CN108384806A - hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，是一种hPDGF‑BB与hFGF2双基因重组病毒载体及其应用，该hPDGF‑BB与hFGF2双基因重组病毒载体的hPDGF‑BB基因的核苷酸序列为SeqID NO.1所示的序列、hFGF2基因的核苷酸序列为SeqID NO.2所示的序列。本发明提供了一种hPDGF‑BB与hFGF2双基因重组病毒载体，并且采用该hPDGF‑BB与hFGF2双基因重组病毒载体制备治疗老龄缺血性心脏疾病引发的心肌缺血损伤的基因药物可经静脉注射给药、同时具有高效、靶向、长期稳定表达的优点，为治疗包括心肌梗死、心力衰竭、心肌缺血再灌注损伤等缺血性心脏疾病提供了一种新的基因治疗药物，具有良好的应用前景。

Description

hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，是一种hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体及其应用。
背景技术
缺血性心脏病(ischaemic heart disease,IHD)是目前严重危害人类健康的心血管疾病，已成为21世纪全球最重要的公共卫生问题。据《柳叶刀》报道，IHD列全球死因谱的第1位，造成2010年全球703万人死亡，而中国因IHD死亡人数高达95万。目前我国约有心肌梗死250万人，年新发急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)超过50万人，2014年AMI的住院总费用为133.75亿元，心肌梗死已成为威胁国人健康的“隐形杀手”。老龄是AMI发病的高危因素，约60％至80％的AMI发生于年龄65岁以上的患者，并且随着年龄的增加，病死率急剧攀升，约60％的死亡发生于年龄75岁以上的AMI患者，因此，寻求新的干预措施，改善老年AMI患者的预后，提高生存率，是当今世界医学界亟待解决的重大问题。
研究表明AMI由于心肌组织缺氧，细胞内缺氧诱导因子(HIF1α)蛋白增多，进而上调血管内皮生长因子(VEGF)及其受体的表达，导致心肌缺血区毛细血管密度的增加，从而部分地减轻冠状动脉狭窄或阻塞的后果。尽管如此，这种内生性的促血管生成物质增多常常不足以尽快建立足够丰富的侧支动脉和毛细血管网来代偿原有的血供，缺血症状难以得到改善。
近年来，血管新生治疗法为AMI的治疗带来了新的契机，血管新生治疗法即将外延性血管新生因子或基因导入坏死心肌组织，实现心肌缺血区的自我搭桥，达到恢复缺血心肌的血液供应、修复或减少坏死心肌组织、改善患者症状和预后的目的，为AMI的治疗开辟了一条崭新的途径。
毋庸置疑，血管新生疗法是AMI治疗中最具前景的治疗策略。目前在生理和病理性血管新生治疗中，VEGF因其强大的促内皮细胞增殖和促血管生成作用而被广泛用于心肌及外周缺血性疾病的研究。动物实验研究证实VEGF治疗有利于侧支血管形成和增加缺血部位血供，但是单一促血管生长因子的临床研究尚未达到理想的预期目的，越来越多的证据显示VEGF诱导的新生血管常常是不成熟和缺乏功能的，而且持续过量表达VEGF可能诱导局部水肿和血管瘤形成，导致心功能恶化、加速缺血肢体的坏死和动脉粥样硬化的发生。因此，寻找更加安全有效的靶基因仍是研究的重点。
新生血管的起源、发展以及维护是一个复杂的、相互作用的过程，涉及血管新生、血管再生以及动脉生成，单一促血管生长因子的作用无法激活和完成血管新生和成熟的整个调控过程，这可能是临床试验失败的主要原因。在血管新生阶段起主要作用的因子称为促血管生成因子，如FGF2和VEGF。在动脉生成阶段发挥主要作用的血管生长因子称为促动脉生成因子，如血小板衍生生长因子(PDGF-BB)、肝细胞生长因子(HGF)等。FGF2由内皮细胞及平滑肌细胞分泌，在刺激血管新生和增加血管强度与韧性方面起重要作用，它能够调节靶细胞包括内皮细胞的生长和分化；而PDGF-BB被认为是作用很强的促动脉生成因子，可以诱导内皮细胞、血管平滑肌细胞的增殖与移行，通过刺激血管内皮细胞释放VEGF而间接促进微血管的生长；PDGF-BB可募集周细胞和血管平滑肌细胞包绕新生血管网络形成完整的血管结构，从而提高新生血管的成熟和稳定性，因此，PDGF-BB具有促血管新生及动脉新生的双重作用。
为提高心肌梗死区的血流灌注，必须重建长期稳定的功能性动脉网络，只有促血管生成因子和促动脉生成因子联合应用才能建立成熟、稳定的动脉血管网络，进而形成功能性和稳定的侧支循环，改善缺血心肌的灌注和功能。研究证实局部注射携带hFGF2和hPDGF-BB的双基因质粒能够有效的促进后肢缺血区域毛细血管和动脉血管的形成，改善腿部血液供应，并促进坏死肌肉组织的修复。研究表明不同的促血管生成因子和促动脉生成因子均有各自特定的“搭档”，hFGF2和hPDGF-BB是最佳的促血管新生组合因子，在血管新生的过程中互相影响并发挥协同作用，逐步激活和完成血管新生的整个过程。
目前对心肌梗死的治疗性促血管新生研究往往集中在心肌内注射生长因子或基因载体(质粒、病毒)，从临床治疗的角度考虑，静脉注射才是最佳治疗途径，心肌内注射需要开胸，其机械损伤容易引起心肌炎症反应。重组蛋白体内半衰期短，需要反复给药，单次大剂量注射可能导致血流动力学紊乱，而且价格昂贵。因此基因治疗才是最佳选择。通过基因治疗，在缺血局部表达血管生长因子，不仅可明显降低全身不良反应，而且编码蛋白释放持续时间长，能引起更加持久的血管再生反应。生长因子的有效运输是建立有效旁支供血通路的关键，但目前采用的质粒载体和病毒载体存在对心肌的靶向性不强、转染效率低、持续时间短、安全性差、难以实现心肌的定位治疗等缺点，大大限制了心脏疾病基因治疗的临床应用，因此，有必要寻找一种更加安全有效的靶向基因治疗方法。
高效靶向的将外源基因导入心肌组织是成功开展心脏疾病基因治疗的关键。9型腺相关病毒(AAV9)载体对心肌有极高的亲和力，可高效地将外源基因导入心肌组织，并能长期稳定表达外源基因，是目前心脏疾病基因治疗的理想载体。目前研究所使用的rAAV9载体通常是采用双质粒或者三质粒共转染贴壁培养HEK293细胞包装而成的，这种传统的AAV包装制备方法最大的缺点是无法制备获得大量的重组AAV病毒颗粒来满足大规模的临床前和临床实验研究需求，进而阻碍了基因治疗研究的进展，因此，廉价、高效、高产量的AAV载体包装方法显得尤为重要。
目前，以腺相关病毒为载体的血管新生疗法方案基本是单基因治疗，即利用腺相关病毒为载体将单一促进血管新生的治疗基因导入体内，尚未见同时将两个血管新生基因构建到同一腺相关病毒载体上的基因治疗方案进入临床，同时，目前也没有将血小板源性生长因子hPDGF-BB和碱性成纤维细胞生长因子hFGF2双基因同时构建到AAV9载体上用于心脏疾病基因治疗的报道。
发明内容
本发明提供了一种hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体及其应用，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决目前以腺相关病毒为载体的血管新生疗法方案基本是单基因治疗尚未见双基因疗法的问题。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体，hPDGF-BB基因的核苷酸序列为SeqID NO.1所示的序列，hFGF2基因的核苷酸序列为SeqID NO.2所示的序列。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述编码的hPDGF-BB蛋白的基因所在表达框的构成是：从5’到3’方向依次为启动子、编码PDGF-BB蛋白的基因、SV40加尾信号序列。
上述编码的hFGF2蛋白的基因所在表达框的构成是：从5’到3’方向依次为启动子、编码hFGF2蛋白的基因、SV40加尾信号序列。
上述重组病毒载体为1型腺相关病毒载体AAV1-hPDGF-hFGF2、6型腺相关病毒载体AAV6-hPDGF-hFGF2、8型腺相关病毒载体AAV8-hPDGF-hFGF2或9型腺相关病毒载体AAV9-hPDGF-hFGF2。
上述启动子为CMV启动子或cTnT心肌组织特异性启动子或α-MHC心肌组织特异性启动子或MLC-2v心肌组织特异性启动子或CBA非特异性启动子或CAG非特异性启动子。
上述使用两个CMV启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个cTnT心肌组织特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个α-MHC心肌组织特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个MLC-2v心肌组织特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个CBA非特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个CAG非特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种根据技术方案之一所述的hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体作为制备治疗老龄缺血性心脏疾病引发的心肌缺血损伤的基因药物方面的应用。
本发明提供了一种hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体，并且采用该hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体制备治疗老龄缺血性心脏疾病引发的心肌缺血损伤的基因药物可经静脉注射给药、同时具有高效、靶向、长期稳定表达的优点，为治疗包括心肌梗死、心力衰竭等缺血性心脏疾病提供了一种新的基因治疗药物，具有良好的应用前景。
附图说明
附图1-A、附图1-B、附图1-C、附图1-D分别为本发明中所构建的含GFP报告基因、hPDGF基因、hFGF2基因，以及hPDGF与hFGF2双基因的重组质粒图谱，图中ITR代表AAV2病毒基因组的反向末端重复序列；CMV为巨细胞病毒启动子；GFP为绿色荧光蛋白基因；hPDGF为人的血小板衍生生长因子hPDGF-BB，hFGF2为人碱性成纤维细胞生长因子；SV40PA为猴空泡病毒40加尾信号序列。
附图1-A为本发明中pFB-CMV-GFP质粒图谱。
附图1-B为本发明中pFB-CMV-hFGF2质粒图谱。
附图1-C为本发明中pFB-CMV-hPDGF质粒图谱。
附图1-D为本发明中hPDGF与hFGF2双基因的重组质粒图谱。
附图2为本发明中重组质粒pFB-CMV-hFGF2、pFB-CMV-hPDGF、pFB-CMV-hPDGF-CMV-hFGF2的酶切鉴定结果(1％琼脂糖凝胶电泳)，其中MW：λDNA/HindⅢMarker；1：pFB-CMV-hFGF2+EcoRI+KpnI；
2：pFB-CMV-hPDGF+EcoRI+SalI；3：pFB-CMV-hPDGF-CMV-hFGF2+SpeI+XhoI。
附图3为本发明中透射电镜检测重组腺相关病毒的形态及大小。见实施例2。
附图4为本发明中AAV9-CMV-eGFP对心肌亲和力检测，其中图4A是激光共聚焦显微镜下观察AAV9载体转导不同时间点GFP蛋白在心肌中的表达；图4B是Western blot检测AAV9载体转导不同时间点GFP蛋白在心肌组织中的表达。
附图5为本发明中AAV9-CMV-eGFP对心肌组织表达特异性检测，其中图5A是激光共聚焦显微镜下观察AAV9载体转导5周时GFP蛋白在心、肝、脾、肺、肾及脑组织中的表达。图5B是Western blot检测AAV9载体转导5周时GFP蛋白在心、肝、脾、肺、肾及脑组织中的表达。
附图6为本发明中Western blot检测AAV9-hPDGF-hFGF2转导5周hPDGF-BB和hFGF2蛋白在心肌中表达。
附图7为本发明中AAV9-hPDGF-hFGF2载体治疗对小鼠心梗28d内生存率的影响。
附图8为本发明中ImageJ软件检测心肌梗死面积。
附图9为本发明中Masson染色检测心肌间质的纤维化程度。
附图10为本发明中Masson染色检测心肌心室重塑程度。
附图11为本发明中α-SMA免疫组化检测各组心肌的小动脉血管密度。
附图12为本发明中Western blot检测心肌梗死区α-SMA及VEGF蛋白的表达。
附图13为本发明中超声心动图检测各组小鼠心功能。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的水如没有特殊说明，为纯净水；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃,hPDGF-BB与hFGF2分别为人的PDGF-BB基因和人的hFGF2基因。
实施例1，该hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体，其特征在于hPDGF-BB基因的核苷酸序列为SeqID NO.1所示的序列，所述hFGF2基因的核苷酸序列为SeqID NO.2所示的序列。本发明提供了一种能在心肌组织中同时高效靶向表达hPDGF-BB与hFGF2双基因的重组病毒载体，实现同一腺相关病毒载体携带两个不同的促血管新生基因在心肌组织内的同时表达；该hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体携带编码hPDGF-BB蛋白的基因与编码hFGF2蛋白的基因，能在心肌组织中同时高效靶向表达hPDGF-BB蛋白和hFGF2蛋白。
实施例2，作为实施例1的优化，编码的hPDGF-BB蛋白的基因所在表达框的构成是：从5’到3’方向依次为启动子、编码hPDGF-BB蛋白的基因、SV40加尾信号序列。
实施例3，作为上述实施例的优化，编码的hFGF2蛋白的基因所在表达框的构成是：从5’到3’方向依次为启动子、编码hFGF2蛋白的基因、SV40加尾信号序列。
实施例4，作为上述实施例的优化，重组病毒载体为1型腺相关病毒载体AAV1-hPDGF-hFGF2、6型腺相关病毒载体AAV6-hPDGF-hFGF2、8型腺相关病毒载体AAV8-hPDGF-hFGF2或9型腺相关病毒载体AAV9-hPDGF-hFGF2，优选9型腺相关病毒载体AAV9-hPDGF-hFGF2。采用对心肌具有高度亲和力的重组AAV9载体，将hPDGF-BB与hFGF2双基因高效靶向传递至老龄心肌组织，使用两个CMV启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，实现同一腺相关病毒载体携带两个不同的促血管新生基因在心肌组织内的同时表达；高效靶向的将外源基因导入心肌组织是成功开展心脏疾病基因治疗的关键，外壳是腺相关病毒识别并结合细胞的重要元件，直接决定了病毒对细胞的感染能力与感染效率，其中9型腺相关病毒载体AAV9-hPDGF-hFGF2对心肌有极高的亲和力，是目前心肌最有效的基因传递载体，可高效地将外源基因导入心肌组织，并能长期稳定表达外源基因，低剂量的一次静脉注射就可以完成基因转导的任务，所以本发明最终选用AAV9作为hPDGF-BB与hFGF2双基因的传递载体。
实施例5，作为上述的优化，启动子为CMV启动子或cTnT心肌组织特异性启动子或α-MHC心肌组织特异性启动子或MLC-2v心肌组织特异性启动子或CBA非特异性启动子或CAG非特异性启动子，优选CMV启动子。重组AAV载体对组织转导能力和亲嗜性除了与衣壳蛋白即血清型有关外，用来驱动外源基因表达的启动子的选择亦非常重要。心肌组织特异性的启动子如cTnT、α-MHC可以驱动外源基因在心肌内特异表达，但心肌特异性启动子的表达效率相对于广泛使用的非特异性启动子(CMV或CBA)来说非常低下。选用CMV启动子来驱动靶基因的表达，CMV启动子的重组AAV9载体对心肌有极高的靶向性和亲和力，5周在心肌中表达至高峰，84％的心肌组织被高效转染，并可长期稳定表达至8周；CMV启动子尽管能够介导外源基因在肝组织中表达，但是CMV启动子在肝脏中容易被沉默导致其转录活性被关闭，而脾、肺、肾、脑及骨骼肌中几乎未见明显的阳性表达，因此CMV启动子的重组AAV9载体对心肌具备高效转染、靶向、长期稳定表达的特性，是一种理想的心脏疾病基因治疗载体系统。
实施例6，作为上述实施例的优化，使用两个CMV启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个cTnT心肌组织特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个α-MHC心肌组织特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个MLC-2v心肌组织特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个CBA非特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个CAG非特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达。
实施例7，该使用上述实施例的hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体作为制备治疗老龄缺血性心脏疾病引发的心肌缺血损伤的基因药物方面的应用。本发明的使用hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体作为制备治疗老龄缺血性心脏疾病引发的心肌缺血损伤的基因药物,可促进心肌梗死区小动脉血管的新生，有效改善老龄缺血心肌的血供，从而减少心肌梗死面积，抑制心肌间质纤维化、减轻心室重塑程度并显著改善心功能；尤其是提供一种可由外周静脉给药、能够治疗老龄心肌梗死及其他相关缺血性心脏疾病的新的基因药物。
下面以重组AAV9载体为例阐述本发明重组病毒载体的构建方法及hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体作为制备治疗老龄缺血性心脏疾病引发的心肌缺血损伤的基因药物方面的应用。
该AAV9-hPDGF-FGF2重组病毒载体的构建方法及应用：
一、hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体骨架质粒pFB-hPDGF-hFGF2的构建及鉴定。
GFP报告基因、hPDGF基因、hFGF2基因，以及hPDGF与hFGF2双基因的重组质粒图谱详见附图1。图中ITR代表AAV2病毒基因组的反向末端重复序列；CMV为巨细胞病毒启动子；GFP为绿色荧光蛋白基因；hPDGF为人的血小板衍生生长因子hPDGF-BB，hFGF2为人碱性成纤维细胞生长因子；SV40PA为猴空泡病毒40加尾信号序列。图1中的A是pFB-CMV-GFP质粒图谱；图1中的B是pFB-CMV-hFGF2质粒图谱；图1中的C是pFB-CMV-hPDGF质粒图谱；图1中的D是pFB-CMV-hPDGF-CMV-hFGF2质粒图谱。
hPDGF-BB与hFGF2基因均购自美国Open Biosystems公司，合成如下表1中的3对引物。
首先以hFGF2基因为模板，以P1和P2引物行PCR扩增，经EcoRI和KpnI双酶切亚克隆至pFB-AAV-CMV-SV40pA穿梭载体，得到pFB-CMV-hFGF2；以hPDGF-BB基因为模板，用P3和P4引物行PCR扩增，经EcoRI和SalⅠ双酶切亚克隆至pFB-AAV-CMV-SV40pA穿梭载体，得到pFB-CMV-hPDGF；以P5和P6行PCR扩增，获得SV40pA片段，并用XhoI和SpeI双酶切。pFB-CMV-hPDGF质粒经MluI和XhoI双酶切，回收CMV-hPDGF片段，CMV-hPDGF及SV40pA片段连接后插入pFB-CMV-hFGF2质粒的MluI和SpeI位点，最终获得pFB-CMV-hPDGF-CMV-hFGF2(pFB-hPDGF-hFGF2)重组载体。所有的重组载体都经酶切鉴定结果见图2，结果表明成功构建pFB-CMV-hPDGF、pFB-CMV-hFGF2和pFB-hPDGF-hFGF2重组载体，经测序分析证明结构及框架正确。
二、重组杆状病毒的包装
将重组载体pFB-CMV-eGFP和pFB-hPDGF-hFGF2分别转化DH10BacTM感受态，涂布于含Kan+终浓度50μg/μl、Gen 7μg/μl、Tet 10μg/μl、X-gal 100μg/μl、IPTG 40μg/μl的平板，48小时左右挑取白色菌落重新划线，待长出白色菌落后接种于含相应抗生素的LB培养基中，用质粒纯化试剂盒提取重组Bacmid，得到两种重组Bacmid质粒Bacmid-CMV-eGFP和Bacmid-pFB-hPDGF-hFGF2。
Sf9细胞用ESF921无血清培养基置于28℃培养箱培养，当细胞生长至相互汇合时，将细胞直接吹起，离心重悬后计数，按3×106接种细胞培养瓶，贴壁后加入6μg的重组Bacmid和18μL的转染试剂，5h后移去转染试剂，加入5ml的ESF921无血清培养基，48小时荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况以判断转染效果；72小时左右观察到细胞有感染迹象时，用15ml的离心管收集孔板中含重组杆状病毒的培养液，1000g离心5分钟以去除细胞及较大的碎片，收集上清即得到P1代重组杆状病毒Bac-CMV-eGFP和Bac-hPDGF-hFGF2，用透射电镜观察杆状病毒的形态，并将P1带杆状病毒扩增1次，利用荧光定量PCR测定杆状病毒的滴度后用于9型腺相关病毒的包装。
目前研究所使用的重组AAV9载体通常是采用双质粒或者三质粒共转染贴壁培养HEK293细胞包装而成的，这种传统的AAV包装制备方法最大的缺点是无法制备获得大量的rAAV病毒颗粒来满足大规模的临床前和临床实验研究需求，进而阻碍了基因治疗研究的进展。本发明通过利用重组杆状病毒载体系统(Bac-to-Bac system)感染昆虫细胞的方法来包装制备rAAV9病毒颗粒，其rAAV9的生产能力是传统方法的10倍以上，具有廉价、高效、产量高的优势，且可放大到较大规模的悬浮培养生产方式，更适合用于人类疾病的基因治疗研究。
三、重组腺相关病毒AAV9-hPDGF-hFGF2的制备、纯化及滴度检测
重组腺相关病毒的制备：将4×106cells/ml的Sf9细胞接种于摇瓶中，按MOI值50vg/cell加入杆状病毒Bac-inRepOpt-hr2-inCap9和Bac-hPDGF-hFGF2或Bac-CMV-eGFP，28℃悬浮培养感染3d后，收集Sf9细胞，加入细胞裂解液体(50mM Tris-HCl，pH7.8，50mMNaCl，2mM MgCl2，1％DOC，0.5％CHAPS，140units/ml Benzonase)，经DNA酶37℃处理1小时后，8000rpm离心30min去除细胞碎片，收集上清液获得重组腺相关病毒AAV9-hPDGF-hFGF2和AAV9-CMV-eGFP初提物。
重组腺相关病毒纯化：经CsCl密度梯度28000rpm超速离心20h，收集病毒条带后再经CsCl密度梯度65000rpm超速离心24h，抽取病毒条带并经透析柱透析去除CsCl和去污剂，然后将病毒保存于PBS中。
重组腺相关病毒的滴度检测：将样品和标准品同时进行Real-time PCR反应，绘制标准曲线后，计算出样品的病毒数量，病毒数量以gc(genome copies)表示。离心收集感染的细胞，经超声破碎，饱和硫酸铵沉淀，氯化铯超速梯度离心，于离心管中央可见一条微细的病毒带。提取病毒DNA，经Real-Time PCR测定。AAV9-CMV-eGFP和AAV9-hPDGF-hFGF2滴度分别为在3.75×1013及2.77×1013vg/ml左右，证实病毒包装成功。
透射电镜鉴定制备的重组腺相关病毒：取纯化后的病毒悬液10μL于载网上，经磷钨酸负染色，置透射电子显微镜下观察重组腺相关病毒的形态及大小。
结果如附图3所示，图中显示，经磷钨酸负染色，透射电镜下重组腺9型相关病毒呈典型二十面体结构，病毒颗粒直径约为20nm，具有典型的腺相关病毒形态，附图3的左图为AAV9-CMV-eGFP，右图为AAV9-hPDGF-hFGF2。
四、重组9型腺相关病毒体内转导特性研究
采用尾静脉注射法，将0.1ml含有1×1011vg的腺相关病毒AAV9-CMV-eGFP在2至4秒内经小鼠尾静脉注射至C57小鼠体内。分别于病毒注射1周、2周、3周、4周、5周、8周处死小鼠，每个时间点5只小鼠。通过体内转导实验，系统研究CMV启动子重组AAV9载体的组织表达特异性及其用于心脏疾病基因靶向治疗的可行性。
检测指标：
1.注射不同时间点后，取小鼠心肌，制作冰冻切片，激光共聚焦显微镜观察心肌组织内eGFP表达情况；
2.Western blot定量检测不同时间点eGFP蛋白在心肌内表达；
3.AAV9-CMV-eGFP转导5周时分别取出小鼠的肝、脾、肺、肾、脑、骨骼肌不同器官组织，行冰冻切片，荧光显微镜下观察不同组织中eGFP表达情况，并用Western blot定量检测，以评价载体转导的靶向性。
结果如图4、图5所示，由图4A可以看出，激光共聚焦显微镜下观察发现CMV启动子介导的GFP荧光在心肌中的表达随着时间延长而逐渐增强，在病毒转染后1周，可见少量心肌组织表达eGFP，病毒转染2周表达eGFP阳性的细胞快速增多，随着时间延长eGFP 阳性的细胞逐渐增加，转染后第5周到达高峰，转染效率约84％，持续至第8周时仍有高达75％左右的转染效率。Western blot检测eGFP蛋白表达结果与荧光显微镜观察结果一致(图4B)，在病毒转导1周，心肌组织中可见少量eGFP蛋白开始表达，随着时间的延长eGFP表达水平逐渐增加，转导染5周到达高峰，持续至第8周时仍有高水平表达。
由图5可以看出，病毒转染5周心肌表达至高峰时，除肝组织有一定eGFP阳性表达，脾、肺、肾、脑组织中未见明显的阳性表达，表明CMV启动子的重组AAV9载体对心肌有极强的靶向亲和力；以上结果表明CMV启动子的重组AAV9载体对心肌有极强的靶向性，并可介导外源基因在心肌中长期稳定表达，是缺血性心脏病基因靶向性治疗的有效手段，可作为一种理想的心脏疾病基因治疗载体。
主要体现在：
1、AAV9-CMV-eGFP经尾静脉转导至小鼠体内，冰冻切片和Western检测表明eGFP蛋白在心肌表达随时间逐渐增强，5周达到高峰，8周时还维持较高水平的表达。
2、5周时取小鼠的肝、脾、肺、肾、脑检测表明，心脏表达至高峰时除肝脏外，而脾、肺、肾、脑中几乎没有表达，表明AAV9-CMV-eGFP载体对心肌有极强的靶向亲和力。
五、重组病毒载体AAV9-hPDGF-hFGF2转导5周PDGF-BB及hFGF2蛋白在心肌中的表达
选择15-18个月雄性C57小鼠，体重28-30g，将AAV9-CMV-eGFP、AAV9-hPDGF-hFGF2以1x1011vg/只经尾静脉注射到老龄小鼠体内，5周时处死小鼠。
检测指标：
1.Western blot定量检测hPDGF-BB蛋白的表达水平；
2.Western blot定量检测hFGF2蛋白的表达水平。
结果如图6所示，从图中可以看出，与空病毒AAV9-CMV-eGFP组相比，AAV9-hPDGF-hFGF2转导5周目的基因hPDGF-BB和hFGF2在心肌中获得高效表达，提示AAV9-hPDGF-hFGF2病毒载体可有效同时介导hPDGF-BB和hFGF2双基因在心肌组织中表达。
六、AAV9-hPDGF-hFGF2在体转导促进梗死心肌修复
选择15个月至18个月的雄性C57小鼠，建立老龄小鼠急性心肌梗死模型，建模成功后通过尾静脉将AAV9-CMV-eGFP、AAV9-hPDGF-hFGF2以1x1011vg/只注射到老龄小鼠体内，设立假手术组(N＝50)、AAV9-CMV-eGFP(N＝50)及AAV9-hPDGF-hFGF2(N＝50)转导组，研究PDGF-BB与hFGF2双基因靶向转导恢复血运重建治疗老龄急性心肌梗死的可行性及有效性，为基因靶向干预治疗老龄急性心肌梗死的临床应用提供新的思路和依据。
老龄小鼠急性心肌梗死模型的建立：
麻醉药品：小鼠采用氯胺酮(Ketamine,8mg/100g)、甲苯噻嗪(Xylazine,2mg/100g)和阿托品(Atropine,0.06mg/100g)混合液腹腔注射麻醉，注射量为0.1ml/10g至0.2ml/10g体重。
气管插管和机械通气：待麻醉生效后，采用自制小鼠插管(20G静脉套管针外鞘及自制导丝、长度：30mm)，经口施无创气管插管术。插管气管插管时如小鼠呼吸节律发生变化则提示插管成功；接呼吸机控制呼吸(频率90次/分至100次/分，潮气量0.4ml至0.5ml)，同时于小鼠结膜及角膜点滴生理盐水，防止失明。
建模前，先给小鼠进行尾静脉注射1000U/kg肝素抗凝。
经推子剃毛，备皮，消毒，固定，接呼吸机控制小鼠呼吸；双目显微镜下，经胸骨左侧第3、4肋间开胸，应用撑开器打开胸腔，暴露心脏，以7-0尼龙线穿过左心耳下缘1.5至2.5mm处结扎左冠状动脉，结扎后观察到支配区域心肌颜色变白，局部心肌运动减弱及左心耳涨满，同时心电图两个以上肢体导联或胸导联上出现S-T段上抬，提示结扎冠脉成功，建立老龄小鼠急性心肌梗死模型；取下撑开器，正压膨肺，6-0缝合线沿第三肋上缘和第四肋下缘行八字缝合，逐层关胸、缝皮。待小鼠苏醒后，行rAAV9病毒载体尾静脉转导，建模60d后行以下检测：
1.统计分析各组小鼠术后生存率。
2.ImageJ分析软件测定心肌梗死面积，每组10只。
3.Masson染色测定心肌间质纤维化及心室重塑程度。每组5只。
4.α-SMA免疫组化检测各组心肌的小动脉血管密度。每组5只。
5.Western blot检测心肌梗死区α-SMA及VEGF蛋白的表达。每组5只。
6.超声心动图检测各组小鼠心功能。每组15只。
小鼠术后生存率：其生存曲线如图7所示，假手术组仅开胸不结扎冠状动脉，术后无死亡；术后28d，AAV9-CMV-eGFP转导组小鼠总死亡率为42.5％，其中30％小鼠死于缺血性心脏破裂，12.5％小鼠死于慢性心力衰竭；而AAV9-hPDGF-hFGF2治疗组总死亡率为20％，其中15％小鼠死于缺血性心脏破裂，5％小鼠死于慢性心力衰竭，表明hPDGF-BB与hFGF2双基因转导可有效改善老龄小鼠心肌梗死后的生存率，降低缺血性心脏破裂及心力衰竭的死亡率。
心肌梗死面积测定：小鼠心梗60d后，取下心脏，在手术显微镜下游离右心室，将左心室完全展开，数字成像。结果如附图8所示，图中灰色(实际红色)区域表示存活心肌，而苍白(实际白色)区域为梗死心肌，ImageJ分析软件分别测定苍白区域和整个左心室面积，心梗面积以梗死区面积(图中灰色区)/整个左心室面积(图中的灰色区+苍白区)的百分比表示。与空病毒组相比，AAV9-hPDGF-hFGF2基因转导可显著降低老龄心肌梗死面积，AAV9-CMV-eGFP转导的老龄小鼠急性心肌梗死28d后心梗面积为38.5±1.5％，而AAV9-hPDGF-hFGF2转导组心梗面积为29.9±1.0％，hPDGF-BB和hFGF2双基因转导可使老龄心肌梗死面积显著降低22.3％(P<0.01)，有效促进老龄梗死心肌的愈合修复。
心肌间质纤维化程度测定：以4％多聚甲醛固定左心室，梯度酒精脱水、二甲苯透明后石蜡包埋，切片5μM，利用Masson染色法测定心肌间质纤维化程度，结果如图9所示，高倍镜下在非梗死区随机选取10视野,心肌间质纤维化程度以心肌胶原面积/所测视野面积的百分比表示。与空病毒组相比，AAV9-hPDGF-hFGF2基因转导可显著抑制老龄心肌非梗死区间质纤维化程度，空病毒组老龄小鼠心肌纤维化程度为18.3±0.9％，AAV9-hPDGF-hFGF2转导组则降为6.8±0.6％，hPDGF-BB与hFGF2双基因转导可使心肌纤维化程度显著降低62.8％(P<0.01)，有效抑制老龄梗死心肌的纤维化进程。
心室重塑程度测定：采用Masson染色测定心内膜的周长及室壁厚度，检测心梗后左心室的重塑程度。结果如图10所示，与空病毒组相比，AAV9-hPDGF-hFGF2治疗组心内膜的周长显著低于空病毒组(P＜0.01)、室壁厚度比率显著高于空病毒组(P＜0.01)。空病毒组老龄小鼠心内膜周长为15.9±1.1mm，而AAV9-hFGF2-hPDGF转导组则降为11.2±0.4mm；AAV9-CMV-eGFP转导的室壁厚度比0.07±0.004，而AAV9-hPDGF-hFGF2转导组则为0.24±0.001；表明AAV9-hPDGF-hFGF2基因转导可显著抑制左心室的扩张重塑程度。
小动脉血管密度检测：采用α-SMA抗体免疫组化检测各组心肌梗死交界区的小动脉血管密度，以评价hPDGF-BB与hFGF2双基因转导促进血管新生的作用。结果如图11所示，与空病毒组相比，AAV9-hPDGF-hFGF2治疗组小动脉血管密度显著高于空病毒组(P＜0.01)。AAV9-CMV-eGFP转导组其血管数为8.1±0.6个，而AAV9-hPDGF-hFGF2转导组则为14.8±0.9个，提示AAV9-hPDGF-hFGF2基因转导可显著促进心梗交界区小动脉血管新生，有效治疗心肌缺血，进而改善老龄缺血心肌的灌注和功能，具有良好的应用前景。
Western blot检测心肌梗死区α-SMA及VEGF蛋白的表达：提取心肌梗死区总蛋白，Western Blot检测血管平滑肌肌动蛋白(a-SMA)及血管内皮细胞生长因子VEGF的表达，研究结果如图12所示，hFGF2和hPDGF双基因转导可显著上调梗死区a-SMA及VEGF蛋白表达，提示AAV9-hPDGF-hFGF2基因转导通过上调a-SMA及VEGF的表达而血管新生。
心功能评估：采用超声心动图检测各组心梗4周的心脏功能，如图13所示，空病毒组符合典型的心肌梗死后心脏超声改变，心梗后60左心室收缩末期直径(LVESD)及舒张末期直径(LVEDD)显著增大，同时左室短轴缩短率(FS％)显著下降，AAV9-hPDGF-hFGF2转染组与AAV9-eGFP组相比心脏功能恶化程度明显减缓，表明hPDGF-BB及hFGF2双基因表达可有效改善心梗后心脏功能。
综上所述，
hPDGF-BB和hFGF2双基因共转导至老龄梗死心肌后可以有效改善小鼠的生存率，降低缺血性心脏破裂和慢性心力衰竭的发生率，促进梗死心肌的愈合修复，有效减少老龄心肌梗死面积，抑制心肌组织间质纤维化、减轻心肌慢性心室重塑并改善心功能，通过上调VEGF等血管生长因子促进梗死区心肌小动脉血管新生，改善老龄缺血心肌的灌注和功能。该基因药物可经静脉注射给药、同时具有高效、靶向、长期稳定表达的优点，为治疗包括心肌梗死、心力衰竭等缺血性心脏疾病提供了一种新的基因治疗药物，具有良好的应用前景。
在本发明实施例中，在建立老龄小鼠急性心肌梗死模型后，给予尾静脉分别注射AAV9-CMV-eGFP和AAV9-hPDGF-hFGF2病毒载体进行治疗，心肌梗死60d后，与空病毒组相比hPDGF-BB和hFGF2双基因转导可显著改善老龄小鼠生存率，有效减少老龄心肌梗死面积，抑制心肌组织间质纤维化、减轻心肌慢性心室重塑并改善心功能，其主要是通过促进心肌缺血区小动脉血管新生而发挥作用，hPDGF-BB和hFGF2通过上调血管壁平滑肌标志物α-SMA及血管内皮生长因子VEGF的表达而促进心肌缺血区的血管新生，由上述可知，采用hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体制备治疗老龄缺血性心脏疾病引发的心肌缺血损伤的基因药物可经静脉注射给药、同时具有高效、靶向、长期稳定表达的优点，为治疗包括心肌梗死、心力衰竭等缺血性心脏疾病提供了一种新的基因治疗药物，具有良好的应用前景。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
表1
hPDGF-BB基因的核苷酸序列为SeqID NO.1所示的序列表
<110> 新疆医科大学第一附属医院
<120> hPDGF-BB基因核苷酸编码序列
<210> 1
<211> 726
<212> DNA
<213> Human
<400> PreSequenceString :
atgaatcgct gctgggcgct cttcctgtct ctctgctgct acctgcgtct ggtcagcgcc 60
gagggggacc ccattcccga ggagctttat gagatgctga gtgaccactc gatccgctcc 120
tttgatgatc tccaacgcct gctgcacgga gaccccggag aggaagatgg ggccgagttg 180
gacctgaaca tgacccgctc ccactctgga ggcgagctgg agagcttggc tcgtggaaga 240
aggagcctgg gttccctgac cattgctgag ccggccatga tcgccgagtg caagacgcgc 300
accgaggtgt tcgagatctc ccggcgcctc atagaccgca ccaacgccaa cttcctggtg 360
tggccgccct gtgtggaggt gcagcgctgc tccggctgct gcaacaaccg caacgtgcag 420
tgccgcccca cccaggtgca gctgcgacct gtccaggtga gaaagatcga gattgtgcgg 480
aagaagccaa tctttaagaa ggccacggtg acgctggaag accacctggc atgcaagtgt 540
gagacagtgg cagctgcacg gcctgtgacc cgaagcccgg ggggttccca ggagcagcga 600
gccaaaacgc cccaaactcg ggtgaccatt cggacggtgc gagtccgccg gccccccaag 660
ggcaagcacc ggaaattcaa gcacacgcat gacaagacgg cactgaagga gacccttgga 720
gcctag 726
hFGF2基因的核苷酸序列为SeqID NO.2所示的序列表
<110> 新疆医科大学第一附属医院
<120> hFGF2基因核苷酸编码序列
<210> 2
<211> 867
<212> DNA
<213> Human
<400> PreSequenceString :
atggtgggtg tggggggtgg agatgtagaa gatgtgacgc cgcggcccgg cgggtgccag 60
attagcggac gcggtgcccg cggttgcaac gggatcccgg gcgctgcagc ttgggaggcg 120
gctctcccca ggcggcgtcc gcggagacac ccatccgtga accccaggtc ccgggccgcc 180
ggctcgccgc gcaccagggg ccggcggaca gaagagcggc cgagcggctc gaggctgggg 240
gaccgcgggc gcggccgcgc gctgccgggc gggaggctgg ggggccgggg ccggggccgt 300
gccccggagc gggtcggagg ccggggccgg ggccggggga cggcggctcc ccgcgcggct 360
ccagcggctc ggggatcccg gccgggcccc gcagggacca tggcagccgg gagcatcacc 420
acgctgcccg ccttgcccga ggatggcggc agcggcgcct tcccgcccgg ccacttcaag 480
gaccccaagc ggctgtactg caaaaacggg ggcttcttcc tgcgcatcca ccccgacggc 540
cgagttgacg gggtccggga gaagagcgac cctcacatca agctacaact tcaagcagaa 600
gagagaggag ttgtgtctat caaaggagtg tgtgctaacc gttacctggc tatgaaggaa 660
gatggaagat tactggcttc taaatgtgtt acggatgagt gtttcttttt tgaacgattg 720
gaatctaata actacaatac ttaccggtca aggaaataca ccagttggta tgtggcactg 780
aaacgaactg ggcagtataa acttggatcc aaaacaggac ctgggcagaa agctatactt 840
tttcttccaa tgtctgctaa gagctga 867

Claims (10)

1.一种hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体，其特征在于hPDGF-BB基因的核苷酸序列为SeqID NO.1所示的序列，hFGF2基因的核苷酸序列为SeqID NO.2所示的序列。
2.根据权利要求1所述的hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体，其特征在于编码的hPDGF-BB蛋白的基因所在表达框的构成是：从5’到3’方向依次为启动子、编码hPDGF-BB蛋白的基因、SV40加尾信号序列。
3.根据权利要求1或2所述的hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体，其特征在于编码的hFGF2蛋白的基因所在表达框的构成是：从5’到3’方向依次为启动子、编码hFGF2蛋白的基因、SV40加尾信号序列。
4.根据权利要求2所述的hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体，其特征在于重组病毒载体为1型腺相关病毒载体AAV1-hPDGF-hFGF2、6型腺相关病毒载体AAV6-hPDGF-hFGF2、8型腺相关病毒载体AAV8-hPDGF-hFGF2或9型腺相关病毒载体AAV9-hPDGF-hFGF2。
5.根据权利要求3所述的hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体，其特征在于重组病毒载体为1型腺相关病毒载体AAV1-hPDGF-hFGF2、6型腺相关病毒载体AAV6-hPDGF-hFGF2、8型腺相关病毒载体AAV8-hPDGF-hFGF2或9型腺相关病毒载体AAV9-hPDGF-hFGF2。
6.根据权利要求2或3所述的hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体，其特征在于启动子为CMV启动子或cTnT心肌组织特异性启动子或α-MHC心肌组织特异性启动子或MLC-2v心肌组织特异性启动子或CBA非特异性启动子或CAG非特异性启动子。
7.根据权利要求4或5所述的hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体，其特征在于启动子为CMV启动子或cTnT心肌组织特异性启动子或α-MHC心肌组织特异性启动子或MLC-2v心肌组织特异性启动子或CBA非特异性启动子或CAG非特异性启动子。
8.根据权利要求2或3或4或5所述的hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体，其特征在于使用两个CMV启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个cTnT心肌组织特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个α-MHC心肌组织特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个MLC-2v心肌组织特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个CBA非特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个CAG非特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达。
9.根据权利要求6或7所述的hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体，其特征在于使用两个CMV启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个cTnT心肌组织特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个α-MHC心肌组织特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个MLC-2v心肌组织特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个CBA非特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达，或使用两个CAG非特异性启动子分别控制hPDGF-BB基因与hFGF2基因的表达。
10.一种根据上述任一权利要求所述的hPDGF-BB与hFGF2双基因重组病毒载体作为制备治疗老龄缺血性心脏疾病引发的心肌缺血损伤的基因药物方面的应用。
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