特定のカプシドバリアントのプールは、顕著なオーバーラップを有する。
最も高い形質導入特性を付与するカプシドバリアントのうちのいくつかは、配列番号１（ＡＡＶ２ ＶＰ１アミノ酸配列）に対して、以下のアミノ酸位置の組み合わせのうちの１つにおいて置換を含む：（ａ）Ｑ２６３、Ｓ２６４、Ｙ４４４、Ｔ４５０、Ｐ４５１、Ｓ４５２、Ｔ４５４、Ｑ４５７、Ｒ４５９、Ｑ４６１、Ｓ４９２、Ａ４９３、Ｄ４９４、Ｅ４９９およびＹ５００Ｆ、または（ｂ）Ｅ５３１、Ｋ５３２、Ｓ５４７、Ｅ５４８、Ｄ５５３、Ｒ５８５およびＲ５８８。
表９．バリアントカプシドタンパク質：アミノ酸置換．４つ全てのＧＳＣおよびＧＢＭ細胞集団を標的とする３ラウンドの定向進化により選択された、上位２３のカプシドバリアントのアミノ酸（ＡＡ）配列。リストの上の数は、ＷＴ ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシド配列中のＡＡ残基位置を指定する。選択されたバリアント中の、保存された、変異していない残基は、点により同定され、変異体ＡＡの位置は、それぞれのＷＴ ＡＡの下に示される。番号９、１０、１８、１９および２３を有するバリアントを、太字で示す。ＮＧＳデータベースにおける選択されたバリアントの頻度（％における）は、配列の右側に対する４つの列において示す。加えて、「１０*」と指定されるバリアントを、合成した。下の配列は、上から下へ、配列番号８および６９８７～７０１０に対応する。
Figure 2022544237000128
Figure 2022544237000129
Figure 2022544237000130
上のバリアント＃９、＃１０、＃１８および＃２３についての完全なアミノ酸配列（チャート中で太字およびローマ数字により示される）を、以下に示す。
バリアント９－配列番号４
Figure 2022544237000131
バリアント１０－配列番号５
Figure 2022544237000132
バリアント１８－配列番号６
Figure 2022544237000133
バリアント２３－配列番号７
Figure 2022544237000134
表９における残りのカプシドバリアントについての完全なアミノ酸配列を以下に示す。
バリアント１－配列番号９
Figure 2022544237000135
バリアント２－配列番号１０
Figure 2022544237000136
バリアント３－配列番号１１
Figure 2022544237000137
バリアント４－配列番号１２
Figure 2022544237000138
バリアント５－配列番号１３
Figure 2022544237000139
バリアント６－配列番号１４
Figure 2022544237000140
バリアント７－配列番号１５
Figure 2022544237000141
バリアント８－配列番号１６
Figure 2022544237000142
バリアント１１－配列番号１７
Figure 2022544237000143
バリアント１２－配列番号１８
Figure 2022544237000144
バリアント１３－配列番号１９
Figure 2022544237000145
バリアント１４－配列番号２０
Figure 2022544237000146
バリアント１５－配列番号２１
Figure 2022544237000147
バリアント１６－配列番号２２
Figure 2022544237000148
バリアント１７－配列番号２３
Figure 2022544237000149
バリアント１９－配列番号２４
Figure 2022544237000150
バリアント２０－配列番号２５
Figure 2022544237000151
バリアント２１－配列番号２６
Figure 2022544237000152
バリアント２２－配列番号２７
Figure 2022544237000153
バリアント１０*－配列番号２８
Figure 2022544237000154
例５．In Vitroでのカプシドバリアントの検証
定向進化スクリーニングにより、ＧＢＭおよびＧＳＣ細胞において最も良く形質導入するカプシドのうちの４つとして、カプシドバリアント＃９、＃１０、＃１８および＃２３を同定した。これらのカプシドを含む組み換えＡＡＶ粒子を、in vitroで、患者由来細胞において、３Ｄ灌流ニューロスフェアアッセイにおいて評価した（図８Ａ）。ニューロスフェアは、自由に浮遊する細胞のクラスターを含んでなる培養系である。本明細書において用いられる場合、ニューロスフェアアッセイ（ＮＳＡ）は、定義された無血清条件において培養される患者由来ＧＢＭおよびＧＳＣ細胞を含む。ＮＳＡは、細胞のクローンの球の使用におけるin vivoでの腫瘍化能力および増殖を反映するモデルを可能にする。ポリアクリルアミドニューロスフェアアッセイ（ｐＮＳＡ）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の水溶液中に浸漬された透明なポリアクリルアミドハイドロゲル粒子を含んでなる１０～２０μｍのマイクロゲルの使用を含む（図８Ｂ）。ＡＡＶ灌流、または動的継代（dynamic passage）を示す。本明細書において用いられる場合、ｐＮＳＡアッセイは、患者由来ＧＢＭのクローンの球における支持を示し、in situでのシングルセルの分解能における蛍光獲得を可能にする。
これら４つのカプシドの各々を含むＡＡＶ粒子を、Antares遺伝子を発現するように操作した。粒子を、ＧＢＭ細胞およびＧＳＣ細胞に投与し、形質導入の１、３および５日後に、蛍光（ｍＦＩ）を評価した。図８Ｃ～８Ｄにおいて示されるとおり、無血清ＧＢＭ細胞における形質導入の動態学および向性は、有利なものであった。図８Ｃにおいて示されるとおり、特にカプシドバリアント＃９を含む粒子についての形質導入の動態学が優れていた。これら４つのバリアントについての第５日の形質導入の動態学の順位付けを、図８Ｄにおいて示す。変異体＃９は、最も右のバーにおいて示す。無血清灌流におけるこれらのカプシドの効率的な形質導入は、これらの粒子が、スケーラブルなｒＡＡＶの生成のために好適であり得、例４において示される定向進化スクリーニングおよびin vivo検証実験を確認することを示唆する。
これら４つのカプシドの各々を含むＡＡＶ粒子を、３つのショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）：スクランブルｓｈＲＮＡ（scrambled shRNA）、Ｎｋｘ６－２およびＡｓｃｌ－１遺伝子をノックダウンの標的とするｓｈＲＮＡ、またはＮｋｘ６－２のみを標的とするｓｈＲＮＡのうちの１つと共に、またはそれを用いずに、ＧＦＰを発現するように操作した。粒子は、ＧＦＰの発現（すなわち、ＡＡＶ形質導入を測定する）、球のサイズ、およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取り込み（細胞死の尺度）であった。図９Ａ～９Ｃにおいて示されるとおり、Ｎｋｘ６－２またはＮｋｘ６－２／Ａｓｃｌ１の組み合わせのいずれかを標的とするｓｈＲＮＡを担持するカプシドバリアント＃９を含有する粒子は、ＧＢＭおよびＧＳＣに、効果的に形質導入し、Ｎｋｘ６－２およびＡｓｃｌ－１の発現の両方をサイレンシングし、これは、ｐＮＳＡアッセイにおいて決定されるとおり、対照のスクランブルｓｈＲＮＡを含有するＡＡＶと比較して、ＧＢＭスフェアサイズの減少および細胞死の増加をもたらした。スクランブルｓｈＲＮＡ（対照、Ｘ）と比較して、細胞の生存率は、形質導入の後４～８日にわたり、Ｎｋｘ６－２／Ａｓｃｌ－１（Ｙ）およびＮｋｘ６－２（Ｚ）ショートヘアピンＲＮＡにおいて実質的に低下する（図９Ｂ～９Ｃ）。サイズの減少および死の増加は、ＭＲのｓｈＲＮＡの枯渇により媒介されたことが、専門の共焦点アルゴリズムを用いてＰＩ取り込みにより捕捉された。図９Ｃにおけるチャートは、３つのｓｈＲＮＡカセットを発現する粒子について、差次的な細胞殺傷（生存％）の動態学を示す。Ｎｋｘ６－２／Ａｓｃｌ－１ ｓｈＲＮＡを発現するベクターが、ほとんどの細胞の死を引き起こしたが、一方、Ｎｋｘ６－２（単独）ベクターは、最も劇的な単一の日の細胞死の増大（第７日と８日との間）を引き起こした。これらの動態学は、これら４つのリードＡＡＶバリアントのさらなるスクリーニングを可能にした。
他の態様
本明細書において開示される特徴の全ては、任意の組み合わせにおいて組み合わせてもよい。本明細書において開示される各々の特徴は、同じか、同等か、または類似の目的に役立つ代替的特徴により置き換えられてもよい。したがって、別段に明示的に記述されない限り、開示される各々の特徴は、一般的な一連の同等または類似の特徴の一例にすぎない。
上の記載から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、それを多様な用途および条件に適応させるために、本開示の多様な変更および改変を行うことができる。したがって、他の態様もまた、請求の範囲内である。
均等物
いくつかの本発明の態様を、本明細書において記載および説明してきたが、一方で、当業者は、機能を行うため、ならびに／または本明細書において記載される結果および／もしくは利点のうちの１つ以上を得るための、多様な他の手段および／または構造を、容易に想起し、かかるバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書において記載される本発明の態様の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書において記載される全てのパラメーター、寸法、材料および立体構造は、例示的であることを意図されること、ならびに、実際のパラメーター、寸法、材料および／または立体構造は、本発明の教示がそのために用いられる特定の適用に依存するであろうことを、容易に理解するであろう。当業者は、本明細書において記載される本発明の特定の態様に対する多くの均等物を、理解するか、または慣用的な実験のみを用いて確認することができるであろう。したがって、前述の態様は、単に例として提示されるものであること、ならびに、添付の請求の範囲およびそれに対する均等物の範囲内において、本発明の態様は、具体的に記載されるかまたは請求されるものとは別段に実施してもよいことが理解されるべきである。本開示の発明の態様は、本明細書において記載される各々の個々の特徴、系、物品、材料、キットおよび／または方法に対して向けられる。加えて、２つ以上のかかる特徴、系、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせは、かかる特徴、系、物品、材料、キットおよび／または方法が互いに相反しない場合には、本開示の発明の範囲内に含まれる。
全ての定義は、本明細書において定義され用いられる場合、定義される用語の辞書の定義、参考として援用される文書における定義および／または通常の意味に対して優先されることが理解されるべきである。
本明細書において開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される主題に関して、参考として援用され、これは、いくつかの場合においては、文書の全体を包含してもよい。
不定冠詞「a」および「an」は、本明細書において、明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、逆であることが明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
句「および／または」、本明細書において、明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、そのように結合された要素のうちの「いずれかまたは両方」、すなわち、いくつかの場合において接続的に存在し、他の場合においては離接的に存在する要素を意味するものと理解されるべきである。「および／または」により列記される複数の要素は、同じ様式において、すなわち、そのように結合された要素のうちの「１つ以上」において、解釈されるべきである。他の要素は、「および／または」節により特に同定された要素の他に、任意に存在してもよく、これは、特に同定された要素と関連しても関連しなくてもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」についての言及は、「含む（comprising）」などのオープンエンドの語法と組み合わせて用いられる場合、一態様においては、Ａのみ（任意にＢ以外の要素を含む）を指していてもよく；別の態様においては、Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を含む）を指していてもよく；さらに別の態様においては、ＡおよびＢの両方（任意に他の要素を含む)を指していてもよい、など。
本明細書において、明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、「または」は、上で定義されるような「および／または」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、リストにおいて項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包含的である、すなわち、少なくとも１つの包含として解釈されるべきであるが、また、多数の要素または要素のリストのうちの１つより多く、および任意にさらなる列記されていない項目を含む。「～のうちの１つのみ」または「～のうちの正確に１つ」、または、請求の範囲において用いられる場合、「～からなる（consisting of）」などの、逆であることが明確に示される用語は、多数の要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素の包含を指すであろう。一般的に、用語「または」とは、本明細書において用いられる場合、「～のいずれか」、「～のうちの１つ」、「～のうちの１つのみ」または「～のうちの正確に１つ」などの排他性の用語により先行される場合には、排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるべきである。「～から本質的になる（consisting essentially of）」とは、請求の範囲において用いられる場合、特許法の分野において用いられる場合のその通常の意味を有するべきである。
本明細書において、明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、１つ以上の要素のリストに関する句「少なくとも１つ」は、要素のリスト中の要素のうちのいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも要素のリスト中に特に列記される各々および全ての要素のうちの少なくとも１つを含むものではなく、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを除外するものではないことが、理解されるべきである。この定義はまた、句「少なくとも１つ」が言及する要素のリスト中に特に同定される要素以外の要素が、特に同定される要素と関連しても関連しなくとも、任意に存在してもよいことを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または、同等に、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、一態様においては、Ｂの不在下における（および任意にＢ以外の要素を含む）、少なくとも１つ（任意に１つより多くを含む）のＡを指していてもよく；別の態様においては、Ａの不在下における（および任意にＡ以外の要素を含む）、少なくとも１つ（任意に１つより多くを含む）のＢを指していてもよく；さらに別の態様においては、少なくとも１つ（任意に１つより多くを含む）のＡ、および少なくとも１つ（任意に１つより多くを含む）のＢ（および任意に他の要素を含む）を指していてもよい；など。
また、逆であることが明確に示されない限り、本明細書において請求される任意の方法であって、１つより多くのステップまたは行為を含むものにおいて、当該方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも、当該方法のステップまたは行為が記述される順序に限定されないことが、理解されるべきである。
請求の範囲において、ならびに上の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「担持する（carrying）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「含む（involving）」、「保持する（holding）」、「～を含んでなる（composed of）」、および類似のものなどの全ての移行句は、オープンエンドである、すなわち、それを含むがそれに限定されないことを意味するものと理解されるべきである。米国特許庁特許審査便覧、セクション2111.03において記載されるとおり、移行句「～からなる（consisting of）」および「～から本質的になる（consisting essentially of）」のみが、それぞれ、クローズまたはセミクローズの移行句であるべきである。オープンエンドの移行句（例えば、「含む（comprising）」）を用いて本文書において記載される態様もまた、代替的な態様においては、オープンエンドの移行句により記載される特徴「からなる（consisting of）」およびそれ「から本質的になる（consisting essentially of）」ものとして企図されることが、理解されるべきである。例えば、本開示が「ＡおよびＢを含む組成物」を記載する場合、本開示はまた、代替的な態様「ＡおよびＢからなる組成物」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物」を企図する。

Claims (21)

  1. 神経膠芽腫細胞（ＧＢＭ）および／または神経膠腫幹細胞様細胞（ＧＳＣ）に形質導入するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、または表９のうちのいずれかにおいて記載されるようなアミノ酸置換を含むカプシドタンパク質を含む、前記ＡＡＶ粒子。
  2. 配列番号１に記載されるような野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシド配列の、以下のアミノ酸位置の組み合わせ：
    Ｑ２６３、Ｓ２６４、Ｙ４４４、Ｔ４５０、Ｐ４５１、Ｓ４５２、Ｔ４５４、Ｑ４５７、Ｒ４５９、Ｑ４６１、Ｓ４９２、Ａ４９３、Ｄ４９４、Ｅ４９９およびＹ５００、もしくは
    Ｅ５３１、Ｋ５３２、Ｓ５４７、Ｅ５４８、Ｄ５５３、Ｒ５８５およびＲ５８８；
    のうちの１つ、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型の野生型ＶＰ１カプシド配列の相同なアミノ酸において置換を含むカプシドタンパク質を含む、ＡＡＶ粒子。
  3. 配列番号１に記載されるような野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシド配列のＥ５３０、Ｅ５３１およびＫ５３２、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型の野生型ＶＰ１カプシド配列の相同なアミノ酸において、置換をさらに含む、請求項２（ａ）または２（ｂ）に記載のＡＡＶ粒子。
  4. アミノ酸置換が、配列番号１のアミノ酸配列に対して、Ｅ５３１Ｇ、Ｋ５３２Ｒ、Ｓ５４７Ａ、Ｅ５４８Ｇ、Ｔ５５０Ｎ、Ｖ５５２Ａ、Ｄ５５３Ａ、Ｅ５５５Ｇ、Ｋ５５６Ｑ、Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む、請求項１または２に記載のＡＡＶ粒子。
  5. アミノ酸置換が、配列番号１のアミノ酸配列に対して、Ｑ２６３Ｇ、Ｓ２６４Ｔ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４５０Ａ、Ｐ４５１Ｅ、Ｓ４５２Ｇ、Ｔ４５４Ｌ、Ｔ４５５Ｋ、Ｑ４５７Ｍ、Ｒ４５９Ｈ、Ｑ４６１Ｌ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９ＤおよびＹ５００Ｆを含む、請求項１または２に記載のＡＡＶ粒子。
  6. アミノ酸置換が、配列番号１のアミノ酸配列に対して、Ｓ２６４Ａ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４５０Ｄ、Ｐ４５１Ｒ、Ｓ４５２Ｇ、Ｔ４５４Ｓ、Ｑ４５７Ｔ、Ｒ４５９Ａ、Ｑ４６１Ｓ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９ＤおよびＹ５００Ｆを含む、請求項１に記載のＡＡＶ粒子。
  7. Ｑ２６３Ａをさらに含む、請求項６に記載のＡＡＶ粒子。
  8. アミノ酸置換が、配列番号１のアミノ酸配列に対して、Ｅ５３０Ｎ、Ｅ５３１Ｄ、Ｋ５３２Ｒ、Ｓ５４７Ａ、Ｅ５４８Ｋ、Ｋ５４９Ｇ、Ｄ５５３Ａ、Ｉ５５４Ｖ、Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子。
  9. アミノ酸置換が、配列番号１のアミノ酸配列に対して、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４５０Ａ、Ｐ４５１Ｓ、Ｓ４５２Ａ、Ｔ４５４Ｓ、Ｑ４５７Ｔ、Ｒ４５９Ｔ、Ｑ４６１Ｇ、Ｔ４９１Ｑ、Ｓ４９２Ｐ、Ａ４９３Ｇ、Ｅ４９９Ｄ、Ｙ５００Ｆ、Ｅ５３０Ｄ、Ｅ５３１ＤおよびＫ５３２Ｒを含む、請求項１または２に記載のＡＡＶ粒子。
  10. アミノ酸置換が、配列番号１のアミノ酸配列に対して、Ｑ２６３Ｅ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４５０Ａ、Ｐ４５１Ｓ、Ｓ４５２Ａ、Ｔ４５４Ｓ、Ｑ４５７Ｔ、Ｒ４５９Ｔ、Ｑ４６１Ｇ、Ｔ４９１Ｑ、Ｓ４９２Ｐ、Ａ４９３Ｇ、Ｅ４９９Ｄ、Ｙ５００Ｆ、Ｅ５３０Ｄ、Ｅ５３１ＤおよびＫ５３２Ｒを含む、請求項１に記載のＡＡＶ粒子。
  11. カプシドが、配列番号４～７および９～２８のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子。
  12. カプシドが、配列番号４～７および９～２８のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項１～３および１１のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子。
  13. カプシドが、配列番号４を含むアミノ酸配列を有する、請求項１～３および１１、１２のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子。
  14. 置換が、野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、ＧＢＭまたはＧＳＣ細胞の形質導入の増大をもたらす、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子。
  15. 少なくとも１つの異種核酸配列をコードする組み換えゲノムを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子。
  16. 異種核酸配列が、治療用ペプチドまたはタンパク質をコードする、請求項１５に記載のＡＡＶ粒子。
  17. 治療用ペプチドが、修復酵素、チェックポイント阻害剤、転写因子、増殖因子受容体、増殖因子リガンド、または腫瘍サプレッサータンパク質である、請求項１６に記載のＡＡＶ粒子。
  18. カプシドが、配列番号４～７および９～７０１０のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、任意にここで、カプシドが、配列番号４～７および９～２８のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子。
  19. カプシドおよびゲノムを含む組み換えＡＡＶベクターであって、前記カプシドが、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、または表８のいずれかに記載されるようなアミノ酸置換を有するＶＰＸタンパク質を含み、ここで、前記置換が、野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、ＧＢＭ細胞またはＧＳＣの形質導入の増大をもたらす、組み換えＡＡＶベクター。
  20. 異種遺伝子またはターゲティングコンストラクトを神経膠腫細胞に送達する方法であって、異種遺伝子またはターゲティングコンストラクトを、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子中に挿入すること、および神経膠腫細胞をＡＡＶと接触させることを含む、前記方法。
  21. ある腫瘍細胞型についてアフィニティーを有するウイルスバリアントを同定する方法であって、腫瘍中へのウイルスライブラリーの持続的腫瘍内勾配注入を提供すること、ここで、注入の速度は、腫瘍増殖の速度に比例する、を含む、前記方法。
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