CN113278591A - 一种心脏靶向性基因工程外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞生物学领域,具体涉及一种心脏靶向性基因工程外泌体及其制备方法和应用。所述外泌体表面展示心脏归巢肽(Heart homing peptide,HHP)CRPPR。通过将归巢肽融合表达在外泌体跨膜蛋白的胞外结构域来实现CRPPR展示在外泌体表面,从而实现了CRPPR的心脏靶向效果和外泌体安全高效的载体特征相融合,为开发更加安全高效的心脏靶向运送载体及心脏靶向药物提供了新的思路。经基因工程修饰,具有心脏靶向性的外泌体能大大延长其在体内的半衰期,提高所携带基因的心脏运送效果和治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域,具体涉及一种心脏靶向性基因工程外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
心血管疾病是人类健康的巨大威胁,心肌梗死、心律失常、心肌肥厚、高血压、心力衰竭等多种疾病目前仍缺乏有效的根治手段。研究显示,干细胞、非编码RNA、功能性蛋白质及多种化学药物都具有出色的心肌保护作用和临床转化潜力,同时也面临着巨大的挑战。心脏是在高速血流剪切力环境中,持续搏动的特殊器官。因此,心肌保护因子或药物无论通过心肌内注射、静脉注射或口服后,能够到达并驻留在心肌细胞的有效浓度过低,使治疗效果受限。传统的运送载体,如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、脂质体等都无法避免靶向效率低,载体毒性,失靶现象,低效基因运送,被肝/肾/脾等快速清除,体内生物半衰期短以及引起炎症和免疫反应等诸多缺陷,严重影响基因治疗的安全性和有效性。心肌靶向运送系统和靶向药物严重匮乏,这是心血管疾病治疗中的难点问题。
外泌体是细胞自体分泌的囊泡状小体,直径约30-150nm,具有良好的生物分布和生物相容性,天然,稳定,纳米尺寸,可穿透生物屏障,不引起免疫反应,还可以携带单一或随意组合的治疗制剂,具有基因运送载体的优良特征。研究显示,胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、心肌球源性细胞等都可以通过外泌体介导的旁分泌途径在心肌损伤修复中发挥治疗作用。心肌球源性细胞及其分泌的外泌体已被证实具有抑制心肌细胞凋亡、心肌纤维化及促进血管新生等作用。因此,干细胞来源的外泌体即可作为理想的基因运送载体,又具有出色的心肌保护作用。
天然未经修饰的外泌体不具有组织选择性,这些未经修饰的外泌体无论通过肌肉注射、静脉注射或口服的方式进入体内后,都无法避免机体的首过效应,会优先在肝、肾、脾等器官富集并被代谢清除,能够到达并驻留在心肌组织的很少。这严重限制了干细胞外泌体心肌保护作用的发挥,这也是严重制约干细胞外泌体用于心血管疾病临床治疗的瓶颈问题。
目前,心肌保护性因子,如非编码RNA、蛋白质和化学药物等缺乏安全、高效的心脏靶向运送系统,天然未经修饰的外泌体虽然可以作为理想的运送载体,但未修饰的外泌体不具有心脏靶向性,其心脏运送效果不佳,进而导致其治疗效果不佳。
综上,未经修饰的外泌体的心脏靶向性不佳。缺乏安全、高效心脏靶向运输系统。
发明内容
本发明的目的在于:针对现有技术存在的,外泌体心脏靶向性不佳的问题,提供一种心脏靶向性基因工程外泌体。该基因工程外泌体,通过将心脏归巢肽CRPPR融合表达在外泌体跨膜蛋白LAMP2的胞外结构域的方式,将心脏归巢肽展示在外泌体的表面,从而实现了CRPPR的心脏靶向效果和外泌体安全高效的载体特征相融合,提升了外泌体的心脏靶向性。
具有心脏靶向性的外泌体能够作为药物输送系统,为开发安全高效的心脏靶向运送载体及心脏靶向药物提供新的思路和技术平台。经基因工程修饰后,具有心脏靶向功能的外泌体在体内的半衰期显著提高,同时心脏运送效率显著提高,进而其治疗效果也显著提高。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种外泌体,所述外泌体表面展示心脏归巢肽CRPPR。
本发明利用富含精氨酸的短肽CRPPR(Heart Homing Peptide,HHP)具有出色的心脏靶向性的特征,应用基因工程技术,将心脏靶向肽HHP标记在外泌体的表面,赋予外泌体心脏靶向功能。
优选的,采用基因工程的方法,将心脏归巢肽CRPPR克隆到外泌体表面膜蛋白LAMP2的胞外结构域。采用基因工程的方法,将心脏归巢肽CRPPR融合表达在外泌体表面膜蛋白LAMP2的胞外结构域,从而使CRPPR展示在外泌体表面。
优选的,将所述心脏归巢肽CRPPR编码基因克隆到LAMP2信号肽及成熟蛋白之间。即将所述心脏归巢肽CRPPR编码基因克隆到LAMP2第35位天冬氨酸和36位丝氨酸之间。
优选的,所述外泌体通过高表达HHP-LAMP2基因的细胞分泌而形成。或者所述外泌体由稳定高表达HHP-LAMP2基因的细胞分泌而形成。
优选的,所述外泌体来源于高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞。或者所述外泌体来源于稳定高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞。
所述高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞,是指经HHP-LAMP2慢病毒感染后的CDC细胞,其感染效率低于100%,感染后的细胞中包括大部分的HHP-LAMP2高表达的细胞以及部分不表达HHP-LAMP2的细胞。命名为:HHP-CDC细胞。
所述稳定高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞,是指用流式细胞术对HHP-LAMP2慢病毒感染后的CDC细胞进行分选,选择ZsGreen荧光蛋白高表达的细胞。pLVX-HHP-LAMP2是双顺反子质粒,同时表达ZsGreen绿色荧光蛋白和HHP-LAMP2蛋白。因此,分选后得到的细胞全部为高表达HHP-LAMP2的CDC细胞,不含有不表达HHP-LAMP2的细胞,命名为:HHP-CDC-FACS细胞。
优选的,所述高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞通过以下制备方法得到:
A,pLVX-HHP-LAMP2质粒的构建:
A1,获得心脏归巢肽CRPPR的编码基因;
A2,将所述心脏归巢肽CRPPR的编码基因克隆到LAMP2信号肽与成熟蛋白编码基因之间;得到含有心脏归巢肽DNA的HHP-LAMP2融合基因序列;
A3,将所述含有心脏归巢肽DNA的HHP-LAMP2融合基因克隆到pLVX-IRES-ZsGreen病毒载体上,得到pLVX-HHP-LAMP2质粒。
B,HHP-CDC细胞的建立:
B1,用pLVX-HHP-LAMP2、pMD2、pSPAX2质粒共转染HEK293T细胞,制备HHP-LAMP2慢病毒颗粒;
B2,用HHP-LAMP2慢病毒颗粒感染CDC细胞,得到所述高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞。
优选的,所述稳定高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞通过以下制备方法得到:
A,pLVX-HHP-LAMP2质粒的构建:
A1,获得心脏归巢肽CRPPR的编码基因;
A2,将所述心脏归巢肽CRPPR的编码基因克隆到LAMP2信号肽与成熟蛋白编码基因之间;得到含有心脏归巢肽DNA的HHP-LAMP2融合基因序列;
A3,将所述含有心脏归巢肽DNA的HHP-LAMP2融合基因克隆到pLVX-IRES-ZsGreen病毒载体上,得到pLVX-HHP-LAMP2质粒;
B,HHP-CDC-FACS细胞的建立:
B1,用pLVX-HHP-LAMP2、pMD2、pSPAX2质粒共转染HEK293T细胞,制备HHP-LAMP2慢病毒颗粒;
B2,用HHP-LAMP2慢病毒感染CDC细胞,然后用流式细胞术对HHP-LAMP2慢病毒感染后的CDC细胞进行分选,选择ZsGreen荧光蛋白高表达的细胞,得到所述稳定高表达HHP-LAMP2的CDC细胞。
优选的,所述外泌体内装载有心肌保护性miRNA、lncRNA、mRNA、DNA、功能性蛋白、脂质中的一种或几种。
本发明的上述外泌体在制备心脏靶向性药物中的应用。
本发明还提供一种上述外泌体的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞;或者制备稳定高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞;
(2)将高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞或者稳定高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞在无血清的IMDM培养基中进行培养,培养完成后,收集培养液;
(3)将步骤(2)收集到的培养液进行分离提纯,得到表面展示心脏归巢肽CRPPR的外泌体。
综上所述,由于采用了上述技术方案,本发明的有益效果是:
1、本发明的心脏靶向性基因工程外泌体,通过基因工程技术将心脏归巢肽CRPPR克隆到外泌体表面膜蛋白LAMP2的胞外结构域,使CRPPR展示在外泌体的表面,然后用HHP-LAMP2慢病毒感染人心肌球源性细胞(cardiosphere derived cells,CDC),则其分泌的外泌体(HHP-EXO)表面将标记有心脏归巢肽CRPPR。
2、在细胞和整体动物水平共同证实,与未经靶向肽标记的外泌体CDC-EXO相比,HHP-EXO外泌体具有更好的心脏驻留效果,约为CDC-EXO的2倍,并且在心肌细胞和心脏成纤维细胞均表现出更强的靶向富集效应。
3、本发明用流式细胞术对HHP-LAMP2慢病毒感染后的CDC细胞进行分选,建立了稳定高表达HHP-LAMP2的CDC细胞。克服了目前常规技术中,由于CDC细胞感染效率低于100%,所造成的靶向肽在HHP-EXO外泌体膜上的展示效率降低以及HHP-EXO外泌体的纯度降低的缺陷。稳定高表达的HHP-CDC细胞中不含有HHP-LAMP2阴性的细胞,因此后续传代扩增中不会造成HHP-LAMP2表达效率的改变,保证了靶向肽在外泌体膜上的展示效率以及靶向外泌体的纯度,从而保证了外泌体的心脏靶向效果和治疗效果。
4、在小鼠压力超负荷诱导的心肌肥厚模型证实,与未经靶向肽标记的外泌体CDC-EXO相比,心脏靶向性外泌体HHP-EXO具有更优秀的治疗效果。HHP-EXO比CDC-EXO具有更好的抑制小鼠心肌肥厚的作用。HHP-EXO比CDC-EXO具有更好的抑制小鼠动脉血压升高的作用。CDC-EXO对小鼠左心功能和肺水肿无改善作用,HHP-EXO能够有效的改善左心功能,并显著抑制肺水肿。CDC-EXO不能抑制小鼠心力衰竭,HHP-EXO能够有效抑制小鼠心力衰竭。HHP-EXO与CDC-EXO均能有效抑制心肌纤维化的发生。
5、本发明的心脏靶向基因工程外泌体可用于多种心肌保护性miRNA、siRNA、lncRNA、mRNA、DNA、功能性蛋白、化合物及药物等的心脏靶向运送,将为心脏靶向药物研发和心血管疾病的精准治疗提供新的思路和技术平台。
附图说明
图1是本发明的实施例1的HHP-EXO外泌体和对比例2的CDC-EXO外泌体的特征鉴定和对照图。图A、B为外泌体的透射电镜图;图C,D为外泌体的粒径检测结果;图E为外泌体的westernblot结果;图F为外泌体免疫共沉淀检测结果图。
图2是本发明的HHP-EXO外泌体和对比例2的CDC-EXO外泌体的心脏细胞靶向效果检测。图A为细胞摄取荧光标记外泌体检测结果;图B,C为心肌细胞摄取荧光标记外泌体的流式检测结果,n=3;D,E为心脏成纤维细胞摄取荧光标记外泌体的流式检测结果,n=3,*p<0.05,**p<0.01。
图3是本发明的实施例1的HHP-EXO外泌体和对比例2的CDC-EXO外泌体心脏靶向效果检测。图A为小鼠心脏荧光分布图;图B为小鼠心脏平均荧光强度统计图;图C为小鼠肝、肾、肺、脾荧光分布图;图D为小鼠各脏器平均荧光强度统计图,n=3,*p<0.05,**p<0.01。
图4是本发明的实施例1的HHP-EXO外泌体和实施例2的HHP-EXO-2外泌体抑制H9C2心肌细胞肥大的检测结果。图A为H9C2心肌细胞罗丹明-鬼笔环肽荧光染色结果;图B为H9C2心肌细胞westernblot检测结果;图C为H9C2心肌细胞表面积统计结果;图D为H9C2心肌细胞β-MHC蛋白质表达量统计结果;图C,D均为3次重复实验统计结果,n=3,*p<0.05,**p<0.01。
图5是本发明的实施例1的HHP-EXO外泌体和对比例2的CDC-EXO外泌体治疗后,小鼠心脏结构检测结果。图A为小鼠心脏整体结构图;图B为小鼠心脏切片HE染色结果;图C为小鼠心脏重量/体重统计结果;图D为小鼠心脏重量/胫骨长度统计结果,SHAM组n=10,PBS组n=12,CDC-EXO组n=12,HHP-EXO组n=12,*p<0.05,**p<0.01。
图6是本发明的实施例1的HHP-EXO外泌体和对比例2的CDC-EXO外泌体治疗后,小鼠心脏结构及功能超声检测结果。图A为小鼠超声心动图;图B为LVAW,d左心室前壁舒张末期厚度;图C为LVAW,s左心室前壁收缩末期厚度;图D为LVD,s左心室收缩末期内径;图E为LVPW,d左心室后壁舒张末期厚度;图F为LVPW,s左心室后壁收缩末期厚度;图G为LVV,s左心室收缩末期容积;图H为LVEF左心室射血分数;图I为LVFS左心室缩短分数;图J为左心室质量,SHAM组n=10,PBS组n=12,CDC-EXO组n=12,HHP-EXO组n=12,与SHAM组比较*p<0.05,**p<0.01,与PBS组比较#p<0.05,##p<0.01。
图7是本发明的实施例1的HHP-EXO外泌体和对比例2的CDC-EXO外泌体治疗后,小鼠心脏纤维化检测结果。图A为小鼠心脏切片Masson染色结果;图B为小鼠心肌血管周围Masson染色结果;图C为小鼠心肌组织间Masson染色结果;图D为小鼠心肌血管周围天狼猩红染色结果;图E为小鼠心肌组织间天狼猩红染色结果。
图8是本发明的实施例1的HHP-EXO外泌体和对比例2的CDC-EXO外泌体治疗后,小鼠动脉压及心衰相关指标检测结果。图A为小鼠平均动脉压统计结果;图B为小鼠血清AngII含量ELISA统计结果;图C为小鼠血清NT-proBNP含量ELISA统计结果;图D为小鼠肺湿重/干重统计结果;图E为小鼠肾重/体重统计结果;图F为小鼠血清肌酐含量ELISA统计结果,SHAM组n=10,PBS组n=12,CDC-EXO组n=12,HHP-EXO组n=12,*p<0.05,**p<0.01。
图9是本发明的实施例1的HHP-EXO外泌体和对比例2的CDC-EXO外泌体抑制心肌细胞肥大的检测结果。图A为心肌细胞FITC-鬼笔环肽荧光染色结果;图B为心肌细胞westernblot检测结果;图C为心肌细胞BNP蛋白质含量统计结果;图D为心肌细胞β-MHC蛋白质含量统计结果;图E为心肌细胞表面积统计结果;图C,D,E均为4次重复实验n=4,*p<0.05,**p<0.01。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实验动物
实验用小鼠、大鼠均采购于上海斯莱克实验动物有限公司,饲养在厦门大学附属心血管病医院SPF动物房,动物房光照循环为:12小时光照/12小时黑暗,环境温度23摄氏度,环境湿度40%-60%。
C57BL/6小鼠,6周龄,雄性,体重约22g。新采购的小鼠在动物房中自由采食、充足饮水的饲养条件下适应2周后,进行实验。繁殖用SD大鼠,7-8周龄,体重约250g,每笼饲养3只大鼠(2雌:1雄),自由饮食、充足饮水,新生乳鼠于出生后48小时内取出,用于细胞分离实验。
细胞分离及培养
人胚肾细胞(HEK293T)
细胞培养:人胚肾细胞(HEK293T)购自于中国科学院上海细胞库,培养基配方:DMEM培养基,含10%FBS,50U/ml Penicillin,50μg/ml Streptomycin。培养条件,含5%CO2的37摄氏度恒温细胞培养箱。
细胞传代:HEK293T细胞接种于10cm培养皿中,生长至密度约90%后,在生物安全柜中,吸掉培养基,用37摄氏度预热的PBS缓冲液润洗细胞2次,吸掉PBS,加入37摄氏度预热的0.25%的胰酶1ml,室温放置约1min,在显微镜下观察,当轻轻晃动培养皿后,细胞大面积脱落时,加入2ml含10%FBS的DMEM培养基终止消化,用移液器轻柔的将细胞吹打分散后,转移到15ml离心管中,800rpm室温离心3min,弃上清,沉淀中加入5ml含10%FBS的DMEM培养基,计数,按照后续实验的需求接种到培养皿中。
细胞冻存:冻存液配方,DMEM:FBS:DMSO=7:2:1,细胞在10cm培养皿中生长至密度约90%后,用胰蛋白酶按照上述步骤进行消化、离心,沉淀中加入2ml冻存液,轻柔吹打混匀,分装到冻存管中,密封管口,标记细胞名称、代数及冻存时间,放入程序降温盒中,放置-80摄氏度冰箱过夜,次日取出,转移到液氮罐中长期保存。
细胞复苏:细胞从液氮罐中取出后,匀速在37摄氏度水浴中,“十”字型摇晃解冻,将细胞悬液转移到预先装有2ml DMEM完全培养基的15ml离心管中,800rpm室温离心3min,弃上清,沉淀中加入5ml DMEM完全培养基,接种到10cm培养皿中,补足培养基至10ml,轻柔晃动使细胞在培养皿中分散均匀,放置于细胞培养箱中培养。
人心肌球源性细胞(cardiosphere-derived cells,CDC)
本发明使用的人心肌组织来源于厦门大学附属心血管病医院先天性心脏病患儿(0~5岁)手术切除的右心耳组织。本发明所有实验方案获得了厦门大学医学院实验伦理委员会的批准。
手术切除的心肌组织及时置于预冷的氧饱和无钙心脏停搏液中,立刻运送到实验室。
用75%消毒酒精对装有心肌的离心管进行无菌处理,在生物安全柜中打开管盖,将心肌组织转移到无菌小烧杯中,用无钙心脏停搏液反复冲洗,去除组织上粘附的脂肪、血凝块等。
将冲洗干净的心肌组织转移到另一个无菌小烧杯中,用眼科剪将组织剪成1mm×1mm×1mm的小块。
用预冷的DPBS(含1%的青霉素-链霉素)冲洗组织块至液体澄清,将组织悬液转移至15ml离心管中,室温1000rpm离心3分钟,弃上清,随后加入3~5ml的Ⅱ型胶原酶(1mg/ml)和胰酶(1:25)的等体积混合液,37℃水浴锅中摇动消化15min。
心肌组织悬液1000rpm离心3分钟,弃上清,组织中加入5ml IMDM完全培养基,用滴管轻轻吹打组织碎块,接种到6cm细胞培养皿中,放置在37摄氏度含5%CO2的细胞培养箱。
细胞贴壁培养约一周左右,更换培养基,继续培养至细胞汇合度约80%,胰酶消化、传代、冻存。
原代新生大鼠心肌细胞
分离心室。新生大鼠在出生后48h内取出,在75%酒精中润洗消毒后拿到超净台中,左手捏住乳鼠背部皮肤,右手用眼科剪在左胸腔处剪一切口暴露心脏,用眼科弯镊取下心脏,置于预冷的PBS中,剪掉心耳,将心室组织转移到装有预冷PBS的小烧杯中。
胶原酶消化。心肌组织置于无菌小烧杯中,用眼科剪剪成约1mm×1mm×1mm的小块,用PBS润洗2次,吸干PBS,组织中加入5ml II型胶原酶(1mg/ml)。组织悬液转移到15ml无菌离心管中,置于37摄氏度水浴锅中,摇动消化10min,用无菌吸管将上清液转移到新的离心管中,加入等体积含10%FBS的DMEM培养基终止消化。
Accutase酶多次消化。未消化完的心肌组织中加入3mlAccutase酶,继续在37摄氏度水浴锅中,摇动消化10min,将上清液转移到新的离心管中,加入等体积含10%FBS的DMEM培养基终止消化,心肌组织中再次加入3mlAccutase酶,重复消化约5-7次后,心肌组织明显变少,上清液澄清,此时终止消化。
细胞离心过滤。将上述胶原酶和Accutase酶多次消化后收集的细胞悬液用100μm孔径的无菌滤网过滤,除去组织块和较大的细胞团块,然后1000rpm室温离心10min,弃上清,细胞沉淀重悬于DMEM培养基(20%FBS、1%Brdu、1%P/S)。
差速贴壁。根据心脏成纤维细胞贴壁快,心肌细胞贴壁较慢的原则,分离两种细胞。细胞悬液接种于10cm培养皿,放在含5%CO2的37摄氏度培养箱静置2h后,轻轻摇晃培养皿数次,贴壁细胞为心脏成纤维细胞,细胞悬液为心肌细胞,转移到新的离心管中待用。
心肌细胞培养。心肌细胞悬液经细胞计数后接种在6孔板中,继续培养24小时后,轻轻晃动培养皿,吸掉培养基,再加入新鲜的DMEM培养基(20%FBS、1%Brdu、1%P/S),继续培养24h后,用于后续实验的给药处理。
原代新生大鼠心脏成纤维细胞
按照“原代新生大鼠心肌细胞分离”方法操作至“差速贴壁”步骤,然后按照如下步骤进行:用预热的PBS冲洗皿底贴壁的成纤维细胞2-3次,洗掉贴壁不牢的心肌细胞,皿中加入含10%FBS、1%P/S的DMEM/F12培养基,继续培养约24-48h,细胞密度达到90%后,用胰蛋白酶消化、细胞计数,接种到6孔板中用于后续实验。
大鼠H9C2心肌细胞
大鼠H9C2心肌细胞购自于中国科学院上海细胞库,细胞培养、传代、冻存等操作与HEK293T细胞相同。
实施例1
外泌体HHP-EXO的制备
1)制备高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞;
A,pLVX-HHP-LAMP2质粒的构建:
A1,获得心脏归巢肽CRPPR的编码基因;
A2,将所述心脏归巢肽CRPPR的编码基因克隆到LAMP2信号肽与成熟蛋白编码基因之间;得到含有心脏归巢肽DNA的HHP-LAMP2融合基因序列;
用重叠延伸PCR(overlap PCR)分别将FLAG tag(DYKDDDDK)、心脏归巢肽CRPPR(Heart homing peptide,HHP)编码基因克隆到LAMP2第35位天冬氨酸和36位丝氨酸之间,引物序列见表1。
表1重叠延伸PCR引物序列
具体为,
以人胚肾细胞HEK293细胞cDNA为模版,用LAMP Up上游引物(含XhoI酶切位点)和LAMP Dn下游引物(含BamHI酶切位点)PCR扩增LAMP2编码基因;
以LAMP2 DNA为模版,用LAMP Up和HHP Dn引物PCR扩增HHP-LAMP25’端片段,用HHPUp和LAMP Dn引物PCR扩增HHP-LAMP23’端片段;
HHP-LAMP25’端片段和HHP-LAMP23’端片段分别进行琼脂糖凝胶电泳及胶回收纯化;
以HHP-LAMP25’端片段和HHP-LAMP23’端片段为模版,用LAMP Up和LAMP Dn引物,PCR扩增完整的HHP-LAMP2编码基因;
A3,将所述含有心脏归巢肽DNA的HHP-LAMP2融合基因克隆到pLVX-IRES-ZsGreen病毒载体上,得到pLVX-HHP-LAMP2质粒。
HHP-LAMP2 DNA和pLVX-IRES-ZsGreen经过XhoI和BamHI双酶切后,用T4 DNA连接酶连接,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆,即为心脏归巢肽重组质粒pLVX-HHP-LAMP2。
B,HHP-CDC细胞的建立:
用pLVX-HHP-LAMP2慢病毒感染CDC细胞,得到高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞(HHP-CDC细胞)。具体为:
慢病毒包装及感染包括如下步骤:
(1)细胞接种:接种0.8×106个HEK293T细胞在6cm培养皿中,培养过夜;
(2)制备脂质体稀释液:次日取15μl Lipofectamine 3000加入到375μl Opti-MEM培养基中混匀;
(3)制备DNA稀释液:取3ugpLVX-HHP-LAMP2、3ug pMD2.G、3ug pSPAX2质粒与18μlP3000混合,加入到375μl Opti-MEM培养基中混匀;
(4)制备DNA-脂质体混合液:取等体积的DNA稀释液加入到脂质体稀释液中混匀,室温静置5min;
(5)DNA-脂质体混合液滴加到HEK293T细胞中,轻柔混匀,细胞置于含的37摄氏度5%CO2培养箱中,12h后更换为含10%FBS的DMEM培养基;
(6)细胞转染48h后,将培养基转移到无菌的15ml离心管中,1800rpm室温离心10min;
(7)上清液用0.45μl无菌滤器过滤后即为pLVX-HHP-LAMP2慢病毒悬液。如果1周内感染目的细胞,可将慢病毒悬液置于4摄氏度冰箱保存,若长期保存,可分装后保存于-80摄氏度冰箱。
(8)CDC细胞接种于6孔板中(0.3×106/孔),培养过夜;
(9)次日取1ml pLVX-HHP-LAMP2慢病毒悬液与1ml IMDM完全培养基混合,加入Polybrane(终浓度8ug/ml),轻柔加入到CDC细胞中;
(10)细胞培养24h后,更换为含IMDM完全培养基,继续培养24-48h,用荧光显微镜观察感染效率。
2)稳定高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞的建立
CDC细胞经HHP-LAMP2慢病毒感染48-72h后,用流式细胞术分选ZsGreen绿色荧光蛋白表达阳性的细胞,继续扩大培养,得到稳定高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞,即HHP-CDC-FACS细胞。
3)外泌体分离纯化
(1)将稳定高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞(HHP-CDC-FACS细胞)接种于10cm培养皿中,加入含IMDM完全培养基,置于37摄氏度CO2培养箱中培养;
(2)细胞汇合度达90%后,更换为无血清的IMDM培养基,继续培养1周,收集上清;
(3)取100ml细胞上清液,于4摄氏度2000g离心10min;
(4)取上清,于4摄氏度10000g离心30min;
(5)取上清,于4摄氏度,120000g离心90min,弃上清;
(6)沉淀溶于预冷的PBS,于4摄氏度,120000g离心90min,弃上清;
(7)沉淀重悬于1ml预冷的PBS,即为外泌体悬液(HHP-EXO);
(8)外泌体悬液经BCA蛋白质浓度检测试剂盒定量后,用于后续实验或分装保存于-80摄氏度冰箱。
实施例2
外泌体HHP-EXO-2的制备
1)制备高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞,方案与实施例1相同。得到高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞后,不进行流式细胞术分选,直接得到高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞(HHP-CDC细胞)。
2)外泌体分离纯化,与实施例1中外泌体分离纯化方法不同之处在于,步骤(1)中,将高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞接种于10cm培养皿中,加入含IMDM完全培养基,置于37摄氏度CO2培养箱中培养;步骤(2)-(8)与实施例1相同。
对比例1
按照实施例1中的方法,将FLAG tag插入到LAMP2第35位天冬氨酸和36位丝氨酸之间,构建重组质粒pLVX-FLAG-LAMP2,包装FLAG-LAMP2慢病毒,感染CDC细胞,建立FLAG-LAMP2高表达的CDC细胞,提取外泌体,即得到FLAG-EXO。用免疫共沉淀进行检测。
用CD63抗体捕获外泌体进行免疫共沉淀检测。外泌体FLAG-EXO与偶联CD63抗体的琼脂糖凝胶4摄氏度共孵育过夜,琼脂糖凝胶经PBS洗脱,用FLAG抗体进行Westernblot检测。结果显示,CD63抗体捕获的外泌体能够检测到清晰的FLAG-LAMP2蛋白条带(图1F下图),证明外泌体融合表达了FLAG。
用FLAG抗体捕获外泌体进行免疫共沉淀检测。将外泌体FLAG-EXO与偶联FLAG抗体的琼脂糖凝胶Anti-FLAG Gel(SigmaA2220)置于4摄氏度共孵育过夜,次日,琼脂糖凝胶经PBS洗脱后,用Westernblot检测外泌体标志性蛋白CD63的表达。结果显示,Anti-FLAG凝胶复合物中能够检测到清晰的CD63条带(图1F上图)。表明,Anti-FLAG抗体能够捕获外泌体,证明FLAG肽分布在外泌体的表面。
上述结果充分证实,pLVX-FLAG-LAMP2质粒高表达的CDC细胞来源的外泌体FLAG-EXO中,FLAG Tag展示在外泌体的表面。实施例1中,心脏归巢肽HHP与FLAG Tag的插入位置完全相同,即LAMP2第35位天冬氨酸和36位丝氨酸之间,并且慢病毒包装、CDC细胞感染和外泌体提取的方法也完全相同。因此,我们可以依此类推,HHP也能够完整的展示在外泌体HHP-EXO的表面。
对比例2
按照实施例1中的外泌体分离纯化方法,构建质粒pLVX-LAMP2,包装慢病毒,感染CDC细胞,建立LAMP2高表达的CDC细胞,提取外泌体,即得到不含HHP的外泌体,CDC-EXO。
分别将HHP-EXO和CDC-EXO外泌体用CM-Dil荧光探针进行标记,并与心肌细胞、心脏成纤维细胞共孵育,检测其靶向效果。流式细胞术和激光共聚焦检测结果显示,加入HHP-EXO-Dil的心肌细胞平均荧光强度显著高于CDC-EXO-Dil(图2A,B,C),并且加入HHP-EXO-Dil的心脏成纤维细胞平均荧光强度也显著高于CDC-EXO-Dil(图2D,E)。表明,CRPPR靶向肽显著增强了外泌体与心肌细胞及心脏成纤维细胞的结合能力,初步证明了HHP-EXO具有心脏靶向功能。
为了研究HHP-EXO外泌体在整体动物水平的靶向效果,本发明将CM-Dil荧光标记的HHP-EXO和CDC-EXO经尾静脉注射到小鼠体内,剂量为2.5mg/kg,48h后,用小动物活体成像系统(IVIS)检测心脏荧光强度。IVIS结果显示,HHP-EXO组小鼠心脏荧光强度显著高于CDC-EXO对照组(5.29×105±0.13×105,n=3vs 2.42×105±0.13×105,n=3;图3A,B),两组小鼠肝、肺、肾、脾组织的荧光强度无显著差异(图3C,D),充分说明HHP-EXO具有显著的心脏选择性,能够在心肌组织中靶向富集。
试验例1、实施例1与实施例2的外泌体抑制心肌细胞肥大的效果比较
本发明用基因工程方法将HHP-LAMP2融合基因在CDC细胞高表达,膜上高表达的HHP-LAMP2融合蛋白将伴随着细胞膜的两次连续内陷,展示到外泌体膜上。因此,HHP-LAMP2融合基因在CDC细胞中的表达效率直接影响靶向肽在HHP-EXO外泌体膜上的展示效率以及HHP-EXO外泌体的纯度,进而影响HHP-EXO外泌体的心脏靶向效率,最终影响治疗效果。
本发明复制了Ang II诱导的H9C2心肌细胞肥大模型,研究不同转染效率的HHP-CDC细胞产生的外泌体治疗效果的差异。
H9C2心肌细胞培养基中分别加入1μMAng II和不同的外泌体,37摄氏度5%CO2培养箱中培养48h,用于蛋白提取或细胞面积检测,分组如下。
(1)CON组:对照组,10%FBS DMEM培养基中不添加Ang II。
(2)Ang II组:10%FBS DMEM中加入1μMAng II、与外泌体等体积的PBS。
(3)HHP-EXO-2组:10%FBS DMEM中加入1μM Ang II和50μg/ml的CDC-EXO-2。
(4)HHP-EXO组:10%FBS DMEM中加入1μMAng II和50μg/ml的HHP-EXO。
细胞检测结果显示,与对照组相比,Ang II组心肌细胞面积增大了2.78倍,具有统计学意义。与Ang II组相比,HHP-EXO-2组心肌细胞增大的现象明显减弱,HHP-EXO-2组细胞面积约为对照组的2.07倍。HHP-EXO组心肌细胞面积显著低于Ang II组和HHP-EXO-2组。HHP-EXO组细胞面积为对照组的1.36倍,与对照组细胞无统计学差异(图4A,C)。
免疫印迹结果显示,与对照组相比,Ang II组心肌细胞β-MHC蛋白质含量增加了2.64倍。HHP-EXO-2组心肌细胞β-MHC蛋白质含量与对照组相比增加了1.72倍,上调幅度显著低于Ang II组,差异有统计学意义。HHP-EXO组心肌细胞β-MHC蛋白质含量与对照组无差异,显著低于Ang II组和HHP-EXO-2组(图4B,D)。
上述结果表明,H9C2心肌细胞在AngII诱导下,细胞面积明显增大,细胞β-MHC蛋白质表达水平显著上调,HHP-EXO-2、HHP-EXO两种外泌体均能够显著抑制AngII诱导的心肌细胞增大,并下调β-MHC蛋白质的表达,并且HHP-EXO比HHP-EXO-2具有更好的效果。
HHP-LAMP2高表达的CDC细胞至少需要进行连续3次以上的传代扩增,才能获得足够数量的细胞和培养基,用于后续的动物实验。实施例2中,按照目前常规的技术手段,HHP-LAMP2慢病毒感染CDC细胞后,感染效率并不能达到100%。在随后的传代扩增中,不表达HHP-LAMP2的细胞会大量繁殖。因此,最终产生的外泌体中将混有大量的不含有HHP靶向肽的外泌体,这将造成靶向肽在HHP-EXO外泌体膜上的展示效率降低,以及靶向外泌体纯度降低,最终影响治疗效果。
为了解决这一问题,本发明实施例1用流式细胞术对HHP-LAMP2慢病毒感染后的CDC细胞进行分选,选择ZsGreen荧光蛋白高表达的细胞,建立稳定高表达HHP-LAMP2的CDC细胞,即HHP-CDC-FACS细胞。HHP-CDC-FACS细胞中不含有HHP-LAMP2阴性的细胞,因此后续传代扩增中不会造成HHP-LAMP2表达效率的改变,从而保证了靶向外泌体的纯度以及后续的治疗效果。实验结果证实,实施例1中的外泌体比实施例2中的外泌体具有更好的治疗效果。
试验例2、HHP-EXO抑制TAC小鼠心肌肥厚
本发明采用主动脉缩窄法(TransverseAortic Constriction,TAC)复制小鼠心肌肥厚模型。小鼠经异弗烷麻醉,用75%酒精消毒颈部及前胸皮肤,在颈部剪开约1cm的切口,钝性分离皮下组织,暴露气管,钝性分离气管周围筋膜、肌肉。手持弯镊提起锁骨上的肌肉,另一支弯镊闭合后深入到气管与胸骨之间,张开镊子将胸腔撑开,将剪刀尖端深入到被撑开的胸腔内,剪开胸骨并固定,暴露出左颈总动脉及头臂干。在左颈总动脉和头臂干交叉处,小心钝性分离胸腺,暴露出主动脉弓,将6-0丝线穿过主动脉弓,将主动脉弓与27G垫针一起结扎,结扎后小心取下垫针。用5-0缝合线将肌肉缝合,再将皮肤缝合,用碘伏消毒创面。小鼠脱离麻醉机,置于37摄氏度恒温垫上苏醒。
在术后第3天,小鼠经小动物超声成像系统Vevo2100检测主动脉弓血流速度,剔除模型不成功的小鼠。小鼠分别在TAC术前3天,术后第7天、14天、21天、28天、42天,用小动物超声成像系统检测小鼠心脏功能。小鼠经异弗烷诱导麻醉,控制心率在450-500次/分钟,用MS-550探头分别在B模式和M模式下记录小鼠左心室长轴及短轴超声心动图。用LVTrace工具包描记左心室前/后壁的心内/外膜轨迹,连续描记3个心动周期。分析小鼠舒张期和收缩期的左心室前壁厚度(LVAWd,LVAWs),左心室后壁厚度(LVPWd,LVPWs),左心室内径(LVDd,LVDs),左室容积(LVVd,LVVs),室间隔厚度(IVSd,IVSs),左室射血分数(LVEF),左室缩短分数(LVFS)。
术后第8天经尾静脉注射CDC-EXO、HHP-EXO及等体积PBS,术后第6周取材。结果显示,TAC模型6周后,PBS组小鼠心脏明显变大,心脏重量/体重、心脏重量/胫骨长度均显著高于SHAM组,具有统计学意义(图5A,C,D),表明PBS组小鼠发生了显著的心肌肥厚。CDC-EXO组小鼠心脏重量/体重、心脏重量/胫骨长度均低于PBS组,未达到显著性差异,HHP-EXO组小鼠心脏重量/体重、心脏重量/胫骨长度均显著低于PBS组,具有统计学意义(图5A,C,D)。HE染色结果显示,与SHAM组相比,PBS组小鼠左心室壁显著增厚,CDC-EXO组左心室壁厚度略低于PBS组,并且HHP-EXO组左心室壁厚度低于CDC-EXO、PBS两组(图5B)。
本发明分别在手术前及术后第7天、14天、21天、28天、42天,通过超声心动图检测小鼠心脏结构及功能变化。结果显示,在术后第7天,注射外泌体前,小鼠左心室前壁厚度、左心室内径及左心室容积在各组小鼠间均无显著性差异,HHP-EXO、CDC-EXO、PBS三组小鼠左心室后壁厚度均高于SHAM组,并且HHP-EXO、CDC-EXO、PBS三组间无显著性差异。在术后第14天,HHP-EXO组、SHAM组小鼠左心室前壁厚度无显著性差异,PBS组、CDC-EXO两组左心室前壁厚度均显著高于HHP-EXO、SHAM两组,HHP-EXO、CDC-EXO、PBS三组小鼠左心室后壁厚度均显著高于SHAM组。在术后第21天,HHP-EXO组与SHAM组小鼠左心室前壁厚度无显著性差异,PBS组及CDC-EXO组左心室前壁厚度均显著高于HHP-EXO、SHAM两组,HHP-EXO、CDC-EXO、PBS三组小鼠左心室后壁厚度均显著高于SHAM组。在术后第28天,小鼠左心室前壁厚度依次为:PBS组>CDC-EXO组>HHP-EXO组>SHAM组,其中HHP-EXO与SHAM两组间的差异无统计学意义,其余各组间均具有显著性差异,CDC-EXO组小鼠左心室后壁厚度呈现出PBS组>CDC-EXO组>HHP-EXO组的趋势,无统计学意义。在术后第42天,CDC-EXO组小鼠左心室前壁厚度及左心室后壁厚度均略低于PBS组,无统计学意义,HHP-EXO组则明显低于PBS组,差异具有统计学意义(图6)。
综合以上数据,在TAC术后第7天,即注射外泌体之前,HHP-EXO、CDC-EXO、PBS三组小鼠的左心室前壁及后壁厚度均无明显差异,三组小鼠的左心室前壁厚度与SHAM组无差异,三组小鼠的左心室后壁厚度均高于SHAM组。TAC手术7天后,三组小鼠左心室室壁厚度呈现出不同程度的增长趋势,CDC-EXO组小鼠左心室壁厚度,在术后第28天,显著性低于PBS组,其余时间点,两组无显著差异。在术后第14天到第28天,HHP-EXO组小鼠左心室前壁厚度均显著低于CDC-EXO、PBS两组,具有统计学意义,左心室后壁厚度差异不显著。在术后第42天,HHP-EXO组小鼠左心室前壁和后壁厚度均显著低于PBS两组,具有统计学意义。由此表明,CDC-EXO外泌体抑制小鼠心肌肥厚的作用有限,HHP-EXO外泌体比CDC-EXO外泌体表现出更加出色的抑制小鼠心肌肥厚的作用。
表2小鼠心脏重量检测
试验例3、HHP-EXO抑制TAC小鼠心肌纤维化
本发明通过Masson染色及天狼猩红染色检测心肌组织中的胶原含量,以反映心肌纤维化情况。结果显示,PBS组小鼠在血管周围及心肌间质区均呈现明显的胶原沉积,而HHP-EXO、CDC-EXO两组小鼠在血管周围及心肌间质均未见明显的胶原沉积(图7),由此表明,HHP-EXO、CDC-EXO两种外泌体均能有效抑制TAC小鼠心肌纤维化的发生。
试验例4、HHP-EXO调控TAC小鼠动脉血压
血压升高是心脏压力超负荷的重要病理变化之一,本发明用导管法检测小鼠的颈动脉压,用ELISA检测小鼠血清中血管紧张素2(Angiotension II,Ang II)的浓度。结果显示,与SHAM组相比,PBS组小鼠平均动脉压显著升高,具有统计学意义。CDC-EXO组小鼠平均动脉压略低于PBS组,无统计学意义。HHP-EXO组小鼠平均动脉压显著低于PBS组,具有统计学意义(SHAM 89.6500±3.0040mmHg,PBS 116.9000±4.7590mmHg,CDC-EXO 103.4000±3.0550mmHg,HHP-EXO 94.3800±4.8710mmHg,图8A)。ELISA结果显示,PBS组小鼠血清AngII含量显著高于SHAM组,具有统计学意义,CDC-EXO组与HHP-EXO组均显著低于PBS组,具有统计学意义,并且HHP-EXO组血清AngII浓度更低于CDC-EXO组(SHAM 196.1000±17.9300pg/ml,PBS 280.9000±12.5300pg/ml,CDC-EXO 223.4000±18.5300pg/ml,HHP-EXO 190.6000±13.0000pg/ml,图8B)。
由此表明,TAC小鼠颈动脉压及血清AngII浓度均明显升高,CDC-EXO外泌体对小鼠动脉血压的调控作用有限,对血清AngII浓度具有一定的调控作用,HHP-EXO外泌体能够显著降低TAC小鼠颈动脉压,显著降低小鼠血清AngII浓度,HHP-EXO外泌体比CDC-EXO外泌体具有更加出色的抑制TAC小鼠动脉压及血清AngII浓度升高的作用。
试验例5、HHP-EXO缓解TAC小鼠心力衰竭
小鼠主动脉缩窄将使左心室负荷增高,进而导致肺循环压力增高,发生肺水肿。本发明用“肺湿重/肺干重”来表示肺含水量,结果显示,PBS组小鼠肺含水量显著高于SHAM组,CDC-EXO组与PBS组无显著差异,HHP-EXO组肺含水量均显著低于CDC-EXO组及PBS组(图8D)。由此表明,HHP-EXO外泌体可以有效的抑制TAC引起的肺水肿。血清B型脑钠肽(BrainNatriuretic Peptide,BNP)含量是心力衰竭的重要指标,本发明通过ELISA检测了血清中NT-proBNP的含量,结果显示,PBS组NT-proBNP的含量显著高于SHAM组,CDC-EXO组低于PBS组,无统计学意义,HHP-EXO组显著低于PBS组(图8C),有统计学意义。
超声心动图结果显示,TAC手术后第7天,即外泌体注射前,HHP-EXO、CDC-EXO、PBS三组小鼠左心室射血分数(LVEF)无差异。外泌体治疗后,即术后第7天至第42天,CDC-EXO和PBS治疗组小鼠LVEF持续下降,HHP-EXO治疗组小鼠LVEF维持稳定。术后第42天,HHP-EXO治疗组小鼠LVEF显著高于CDC-EXO治疗组和PBS治疗组(SHAM 53.2659%±1.0218%;PBS36.3783%±1.7518%;CDC-EXO 36.2384%±1.3736%;HHP-EXO 43.2593%±2.1622%,图6H)。由此表明,CDC-EXO不能改善压力负荷诱导的小鼠心功能损伤,HHP-EXO对压力负荷诱导的小鼠心功能损伤具有很好的治疗作用。
上述试验数据证明,PBS组小鼠左心室射血分数从术前的55.2511%持续下降至36.3783%,并且肺含水量显著增加,血清NT-proBNP浓度显著升高,发生了心力衰竭。CDC-EXO外泌体对TAC小鼠左心室射血功能、肺含水量及血清NT-proBNP浓度均无明显的改善作用,对小鼠心力衰竭无治疗作用。HHP-EXO外泌体能有效的改善TAC小鼠的左心室射血功能,并且能显著的降低TAC小鼠的肺含水量及血清NT-proBNP含量,有效抑制了TAC小鼠心力衰竭的发生。
试验例6、外泌体抑制AngII诱导的心肌细胞肥大
本发明复制了Ang II诱导心肌细胞肥大模型,分4组。原代乳鼠心肌细胞贴壁培养48h后,将培养基更换为含1μM Ang II和不同外泌体的DMEM培养基,37摄氏度5%CO2培养箱中培养48h,PBS清洗细胞2次,用于蛋白提取或细胞面积检测。
(1)CON组:对照组,10%FBS DMEM培养基中不添加Ang II。
(2)PBS组:10%FBS DMEM中加入1μMAng II、与外泌体等体积的PBS。
(3)CDC-EXO组:10%FBS DMEM中加入1μMAng II、50μg/ml的CDC-EXO。
(4)HHP-EXO组:10%FBS DMEM中加入1μMAng II、50μg/ml的HHP-EXO。
FITC-鬼笔环肽染色测量心肌细胞面积
(1)心肌细胞用PBS清洗2次,4%多聚甲醛室温固定10min,PBS清洗2次,每次5min。
(2)细胞用丙酮(≤-20℃)室温脱水处理5min,PBS清洗2次,每次5min。
(3)细胞上滴加200μl FITC-鬼笔环肽工作液(100nM),室温避光孵育30min,PBS清洗2次,每次5min。
(4)细胞爬片上滴加200μl DAPI溶液(100nM),室温避光静置1min,PBS清洗2次。
(5)在载玻片上滴一滴放荧光淬灭封片剂,将细胞爬片倒置在封片剂上,用透明指甲油永久封片。
(6)用TissueFAXS全景扫描系统拍照,FITC激发/发射滤片(Ex/Em=495/516nm),DAPI激发/发射滤片(Ex/Em=364/454nm)。
细胞检测结果显示,PBS组心肌细胞与1μM AngII共培养48h后,细胞明显增大,细胞面积约为对照组的1.9倍,具有统计学意义。CDC-EXO组心肌细胞增大的现象明显减弱,面积约为对照组的1.38倍,显著低于PBS组,差异具有统计学意义。HHP-EXO组心肌细胞未发现增大,细胞面积为对照组的1.07倍,与对照组细胞无差异,同时显著低于PBS组及CDC-EXO组(图9A,E),差异具有统计学意义。
免疫印迹结果显示,与对照组相比,PBS组心肌细胞在AngII的诱导下,β-MHC蛋白质含量增加了2.10倍。CDC-EXO组心肌细胞β-MHC蛋白质含量与对照组相比增加了1.39倍,上调幅度显著低于PBS组,差异有统计学意义。HHP-EXO组心肌细胞β-MHC蛋白质含量与对照组无差异,显著低于PBS组。与对照组相比,PBS组心肌细胞BNP蛋白质表达量增加了1.94倍。CDC-EXO组心肌细胞BNP蛋白质表达量与对照组相比增加了1.47倍,上调幅度低于PBS组。HHP-EXO组心肌细胞BNP蛋白质表达量与对照组无差异,显著低于PBS组和CDC-EXO组(图9B,C,D)。上述结果表明,心肌细胞在AngII诱导下,细胞面积明显增大,细胞β-MHC、BNP蛋白质表达水平显著上调,CDC-EXO、HHP-EXO两种外泌体均能够显著抑制AngII诱导的心肌细胞增大,并下调β-MHC、BNP蛋白质的表达,并且HHP-EXO比CDC-EXO具有更好的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tatgctcgag tgcggggtca tggtgtgct 29
<210> 2
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atctggatcc ttacagagtc tgatatccag 30
<210> 3
<211> 62
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tgccgacctc cgcgtcgccg acggcgtcga cgccggcgac gctcagaaaa tgccacttgc 60
ct 62
<210> 4
<211> 62
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gcgtcgccgg cgtcgacgcc gtcggcgacg cggaggtcgg caatctgtca aattaagttc 60
ca 62
<210> 5
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gattacaagg atgacgatga caagtcagaa aatgccactt gcct 44
<210> 6
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cttgtcatcg tcatccttgt aatcatctgt caaattaagt tcca 44
Claims (10)
1.一种外泌体,其特征在于,所述外泌体表面展示心脏归巢肽CRPPR。
2.根据权利要求1所述的外泌体,其特征在于,采用基因工程的方法,将心脏归巢肽CRPPR克隆到外泌体表面膜蛋白LAMP2的胞外结构域。
3.根据权利要求2所述的外泌体,其特征在于,将所述心脏归巢肽CRPPR编码基因克隆到LAMP2信号肽与成熟蛋白之间。
4.根据权利要求1所述的外泌体,其特征在于,所述外泌体由高表达HHP-LAMP2基因的细胞分泌而形成;或者所述外泌体由稳定高表达HHP-LAMP2基因的细胞分泌而形成。
5.根据权利要求4所述的外泌体,其特征在于,所述外泌体来源于高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞;或者所述外泌体来源于稳定高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞。
6.根据权利要求5所述的外泌体,其特征在于,所述高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞通过以下制备方法得到:
A,pLVX-HHP-LAMP2质粒的构建:
A1,获得心脏归巢肽CRPPR的编码基因;
A2,将所述心脏归巢肽CRPPR的编码基因克隆到LAMP2信号肽与成熟蛋白编码基因之间;得到含有心脏归巢肽DNA的HHP-LAMP2融合基因序列;
A3,将所述含有心脏归巢肽DNA的HHP-LAMP2融合基因克隆到pLVX-IRES-ZsGreen病毒载体上,得到pLVX-HHP-LAMP2质粒;
B,HHP-CDC细胞的建立:
B1,用pLVX-HHP-LAMP2、pMD2、pSPAX2质粒共转染HEK293T细胞,制备HHP-LAMP2慢病毒颗粒;
B2,用HHP-LAMP2慢病毒颗粒感染CDC细胞,得到所述高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞。
7.根据权利要求5所述的外泌体,其特征在于,所述稳定高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞通过以下制备方法得到:
A,pLVX-HHP-LAMP2质粒的构建:
A1,获得心脏归巢肽CRPPR的编码基因;
A2,将所述心脏归巢肽CRPPR的编码基因克隆到LAMP2信号肽与成熟蛋白编码基因之间;得到含有心脏归巢肽DNA的HHP-LAMP2融合基因序列;
A3,将所述含有心脏归巢肽DNA的HHP-LAMP2融合基因克隆到pLVX-IRES-ZsGreen病毒载体上,得到pLVX-HHP-LAMP2质粒;
B,HHP-CDC细胞的建立:
B1,用pLVX-HHP-LAMP2、pMD2、pSPAX2质粒共转染HEK293T细胞,制备HHP-LAMP2慢病毒颗粒;
B2,用HHP-LAMP2慢病毒颗粒感染CDC细胞,然后用流式细胞术对HHP-LAMP2慢病毒感染后的CDC细胞进行分选,选择ZsGreen荧光蛋白高表达的细胞,得到所述稳定高表达HHP-LAMP2的CDC细胞。
8.根据权利要求1-7任一所述的外泌体,其特征在于,所述外泌体内装载有心肌保护性miRNA、lncRNA、mRNA、DNA、功能性蛋白、脂质中的一种或几种。
9.如权利要求1-7任一所述的外泌体在制备心脏靶向性药物中的应用。
10.一种如权利要求1-5任一所述的外泌体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞;或者制备稳定高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞;
(2)将高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞或者稳定高表达HHP-LAMP2基因的CDC细胞在无血清的IMDM中进行培养,培养完成后,收集培养液;
(3)将步骤(2)收集到的培养液进行分离提纯,得到表面展示心脏归巢肽CRPPR的外泌体。
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