CN114432453B - 敲低或抑制clec4d的试剂在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用 - Google Patents

敲低或抑制clec4d的试剂在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及敲低或抑制CLEC4D的试剂在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。本发明通过敲低CLEC4D能够抑制CLEC4D蛋白表达，改善心肌缺血再灌注后心功能，降低心肌缺血再灌注后心脏纤维化，改善心肌缺血再灌注后心肌细胞肥大。

Description

敲低或抑制CLEC4D的试剂在制备心肌缺血再灌注损伤药物中 的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及敲低或抑制CLEC4D的试剂在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。
背景技术
心肌缺血再灌注损伤指冠状动脉部分或完全急性阻塞后，在一定时间又重新获得再通时，缺血心肌虽然得以恢复正常灌注，但其组织损伤反而呈进行性加重的病理过程。缺血期引起的心肌超微结构、能量代谢、心功能和电生理等一系列损伤性变化，在血管再通后表现得更为突出，甚至可发生严重的心律失常而导致猝死。心内直视手术、冠状动脉搭桥术、冠状动脉腔内成形术、溶栓术后以及心肌内侧支循环血量突然增加等情况下，都可发生心肌缺血后再灌注损伤。对其发生机制认为主要与细胞内氧自由基的大量产生、钙离子超负荷、白细胞的炎症作用及高能磷酸化合物缺乏等有关。除了心脏，缺血再灌注损伤还可见于脑、肺、肝、胰、肾及胃肠道等器官。
C型凝集素结构域家族4成员D(C-type lectin domain family 4member D,CLEC4D)基因，其表达的蛋白属于C型凝集素受体，可作为固有免疫细胞上的模式识别受体，识别核苷酸、糖类、脂多糖、以及其他病原体成分和自身配体，通过细胞粘附、细胞-细胞信号传导、内吞抗原、糖蛋白转换等方式，诱发原始宿主防御的复杂信号级联反应，释放炎症细胞因子、炎症趋化因子、诱导免疫应答，对体内平衡和宿主抗病原菌中起重要作用。
目前，CLEC4D蛋白在心肌缺血再灌注损伤中的作用及其机制尚未有任何相关的研究和报道。
发明内容
本发明的目的在于提供敲低或抑制CLEC4D的试剂在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，增加CLEC4D的医药用途。
本发明提供了敲低或抑制CLEC4D的试剂在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。
优选的，所述心肌缺血再灌注损伤包括心室病理性重构和/或心力衰竭。
优选的，所述试剂包括敲低CLEC4D基因表达的shRNA。
优选的，所述shRNA的正链核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反链核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
优选的，所述试剂包括CLEC4D抑制剂。
优选的，所述CLEC4D抑制剂的活性成分包括AAV-shCLEC4D。
优选的，所述药物还包括药学可接受的辅料。
优选的，所述药学可接受的辅料选自缓冲剂、包囊剂、填充剂、粘合剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂和吸附载体中的一种或多种组合。
本发明提供了一种心肌缺血再灌注损伤药物，所述药物的有效成分包括敲低或抑制CLEC4D的试剂。
本发明提供了敲低或抑制CLEC4D的试剂在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。动物实验表明，敲低CLEC4D能够改善心肌缺血再灌注后心功能，降低心肌缺血再灌注后心脏纤维化，改善心肌缺血再灌注后心肌细胞肥大。本发明首次明确CLEC4D能够改善心肌缺血再灌注损伤和/或心力衰竭，为心肌缺血再灌注损伤和/或心力衰竭的诊断及治疗提供新的防治药物研发途径和药物作用靶点，具有十分重要的药用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为干扰载体pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP载体图谱；
图2为AAV9-shCLEC4D测序结果；
图3为敲低CLEC4D干预心肌缺血再灌注损伤小鼠心功能的超声心动图检测结果；
图4为RT-qPCR动物水平验证AAV9-shCLEC4D效率结果；
图5为敲低CLEC4D干预心肌缺血再灌注损伤小鼠心脏纤维化的马松染色结果；
图6为敲低CLEC4D干预心肌缺血再灌注损伤小鼠心肌细胞横截面积的HE染色结果；
图7为敲低CLEC4D干预心肌缺血再灌注损伤小鼠心肌细胞横截面积的WGA染色结果。
具体实施方式
本发明提供了敲低或抑制CLEC4D的试剂在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。
在本发明中，所述心肌缺血再灌注损伤优选包括心室病理性重构和/或心力衰竭。本发明所述心肌缺血再灌注优选包括心血管疾病诱发的心肌缺血再灌注。
在本发明中，所述试剂优选包括敲低CLEC4D基因表达的shRNA。本发明所述敲低CLEC4D基因表达的shRNA的正链核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反链核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明所述各核苷酸序列的碱基序列，从5’-3’依次如下：
SEQ ID NO.1：AATTCGCTTCCAGTCTAACTGTTACTTCTCGAGAAGTAACAGTTAGACTGGAAGTTTTTTG；
SEQ ID NO.2：GATCCAAAAAACTTCCAGTCTAACTGTTACTTCTCGAGAAGTAACAGTTAGACTGGAAGCG。
本发明所述shRNA存在茎环(5’-CTCGAG-3’)结构，将反向重复序列分隔开，形成发夹结构，从而达到敲低CLEC4D基因表达的效果。
在本发明中，所述试剂优选包括CLEC4D抑制剂。本发明所述CLEC4D抑制剂的活性成分优选包括AAV-shCLEC4D，进一步优选为AAV9-shCLEC4D。本发明对所述AAV-shCLEC4D的来源没有严格要求，采用常规构建质粒的方式，将上述敲低CLEC4D基因表达的shRNA重组到腺病毒载体，得到重组腺病毒AAV9-shCLEC4D即可。本发明所述腺病毒载体的优选为AAV9，更优选为pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP。
得重组腺病毒AAV9-shCLEC4D后，本发明优选对重组腺病毒AAV9-shCLEC4D进行包装。本发明对所述包装的方式不做具体的限定，将重组腺病毒AAV9-shCLEC4D的滴度确定为1×1011～1×1012个病毒基因组/mL即可。
本发明对所述CLEC4D的来源没有特殊限制，化学合成或者微生物代谢获得均可。
本发明还提供了一种心肌缺血再灌注损伤药物，有效成分包括敲低或抑制CLEC4D的试剂。本发明通过敲低或抑制CLEC4D能够在心肌缺血再灌注损伤后改善心功能，并且有助于降低心肌缺血再灌注损伤后心脏的纤维化，抑制心肌缺血再灌注损伤后的心肌肥厚，抑制心室病理性重构、改善心力衰竭，将具备敲低或抑制CLEC4D的试剂作为药物的活性成分，能够改善心肌缺血再灌注损伤。
在本发明中，所述药物优选还包括药学可接受的辅料。本发明所述药学可接受的辅料选自缓冲剂、包囊剂、填充剂、粘合剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂和吸附载体中的一种或多种组合。本发明所述药物的剂型优选包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、汤剂、口服液、注射剂或栓剂。本发明在具体实施过程中，根据药物的剂型选择合适的辅料即可。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.AAV9-shCLEC4D腺相关病毒载体构建
利用限制性内切酶酶切干扰载体pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP后和shRN A片段(正链核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’-AATTCGCTTCCAGTCTAACTGTTACTTCTCGAGAAGTAACAGTTAGACTGGAAGTTTTTTG-3’；反链核苷酸序列如SEQ ID NO.2：5’-GATCCAAAAAACTTCCAGTCTAACTGTTACTTCTCGAGAAGTAACAGTTAGACTGGAAGCG-3’)连接，随后进行大肠杆菌转化，转化后使用条件培养基(无抗性的LB培养基)筛选目标菌株后送至擎科公司测序，利用核酸提取试剂盒进行质粒抽提，得重组腺病毒AAV9-shCLEC4D，干扰载体pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP的图谱如图1所示，测序结果如图2所示。根据图2测序结构可以看出，测序结果与目的序列一致，表明该重组腺病毒AAV9-shCLEC4D构建成功(所述腺相关病毒构建过程由汉恒生物技术有限公司进行，构建的AAV9-shCLEC4D由汉恒生物技术有限公司提供，滴度为1.0×1013μg/mL)。
2.AAV9-Empty腺相关病毒载体构建
同步骤1，使用的shRNA片段的正链核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’-GATCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTAATTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTC-3’；反链核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：5’-GATCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTAATTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTC-3’，由汉恒生物技术有限公司构建AAV9-Empty，滴度为1.3×1013μg/mL。
实施例2
1.小鼠分组和模型建立
将购自北京维通利华实验动物技术有限公司的40只实验小鼠，平均分为心肌缺血再灌注损伤(IRI)组(实验组)和假手术(Sham)组(对照组)；
实验组：用4wt％水合氯醛以10μl/g腹腔注射麻醉各小鼠，在体视镜下分离覆盖气管上的颈部皮肤、肌肉及组织，暴露气管后，在声门下两个气管软骨环之间切一个小孔，插入气管插管，固定。检查胸廓的运动确保两肺通气良好。在体视镜下，使用小剪刀将小鼠胸骨左缘第四第五肋间位置做一1.2cm长的切口，使用显微镊钝性分离胸壁肌肉、肋间肌肉，暴露心脏，结扎左前降支动脉。缝合胸腔。30分钟后再次打开胸腔，将结扎线剪断取出。最后缝合肋间肌、胸壁肌肉及皮肤，对术后伤口进行碘酒消毒。
对照组：操作步骤除结扎部分不执行外，与实验组一致。手术后注意观察是否有呼吸不畅，如果有应及时清理呼吸道。苏醒后将小鼠从恒温垫取下，放回鼠笼。
2.病毒的尾静脉注射
将实验组小鼠平分为两组，分别记为AAV9-Empty+IRI组和AAV9-shCLEC4D+IRI组，各组小鼠进行步骤1处理前一周将小鼠置于尾静脉注射器上，使用酒精对小鼠尾部进行消毒，AAV9-shCLEC4D+IRI组使用胰岛素注射器通过尾静脉注射的方式按5×1011μg/mL的剂量注射实施例1得到的AAV9-shCLEC4D；
AAV9-Empty+IRI组使用胰岛素注射器通过尾静脉注射的方式按5×1011μg/mL的剂量注射实施例1得到的AAV9-Empty，注射完后使用脱脂棉止血后放入鼠笼，按照上述步骤1对实验组小鼠进行后续处理。
按照同样的方式将对照组小鼠平均分为两组，分别记为AAV9-Empty+Sham组和AAV9-shCLEC4D+Sham组，处理方式同实验组小鼠。
测试例1
实施例2处理结束后，使用1.5％～2％异氟烷麻醉小鼠，采用频率为30MHZ的Visual Sonics 2100小动物超声成像系统评估小鼠心功能。可采集B模和M模图像，测量收缩功能指标EF和FS以评估小鼠的收缩功能。每个指标测量三次，取平均值，以评估小鼠心功能，结果如图3所示，其中，图3中A为小鼠心脏超声代表图；B为小鼠心脏超声的射血分数(EF)统计结果，从左到右分别为AAV9-Empty+Sham、AAV9-shCLEC4D+Sham、AAV9-Empty+IRI和AAV9-shCLEC4D+IRI处理组，各组射血分数依次为57.79％，58.53％，39.86％和49.20％；C为小鼠心脏超声的缩短分数(FS)统计结果，从左到右分别为AAV9-Empty+Sham、AAV9-shCLEC4D+Sham、AAV9-Empty+IRI和AAV9-shCLEC4D+IRI处理组，各组缩短分数依次为29.96％，30.39％，19.04％和24.49％。
根据图3可以看出敲低CLEC4D能够保护缺血再灌注损伤小鼠心功能。***表示p<0.001。
测试例2
实施例2处理结束后，利用Trizol法提取实验组小鼠组织RNA，使用RevertAiFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific#K1622)反转录总RNA。使用iTaqUniversal SYBR Green Supermix(Bio-Rad#1725121/-20℃)在LightCycler480II(Roche)中通过实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)对cDNA进行定量。采用18S作为内参，检测CLEC4D的相对表达量。所有qPCR反应均为3个重复，并在每个周期结束时采集信号。用
Figure BDA0003519996190000061
法计算相对表达量。检测结果统计图见图4。
根据图4可以看出，AAV9-shCLEC4D+Sham组小鼠心脏组织中CLEC4D的mRNA相对表达量与AAV9-Empty+Sham组相比降低了0.37倍，说明AAV9-shCLEC4D有效敲除CLEC4D的mRNA表达，**表示p<0.01。
测试例3
1.1马松染色：实施例2小鼠安乐死后，取心脏，经脱水、石蜡包埋后，制成厚度为5μm的石蜡切片。石蜡切片经脱蜡水化后，使用马松三色染色法试剂盒(购于凯基生物)进行胶原纤维的染色。待组织切片晾干后，中性树胶封片并于显微镜下观察并采集图像，评估心肌胶原纤维的变化，并运用ImageJ进行胶原纤维含量的定量分析，结果如图5。
图5中A为马松染色小鼠心脏纤维化代表图，蓝色为标记的心肌组织纤维化区域，比例尺：50μm。图5中B为马松染色后各处理组胶原纤维含量的统计结果，**表示p<0.01；***表示p<0.001，从左到右分别为AAV9-Empty+Sham、AAV9-shCLEC4D+Sham、AAV9-Empty+IRI和AAV9-shCLEC4D+IRI处理组，各组胶原纤维含量依次为0.3028％，0.3394％，7.475％和3.030％说明敲低CLEC4D能够改善缺血再灌注损伤小鼠心脏纤维化。
1.2.HE染色：实施例2小鼠安乐死后，取心脏，经脱水、石蜡包埋后，制成厚度为5μm的石蜡切片。石蜡切片经脱蜡、水化后，使用苏木素-伊红染料(购于凯基生物)对组织切片进行染色。将切片自然晾干后，使用盖玻片封片后在明场显微镜(Nikon eclipse 80i)采集图片，并运用ImageJ测量心肌细胞横截面积，结果如图6。
图6中A为HE染色小鼠心肌细胞横截面积大小代表图，比例尺：50μm。图6中B为HE染色后各处理组心肌细胞横截面积大小的统计结果，***表示p<0.001，从左到右分别为AAV9-Empty+Sham、AAV9-shCLEC4D+Sham、AAV9-Empty+IRI和AAV9-shCLEC4D+IRI处理组，各组心肌细胞横截面积依次为371.4μm，373.3μm，492.8μm和429.1μm，说明敲低CLEC4D能够改善缺血再灌注损伤小鼠心肌细胞横截面积的大小。
1.3.麦胚凝集素(WGA)染色：实施例2小鼠安乐死后，取心脏，置于OCT复合物中并于-80℃冷冻定型。通过冰冻切片机制备小鼠心脏组织的冰冻切片，厚度为5μm，使用WGA(购于Sigma)对冰冻切片进行染色，避光条件下用50％甘油封片后，采用荧光显微镜(CarlZeiss Microscopy GmbH)采集图片，并采用ImageJ测量心肌细胞横截面积，结果如图7。
图7中A为WGA染色小鼠心肌细胞横截面积代表图，绿色为WGA标记的心肌组织细胞轮廓，比例尺：50μm。图6中B为WGA染色后各处理组心肌细胞横截面积大小的统计结果，***表示p<0.001，从左到右分别为AAV9-Empty+Sham、AAV9-shCLEC4D+Sham、AAV9-Empty+IRI和AAV9-shCLEC4D+IRI处理组，各组心肌细胞横截面积依次为420.8μm，422.0μm，536.4μm，456.0μm，说明敲低CLEC4D能够改善缺血再灌注损伤小鼠心肌细胞横截面积的大小。
本发明提供的敲低或抑制CLEC4D的试剂能够改善心肌缺血再灌注后心功能，降低心肌缺血再灌注后心脏纤维化，改善心肌缺血再灌注后心肌细胞肥大，为心肌缺血再灌注损伤和/或心力衰竭的诊断及治疗提供新的防治药物研发途径和药物作用靶点，具有十分重要的药用价值。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 上海大学
<120> 敲低或抑制CLEC4D的试剂在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aattcgcttc cagtctaact gttacttctc gagaagtaac agttagactg gaagtttttt 60
g 61
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatccaaaaa acttccagtc taactgttac ttctcgagaa gtaacagtta gactggaagc 60
g 61
<210> 3
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatccgttct ccgaacgtgt cacgtaattc aagagattac gtgacacgtt cggagaattt 60
tttc 64
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatccgttct ccgaacgtgt cacgtaattc aagagattac gtgacacgtt cggagaattt 60
tttc 64

Claims (8)

1.敲低或抑制CLEC4D的试剂在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用；
所述试剂包括敲低CLEC4D基因表达的shRNA；
所述shRNA的正链核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示，反链核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述心肌缺血再灌注损伤包括心室病理性重构和/或心力衰竭。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂的活性成分包括AAV-shCLEC4D。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学可接受的辅料。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药学可接受的辅料选自缓冲剂、包囊剂、填充剂、粘合剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂和吸附载体中的一种或多种组合。
6.一种心肌缺血再灌注损伤药物，其特征在于，所述药物的有效成分包括敲低或抑制CLEC4D的试剂；
所述试剂包括敲低CLEC4D基因表达的shRNA；
所述shRNA的正链核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示，反链核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述心肌缺血再灌注损伤包括心室病理性重构和/或心力衰竭。
8.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述试剂的活性成分包括AAV-shCLEC4D。
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