CN104826134A - 一种抗肝纤维化基因药物rAAV8-KAL - Google Patents
一种抗肝纤维化基因药物rAAV8-KAL Download PDFInfo
- Publication number
- CN104826134A CN104826134A CN201510219621.3A CN201510219621A CN104826134A CN 104826134 A CN104826134 A CN 104826134A CN 201510219621 A CN201510219621 A CN 201510219621A CN 104826134 A CN104826134 A CN 104826134A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- kal
- group
- kallistatin
- hepatic fibrosis
- fibrosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及基因药物rAAV8-KAL及其在抗肝纤维化中的应用，具体涉及基于8型重组腺相关病毒和抗纤维化Kallistatin的基因药物，所述基因药物可有效治疗肝纤维化，同时可在体内长时间维持稳定表达水平，无需反复给药，解决了现有抗纤维化药物无法靶点单一、需重复给药等问题。
Description
技术领域:
本发明涉及分子药物学，具体地说涉及重组腺相关病毒载体携带Kallistatin基因在抗肝纤维化中的的应用。
背景技术:
肝纤维化是各类慢性肝病进一步发展、恶化的重要环节，若能在肝纤维化阶段消除致病因素并给予适当治疗，对于我国这一肝病大国意义十分重大。肝脏在纤维化过程中，普遍存在缺氧、炎症、氧化应激、门脉高压和血管增生等症状，因此，有效的抗纤维化药物应将针对多靶点、多途径作为其主要研究方向。目前此类药物大多为重组蛋白，需反复给药，麻烦不便。临床医学研究表明，持续稳定剂量给药比间断性峰值给药更为有效、副作用更低，而新兴的基因药物治疗技术恰能实现持续稳定的给药途径。
Kallistatin是一种内源性血管生成抑制因子，具有抗炎症、抗氧化、舒张血管、抗血管生成、抗肿瘤等多种生物学功能，对肝纤维化进程涉及到的各种症状起到一对一的抑制作用；重组腺相关病毒载体(rAAV)以其高稳定性，低致病性、低免疫原性、宿主范围广、分裂或非分裂细胞都能感染，以及持久表达目的基因等多方面优势，被认为是最有希望的临床基因药物治疗载体，尤其是在纤维化的肝脏中，粒径仅为20nm的rAAV能更加有效穿越肝窦内皮层进而转导肝细胞或肝星状细胞，是一种比较理想的肝纤维化基因药物治疗载体，在AAV的众多血清型中，8型AAV载体是目前对肝靶向性最好的一种rAAV载体，可以将Kallistatin以持续稳定剂量运输到肝脏中。
本实验室将rAAV8-kallistatin基因药物，经尾静脉注射到四氯化碳CCl4诱导的肝纤维化模型小鼠体内，并观察32天，发现rAAV8-Kal不仅对肝纤维化有显著疗效，且能在整个观察期内维持稳定水平表达。本实验涉及的rAAV8-kallistatin基因药物能够有效治疗肝纤维化的研究成果，迄今尚未见有国内外的相关报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种用于治疗肝纤维化的基因药物，以解决现有治疗肝纤维化药物靶点单一、需长期反复给药等问题。
本发明的基因治疗药物，由8型rAAV介导Kallistatin基因的表达，其具体特征是：病毒载体为8型rAAV；抗纤维化治疗基因为Kallistatin；基因表达框依次含有CMV/CAG鸡β-actin启动子、Kallistatin基因、WPRE(Woodchuck hepatitis Post-transcriptional Regulatory Element)增强子、polyA尾巴，基因表达框两端为AAV2ITR(inverted terminal repeat sequence)。
不同血清型的AAV序列虽具有较高同源性，但每个AAV型都具有不同的衣壳，而衣壳则是决定AAV趋性和转导特点的主要因素。本发明以rAAV2质粒为基因表达质粒，分别采用rAAV2、8辅助质粒进行包装，得到两种血清型的rAAV病毒。通过动物实验发现，rAAV2/8在肝纤维化治疗中效果更佳。
本发明所述基因药物采用三质粒转染法制备，即采用磷酸钙法将表达质粒与辅助质粒共同转染293细胞，并于60-72小时后收获重组病毒，经层析纯化后备用。
本发明提供了rAAV8-KAL在制备抗肝纤维化药物中的应用。
本发明还提供了以rAAV8-KAL为有效成分与药学上可接受的一种或多种载体组成的药物组合物。
本发明还提供了所述组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
本发明的基因药物优先选用静脉注射的给药方式。
本发明的有益效果在于：提供了一种针对多靶点通过多途径的肝纤维化基因治疗药物，所述基因药物不仅能够有效治疗肝纤维化，且无需重复给药，能在体内长时间维持稳定表达水平。
附图说明：
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1-各组小鼠肝脏外观
其中：a为正常组；b为造模刚完成；c为模型组；d为rAAV2-Kal治疗组；e为rAAV8-Kal治疗组。
图2-各组小鼠肝脏HE染色(×100)
图3-各组小鼠肝脏苦味酸天狼猩红染色(×100)
图4-各组小鼠肝功能指标(ALT、AST、TBIL)检测结果
其中：N为正常组；M为模型组；2K为rAAV2-Kal治疗组；8K为rAAV8-Kal治疗组(VSM组:*p<0.05,**p<0.01)。
图5-各组小鼠血清中HA、LN、C-Ⅲ、C-Ⅳ水平检测结果
图6-各组小鼠肝组织氧化指标(MDA、SOD)检测结果
图7-各组小鼠肝组织羟脯氨酸含量(Hyp)检测结果
图8-各组小鼠血清中kallistatin表达的经时关系
图9-各组小鼠肝组织中kallistatin含量
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不以此限制本发明。
《实施例1》rAAV8-kallistatin基因药物的制备
Kallistatin质粒表达框组成依次为：CMV/CAG鸡β-actin启动子、KallistatincDNA、WPRE增强子、polyA尾巴，基因表达框两端为AAV2ITR。采用磷酸钙无辅助病毒质粒法制备重组病毒：将Kallistatin表达质粒，腺病毒辅助质粒与rAAV8辅助质粒共转染293细胞，60-72小时后收获细胞，用去氧胆酸钠(0.5％)和benzonase(30u/ml)裂解，离心(3000g 30min)去细胞碎片，氯化铯密度梯度离心，即得重组病毒rAAV8-Kallistatin，并用色谱层析法纯化。
《实施例2》小鼠肝纤维化模型的构建
小鼠以1mL/100g体重腹腔注射四氯化碳CCl4，前三次为15％，中间十次为25％，后三次为30％，隔两天一次，共16次，46天造模完成，得到肝纤维化小鼠模型。
《实施例3》实验组别及处理
雄性KM小鼠12只，体重约25g，实验室饲养一周后，随即分为4组，每组3只，所有小白鼠均用足量的鼠粮和水饲养。正常组：小鼠正常饲养，不做任何处理；模型组：小鼠按肝纤维化模型构建方法建模，不给药；ssrAAV2-Kal治疗组；造模完成后通过尾静脉注射ssrAAV2-Kal，1*1012VG/只，一次性给药；ssrAAV8-Kal治疗组：造模完成后通过尾静脉注射ssrAAV8-Kal，1*1012VG/只，一次性给药。
《实施例4》小鼠血清样品的制备及保存
在第零天，ssrAAV2、8-kallistatin给药后的第一、三、五、七、十四、二十八、三十二、五十六天，小鼠断尾取血150μL左右，离心得血清，于-80℃保存。
《实施例5》ssrAAV2、8-kallistatin抗纤维化作用研究
治疗期结束后，分别通过肝脏外观、肝脏病理切片染色、肝功能指标(ALT、AST、TBIL)、纤维化血清指标(HA、LA、CⅢ、CⅣ)及肝组织指标(SOD、MDA、Hyp)几个方面，综合评价ssrAAV2、8-Kal两种基因药物对小鼠肝纤维化的疗效。
《实施例6》各实验组小鼠肝脏外观
正常组小鼠肝脏整体呈暗红色，表面光滑且有明显光泽，边缘锐利整齐，质地软而有弹性；造模刚完成的小鼠肝脏明显发黄，表面粗糙且布满颗粒，边缘钝化，质地较硬且没有弹性，个别小鼠肝脏于隔膜和周围器官粘连严重，整个肝脏趋向于肝硬化；一个月后的模型组小鼠肝脏仍发黄，表面有粗糙颗粒，边缘也比较钝，但不及刚造模完成时明显；ssrAAV2-Kal治疗组较模型组有所好转，肝脏恢复些许红润颜色且变得有光泽，表面稍有粗糙颗粒，边缘比较锐利，质地也比模型组软且有弹性；ssrAAV8-Kal治疗组小鼠肝脏已恢复正常暗红色，表面光滑有光泽，边缘锐利整齐，质地软且有弹性，已十分接近正常组(图1)。
《实施例7》各组小鼠肝脏HE染色
正常组小鼠肝组织肝小叶结构完整，细胞排列整齐，形态正常，分布规律；造模刚完成的小鼠肝组织几乎没有一个完整的肝小叶结构，细胞排列混乱，肝细胞肿胀，体积变大，细胞空泡和坏死，伴随有大片炎性细胞浸润，体现出严重损伤性病理改变；一个月后的模型组小鼠稍有恢复，但仍有部分炎性细胞浸润现象，肝小叶结构也比较混乱；ssrAAV2-Kal治疗组于模型组相比有明显好转，细胞排列相对整齐，纤维间隔显著减轻，但仍有少数炎症细胞聚集；ssrAAV8-Kal治疗组疗效显著，整体趋近于正常组，肝小叶结构基本恢复正常，细胞排列整齐，大小正常，纤维间隔基本消失，无炎性细胞，个别区域偶见汇管区纤维化，但与ssrAAV2-Kal治疗组相比明显好转(图2)。
《实施例8》各组小鼠肝脏苦味酸天狼猩红染色
正常组小鼠切片中只有中央静脉、肝门静脉和肝动脉边缘有少量胶原着色，这是肝组织中正常的胶原着色；模型组小鼠有大面积胶原着色，尤其是汇管之间及汇管和中央静脉之间形成明显的纤维间隔，肝小叶结构紊乱，形成假小叶，汇管区周围也有大量胶原沉积和纤维化；与模型组相比，ssrAAV2、8-Kal两个治疗组的纤维化状况有了明显改善，胶原沉积明显减少，纤维化程度减轻，汇管区纤维化及纤维间隔显著减轻，同时我们也可以观察出，与ssrAAV2-Kal组相比，ssrAAV8-Kal组的疗效更为显著，ssrAAV2-Kal组仍有较细纤维间隔存在，但ssrAAV8-Kal组几乎已恢复的与正常组相同(图3)。
《实施例9》各组小鼠肝功能指标(ALT、AST、TBIL)检测结果
各实验组小鼠血清ALT、AST和TBIL水平分析结果，与正常组相比，模型组小鼠ALT、AST和TBIL水平明显升高，均显著高于正常组，说明小鼠肝脏在造模过程中受到严重损伤；ssrAAV2-Kal治疗组与模型组相比ALT和TBIL水平显著下降(P<0.05)，但与正常水平还有一定差距，说明ssrAAV2-Kal确实能在一定程度促进肝功能恢复正常，但无法复原成正常水平；而ssrAAV8-Kal组(ALT：39±3.21，AST：116±3.21，TBIL：2.01±0.31)与模型组(ALT：73.67±5.46，AST：183±5.51，TBIL：3.23±0.21)相比，ALT、AST水平具有极显著下降(P<0.01)，TBIL水平也有显著性下降(P<0.05)，已基本恢复正常水平(图4)。
《实施例10》各组小鼠血清中HA、LN、C-Ⅲ、C-Ⅳ水平检测结果
模型组小鼠血清HA、LN、C-Ⅲ、C-Ⅳ含量均显著高于正常组，说明小鼠肝纤维化模型造模成功；ssrAAV2-Kal治疗组与模型组相比HA、LN、C-Ⅲ、C-Ⅳ水平有所下降，但除HA水平与模型组有显著性差异外(P<0.05)，其余三项指标与模型组差异并不明显(P>0.05)，与正常水平还有一定差距，说明ssrAAV2-Kal对肝纤维化确实有一定修复作用，但结果并不显著，无法恢复成正常水平；ssrAAV8-Kal治疗组(HA：246.30±3.62)与模型组(HA：324.67±10.17)相比，HA水平有极显著性下降(P<0.01)，LN、C-Ⅲ、C-Ⅳ水平也都有显著性下降(P<0.05)，与ssrAAV2-Kal相比，对这四项纤维化血清指标的影响更显著，治疗效果更接近正常水平，也就是说，在相同给药剂量的情况下，ssrAAV8-Kal比ssrAAV2-Kal对肝纤维化的疗效更好(图5)。
《实施例11》各组小鼠肝组织氧化指标(MDA、SOD)检测结果
与正常组相(SOD：31.21±1.03，MDA：329.88±9.09)比较，模型组(SOD：19.83±1.12，MDA：578.60±18.67)小鼠肝组织中SOD活力显著下降，MDA含量显著升高；与模型组相比：ssrAAV2-Kal治疗组(SOD：21.39±2.27，MDA：425.92.60±20.50)SOD活力有所升高，但无显著差异(P>0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05),ssrAAV8-Kal治疗组SOD(SOD：24.14±0.83，MDA：355.09±17.10)活力显著升高(P<0.05)，MDA含量降低极显著(P<0.01)，已十分接近正常组，说明与ssrAAV2-Kal相比，ssrAAV8-Kal清除氧自由基及抑制脂质过氧化的作用更明显和优越(图6)。
《实施例12》各组小鼠肝组织羟脯氨酸含量(Hyp)检测结果
与正常组相比，模型组肝组织中Hyp含量显著增高，提示肝纤维化模型的形成；与模型组比较，ssrAAV2、8-Kal两个治疗组中Hyp含量均有极显著下降(P<0.01)，但ssrAAV8-Kal治疗组下降更明显，更接近于正常组，说明ssrAAV8-Kal抑制胶原合成、促进胶原降解效果更(图7)。
《实施例13》各组小鼠血清中kallistatin表达的经时关系
模型组小鼠血清中kallistatin含量非常低，并且在整个监测过程中基本没有变化；ssrAAV2-Kal组在给药的第3天就达到约2.39×103pg/mL表达量，随后表达量逐渐升高，并在第14天达到5.77×103pg/mL左右，直至第32天都较稳定维持在此水平；ssrAAV8-Kal组在给药后第3天表达量约为1.55×107pg/mL，比ssrAAV2-Kal组高出约4个数量级，并在第28天达到表达峰值，约8×107pg/mL，到第32天为止都稳定维持在此水平(图8)。
《实施例14》各组小鼠肝组织中kallistatin含量
虽然模型组小鼠血清中kallistatin含量非常低(约25pg/mL)，但其肝组织中kallistatin含量却可达到(约5.8×103pg/mL)，远高于血清中的水平；同时可观察到，ssrAAV8-Kal组肝脏中kallistatin含量(8.0×104pg/mL)比ssrAAV2-Kal组(7.9×105pg/mL)高出约10倍，这也与两种基因药物对肝纤维化的疗效相对应，何种基因药物在肝脏中kallistatin的表达量更高，它对肝纤维化的疗效就更佳(图9)。
对小鼠病理切片、血清指标、肝组织指标等一系列结果的分析显示，ssrAAV2、8-Kal两种基因药物均可通过抗炎症、抗氧化、抗纤维生成等途径对肝纤维化产生积极的疗效，并且在相同给药剂量和给药方式的情况下，ssrAAV8-Kal对小鼠肝纤维化的治疗效果比ssrAAV2-Kal更好，基本可恢复正常水平。
对各组小鼠给药后血清中kallistatin表达经时关系及kallistatin组织分布情况的研究分析发现，ssrAAV8-Kal相比ssrAAV2-Kal，对肝纤维化疗效更显著的主要原因是，ssrAAV8-Kal在体内抗原清除率较低，从而得以高效表达，同时，其对肝脏较高的靶向性也是重要因素之一。此外，给药后ssrAAV8-Kal不但可在短时间内表达出治疗基因，并可在较长时间内维持稳定的高表达水平。
Claims (5)
1.一种抗肝纤维化rAAV8-KAL基因药物，其特征是，所述基因药物系由8型rAAV病毒载体介导抗纤维化Kallistatin基因的表达，基因表达框依次含有CMV/CAG鸡β-actin启动子、Kallistatin基因、WPRE增强子、polyA尾巴，基因表达框两端为AAV2ITR。
2.制备权利要求1所述基因药物的方法，其特征是，采用磷酸钙无辅助病毒质粒法制备重组病毒，将Kallistatin表达质粒、腺病毒辅助质粒与rAAV8辅助质粒共转染293细胞，60-72小时后收获细胞，用0.5％去氧胆酸钠和30u/ml benzonase裂解，离心3000g 30min，去细胞碎片，氯化铯密度梯度离心，即得重组病毒rAAV8-KAL，并用色谱层析法进行纯化。
3.权利要求1、2所述基因药物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
4.以权利要求1所述基因药物为有效成分与药学上可接受的载体组成的药物组合物。
5.权利要求4所述组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510219621.3A CN104826134A (zh) | 2015-05-01 | 2015-05-01 | 一种抗肝纤维化基因药物rAAV8-KAL |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510219621.3A CN104826134A (zh) | 2015-05-01 | 2015-05-01 | 一种抗肝纤维化基因药物rAAV8-KAL |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104826134A true CN104826134A (zh) | 2015-08-12 |
Family
ID=53804570
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510219621.3A Pending CN104826134A (zh) | 2015-05-01 | 2015-05-01 | 一种抗肝纤维化基因药物rAAV8-KAL |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104826134A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1966082A (zh) * | 2006-11-03 | 2007-05-23 | 许瑞安 | 一种防治结直肠癌的基因药物及其制备方法和用途 |
| CN102311974A (zh) * | 2010-07-05 | 2012-01-11 | 北京五加和分子医学研究所有限公司 | rAAV8-HBV1.3病毒用于建立HBV小鼠模型 |
| CN103990112A (zh) * | 2014-05-28 | 2014-08-20 | 许瑞安 | 重组Tat-Cygb融合蛋白的抗炎、创伤愈合及抗肝纤维化作用 |
-
2015
- 2015-05-01 CN CN201510219621.3A patent/CN104826134A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1966082A (zh) * | 2006-11-03 | 2007-05-23 | 许瑞安 | 一种防治结直肠癌的基因药物及其制备方法和用途 |
| CN102311974A (zh) * | 2010-07-05 | 2012-01-11 | 北京五加和分子医学研究所有限公司 | rAAV8-HBV1.3病毒用于建立HBV小鼠模型 |
| CN103990112A (zh) * | 2014-05-28 | 2014-08-20 | 许瑞安 | 重组Tat-Cygb融合蛋白的抗炎、创伤愈合及抗肝纤维化作用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 刘洪芳: "重组人Kallistatin蛋白的抗肝纤维化作用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mah et al. | Virus-based gene delivery systems | |
| CN110520536A (zh) | 用于穿过维管结构的基因转移的方法和组合物 | |
| US20230265452A1 (en) | Phagemid Vector | |
| CN104958324A (zh) | 一种溶瘤病毒制剂及其制备方法 | |
| RU2018143411A (ru) | Лечение комплемент-опосредуемых расстройств | |
| Pan et al. | The adeno-associated virus-mediated HSV-TK/GCV suicide system: a potential strategy for the treatment of bladder carcinoma | |
| CN103215308A (zh) | 表达重组人fviii的整合质粒、细胞株及其构建方法和应用 | |
| CN101319229B (zh) | 重组人bFGF和人PDGF-B的双基因腺病毒载体及其用途 | |
| CN1948475B (zh) | 可用于治疗艾滋病的重组表达载体、经改造的造血干细胞和方法 | |
| Sellner et al. | Generation of efficient human blood progenitor–targeted recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) by applying an AAV random peptide library on primary human hematopoietic progenitor cells | |
| Pan et al. | Suppression of bladder cancer growth in mice by adeno-associated virus vector-mediated endostatin expression | |
| CN104826134A (zh) | 一种抗肝纤维化基因药物rAAV8-KAL | |
| Gómez-Banoy et al. | Genetic manipulation with viral vectors to assess metabolism and adipose tissue function | |
| CN113265458B (zh) | 一种心肌缺血再灌注损伤标志物circRNA及其应用 | |
| EP2566491B1 (en) | Modified rodent parvovirus capable of propagating and spreading through human gliomas | |
| CN108606981B (zh) | 运用MSCs定向趋化特性运载EPO治疗肺纤维化 | |
| Karimipoor | Recent advances in hemophilia gene therapy | |
| CN101306198B (zh) | Nr2b重组腺病毒疫苗 | |
| Chan et al. | Gene delivery for the generation of bioartificial pacemaker | |
| Isaacs et al. | Prospects of gene and cell therapy for managing cardiac complications in Friedreich ataxia | |
| Smith et al. | 294. Characterizing AAV CaptureSelect Affinity Ligand Interactions | |
| Pillay et al. | 293. Discovery of an Essential Receptor for Adeno-Associated Virus Infection | |
| Deverman et al. | 252. Using Cre-Dependent In Vivo Selection to Identify AAV Variants That Enable Efficient and Widespread Gene Transfer to the Adult Central Nervous System | |
| Warischalk et al. | 251. Defining Conserved Structural Components of the AAV Capsid That Enable Tissue-Specific Transduction Following Systemic Administration | |
| Eichler et al. | 250. A Phase 2/3 Study of the Efficacy and Safety of Ex Vivo Gene Therapy with Lenti-DTM Lentiviral Vector for the Treatment of Cerebral Adrenoleukodystrophy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150812 |