CN101319229B - 重组人bFGF和人PDGF-B的双基因腺病毒载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因治疗领域，要解决的技术问题是提供一种能有效治疗心血管系统疾病的新的基因治疗产品。具体涉及包含重组人bFGF和人PDGF-B双基因的表达载体及制备方法和用途。该载体含有编码bFGF蛋白的基因与编码PDGF-B蛋白的基因，能在真核细胞中同时表达bFGF蛋白与PDGF-BB蛋白。优选的方案是将编码bFGF蛋白的基因与编码PDGF-B蛋白的基因分别处于不同的启动子的控制之下表达。实验表明，本发明重组载体在治疗冠心病中的心肌缺血的具有很好应用前景，为心血管系统疾病的治疗提供了一个新的选择。

Description

重组人bFGF和人PDGF-B的双基因腺病毒载体及其用途

技术领域

本发明属于基因治疗领域，具体涉及一种重组了人bFGF和人PDGF-B的腺病毒双价载体及其用途

背景技术

心血管系统疾病是现代社会严重威胁人类健康，引起死亡的主要疾病。冠心病是最常见的心血管疾病，有极高的死亡率和致残率。治疗冠心病最常用的方法是介入治疗冠状动脉搭桥手术及心肌内激光打孔方法，尽管这些方法对冠心病的治疗起到了积极作用，但均有其自身局限性。当前国外学者正尝试用血管新生疗法消除或减轻心肌缺血状态，血管新生是应用促血管生长因子刺激心肌缺血区小血管生长和侧枝循环形成即心肌缺血区的自我搭桥。由于该方法既可单独应用，又可与冠脉搭桥、心肌内激光打孔等方法联合使用，所以在冠心病治疗研究领域中受到了广泛重视。

促血管生长因子治疗冠心病是近十年来研究的热点之一，并已取得了较大进展，有些促血管生长因子，如VEGF、FGF-2、FGF-4等已用于II、III期临床。目前研究表明能够促进冠脉血管生长的因子诸多，优缺点各异，应用较多的是VEGF、FGF、Ang-1、TGF-β、HGF、HIF1等因子。随着临床各种治疗方法的进展和新型载体的出现，应用促血管生长因子治疗冠心病将显示更广阔的前景。

目前，临床应用促血管生长因子主要通过以下几种方式：重组蛋白、腺病毒载体和质粒载体。蛋白治疗和基因治疗各有其优缺点。蛋白治疗的优势在于药代动力学过程明确，给药剂量可控，不用病毒等免疫原性物质。但存在靶器官以外部位的血管新生，使潜在性癌变的危险增加；蛋白因子半衰期短，需反复给药，使用大量蛋白制剂，其价格昂贵，且有可能造成过敏等缺点。而基因治疗的优势在于治疗基因可进行持续表达，具有细胞特异性，有可能一次见效，还可能一次将多重因子导入，发挥协同作用。

当前本领域大多数的临床前研究和所有的临床研究都采用单一细胞因子治疗。但心血管的生成是一个复杂的过程，需要多种生长因子的协同作用才能形成有功能的成熟稳定的新血管网，因此这十几年来几乎所有大规模的随机、双盲、安慰剂对照的人体实验都不成功。事实上，临床上单一采用VEGF或bFGF治疗心肌缺血还存在一些争议，并且在动物和人体试验中采用单一因子进行治疗产生了一些严重的并发症，例如动物实验中，VEGF能导致病理性血管生成、动脉粥样硬化、视网膜出血，甚至产生血管瘤；过度表达的PDGF能导致心肌纤维化，进而导致心衰甚至死亡，因此需要改善现在的研究方案和治疗手段。国内外前期的临床前研究发现，bFGF在体内选择性促进血管生成而不刺激其他组织生长，而PDGF-BB(PDGF-B基因表达的蛋白形成的同源二聚体结构，称为PDGF-BB)则能通过募集周细胞和血管平滑肌细胞到新生血管，从而促进新生血管的成熟和稳定。

1993年，第一例应用腺病毒载体进行基因治疗的临床方案得到美国NIH的DNA咨询委员会(RAC)批准。自此，腺病毒载体成为继逆转录病毒载体之后被广泛应用的病毒基因转移系统。虽然腺病毒载体还未完全解决一过性表达的缺陷，但由于其转基因效率高等优点，在临床上已得到越来越多的应用。截至2008年3月为止，在全世界范围内开展的1347项基因治疗临床方案中，以腺病毒为载体的方案占了其中的25％(342项)，逐年呈现上升趋势，适应症包括肿瘤、心血管疾病、传染性疾病(包括艾滋病)等各个方面。心血管疾病的基因治疗方案达到121项(占9％)，绝大部分以裸DNA(62项)和腺病毒(46项)为载体系统。进展较快的方案包括：VEGF165裸DNA心肌内注射治疗严重心绞痛，已于2007年7月在加拿大完成了II/III期临床试验；Ad-FGF-4心肌内注射治疗严重心绞痛的方案也于2006年12月在美国进入III期临床试验。

现阶段，以腺病毒为载体的基因治疗方案基本是单基因治疗，即利用腺病毒为载体将单一治疗基因——包括标记基因或治疗基因导入体内，还未见同时将两个基因构建在一个载体上的基因治疗方案进入临床。而且，在临床前研究中，腺病毒双基因的导入主要是通过在两个基因间插入一个内在的核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)，共用同一个启动子实现两个基因同时表达的目的，第二个基因的表达效率受第一个基因表达的影响，表达量很难受控制。或者，同时用两种腺病毒携带两个不同的基因，但在体内研究中几乎不可能控制两种腺病毒的感染效率，两个基因的表达量也很难控制。目前也没有同时使用bFGF(basic Fibroblast Growth Factor，碱性成纤维细胞生长因子)和PDGF-BB(plateletderived growth factor，血小板衍生生长因子)双重因子进行基因治疗方案的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能有效治疗心血管系统疾病，尤其是心肌缺血，及其他相关缺血性疾病的新的基因治疗产品。

本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种双基因重组载体，该重组载体含有编码bFGF蛋白的基因与编码PDGF-B蛋白的基因，能在真核细胞中同时表达bFGF蛋白与PDGF-BB蛋白。

其中，上述的bFGF为人bFGF，PDGF-B为人PDGF-B。

其中，上述重组载体中编码bFGF蛋白的基因与编码PDGF-B蛋白的基因分别处于不同启动子的控制之下表达。

其中，上述人bFGF的编码基因具有Seq ID No.3所示的核苷酸序列，所述人PDGF-B的编码基因具有Seq ID No.4所示的核苷酸序列。

其中，上述编码bFGF蛋白的基因处于SV40启动子的控制之下表达。优选的，该编码bFGF蛋白的基因所在表达框的构成是：从5’到3’方向依次为SV40启动子、人IL-2信号肽的编码序列、编码bFGF蛋白的基因、SV40加尾信号。更优选的，上述编码bFGF蛋白的基因所在表达框的核苷酸序列为Seq ID No.1所示。该表达框共有1493个核苷酸，其中，第1到688为SV40启动子、第689到751为加入的IL-2信号肽序列、第752到1219为人bFGF基因序列、第1220到1493为SV40加尾信号。

其中，上述编码PDGF-B蛋白的基因处于CMV5启动子的控制之下表达。优选的，该编码PDGF-B蛋白的基因所在表达框的构成是：从5’到3’方向依次为CMV5启动子、编码人PDGF-B蛋白的基因、β-珠蛋白加尾信号。更优选的，上述编码PDGF-B蛋白的基因所在表达框的核苷酸序列为Seq ID No.2所示。该表达框共有1493个核苷酸，其中，第1到1057为CMV5启动子、第1058到1783为人PDGF-B基因序列、第1784到1905为β-珠蛋白加尾信号。由于使用了人PDGF-B蛋白编码基因本身的信号肽，故没有另外使用信号肽，当然本领域普通技术人员也可以根据情况对信号肽进行替换。

其中，上述重组载体中bFGF和PDGF-BB蛋白的表达比例为1∶4-1∶6。

其中，上述重组载体为质粒载体或腺病毒载体。进一步的，上述腺病毒载体为复制缺陷型腺病毒。更进一步的，上述重组载体具有Seq ID No.5所示的核苷酸序列。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供含有上述重组载体的宿主细胞。

本发明所要解决的第三个技术问题是提上述的重组载体在制备治疗冠心病、心肌缺血、肢端缺血或脑缺血的药物组合物中的用途。

本发明同时还提供了一种药物组合物。该药物组合物由上述重组载体为主要活性成分，添加药学上可以接受的辅料制备成。该药物组合物主要用于治疗冠心病、心肌缺血、肢端缺血或脑缺血的药物组合物中的用途。

根据本发明的第一个方面。本发明的重组载体是重组了人bFGF和人PDGF-B编码基因的双基因载体，本领域技术人员可以根据本发明中的记载，参考本领域的现有的基因操作指南和实验手册制备得到。本发明重组载体中人bFGF和人PDGF-B编码基因可以处于同一个启动子的调控下进行体内的表达，也可以处于两个单独的启动子的调控之下。最好能构建两个单独的表达框架，以对两个基因的相对表达量进行一定的控制。两个表达框架既可以同向，也可以反向。

本发明重组载体的载体骨架可以是质粒载体或病毒载体，优选使用在真核动物中转基因效率更高的腺病毒载体。另外，在重组双基因的腺病毒载体构建中，为了避免重组腺病毒在真核细胞中的扩增过程中发生同源重组，可以选择两个不同的启动子和不同的加尾信号构建两个单独的表达框架。两个启动子和加尾信号序列的同源性应尽可能量低一些，以有效地避免生产过程中的同源重组，有利于重组双基因腺病毒大量生产时的质量控制。

参考现有bFGF重组蛋白和PDGF-BB重组蛋白在肢端缺血模型中促新生血管的研究，为了实现重组双基因腺病毒表达bFGF和PDGF-BB蛋白之间比例的控制，本发明的优选方案中把PDGF-B基因构建于表达效率较高的由穿梭载体携带的CMV5启动子之后，bFGF基因则构建于SV40启动子之后。在体外感染实验中，不同细胞的bFGF和PDGF-BB的表达比例基本一致，介于1∶4至1∶6之间，实现了bFGF和PDGF-BB的表达比例的控制。

在本发明实施例中的体外促血管内皮细胞(HUVEC)生长研究中，单重组bFGF的腺病毒载体、单重组PDGF-BB的腺病毒载体和双基因腺病毒载体均能有效地促进HUVEC的生长，且存在剂量依赖关系；双基因腺病毒与两种单基因腺病毒相比，其效果差异均具有统计学意义。表明了bFGF和PDGF-BB的联合应用刺激HUVEC生长的效果明显高于单独应用bFGF和PDGF-BB，具有协同效果。

在本发明实施例中，在结扎大鼠冠状动脉左前降支后立即给予梗死区周围心肌内注射单重组bFGF的腺病毒载体、单重组PDGF-BB的腺病毒载体和双基因腺病毒载体进行治疗，结果表明三者均能改善大鼠的心功能，减少心肌梗死面积。心肌梗死发生后，存活心肌发生重构，增加了心肌对缺血的敏感性，其功能主要是通过促进新生血管的生成达到的。与对照组Ad-Null相比，各治疗组心肌组织的毛细血管密度和小动脉密度明显增加。本发明双基因腺病毒载体组在各个时间段的毛细血管密度和小动脉密度均高于单基因腺病毒载体组。双基因腺病毒载体组促血管生成作用在血管生成的各个阶段均优于单重组bFGF的腺病毒载体；而在后期，就小动脉的生成及稳定而言，双基因组也优于重组PDGF-BB的腺病毒载体。表明了bFGF和PDGF-BB的联合应用在动物模型体内也具有协同效果。

本发明重组载体是首次提出同一载体将能促进血管生成的两种不同的因子导入体内以治疗心肌缺血的基因治疗产品。现有技术均运用单一的促血管生成因子进行治疗，刺激血管生成的疗效不显著，而实验证明本发明重组载体中的双因子可起到协同作用，提高治疗效果。使用本发明重组载体还可克服体外表达蛋白的繁琐的纯化过程、复性效率低、不稳定、在存储及运输过程中容易失活等问题，降低了生产及使用成本；同时还可解决重组双基因腺病毒可解决在临床应用中使用剂量大，蛋白的半衰期短，需多次输注才能达到治疗效果等问题，在进入体内后，可在体内持续表达1周以上，维持有效的血药浓度，可减少用药次数，提高治疗效果。本发明重组载体在治疗冠心病中的心肌缺血的具有很好应用前景，为心血管系统疾病的治疗提供了一个新的选择。

附图说明

图1表示重组双基因腺病毒(Ad-FP)的构建过程。

图2为hbFGF的PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳结果，其中M：100bp DNA ladder；1：bFGF PCR产物。

图3为hPDGF-B的PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳结果，其中M：100bp DNA ladder：C：空白对照组；1：PDGF-B PCR产物。

图4为pAdv-F5和pAdv-F10的酶切鉴定结果(1％琼脂糖凝胶电泳)，其中M：1kb DNA ladder；1：pAdv-F5+BamH I；2：pAdv-F5+Nhe I+XbaI；3：pAdv-F5+Bgl II；4：pAdv-F10+BamH I；5：pAdv-F10+Nhe I+XbaI；6：pAdv-F10+Bgl II；7：pAdv-F10质粒。

图5为pAdv-FP的Sma I酶切鉴定结果(1％琼脂糖凝胶)，其中M：1kb DNA ladder；1：pAdv-F5；2：pAdv-F5-P13；3：pAdv-F5-P16；4：pAdv-F10；5：pAdv-F10-P。

图6为pAd-F5-P13和pAd-F10-P的酶切鉴定结果(1％琼脂糖凝胶)，其中M：1kb DNA ladder；1：pAd-F5-P13+Pac I；2：pAd-F10-P+Pac I。

图7为Ad-F5-P13及Ad-F10-P的PCR结果(1％琼脂糖凝胶)，其中M：100bp DNA ladder；1，2，3：PF1+PF2；4，5，6：PP3+PP4；7，8，9：PB5+PB6；10，11，12：PA7+PA8；1，4，7，10：阳性对照；2，5，8，11：Ad-F5-P13；3，6，9，12：Ad-F10-P。

图8为Ad-F5和Ad-F10的PCR结果(1％琼脂糖凝胶)，其中M：100bp DNA ladder；1，2，3：PF1+PF2；4，5，6：PB5+PB6；7，8，9：PA7+PA8；1，4，7：阳性对照；2，5，8：Ad-F5；3，6，9：Ad-F10。

图9为Ad-P11的PCR结果(1％琼脂糖凝胶电泳)，其中M：100bp DNA ladder；1，2：PP3+PP4；3，4：PB5+PB6；5，6：PA7+PA8；1，3，5：阳性对照；2，4，6：Ad-P11。

图10为5种重组腺病毒的结构示意图，其中：LITR表示腺病毒的左侧反向末端重复序列，RITR表示腺病毒的右侧反向末端重复序列，△E3表示腺病毒的E3区缺失。

图11为CsCl密度梯度超离心结果，其中A：不连续CsCl密度梯度离心；B：连续CsCl密度梯度离心。

图12为不同MOI值下各组重组腺病毒促HUVEC生长结果，其中：*：与Ad-Null相比，P＜0.01，差异有非常显著意义；△：与Ad-F10-P相比，P＜0.01，差异有非常显著意义；▲：与Ad-F10-P相比，P＜0.05，差异有显著意义。

图13为不同时间段各组心肌组织的毛细血管密度示意图，其中：*：与Ad-Null相比，P＜0.01，差异有非常显著意义；☆：与Ad-Null相比，P＜0.05，差异有显著意义；△：与Ad-F10-P相比，P＜0.01，差异有非常显著意义；▲：与Ad-F10-P相比，P＜0.05，差异有显著意义。图14为不同时间段各组心肌组织的小动脉密度示意图，其中：*：与Ad-Null相比，P＜0.01，差异有非常显著意义；☆：与Ad-Null相比，P＜0.05，差异有显著意义；△：与Ad-F10-P相比，P＜0.01，差异有非常显著意义；▲：与Ad-F10-P相比，P＜0.05，差异有显著意义。

以下结合附图通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容的思想所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例一 本发明重组bFGF和PDGF-B双基因腺病毒的构建及筛选

重组bFGF和PDGF-B双基因腺病毒的详细构建过程见图1，为了得到在腺病毒包含两个独立表达框架(包括不同启动子、多克隆位点、加尾信号)的表达载体，将bFGF基因先插入真核表达载体pSI(购自Promega公司)，再利用载体上的酶切位点将包含完整bFGF表达框架(SV40启动子-分泌型bFGF-SV40加尾信号)的序列切出，插入改造过的穿梭载体pAdenoVator-CMV5ΔB362(pAdenoVator-CMV5购自Qbiogen公司)，可分别得到同向或反向插入的bFGF穿梭质粒——pAdv-F10及pAdv-F5；将PDGF-B cDNA片段插入重组bFGF穿梭载体——pAdv-F10及pAdv-F5，筛选PDGF-B的插入方向，即可得到两种插入方向的重组质粒pAdv-F10-P及pAdv-F5-P13；进一步与包含整个腺病毒基因组(E1，E3缺失)的环状质粒pAdenoVatorΔE1E3重组得到pAd-F10-P及pAd-F5-P13；在293细胞中筛选得到重组双基因腺病毒Ad-F10-P及Ad-F5-P13。

重组双基因腺病毒的具体构建过程如下：

1.重组bFGF真核表达载体——pSI-bFGF的构建及鉴定

用PCR方法从含bFGF基因的质粒pBLAST45-hbFGF(购自Invivogene公司)上扩增出编码bFGF的核苷酸片段，PCR结果见图2。5’端引物(Seq ID No.6：5’AAC TAG CTA GC

ATGG CAG CCG GGA GCA TCA CCA C 3’)引入编码人IL-2的信号肽序列(以斜体字表示)及Nhe I切点，3’端引物(Seq ID No.7：5’GGA ATT CAG CTC TTA GCA GAC ATT GGA AG 3’)引入EcoR I切点。PCR产物经Nhe I/EcoR I双酶切后插入真核表达载体pSI。重组质粒pSI-bFGF经酶切和测序鉴定，证明结构及框架正确。

2.重组bFGF穿梭载体——pAdv-F的构建及鉴定

用Bgl II/Cla I双酶切切出的1.5kb片段包含完整bFGF表达框架(SV40启动子-分泌型bFGF-SV40加尾信号)，再插入改造过的穿梭载体pAdenoVator-CMV5ΔB362(缺失362位的Bgl II位点，只保留1776位的Bgl II位点)，可分别得到同向或反向插入的bFGF穿梭质粒-pAdv-F10及pAdv-F5两种克隆。筛选到的同向或反向克隆经不同的酶切鉴定(见图4)，证明结构正确。

3.重组双基因穿梭载体——pAdv-F10-P及pAdv-F5-P13的构建及鉴定

用PCR方法从含PDGF-B基因的质粒pBLAST49-hPDGF-B上扩增出编码PDGF-B的核苷酸片段，PCR结果见图3。5’端引物(Seq ID No.8：5’AGC TTT GTT TAA ACA TGA ATC GCT GCTGGG CGC TCT TC 3’)，3’端引物(Seq ID No.9：5’AGC TTT GTT TAA ACT AGG CTC CAAGGG TCT CCT TCA G 3’)均引入Pme I切点。PCR产物经Pme I酶切后插入重组bFGF穿梭载体-pAdv-F10及pAdv-F5，即可得到bFGF基因与PDGF-B基因同向或反向的两种重组双基因穿梭载体。筛选的克隆经酶切鉴定插入方向(结果见图5)，结果表明pAdv-F5-P13、pAdv-F5-P16及pAdv-F10-P中的PDGF-B为正向插入，经测序分析证明结构及框架正确。

4.重组质粒pAd-F10-P及pAd-F5-P13的构建及鉴定

pAdv-F10-P及pAdv-F5-P13用Fse I线性化后，与包含整个腺病毒基因组(E1，E3缺失)的环状质粒pAdenoVatorΔE1E3电转化BJ5183(购自Qbiogen)，在大肠杆菌中重组分别得到pAd-F10-P及pAd-F5-P13。重组克隆经Pac I鉴定(结果见图6)，筛选得到pAd-F10-P和Ad-F5-P13切出片段为4.5kb，其重组位点均位于复制子和右臂。

5.重组腺病毒Ad-F5-P13及Ad-F10-P的筛选及鉴定

使用常规共转染方法将Pac I线性化后的pAd-F5-P13及pAd-F10-P与脂质体Lipofectamine 2000(购自Invitrogen公司)共转染293细胞(购自ATCC)，筛选得到重组腺病毒Ad-F5-P13及Ad-F10-P。原代病毒种子液抽提病毒DNA后，通过PCR扩增插入bFGFDNA片段(PF1+PF2)和扩增插入PDGF-B DNA片段(PP3+PP4)鉴定是否为重组双基因腺病毒，同时扩增鉴定腺病毒特征的E2B区片段(PB5+PB6)以及是否存在E1A区(复制型腺病毒的存在)(PA7+PA8)。

其中，扩增bFGF DNA片段的引物为：

5’引物(PF1)：5’ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCT 3’(Seq ID No.10)

3’引物(PF2)：5’TCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAG 3’(Seq ID No.11)

扩增PDGF-B DNA片段的引物为：

5’引物(PP3)：5’ATGAATCGCTGCTGGGCGCTCTTC 3’(Seq ID No.12)

3’引物(PP4)：5’TAGGCTCCAAGGGTCTCCTTCAG 3’(Seq ID No.13)

扩增腺病毒特异的E2B区的引物为：

5’引物(PB5)：5’TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG 3’(Seq ID No.14)

3’引物(PB6)：5’CATCTGAACTCAAAGGGTGG 3’(Seq ID No.15)

扩增腺病毒复制区——E1A区的引物为：

5’引物(PA7)：5’ATTACCGAAGAAATGGCCGC 3’(Seq ID No.16)

3’引物(PA8)：5’CCCATTTAACACGCCATGCA 3’(Seq ID No.17)

经鉴定，重组腺病毒均插入人bFGF片段(540bp左右的条带)，人PDGF-B片段(720bp左右的条带)，腺病毒E2B区阳性条带(860bp左右的条带)，而无E1A区的阳性条带(无复制型腺病毒出现)(结果见图7)。

验证正确的Ad-F5-P13及Ad-F10-P通过有限稀释法筛选单克隆病毒，根据各单克隆的滴度、PCR扩增情况选择合适的单克隆分别逐级建立Ad-F5-P13及Ad-F10-P的原始种子库、主种子库和工作种子库。由工作种子库重组开展腺病毒的生产。

实施例二 重组bFGF腺病毒和重组PDGF-B腺病毒的构建及筛选

重组bFGF腺病毒的详细构建过程如下：在实施例一的重组bFGF穿梭载体——pAdv-F5及pAdv-F10的基础上进行，分别与包含整个腺病毒基因组(E1，E3缺失)的环状质粒pAdenoVatorΔE1E3电转化BJ5183重组得到pAd-F10及pAd-F5；使用常规共转染方法将PacI线性化后的pAd-F5及pAd-F10与脂质体Lipofectamine 2000共转染293细胞，筛选得到重组腺病毒Ad-F5及Ad-F10。原代病毒种子液抽提病毒DNA后，通过PCR扩增插入bFGF DNA片段(PF1+PF2)鉴定是否为重组腺病毒，同时扩增鉴定腺病毒特征的E2B区片段(PB5+PB6)以及是否存在E1A区(复制型腺病毒的存在)(PA7+PA8)。PCR结果见图8，表明得到的重组腺病毒Ad-F5和Ad-F10均插入人bFGF片段，腺病毒E2B区条带，而无E1A区条带(无复制型腺病毒出现)。

重组PDGF-B腺病毒的详细构建过程如下：将实施例一中得到的PDGF-B cDNA片段插入穿梭载体pAdenoVator-CMV5ΔB362，筛选得到正向插入的重组质粒pAdv-P11；进一步与包含整个腺病毒基因组(E1，E3缺失)的环状质粒pAdenoVatorΔE1E3电转化BJ5183重组得到pAd-P11；使用常规共转染方法将Pac I线性化后的pAd-F5及pAd-F10与脂质体Lipofectamine2000共转染293细胞，筛选得到重组腺病毒Ad-P11。原代病毒种子液抽提病毒DNA后，通过PCR扩增插入PDGF-B DNA片段(PP3+PP4)鉴定是否为重组腺病毒，同时扩增鉴定腺病毒特征的E2B区片段(PB5+PB6)以及是否存在E1A区(复制型腺病毒的存在)(PA7+PA8)。PCR结果见图9，表明得到的重组腺病毒Ad-P11插入人PDGF-B片段，腺病毒E2B区条带，而无E1A区条带(无复制型腺病毒出现)。

由此，我们得到了5种不同重组腺病毒：bFGF单基因腺病毒-Ad-F5及Ad-F10，PDGF-B单基因腺病毒Ad-P11和双基因腺病毒-Ad-F5-P13及Ad-F10-P，其结构示意图见图10。

实施例三 本发明重组腺病毒的大量扩增及纯化

将上述实例中构建的不同重组腺病毒分别经293细胞大量扩增后，采用两步CsCl密度梯度超离心纯化重组腺病毒-Ad-F、Ad-P和Ad-FP，第一步采用不连续CsCl梯度去除大部分的细胞碎片以及缺陷的病毒颗粒(即不具备感染活性的病毒颗粒)，第二步采用连续CsCl密度梯度彻底将具备感染活性的病毒颗粒与缺陷的病毒颗粒区分开，最后再通过透析脱盐，去除CsCl，并交换至需要的保存液。

病毒不连续CsCl密度梯度离心的结果见图11-A，对光可见病毒颗粒形成的两条白色区带，上面的条带较弱，较为弥散，为装配缺陷的不具备感染活性的病毒颗粒；下面的条带较强，较为致密，为具备感染活性的病毒颗粒。不连续CsCl密度梯度离心的结果见图11-B，对光可见病毒颗粒形成的一条致密的白色区带，条带很清晰，无其他杂质。

实施例四 本发明重组腺病毒体外表达

我们将Ad-F、Ad-P和Ad-FP感染不同类型的哺乳动物细胞，包括人肺癌细胞株A549、人宫颈癌细胞株HeLa、小鼠成纤维细胞株NIH-3T3、大鼠心肌细胞H9C2、人脐静脉内皮细胞HUVEC(均购自ATCC)，用ELISA方法检测腺病毒感染48小时后的细胞培液中bFGF和PDGF-BB的表达情况，结果见表1。

表1 腺病毒感染不同细胞株的ELISA检测结果

*：上清中bFGF的含量(ng/ml)

**：上清中PDGF-BB的含量(ng/ml)

结果表明，在5种不同的哺乳动物细胞株(包括2种人肿瘤细胞株、1种人正常内皮细胞株、1种小鼠胚胎成纤维细胞以及1种大鼠心肌细胞)中Ad-F5、Ad-F10均能有效地分泌表达bFGF蛋白，Ad-P11能分泌表达PDGF-BB蛋白，而Ad-F5-P13、Ad-F10-P能分泌表达bFGF和PDGF-BB两种蛋白。从表达量来看，插入bFGF片段方向相反的Ad-F5及Ad-F10，以及bFGF和PDGF-BB片段插入方向相对的Ad-F5-P13及Ad-F10-P在bFGF蛋白及PDGF-BB蛋白的表达量上没有差异，说明bFGF片段的插入方向并不影响bFGF蛋白的表达，也不影响PDGF-BB蛋白的表达。

不同哺乳动物细胞株中，重组双基因腺病毒Ad-F5-P13及Ad-F10-P两种蛋白的表达比例见表2。

表2 上清中bFGF蛋白和PDGF-BB蛋白的表达比例情况

*：bFGF蛋白量：PDGF-BB蛋白量

从结果可以看出，反向插入的Ad-F5-P13和同向插入的Ad-F10-P除了能同时表达bFGF和PDGF-BB之外，其bFGF和PDGF-BB的表达比例也基本一致，介于1∶4至1∶6之间。

由于bFGF基因插入方向的不同并不影响单基因bFGF的表达(Ad-F5和Ad-F10)，同时也不影响PDGF-B基因的表达(Ad-F5-P13和Ad-F10-P)，所以，我们选择Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P进行下一步的促血管生成功能的研究。

实施例五 本发明重组腺病毒体外促血管内皮细胞生长实验

取足量HUVEC细胞培养物，离心收集细胞，用基础培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液配成1.0×10⁵/ml的细胞悬液，置37℃备用。HUVEC细胞以2.0×10⁵细胞/2ml基础培养液/孔接种6孔板，分别按MOI＝10、50、100感染重组腺病毒Ad-Null、Ad-F10、Ad-P11及Ad-F10-P，37℃，5％ CO₂培养7天。同时，设立阳性和阴性对照，阳性对照的培养基为完全培养基，阴性对照的培养基为基础培养基。第7天，0.25％的胰蛋白酶-EDTA液消化6孔板中的HUVEC细胞，胎盘兰染色计数活细胞。以阴性对照的细胞数量为100％对照，计算处理后细胞的生存率。

实验结果见图12，表明重组腺病毒Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P直接感染HUVEC能促进其生长。

Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P促HUVEC细胞生长存在剂量依赖关系。与Ad-Null相比(MOI＝100)，Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P促HUVEC增殖率分别达到165％、64.7％和229.5％。在三种不同的MOI值感染下，Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P与Ad-Null相比，P＜0.01，差异均有高度统计学意义，说明重组腺病毒对HUVEC细胞增殖的影响并不是腺病毒感染造成的，而是表达的目的蛋白——bFGF和PDGF-BB刺激HUVEC细胞生长，且bFGF刺激HUVEC生长的效果高于PDGF-BB。

Ad-F10-P与Ad-P11相比(MOI＝10、50、100)，P＜0.01，差异均有高度统计学意义。而Ad-F10-P与Ad-F10相比，在高MOI值(100)时，P＞0.05，差异无统计学意义；在低MOI值(50、10)时，P＜0.05，差异有统计学意义。这提示，bFGF和PDGF-BB的联合应用刺激HUVEC生长的效果明显高于单独应用bFGF和PDGF-BB，可初步认为具有一定的协同效果。

实施例六 本发明重组腺病毒的体内功效实验

按常规冠状动脉结扎方式构建大鼠心肌缺血模型，具体如下：雄性SD大鼠(200～250g)称重后以10％水合氯醛(400mg/kg体重)腹腔注射麻醉；将其仰卧固定于操作台上，用18号静脉穿刺套管行气管插管，连接小物呼吸机进行机械辅助呼吸，呼∶吸比率为1∶1，频率90次/分；胸部碘伏消毒，备皮，在左前胸第四肋间水平剪开皮肤，钝性分离肋间肌，进入胸腔；用眼科开睑器撑开肋间切口，小心剪开心包，显露心脏，于左冠状动脉前降支(LAD)根部(以动脉圆锥和左心耳连线中点与心尖的连线为标志)下2mm处(如图33所示)用6-0丙烯线贯穿缝扎；成功的即时标志为：直视下可见结扎血管供应区域心肌变为苍白伴或不伴有局部室壁运动障碍。

心梗模型建立成功后，观察10分钟。腺病毒母液以生理盐水稀释至滴度为1×10¹⁰IU/ml，用微量注射器分别吸取100μl悬液，从梗死区一侧注入血区心外膜下心肌内，以形成的“皮丘”能覆盖住梗死区的边缘为佳。注射部位为心肌梗死与非梗死的交界区。移植成功后胀肺，待循环稳定后逐层关胸。逐渐减低呼吸频率，自主呼吸完全恢复且平稳时，拔除气管插管。术后分笼隔离，保暖防潮，保证充足饮食。

手术时大鼠随机分为四组：

分组

腺病毒

大鼠数量(只)

I	Ad-Null	20
			II	Ad-F10	20
III	Ad-P11	20
			IV	Ad-F10-P	20

手术后7天、28天、56天，每组取实验大鼠各5只，过量戊巴比妥钠(100mg/kg)腹腔注射处死，开胸取心脏，4％多聚甲醛4℃固定4小时，分别进行HE染色、Masson三色染色和免疫组化染色。

1.心功能检测

4周时各组实验大鼠通过彩色超声检测仪进行大鼠心功能检测，左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVI Ds)、左室短轴缩短率(FS)及射血分数(EF)的结果见表3。

表3 各组大鼠心功能检测结果

	LVIDd(cm)	LVIDs(cm)	FS(％)	EF
					Ad-Null	0.581±0.019	0.326±0.080	44.4±8.01	0.802±0.080
Ad-F10	0.580±0.064	0.255±0.041b*	55.92±5.14a*	0.900±0.031a*
					Ad-P11	0.548±0.063	0.229±0.050b	58.5±5.53aΔ	0.917±0.030a
Ad-F10-P	0.534±0.044	0.170±0.067a	68.8±9.79a	0.956±0.037a

a：与Ad-Null组相比，P＜0.01，差异有非常显著意义

b：与Ad-Null组相比，P＜0.05，差异有显著意义

*：与Ad-F10-P组相比，P＜0.01，差异有非常显著意义

Δ：与Ad-F10-P组相比，P＜0.05，差异有显著意义

数据表明，LVIDd的数值Ad-F10组、Ad-P11组和Ad-F10-P组与Ad-Null组相比，P＞0.05，差异无统计学意义；而LVIDs的数值Ad-F10组和Ad-P11组与Ad-Null组相比，P＜0.05，差异有统计学意义，Ad-F10-P组与Ad-Null组相比，P＜0.01，差异有高度统计学意义；FS和EF的数值Ad-F10组、Ad-P11组和Ad-F10-P组与Ad-Null组相比，P＜0.01，差异有高度统计学意义。这提示，Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P能显著改善心肌缺血模型大鼠的心功能。

同时，Ad-F10-P组与Ad-F10组相比较，LVIDd的数值差异无统计学意义，而LVIDs、FS和EF的数值的差异有高度统计学意义(P＜0.01)，提示Ad-F10-P组对心功能的改善比Ad-F10组更好。而Ad-F10-P组与Ad-P11组相比较，LVIDd、LVIDs和EF的数值之间的差异无统计学意义，而FS的数值的差异有统计学意义(P＜0.05)，提示与Ad-P11组相比，Ad-F10-P组对心功能的改善不明显。

2.梗死面积计算

心脏的连续切片通过Masson三色染色计算各组的梗死面积，结果见表4。

表4 不同时间各组大鼠梗死面积计算结果

a：与Ad-Null组相比，P＜0.01，差异有非常显著意义

b：与Ad-Null组相比，P＜0.05，差异有显著意义

*：与Ad-F10-P组相比，P＜0.01，差异有非常显著意义

Δ：与Ad-F10-P组相比，P＜0.05，差异有显著意义

结果显示，治疗组各组Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P的梗死面积在1周、4周和8周时与对照组Ad-Null相比，除了Ad-P11组1周时的P＜0.05，差异有统计学意义，其它组别和时间的P＜0.01，差异有高度统计学意义。这说明在各时间点，各治疗组Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P组的心肌梗死面积均有效地减少。同时，Ad-F10-P组与Ad-F10组相比较，1周时差异有高度统计学意义(P＜0.01)，4周时差异有统计学意义(P＜0.05)，8周时差异无统计学意义，提示与Ad-F10组相比，Ad-F10-P组对梗死面积的减少作用不明显。而Ad-F10-P组与Ad-P11组相比较，各时段差异均有高度统计学意义(P＜0.01)，提示Ad-F10-P组对梗死面积的减少比Ad-P11组更好。

3.血管密度计算

采用vwF免疫组化检测心肌内的毛细血管密度，α-actin免疫组化检测心肌组织内的小动脉密度。根据vwF免疫组化的计数结果，Ad-Null组在1周时的毛细血管密度为251.73±59.63个/mm²，4周时为256±86.25，8周时为311.47±73.62；Ad-F10组在1周时的毛细血管密度为574.72±114.59个/mm²，4周时为514.93±111.16，8周时为616.96±153.73；AdP11组在1周时的毛细血管密度为409.17±117.25个/mm²，4周时为420.94±54.75，8周时为501.76±123.46；Ad-F10-P组在1周时的毛细血管密度为707.84±124.12个/mm²，4周时为826.88±110.97，8周时为875.95±158.26。

图13显示不同时间段各组心肌组织毛细血管密度的差异，1周时，Ad-F10组和Ad-F10-P组与Ad-Null组相比，P＜0.01，差异有高度统计学意义，而Ad-P11组与Ad-Null组相比，P＜0.05，差异有统计学意义；4周和8周时，治疗组各组Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P与对照组Ad-Null相比P＜0.01，差异有高度统计学意义。这说明在各时间点，各治疗组Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P组的心肌组织的毛细血管密度均高于Ad-Null组，在大鼠心肌缺血模型中有明显的促血管生成作用。

同时，Ad-F10-P组与Ad-F10组相比较，1周时差异无统计学意义，4周时差异有高度统计学意义(P＜0.01)，8周时差异有统计学意义(P＜0.05)Ad-F10-P组与Ad-P11组相比较，1、4、8周时差异均有高度统计学意义(P＜0.01)。提示Ad-F10-P组的促血管生成作用强于Ad-F10和Ad-P11组，这也可能是Ad-F10-P组对心功能改善、梗死面积缩小更为有效的主要原因之一。

根据α-actin免疫组化的计数结果，Ad-Null组在1周时的小动脉密度为18.77±4.48个/mm2，4周时为19.2±4.79，8周时为21.76±4.79；Ad-F10组在1周时的小动脉密度为37.55±10.82个/mm²，4周时为41.81±10.07，8周时为36.27±6.36；Ad-P11组在1周时的小动脉密度为30.29±4.41个/mm²，4周时为32.85±4.97，8周时为29.87±5.29；Ad-F10-P组在1周时的小动脉密度为42.24±6.22个/mm²，4周时为46.51±4.97，8周时为46.93±7.54。

图14显示不同时间段各组心肌组织小动脉密度的差异，1、4、8周时，治疗组各组Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P与对照组Ad-Null相比P＜0.01，差异有高度统计学意义。这说明在各时间点，各治疗组Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P组的心肌组织的小动脉密度均高于Ad-Null组，在大鼠心肌缺血模型中有明显的促成熟血管生成的作用。

同时，Ad-F10-P组与Ad-F10组相比较，仅在8周时差异有统计学意义(P＜0.05)，提示Ad-F10-P组的促成熟血管生成作用在长期作用中比Ad-F10组表现得更为明显。而Ad-F10-P组与Ad-P11组相比较，在1、4、8周时差异均有高度统计学意义(P＜0.01)，提示Ad-F10-P组的促成熟血管生成作用强于Ad-P11组。

本发明重组载体在体外促血管内皮细胞生长的研究中，Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P均能有效地促进HUVEC的生长，且存在剂量依赖关系；Ad-F10-P与Ad-F10、Ad-P11相比，差异存在统计学意义。这提示，bFGF和PDGF-BB的联合应用刺激HUVEC生长的效果明显高于单独应用bFGF和PDGF-BB，存在协同效果。在结扎大鼠冠状动脉左前降支后立即给予梗死区周围心肌内注射重组腺病毒Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P进行体内治疗，结果表明Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P均能改善大鼠的心功能，减少心肌梗死面积。心肌梗死发生后，存活心肌发生重构，增加了心肌对缺血的敏感性。非梗死区心肌肥厚、局部毛细血管密度下降，导致血液供应不足，在运动等心肌耗氧量增加的情况下出现显著的心肌缺血。因此，恢复心肌组织的正常结构、重建其正常的血液供应，是预防或延缓心肌梗死患者左室功能不全的手段之一。Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P改善大鼠的心功能，减少心肌梗死面积，主要是通过促进新生血管的生成达到的。与对照组Ad-Null相比，各治疗组心肌组织的毛细血管密度和小动脉密度明显增加。为了研究Ad-F10、Ad-P11和Ad-F10-P在术后不同时间点的促血管生成作用，我们分别在血管生成早期(1周)、中期(4周)及后期(8周)分析各组实验大鼠的毛细血管和小动脉密度。结果表明，双基因组Ad-F10-P在各个时间段的毛细血管密度和小动脉密度均高于单基因组Ad-F10和Ad-P11。双基因组Ad-F10-P促血管生成作用在血管生成的各个阶段均优于Ad-P11；而在后期，就小动脉的生成及稳定而言，双基因组Ad-F10-P也优于Ad-F10。本发明双基因重组通过对bFGF和PDGF-B的联合表达能诱导产生有功能的稳定的血管网络。

由上述实例可知，本发明重组载体能有效地在体外促血管内皮细胞生长，并在体内能有效治疗心肌缺血，双因子的应用可起到协同作用，提高治疗效果，且更为安全、可靠、有效，优于现有的直接注射蛋白的方案和单基因治疗的方案，具有很好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学

<120>重组人bFGF和人PDGF-B的双基因腺病毒载体及其用途

<130>A080198K

<160>17

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>531

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>1

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60

gcaatggcag ccgggagcat caccacgctg cccgccttgc ccgaggatgg cggcagcggc 120

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atcaagctac aacttcaagc agaagagaga ggagttgtgt ctatcaaagg agtgtgtgct 300

aaccgttacc tggctatgaa ggaagatgga agattactgg cttctaaatg tgttacggat 360

gagtgtttct tttttgaacg attggaatct aataactaca atacttaccg gtcaaggaaa 420

tacaccagtt ggtatgtggc actgaaacga actgggcagt ataaacttgg atccaaaaca 480

ggacctgggc agaaagctat actttttctt ccaatgtctg ctaagagctg a          531

<210>2

<211>726

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

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tttgatgatc ttcagcgcct gctgcacaga gactccgtag atgaagatgg ggctgagctg    180

gacttgaaca tgacccgagc acactccgga gtcgagttgg aaagctcatc tcgagggagg    240

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<210>3

<211>1493

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<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>3

gatctgcgca gcaccatggc ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt    60

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<210>4

<211>1905

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

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tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt    300

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ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag    240

tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt    300

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ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa    420

cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga cgcaaatggg cggtaggcgt    480

gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cctcactctc    540

ttccgcatcg ctgtctgcga gggccagctg ttgggctcgc ggttgaggac aaactcttcg    600

cggtctttcc agtactcttg gatcggaaac ccgtcggcct ccgaacggta ctccgccacc    660

gagggacctg agcgagtccg catcgaccgg atcggaaaac ctctcgagaa aggcgtctaa    720

ccagtcacag tcgcaaggta ggctgagcac cgtggcgggc ggcagcgggt ggcggtcggg    780

gttgtttctg gcggaggtgc tgctgatgat gtaattaaag taggcggtct tgagacggcg    840

gatggtcgag gtgaggtgtg gcaggcttga gatccagctg ttggggtgag tactccctct    900

caaaagcggg cattacttct gcgctaagat tgtcagtttc caaaaacgag gaggatttga    960

tattcacctg gcccgatctg gccatacact tgagtgacaa tgacatccac tttgcctttc    1020

tctccacagg tgtccactcc caggtccaag tttaaacatg aatcgctgct gggcgctctt    1080

ccttcctctc tgctgctacc tgcgcctggt cagcgccgag ggggatccca ttcctgagga    1140

actgtatgaa atgctgagcg accactccat ccgctccttt gatgatcttc agcgcctgct    1200

gcacagagac tccgtagatg aagatggggc tgagctggac ttgaacatga cccgagcaca    1260

ctccggagtc gagttggaaa gctcatctcg agggaggagg agcctagggt ccctggcagc    1320

agcagagcct gctgtaatcg ccgagtgcaa gacgcgcaca gaggtgttcc agatctcgcg    1380

gaacctcatc gatcgcacca acgccaactt cctggtgtgg ccgccctgtg tggaggtgca    1440

gcgctgctcc ggctgctgca ataaccgcaa tgtgcaatgc cgggcctcgc aggtgcagat    1500

gcggccggtc caggtgagaa agattgagat tgtgcgaaag aagcccatct tcaagaaggc    1560

cacagtgacc ttggaggatc acctcgcctg caagtgtgag acaatagtga cccctcggcc    1620

tgtgactaga agtcctggga catccaggga gcagcgagcc aagacgcctc aagctcgggt    1680

gaccattcgg acggtgagaa tccgccggcc ccccaaaggc aagcaccgaa agtttaagca    1740

cacccatgac aaggcggccc tgaaggagac cctcggagcc taggtttaaa cggatccccc    1800

gacctcgacc tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt    1860

tttgtgtctc tcactcggaa ggacatatgg gagggcaaat catttggtcg agatccctcg    1920

gagatcgatc tgcgcagcac catggcctga aataacctct gaaagaggaa cttggttagg    1980

taccttctga ggcggaaaga accagctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc    2040

cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag    2100

gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta    2160

gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc    2220

cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc    2280

ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg    2340

caaaaagctt gattcttctg acacaacagt ctcgaactta agctgcagaa gttggtcgtg    2400

aggcactggg caggtaagta tcaaggttac aagacaggtt taaggagacc aatagaaact    2460

gggcttgtcg agacagagaa gactcttgcg tttctgatag gcacctattg gtcttactga    2520

catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag ttcaattaca gctcttaagg    2580

ctagagtact taatacgact cactataggc tagcatgtac aggatgcaac tcctgtcttg    2640

cattgcacta agtcttgcac ttgtcacaaa cagtgcaatg gcagccggga gcatcaccac    2700

gctgcccgcc ttgcccgagg atggcggcag cggcgccttc ccgcccggcc acttcaagga    2760

ccccaagcgg ctgtactgca aaaacggggg cttcttcctg cgcatccacc ccgacggccg    2820

agttgacggg gtccgggaga agagcgaccc tcacatcaag ctacaacttc aagcagaaga    2880

gagaggagtt gtgtctatca aaggagtgtg tgctaaccgt tacctggcta tgaaggaaga    2940

tggaagatta ctggcttcta aatgtgttac ggatgagtgt ttcttttttg aacgattgga    3000

atctaataac tacaatactt accggtcaag gaaatacacc agttggtatg tggcactgaa    3060

acgaactggg cagtataaac ttggatccaa aacaggacct gggcagaaag ctatactttt    3120

tcttccaatg tctgctaaga gctgaattca cgcgtggtac ctctagagtc gacccgggcg    3180

gccgcttcga gcagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat    3240

gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat    3300

tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca    3360

gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gtaaaatcg     3419

<210>6

<211>97

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>6

aactagctag catgtacagg atgcaactcc tgtcttgcat tgcactaagt cttgcacttg    60

tcacaaacag tgcaatggca gccgggagca tcaccac                             97

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>7

ggaattcagc tcttagcaga cattggaag               29

<210>8

<211>38

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>8

agctttgttt aaacatgaat cgctgctggg cgctcttc    38

<210>9

<211>37

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>9

agctttgttt aaactaggct ccaagggtct ccttcag     37

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>10

atgtacagga tgcaactcct gtct    24

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>11

tcagctctta gcagacattg gaag    24

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>12

atgaatcgct gctgggcgct cttc    24

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>13

taggctccaa gggtctcctt cag    23

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>14

tcgtttctca gcagctgttg        20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>15

catctgaact caaagggtgg        20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>16

attaccgaag aaatggccgc    20

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>17

cccatttaac acgccatgca    20

Claims (13)

1.重组载体，其特征在于装载有编码bFGF蛋白的基因与编码PDGF-B蛋白的基因，能在真核细胞中同时表达bFGF蛋白与PDGF-B蛋白；所述编码bFGF蛋白的基因处于SV40启动子的控制之下表达，所述编码PDGF-B蛋白的基因处于CMV5启动子的控制之下表达。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于所述bFGF为人bFGF，所述PDGF-B为人PDGF-B。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述人bFGF的编码基因的核苷酸序列为Seq ID No.1所示，所述人PDGF-B的编码基因的核苷酸序列为Seq ID No.2所示。

4.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于所述编码bFGF蛋白的基因所在表达框的构成是：从5’到3’方向依次为SV40启动子、人IL-2信号肽的编码序列、编码bFGF蛋白的基因、SV40加尾信号。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述编码bFGF蛋白的基因所在表达框的核苷酸序列为Seq ID No.3所示。

6.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于所述编码PDGF-B蛋白的基因所在表达框的构成是：从5’到3’方向依次为CMV5启动子、人PDGF-B蛋白信号肽的编码序列、编码PDGF-B蛋白的基因、β-珠蛋白加尾信号。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于所述编码PDGF-B蛋白的基因所在表达框的核苷酸序列为Seq ID No.4所示。

8.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于所述载体为质粒载体或腺病毒载体。

9.根据权利要求8所述的重组载体，其特征在于所述腺病毒载体为复制缺陷型腺病毒载体。

10.根据权利要求9所述的重组载体，其特征在于其核苷酸序列为Seq ID No.5所示。

11.含有权利要求1～10任一项所述的重组载体的宿主细胞。

12.权利要求1～10任一项所述的重组载体在制备治疗冠心病引发的心肌缺血、肢端缺血或脑缺血的药物中的用途。

13.由权利要求1～10任一项所述的重组载体为主要活性成分添加药学上可以接受的辅料制备成的药物组合物。

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