ES2623142T3

ES2623142T3 - Un método para amplificar las células madre cardíacas in vitro e in vivo

Info

Publication number: ES2623142T3
Application number: ES08835478.2T
Authority: ES
Inventors: Joshua M. Hare; Konstantinos Chatzistergos
Original assignee: VESTION Inc
Current assignee: VESTION Inc
Priority date: 2007-10-01
Filing date: 2008-10-01
Publication date: 2017-07-10
Anticipated expiration: 2028-10-01
Also published as: EP2205251B1; EP2205251A1; WO2009046058A1; EP2205251A4

Abstract

Una composición que comprende células madre Mesenquimales y células madre cardíacas para usar en el tratamiento de enfermedades cardíacas o trastornos cardíacos en un paciente, en donde la composición se produce mediante un método que comprende: cocultivar ex vivo las células madre mesenquimales con las células madre cardíacas; y administrar al tejido cardíaco de un paciente in vivo el cultivo de células madre mesenquimales y células madre cardíacas en una concentración eficaz para reparar el tejido cardíaco dañado.

Description

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DESCRIPCION

Un metodo para amplificar las celulas madre cardfacas in vitro e in vivo Campo de la invencion

La descripcion se refiere a las composiciones de celulas madre y los metodos de reparacion de tejidos, y la amplificacion de celulas madre cardfacas in vivo e in vitro.

Antecedentes

Las celulas madre mesenquimales (MSC) son celulas madre que se derivan de la medula osea que han entrado en ensayos clmicos para el tratamiento de diversas enfermedades que incluyen el infarto del miocardio y la insuficiencia cardfaca. En la ultima decada se han realizado extensos intentos para caracterizar la naturaleza de la medula osea y la participacion de las celulas precursoras cardfacas en la recuperacion a continuacion de la lesion isquemica del corazon. La idea de que las celulas precursoras potencialmente reparadoras existen en la medula y en el corazon tiene enormes implicaciones clmicas y ha estimulado un gran numero de estudios clmicos para comprobar si la medula osea o sus derivados ejercen una recuperacion clmica a continuacion del infarto del miocardio (MI) y otros tipos de lesiones cardfacas. A pesar de que este trabajo se realiza tanto en los niveles clmicos como basicos, no ha surgido un consenso referente a la capacidad de estos tipos de celulas adultas para diferenciarse en elementos celulares que comprenden el corazon. Por el contrario, hay informes diametralmente opuestos referentes a esta cuestion, y la prueba definitiva del injerto celularfalta en el contexto clmico.

Resumen

Este Resumen se proporciona para presentar un resumen de la invencion para indicar brevemente, la naturaleza y fundamento de la invencion. Se presenta con el entendimiento que no se usara para interpretar o limitar el alcance o el significado de las reivindicaciones.

Esta invencion se dirige a una limitacion importante en el area de la terapia celular cardfaca. Esta limitacion implica el uso de celulas madre cardfacas para tratar a pacientes con enfermedades cardfacas. Las celulas madre cardfacas, aunque muy prometedoras como terapia, requieren una biopsia de tejido y un largo penodo de crecimiento en el laboratorio. Las MSC pueden usarse para acelerar el crecimiento de las CSC in vitro o pueden usarse para amplificar CSC in vivo, de ese modo se elimina la necesidad de la biopsia de tejido.

La invencion se refiere a una composicion que comprende celulas madre mesenquimales y celulas madre cardfacas para usar en el tratamiento de las enfermedades cardfacas o trastornos cardfacos en un paciente, en donde, la composicion se produce mediante un metodo que comprende: cocultivar ex vivo las celulas madre mesenquimales con celulas madre cardfacas; y administrar in vivo el tejido cardfaco de un paciente, el cultivo de celulas madre mesenquimales y celulas madre cardfacas en una concentracion efectiva para reparar el tejido cardfaco danado. Ademas, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende celulas madre mesenquimales cultivadas y celulas madre cardfacas para usar en el tratamiento de la enfermedad cardfaca o trastornos cardfacos. En un aspecto preferido, un metodo para tratar la enfermedad cardfaca y trastornos cardfacos en un paciente que comprende, aislar celulas madre de un paciente o donante; purificar las celulas madre y obtener celulas madre mesenquimales; administrar el tejido cardfaco de un paciente, las celulas madre mesenquimales en una concentracion eficaz para reparar el tejido cardfaco danado; y, tratar las enfermedades cardfacas y los trastornos cardfacos.

En otra modalidad preferida, las celulas madre mesenquimales son autologas o se derivan de donantes.

En una modalidad preferida, las celulas madre mesenquimales se diferencian en multiples linajes. Preferentemente, las celulas madre mesenquimales se diferencian en al menos un linaje de celulas cardfacas; con mayor preferencia, las celulas madre mesenquimales se diferencian en al menos dos linajes de celulas cardfacas; con mayor preferencia, las celulas madre mesenquimales se diferencian en tres linajes de celulas cardfacas.

En otra modalidad preferida, los linajes de celulas cardfacas se identifican por al menos un marcador que comprende el factor de transcripcion cardfaco GATA-4; marcadores de celulas endoteliales Factor VIII y KDR; marcador del musculo liso vascular a-actina de musculo liso; o el marcador cardiomiocitario a-actina sarcomerica.

En otra modalidad preferida, las celulas madre se obtienen de la medula osea, la circulacion o tejidos y organos.

En otra modalidad preferida, las celulas madre mesenquimales se afslan de las celulas de medula osea adultas.

En otra modalidad preferida, las celulas mesenquimales reclutan celulas madre endogenas cardfacas, reconstruyen nichos de celulas madre miocardicas y aceleran la diferenciacion celular endogena en miocitos.

En otra modalidad preferida, las celulas madre endogenas cardfacas se identifican por al menos un marcador que

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comprende conexina-43, N-cadherina, c-kitpos, CD3neg, CD14neg y CD68neg.

En otra modalidad preferida, las celulas madre ca^acas son autologas o se derivan de donantes.

Aun en otro aspecto preferido, los factores de las celulas madre mesenquimales se administran al paciente.

En un aspecto preferido, modalidad, un metodo de reclutamiento de celulas madre cardfacas endogenas al tejido cardfaco danado comprende administrar al tejido cardfaco danado, celulas madre mesenquimales purificadas; y, reclutar las celulas madre cardfacas endogenas.

En otra modalidad preferida, las celulas madre mesenquimales se purifican de las celulas de la medula osea adulta.

En otra modalidad preferida, las celulas madre mesenquimales son autologas, heterologas singenicas, alogenicas o xenogenicas.

En otra modalidad preferida, el dano al tejido del corazon puede ser de cualquier fuente o causa y comprende enfermedad, dano ffsico, dano qmmico, cirugfa, trasplante, o defectos congenitos.

En otro aspecto preferido, el metodo para induciry/o acelerar la proliferacion de las celulas madre cardfacas comprende aislar celulas madre mesenquimales; cocultivar celulas madre mesenquimales y celulas madre cardfacas en una concentracion suficiente para induciry/o acelerar la proliferacion de las celulas madre cardfacas.

En otra modalidad preferida, las celulas madre cardfacas se diferencian en celulas cardfacas que expresan al menos uno de MDR1 o GATA-4.

En otra modalidad preferida, las celulas madre cardfacas se derivan de una biopsia de tejido autologa o histocompatible. En otro aspecto preferido, las celulas mesenquimales aisladas se administran a un paciente.

En otra modalidad preferida, las celulas madre mesenquimales y las celulas madre cardfacas son autologas, heterologas singenicas, alogenicas o xenogenicas.

Aun en otra modalidad, las celulas madre mesenquimales y las celulas madre cardfacas se afslan de diferentes fuentes. Preferentemente, las celulas madre cardfacas son celulas madre endogenas o se derivan de donantes. Las celulas madre cardfacas se identifican preferentemente por al menos un marcador que comprende conexina-43, N-cadherina, c- kitpos, CD3neg, CD14neg y CD68neg.

En otro aspecto preferido, las celulas mesenquimales son celulas madre autologas y se administran a un paciente en una dosis terapeuticamente eficaz para reclutar celulas madre endogenas al tejido danado.

En otra modalidad preferida, las celulas madre mesenquimales y las celulas madre cardfacas endogenas se afslan opcionalmente y se cultivan ex vivo y se administran a un paciente.

En otro aspecto preferido, un metodo para tratar el tejido cardfaco danado comprende administrar celulas madre mesenquimales al tejido cardfaco; estimular la proliferacion in vivo de las celulas madre cardfacas; y, tratar el tejido cardfaco danado.

En otro aspecto preferido, los factores solubles de las celulas madre mesenquimales cultivadas se administran al tejido cardfaco. En un aspecto preferido, un factor de celulas madre mesenquimales estimula la proliferacion de celulas madre cardfacas in vivo.

En otro aspecto preferido, un anticuerpo o un aptamero es espedfico, es decir, se une espedficamente a un factor de celulas madre mesenquimales.

En otro aspecto preferido, un factor de celulas madre mesenquimales estimula la proliferacion de celulas madre cardfacas in vitro.

En otra modalidad preferida una composicion que comprende celulas madre mesenquimales y celulas madre cardfacas. En otra modalidad preferida, la composicion comprende celulas madre mesenquimales de una fuente, por ejemplo, autologas, que se derivan de donantes, etc., y celulas madre cardfacas de otra fuente, por ejemplo, autologas, que se derivan de donantes etc.

En otro aspecto preferido, una celula madre mesenquimal comprende un polinucleotido que codifica para un agente terapeutico, quimocina, factor de crecimiento o ligandos de estos.

Otros aspectos de la invencion se describen a continuacion.

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Breve descripcion de las figuras

Las figuras 1A-1I son escaneos de fotograffas que muestran la diferenciacion del trilineaje de MSC alogenicas. Figura 1A: Compromiso de linaje ca^aco de aMSC gFppos que expresa GATA-4 (flechas) en la BZ de un corazon tratado 24h despues del trasplante. Figura 1B: La aMSC cardfaca comprometida que experimenta la division simetrica en la zona del infarto de un corazon tratado 72h despues del trasplante. Figura 1C: Las aMSC GFPpos que experimentan una division asimetrica dentro de la zona del infarto de un corazon tratado 72h y dan lugar a un (GATA-4p°s) comprometido ca^aco y una celula hija no comprometida. Figura 1D: Compromiso del linaje endotelial de las aMSC 72h despues del trasplante, indicado por la colocalizacion de GFP y KDR/factor VIII (flechas). Figura 1E: Ampliacion de la esquina inferior derecha de la Figura 1C. Figura 1F: Compromiso de las celulas musculares lisas vasculares de las aMSC 72h despues del trasplante, como se indica por la colocalizacion de la GFP con a-actina de musculo liso (flechas). Figura 1G: Ampliacion de la esquina inferior derecha de la Figura 1E. El acoplamiento electrico de las aMSC con el tejido cardfaco circundante 24h despues del trasplante, como se indica por la colocalizacion del GFP y la Conexina-43. Figura 1I: Las celulas GFPp°s en una zona de regeneracion (Rgz) 72h despues del trasplante expresan a-actina sarcomerica (flechas) y estan mecanicamente acopladas por N-cadherina con la zona infartada (IZ) y en la zona ffmite (BZ).

Las figuras 2A a la 2J son escaneos de fotograffas que muestran la regeneracion de musculos cardfacos, vasculatura y nichos de celulas madre. Figura 2A: Un progenitor MSC cardfaco GFPp°s inmaduro que expresa GATA-4 en la zona ffmite de un corazon tratado 2 semanas despues del trasplante. Tenga en cuenta el CSC c-kitp°s contiguo. Figura 2B: Las MSC inmaduras en la zona ffmite de un corazon tratado 2 semanas, que expresan a-actina sarcomerica (flechas). Figura 2C: Regeneracion robusta del miocardio infartado 2 semanas despues del trasplante, como se demuestra por la presencia de cromosomas Y que contienen miocitos cardfacos. Figura 2D: Formacion de vasos coronarios nuevos 2 semanas despues del trasplante, como se indica por el cromosoma Y que contiene la celula endotelial (flecha). Figura 2E: El miocardio quimerico consistio en miocitos cardfacos maduros, precursores cardfacos y MSC inmaduras, todos conectados por conexina-43 entre sf y el musculo cardfaco circundante (flechas). Figura 2F: Diferenciacion definitivo de miocitos cardfacos de MSC 2 semanas despues del trasplante, como se indica la existencia del cromosoma Y que contienen miocitos cardfacos maduros. Figura 2G: Movilizacion de celulas c-kitp°s a los sitios de lesion 2 semanas despues del trasplante. Las celulas C-kit se encontraron en grupos cercanos a las celulas GFP. Figura 2H: A diferencia de los animales tratados con aMSC, los grupos Placebo y control, mostraron un numero significativamente menor de celulas c-kit que se aislaron ademas. Figuras 2I, 2J: Las celulas c-kit movilizadas, a menudo se conectaron con N- cadherina y conexina-43 entre sf, el tejido cardfaco circundante y con celulas GFPp°s, lo que indica la reconstitucion de nichos de celulas madre cardfacas.

Las Figuras 3A a la 3J muestran la recuperacion funcional a largo plazo a continuacion del trasplante de aMSC. La Figura 3A es un grafico que muestra la evaluacion de la funcion global de LV mediante imagenes de MR cine que muestran un aumento significativo en el % de fraccion de eyeccion en el grupo tratado con aMSC en comparacion con el placebo, a los 2 meses [16.9±1% de aumento en aMSC, n=6, versus 0.4±3.7% de aumento en el placebo, n=4; *p= 0.005] y 3 meses despues del tratamiento [16.5±8% de aumento en aMSC, n=6, versus 5.5±4.6% de disminucion en el placebo, n=4; fp= 0.05]. Las Figuras 3B, 3C son escaneos de fotograffas que muestran imagenes de MR con retraso de la mejora del contraste (DCE) 3 meses despues del infarto del miocardio experimental (MI) (Figura 3B) y la misma vista de eje corto despues de 3 meses de terapia con aMSC (Figura 3C). Tenga en cuenta el desarrollo de tejido nuevo endocardico en la BZ de los corazones tratados (puntas de las flechas). La Figura 3D es un grafico que muestra la cuantificacion del tamano del infarto por DCE MRI que mostro un % de disminucion significativa en el tamano de la cicatriz en los animales con aMSC en comparacion con el grupo placebo a los 2 meses [21.9±7.3% de disminucion en aMSC, n=6, versus 1.1±5.5% de aumento en el placebo n=4; *p= 0.047 y 3 meses despues del tratamiento [29.0±5.1% de disminucion en aMSC, n=6, versus 4.3±9.4% de aumento en el placebo, n=4; fp= 0.01]. Las Figuras 3e, 3F son escaneos de fotograffas que muestran cortes representativos de 4 mm de espesor de los corazones cosechados 12 semanas despues del MI, que ilustran diferencias en el diametro de LV asf como en la extension del tamano de la cicatriz entre los animales placebo y los tratados con aMSC (Figuras 3E y 3F, respectivamente). La Figura 3G es un grafico que muestra una representacion del pico de la deformacion circunferencial (pico Ecc) de la pared endocardica con el tiempo, que demuestra mejoras significativas en la contractilidad regional de los corazones tratados (pico negativo Ecc indica la contraccion regional normal), 8 y 12 semanas despues de la terapia con aMSC (*p=0.001 versus placebo). La Figura 3H es un grafico que muestra la mejora de la contractilidad, que se evidencia por los cambios absolutos en el pico Ecc, mostro correlacion con la reduccion absoluta en el tamano del infarto (correlacion de Pearson: R=-0.97). La Figura 3I es un grafico que muestra la recuperacion en el pico Ecc fuertemente relacionada con el injerto de aMSC (R= - 0.82). La Figura 3J es un escaneo de una fotograffa que muestra la evidencia del corazon quimerico 12 semanas despues del trasplante, que se demuestra por la presencia de CM maduro GATA-4p°s /Yp°s recien formado.

Las Figuras 4A a la 4E muestran la regeneracion de los vasos coronarios grandes y pequenos a continuacion del trasplante de aMSC. Las Figuras 4A-4C son escaneos de fotograffas que muestran microscopfa confocal de vasos grandes (Figura 4A), de tamano medio (Figura 4B) y capilares (Figura 4C) en la BZ del grupo tratado con aMSC que exhiben celulas Yp°s en sus estructuras. Los vasos regenerados grandes y medianos colocalizados con una actina de musculo liso y factor VIII. Las Figuras 4D, 4E son graficos que muestran la cuantificacion de densidades de nuevos vasos por unidad de volumen del miocardio. La mayona de los vasos regenerados se detectaron en la BZ de los corazones tratados con aMSC.

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La Figura 5 es una ilustracion esquematica que muestra un resumen de los resultados in vivo (insertos de panel a-f).

Las Figuras 6A-6E muestran la Citometna de Escaneo Laser (LSC) para mapear el trafico celular. Figuras 6A-6C: Dentro de las 72 horas despues de la implantacion, las MSC GFPpos emigraron del sitio endomiocardico de la inyeccion hasta el borde subepicardico infartado. No se detectaron celulas en el miocardio circundante saludable, lo que indica que el trafico de MSC fue impulsado por senales de dano. Figuras 6D, 6E: Se uso Microscopfa Confocal para anti GFP y el cromosoma Y para verificar la deteccion de las MSC. Tenga en cuenta que no todas las celulas GFPpos son cromosoma Ypos y viceversa. La sensibilidad de la deteccion combinada FISH/inmunofluorescencia fue de 45.5±2.1% de las celulas masculinas totales.

Las Figuras 7A a la 7D son escaneos de fotograffas que muestran una retencion robusta de aMSC dos semanas despues del trasplante intramiocardico. La Figura 7A muestra la coloracion histologica de hematoxilina y eosina que demuestra el rastreo de un sitio de inyeccion. La Figura 7B muestra la presencia de celulas GFPpos dentro de la misma inyeccion que confirma el origen de las celulas exogenas. Figuras 7C, 7D: La Conexina-43 y la (31-Integrina se usaron como marcadores de retorno y el injerto de las MSC en el miocardio del huesped. Tenga en cuenta la presencia fuerte de celulas c-kit en la Figura 7C.

Las Figuras 8A a la 8C muestran el destino de los aloinjertos en el miocardio del huesped durante las primeras 72h despues del trasplante. La Figura 8A es un escaneo de una fotograffa que muestra la deteccion de la inmunofluorescencia de la Histona H3 fosforilada con serina-10 (flechas) que demuestra la presencia de aMSC mitoticas dentro de un sitio de inyeccion, 72h despues del trasplante. Figura 8B: La colocalizacion de H3-fosfo y caspasa-3 escindida ilustro la condensacion de la cromatina prematura de una aMSC (flecha) y el inicio de la apoptosis 72h despues del trasplante. La punta de flecha muestra una aMSC adyacente en mitosis. Figura 8C: El numero de MSC apoptoticas fue contrabalanceado por un numero analogo de celulas que experimentan mitosis. Mitotico: fosfoHistona- H3pos-GFPpos: 1.2±0.7% del total de celulas GFPpos a las 24h (n=1) y 1.3±0.4% a las 72h (n=3)]; Diferenciacion: GATA- 4pos-GFPpos 13.4±5.4% de las celulas GFPpos detectadas a las 24h (n=1) y 23.4± 3.2%, a las 72 horas (n=3); Apoptotico: caspasa3pos-GFPpos: 0.31±1.0% a las 24h (n=1) y 1.0±0.6% a las 72h del total de celulas GFPpos (n=3).

Las Figuras 9A a la 9D muestran la movilizacion de CSC c-kitpos endogenas 2 semanas despues del trasplante de MSC. Las Figuras 9A-9C muestran el reclutamiento dramatico de celulas c-kitpos en los sitios de la inyeccion. Las celulas c-kit estaban en grupos en el IZ (Figura 9A) y BZ (Figura 9B) de los corazones tratados, pero se aislaron principalmente en las zonas sanas y/o en los corazones de los animales no tratados (Figura 9C). La Figura 9D es un grafico que muestra la distribucion de las celulas c-kit dentro de las diferentes zonas de los animales tratados y no tratados. IZ: 2.14±0.09 celulas/mm2 para el grupo aMSC (n=3) versus 0.04±0.02 celulas/mm2 para el placebo (n=3) y 0.09 ±0.04 celulas/mm2 para los grupos controles (n=3) respectivamente, *p<0.001; BZ: 0.74±0.12 celulas/mm2 para el grupo aMSC versus 0.008±0.002 celulas/mm2 para el placebo y 0.013 ±0.003 celulas/mm2 para los grupos controles respectivamente, fp=0.001; RZ: 0.10±0.01 celulas/mm2 para las aMSC versus 0.002±0.001 celulas/mm2 para el placebo y 0.01 ±0.005 celulas/mm2 para los grupos controles respectivamente, *p<0.001.

Las Figuras 10A a la 10C muestran la estimulacion de la reparacion cardfaca endogena a continuacion del trasplante de aMSC. Figuras 10A, 10B: Ademas de las MSC GFPpos, los nichos CSC regenerados contuvieron grupos de celulas c- kitpos que se colocalizaron con MDR1pos y GATA-4pos. Figura 10C: La cuantificacion de las celulas precursoras cardfacas c-kitpos / GATA-4pos entre grupos, demostro un proceso de reparacion endogeno activo en los animales tratados con MSC que se inicio, pero no se restringio, en la BZ de los corazones infartados. IZ: 0.4±0.08% del total de celulas c-kitpos en el grupo aMSC (n=3) versus 0.3±0.3% en el placebo (n=3) y ninguno en el control (n=3), p=0.5; BZ: 3.9±1.6% en el grupo aMSC versus 0.28±0.14% en el placebo y ninguno en el control, *p=0.038; RZ: ninguno para cualquiera de los grupos).

Las Figuras 11A a la 11C muestran la retencion a largo plazo de aMSC. Figura 11A: Se encontraron aMSC trasplantadas en grupos en la IZ y BZ del miocardio huesped. La colocalizacion de BrdU con el cromosoma Y se uso para confirmar el origen de los aloinjertos (flechas). Algunas de estas celulas habfan perdido BrdU, presumiblemente por la division mitotica (puntas de flecha). Figura 11B: Distribucion de las aMSC en el miocardio infartado cronico. Las celulas se detectaron en el IZ y BZ, pero no en las zonas sanas remotas. Figura 11C: Los cardiomiocitos recien formados fueron totalmente funcionales y se integraron en el miocardio del huesped; La demostracion del acoplamiento electrico de aMSC con los cardiomiocitos residentes a traves del desarrollo de uniones gap conexina-43 (flechas).

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se describe haciendo referencia a las figuras adjuntas, en donde se usan numeros de referencia similares a lo largo de todas las figuras para designar elementos similares o equivalentes. Las figuras no se dibujan a escala y se proporcionan meramente para ilustrar la presente invencion. A continuacion, se describen varios aspectos de la invencion con referencia a las aplicaciones de ejemplos para ilustracion. Se debe entender que numerosos detalles espedficos, relaciones, y metodos se exponen para proporcionar una comprension completa de la invencion. Sin embargo, un experto en la tecnica correspondiente reconocera facilmente que la invencion se puede practicar sin uno o mas de los detalles espedficos o con otros metodos. La presente invencion no se limita por el orden ilustrado de

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los actos o acontecimientos, ya que algunos actos pueden ocurrir en diferentes ordenes y/o simultaneamente con otros actos o acontecimientos. Ademas, no todos los actos o acontecimientos ilustrados se requieren para implementar una metodologfa de acuerdo con la presente invencion.

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos (que incluyen los terminos tecnicos y cientificos) que se usan en la presente tienen el mismo significado que el que una persona con conocimiento ordinarios en la tecnica a la que pertenece esta invencion entiende comunmente. Se entendera ademas que los terminos, tales como los que se definen en los diccionarios usados comunmente, deben interpretarse como teniendo un significado que sea consistente con su significado en el contexto de la tecnica correspondiente y no se interpretara en un sentido idealizado o excesivamente formal a menos que se defina expresamente en la presente.

Definiciones

La terminologfa que se usa en la presente es con el proposito de describir modalidades particulares solamente y no pretende limitar la invencion. Como se utiliza en la presente descripcion, las formas singulares "un", "una" y "la" pretenden incluir las formas plurales tambien, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Ademas, en la medida en que los terminos "incluyendo", "incluye", "tener", "tiene", "con" o variantes de estos, se usan en la descripcion detallada y/o en las reivindicaciones, tales terminos pretenden inclusive de una manera similar al termino "que comprende".

El termino "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular determinado por una persona con conocimientos ordinarios en la tecnica, que dependera en parte de como se mide o determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medicion. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar dentro de 1 o mas de 1 desviacion estandar, segun la practica en la tecnica. Como alternativa, "aproximadamente" puede significar un intervalo de hasta 20%, preferentemente hasta el 10%, con mayor preferencia hasta el 5%, y aun con mayor preferencia hasta el 1% de un valor dado. Como alternativa, particularmente con respecto a sistemas o procesos biologicos, el termino puede significar dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces, y con mayor preferencia dentro de 2 veces, de un valor. Cuando se describen valores particulares en la solicitud y en las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, el termino "aproximadamente" significa que debe asumirse dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular.

Tal como se utiliza en la presente descripcion, "enfermedad cardfaca" se refiere a cualquier tipo de enfermedad cardfaca que incluye cardiomiopatfa, cardiomiopatfa hipertrofica, cardiomiopatfa dilatada, aterosclerosis, enfermedad arterial coronaria, enfermedad cardfaca isquemica, miocarditis, infeccion viral, heridas, enfermedad cardfaca hipertensiva, enfermedad valvular, enfermedad cardfaca congenita, infarto de miocardio, insuficiencia cardfaca congestiva, arritmias, enfermedades que resultan en la remodelacion del corazon, etc. Las enfermedades del corazon pueden deberse a cualquier razon, como por ejemplo, dano al tejido cardfaco tal como una perdida de contractilidad (por ejemplo, como podna demostrarse por una fraccion de eyeccion disminuida).

El dano cardfaco o trastorno caracterizado por la funcion cardfaca insuficiente incluye cualquier deterioro o ausencia de una funcion cardfaca normal o presencia de una funcion cardfaca anormal. La funcion cardfaca anormal puede ser el resultado de una enfermedad, lesion y/o envejecimiento. Como se utiliza en la presente descripcion, la funcion cardfaca anormal incluye anomalfas morfologicas y/o funcionales de un cardiomiocito, una poblacion de cardiomiocitos o el propio corazon. Ejemplos no limitantes de anomalfas morfologicas y funcionales incluyen el deterioro ffsico y/o la muerte de cardiomiocitos, los patrones de crecimiento anormales de los cardiomiocitos, las anomalfas en la conexion ffsica entre cardiomiocitos, la baja o sobreproduccion de una sustancia o sustancias por cardiomiocitos, la insuficiencia de los cardiomiocitos para producir una sustancia o sustancias que normalmente producen, y la transmision de los impulsos nerviosos en patrones anormales o en tiempos anormales. Las anormalidades a un nivel mas grave incluyen discinesis, reduccion de la fraccion de eyeccion, cambios observados por ecocardiograffa (por ejemplo, dilatacion), cambios en la ECG, cambios en la tolerancia al ejercicio, reduccion de la perfusion capilar y cambios observados por angiograffa. Se observa una funcion cardfaca anormal con muchos trastornos que incluyen, por ejemplo, enfermedad cardfaca isquemica, por ejemplo, angina de pecho, infarto del miocardio, cardiopatfa isquemica cronica, enfermedad cardfaca hipertensiva, enfermedad pulmonar cardfaca (cor pulmonar), enfermedad cardfaca valvular del corazon, por ejemplo, fiebre reumatica, prolapso de la valvula mitral, calcificacion del anillo mitral, enfermedad cardfaca carcinoide, endocarditis infecciosa, enfermedad cardfaca congenita, enfermedad miocardica, por ejemplo, miocarditis, cardiomiopatfa dilatada, miocardiopatfa hipertensiva, trastornos cardfacos que resultan en la insuficiencia cardfaca congestiva y tumores del corazon, por ejemplo sarcomas primarios y tumores secundarios. El dano al corazon incluye ademas heridas, tales como por ejemplo, herida de cuchillo; biologicas (por ejemplo enfermedades virales, autoinmunes) o qrnmicas (por ejemplo, quimioterapia, farmacos); cirugfa; trasplante y similares.

"Isquemia miocardica" se refiere a la falta de flujo de oxfgeno al corazon que da lugar al dano isquemico miocardico. Como se utiliza en la presente descripcion, la frase dano isquemico miocardico incluye el dano causado por la reduccion del flujo sangumeo al miocardio. Ejemplos no limitantes de causas de isquemia miocardica y dano isquemico miocardico incluyen: disminucion de la presion diastolica aortica, aumento de la presion intraventricular y contraccion miocardica, estenosis de la arteria coronaria (por ejemplo, ligadura coronaria, estenosis coronaria fija, cambio de placa agudo (por ejemplo, ruptura, hemorragia), trombosis de la arteria coronaria, vasoconstriccion), estenosis y regurgitacion de la

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valvula aortica, y aumento de la presion auricular derecha. Ejemplos no limitantes de efectos adversos de la isquemia miocardica y el dano isquemico miocardico incluyen: dano a miocitos (por ejemplo, perdida de celulas de miocitos, hipertrofia de miocitos, hiperplasia celular de miocitos), angina (por ejemplo, angina estable, angina variable, angina inestable, muerte subita cardfaca), infarto del miocardio e insuficiencia cardfaca congestiva. Los danos causados por la isquemia miocardica pueden ser agudos o cronicos, y las consecuencias pueden incluir la formacion de cicatrices, remodelacion cardfaca, hipertrofia cardfaca, adelgazamiento de la pared, dilatacion y cambios funcionales asociados. La existencia y la etiologfa del dano miocardico agudo o cronico y/o la isquemia miocardica pueden diagnosticarse usando cualquiera de una variedad de metodos y tecnicas bien conocidas en la tecnica que incluyen, por ejemplo, imagenes no invasivas (por ejemplo, MRI, ecocardiograffa), angiograffa, pruebas de estres, ensayos para protemas cardfacas espedficas tales como troponina cardfaca y smtomas cknicos. Estos metodos y tecnicas, asf como otras tecnicas apropiadas, pueden usarse para determinar cuales individuos son los candidatos adecuados para los metodos de tratamiento descritos en la presente. "Nicho de celulas madre" se refiere al microambiente en el que se encuentran las celulas madre, que interactua con las celulas madre para regular el destino de las celulas madre. (Ver, por ejemplo, Kendall Powell, Nature 435, 268 - 270 (2005). La palabra 'nicho' puede referirse al microambiente de celulas madre in vivo o in vitro. Durante el desarrollo embrionario, diversos factores del nicho actuan sobre las celulas madre embrionarias para alterar la expresion genica, e inducir su proliferacion o diferenciacion para el desarrollo del feto. Dentro del cuerpo humano, los nichos de celulas madre mantienen las celulas madre adultas en un estado inactivo, pero despues de la lesion tisular, el microambiente circundante activa senales a las celulas madre para promover la autorrenovacion o la diferenciacion para formar nuevos tejidos. Varios factores son importantes para regular las caractensticas de las celulas madre dentro del nicho: interacciones celula a celula entre celulas madre, asf como interacciones entre celulas madre y celulas diferenciadas vecinas, interacciones entre celulas madre y moleculas de adhesion, componentes de la matriz extracelular, tension de oxfgeno, factores de crecimiento, citocinas y la naturaleza fisicoqmmica del ambiente, que incluyen el pH, la fuerza ionica (por ejemplo, la concentracion de Ca2+, metabolitos como el ATP) son importantes ademas. Las celulas madre y el nicho pueden inducirse mutuamente durante el desarrollo y senalizarse redprocamente para mantenerse mutuamente durante la edad adulta. Las localizaciones anatomicas espedficas que regulan como participan en la generacion, el mantenimiento y la reparacion del tejido. El nicho salva las celulas madre del agotamiento, mientras protege al huesped de la proliferacion excesiva de las celulas madre. Constituye una unidad basica de fisiologfa tisular, que integra senales que median la respuesta equilibrada de las celulas madre a las necesidades de los organismos. Aun el nicho puede inducir ademas patologfas que imponen una funcion aberrante en las celulas madre u otros objetivos. La interaccion entre las celulas madre y su nicho crea el sistema dinamico necesario para sostener los tejidos, y para el diseno final de las terapias con las celulas madre.

"Muestras biologicas" incluyen muestras de fluidos solidos y corporales. Las muestras biologicas que se usan en la presente invencion pueden incluir celulas, protemas o extractos de membrana de celulas, sangre o fluidos biologicos tales como fluido asdtico o fluido cerebral (por ejemplo, lfquido cefalorraqmdeo). Ejemplos de muestras biologicas solidas incluyen, pero no se limitan a, muestras tomadas de tejidos del sistema nervioso central, hueso, mama, rinon, cervix, endometrio, cabeza/cuello, vesmula biliar, glandula parotida, prostata, glandula pituitaria, musculo, esofago, estomago, intestino delgado, colon, hngado, bazo, pancreas, tiroides, corazon, pulmon, vejiga, adiposo, ganglio linfatico, utero, ovario, glandula suprarrenal, testmulos, airngdalas y timo. Ejemplos de "muestras de fluido corporal" incluyen, pero no se limitan a la sangre, suero, semen, fluido prostatico, fluido seminal, orina, saliva, esputo, moco, medula osea, linfa y lagrimas.

"Celula progenitora que se deriva de la medula osea" (BMDC) o "celula madre que se deriva de la medula osea" se refiere a una celula madre primitiva con la maquinaria para la autorrenovacion constitutivamente activa. Se incluyen en esta definicion celulas madre que son totipotentes, pluripotentes y precursores. Una "celula precursora" puede ser cualquier celula en una via de diferenciacion celular que sea capaz de diferenciarse en una celula mas madura. Como tal, el termino "poblacion de celulas precursoras" se refiere a un grupo de celulas capaces de desarrollarse en una celula mas madura. La poblacion de celulas precursoras puede comprender celulas que son totipotentes, celulas pluripotentes y celulas restringidas de celulas madre (es decir, celulas capaces de desarrollarse en al menos todos los linajes hematopoyeticos, o en, por ejemplo, solo celulas del linaje eritroide). Como se utiliza en la presente descripcion, el termino "celula totipotente" se refiere a una celula capaz de desarrollarse en todos los linajes de celulas. Del mismo modo, el termino "poblacion totipotente de celulas" se refiere a una composicion de celulas capaces de desarrollarse en todos los linajes de celulas. Ademas, como se utiliza en la presente descripcion, el termino "celula pluripotente" se refiere a una celula capaz de desarrollarse en una variedad (aunque no en todos) de linajes y son al menos capaces de desarrollarse en todos los linajes hematopoyeticos (por ejemplo, linajes linfoides, eritroides y trombodticos). Las celulas madre que se derivan de la medula osea contienen dos tipos de celulas madre bien caracterizados. Las celulas madre mesenquimales (MSC) normalmente forman condrocitos y osteoblastos. Las celulas madre hematopoyeticas (HSC) son de origen mesodermico que normalmente dan lugar a celulas de la sangre y el sistema inmune (por ejemplo, eritroides, granulocitos/macrofagos, magacariocitos y linajes linfoides). Ademas, se ha demostrado que las celulas madre hematopoyeticas tienen el potencial de diferenciarse en las celulas del hngado (que incluyen hepatocitos, celulas del conducto biliar), pulmon, rinon (por ejemplo, celulas epiteliales tubulares renales y parenquima renal), el tracto gastrointestinal, fibras musculares esqueleticas, astrocitos del CNS, neuronas de Purkinje, musculo cardfaco (por ejemplo, cardiomiocitos), endotelio y piel.

Como se utiliza en la presente descripcion, el termino "autologo" denota referirse a cualquier material que se deriva del mismo individuo al que mastarde sera reintroducido en el individuo.

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El termino "celula xenogenica" se refiere a una celula que se deriva de una especie animal diferente de la especie animal que se convierte en el huesped animal receptor en un procedimiento de trasplante o vacunacion.

El termino "celula alogenica" se refiere a una celula que es de la misma especie animal pero geneticamente diferente en uno o mas loci geneticos como el animal que se convierte en el "huesped receptor". Esto se aplica normalmente a las celulas trasplantadas de un animal a otro animal no identico de la misma especie.

El termino "celula singenica" se refiere a una celula que es de la misma especie animal y tiene la misma composicion genetica para la mayona de los marcadores genotipicos y fenotfpicos que el animal que se convierte en el huesped receptor de esa lmea celular en un procedimiento de trasplante o vacunacion. Esto se aplica normalmente a las celulas trasplantadas de gemelos identicos o puede aplicarse a celulas trasplantadas entre animales muy endogamicos.

Los terminos "paciente" o "individuo" se usan indistintamente en la presente, y se refiere a un individuo mamftero a tratar, siendo los pacientes humanos los preferidos. En algunos casos, los metodos de la invencion son utiles en animales de experimentacion, en aplicaciones veterinarias y en el desarrollo de modelos animales para enfermedades, que incluyen, pero no se limitan a, roedores que incluyen ratones, ratas y hamsteres; y primates.

"Diagnostico" o "diagnosticado" significa identificar la presencia o naturaleza de una condicion patologica. Los metodos diagnosticos difieren en su sensibilidad y especificidad. La "sensibilidad" de un ensayo de diagnostico es el porcentaje de individuos enfermos que resultan positivos (porcentaje de "positivos verdaderos"). Los individuos enfermos no detectados por el ensayo son "falsos negativos". Los individuos que no estan enfermos y que resultan negativos en el ensayo, se denominan "negativos verdaderos". La "especificidad" de un ensayo de diagnostico es 1 menos la tasa de falsos positivos, donde la tasa de "falsos positivos" se define como la proporcion de aquellos sin la enfermedad que dan positivo. Aunque un metodo de diagnostico particular puede no proporcionar un diagnostico definitivo de una condicion, basta con que el metodo proporcione una indicacion positiva que ayuda en el diagnostico.

"Tratamiento" es una intervencion realizada con la intencion de prevenir el desarrollo o la alteracion de la patologfa o los smtomas de un trastorno. Como consecuencia, "tratar" se refiere al tratamiento terapeutico y profilactico o medidas preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya estan con el trastorno, asf como aquellos en los que debe prevenirse el trastorno. Como se utiliza en la presente descripcion, "mejorado" o "tratamiento" se refiere a un smtoma que se enfoca a un valor normalizado (por ejemplo, un valor que se obtiene en un paciente o individuo sano), por ejemplo, es menos que el 50% diferente de un valor normalizado, preferentemente menos de aproximadamente el 25% diferente de un valor normalizado, con mayor preferencia, es menos que el 10% diferente de un valor normalizado, y aun con mayor preferencia, no es significativamente diferente de un valor normalizado determinado usando pruebas estadfsticas rutinarias.

Los terminos "union espedfica" o "que se une espedficamente" cuando se usan en referencia a la interaccion de un anticuerpo y una protema o peptido o aptameros, significa que la interaccion depende de la presencia de una estructura particular (es decir, el antfgeno determinante o epftopo) sobre la protema; en otras palabras, el anticuerpo reconoce y se une a una estructura proteica espedfica en lugar de protemas en general. Por ejemplo, si un anticuerpo es espedfico para el epftopo "A," la presencia de una protema que contiene el epftopo A (o libre, A no marcado) en una reaccion que contiene el marcaje "A" y el anticuerpo reducira la cantidad del marcaje "A" unido al anticuerpo. De este modo, un anticuerpo que "se une espedficamente a" o es "espedfico para" un polipeptido particular o un epftopo sobre un polipeptido particular es uno que se une a ese polipeptido particular o epftopo sobre un polipeptido particular sin unirse sustancialmente a ningun otro polipeptido o epftopo polipeptfdico.

Tecnicas Generales

Para la elaboracion adicional de tecnicas generales utiles en la practica de esta invencion, el profesional puede referirse a libros de texto estandar y revisiones en biologfa celular, cultivo de tejidos, embriologfa y cardiofisiologfa.

Con respecto al cultivo de tejidos y celulas madre embrionarias, el lector puede referirse a Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987); Guide to Techniques in Mouse Development (P. M. Wasserman et al. eds., Academic Press 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (P. D. Rathjen et al., Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998). Con respecto al cultivo de celulas del corazon, las referencias estandares incluyen The Heart Cell in Culture (A. Pinson ed., CRC Press 1987), Isolated Adult Cardiomyocytes (Vols. I & II, Piper & Isenberg eds., CRC Press 1989), Heart Development (Harvey & Rosenthal, Academic Press 1998), I Left my Heart in San Francisco (T. Bennet, Sony Records 1990); y Gone with the Wnt (M. Mitchell, Scribner 1996).

Los metodos generales en bioqmmica molecular y celular pueden encontrarse en libros de texto estandar como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ra Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift &

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Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); y Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). Los reactivos, vectores de clonacion y estuches para la manipulacion genetica que se referencian en esta descripcion estan disponibles de proveedores comerciales tales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich y ClonTech.

Composiciones de Celulas Madre

Los aspectos de la descripcion proporcionados para las composiciones que comprenden celulas madre mesenquimales (MSC) utilizadas, en algunos aspectos, para la aceleracion de la preparacion de celulas madre cardfacas (CSC). La mejora de las CSC in vitro mejorara su utilidad. Las MSC pueden usarse ademas para proliferar las CSC in vivo. Las CSC proliferan y se diferencian en celulas cardfacas, por ejemplo cardiomiocitos. En resumen, los resultados descritos en la presente muestran que las inyecciones de MSC en corazones de cerdo causaron proliferacion masiva de CSC. Las MSC se unen y forman complejos con CSC, y causan su proliferacion y diferenciacion en miocitos cardfacos. Sin desear limitarse por la teona, la proliferacion de celulas madre cardfacas puede deberse a un factor de celulas madre mesenquimales, a una interaccion de ligando de receptor entre las MSC y CSC u otras celulas en el tejido cardfaco, o combinaciones de ambos.

Para determinar si las MSC tuvieron un potencial precursor cardfaco o si su efecto terapeutico se ejercio a traves de los efectos paracrinos, se inyectaron celulas madre mesenquimales que se derivaron de la medula osea adulta alogenica de machos (aMSC) en cerdos hembras a continuacion del infarto del miocardio (MI) (Figura 5). Se hipotetizo que las celulas madre mesenquimales que se derivan de la medula osea adulta alogenica (aMSC) eran celulas precursoras adultas verdaderas que podfan diferenciarse en tres linajes celulares cardfacos, y que las aMSC participan en la recuperacion cardfaca formando interacciones celula a celula con elementos miocardicos existentes que se incluyen con celulas precursoras endogenas.

Una celula madre es una celula del embrion, feto o adulto que tiene, bajo ciertas condiciones, la capacidad de reproducirse durante largos penodos o, en el caso de las celulas madre adultas, a lo largo de toda la vida del organismo. Ademas puede dar lugar a celulas especializadas que componen los tejidos y organos del cuerpo.

Una celula madre pluripotente tiene la capacidad de dar lugar a tipos de celulas que se desarrollan de las tres capas germinales (mesodermo, endodermo y ectodermo) de las cuales surgen todas las celulas del cuerpo. Las unicas fuentes conocidas de celulas madre pluripotentes humanas son aquellas que se afslan y cultivan de embriones humanos tempranos y del tejido fetal que estaba destinado a ser parte de las gonadas.

Una celula madre embrionaria se deriva de un grupo de celulas llamadas masa celular interna, que forma parte del embrion temprano (de 4 a 5 dfas) llamado blastocito. Una vez eliminados del blastocito las celulas de la masa celular interna pueden cultivarse en celulas madre embrionarias. Estas celulas madre embrionarias no son en sf embriones.

Una celula madre adulta es una celula indiferenciada (no especializada) que se produce en un tejido diferenciado (especializado), se renueva y se especializa para producir todos los tipos celulares de tejido especializados en el que se coloca cuando se transfiere al tejido apropiado. Las celulas madre adultas son capaces de hacer copias identicas de sf mismas durante toda la vida del organismo. Esta propiedad se conoce como "autorrenovacion". Las celulas madre adultas se dividen normalmente para generar celulas progenitoras o precursoras, que luego se diferencian o se desarrollan en tipos celulares "maduros" que tienen formas caractensticas y funciones especializadas, por ejemplo, la contraccion celular muscular o la senalizacion de celulas nerviosas. Las fuentes de celulas madre adultas incluyen la medula osea, sangre, cornea y retina del ojo, cerebro, musculo esqueletico, pulpa dental, hugado, piel, revestimiento del tracto gastrointestinal y pancreas.

Las celulas madre de la medula osea son el tipo mas estudiado de celulas madre adultas. Ellas pueden usarse clmicamente para restablecer diversos componentes sangumeos e inmunes a la medula osea mediante trasplante. Actualmente se identifican dos tipos importantes de celulas madre que se encuentran en la medula osea: las celulas madre hematopoyeticas (HSC, o celulas CD34+) que se consideran por lo general como celulas sangumeas e inmunitarias, y las celulas madre estromales (mesenquimales) (MSC) que se consideran por lo general para formar el hueso, cartflago, musculo y la grasa. Sin embargo, ambos tipos de celulas madre que se derivan de la medula han demostrado recientemente una extensa plasticidad y multipotencia en su capacidad para formar los mismos tejidos.

La medula, que se localiza en la cavidad medular de los huesos, es el unico sitio de la hematopoyesis en humanos adultos. Produce alrededor de seis mil millones de celulas por kilogramo de peso corporal por dfa. La medula hematopoyeticamente activa (roja) hace una regresion despues del nacimiento hasta la adolescencia tardfa, despues de lo cual se enfoca en las vertebras craneales inferiores, los hombros y las cintas pelvicas, las costillas y el esternon. Las celulas grasas reemplazan las celulas hematopoyeticas en los huesos de las manos, pies, piernas y brazos (medula amarilla). La grasa llega a ocupar aproximadamente el cincuenta por ciento del espacio de la medula roja en el adulto y la metamorfosis de grasa adicional continua lentamente con el envejecimiento. En individuos muy viejos, puede ocurrir una transformacion gelatinosa de la grasa en un material mucoso (medula blanca). La medula amarilla puede revertir a la medula hematopoyeticamente activa si la demanda prolongada esta presente, como con la anemia hemolftica. De este modo, la hematopoyesis puede expandirse aumentando el volumen de la medula roja y disminuyendo el tiempo de

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desarrollo (transito) del progenitor a la celula madura.

El estroma de la medula consiste principalmente en una red de senos que se originan en el endostio de los capilares corticales y terminan en los vasos de recogida que entran en la circulacion venosa sistemica. La pared trilaminar del seno se compone de celulas endoteliales; una membrana basal delgada, subdesarrollada, y las celulas reticulares adventicias que son fibroblastos capaces de transformarse en adipocitos. El endotelio y las celulas reticulares son fuentes de citoquinas hematopoyeticas. La hematopoyesis tiene lugar en los espacios intersenos y esta controlada por una disposicion compleja de citoquinas estimuladoras e inhibitorias, contactos celula a celula y los efectos de los componentes de la matriz extracelular en las celulas proximas. En este ambiente unico, las celulas madre linfohematopoyeticas se diferencian en todos los tipos de celulas sangumeas. Las celulas maduras se producen y se liberan para mantener los niveles de celulas sangumeas en estado estable. El sistema puede satisfacer la demanda creciente de celulas adicionales como resultado de la perdida de sangre, hemolisis, inflamacion, citopenias inmunitarias y otras causas.

Una celula "progenitora o precursora" surge en tejidos fetales o adultos y esta parcialmente especializada; se divide y da lugar a celulas diferenciadas. Los investigadores a menudo distinguen las celulas precursoras/progenitoras de las celulas madre adultas cuando una celula madre se divide, una de las dos nuevas celulas es a menudo una celula madre capaz de reproducirse de nuevo. A diferencia de cuando una celula progenitora/precursora se divide, puede formar mas celulas progenitoras/precursoras o puede formar dos celulas especializadas. Las celulas progenitoras/precursoras pueden reemplazar las celulas que estan danadas o muertas, manteniendo de este modo la integridad y las funciones de un tejido como el Idgado o el cerebro.

Las celulas madre mesenquimales son las celulas expansivas pluripotenciales formativas que se encuentran entre otros en la medula osea, la sangre, la dermis y el periostio que son capaces de diferenciarse en cualquiera de los tipos espedficos de tejidos mesenquimales o conectivos (es decir, los tejidos del cuerpo que soportan los elementos especializados; particularmente los tejidos conectivos adiposos, oseos, cartilaginosos, elasticos y fibrosos conectivos) en dependencia de diversas influencias de factores bioactivos, tales como las citocinas.

El aislamiento y purificacion de celulas madre mesenquimales se ha descrito en detalle en los ejemplos a continuacion. En una modalidad preferida, las celulas madre mesenquimales se afslan de la medula osea de pacientes adultos. En un aspecto, las celulas se pasan a traves de un gradiente de densidad para eliminar los tipos de celulas no deseadas. Preferentemente, las celulas se siembran y cultivan en medios apropiados. En otra modalidad preferida, las celulas se cultivan durante al menos un dfa, preferentemente, aproximadamente tres a aproximadamente siete dfas, y se eliminan las celulas no adherentes. Las celulas adherentes se siembran y se expanden.

Otros medios para aislar y cultivar las celulas madre utiles en la presente invencion son bien conocidos. La sangre del cordon umbilical es una fuente abundante de celulas madre hematopoyeticas. Las celulas madre que se obtienen de la sangre del cordon umbilical y las que se obtienen de la medula osea o sangre periferica parecen ser muy similares para el uso del trasplante. La placenta es una excelente fuente facilmente disponible para las celulas madre mesenquimales. Ademas, las celulas madre mesenquimales pueden derivarse del tejido adiposo y de las celulas estromales de la medula osea y se especula que estan presentes en otros tejidos. Aunque existen dramaticas diferencias cualitativas y cuantitativas en los organos a partir de los cuales pueden derivarse celulas madre adultas, las diferencias iniciales entre las celulas pueden ser relativamente superficiales y equilibradas por el intervalo similar de plasticidad que exhiben.

Se proporcionan composiciones homogeneas de celulas madre mesenquimales humanas que sirven como progenitores para todos los linajes celulares mesenquimales. Las MSC se identifican por marcadores de superficie celular espedficos que se identifican con anticuerpos monoclonales unicos. Las composiciones de MSC homogeneas se obtienen por seleccion positiva de las celulas de la medula adherentes o periosteo que estan libres de marcadores asociados ya sea con celulas hematopoyeticas o celulas mesenquimales diferenciadas. Estas poblaciones de celulas mesenquimales aisladas muestran caractensticas epitopicas asociadas unicamente con celulas madre mesenquimales, tienen la capacidad de regenerarse en cultivo sin diferenciarse y tienen la capacidad para diferenciarse en linajes mesenquimales espedficos cuando se induce ya sea, in vitro o se coloca in vivo en el sitio del tejido danado.

Para obtener celulas madre mesenquimales humanas individuales, las celulas madre mesenquimales pluripotentes se separan de otras celulas de la medula osea o de otras fuentes de MSC. Las celulas de la medula osea pueden obtenerse de la cresta ilfaca, femoral, tibia, espina, costilla u otros espacios medulares. Otras fuentes de celulas madre mesenquimales humanas incluyen el saco vitelino embrionario, placenta, cordon umbilical, piel fetal y adolescente, y la sangre.

Como se analizo anteriormente, las celulas madre mesenquimales pueden aislarse y purificarse por diferentes metodos. Un metodo preferido se ha descrito en detalle en la seccion de ejemplos a continuacion. Otros metodos incluyen, proporcionar una muestra de tejido que contiene celulas madre mesenquimales, anadir celulas de la muestra de tejido a un medio que contiene factores que estimulan el crecimiento de celulas madre mesenquimales sin diferenciacion y permite, cuando se cultivan, la adherencia selectiva de solo las celulas madre mesenquimales a una superficie de sustrato, cultivar de la mezcla de material de muestra y eliminar la materia no adherida de la superficie del sustrato.

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En una modalidad preferida, las celulas madre mesenquimales se derivan de una o fuentes que comprenden: fuentes autologas, heterologas, singenicas, alogenicas o xenogenicas. Estas fuentes pueden incluir lmeas celulares. Como se utiliza en la presente descripcion, "fuente" se refiere al animal del que se obtuvieron estas celulas madre, que incluye al ser humano.

La diferenciacion de las celulas madre mesenquimales al linaje cardfaco se controla por factores presentes en el ambiente cardfaco. Las influencias ambientales, qmmicas, electricas y mecanicas ambientales alteran las MSC pluripotentes y convierten las celulas administradas al corazon en el linaje cardfaco.

En una modalidad preferida, las celulas madre mesenquimales se diferencian en linajes de celulas que forman los diferentes tejidos del corazon. En algunas modalidades, los linajes se identifican mediante marcadores espedficos de celulas cardfacas que comprenden, factor de transcripcion cardfaca GATA-4, MDR1; marcadores de celulas endoteliales Factor VIII y KDR; marcador del musculo liso vascular a-actina de musculo liso; o el marcador cardiomiocitario a-actina sarcomerica. Por ejemplo, la deteccion de la expresion de protemas espedficas de cardiomiocitos se logra usando anticuerpos, por ejemplo, con anticuerpos monoclonales de cadena pesada de miosina MF20 (MF20), ATPasa calcica del retmulo sarcoplasmico (SERCA1) (mnAb 10D1) o uniones gap usando anticuerpos contra la conexina 43. Otros marcadores para cardiomiocitos comprenden troponina I cardfaca (cTnl), troponina cardfaca T (cTnT), cadena pesada de miosina sarcomerica (MHC), GATA-4, Nkx2.5, N-cadherina, p1-adrenoceptor p1-AR), ANF, familia de factores de transcripcion MEF-2, creatina quinasa MB (CK-MB), mioglobina, o factor natriuretico auricular (ANF).

El factor de transcripcion GATA incluye miembros de la familia GATA de factores de transcripcion de dedo de zinc. Los factores de transcripcion GATA estan implicados en el desarrollo de varios linajes celulares que se derivan del mesodermo. Preferentemente, los factores de transcripcion GATA incluyen GATA-4 y/o GATA-6. Las protemas GATA-6 y GATA-4 comparten altos niveles de identidad de secuencia de aminoacidos sobre una region rica en prolina en el extremo amino de la protema que no se conserva en otros miembros de la familia GATA.

En otro aspecto preferido, se administran factores solubles de cultivos de celulas madre mesenquimales a un paciente con enfermedad cardfaca o trastornos de estos. Los factores se administran en una cantidad eficaz que resulta en la localizacion, proliferacion y maduracion de las celulas madre cardfacas en celulas del tejido cardfaco danado.

En otro aspecto preferido, las celulas mesenquimales se administran a un paciente, para tratar enfermedades cardfacas o trastornos de estos. Las celulas pueden ser autologas o se derivan de donantes. La administracion de las celulas madre mesenquimales da lugar al reclutamiento de celulas madre cardfacas a los tejidos danados, la proliferacion acelerada y la diferenciacion de las celulas madre cardfacas y la reparacion de los tejidos danados. En un aspecto preferido, las celulas madre cardfacas son celulas madre endogenas. En otro aspecto, las celulas madre cardfacas pueden derivarse de donantes. Las combinaciones de ongenes de las celulas madre mesenquimales y las celulas madre cardfacas pueden ser de cualquier combinacion. Por ejemplo, las celulas madre mesenquimales son autologas y las celulas madre cardfacas son endogenas. En otras alternativas, las celulas madre mesenquimales se derivan de donantes y las celulas madre cardfacas son endogenas. En otra modalidad, las celulas madre mesenquimales son autologas y las celulas madre cardfacas se derivan de donantes. En otras modalidades, las celulas madre mesenquimales comprenden tanto celulas autologas como donantes y las celulas madre cardfacas comprenden celulas derivadas de donantes y endogenas. En otros aspectos, factores solubles de celulas madre mesenquimales se administran al tejido cardfaco danado para reclutar, acelerar la proliferacion y la diferenciacion de celulas madre cardfacas.

En una modalidad preferida, las celulas madre cardfacas se identifican mediante marcadores que comprenden: c-kitpos, CD3neg, CD14neg y CD68neg.

La lesion cardfaca promueve respuestas tisulares que mejoran la miogenesis usando MSC implantadas. Por lo tanto, las MSC se introducen en la zona del infarto para reducir el grado de formacion de cicatrices y para aumentar la funcion ventricular. De este modo, se crea un nuevo musculo dentro de un segmento miocardico infartado. Las MSC se infiltran directamente en la zona del tejido infartado. La integracion y posterior diferenciacion de estas celulas se caracteriza, como se describio anteriormente. El tiempo de intervencion esta disenado para imitar el escenario clmico donde los pacientes con infarto agudo de miocardio acudinan primero a la atencion medica, recibinan tratamiento de primera lmea, a continuacion de la estabilizacion e intervencion con terapia de reemplazo miocardico si fuera necesario.

De las cuatro camaras del corazon, el ventnculo izquierdo es el principal responsable del bombeo de sangre a presion a traves del sistema circulatorio del cuerpo. Posee las paredes miocardicas mas gruesas y es el sitio mas frecuente de lesion miocardica que da lugar a la insuficiencia cardfaca congestiva. El grado de avance o gravedad de la insuficiencia cardfaca congestiva oscila de aquellos casos donde el trasplante cardfaco se indica tan pronto como un organo donante adecuado este disponible para aquellos donde se observa poca o ninguna lesion permanente y el tratamiento es principalmente profilactico.

La gravedad del infarto del miocardio resultante, es decir, el porcentaje de masa muscular del ventnculo izquierdo que se implica puede variar de aproximadamente 1 a aproximadamente el 80 por ciento. Esto representa areas de tejido afectadas, ya sea como una isquemia contigua o la suma de lesiones isquemicas mas pequenas, con areas horizontales

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afectadas de aproximadamente 1 cm2 a aproximadamente 6 cm2 y un espesor de 1-2 mm a 1-1.5 cm. La gravedad del infarto se afecta significativamente por el(los) vaso(s) involucrado(s) y cuanto tiempo ha pasado antes de que se inicie la intervencion del tratamiento.

Las celulas madre mesenquimales que se usan de acuerdo con la invencion son, por orden de preferencia, autologas, alogenicas o xenogenicas, y la eleccion puede depender en gran medida de la urgencia de la necesidad del tratamiento. Un paciente que presenta una condicion potencialmente mortal puede mantenerse en una maquina corazon/pulmon, mientras que se cultiva un numero suficiente de MSC autologas o puede proporcionarse el tratamiento inicial usando otras MSC autologas.

La terapia con MSC de la descripcion puede proporcionarse por varias vfas de administracion, que se incluyen a continuacion. En primer lugar, puede usarse la inyeccion al musculo intracardfaco, que evita la necesidad de un procedimiento quirurgico abierto, cuando las MSC estan en una preparacion de suspension lfquida inyectable o cuando estan en un medio biocompatible que se inyecta en forma lfquida y se convierte en semisolido en el sitio del miocardio danado. Puede usarse una jeringa intracardfaca convencional o un dispositivo de entrega artroscopico controlable, siempre y cuando el lumen de la aguja o diametro sea de diametro suficiente (por ejemplo, de calibre 30 o mayor) que las fuerzas cortantes no danaran las MSC. Las preparaciones de MSC en suspension lfquida inyectables pueden administrarse ademas, por via intravenosa, ya sea por goteo continuo o como un bolo. Durante los procedimientos quirurgicos abiertos, que implican acceso ffsico directo al corazon, todas las formas de preparaciones descritas para la entrega de las MSC estan disponibles.

Como ejemplo representativo de un intervalo de dosis es un volumen de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 pl de suspension inyectable que contiene aproximadamente 10-40 x 106 MSC/ml. La concentracion de celulas por unidad de volumen, tanto si el medio portador es lfquido o solido, permanece sustancialmente dentro del mismo intervalo. La cantidad de MSC entregada normalmente sera mayor cuando se hace una aplicacion solida de tipo "parche" durante un procedimiento abierto, pero la terapia de seguimiento por inyeccion sera como se describio anteriormente. Sin embargo, la frecuencia y la duracion de la terapia variaran en dependencia del grado (porcentaje) de implicacion tisular, como ya se describio (por ejemplo, 5-40% de masa ventricular izquierda).

En los casos que tienen en el intervalo del 5-10% de implicacion del tejido, es posible tratar con tan poca como una sola administracion de un millon de MSC en 20-50 pl de la preparacion de la inyeccion. El medio de inyeccion puede ser cualquier lfquido isotonico farmaceuticamente aceptable. Los ejemplos incluyen solucion salina tamponada con fosfato (PBS), medio de cultivo tal como DMEM (preferentemente exento de suero), solucion salina fisiologica o dextrosa al 5% en agua.

En los casos que tienen mas de un rango, alrededor del 20% de nivel de gravedad de la implicacion del tejido, se preven inyecciones multiples de 20-50 pl (10-40 *10® MSC/ml). La terapia de seguimiento puede incluir dosis adicionales.

En casos muy graves, por ejemplo, en un intervalo alrededor del 40% de nivel de gravedad de la implicacion del tejido, pueden indicarse dosis multiples equivalentes para una duracion mas prolongada con dosis de mantenimiento postoperatoria a largo plazo (hasta varios meses).

En otro aspecto, las celulas madre mesenquimales expandidas, aisladas y cultivadas pueden utilizarse para la implantacion de diversos dispositivos protesicos. Por ejemplo, usando estructuras ceramicas porosas rellenas con celulas madre mesenquimales humanas expandidas por cultivo, e implantando estas estructuras en areas donde existe un dano tisular extenso.

Tipos Adicionales de Celulas Madre

En otro aspecto, pueden usarse otras celulas madre con las celulas madre mesenquimales en el tratamiento de enfermedades cardfacas y trastornos de estos. Preferentemente, las celulas madre son celulas madre totipotentes o pluripotentes.

Hay muchas celulas indiferenciadas que se han encontrado in vivo. Las celulas madre son celulas inmaduras indiferenciadas, capaces de auto renovarse (division sin lfmite) y de la diferenciacion (especializacion). Estas celulas juveniles son abundantes en un embrion en desarrollo, sin embargo, su numero disminuye a medida que avanza el desarrollo. Por el contrario, un organismo adulto contiene un numero limitado de celulas madre que estan confinadas a ciertos compartimentos corporales.

Se cree generalmente que las celulas madre son monopotentes, bipotentes o pluripotentes. Las celulas madre monopotentes y bipotentes tienen un desarrollo mas restringido y dan lugar a uno o dos tipos de celulas especializadas, respectivamente. Por el contrario, las celulas madre pluripotentes (PSC) pueden diferenciarse en muchos tipos diferentes de celulas, dando lugar a tejido (que constituyen organos) o en el caso de las celulas madre totipotentes, todo el organismo. Las celulas madre pluripotentes, a diferencia de las monopotentes o bipotentes, son capaces de la diferenciacion multilinaje, dando lugar a un tejido que pudiera consistir de una recoleccion de celulas de diferentes tipos o linajes.

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De acuerdo con el entendimiento actual, una celula madre, tal como una celula madre pluripotente, tiene las siguientes cuatro caractensticas: (i) es una celula indiferenciada-- es decir, no se diferencia terminalmente; (ii) tiene la capacidad de dividirse sin lfmite; (iii) tiene la capacidad de dar lugar a progenie diferenciada; y (iv) cuando se divide cada hija tiene una opcion: puede permanecer como celula madre como su padre o puede embarcarse en un curso que conduce a la diferenciacion.

La celula madre hematopoyetica es un ejemplo de una celula madre pluripotente que se encuentra entre las celulas de la medula y da lugar a todas las celulas sangumeas diversas (que incluyen leucocitos y eritrocitos). Las celulas madre hemopoyeticas pueden extraerse por aislamiento de (i) la medula osea, (ii) sangre periferica movilizada por el factor de crecimiento o (iii) sangre del cordon umbilical (placenta). Recientemente, se han preparado celulas madre hematopoyeticas a partir de celulas madre Embrionarias (ES), que se extraen de embriones que se obtienen usando tecnicas de fecundacion in vitro. Estas celulas indiferenciadas son capaces de la diferenciacion en multiples linajes y la reconstitucion detodo el tejido corporal, es decir, son totipotentes.

Hay una serie de celulas madre indiferenciadas del linaje hemopoyetico. Estas incluyen celulas madre pluripotentes (PSC), celulas madre linfoides (LSC) y celulas madre mieloides conocidas colectivamente como celulas progenitoras linfohematopoyeticas (LPC). Las LSC y celulas madre mieloides se forman cada una por la diferenciacion de las PSC. Por lo tanto, las LSC y las celulas madre mieloides estan mas comprometidos que las PSC. Ejemplos de celulas diferenciadas del linaje hemopoyetico incluyen celulas T, celulas B, eosinofilos, basofilos, neutrofilos, megacariocitos, monocitos, granulocitos, mastocitos y linfocitos.

Otras celulas madre incluyen celulas madre neurales, celulas madre multipotentes que pueden generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos (Nakafuku and Nakamura, 1995, J. Neurosci Res., vol 4l(2): 153-68; Anderson, 1994, FASEB J., vol 8(10): 707-13; Morshead et al., 1994, Neuron, Vol 13(5): 1071-82). Las celulas satelitales del musculo esqueletico son otro tipo de celulas madre, mas espedficamente, una clase distinta de celulas miogenicas que se mantienen como celulas madre quiescentes en el adulto y pueden dar lugar a nuevas celulas musculares cuando sea necesario (Bischoff, 1986, Dev Biol., vol 115(1): 129-39). Otros tipos de celulas madre son celulas madre epiteliales, un subconjunto de celulas basales y celulas madre mesenquimales.

Las celulas madre embrionarias (ES) se usan habitualmente en la produccion de animales transgenicos. Las ES han demostrado que se diferencian in vitro en varios tipos celulares que incluyen precursores linfoides (Potocnik et al., 1994, EMBO J., vol 13(22): 5274-83) y celulas neurales. Las celulas ES se caracterizan por una serie de marcadores espedficos de etapas tales como los marcadores embrionarios 3 y 4 (SSEA-3 y SSEA-4), las glicoprotemas de alto peso molecular TRA-1-60 y TRA-1-81 y la fosfatasa alcalina (Andrews et al., 1984, Hybridoma, vol 3: 347-361; Kannagi et al., 1983, EMBO J., vol 2: 2355-2361; Fox et al., 1984, Dev. Biol., vol 103: 263-266; Ozawa et al., 1985, Cell. Differ., vol 16: 169-173).

Diversos antfgenos se asocian con celulas indiferenciadas y diferenciadas. El termino "asociado" aqrn significa, las celulas que expresan o son capaces de expresar, o que presentan o son capaces de ser inducidas a presentar, o que comprenden el(los) antfgeno(s) respectivo(s). La mayona de las celulas indiferenciadas y las celulas diferenciadas comprenden antfgenos de la Clase I y/o Clase II del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC). Si estos antfgenos estan asociados con esas celulas, entonces se denominan celulas Clase I+ y/o Clase II+. Cada antfgeno espedfico asociado con una celula indiferenciada o una celula diferenciada puede actuar como un marcador. Por lo tanto, diferentes tipos de celulas pueden distinguirse entre sf en base a su antfgeno(s) particular(es) asociado(s) o en base a una combinacion particular de antfgenos asociados. Ejemplos de estos antfgenos marcados incluyen los antfgenos CD34, CD19 y CD3. Si estos antfgenos estan presentes, entonces estas celulas particulares se denominan celulas CD34+, CD19+ y CD3+ respectivamente. Si estos antfgenos no estan presentes, estas celulas se denominan celulas CD34-, CD19- y CD3- respectivamente.

Algunos de los marcadores identificados en las celulas madre mieloides comprenden CD34+ DR+, CD13+, CD33+, CD7+ y las celulas TdT+. Las PSC son celulas CD34+ DR' TdT' (siendo otros marcadores utiles CD38' y CD36+). Las LSC son celulas DR+, CD34+ y TdT+ (ademas CD38+). Las celulas madre embrionarias expresan SSEA-3 y SSEA-4, glicoprotemas de alto peso molecular TRA-1-60 y TRA-1-81 y la fosfatasa alcalina. Ademas no expresan SSEA-1, cuya presencia es un indicador de diferenciacion. Se conocen otros marcadores para otros tipos de celulas madre, tales como Nestein para celulas madre neuroepiteliales (J. Neurosci, 1985, Vol 5: 3310). Las celulas madre mesenquimales son ademas positivas para SH2, SH3, cD29, CD44, CD71, CD90, CD106, CD120a y CD124, por ejemplo, y negativas para CD34, CD45 y CD14.

Las celulas madre pueden aislarse ademas para su transduccion y diferenciacion usando metodos conocidos. Por ejemplo, en ratones, las celulas de medula osea se afslan sacrificando el raton y cortando los huesos de las piernas con un par de tijeras. Las celulas madre ademas pueden aislarse de las celulas de la medula osea panning las celulas de la medula osea con anticuerpos que unen celulas no deseadas, tales como CD4+ y CD8+ (celulas T), CD45+ (celulas panB), GR-1 (granulocitos) y lad (celulas presentadoras de antfgenos diferenciadas). Para un ejemplo de este protocolo ver, Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992).

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En seres humanos, las celulas madre hematopoyeticas CD34+ pueden obtenerse de una variedad de fuentes que incluyen sangre de cordon umbilical, medula osea y sangre periferica movilizada. La purificacion de las celulas CD34+ puede lograrse por el procedimiento de afinidad de anticuerpos. El procedimiento de aislamiento en columna de afinidad para aislar celulas CD34+ se describe por Ho et al., Stem Cells 13 (suppl. 3): 100-105(1995). Ver ademas, Brenner, Journal of Hematotherapy 2: 7-17 (1993). Los metodos para aislar, purificar y expandir en cultivo las celulas madre mesenquimales se conocen.

Como alternativa, o ademas, muchas celulas pueden identificarse por caractensticas morfologicas. La identificacion de celulas usando microscopfa, opcionalmente con tecnicas de tincion es una rama de la ciencia extremadamente bien desarrollada denominada histologfa y las habilidades relevantes se poseen ampliamente en la tecnica.

Pueden emplearse diversas tecnicas para separar las celulas mediante la eliminacion inicial de las celulas de linaje dedicado. Los anticuerpos monoclonales son particularmente utiles para identificar marcadores asociados con linajes celulares particulares y/o etapas de la diferenciacion.

Si se desea, una gran proporcion de celulas terminalmente diferenciadas pueden eliminarse usando inicialmente una separacion "relativamente cruda". Por ejemplo, las separaciones de cuentas magneticas pueden usarse inicialmente para eliminar un gran numero de celulas comprometidas del linaje. Es conveniente, que al menos aproximadamente el 80%, normalmente al menos el 70% del total de las celulas hematopoyeticas se eliminen.

Los procedimientos para la separacion pueden incluir pero no se limitan a, la separacion magnetica, usando cuentas magneticas recubiertas con anticuerpos, cromatograffa de afinidad, agentes citotoxicos unidos a un anticuerpo monoclonal o usados conjuntamente con un anticuerpo monoclonal, que incluyen, pero no se limitan a, complemento y citotoxinas y "panning" con anticuerpo unido a una matriz solida, por ejemplo, placa, elutriacion o cualquier otra tecnica conveniente.

Las tecnicas que proporcionan una separacion precisa incluyen pero no se limitan a la citometna de flujo, que puede tener diversos grados de complejidad, por ejemplo, una pluralidad de canales de color, canales de deteccion de dispersion de la luz de angulo bajo y obtuso, canales de impedancia, etc.

Agentes Cardiotropicos: En algunos aspectos de la descripcion, uno o mas "factores cardiotropicos" pueden incluirse en el medio de cultivo si el usuario desea que se diferencien las celulas madre. Estos son factores que, ya sean solos o en combinacion, aumentan la proliferacion o supervivencia de las celulas de tipo cardiomiocito o inhiben el crecimiento de otros tipos de celulas. El efecto puede deberse a un efecto directo sobre la propia celula, o debido a un efecto sobre otro tipo celular, lo que a su vez mejora la formacion de cardiomiocitos. Por ejemplo, los factores que inducen la formacion de celulas hipoblasticas o equivalentes de epiblasto, o hacen que estas celulas produzcan sus propios elementos promotores del corazon, entran dentro de la rubrica de factores cardiotropicos.

Los factores pensados para inducir la diferenciacion de las celulas madre pluripotentes en celulas de la capa del mesodermo, o facilitar la diferenciacion adicional en celulas del linaje de los cardiomiocitos incluyen los siguientes: Los analogos de nucleotidos que afectan a la metilacion del ADN y alteran la expresion de genes relacionados con cardiomiocitos TGF-p ligandos (ejemplificado porTGF-p1, TGF-p2, TGF-p3 y otros miembros de la superfamilia de los TGF-p). Los ligandos se unen a un receptor de TGF-p que activan las serinas quinasas de Tipo I y Tipo II y causan la fosforilacion del efector de Smad. Los morfogenos como Activina A y Activina B (miembros de la superfamilia de los TGF-p); factores de crecimiento similares a la insulina (tales como IGF II); protemas morfogenicas oseas (miembros de la superfamilia de los TGF-p, ejemplificadas por BMP-2 y BMP-4); factores de crecimiento de fibroblastos (ejemplificados por bFGF, FGF-4 y FGF-8) y otros ligandos que activan la quinasa citosolica raf-1 y protemas quinasas activadas por mitogenos (MAPK); factor de crecimiento derivado de plaquetas (ejemplificado por PDGFp), factores natriureticos (ejemplificado por el factor natriuretico atrial (ANF), peptido natriuretico cerebral (BNP). Los factores relacionados tales como la insulina, factor inhibidor de leucemia (LIF), factor de crecimiento epidermico (EGF), TGFa, y productos del gen cripto. Anticuerpos espedficos con actividad agonista para los mismos receptores. Como alternativa o ademas, las celulas pueden ser cocultivadas con celulas (tales como las celulas endoteliales de diversos tipos) que segregan factores que mejoran la diferenciacion de los cardiomiocitos. Los analogos de nucleotidos que afectan la metilacion del ADN (y de este modo influyen en la expresion genica) pueden usarse eficazmente para aumentar la proporcion de celulas del linaje de cardiomiocitos que emergen a continuacion de la diferenciacion inicial. Por ejemplo, se ha encontrado que la inclusion de la 5-aza-desoxi-citidina en el medio de cultivo aumenta la frecuencia de las celulas que se contraen en la poblacion y la expresion de aMHC cardfaca.

Las combinaciones particularmente eficaces de agentes cardiotropicos incluyen el uso de un morfogeno como la Activina A y una pluralidad de factores de crecimiento, tales como los incluidos en las familias TGF-p e IGF durante la fase de compromiso inicial, opcionalmente se suplementa con cardiotropinas adicionales tales como uno o mas factores de crecimiento de fibroblastos, protemas morfogenicas oseas y factores de crecimiento derivados de plaquetas.

Durante la elaboracion de esta invencion, se encontro que los factores omitidos tales como el factor II de crecimiento similar a la insulina (IGF II) y las moleculas relacionadas con las etapas finales de la diferenciacion in vitro aumentaron realmente los niveles de la expresion genica cardfaca. En estudios no relacionados, se ha encontrado que la IGF II

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disminuye los niveles de GSK3p en fibroblastos (Scalia et al., J. Cell. Biochem. 82:610, 2001). Por lo tanto, el IGF II puede potenciar los efectos de las protemas Wnt presentes en el medio de cultivo o son secretadas por las celulas. Las protemas Wnt se estabilizan normalmente y causan la translocacion nuclear de una molecula citoplasmica, p-catenina, que comprende una porcion del factor de transcripcion TCF. Esto cambia la actividad transcripcional de multiples genes. En ausencia de Wnt, la quinasa GSK3p fosforila la p-catenina, lo que desestabiliza la p-catenina y la mantiene en el citoplasma.

Dado que los activadores de Wnt como la IL-2 limitan aparentemente la diferenciacion de cardiomiocitos, se cree que el cultivo con antagonistas de Wnt puede aumentar la extension o proporcion de diferenciacion de cardiomiocitos de celulas hES. La senalizacion Wnt puede inhibirse mediante la inyeccion de mRNA sintetico que codifica ya sea DKK-1 o Crescent (protemas secretadas que se unen e inactivan Wnts) (Schneider et al., Genes Dev. 15:304, 2001), o por infeccion con retrovirus que codifican DKK-1 (Marvin et al., Genes Dev. 15:316, 2001). Como alternativa, la via Wnt puede inhibirse aumentando la actividad de la quinasa GSK3p, por ejemplo, cultivando las celulas con factores tales como la IL-6 o glucocorticoides.

Las combinaciones y cantidades de tales compuestos que son eficaces para enriquecer la produccion de cardiomiocitos pueden determinarse empmcamente cultivando celulas madre embrionarias diferenciadas tempranamente o indiferenciadas o su progenie en un ambiente de cultivo que incorpora tales factores y determinando despues si el compuesto ha aumentado el numero de celulas del linaje de cardiomiocitos en la poblacion de acuerdo con los marcadores fenotfpicos listados a continuacion.

Siguiente a la diferenciacion inicial (y antes o despues de una etapa de separacion, si se emplea), es posible aumentar el porcentaje de celulas del linaje de cardiomiocitos cultivando en un ambiente que contiene un "agente de enriquecimiento de cardiomiocitos". Este es un factor en el medio o en un sustrato superficial que promueve la proliferacion del tipo celular deseado, ya sea facilitando la proliferacion de celulas del linaje de cardiomiocitos, o inhibiendo el crecimiento (o causando apoptosis) de celulas de otros tipos de tejidos. Algunos de los factores cardiotropicos listados anteriormente son adecuados para este proposito. Ademas, ciertos compuestos conocidos beneficiosos son adecuados para los cardiomiocitos in vivo, o sus analogos. Se incluyen compuestos capaces de formar un enlace fosfato de alta energfa (tal como la creatina); una molecula portadora del grupo acilo (tal como la carnitina); y un modulador de canales de calcio de cardiomiocitos (tal como la taurina).

Los marcadores espedficos de cardiomiocitos comprenden: Troponina cardfaca I (cTnl), una subunidad del complejo de troponina que proporciona un interruptor molecular sensible al calcio para la regulacion de la contraccion muscular estriada. Troponina cardfaca T (cTnT), Factor natriuretico auricular (ANF), una hormona que se expresa en cardiomiocitos cardfacos y fetales en desarrollo pero regulada negativamente en adultos. Se considera un buen marcador para los cardiomiocitos porque se expresa de una manera muy espedfica en las celulas cardfacas pero no en los miocitos esqueleticos. Las celulas ademas expresaran por lo general al menos uno (y a menudo al menos 3, 5 o mas) de los siguientes marcadores: cadena pesada de miosina sarcomerica (MHC) Titina, tropomiosina, a-actinina y desmina, GATA-4, un factor de transcripcion que esta muy expresado en el mesodermo cardfaco y persiste en el corazon en desarrollo. Regula muchos genes cardfacos y juega un papel en la cardiogenesis Nkx2.5, un factor de transcripcion cardfaca que se expresa en el mesodermo cardfaco durante el desarrollo embrionario temprano del raton, que persiste en el corazon en desarrollo. MEF-2A, MEF-2B, MEF-2C, MEF-2D; los factores de transcripcion que se expresan en el mesodermo cardfaco y persisten en el desarrollo de la N-cadherina del corazon, que media la adhesion entre las celulas cardfacas, Conexina 43 que forma uniones gap entre cardiomiocitos. p1-adrenoceptor (p1-AR), creatina quinasa MB (CK-MB) y mioglobina, que se elevan en suero a continuacion del infarto de miocardio. Otros marcadores que pueden ser positivos en los cardiomiocitos y sus precursores incluyen actina cardfaca a, respuesta de crecimiento temprana I, y ciclina D2.

Los marcadores espedficos de tejidos pueden detectarse usando cualquier tecnica inmunologica adecuada, tal como inmunocitoqmmica de flujo o adsorcion por afinidad para marcadores de superficie celular, inmunocitoqmmica (por ejemplo, de celulas fijas o secciones de tejido) para marcadores intracelulares o de superficie celular, analisis de transferencia (de tipo) Western de extractos celulares e inmunoensayo enzimatico, para extractos celulares o productos que se secretan en el medio. Se dice que la expresion de un antfgeno por una celula se detecta por un anticuerpo si una cantidad detectable significante del anticuerpo se unira al antfgeno en un ensayo de inmunocitoqmmica estandar o por citometna de flujo, opcionalmente despues de la fijacion de las celulas, y opcionalmente usando un anticuerpo secundario marcado u otro conjugado (tal como un conjugado de biotina avidina) para amplificar el marcaje.

La expresion de productos genicos espedficos de tejidos ademas puede detectarse a nivel de ARNm por analisis de transferencia (de tipo) Northern, analisis de hibridacion dot-blot o por reaccion en cadena de polimerasa iniciada por transcriptasa inversa (RT-PCR) usando cebadores espedficos de secuencia en metodos de amplificacion estandar. Ver la patente de los EE. UU. num. 5,843,780 para detalles de la tecnica general. Los datos de la secuencia para otros marcadores listados en esta descripcion pueden obtenerse de la base de datos publica tal como GenBank (URL
www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez). Se dice que la expresion al nivel del ARNm se detecta de acuerdo con uno de los ensayos descritos en esta descripcion si el rendimiento del ensayo en muestras de celulas de acuerdo con procedimientos estandares en un experimento controlado tfpico da lugar a un producto de hibridacion o amplificacion claramente discernible. La expresion de marcadores espedficos de tejido detectados a nivel de protema o ARNm se

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considera positiva si el nivel es al menos 2 veces, y preferentemente mas de 10 o 50 veces superior al de una celula de control, tal como una celula madre pluripotente indiferenciada u otros tipos de celulas no relacionadas.

Una vez que los marcadores en la superficie de las celulas del fenotipo deseado se han identificado, pueden usarse para la inmunoseleccion para enriquecer ademas la poblacion por tecnicas tales como el inmunopanning o la seleccion de celulas activadas por fluorescencia mediada por anticuerpos.

Terapia Genica

En algunos aspectos preferidos, las celulas madre mesenquimales comprenden genes terapeuticos para su entrega en el cuerpo, tales como, por ejemplo, el corazon. En algunos aspectos, el gen terapeutico es un transgen. Por ejemplo, las celulas entregadas por ejemplo, las celulas madre mesenquimales se eliminan del cuerpo y se introduce un transgen terapeutico en ellas a traves de vetuculos bien conocidos por aquellos con experiencia en la tecnica tales como los que se usan en los metodos de transferencia directa de genes. Por ejemplo, mientras todavfa estan en el laboratorio, las celulas geneticamente modificadas se prueban y despues se les permite crecer y multiplicarse y, por ultimo, se infunden de nuevo al paciente. Como alternativa, las celulas alogenicas que llevan genes endogenos normales pueden revertir una deficiencia en un tejido objetivo particular. El uso de celulas que llevan transgenes o genes endogenos normales, se denomina en la presente terapia genica.

La terapia genica usando celulas modificadas geneticamente ofrece varias ventajas unicas sobre la transferencia directa de genes al cuerpo. Primero, la adicion del transgen terapeutico a las celulas de entrega tiene lugar fuera del paciente, lo que permite al clrnico una medida importante de control porque pueden seleccionar y trabajar solamente con aquellas celulas que contienen tanto el transgen y la produccion del agente terapeutico en una cantidad suficiente.

En algunos aspectos, las celulas madre mesenquimales expresan factores de reclutamiento de celulas madre, factores de crecimiento, factores terapeuticos, factores endogenos tales como, por ejemplo, troponina cardfaca I (cTnl), troponina cardfaca T (cTnT), factor natriuretico auricular (ANF), y similares. En vista de lo anterior, los metodos de acuerdo con la presente descripcion son utiles para dirigir un gen de interes (ya sea un transgen o un gen endogeno) a un tejido en un mamfero introduciendo una celula que comprende el gen de interes para el mamfero. Estos metodos son utiles para tratar una enfermedad caracterizada por una deficiencia en un producto genico en un mamfero, por la administracion de una celula que comprende un gen funcional que codifica el producto genico en el mairnfero y la administracion de un glicoconjugado al mamfero. Las celulas madre pueden usarse como vetuculo para administrar genes a tejidos espedficos del cuerpo. Las terapias en base a celulas madre son un area importante en la investigacion del cancer.

Los aspectos de la descripcion proporcionan ademas la localizacion de celulas transfundidas tales como celulas madre para proporcionar un gen funcional a un paciente que sufre de una enfermedad causada por la falta de ese gen, o, el reclutamiento de celulas madre endogenas al tejido cardfaco danado. Al proporcionar un gen que permite el reclutamiento, la estimulacion y la proliferacion de celulas madre cardfacas, el tratamiento de la enfermedad cardfaca o los trastornos de estos pueden acelerarse mas aun. Por lo tanto, la presente descripcion proporciona ademas la capacidad de dirigir la localizacion de las celulas transfundidas, tales como las celulas madre alogenicas que tienen un gen normal estable. Tales celulas transfundidas crean despues una micro- quimera estable del receptor.

El reclutamiento de las celulas madre al sitio objetivo puede inducirse artificialmente por la administracion sistemicamente de una quimocina apropiada o en el sitio deseado via inyeccion o por la expresion a partir de las celulas madre mesenquimales. Una molecula adecuada es el factor 1 inducible de hipoxia, una quimocina tal como el factor 1 que se deriva del estroma (SDF-1). Las celulas madre endoteliales pueden reclutarse ademas al sitio deseado por medio de una interleucina, tal como IL-1 o IL-8.

Puede desearse que las celulas tengan la capacidad de replicarse en cierta seleccion de farmacos y aplicaciones terapeuticas, y para proporcionar un deposito para la generacion de cardiomiocitos y sus precursores. Las celulas pueden opcionalmente telomerizarse para aumentar su potencial de replicacion, ya sea antes o despues de que progresan a celulas de linaje de desarrollo restringidas o celulas terminalmente diferenciadas. Las celulas madre que se telomerizan pueden tomarse por la via de diferenciacion descrita anteriormente; o las celulas diferenciadas pueden telomerizarse directamente.

Las celulas son telomerizadas alterandolas geneticamente por transfeccion o transduccion con un vector adecuado, recombinacion homologa, u otra tecnica apropiada, de manera que expresan el componente catalftico de la telomerasa (TERT), por lo general bajo un promotor heterologo que aumenta la expresion de la telomerasa mas alla de lo que ocurre bajo el promotor endogeno. El componente catalftico particularmente adecuado es el de la telomerasa humana (hTERT), proporcionado en la solicitud de Patente Internacional num. WO 98/14592. Para ciertas aplicaciones, pueden usarse ademas homologos de especies como TERT de raton (patente num. WO99/27113). La transfeccion y expresion de la telomerasa en celulas humanas se describe en Bodnar et al., Science 279:349, 1998 and Jiang et al., Nat. Genet. 21:111, 1999. En otro ejemplo, se usan clones hTERT (patente num. WO 98/14592) como fuente de secuencia que codifica hTERT, y se empalman en un sitio EcoRI de un vector PBBS212 bajo el control del promotor MPSV, o en el sitio EcoRI del vector del retrovirus pBABE comercialmente disponible, bajo el control del promotor LTR.

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Las celulas madres diferenciadas o indiferenciadas se alteran geneticamente usando sobrenadantes que contiene el vector durante un penodo de 8-16 h, y despues se intercambian en medio de crecimiento durante 1-2 d^as. Las celulas geneticamente alteradas se seleccionan usando un agente de seleccion de farmacos tal como la puromicina, G418, o la blasticidina, y luego se recultivan. Despues pueden evaluarse para la expresion de hTERT mediante RT-PCR, actividad telomerasa (ensayo TRAP), tincion inmunocitoqmmica para hTERT, o capacidad replicativa. Los siguientes estuches de ensayo estan disponibles comercialmente para fines de investigacion: TRAPeze™, XL Telomerase Detection Kit (Cat. s7707; Intergen Co., Purchase N.Y.); y TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAplus (Cat. 2,013,89; Roche Diagnostics, Indianapolis Ind ). La expresion de TERT puede evaluarse ademas en el ARNm mediante RT-PCR. Para fines de investigacion esta disponible comercialmente el estuche de cuantificacion de hCATT de LightCycler TeloTAGGG (Cat. 3,012,344; Roche Diagnostics). Las colonias que se replican continuamente se enriquecen por cultivo adicional en condiciones que apoyan la proliferacion, y las celulas con fenotipos deseables pueden clonarse opcionalmente por dilucion limitante.

En ciertos aspectos, las celulas madre se diferencian en precursores de cardiomiocitos, y despues se modifican geneticamente para expresar TERT. En otros aspectos, las celulas madre se alteran geneticamente para expresar TERT, y despues se diferencian en precursores de cardiomiocitos o celulas diferenciadas terminalmente. La modificacion exitosa para aumentar la expresion de TERT puede determinarse por el ensayo TRAP, o determinando si la capacidad replicativa de las celulas ha mejorado.

En dependencia del uso propuesto de las celulas, pueden aceptarse ademas otros metodos de inmortalizacion, tales como la transformacion de las celulas con ADN que codifica myc, el antfgeno T grande de SV40, o MOT-2 (patente de EE. UU. num 5,869,243, solicitudes de patentes internacionales num. WO 97/32972 y WO 01/23555). La transfeccion con oncogenes o productos de oncovirus es menos adecuada cuando las celulas se van a usar con fines terapeuticos. Las celulas telomerizadas son de particular interes en aplicaciones en donde es ventajoso tener celulas que puedan proliferar y mantener su cariotipo, por ejemplo, en la seleccion farmaceutica, y en protocolos terapeuticos donde se administran celulas diferenciadas a un individuo para aumentar la funcion de la actividad cardfaca.

Las celulas pueden alterarse geneticamente ademas para mejorar su capacidad para involucrarse en la regeneracion de tejidos, o para entregar un gen terapeutico a un sitio de administracion. Un vector se disena usando la secuencia de codificacion conocida para el gen deseado, operativamente unido a un promotor que es tan pan espedfico o como activo espedficamente en el tipo de celula diferenciada. De particular interes son las celulas que estan geneticamente alteradas para expresar uno o mas factores de crecimiento de diversos tipos, factores cardiotropicos tales como factor natriuretico atrial, cripto y factores de regulacion de la transcripcion cardfaca, tales como GATA-4, Nkx2.5 y MEF2-C. La produccion de estos factores en el sitio de administracion puede facilitar la adopcion del fenotipo funcional, mejorar el efecto beneficioso de la celula administrada, o aumentar la proliferacion o la actividad de las celulas huesped vecinas al sitio de tratamiento.

Introduccion de Transgenes en las Celulas Madre

Los medios para introducir transgenes en las celulas son bien conocidos. Una variedad de metodos para suministrar y expresar un acido nucleico dentro de una celula de mairnfero son conocidos por aquellos con conocimientos ordinarios en la tecnica. Estos metodos incluyen, por ejemplo, vectores virales, entrega de genes en base a liposomas (patente num. WO 93/24640; Mannino Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7):682-691 (1988); patente de EE. UU. num. 5,279,833; patente num. WO 91/06309; Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7414 (1987); y Budker et al., Nature Biotechnology, 14(6):760-764 (1996)). Otros metodos conocidos por el tecnico con experiencia incluyen la electroporacion (patentes de EE. UU. numeros 5,545,130, 4,970,154, 5,098,843, y 5,128,257), transferencia directa de genes, fusion celular, metodos de precipitacion, bombardeo de partfculas y captacion mediada por receptor (patente de EE. UU. numeros 5,547,932, 5,525,503, 5,547,932, y 5,460,831). Ver ademas, patente de EE. UU. num. 5,399,346.

Los vectores retrovirales ampliamente usados incluyen aquellos en base al virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del simio gibon (GaLV), el virus de la Inmunodeficiencia de Simios (SIV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones es estos. Ver, por ejemplo, Buchscher et al., J. Virol. 66(5):2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66(5):1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700, and Rosenburg & Fauci, in Fundamental Immunology, Third Edition (Paul ed., 1993)).

Los vectores basados en AAV Ademas se usan para transducir celulas con acidos nucleicos diana, por ejemplo, en la produccion in vitro de acidos nucleicos y polipeptidos, y procedimientos de terapia genica in vivo y ex vivo. Ver, West et al., Virology 160:38-47 (1987); patente de EE. UU. num. 4,797,368; patente num. WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invst. 94:1351 (1994) and Samulski (supra) for an overview of AAV vectors. La construccion de vectores recombinantes AAV se describen en un numero de publicaciones que incluyen Lebkowski, patente de EE. UU. num. 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5(11):3251-3260 (1985); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 (1984); and Samulski et al., J Virol. 63:03822-3828 (1989).

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Los vectores retrovirales se usan por lo general para celulas utiles en la presente invencion. Tales vectores pueden comprender, por ejemplo, un acido nucleico empaquetador de HIV-2 envasado en una partfcula de HIV-2, por lo general se usa una lmea celular de empaquetamiento. Los vectores de transduccion celular tienen una utilidad comercial considerable como un metodo de introduccion de genes en celulas objetivo. En particular, los procedimientos deterapia genica pueden usarse, en los que los vectores de transduccion celular de la invencion se usan para transducir celulas objetivos con un acido nucleico terapeutico en un procedimiento in vivo o ex vivo.

Pueden usarse celulas madre, tales como celulas madre CD34+, en procedimientos ex vivo para transduccion celular y terapia genica. La presente invencion utiliza la caractenstica de que las celulas madre se diferencian en otros tipos celulares in vitro, o pueden introducirse en un mairnfero (tal como el donante de las celulas) donde se injertaran en el corazon para la diferenciacion. Por lo tanto, las modalidades se extienden a dirigir las celulas madre a organos particulares para regenerar el tejido, tal como al corazon para regenerar las celulas del musculo cardfaco. Las celulas madre, por ejemplo, las celulas madre pluripotentes, pueden usarse ademas conjuntamente con las celulas madre mesenquimales. Si se desea, las celulas madre pueden diferenciarse ademas in vitro. Los metodos para diferenciar celulas CD34+ in vitro en tipos de celulas inmunitarias clmicamente importantes usando citoquinas tales como GM-CSF, IFNy y TNFa se conocen (ver, Inaba et al., J. Exp. Med. 176, 1693-1702(1992), y Szabolcs et al. 154: 5851-5861(1995)). Yu et al., PNAS 92: 699-703(1995) describen un metodo para transducir celulas CD34+ de sangre de cordon fetal humano usando vectores retrovirales.

Seleccion de Farmacos

Las celulas de esta descripcion pueden usarse para seleccionar factores (tales como disolventes, farmacos de moleculas pequenas, peptidos, oligonucleotidos) o condiciones ambientales (tales como condiciones de cultivo o manipulacion) que afectan las caractensticas de dichas celulas y sus diversas progenies.

En algunas aplicaciones, las celulas madre mesenquimales u otros tipos de celulas madre se usan para seleccionar factores que promueven la maduracion en precursores de cardiomiocitos de etapa mas tarde, o celulas diferenciadas terminalmente, o para promover la proliferacion y el mantenimiento de tales celulas en cultivo a largo plazo. Por ejemplo, los factores de maduracion o factores de crecimiento candidatos se prueban anadiendolos a celulas en diferentes pocillos y, despues, se determina cualquier cambio fenotfpico que da lugar, de acuerdo con los criterios deseables para el cultivo adicional y el uso de las celulas.

Otras aplicaciones de seleccion de esta descripcion se refieren a la prueba de compuestos farmaceuticos para su efecto sobre el mantenimiento o la reparacion del tejido del musculo cardfaco. La seleccion puede realizarse ya sea porque el compuesto esta disenado para tener un efecto farmacologico en las celulas, o porque un compuesto disenado para tener efectos en otras partes puede tener efectos secundarios no deseados en las celulas de este tipo de tejido. La seleccion puede llevarse cabo usando cualquiera de las celulas madre o celulas diferenciadas terminalmente.

El lector se refiere generalmente al libro de texto estandar In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997, y la patente de EE.UU. num. 5,030,015. La evaluacion de la actividad de los compuestos farmaceuticos candidatos generalmente implica la combinacion de las celulas de esta invencion con el compuesto candidato, ya sea solo o en combinacion con otros farmacos. El investigador determina cualquier cambio en la morfologfa, fenotipo marcador o actividad funcional de las celulas que sea atribuible al compuesto (en comparacion con celulas no tratadas o celulas tratadas con un compuesto inerte) y, despues, correlaciona el efecto del compuesto con el cambio que observa.

La citotoxicidad puede determinarse en primer lugar por el efecto sobre la viabilidad celular, la supervivencia, la morfologfa y la expresion de ciertos marcadores y receptores. Los efectos de un farmaco sobre el ADN cromosomico pueden determinarse midiendo la smtesis o la reparacion del ADN. La incorporacion de [3H]-timidina o BrdU, es consistente con un efecto del farmaco, especialmente en tiempos no programados en el ciclo celular, o por encima del nivel requerido para la replicacion celular. Los efectos no deseados pueden incluir ademas tasas inusuales de intercambio de cromatidas hermanas, determinadas por la propagacion de la metafase. El lector se refiere a A. Vickers (pp 375-410 in In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997) para una elaboracion adicional.

El efecto de la funcion celular puede evaluarse usando cualquier ensayo estandar para observar el fenotipo o la actividad de los cardiomiocitos, tales como la expresion del marcador, la union al receptor, la actividad contractil, o la electrofisiologfa, ya sea en cultivo celular o in vivo. Los candidatos farmaceuticos pueden probarse ademas para su efecto sobre la actividad contractil, tal como si ellos aumentan o disminuyen la extension o la frecuencia de la contraccion. Donde se observa un efecto, la concentracion del compuesto puede titularse para determinar la dosis efectiva media (ED50).

Tratamiento

La cantidad de celulas madre administradas al paciente variara ademas en dependencia de la condicion del paciente y debe determinarse por los profesionales a traves de la consideracion de todos los factores apropiados. Preferentemente, sin embargo, se utilizan para seres humanos adultos aproximadamente 1x106 a aproximadamente 1x1012, con mayor preferencia aproximadamente 1x108 a aproximadamente 1x1011, con mayor preferencia,

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aproximadamente 1x109 a aproximadamente 1x1010 celulas madre. Estas cantidades variaran en dependencia de la edad, peso, tamano, condicion, sexo del paciente, el tipo de tumor a tratar, la via de administracion, si el tratamiento es regional o sistemico y otros factores. Aquellos con experiencia en la tecnica debenan ser facilmente capaces de derivar dosis y programas de administracion apropiados para adecuarse a la circunstancia espedfica y a las necesidades del paciente.

Los metodos de reintroduccion de componentes celulares son conocidos en la tecnica e incluyen procedimientos tales como los ejemplificados en la patente de EE.UU. num. 4,844,893 de Honsik, et al. y la patente de EE.UU. num. 4,690,915 de Rosenberg.

Composiciones Farmaceuticas

En otros aspectos, la presente invencion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden celulas madre mesenquimales. En otros aspectos preferidos, las composiciones farmaceuticas comprenden una celula madre mesenquimal y celulas madre embrionarias.

En otros aspectos, la presente descripcion caracteriza estuches para tratar el dano del tejido cardfaco o para entregar un gen o un producto genico funcional al corazon en un mairnfero que comprende una celula madre mesenquimal. Las celulas madre se han presentado generalmente a los organos deseados ya sea por inyeccion en el tejido, por infusion en la circulacion local o por movilizacion de celulas madre autologas de la medula acompanada de previa eliminacion de organos que atrapan las celulas madre antes de su movilizacion cuando sea factible, es decir, esplenectomfa.

En algunas modalidades, la administracion de las composiciones de celulas madre puede acoplarse con otras terapias. Por ejemplo, puede administrarse un agente terapeutico antes, concomitantemente con, o despues de infundir las celulas madre a un paciente.

La administracion de celulas transducidas ex vivo puede ser por cualquiera de las vfas normalmente usadas para introducir una celula o molecula en contacto final con celulas de la sangre o tejido. Las celulas madre pueden administrarse de cualquier manera adecuada, preferentemente con veldculos farmaceuticamente aceptables. Los metodos adecuados para administrar tales celulas en el contexto de la presente invencion a un paciente estan disponibles, y, aunque se puede usar mas de una via para administrar una composicion particular, una via particular puede proporcionar a menudo una reaccion mas inmediata y mas eficaz que otra via.

Los portadores farmaceuticamente aceptables se determinan en parte por la composicion particular que se administra, asf como por el metodo particular que se usa para administrar la composicion. Como consecuencia, hay una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmaceuticas de la presente invencion.

Las formulaciones adecuadas para la administracion parenteral, tales como, por ejemplo la via intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intradermica, intraperitoneal, y subcutanea, incluyen soluciones de inyeccion isotonicas esteriles acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostaticos y solutos que hacen a la formulacion isotonica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspension, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. La administracion parenteral es un metodo util de administracion. Las formulaciones pueden presentarse en contenedores sellados de dosis unitaria o de multiples dosis, tales como, frascos y ampulas, y en algunas modalidades, pueden almacenarse en una condicion seca por congelacion (liofilizada) que requiere solamente la adicion del portador lfquido esteril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Estas formulaciones pueden administrarse con factores que movilizan la clase deseada de celulas madre adultas en la circulacion.

Las soluciones y las suspensiones de inyeccion extemporaneas pueden prepararse a partir de polvos, granulos y tabletas esteriles del tipo descrito anteriormente. Las celulas transducidas por el vector como se describio anteriormente en el contexto de la terapia ex vivo pueden administrarse ademas parenteralmente como se describio anteriormente, excepto que la liofilizacion no es generalmente apropiada, ya que las celulas se destruyen por la liofilizacion. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente descripcion debena ser suficiente para efectuar una respuesta terapeutica beneficiosa en el paciente a lo largo del tiempo. La dosis se determinara por la eficacia de las celulas particulares empleadas y la condicion del paciente, asf como el peso corporal del paciente a tratar. El tamano de la dosis se determinara ademas por la existencia, naturaleza y extension de cualquier efecto secundario adverso que acompane a la administracion de un tipo celular en un paciente particular. Para determinar la cantidad efectiva de celulas a administrar en el tratamiento o profilaxis de enfermedades, el medico debe evaluar los niveles plasmaticos circulantes, y, en el caso de la terapia de reemplazo, la produccion del producto genico de interes.

Las celulas transducidas se preparan para la reinfusion de acuerdo con metodos establecidos. Ver, Abrahamsen et al., J. Clin. Apheresis 6:48-53(1991); Carter et al., J. Clin. Apheresis 4:113-117(1988); Aebersold et al., J. Immunol. Methods 112: 1-7(1988); Muul et al., J. Immunol. Methods 101:171-181(1987) and Carter et al., Transfusion 27:362-365(1987). Despues de un penodo de aproximadamente 2-4 semanas en cultivo, las celulas pueden estar en un numero entre 1*106 y 1*1010 En este sentido, las caractensticas de crecimiento de las celulas vanan de paciente a paciente y de tipo celular a tipo celular. Aproximadamente 72 horas antes de la reinfusion de las celulas transducidas, se toma una

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aKcuota para el analisis del fenotipo y el porcentaje de celulas que expresan el agente terapeutico.

Para la administracion, las celulas de la presente descripcion pueden administrarse a una velocidad determinada por la LD50 del tipo celular y los efectos secundarios del tipo de celula a diversas concentraciones, como se aplican a la masa y la salud general del paciente. La administracion puede lograrse a traves de dosis unicas o divididas. Las celulas madre adultas pueden movilizarse ademas usando factores administrados exogenamente que estimulen su produccion y la salida de tejidos o espacios, que pueden incluir, pero no estan restringidos a, la medula osea o tejidos adiposos.

La invencion se ha descrito en detalle con referencia a las modalidades preferidas de esta. Sin embargo, se apreciara que aquellos con experiencia en la tecnica, al considerar esta descripcion, pueden hacer modificaciones y mejoras dentro del alcance de la invencion. Los ejemplos siguientes no limitantes son ilustrativos de la invencion.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar las modalidades seleccionadas de la invencion. Se apreciara que las variaciones de proporciones y alternativas en los elementos de los componentes mostrados seran evidentes para aquellos con experiencia en la tecnica y estan dentro del alcance de las modalidades de la presente invencion.

Las modalidades de la invencion pueden ser practicadas sin los aspectos teoricos presentados. Ademas, los aspectos teoricos se presentan con el entendimiento de que los solicitantes no buscan estar limitados a la teona presentada.

Aunque diversas modalidades de la presente invencion se han descrito anteriormente, se entendera que estas se presentan en forma de ejemplo solamente, y sin limitacion. Pueden realizarse numerosos cambios en las modalidades descritas de acuerdo con la presente descripcion sin apartarse del alcance de la invencion. De este modo, la amplitud y alcance de la presente invencion no debe limitarse por ninguna de las modalidades ilustrativas.

Materiales y Metodos

Aislamiento, Cosecha y Marcaje de Celulas Madre Mesenquimales

Se aislaron MSC de cerdo y se expandieron a partir de un solo donante Yorkshire macho sano (Schuleri, K. H. et al. Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol 294, H2002-H2011 (2008)). En resumen, se obtuvo la medula osea de la cresta ilfaca, y se pasaron los aspirados a traves de un gradiente de densidad para eliminar los tipos de celulas no deseados y se sembraron con 25 ml de medio MEM Alpha (Mediatech, Manassas, VA) que contema 20% de Suero Bovino fetal (Hyclone, Logan, UT) en frascos de cultivo de 162 cm2 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). A los 5-7 dfas despues de la siembra, las celulas no adherentes se eliminaron por lavado durante los cambios de medio y la poblacion de MSC purificada, restante y adherida al plastico se expandio en cultivo. La poblacion de MSC se cosecho despues y se transdujo con 5-bromodesoxiuridina (BrdU) o protema fluorescente verde (vector Lenti-GFP, Lentigen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las celulas usadas se cosecharon cuando alcanzaron una confluencia del 8090% en el pase 5. Las MSC marcadas se colocaron en una solucion de crioconservacion que consistfa en DMSO al 10%, albumina de suero porcina al 5% y Plasmalyte al 85%. Las celulas se colocaron en bolsas criogenicas a una concentracion de 5-10 millones de MSC por ml y se congelaron en un congelador de tasa de control hasta -180°C hasta el dfa de la implantacion. La viabilidad de todos los lotes de MSC descongelados se verifico que fuera > 85% antes del uso en el estudio usando la tincion con azul de tripan.

Induccion del Infarto del Miocardio e Inyecciones transendocardicas

Diecisiete hembras de Yorkshire sanas que pesaban 25-35 kg, y 21 hembras en miniatura de Gottingen sanas que pesaban 20-27 kg se incluyeron en este estudio. Se genero infarto de miocardio experimental (Schuleri, K. H. et al. Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol 294, H2002-H2011 (2008); Amado, L. C. et al. J. Am. Coll. Cardiol. 48, 2116-2124 (2006)). En resumen, la arteria carotida comun derecha se canulo bajo anestesia inducida con ketamina (33 mg/kg, IM) y se mantuvo con isoflurano (1.5-2.0%). El infarto del miocardio se indujo por el acceso a la arteria coronaria Descendiente Anterior Izquierda (LAD) y se ocluyo despues de la primera rama diagonal inflando un globo de angioplastia coronaria (2.75 x 15 mm). Debido a las diferencias en la anatoirna coronaria entre Gottingen y Yorkshires, el globo se inflo durante 150min y 60min respectivamente para lograr tamanos de infarto comparables. Posteriormente, se desinflo el globo, se establecio la reperfusion y se cerro permanentemente la arteria carotida. Todos los animales fueron adecuadamente heparinizados durante el procedimiento. El grupo de animales Yorkshire recibio inyecciones intramiocardicas de MSC porcinas marcadas con GFP alogenico (75 x 106 celulas) o placebo (Plasmalyte solo, Baxter Edwards Critical Care, Deerfield, IL), tres dfas despues del infarto del miocardio (MI). Para el modelo de insuficiencia cardfaca cronica, se monitorizaron los minicerdos infartados durante 12 semanas antes del trasplante (total de 200 x 106 MSC marcadas con BrdU alogenico o plasmalito). Todas las inyecciones se realizaron bajo fluoroscopfa, con un cateter avanzado de inyeccion de punta de aguja de pistola al LV a traves de un cateter grna orientable (Stiletto, Boston Scientific, Natick, Massachusetts). Las areas hipocineticas, acineticas y discineticas durante la ventriculografa de contraste se identificaron y se realizaron inyecciones dentro y en los lfmites del area disfuncional, tal como se definio por ventriculografa biplanar. Un total de 15 inyecciones se realizaron en cada animal, con cada inyeccion que contuvo 0.5 ml del inyectable. Cada inyeccion fue guiada por fluoroscopfa para distribuir las celulas uniformemente a lo largo de todo

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el infarto y las zonas Ifmites.

MRI Cardfaco

La imagen MR cardfaca (CMR) de la funcion ca^aca de Gottingen se realizo en los siguientes puntos temporales: valores iniciales, 10 dfas, 1, 2 y 3 meses despues del IM y 1, 2 y 3 meses a continuacion del trasplante. Se obtuvieron imagenes CMR en serie con una matriz de fase de cuatro canales, 1.5 T MR Scanner (Siemens Symphony, Erlangen, Alemania) en animales anestesiados con electrocardiograma y adquisicion de respiracion corta. El protocolo para imagenes de CMR cine e imagenes CMR de marcaje se ha descrito antes (Amado, L. C. et al. J. Am. Coll. Cardiol. 48, 2116-2124 (2006); Amado, L. C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 102, 11474-11479 (2005)). En resumen, la funcion de LV Global se evaluo en precesion libre en estado estacionario con un numero de cortes para cubrirtodo el LV desde el apex a la base. Los parametros de la imagen fueron los siguientes: Tiempo de retardo del eco (TE)=1.9 ms, tiempo de repeticion(TR)= 4.2 ms; angulo de giro 45°; matriz 256 * 160; espesor de corte/sin interrupcion 8 mm; campo de vision (FOV) 28 cm y promedio de la senal numero 1( NSA). Las imagenes cine se analizaron con un soporte comprensible de investigacion validado por el grupo de MR de Cardiologfa en la Universidad de Lund, Suecia.

Para evaluar la funcion cardfaca regional, las imagenes de MRI marcadas se adquirieron con un ECG protegido, espacio k segmentado, secuencia de eco pulsado de recuperacion de gradiente rapido con una modulacion espacial para generar un patron de rejilla. Las imagenes se obtuvieron al mismo nivel de las imagenes de MR cine con los siguientes parametros: TR: 6.7, TE: 3., angulo de giro = 12°; matriz 256x160; vistas/segundo 4; espesor del corte sin hueco 8 mm; 31.25 kHz; FOV 28 cm; 1 NSA; y espacio de etiquetado de 6 pfxeles. Las imagenes se analizaron cuantitativamente con un paquete de soporte personalizado (DIAGNOSOFT™ PLUS, Diagnosoft Inc, Palo Alto, California). La magnitud de la deformacion regional se determino a partir de los 24 segmentos desplazados radialmente para cada seccion de eje corto cubriendo todo el LV y promediada entre los cortes para cada region y cada punto de tiempo, generando un mapa de distension para cada punto de tiempo durante el ciclo cardfaco. El pico de la tension circunferencial sistolica (pico Ecc) se determino del mapa de distencion para cada punto de tiempo. El potenciador de Contraste de Retraso se uso para evaluar la extension del area infartada. El protocolo incluyo un bolo intravenoso de Gadolinio-DTPA (0.1 mmol/kg, 5 m/s, MAGNEVIST™, Berlex, Bayer Healthcare Pharmaceuticals) a traves de una lmea intravenosa periferica. Las imagenes se adquirieron 15 minutos mas tarde en el mismo lugar que las imagenes de cine de eje corto. Los parametros de imagen fueron TR=7.3, TE=3.3, TI=200 ms; angulo de giro =25°, matriz 256 * 196; separacion de espesor del corte 8 mm 31.2 kHz, FOV 28 cm y 2 NSA.

Histologfa

Para la primera fase del estudio, se realizo una evaluacion microscopica entre los cerdos Yorkshire tratados (n=3), placebo (n=3) y control (n=3) a las 2 semanas despues de las inyecciones intramiocardicas. Ademas, para evaluar la evolucion inmunofenotfpica aguda de las MSC trasplantadas, se sacrificaron 8 animales mas a las 24h (placebo n=1 y tratados con MSC n=1) y 72h (placebo n=3 y n=3 tratados con MSC) despues de las inyecciones. Para la segunda fase del estudio, se realizo una evaluacion microscopica entre los cerdos Gottingen tratados (n=12) y placebo (n=9) 3 meses despues de las inyecciones intramiocardicas. Todos los animales que completaron el estudio se sacrificaron por eutanasia humanamente y sus corazones se extirparon, se seccionaron en cortes de eje corto de 4 mm de espesor, se ponderaron y fotografiaron digitalmente. Multiples muestras de tejidos de las zonas infartadas se recogieron, las zonas del lfmite y remotas de cada corte, se fijaron en formalina tamponada al 10% y se embebieron en parafina. La Hematoxilina y Eosina (H&E), asf como la tincion Tricromica de Masson se usaron para el examen histologico primario.

Microscopfa Confocal de Inmunofluorescencia

Los estudios de inmunofluorescencia se llevaron a cabo en secciones de parafina de 4 pm de espesor. En resumen, despues de desparafinar y rehidratar las secciones de tejido, se desenmascaro el antfgeno por microondas de las laminas durante 20 minutos en solucion tamponada de citrato, pH=6 (Dako, Carpenteria, CA). Las secciones se bloquearon durante 1h a RT con suero de burro normal al 10% (Chemicon International Inc, Temecula, CA), a continuacion, 1 hora de incubacion a 37°C con el anticuerpo primario. Se usaron los siguientes anticuerpos: C-kit, a- actina sarcomerica, a-actina de musculo liso, Conexina-43 (Sigma, Saint Louis, MO), N-cadherina, anti-GFP, Laminina, Fosfo-Histona H3 (Abcam, Cambridge, MA), GATA-4, MDR1, Integrin-p1, Cd3, CD14, CD68 (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA), Caspasa-3 activada (BD Biosciences, San Jose, CA), Nkx2.5 (R&D systems Inc, Minneapolis, MN), Factor VIII (Biocare Medical, Concord, CA) y KDR (Cell Signaling, Boston, MA). Por consiguiente, los anticuerpos se visualizaron incubando las secciones durante 1h a 37°C con FITC, Cy3 y fragmentos F(ab')2 conjugados con Cy5 de anticuerpos secundarios purificados por afinidad (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). Las laminas se contrastaron con DAPI, se montaron con reactivo ProLong Antifade Gold (Invitrogen, Carlsbad, California) y se almacenaron a 4°C hasta el examen adicional. Las evaluaciones microscopicas y las adquisiciones de imagenes se realizaron con un Microscopio Confocal Zeiss LSM-510 (Carl Zeiss MicroImaging, Inc. Thornwood, NY).

Mapeo de Tejidos

Para evaluar el trafico de las MSC, utilizamos el citometro Compucyte Laser Scanning Cytometer (LSC) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (CompuCyte Corporation, Cambridge, MA). En resumen, despues de detectar y

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amplificar la senal de las MSC trasplantadas con GFPpos con un anticuerpo anti-GFP marcado con FITC de acuerdo con los protocolos inmunofluorescentes establecidos en este laboratorio, las laminas del tejido se escanearon bajo el LSC para mapear la distribucion espacial de la senal FITC en las muestras. La senal fluorescente detectada se proyecto como un diagrama de dispersion y, como consecuencia, se ajusto y se fusiono a la lamina escaneada de H&E (Coolscan, Nikon) de la misma muestra usando un paquete de soporte de creacion de imagenes (Adobe Photoshop CS3). Las dispersiones detectadas se verificaron mas a fondo bajo el microscopio confocal para excluir la deteccion de cualquier senal positiva falsa.

Hibridacion in Situ de Fluorescencia

La Hibridacion in Situ de Fluorescencia (FISH) se empleo para detectar el cromosoma Y de las MSC alogenicas trasplantadas con desigualdad sexual en los corazones porcinos hembras. Los cromosomas de metafase se detectaron por hibridacion de las muestras de tejido con cromosoma Y porcino conjugado con Cy3 (StarFISH, Cambio Ltd, Cambridge, RU) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, a continuacion de la desparafinizacion y la rehidratacion, las muestras se calentaron durante 20 min en tampon citrato, pH=6 (Dako). Despues de enfriar durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT), los tejidos se digirieron durante 3 min a 37°C con pepsina, se lavaron con tampon SSC 2X (invitrogen) y se deshidrataron a traves de etapas de lavado en etanol en serie. Las muestras se secaron al aire y se aplico la sonda. Despues de cubrir las muestras con un cubreobjetos y sellarlas con cemento de caucho, las muestras se colocaron en el hibridizador (Dako) para desnaturalizacion (10 min a 80°C) seguido de hibridacion durante la noche a 37°C. Al dfa siguiente, las muestras se lavaron con SSC 2X, se montaron con DAPI y se cubrieron.

Analisis Morfometrico y Evaluacion Microscopica

Los numeros de celulas GFPpos, c-kitpos y Ypos se cuantificaron por milfmetro cuadrado (mm2). Las celulas apoptoticas y mitoticas a los puntos de tiempo de 24h y 72h se expresaron como el porcentaje de celulas GFPpos colocalizadas con caspasa 3 activada y fosfo-H3 respectivamente. El mismo procedimiento se siguio para la cuantificacion del compromiso cardfaco y vascular de los aloinjertos, asf como de las celulas endogenas c-kitpos. El analisis morfometrico se realizo usando un paquete de investigacion personalizado (Image J, NIH, Bethesda, Maryland). Para evaluar la densidad de los vasos recien formados, se obtuvo la relacion axial (diametro mayor/diametro menor) para cada cromosoma Y que contema la estructura vascular. Esta metodologfa se uso para corregir el angulo de orientacion de los vasos con el plano de seccion (Tillmanns, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1668-1673 (2008)). La suma de las relaciones axiales de los vasos por unidad de area de tejido produjo la densidad de los vasos por muestra.

Analisis Estadfstico

Todos los valores se presentan como media ± SEM. Todos los analisis se realizaron usando SPSS para Windows version 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Las diferencias entre los grupos a continuacion de la evaluacion inmunohistologica se compararon usando el ANOVA de una via. Las diferencias entre los grupos en la fraccion de eyeccion y el tamano del infarto en base a las imagenes de MR se calcularon usando ANOVA de una via en diferentes puntos temporales. La prueba de Tukey se uso para el analisis post-hoc. La diferencia en el pico Ecc se calculo por mediciones repetidas de analisis de varianza de 2 vfas con una repeticion de factor. Se aplico la correlacion de Pearson para hallar una relacion entre el injerto de celulas y el aumento en el pico Ecc. Un nivel de P<0.05 se considero estadfsticamente significativo.

Estudios de animales

Para este estudio, 17 cerdos Yorkshire hembras sanas que pesaban 25-35 kg, y 21 cerdos miniatura Gottingen sanos que pesaban 20-27 kg, se sometieron a infarto del miocardio experimental (MI) seguido por reperfusion. El estudio se condujo en 2 fases. En la primera fase, se estudiaron tres grupos: Los cerdos Yorkshire recibieron inyecciones transendocardicas (TEI) (Stiletto, Boston Scientific, Natick, Massachusetts) de 75 X 106 celulas madre mesenquimales que se derivaron de medula osea adultas alogenicas (aMSC) (n=7), Placebo (n=7) o ninguna inyeccion (n=3) tres dfas a continuacion del MI. Los animales se sacrificaron a las 24h (n=1 placebo y n=1 tratadas con aMSC), 72h (n=3 placebo y n=3 tratados con aMSC) y 2 semanas (n=3 tratados con aMSC y n=3 placebo y n=3 de control) despues del trasplante para estudiar el destino de las celulas alogenicas.

En la segunda fase, se estudiaron dos grupos: Cerdos miniatura Gottingen recibieron TEI de 200 * 106 celulas de aMSC machos (n=12) o placebo (n=9), 12 semanas despues del MI. Los animales se siguieron por los analisis de cine y Tagging-MRI (Siemens Symphony, Erlangen, Alemania) en multiples puntos de tiempo (valores iniciales, 10 dfas, 1, 2 y 3 meses despues del MI y 1, 2 y 3 meses a continuacion del trasplante) para evaluar la cantidad de la recuperacion funcional de los grupos tratados versus a los no tratados.

Ejemplo 1: Las celulas madre mesenquimales regeneran el musculo cardfaco, la vasculatura y los nichos de las celulas madre

Para determinar si las celulas madre mesenquimales tienen un potencial precursor cardfaco o si su efecto terapeutico se

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ejerce a traves de los efectos paracrinos, se inyectaron celulas madre mesenquimales que se derivaron de la medula osea adulta alogenica masculina (aMSC) marcadas con GFP a cerdos hembras a continuacion del infarto del miocardio (MI) (Figura 5). Sin desear limitarse por la teona, se conjeturo que las celulas madre mesenquimales que se derivan de la medula osea adultas alogenicas (aMSC) son verdaderas celulas precursoras adultas que pueden diferenciarse en los tres linajes celulares cardfacos, y que las aMSC participan en la recuperacion cardfaca por la formacion de interacciones celula a celula con los elementos miocardicos existentes, que se incluyen con las celulas precursoras endogenas.

Primero, se examino el destino de GFP alogenica, las aMSC positivas para el cromosoma Y inyectadas directamente en el miocardio a traves de un cateter endocardico en cerdos 3 dfas a continuacion del infarto de miocardio (MI). Despues de la entrega celular en las zonas del infarto y en los lfmites, la retencion de las celulas fue robusta y completamente confinada a las zonas del infarto y los lfmites del miocardio, con evidencia de la migracion de celulas a lo largo de esta region (Figuras 6A-6E y Figuras 7A-7D), que incluyeron la migracion endo a epicardica, y en corrientes celulares a lo largo del area del dano. De 1 a 3 dfas despues de la inyeccion, las aMSC mostraron evidencia de la autorrenovacion con apoptosis minima (Figuras 8A, 8C). La inmunotincion para la histona-H3 fosforilada 1 y 3 dfas despues del trasplante demostro que un numero sustancial de celulas entro en el ciclo celular y se sometieron a mitosis, mientras que la ausencia simultanea de la caspasa-3 activada marcada pro apoptotica en la mayona de las aMSC indico su capacidad de supervivencia (Figuras 8B, 8C).

Para direccionar el compromiso del linaje de las aMSC se evaluo la colocalizacion de las aMSC GFPpos con el factor de transcripcion cardfaca GATA-4, los marcadores endoteliales Factor VIII y KDR, marcador del musculo liso vascular a- actina de musculo liso, y el marcador cardiomiocitario a-actina sarcomerica. La diferenciacion de las MSC en celulas precursoras cardfacas fue evidente 24h despues del trasplante y aumento 2 veces por 72 horas, un aumento impulsado tanto por la diferenciacion como por la replicacion celular (Figuras 1A, 1B, Figura 8C). Ademas, el compromiso del linaje de las celulas del musculo liso endotelial y vascular no estuvo presente 24h despues del trasplante, pero ambos pudrieron detectarse a las 72 horas (Figuras 1C-1F). Hubo aMSC GFPpos (1.3±0.4%) que colocalizadas con KDR/Factor VIII, documentan el compromiso del linaje a las celulas endoteliales. Hubo una amplia interaccion celula a celula entre aMSC GFPpos y celulas cardfacas nativas, mediada por Conexina-43 y N-cadherina (Figuras 1G, 1H).

Dos semanas despues de la inyeccion, permanecio una retencion celular robusta y una diferenciacion adicional en fenotipos de celulas maduras (Figura 2, Figuras 7A-7D]. Las aMSC GFPpos expresaron a-actina sarcomerica y GATA-4 y exhibieron caractensticas morfologicas tanto de celulas precursoras inmaduras cardfacas (Figuras 2A, 2B) y de miocitos cardfacos maduros y celulas vasculares (Figuras 2C, 2D). El miocardio quimerico estuvo presente dentro de las zonas infartadas y los lfmites, pero no en las areas remotas, y formo interacciones celula a celula con miocitos cardfacos nativos (Figuras 2E, 2F).

Despues, se probo si las aMSC interactuan con celulas madre cardfacas endogenas (CSC) c-kitpos. Las CSC c-kitpos endogenas estuvieron raras 1-3 dfas despues del trasplante, pero aumentaron dramaticamente en los cerdos tratados con aMSC en 2 semanas (Figuras 2G, 2H). El numero de celulas c-kit aumento en 50 veces en la zona de infarto de los animales tratados y ademas fue elevado, aunque menos dramaticamente, en zonas lfmites y remotas de animales tratados con MSC (Figuras 9A-9D). Estas celulas c-kitpos fueron CD3neg, CD14neg y CD68neg, excluyendo los fenotipos inflamatorios y de mastocitos, y se detectaron en grupos en las zonas infartadas y los lfmites de los animales tratados con aMSC. En areas remotas y en corazones no tratados, las celulas c-kit se observaron como una celula aislada rara y no formaron parte de grupos de celulas (Figuras 2G, 2H, y Figuras 7C y 9A-9D). Para direccionar las celulas c-kit endogenas se acoplaron a celulas huesped o quimericas, se probo la expresion de la conexina-43 y la N-cadherina; las celulas c-kit formaron uniones gap y conexiones mecanicas a traves de estas protemas con otras celulas c-kit asf como con MSC GFPpos (Figuras 2I, 2J). Estas interacciones celula a celula se parecen mucho a los nichos de las celulas madre cardfacas. La caracterizacion inmunohistoqmmica adicional demostro que un numero de estas celulas coexpresaron MDR1 y GATA-4, lo que indica el compromiso con el linaje cardfaco dentro de los nichos regenerados. Hubo un aumento de 25 veces en el numero de estas celulas c-kit comprometidas en el linaje cardfaco en las zonas lfmites de los animales tratados con aMSC, en comparacion con los animales que recibieron la inyeccion solo de vehroulo no celular, y con animales de control no tratados. No se observaron diferencias en las zonas infartadas y no infartadas, lo que indica la presencia de un mecanismo de reparacion endogeno activo en las zonas lfmites de los corazones tratados (Figuras 10A-10C). Estos hallazgos introducen un nuevo mecanismo subyacente al tratamiento con MSC que, ademas de regenerar el tejido miocardico quimerico dentro de las dos primeras semanas despues del trasplante, ahora ademas, se muestra orquestar un programa de reparacion cardfaca endogena que comprende una afluencia de celulas c-kitpos con compromiso de linaje al fenotipo de los miocitos y a traves de la formacion de estructuras parecidas a nichos de celulas madre cardfacas.

El siguiente injerto a largo plazo de aMSC y la contribucion a la recuperacion cardfaca funcional, mas tarde despues del infarto se examino. Se inyectaron aMSC masculinas marcadas con BrdU en animales hembras que habfan sufrido infarto del miocardio 3 meses antes. Estos animales se estudiaron durante 3 meses a continuacion de la inyeccion de celulas por MRI cardfaca seriada, seguido por evaluacion histologica. Tres meses despues del MI, los cerdos tuvieron fracciones de eyeccion disminuidas ((33.4±1.0% versus 47.7±2.0 % valores iniciales; p = 0.008), la cicatriz del infarto comprendio 18.3±2.5% del ventnculo y una disfuncion regional significativa del segmento de la cicatriz se documento usando marcaje MR (Figuras 3A-3J). La inyeccion intramiocardica de las aMSC tres meses despues del MI produjo

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aumentos sustanciales de la fraccion de eyeccion, reduccion de la cicatriz y restauracion de la funcion ca^aca regional en las zonas lfmites de la cicatriz correspondientes a las regiones de reduccion de la cicatriz (Figuras 3A-3H). Es importante destacar, que la reduccion del tamano de la cicatriz se correlaciono estrechamente con la recuperacion funcional regional (Figura 3H).

Los corazones se analizaron por un examen inmunohistologico para probar si esta recuperacion funcional requena un injerto celular. Las celulas que conteman cromosomas Y (Ypos) estuvieron presentes en las zonas del infarto y los lfmites del grupo tratado con aMSc, pero no se detectaron en el grupo placebo, ni en las zonas remotas de los animales tratados con aMSC. La densidad de las celulas Ypos no difirio entre la zona del infarto (0.17 ± 0.04 celulas / mm2) y la zona lfmite (0.15 ± 0.03 celulas/ mm2) (Figuras 11A, 11B) la cotincion con factor de transcripcion espedfico ca^aco GATA-4 y la a-actina sarcomerica mostro que 14.0 ± 4.0% de las celulas Ypos tema un fenotipo de miocito cardfaco adulto. Es interesante senalar que las celulas Ypos de origen donante exhibieron ademas la formacion de uniones de interrupcion potenciales con cardiomiocitos residentes, como se indica por la expresion del conexina-43 (Figura 11C). Es importante destacar que, el numero total de celulas Ypos injertadas en la BZ se correlaciono con la mejora en el pico de la tension circunferencial sistolica (Ecc) (r=0.8; p=0.03) (Figura 3I), lo que indico una contribucion cntica del injerto celular y la diferenciacion al grado de la recuperacion funcional.

Las celulas Ypos estuvieron presentes ademas en estructuras vasculares grandes y pequenas, apoyando la participacion en la formacion de nuevos vasos en la IZ y BZ. Las celulas donantes diferenciadas tanto en el musculo vascular como en los linajes endoteliales, con evidencia por colocalizacion de a-actina de musculo liso y factor VIII, respectivamente [Figura 4 ac]. Se incorporaron un total de 9.9 ± 2.4% de las celulas Ypos a las paredes de los vasos, con 5.9 ± 1.9% del factor de coexpresion VIII y 4.0 ± 1.6% de a-actina de musculo liso. La densidad de los vasos recien formados se calculo en la longitud del vaso por milfmetro cubico. En la IZ, la densidad de las celulas fue 0.05±0.01 mm/mm3 y en la BZ fue similar 0.04± 0.02 mm/mm3 [Figura 4 d]. En la BZ las aMSC se incorporaron principalmente a los vasos grandes y medianos (500 pm-1 mm, Figuras 4A, 4B, 4D, 4E) compuesto de ambos capas endoteliales y de musculo liso, lo que ilustra su capacidad para restaurar el flujo sangumeo a traves de la formacion de grandes vasos coronarios. En la IZ, la mayona de los vasos nuevos tuvieron un diametro <20pm y estuvieron compuestos de capas endoteliales unicas sin capas de musculo liso, en consistencia con la formacion de capilares.

No todos los pacientes con enfermedad cardfaca pueden ser capaces de recibir terapias en base a celulas autologas efectivas, ya que la edad y las enfermedades del huesped pueden afectar la calidad de los injertos autologos per se. Las MSC por otro lado, son una verdadera poblacion de celulas madre con capacidades inmunomoduladoras e inmunotolerogenas que se conocen son un aloinjerto cardfaco seguro y exitoso. Las MSC reunen todas las expectativas de un producto celular que puede estar facilmente disponible en cantidades terapeuticas, proporcionando de este modo una terapia en base a celulas "version estandar" para tratar las enfermedades cardfacas.

Juntos estos hallazgos demuestran que las MSC alogenicas, inalteradas para mejorar su supervivencia, se injertan y exhiben trilineaje de diferenciacion de celulas cardfacas. El proceso de reparacion se impulsa por senales de dano y ocurre tanto en el infarto agudo como en el infarto del miocardio cronico. El injerto de MSC se acompana de la formacion de interacciones entre celulas, tanto con las celulas adultas del huesped como con las celulas precursoras endogenas del huesped. Este ultimo reconstituye los grupos multicelulares que tienen las caractensticas de los nichos celulares de la celula madre y promueve la migracion y la diferenciacion miodtica de celulas precursoras cardfacas endogenas. Dentro de 72h el destino de los aloinjertos se determina y el nivel de regeneracion se conserva hasta tres meses despues del trasplante. El grado del injerto se correlaciona con la recuperacion de la funcion cardfaca, que es sustancial, y con la reduccion de la formacion de cicatrices miocardicas. Aunque la reduccion de la cicatriz es incompleta, estos hallazgos plantean la posibilidad de que las estrategias que implican aplicaciones de aMSC repetidas o la aceleracion de sus tasas de diferenciacion pudieran dar lugar a la eliminacion total cercana de la cicatriz cardfaca. El impacto en la salud publica de un tratamiento eficaz para la cardiomiopatfa isquemica cronica es inmenso, y estos datos son los primeros en indicar ese potencial para la terapia con MSC. La totalidad de estos hallazgos documentan una capacidad impresionante de una celula madre derivada de la medula osea adulta para reparar corazones lesionados aguda y cronicamente, y tienen importantes implicaciones mecanicas y clmicas.

Aunque la invencion se ha ilustrado y descrito con respecto a uno o mas implementaciones, alteraciones equivalentes y modificaciones ocurriran a los expertos en la tecnica tras la lectura y comprension de esta especificacion y de las figuras adjuntas. Ademas, aunque una caractenstica particular de la invencion pudo describirse con respecto a solo una de varias implementaciones, dicha caractenstica puede combinarse con una o mas caractensticas de las otras implementaciones como se desee y es ventajoso para cualquier aplicacion dada o particular.

El Resumen de la Descripcion se proporciona para permitir al lector averiguar rapidamente la naturaleza de la descripcion tecnica. Se presenta con el entendimiento de que no se usara para interpretar o limitar el alcance o el significado de las siguientes reivindicaciones.

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Reivindicaciones

1. Una composicion que comprende celulas madre Mesenquimales y celulas madre ca^acas para usar en el tratamiento de enfermedades ca^acas o trastornos cardfacos en un paciente, en donde la composicion se produce mediante un metodo que comprende:

cocultivar ex vivo las celulas madre mesenquimales con las celulas madre cardfacas;

y administrar al tejido cardfaco de un paciente in vivo el cultivo de celulas madre mesenquimales y celulas madre cardfacas en una concentracion eficaz para reparar el tejido cardfaco danado.
2. La composicion para usar de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde las celulas madre mesenquimales son autologas o alogenicas para el paciente.
3. La composicion para usar de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde las celulas madre cardfacas son autologas o alogenicas para el paciente.
4. La composicion para usar de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde las celulas madre mesenquimales se diferencian en al menos un linaje de celulas cardfacas o en al menos dos linajes de celulas cardfacas o en tres linajes de celulas cardfacas.
5. La composicion para usar de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde los linajes de celulas cardfacas se identifican por al menos un marcador que comprende el factor de transcripcion cardfaco GATA-4; marcadores de celulas endoteliales Factor VIII y KDR; marcador del musculo liso vascular a-actina de musculo liso; o marcador cardiomiocitario a-actina sarcomerica.
6. La composicion para usar de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde las celulas madre se obtienen de la medula osea, circulacion o tejidos y organos.
7. La composicion para usar de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde las celulas madre mesenquimales reclutan celulas madre endogenas del tejido cardfaco, reconstruyen nichos de celulas madre miocardicas y aceleran la diferenciacion celular endogena en los miocitos.
8. La composicion para usar de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde las celulas madre cardfacas endogenas se identifican por al menos un marcador que comprende conexina-43, N-cadherina, c-kitpos, CD3neg, CD14neg y CD68neg.
9. La composicion para usar de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en donde la enfermedad cardfaca es dano ffsico, dano qrnmico, cirugfa, trasplante o un defecto congenito.
10. La composicion para usar de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en donde el numero de celulas mesenquimales es de un millon.
11. La composicion para usar de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en donde la composicion comprende 20-50 pl de celulas madre mesenquimales a una concentracion de 10-40x106 MSC/ml.
12. Una composicion farmaceutica que comprende celulas madre mesenquimales cultivadas y celulas madre cardfacas para usar en el tratamiento de enfermedades cardfacas o trastornos cardfacos.
13. La composicion farmaceutica para usar segun la reivindicacion 12, en donde las celulas madre cardfacas se identifican por al menos un marcador que comprende conexina-43, N-cadherina, c-kitpos, CD3neg, CD14neg y CD68neg.
14. La composicion farmaceutica para usar de acuerdo con la reivindicacion 12 o 13, en donde la composicion comprende 1 millon de celulas madre mesenquimales.
15. La composicion farmaceutica para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde la composicion es una solucion con una concentracion de 10-40x106 MSC/ml.
16. La composicion farmaceutica para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en donde la composicion esta en una forma de dosificacion unitaria de 20-50 pl.
17. La composicion farmaceutica para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en donde la composicion es adecuada para inyectar.
18. La composicion farmaceutica para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, en donde la composicion comprende solucion salina tamponada con fosfato (PBS), medio de cultivo, salina fisiologica al 5% de dextrosa en agua, un factor cardiotropico o esta libre de suero.