CN116790612B - 一种促进心肌再生修复的过氧化物酶体生发蛋白3及其应用 - Google Patents
一种促进心肌再生修复的过氧化物酶体生发蛋白3及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种过氧化物酶体生发蛋白3(PEX3)及其在心肌损伤后心肌再生修复中的应用，属于生物医学技术领域。试验结果显示，在补充心肌细胞内的PEX3蛋白后，体外iPSC‑CMs和体内成熟心肌细胞增殖能力明显提高，在成年心脏遭受急性心肌缺血损伤后，心肌细胞迅速启动内源性心肌再生，进而发挥促进损伤后心肌再生修复、瘢痕减少和心功能恢复等作用，因此本发明为急性心肌梗死和心肌缺血再灌注损伤的预防和治疗提供了新的药物作用靶点，具有十分重要的临床转化价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体而言，涉及一种过氧化物酶体生发蛋白3(PEX3)及其在心肌损伤后心肌再生修复中的应用。
背景技术
实现心肌梗死后的心肌再生修复，一直是心血管领域内极为复杂和至关重要的科学问题。逆转或减缓梗死后心肌病理性重塑、实现心肌组织的有效再生对于心肌梗死的治疗具有重要的意义。近年越来越多的研究表明，新生一周以内的小鼠在发生心梗后可以实现完全的自我修复；与此类似，有研究报道人类新生儿心脏也存在一定的再生修复能力，但是这种再生能力在成年后明显减弱。目前，发现包括ERBB2、Hippo/YAP在内的多个基因，在出生后表达减弱或消失；而在成年阶段恢复其表达，可以重新启动损伤心脏的内源性心肌再生修复能力。
过氧化物酶体生发蛋白3(peroxisomal biogenesis factor 3，PEX3)属于过氧化物酶体生发因子，分子量为42kDa，由373个氨基酸构成，在人和小鼠中具有高度的序列保守性。PEX3主要参与细胞内过氧化物酶体的生物合成和内质网定位。由于PEX3基因突变或缺失导致上述生物过程不能正常进行而产生的疾病称之为过氧化物酶体生物发生缺陷病，即PBD。而对于PEX3蛋白在小鼠或人心肌再生修复中的作用，目前尚无相关文献报道。
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是微小病毒科依赖病毒属，病毒颗粒大小约为20～26nm，经过病毒包装后可以形成携带有外源插入基因的腺相关病毒的病毒颗粒。由于腺相关病毒不整合到宿主基因组，因此具有安全可靠性，同时具有表达时效长的优点，目前已成为最有前景的基因治疗工具。另外，使用cTNT心肌特异性启动子，大大加强了心肌靶向性，保证搭载的生物制剂有效地在人的心肌细胞中表达和发挥功能。本发明拟构建一种全新的、搭载安全高效的心肌细胞特异启动子驱动的PEX3蛋白腺相关病毒制剂，用于实现人心肌梗死后心肌再生修复。
通过检索国内外文献，未见PEX3蛋白通过促进心肌细胞增殖和抑制过度纤维化以改善心脏心肌梗死后心功能的相关报道。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种人PEX3基因和表达人PEX3蛋白的重组腺相关病毒在心肌损伤后心肌再生修复中的应用及相关药物产品，以解决急性心肌梗死或心肌缺血再灌注损伤的再生修复治疗问题。
本发明人意外地发现，人PEX3具有通过影响过氧化物酶体水平进而促进心肌再生修复的功能。因此，为了解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：人PEX3基因的下述任一种应用：(1)在制备促进心肌细胞增殖的药物或试剂中的应用；(2)在制备促进心肌损伤后心肌再生修复药物中的应用。优选地，将所述人PEX3基因在机体的心肌组织中过量表达。进一步优选地，所述的心肌损伤为急性心肌梗死或心肌缺血再灌注损伤。
为了解决传统的给药方式存在靶向性差、生物安全性低、治疗效率不高等问题，本发明人设计了腺相关病毒载体搭载人PEX3蛋白的给药方式制备PEX3制剂，因此，本发明的目的还可以通过以下技术方案实现：表达人PEX3蛋白的重组腺相关病毒的下述任一种应用：(1)在制备促进心肌细胞增殖的药物或试剂中的应用；(2)在制备促进心肌损伤后心肌再生修复药物中的应用。进一步优选地，所述的心肌损伤为急性心肌梗死或心肌缺血再灌注损伤。
另外，本发明所述人PEX3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组腺相关病毒含有所述人PEX3蛋白的编码基因，所述人PEX3蛋白的编码基因的编码链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。进一步优选地，所述的腺相关病毒为AAV9。再进一步优选地，所述的腺相关病毒含有心肌特异性启动子cTNT，从而实现以心肌特异性cTNT启动子驱动，进行心肌内细胞特异性表达人PEX3的目的。
再者，本发明还提供了一种促进心肌再生修复的药物，所述药物的活性成分包括表达人PEX3蛋白的重组腺相关病毒。进一步优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料或添加剂，从而制备成注射剂进行心肌原位注射或静脉注射给药。
需要说明的是：本发明将心肌特异性启动子cTNT驱动的人PEX3蛋白腺相关病毒制剂，作为促进心肌再生修复的药物用于缺血性心脏病模型的治疗和评估，步骤如下：
①成年小鼠心肌梗死模型的构建和PEX3制剂心肌原位注射给药；
②心肌特异性启动子cTNT驱动的人PEX3蛋白腺相关病毒制剂在心梗损伤后心肌再生修复中的应用评估，包括转染效率、心脏功能、心肌细胞过氧化物酶体水平和增殖水平的评估；
③人iPSC-CMs糖氧剥夺模型的构建及PEX3制剂给药；
④心肌特异性启动子cTNT驱动的人PEX3蛋白腺相关病毒制剂对体外人iPSC-CMs增殖功能的作用评估。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和进步性：
(1)本发明首次揭示PEX3蛋白具有促进心肌再生修复的作用：试验结果显示，在补充心肌细胞内的PEX3蛋白后，体外iPSC-CMs和体内成熟心肌细胞增殖能力明显提高，在成年心脏遭受急性心肌缺血损伤后，心肌细胞迅速启动内源性心肌再生，进而发挥促进损伤后心肌再生修复、瘢痕减少和心功能恢复等作用。因此，本发明为急性心肌梗死和心肌缺血再灌注损伤的预防和治疗提供了新的药物作用靶点，具有十分重要的临床转化价值。
(2)心肌细胞特异性cTNT启动子提升治疗精准性和效率：本发明采用的是搭载心肌细胞特异性启动子cTNT的腺相关病毒载体，当其成功转染心肌组织时，只有心肌细胞才能启动载体表达外源性PEX3基因，从而实现细胞特异性治疗，同时可有效避免组织或细胞脱靶带来的副作用。以腺相关病毒为载体，搭载cTNT驱动的具有治疗作用的基因片段是心肌梗死的理想治疗方式。
(3)操作的易行性及安全性：本发明提供的基因表达载体可通过局部心肌原位注射和静脉注射两种方式给药，方便易行，可有效避免体外循环和心脏移植等手段带来的巨大风险，为急性心肌梗死和缺血再灌注损伤的生物学治疗提供了新的策略。
(4)心脏保护和修复作用的效果显著：前期实验结果表明，通过尾静脉注射和梗死边缘区原位注射可有效促进成年小鼠心肌细胞内源性增殖，减少慢性瘢痕形成，抑制心室病理性重塑和显著改善心肌功能。
附图说明
图1：pHBAAV-cTNT-MCS-ZsGreen载体图谱；
图2：PCR扩增PEX3目的基因片段的电泳图；
图3：AAV9:cTNT-PEX3制剂原位注射心肌梗死损伤后小鼠术后3、28天心脏EF和FS值；
图4：AAV9:cTNT-PEX3制剂原位注射心梗后小鼠2周后心脏组织内PEX3表达情况；
图5：AAV9:cTNT-PEX3制剂原位注射心梗后小鼠2周后心脏中和其它脏器中PEX3表达情况；
图6：AAV9:cTNT-PEX3制剂原位注射心梗后小鼠术后28天心脏纤维化面积；
图7：AAV9:cTNT-PEX3制剂原位注射心梗后小鼠2周后心脏组织PMP70免疫荧光染色；
图8：AAV9:cTNT-PEX3制剂原位注射心肌梗死损伤后小鼠2周后心脏组织Ki67免疫荧光染色；
图9：AAV9:cTNT-PEX3制剂转染iPSC-CMs后EdU免疫荧光染色。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行详细说明。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不应视为对本发明适用范围的一种限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体技术操作步骤和操作者，均按照本领域文献所描述的一般技术条件或相关产品说明书进行。
实施例1：心肌特异性cTNT启动子驱动的人PEX3蛋白腺相关病毒制剂的制备
第一部分：心肌特异性启动子cTNT驱动的过表达人PEX3蛋白腺相关病毒载体构建1、目的基因：人PEX3
2、工具载体信息：
载体名称：HBAAV017；元件顺序：pHBAAV-cTNT-MCS-ZsGreen；克隆位点：NheI/NcoI；载体图谱见(HBAAV017载体，NheI/NcoI酶切)，见图1。
3、载体酶切
配制50ul酶切体系(包括ddH2O 42ul，10×CutSmart Buffer 5ul，上述工具载体DNA(1ug/ul)2ul，限制性内切酶AgeI(10U/ul)1ul)。依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应过夜。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。
4、目的基因片段的获取
(1)设计合成PEX3基因的引物：
PEX3-p1：TACGACTCCAGACATACCTT；
PEX3-p2：GAGTCGTTGACCTCTTTACT
(2)PCR扩增：
配制如下体系，轻轻混匀，置于PCR仪中进行反应。片段PCR扩增体系如下：
PCR程序如下：
获得PCR产物大小：1122bp；电泳图见图2。
5、PCR产物与载体进行交换与转化
冰水浴中配制反应体系如下：
用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，避免产生气泡。于37℃反应30min，随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。将10μl交换反应产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μlLB培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置12-16h。
6、PCR菌落鉴定
鉴定引物：
R：CCATCAAGTGGGCAAGCTAC；
F：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG
PCR鉴定：
配制反应体系，菌液PCR鉴定体系如下：
注：配置MIX时，MIX中的比例应同等比例放大。待验证的克隆数；根据使用的载体，选取验证引物，震荡混匀，短暂离心。在超净工作台中，用无菌的枪头挑取单个菌落至20μl反应体系中，吹打混匀，置于PCR仪中进行反应。
菌液PCR鉴定程序如下：
鉴定结果：PCR产物电泳结果与预期结果相一致。
7、测序
将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序。对测序结果与目的基因序列进行比对分析。比对结果显示：测序结果与目标序列完全一致，具体序列如序列表中序列2所示。
第二部分：上述载体的出毒包装
1、质粒转染与腺相关病毒收获：
转染前24h，用0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的AAV-293细胞，以含10％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为达30％-40％，重新接种于细胞培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱内培养。24h左右待细胞密度达到50％-60％时即可用于转染；转染前2h更换为无血清培养基；将DNA溶液(穿梭质粒5μg、辅助质粒5μg)与DMEM混合均匀，调整总体积为50μl，室温下温育5min；取10μl Lipofectamine 2000试剂与50μl DMEM混合，室温下温育5min；将稀释后的DNA溶液与Lipofectamine2000轻轻混匀，勿振荡，室温下温育20min，以便形成DNA/Lipofectamine2000转染复合物；将转染复合液缓慢滴加至AAV-293细胞培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入2ml的PBS清洗一次，轻柔晃动以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10％血清的细胞培养基5ml，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养，每天观察转染后细胞生长状况，若培养基明显发黄，酌情补加适量的新鲜完全培养液。转染后约12-16d，显微镜观察AAV-293细胞是否开始飘落，出现细胞病发(cytopathic effect,CPE)。待大部分细胞显示典型CPE，且有50％细胞脱壁，低速离心收集细胞并重悬于2ml DMEM中，-70℃/37℃反复冻融、振荡3次，4℃、7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。
2、腺相关病毒的扩增：
将生长状态良好的AAV-293细胞传入细胞培养瓶中，待细胞汇合达60％，弃去旧培养液，加入重组成功后的复制缺陷型腺相关病毒粗提液2mL，置于细胞培养箱中孵育90min后补加完全培养液3ml，继续培养。待大部分细胞出现典型的CPE，且有50％细胞脱壁时，低速离心收集细胞并重悬于2mlDMEM中，-70℃/37℃反复冻融、振荡3次，4℃、7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。重复2-3次。
3、腺相关病毒纯化：
使用Adeno-XTMVirus Purification Kit。取出Adeno-X纯化装置，0.45μm滤膜过滤10ml病毒粗提液，保存滤液于收集瓶中；向病毒滤液中加入4μl25U/μl的Benzonase，混匀，37℃温育30min后，加入10ml1×dilutionbuffer，混合均匀；组装过滤装置，使用灭菌PBS排尽滤器和套管中的空气后，将套管插入收集瓶病毒滤液中，以5ml/min的速度向外拉动注射器，使病毒滤液流经滤器；使用1×Wash Buffer洗涤过滤装置；使用5ml的BDLuer-Lok注射器洗脱腺相关病毒：在注射器中吸入3ml的1×Eultion Buffer；连接注射器和滤器的凹口，推入lml Elution Buffer流经滤器至5ml灭菌离心管中；室温下孵育滤器5min，推入剩下的Elutionbuffer流经滤器来收集剩下的腺相关病毒；将纯化后的腺相关病毒分装，-70℃保存。
实施例2：cTNT启动子驱动的人PEX3蛋白激酶基因表达载体促进iPSC-CMs增殖的试验研究
在iPSC-CMs中分别转染相同滴度(MOI＝50)的空载病毒、心肌特异性人PEX3基因表达载体(AAV9:cTNT-PEX3)及设立单纯空白对照。同时在此基础上构建iPSC-CMs糖氧剥夺模型。具体地，iPSC-CMs在设定的条件下预处理和培养不同时间后，将心肌细胞置于无糖、无血清DMEM中，并在矩形广口瓶中，加入厌氧包37℃孵育8小时。然后，使用含糖的培养基代替无糖，无血清的培养基，置入装有5％CO2和空气的平衡培养箱中，在37℃下放置12小时。构建转染48小时后在显微镜下确定转染效率然后进行后续免疫荧光染色实验，具体操作如下：
(1)在使用EDU染色试剂盒对贴壁细胞进行染色前，更换心肌细胞培养液，在新培养液中加入试剂盒中A液，继续孵育细胞2小时(该孵育时间的长短取决于细胞生长速率，通常宜继续孵育细胞周期10％左右的时间)。
(2)EdU标记细胞完成后，将细胞培养皿从37度培养箱中取出，在显微镜下评估细胞生长状态和密度。去除细胞培养液，将PBS沿管壁加入培养皿中清洗细胞，重复3次。去除PBS，向培养皿中加入4％多聚甲醛(浸没细胞)，室温下置于摇床上50转慢摇20分钟。去除固定液，加入PBS后置于摇床上50转慢摇5分钟，重复3次。去除PBS后，加入含有0.2％Triton的山羊血清(山羊血清：PBS＝1:10配置)液，室温50转慢摇通透30分钟。去除通透液后，加入PBS后置于摇床上50转慢摇5分钟，重复3次。接着，加入不含有Triton的山羊血清，室温50转慢摇封闭2小时后，一抗稀释液(cTNT：山羊血清＝1：200)4度冰箱50转慢摇过夜。
(3)去除并清洗一抗稀释液后，加入对应种属二抗稀释液室温50转慢摇孵育2小时。
(4)按照试剂盒说明书配置EDU染色液(430μl的D液+20μl的E液+1.2μl的B液+50μl的F液＝500μl的EDU染色液)，室温摇床50转避光孵育1小时。去除染色液，加入PBST后置于摇床上50转慢摇5分钟，重复3次。DAPI液染核后，使用激光共聚焦显微镜进行拍摄。并统计各组EDU阳性信号细胞比例(EdU，见图9)。
实施例3：cTNT启动子驱动的人PEX3蛋白激酶基因表达载体促进梗死后心肌再生修复的试验研究
由南京医科大学医药实验动物中心购入40只8周龄C57BL/6J雄性小鼠，分成两组构建心肌梗死联合梗死边缘心肌内病毒注射模型，具体操作如下：对小鼠腹腔注射1.2％(200μl/10g)三溴乙醇至充分麻醉。采用窄胶带将四肢固定于平板上，给予气管插管及小动物呼吸机进行辅助通气。剔除心前区毛发并消毒后，在心前区左侧3-4肋间剪开肋间隙皮肤，分离皮下组织暴露胸腔和心脏，左手持眼科镊将心脏轻柔向左移动，在冷光源下可清晰看到LAD，右手持精细持针器，使用带7-0缝线的缝合针在LAD中段部位左侧穿过心肌层使用外科结结扎缝线，提起心脏。由助手使用带36G针头的显微注射器，在结扎部位周围苍白梗死区域边缘的左侧、右侧、和上方分别进行心肌内注射AAV9:cTNT-PEX3制剂或对照病毒(每个点3μl，注射的病毒总量为1.1×109v.g)。然后使用带3-0线缝的缝合针逐层缝合皮下组织和皮肤。最后，拔出气管插管，并置于恒温台上待其完全清醒并完全恢复正常活动后放回鼠笼。随后进行后续实验：
第一部分：每组随机选取6只小鼠用于监测术后各时间点的心脏功能恢复情况。在术后第3天和第28天，行心脏超声检测MI损伤后两组心脏功能受损的恢复情况。术后28天，AAV9:cTNT-CON组存活6只，AAV9:cTNT-PEX3组存活6只。应用心超评估心梗小鼠心功能发现，相比于AAV9:cTNT-CON组，AAV9:cTNT-PEX3组小鼠的心脏射血分数(EF值)显著提高，并维持缓慢升高趋势直至最长观察时间点，表明病毒制剂可以明显且持续促进小鼠MI后心功能的恢复(见图3)。随后，在术后28天处死该部分实验的所有小鼠，取新鲜心脏组织制备石蜡标本切片，使用Masson染色试剂盒对组织切片进行染色，发现AAV9:cTNT-PEX3组小鼠较AAV9:cTNT-CON组的心肌纤维化程度显著减少(见图6)。以上结果说明，AAV9:cTNT-PEX3制剂可促进心肌再生修复，减少纤维化面积，抑制心脏重构，改善心脏功能。
第二部分：在术后第14天，每组随机选取3只小鼠，免疫印迹法检测转染效率(见图4)。同时，取材包括心、脑、肝、肺和肾在内的各脏器，检测PEX3蛋白制剂所包含的标签蛋白FLAG的表达，仅在心脏中发现有表达，证明PEX3制剂具有较好的靶向性和生物安全性(见图5)。取材新鲜的损伤边缘区组织制作石蜡切片，进行Ki67染色发现，AAV9:cTNT-PEX3组小鼠的损伤边缘区的心肌细胞的细胞周期活性、有丝分裂显著增多，提示AAV9:cTNT-PEX3制剂可以促进成年小鼠MI损伤后心肌细胞的增殖(见图7)，同时PEX3蛋白的过表达提高了过氧化物酶体水平，提示PEX3蛋白通过调节过氧化物酶体水平促进心肌再生修复(图8)。本实施方式表明AAV9:cTNT-PEX3制剂可作为急性心肌心肌梗死损伤后的再生修复治疗新策略。
Claims (7)
1.人PEX3基因在制备促进心肌损伤后心肌再生修复药物中的应用；所述的心肌损伤是急性心肌梗死或心肌缺血再灌注所致的心肌损伤；所述应用是将人PEX3基因在机体的心肌组织中过量表达；所述人PEX3基因为氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示的人PEX3 蛋白的编码基因。
2. 表达人PEX3蛋白的重组腺相关病毒在制备促进心肌损伤后心肌再生修复药物中的应用；所述的心肌损伤是急性心肌梗死或心肌缺血再灌注所致的心肌损伤；所述人PEX3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组腺相关病毒含有所述人PEX3蛋白的编码基因，所述人PEX3蛋白的编码基因的编码链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的腺相关病毒为AAV9。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的腺相关病毒含有心肌特异性启动子cTNT。
6. 一种促进心肌损伤后心肌再生修复的药物，所述的心肌损伤是急性心肌梗死或心肌缺血再灌注所致的心肌损伤，其特征在于，所述药物的活性成分包括表达人PEX3蛋白的重组腺相关病毒；所述人PEX3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
7.根据权利要求6所述促进心肌再生修复的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料或添加剂。
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Non-Patent Citations (2)
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| The peroxisome biogenesis factors Pex3 and Pex19: multitasking proteins with disputed functions;Renate L M Jansen等;《FEBS Lett》;参见全文 * |
| 过氧化物酶体生物发生研究进展;孙艳等;《生物学杂志》;参见全文 * |
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