ES2625041T3

ES2625041T3 - Tratamiento de degenaration de disco intervertebral usando células derivadas de tejido del cordón umbilical e hidrogel

Info

Publication number: ES2625041T3
Application number: ES12725939.8T
Authority: ES
Inventors: Brian C. Kramer; Laura J. Brown; Anthony J. Kihm
Original assignee: DePuy Synthes Products Inc
Current assignee: DePuy Synthes Products Inc
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2012-05-17
Publication date: 2017-07-18
Anticipated expiration: 2032-05-17
Also published as: JP6100245B2; US20110280838A1; EP2709637B1; MX348245B; BR112013029800A2; US20170065745A1; RU2645079C2; JP2014516034A; ZA201309546B; CA2836637C; BR112013029800B1; CN110841109A; WO2012158952A1; AU2012255270B2; SG194825A1; CN103717226A; KR101914918B1; MX2013013560A; EP2709637A1; WO2012158952A8

Abstract

Un hidrogel y una población homogénea aislada de células obtenidas a partir de tejido del cordón umbilical humano, o una composición farmacéutica que comprende dicho hidrogel y población homogénea aislada de células, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o condición relacionada con la degeneración del disco intervertebral, en la que el tratamiento comprende la mejora de la celularidad y la arquitectura de un disco degenerado, en el que el tejido del cordón umbilical está sustancialmente libre de sangre y la población homogénea aislada de células es capaz de autorrenovación y expansión en cultivo, tiene el potencial de diferenciarse y no expresa CD117 o telomerasa.

Description

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Tratamiento de degenaration de disco intervertebral usando celulas derivadas de tejido del cordon umbilical e hidrogel

CAMPO DE LA INVENCION

[0001] La invencion se refiere en general al campo de la terapeutica a base de celulas. En algunos aspectos, la invencion se refiere al uso de Celulas derivadas de tejido de cordon umbilical para tratar una enfermedad o condicion relacionada con la degeneracion del disco intervertebral.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0002] Varias publicaciones, incluyendo patentes, solicitudes publicadas, artfculos tecnicos y artfculos academicos se citan a lo largo de la memoria descriptiva.

[0003] El dolor de espalda es una de las discapacidades mas comunes, y causa malestar ffsico y emocional importante en los individuos afectados. El deterioro de la estructura del disco intervertebral (IVD) es una de las principales causas de dolor de espalda inferior. El IVD esta formado de un anillo fibroso exterior fibroso que rodea al nucleo pulposo gelatinoso mas suave. Las fibras del anillo fibroso se unen a las placas terminales de los cuerpos vertebrales de la medula espinal e interceptan el nucleo pulposo, la creacion de un entorno isobarico. Bajo una carga axial, el nucleo pulposo comprime y radialmente transfiere esa carga al anillo fibroso. La naturaleza laminada del anillo fibroso proporciona una alta resistencia a la traccion y por lo tanto permite que se expanda radialmente en respuesta a esta carga transferida.

[0004] En un IVD sano, las celulas dentro del nucleo pulposo forman solo alrededor del uno por ciento del tejido del disco en volumen. Estas celulas producen una matriz extracelular (ECM) que contiene un alto porcentaje de proteoglicanos. Los proteoglicanos contienen grupos sulfatados funcionales que retienen el agua, proporcionando de este modo al nucleo pulposo sus cualidades de amortiguacion. Las celulas de nucleo pulposo tambien pueden secretar pequenas cantidades de citoquinas y metaloproteinasas de matriz (MlVIPs), que ayudan a regular el metabolismo de las celulas de nucleo pulposo.

[0005] En algunos casos de la enfermedad de IVD, la degeneracion gradual de la IVD es causada por las inestabilidades mecanicas en otras porciones de la columna vertebral. En estos casos, el aumento de cargas y presiones en el nucleo pulposo hacen que las celulas dentro del disco (o macrofagos invasores) emitan cantidades mas grandes de las normales de las citocinas mencionadas anteriormente. En otros casos de enfermedad IVD, los factores geneticos o apoptosis pueden causar una disminucion en el numero de celulas del disco y/o una liberacion de cantidades toxicas de citoquinas y MMPs. En algunos casos, la accion de bombeo del disco puede funcionar mal (debido a, por ejemplo, una disminucion en la concentracion de proteoglucanos dentro del nucleo pulposo), retardando de este modo el flujo de nutrientes en el disco, asf como el flujo de productos de desecho de el disco. Esta capacidad reducida para proporcionar nutrientes a las celulas y eliminar los residuos puede dar lugar a disminucion de la viabilidad celular y el metabolismo, resultando en una mayor degradacion de la ECM, junto con la acumulacion de altos niveles de toxinas que pueden causar la irritacion del nervio y el dolor.

[0006] A medida que la degeneracion de IVD progresa, los niveles toxicos de citoquinas y MMPs presentes en el nucleo pulposo empiezan a degradar el ECM. En particular, MMPs (mediadas por citoquinas) comienzan la escision de las porciones de retencion de agua de los proteoglicanos, lo que reduce las capacidades de retencion de agua. Esta degradacion conduce a un nucleo pulposo menos flexible, que cambia el patron de carga dentro del disco, y a su vez puede conducir a la deslaminacion del anillo fibroso. Estos cambios provocan inestabilidad mas mecanico, lo que puede causar que las celulas emitan incluso mas citoquinas y conducir a la regulacion positiva de MMPs. A medida que esta cascada destructiva continua y degeneracion de iVd progresa, el disco comienza a abultarse ("una hernia de disco"), y a continuacion, en ultima instancia, se rompe, provocando que el nucleo pulposo entre en contacto con la medula espinal y produce dolor.

[0007] Actualmente, las terapias principales para la degeneracion de IVD son intervenciones quirurgicas en las que discos degenerados se escinden o se fusionan con los discos vecinos. Las terapias quirurgicas tienen como objetivo aliviar el dolor y otros smtomas de la degeneracion de IVD, pero no hacen nada para reparar o regenerar los IVD enfermos. Un enfoque para el tratamiento de celulas degeneradas IVD y tejidos es el uso de terapias a base de celulas, en las que se administran las celulas vivas para reparar, reemplazar y/o remodelar los tejidos enfermos. Varios estudios recientes han investigado el uso de terapias para enfermedades degenerativas a base de celulas IVD. Por ejemplo, la patente de EE.UU. Nos 6.352.557 ("Ferree") y 6.340.369 ("Ferree II") ensenan la extraccion de celulas IVD vivas de un paciente, el cultivo de las celulas y su trasplante en un IVD afectado. Del mismo modo, Alini, Eur. Spine J., 2002: 11 (Supp.2): S215 220, describe el aislamiento y el cultivo de celulas de nucleo pulposo, la incorporacion de las celulas en una biomatriz, y luego la inyeccion de las celulas embebidas en pacientes para restaurar la funcionalidad a IVDs afectadas. Estos enfoques, aunque prometedores, han demostrado una eficacia limitada en la reparacion de los IVD degenerados y sufren de complicaciones causadas por la incompatibilidad inmunologica entre los donantes y los receptores celulares.

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[0008] Un enfoque terapeutico a base de celulas alternativo es el uso de celulas madre, que tienen la capacidad de dividirse y diferenciarse en celulas que comprenden los tejidos enfermos. El trasplante de celulas madre puede utilizarse como una herramienta clmica para reconstituir un tejido diana, restaurando con ello la funcionalidad fisiologica y anatomica. La aplicacion de la tecnologfa de celulas madre es amplia, incluyendo la ingeniena de tejidos, administracion de terapia genica, y la terapeutica de celulas, es decir, administracion de agentes bioterapeuticos a un lugar de destino a traves de celulas vivas suministradas exogenamente o componentes celulares que producen o contienen aquellos agentes (para una resumen, vease Tresco, P.A. #et al#., Advanced Drug Delivery Reviews, 2000; 42: 237). La identificacion de las celulas madre ha estimulado la investigacion dirigida a la generacion selectiva de tipos de celulas espedficas para medicina regenerativa. Uno de los obstaculos a la realizacion del potencial terapeutico de la tecnologfa de celulas madre ha sido la dificultad de obtener un numero suficiente de celulas madre. Tejido embrionario, o fetal, es una fuente de celulas madre. Las celulas madre y progenitoras embrionarias se han aislado a partir de un numero de especies de mairnferos, incluyendo seres humanos, y varios de estos tipos de celulas se han demostrado capaces de autorrenovacion y la expansion, como la diferenciacion bien en un numero de diferentes linajes de celulas. Sin embargo, la obtencion de celulas madre a partir de fuentes embrionarias y fetales ha planteado muchas cuestiones eticas y morales que han impedido un mayor desarrollo de la terapeutica de celulas madre embrionarias.

[0009] Existe por tanto una necesidad en la tecnica para la terapeutica madre a base de celulas que eviten los problemas que rodean las celulas madre embrionarias y fetales. tejidos posparto, tales como el cordon umbilical y la placenta, han generado interes como una fuente alternativa de multipotentes o las celulas madre pluripotentes. Por ejemplo, se han descrito metodos para la recuperacion de las celulas madre por perfusion de la placenta o la coleccion de la sangre del cordon umbilical o tejido. Una limitacion de obtencion de celulas madre a partir de estos metodos ha sido un volumen inadecuado de la sangre o la cantidad de celulas de cordon obtenido, asf como la heterogeneidad o la falta de caracterizacion de las poblaciones de celulas obtenidas a partir de dichas fuentes.

[0010] Por consiguiente, un suministro fiable, bien caracterizado y abundante de las poblaciones sustancialmente homogeneas de celulas madre que tienen la capacidad de diferenciarse en celulas que son fenotfpicamente similares a las celulas IVD endogenas sena ventajoso en una variedad de aplicaciones de diagnostico y terapeuticas para la reparacion, la regeneracion, y/o sustitucion de celulas IVD, y para la reconstruccion y/o remodelacion de tejidos IVD.

RESUMEN DE LA INVENCION

[0011] En un aspecto, los metodos se proporcionan en este documento para uso en el tratamiento de una enfermedad o condicion relacionada con degeneracion IVD (IDD). Los metodos comprenden la administracion de celulas derivadas de tejido de cordon umbilical en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o condicion. El tejido del cordon umbilical del que se obtienen las celulas es preferiblemente sustancialmente libre de sangre. Las Celulas derivadas de tejido de cordon umbilical son preferiblemente capaces de autorrenovacion y expansion en cultivo y tienen el potencial de diferenciarse, por ejemplo, a un fenotipo de celulas IVD; requerir L-valina para el crecimiento; puede crecer en al menos aproximadamente 5% de oxfgeno; no producen CD117 ni HLA-DR ni telomerasa; expresan actina de musculo liso alfa; y expresar, con relacion a fibroblastos humanos, celulas madre mesenquimales o celula medula osea de cresta ilfaca, aumento de los niveles de interleucina 8 y reticulon 1.

[0012] En otro aspecto, las composiciones farmaceuticas se proporcionan para su uso en el tratamiento de una enfermedad o condicion relacionada con degeneracion IVD, las composiciones que comprenden un vehuculo farmaceuticamente aceptable y celulas de cordon derivadas de tejido umbilical en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o afeccion, en el que el tejido del cordon umbilical del que se obtienen las celulas esta sustancialmente libre de sangre, y en donde las celulas son capaces de autorrenovacion y expansion en cultivo y tienen el potencial de diferenciarse, por ejemplo, a un fenotipo de celulas IVD; requieren L-valina para el crecimiento; puede crecer en al menos aproximadamente 5% de oxfgeno; no producen CD117 o HLA-DR o telomerasa; expresan actina de musculo liso alfa; y expresan, con relacion a fibroblastos humanos, celulas madre mesenquimales, o celulas de medula osea de cresta ilfaca, aumento de los niveles de interleucina 8 y reticulon 1.

[0013] Los kits se describen para el tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad o condicion relacionada con degeneracion IVD, los kits comprenden instrucciones para usar el kit en un metodo para tratar una enfermedad o condicion relacionada con degeneracion IVD, un vehfculo farmaceuticamente aceptable, y celulas de cordon derivadas de tejido umbilical en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o afeccion, en la que el tejido del cordon umbilical del que se obtienen las celulas esta sustancialmente libre de sangre, y en el que las celulas capaces de autorrenovacion y expansion en cultivo y tienen el potencial de diferenciarse, por ejemplo, a un fenotipo de celulas IVD; requerir L-valina para el crecimiento; puede crecer en al menos aproximadamente 5% de oxfgeno; no producen CD117 o HLA-DR o telomerasa; expresan actina de musculo liso alfa; y expresan, con relacion a fibroblastos humanos, celulas madre mesenquimales o celula de cresta ilfaca de medula osea, aumento de los niveles de interleucina 8 y reticulon 1. En algunas realizaciones, los kits proporcionados en este documento comprenden ademas al menos un reactivo y/o instrucciones para el cultivo de las celulas. En algunas realizaciones, los kits proporcionados en este documento comprenden instrucciones para la induccion de celulas a diferenciarse al menos parcialmente in vitro, por ejemplo, en celulas que muestran un fenotipo de nucleo pulposo celular y/o un

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fenotipo de celulas de anillo fibroso.

[0014] En diversas realizaciones, las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical utilizadas en los metodos, composiciones y/o kits descritos en el presente documento expresan receptor de lipoprotema oxidada de baja densidad 1, reticulon, ligando del receptor de quimiocina 3, y/o protema quimiotactica de granulocitos 2. En algunas realizaciones, celulas derivadas de tejido del cordon umbilical descritas en este documento expresan CD10, CD13, CD44, CD73, y CD90. En algunas realizaciones, las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical descritas en este documento tienen la capacidad de diferenciarse en anillo fibroso y/o celulas de nucleo pulposo.

[0015] En diversas realizaciones, la enfermedad o condicion relacionada con la degeneracion de IVD puede ser causada o inducida por la edad, trauma, autoinmunidad, reaccion inflamatoria, un defecto genetico, la deposicion de inmunocomplejo, y/o combinaciones de los mismos. Un IVD seleccionado para tratamiento puede ser intacto o en cualquier etapa de dano o degeneracion. Por ejemplo, un IVD seleccionado para tratamiento puede ser herniado, roto, deslaminado, y/o de otra manera danado o degenerado.

[0016] Los metodos proporcionados en el presente documento comprenden la administracion de celulas derivadas de tejido umbilical indiferenciadas con un hidrogel. Celulas humanas derivadas de tejido umbilical producen factores troficos beneficiosos incluyendo pero no limitados a citocinas, factores de crecimiento, inhibidores de proteasas, protemas de matriz extracelular que promueven la supervivencia, el crecimiento y diferenciacion de celulas progenitoras IVD o precursores endogenos. Los factores troficos descritos aqu podnan ser secretados directamente por las celulas humanas derivadas de cordon umbilical trasplantadas tisulares en el entorno de acogida. Los factores troficos u otros derivados de celulas podnan ser recogidos a partir de celulas derivadas de tejido umbilical humano ex vivo y posteriormente introducidas en el paciente.

[0017] En algunas realizaciones, las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical descritas en este documento son inducidas in vitro para diferenciarse en celulas de un linaje de condrocitos, y/o en celulas que muestran el fenotipo de una celula de anillo fibroso, una celula de nucleo pulposo, y/u otra celula de tipo IVD antes de, despues de o simultaneamente con la administracion de las celulas. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los metodos proporcionados en este documento comprenden ademas la etapa de inducir celulas derivadas de tejido del cordon umbilical para diferenciarse al menos parcialmente in vitro.—

[0018] En algunas realizaciones, las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical pueden manipularse geneticamente para expresar un producto de gen, tal como, pero no limitado a un producto genico que promueve la reparacion y/o regeneracion de los tejidos de IVD. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical estan disenadas geneticamente para expresar un factor trofico u otro producto genico. En algunas realizaciones, el producto del gen ejerce un efecto trofico o de otra manera modula las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical, tipos de celulas adicionales administradas con celulas derivadas de tejido del cordon umbilical, celulas IVD endogenas, y/u otras celulas endogenas. En algunas realizaciones, el producto genico es un componente de la matriz extracelular o un agente que modula la matriz extracelular. En algunas realizaciones, el producto del gen estimula la expresion de una o mas protemas de matriz extracelular.

[0019] En algunas realizaciones, las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical se administran con al menos otro tipo de celulas, tales como, pero no limitado a una celula de anillo fibroso, una celula de nucleo pulposo, un fibroblasto, un condrocito, una celula madre mesenquimal, de celulas derivadas de tejido adiposo, u otro tipo de celulas madre multipotentes o pluripotentes. El al menos otro tipo de celula se puede administrar simultaneamente con, antes de, o despues de las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical.

[0020] En algunas realizaciones, las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical y el hidrogel se administran con al menos un agente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical se administran con un factor trofico, tal como, pero no limitados a, TGF-beta, GDF-5, TIMP 1, y PDGF-BB. En diversas realizaciones, el al menos un agente ejerce un efecto atrofico o de otra manera modula el celulas derivadas de tejido del cordon umbilical, uno o mas tipos adicionales de celulas administradas con celulas del cordon umbilical, celulas derivadas de tejido IVD endogenas, y/u otras celulas endogenas. En algunas realizaciones, el al menos un agente estimula la expresion de una o mas protemas de matriz extracelular. Otros agentes incluyendo, pero no limitado a, agentes antiinflamatorios, agentes de supervivencia celular, agentes reductores del dolor y agentes inmunomoduladores. El agente puede administrarse simultaneamente con, antes de, o despues de la administracion de las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical.

[0021] En diversos aspectos, las celulas pueden administrarse, ser dirigidas a administrarse o formularse para ser administradas por inyeccion en un IVD, incluyendo, por ejemplo, el nucleo pulposo y/o el anillo fibroso de un IVD degenerado. En algunas realizaciones, se administran celulas, dirigidas a administrarse o formularse para ser administradas de tal manera que las celulas se encapsulan dentro de un dispositivo implantable o por implantacion de un dispositivo o matriz que comprende las celulas.

[0022] Otra realizacion de la invencion es un metodo de tratamiento de una enfermedad o condicion relacionada con la degeneracion del disco intervertebral, que comprende administrar una composicion farmaceutica que comprende

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al menos (1) un hidrogel y (2) una poblacion homogenea aislada de celulas obtenida a partir de tejido del cordon umbilical humano a un disco intervertebral en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o afeccion, por lo que el tejido del cordon umbilical esta sustancialmente libre de sangre, y en el que la poblacion homogenea aislada de las celulas es capaz de autorrenovacion, expansion en cultivo, y tiene el potencial para diferenciar y no expresar CD117 y/o telomerasa. La poblacion homogenea aislada de celulas puede tener adicionalmente cualquiera de las siguientes caractensticas: (a) expresa reticulon, ligando de receptor de quimiocina 3, y la protema de granulocitos quimiotactica; (b) no produce CD31, CD34 ni HLA-DR; (c) expresa, con relacion a fibroblastos humanos, celulas madre mesenquimales, o celulas de cresta ilfaca de la medula osea, el aumento de los niveles de interleucina 8 y reticulon 1; y (d) expresa CD10, CD13, CD44, CD73, y CD90. En otra realizacion de la invencion, la poblacion homogenea aislada de celulas expresa receptor de lipoprotemas oxidadas de baja densidad 1, reticulon, ligando del receptor de quimioquinas 3, y/o protema de granulocitos quimiotactica. La composicion se puede administrar mediante inyeccion. En una realizacion, la composicion comprende ademas (a) al menos otro tipo de celula, que puede ser modificado geneticamente para expresar al menos un producto genico exogeno (como por ejemplo, un factor trofico), y/o (b) al menos un agente, tal como por ejemplo factor atrofico (por ejemplo TGF-beta, GDF-5, PDGF-BB y TlMP-1). En otra realizacion, la composicion se administra en un disco intervertebral degenerado como el nucleo pulposo o en el anillo fibroso del disco intervertebral. La poblacion aislada de celulas puede ser al menos parcialmente inducida a diferenciarse in vitro antes de la administracion. En una realizacion de la invencion, la poblacion homogenea aislada de celulas es inducida para diferenciarse en celulas que muestran un fenotipo de celulas de anillo fibroso o en celulas que muestran un fenotipo celular nucleo pulposo.

[0023] La invencion es un metodo de tratamiento de una enfermedad o condicion relacionada con la degeneracion del disco intervertebral, que comprende administrar un hidrogel y una poblacion homogenea aislada de celulas obtenida a partir de tejido del cordon umbilical humano a un disco intervertebral en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o afeccion, en la que el tejido del cordon umbilical esta sustancialmente libre de sangre, y en donde la poblacion homogenea aislada de las celulas es capaz de autorrenovacion, expansion en cultivo, y tiene potencial para diferenciarse y no expresar CD117 y/o telomerasa. La poblacion homogenea aislada de celulas puede tener adicionalmente cualquiera de las siguientes caractensticas: (a) expresa reticulon, ligando de receptor de quimiocina 3, y la protema de granulocitos quimiotactica; (b) no produce CD31, CD34 y HLA-DR; (c) expresa, con relacion a fibroblastos humanos, celulas madre mesenquimales o celula de medula osea de cresta ilfaca, aumento de los niveles de interleucina 8 y reticulon 1; y (d) expresa CD10, CD13, CD44, CD73, y CD90. En otra realizacion, la poblacion homogenea aislada de celulas expresa lipoprotemas oxidadas de baja densidad del receptor 1, reticulon, ligando del receptor de quimioquinas 3 y la protema quimiotactica de granulocitos. El hidrogel y la poblacion homogenea aislada de celulas se pueden administrar mediante inyeccion. El hidrogel se administra simultaneamente con, o antes de, o despues de la poblacion homogenea aislada de celulas obtenidas a partir de tejido del cordon umbilical humano. En una realizacion, la poblacion homogenea aislada de celulas se administra dentro de un dispositivo implantable. En otra realizacion, el metodo ademas comprende la administracion de al menos otro tipo de celulas simultaneamente con, o antes de, o despues de la poblacion homogenea aislada de celulas obtenidas a partir de tejido del cordon umbilical humano. El al menos otro tipo de celula puede modificarse por ingeniena genetica para expresar al menos un producto genico exogeno (tal como el factor atrofico o un producto del gen exogeno que modula la expresion de una o mas protemas de matriz extracelular).

[0024] El metodo puede comprender ademas la administracion de al menos un agente tal como por ejemplo un factor trofico (por ejemplo, TGF-beta, GDF-5, PDGF-BB y TIMP-1) que puede ejercer un efecto trofico sobre la poblacion de celulas homogeneas aisladas obtenidas a partir de tejido del cordon umbilical humano. En algunas realizaciones, la poblacion de celulas homogeneas aisladas e hidrogel se administran en un disco intervertebral degenerado como el nucleo pulposo del disco intervertebral o el anillo fibroso del disco intervertebral. En otras realizaciones, la poblacion homogenea aislada de celulas obtenidas a partir de tejido de cordon umbilical humano son celulas pueden inducirses a diferenciarse en celulas que muestran un fenotipo de celulas de anillo fibroso o en celulas que muestran un fenotipo celular de nucleo pulposo.

[0025] Cualquier hidrogel conocido en la tecnica (tales como los divulgados en el presente documento) pueden usarse para el metodo. En una realizacion, el hidrogel comprende fibrinogeno y trombina. En otra realizacion, el hidrogel comprende una cola de fibrina tal como, por ejemplo, cola de fibrina EVlCEL® (sellador de fibrina EVICEL® (humano), Omrix Pharmaceuticals, Ltd.).

[0026] Las anteriores y otras caractensticas y ventajas de la invencion seran evidentes de la siguiente descripcion mas particular de realizaciones preferidas de la invencion, como se ilustra en los dibujos adjuntos.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0027] El resumen anterior, asf como la siguiente descripcion detallada de la invencion, se entendera mejor cuando se lea en conjuncion con las figuras adjuntas. Para el proposito de ilustrar la invencion, las cifras demuestran realizaciones de la presente invencion.

[0028] Las Figuras 1 y 2 muestran imagenes de resonancia magnetica de la columna vertebral lumbar (vease el Ejemplo 12). Imagenes de resonancia magnetica Midsagital T2 ponderadas muestran discos sanos que aparecen en

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el grupo de control. Los discos en el grupo pinchado sufren degeneracion (oscurecimiento y perdida de altura). Los discos en los grupos tratados se someten a menos evidencia de la degeneracion de los discos en el grupo pinchado. En particular, las figuras 1 y 2 muestran imagenes de resonancia magnetica de la columna vertebral lumbar ponderadas por muestra T2 de L1-2 por L5-6, en puntos de tiempo 0 (antes de la puncion anular), 3 semanas (antes de la cirugfa de la inyeccion), 6 semanas, y 12 semanas (antes del sacrificio). Los discos perforados (L2-3, L3-4, y L4-5) se describen por las cajas (L2-3, L3-4, L4-5 y de arriba a abajo). Los discos de control no perforados (L1-2 y L5-6) no muestran ninguna evidencia de degeneracion. Los discos de la muestra de control no degeneran (Figura 1A), tal como se esperaba. Los discos perforados (Figura Ib) se hacen mas pequenos y mas oscuros en todos los puntos de tiempo, lo que sugiere la degeneracion. Los discos que se perforaron y despues se trataron con vehnculo (Figura 1C), celulas + tampon (Figura 2A), y celulas + vehnculo (Figura 2B), demuestran menos evidencia de degeneracion en todos los puntos de tiempo en comparacion con los discos perforados (Figura lb).

[0029] La Figura 3 muestra imagenes de resonancia magnetica ponderadas por T2 (area del disco e mdice MRI) (vease el Ejemplo 12). En particular, la media de la zona NP IRM (Figura 3A) y el mdice de IRM (Figura 3B) que combinan L2-3, L3-4 y L4-5 (los discos tratados) para cada grupo de conejo, expresado como un porcentaje del valor de tiempo 0, demuestran que el grupo perforado se somete a la mayor disminucion en el area y el mdice a traves de puntos de tiempo, mientras que los grupos que se perforaron y posteriormente se trataron con el vehnculo, las celulas en tampon (B + C), o celulas en vehnculo (C + C) se someten a una menor disminucion en area e mdice. En la Figura 3, f: indica, la significacion comparacion con el control y * indica importancia en comparacion con la puncion .. Ademas, el mdice de IRM en la Figura 3 se determina como sigue:

fndice de imagnes de resonancia magnetica = NP Area x senal de intensidad

[0030] La Figura 4 muestra curvas de desplazamiento promedio total normalizado (fase de rampa + fluencia) de L3-4 FSU despues de 12 semanas (vease el Ejemplo 12). El desplazamiento dependiente del tiempo bajo una carga constante genera curvas de fluencia de distinta apariencia. Tampon + celulas se comporta mas como vehnculo pinchado + celulas se comporta mas como control, vehnculo solo cae en algun lugar en el medio. Las curvas promedias de fluencia se generaron para cada condicion. Las pruebas axiales generan curvas de fluencia de apariencia distinta en la fase temprana de la prueba (tiempo de 0 a 200 segundos). Los lfmites de puntos representan el error estandar de medicion. Las curvas generadas para la puncion y tampon + celulas parecen similares, al igual que las curvas para el control y el vehnculo + celulas. Cada uno de estos grupos aparece distinto de la curva generada para el grupo de vehnculo.

[0031] Las figuras 5, 6 y 7 muestran la rodajas sagitales de histologfa de disco L4-5 obtenidas despues del sacrificio a las 12 semanas para cada grupo de tratamiento, se tineron con H&E, ampliada 20x y l00x (vease Ejemplo 12). La Figura 5A muestra la rebanada sagital de histologfa de disco L4-5 para el grupo de control. La figura 513 muestra la rebanada sagital de histologfa de disco L4-5 para el grupo de pinchado. La Figura 6A muestra la rebanada sagital de histologfa de disco L4-5 para el grupo de vehmulo. La figura 613 muestra la rebanada sagital de histologfa de disco L4-5 para el grupo de tampon y celulas. La Figura 7 muestra la rebanada sagital de histologfa de disco L4-5 para el grupo de soporte y celulas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

[0032] Varios terminos relacionados con los metodos y otros aspectos de la presente invencion se utilizan en toda la memoria y las reivindicaciones. A tales terminos se les debe dar su significado ordinario en la tecnica a menos que se indique lo contrario. Otros terminos definidos espedficamente se interpretaran de una manera coherente con la definicion proporcionada en este documento.

[0033] Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Asf, por ejemplo, la referencia a "una celula" incluye una combinacion de dos o mas celulas, y similares.

[0034] El termino "aproximadamente" tal como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duracion temporal, y similares, pretende abarcar variaciones de ± 20% o ± 10%, mas preferiblemente ± 5%, incluso mas preferiblemente ± 1%, y aun mas preferiblemente ± 0,1% desde el valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para llevar a cabo los metodos descritos.

[0035] "Derivado" se utiliza para indicar que las celulas se han obtenido a partir de su fuente biologica y crecido, se expandio en cultivo, se inmortalizaron, o se manipularon de otra manera in vitro.

[0036] "Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" de su estado natural. Si una molecula o composicion se produce en la naturaleza, se ha "aislado" si se ha cambiado o retirado de su entorno original, o ambos.

[0037] El termino "expresar", "expresado", o "expresion" de una molecula de acido nucleico o gen se refiere a la biosmtesis de un producto genico, por ejemplo, la biosmtesis de un polipeptido.

[0038] Los "factores troficos" son sustancias que promueven la supervivencia, el crecimiento, la diferenciacion, la

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proliferacion y/o la maduracion de una celula, o estimulan una mayor actividad biologica de una celula. Derivados de celulas se refieren a cualquier material que se puede obtener a partir de celulas e incluyen medios de celulas acondicionadas, lisado celular, protemas de matriz extracelular, factores troficos, fracciones de celulas, membranas celulares.

[0039] "Degeneracion" se refiere a cualquier dano ffsico, lesion, degeneracion o trauma a un IVD.

[0040] "Patologfa" se refiere a cualquier indicio estructural o funcional de una desviacion del estado normal de una celula, tejido, organo o sistema, segun se mide mediante cualquier medio adecuado en la tecnica.

[0041] Una "enfermedad" es cualquier desviacion de o deterioro en la salud, condicion, o el funcionamiento de una celula, tejido, organo, sistema o organismo en su conjunto, segun se mide mediante cualquier medio adecuado en la tecnica.

[0042] "Tratar," tratando" o 'tratamiento' se refieren a cualquier exito o indicio de exito en la atenuacion o mejora de la enfermedad, dano o condicion, incluyendo cualquier parametro objetivo o subjetivo tal como reduccion, remision, disminucion de smtomas o hacer la enfermedad, dano o condicion mas tolerable para el paciente, la desaceleracion de la velocidad de degeneracion o declive, haciendo que el punto final de la degeneracion sea menos debilitante, o mejorando el bienestar ffsico o mental de un sujeto. El tratamiento o mejora de los smtomas se pueden basar en parametros objetivos o subjetivos; incluyendo los resultados de un examen ffsico, examen neurologico y/o evaluaciones psiquiatricas.

[0043] "Cantidad eficaz" o "cantidad terapeuticamente eficaz" se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a una cantidad de un compuesto, material, o composicion, tal como se describe en el presente documento eficaz para lograr un resultado biologico particular, tal como, pero no limitado a, los resultados biologicos descritos, se describe, o se ejemplifica en el presente documento. Tales resultados pueden incluir, pero no se limitan al tratamiento de la enfermedad IVD o dano en un sujeto, tal como se determina por cualquier medio adecuado en la tecnica.

[0044] "Farmaceuticamente aceptable" se refiere a aquellas propiedades y/o sustancias que son aceptables para el paciente desde un punto de vista y para el qmmico farmaceutico fabricante desde un punto de vista ffsico/qmmico farmacologico/toxicologico respecto a la composicion, formulacion, estabilidad, aceptacion del paciente y biodisponibilidad. "Vetffculo farmaceuticamente aceptable" se refiere a un medio que no interfiere con la eficacia de la actividad biologica del ingrediente activo y no es toxico para el huesped al que se administra.

[0045] Se ha descubierto que las enfermedades y condiciones relacionadas con la degeneracion del disco intervertebral (IVD) se pueden tratar mediante la administracion de Celulas derivadas de tejido de cordon umbilical ZT y un hidrogel como se ha descrito en este documento. Ventajosamente, los metodos, composiciones y kits proporcionados en este documento promueven la reparacion y la regeneracion de IVDs degenerados, y de este modo alivian uno o mas smtomas asociados con la degeneracion IVD. Por consiguiente, en un aspecto, se proporcionan metodos para tratar una enfermedad o condicion relacionada con degeneracion IVD, que comprende la administracion de Celulas derivadas de tejido de cordon umbilical a un IVD en una cantidad suficiente para tratar la enfermedad o condicion.

[0046] En diversas realizaciones, la enfermedad o condicion relacionada con la degeneracion de IVD puede ser causada o inducida por la edad, trauma, autoinmunidad, reaccion inflamatoria, un defecto genetico, la deposicion de inmunocomplejo (por ejemplo, formacion de tejido de cicatriz), y/o combinaciones de los mismos. Un IVD seleccionada para tratamiento puede ser intacto o en cualquier etapa de dano o degeneracion. Por ejemplo, un IVD seleccionada para tratamiento puede ser herniada (por ejemplo, donde una porcion del anillo fibroso tiene una protuberancia u otro saliente), rota (por ejemplo, donde al menos una porcion del anillo fibroso se rompe, lo que resulta en una disminucion de la presion y/o el volumen del nucleo pulposo), deslaminada (por ejemplo, donde dos o mas capas del anillo fibroso se han separado), y/o se ha danado o degenerado (por ejemplo, donde el anillo fibroso tiene fisuras, grietas, lagrimas, o similares, y/o donde la matriz extracelular se degrada o altera).

[0047] En diversas realizaciones, las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical se administran a un IVD degenerado, por ejemplo por inyeccion, trasplante, implante, inyeccion o la administracion de un complejo de celula de matriz, o cualquier otro medio conocido en la tecnica para proporcionar la terapia celular. En algunas realizaciones, las celulas se administran directamente al anillo fibroso y/o en el nucleo pulposo del IVD. En algunas realizaciones, las celulas se administran a un IVD indirectamente. Por ejemplo, las celulas pueden estar en un vetffculo acuoso, encapsulado en un dispositivo o se siembran en una matriz, que se implanta a continuacion en o cerca de un IVD degenerado. Los vehmuloes acuosos incluyen, pero no se limitan a soluciones de tampon fisiologicas, tales como solucion salina tamponada, solucion salina tamponada con fosfato, solucion de sales equilibradas de Hank, solucion salina tamponada con Tris y solucion salina tamponada con Hepes. En diversas realizaciones, un dispositivo, matriz, u otro deposito celular se pueden implantar de manera que se unen a una pared exterior del anillo fibroso, o situan fuera de, pero junto a una pared del anillo fibroso, o adyacente a una placa terminal de un cuerpo vertebral que rodea la IVD.

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[0048] En algunas realizaciones, las celulas se administran en la forma de un dispositivo tal como un complejo de celulas de matriz. Materiales de dispositivos incluyen, pero no se limitan a materiales biorreabsorbibles tales como colagenos, 35/65 poli(epsilon-caprolactona)(PCL)/poli(acido glicolico) (PGA), construcciones bioabsorbibles PANACRYLTM, VICRYL™ poliglactina 910, y peptidos de automontaje y materiales no reabsorbibles tales como fluoropolfmeros (por ejemplo, fluoropolfmeros de TEFLON®), plastico y metal. Matrices incluyen andamios biocompatibles, celosfas, estructuras de automontaje y similares, ya sean bioabsorbibles o no, lfquido, gel o solido. Tales matrices se conocen en la tecnica del tratamiento terapeutico de celulas, la reparacion quirurgica, la ingeniena de tejidos y curacion de heridas. Preferiblemente, las matrices se tratan previamente con las celulas terapeuticas. Mas preferiblemente, las matrices estan pobladas con celulas en estrecha asociacion con la matriz o sus espacios. Las celulas pueden adherirse a la matriz o pueden atraparse o contenerse dentro de la matriz sus espacios. Los mas preferidos son complejos de celulas de matriz en los que las celulas estan creciendo en estrecha asociacion con la matriz y cuando se utiliza terapeuticamente, el crecimiento, reparacion y/o regeneracion de las propias celulas IVD del paciente es estimulado y apoyado, y la angiogenesis adecuada es estimulada o apoyada de manera similar. Las composiciones celulas de matriz pueden introducirse en el cuerpo de un paciente de cualquier modo conocido en la tecnica, incluyendo, pero no limitados a la implantacion, inyeccion, fijacion quirurgica, trasplante con otro tejido, y similares. En algunas realizaciones, las matrices se forman in vivo, o incluso mas preferiblemente in situ, por ejemplo geles polimerizables in situ se pueden utilizar de acuerdo con la invencion. Ejemplos de tales geles se conocen en la tecnica.

[0049] Celulas derivadas de tejido del cordon umbilical se administran a un IVD degenerada como parte de una composicion que comprende un hidrogel. En otra realizacion, las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical se administran a un IVD degenerada junto con un hidrogel.

[0050] Las celulas descritas en este documento tambien pueden sembrarse en matrices tridimensionales, tales como andamios y se implantan in vivo, donde las celulas sembradas pueden proliferar sobre o en el marco, o ayudar a establecer tejido de reemplazo in vivo con o sin la cooperacion de otras celulas. El crecimiento de las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical en el marco tridimensional de resultados de preferencia en la formacion de un tejido tridimensional, o fundacion del mismo, que puede utilizarse in vivo, por ejemplo para reparar y/o regenerar tejido danado o enfermo.

[0051] Las celulas pueden sembrarse en un marco tridimensional o matriz, tal como un andamio, una espuma, un andamio electrostaticamente por hilado, un andamio no tejido, micropartfculas porosas o no porosas, o hidrogel y se administran en consecuencia. El marco se puede configurar en varias formas, tales como la tubular sustancialmente plana, sustancialmente cilmdrica o, o puede ser completamente de forma libre como puede requerirse o desearse para la estructura correctiva bajo consideracion. Dos o mas marcos sustancialmente planos se pueden colocar uno encima de otro y asegurarse juntos como sea necesario para generar un marco de multiples capas.

[0052] En tales marcos tridimensionales, las celulas pueden coadministrarse con otros tipos de celulas, u otros progenitores de tipo de tejidos blando, incluyendo las celulas madre. Cuando se cultivan en un sistema tridimensional, las celulas proliferantes pueden madurarse y segregarse apropiadamente para formar componentes de tejidos adultos analogos a las contrapartes encontradas naturalmente in vivo.

[0053] Las matrices descritas y ejemplificadas en el presente documento pueden disenarse de tal manera que la estructura de la matriz soporta las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical sin degradacion posterior, apoya a las celulas desde el momento de la siembra hasta que el trasplante de tejido se remodela por el tejido del huesped, o permite que las celulas sembradas se adjunten, se proliferen, y se desarrollen en una estructura de tejido que tiene suficiente integridad mecanica para apoyarse in vitro, en cuyo momento, la matriz se degrada.

[0054] Las matrices, andamios, tales como espumas de materiales no tejidos, estructuras electrostaticamente hiladas, micropartfculas y sistemas de automontaje contemplados para uso en esta invencion pueden implantarse en combinacion con una o mas celulas, factores de crecimiento, medicamentos u otros componentes, tales como agentes bioactivos que promueven cicatrizacion, regeneracion, reparacion o crecimiento de tejido, o estimulan la vascularizacion o la inervacion de la misma o de otra manera aumentan o mejoran el resultado terapeutico o la practica de la invencion, ademas de las celulas de la invencion.

[0055] En algunas realizaciones, las celulas descritas en este documento se pueden cultivar libremente en cultivo, eliminarse del cultivo e inocularse en un marco tridimensional. La inoculacion del marco tridimensional con una concentracion de celulas, por ejemplo, aproximadamente 106 a 5 x 107 celulas por mililitro, se traduce preferiblemente en el establecimiento del soporte tridimensional en periodos relativamente cortos de tiempo. Ademas, en algunas aplicaciones puede ser preferible utilizar un numero mayor o menor de celulas dependiendo del resultado deseado.

[0056] En algunos aspectos, es util recrear en el cultivo el microambiente celular encontrado in vivo, de tal manera que el grado en que las celulas se cultivan antes de la implantacion in vivo o in vitro utilizado puede variar. Las celulas pueden ser inoculadas en el marco antes o despues de formar la forma deseada para la implantacion, por ejemplo, cuerdas, tubos, filamentos, y similares. Despues de la inoculacion de las celulas sobre el marco, el marco

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se incuba preferiblemente en un medio de crecimiento apropiado. Durante el penodo de incubacion, las celulas inoculadas creceran y envolveran el marco y pueden, por ejemplo abarcar, o parcialmente abarcar los espacios intersticiales. Es preferible, pero no necesario cultivar las celulas a un grado apropiado, que refleja la densidad celular in vivo de tejido que esta siendo reparado o regenerado. En otras realizaciones, la presencia de las celulas, incluso en numeros bajos en el marco estimula el crecimiento hacia dentro de las celulas sanas endogenas para facilitar la curacion, por ejemplo, del tejido danado o lesionado.

[0057] Ejemplos de matrices, por ejemplo andamios, que pueden usarse incluyen esteras, espumas porosas o semiporosas, peptidos de automontaje y similares. Esterillas no tejidas pueden, por ejemplo, formarse usando fibras compuestas de polfmeros naturales o sinteticos. En una realizacion preferida, los copolfmeros absorbibles de acidos glicolico y lactico (PGAIPLA), que se venden bajo el nombre comercial VICRYL™ (Ethicon, Inc., Somerville, NJ) se utilizan para formar una estera. Espumas, compuestas de, por ejemplo, copolfmero de poli(epsilon- caprolactona)/poli(acido glicolico) (PCL/pGa), formado por procesos tales como liofilizacion, o liofilizacion, como se discute en la patente de Estados Unidos N° 6.355.699, tambien puede servir como andamios.

[0058] Los geles se utilizan en este documento. Ejemplos de geles incluyen geles inyectables, en geles polimerizables in situ, e hidrogeles; geles pueden estar compuestos de peptidos de automontaje. Estos materiales se utilizan frecuentemente como soportes para el crecimiento de tejido. Por ejemplo, cuando se usa como un gel inyectable, un gel puede estar compuesto por agua, solucion salina o solucion tamponada fisiologica y un material gelificante. materiales gelificantes incluyen, pero no se limitan a protemas, tales como, colageno, elastina, trombina, fibronectina, gelatina, fibrina, tropoelastina, polipeptidos, laminina, proteoglicanos, cola de fibrina, coagulo de fibrina, coagulo de plasma rico en plaquetas (PRP), coagulo de plasma pobre en plaquetas (PPP), hidrogeles de peptidos de automontaje, y atelocolageno; polisacaridos tales como, pectina, celulosa, celulosa oxidada, quitina, quitosano, agarosa, acido hialuronico; polinucleotidos tales como acidos ribonucleicos, acidos desoxirribonucleicos, y otros tales como, alginato, alginato reticulado, poli(N-isopropilacrilamida), poli(oxialquileno), copolfmeros de poli(oxido de etileno) poli(oxido de propileno), poli(alcohol vimlico), poliacrilato, monostearoilglicerol co-succinato/polietileno glicol (MGSA/PEG) copolfmeros y combinaciones de los mismos. En una realizacion, el material de gelificacion (es decir, el hidrogel) comprende fibrinogeno (factor I), tal como por ejemplo fibrinogeno recombinante o fibrinogeno purificado a partir de sangre. En otra realizacion el hidrogel comprende fibrinogeno y trombina. En aun otra realizacion, el gel es cola de fibrina EVICEL® (sellador de fibrina EVICEL® (humano), Omrix Pharmaceuticals, Ltd.) (BAC2 (fibrinogeno) y trombrina).

[0059] En general, los hidrogeles son materiales polimericos reticulados que pueden absorber mas de 20% de su peso en agua mientras se mantiene una estructura tridimensional distinta. Ademas, los hidrogeles tienen una alta permeabilidad para el oxfgeno, nutrientes y otros metabolitos solubles en agua. Esta definicion incluye polfmeros reticulados en seco que se hinchan en medios acuosos, asf como materiales hinchados por agua. Una gran cantidad de polfmeros hidrofilos se puede reticular para producir hidrogeles, si el polfmero es de origen biologico, semisintetico o totalmente sintetico. El hidrogel puede ser producido a partir de un material polimerico sintetico. Tales polfmeros sinteticos se pueden adaptar a una amplia gama de propiedades y uniformidad lote a lote predecible, y representan una fuente fiable de material que generalmente esta libre de preocupaciones de inmunogenicidad. En una realizacion de la invencion, los hidrogeles se forman a partir de peptidos de automontaje, como los discutidos en la patente de los Estados Unidos Nos 5.670.483 y 5.955.343, la Publicacion de Patente de Estados Unidos N° 2002/0160471, la Solicitud PCT N° WO 02/062969.

[0060] Propiedades que hacen que los hidrogeles sean particularmente valiosas como una matriz en esta invencion incluyen el grado de hinchamiento de equilibrio, la cinetica de sorcion, la permeabilidad de solutos, y sus caractensticas de rendimiento en vivo. La permeabilidad a los compuestos depende en parte del grado de inflamacion o contenido de agua y la velocidad de biodegradacion. Puesto que la resistencia mecanica de una disminucion de gel en proporcion directa con el grado de inflamacion, sino que tambien esta dentro de la contemplacion de la presente invencion que el hidrogel se pueda unir a un sustrato de modo que el sistema compuesto mejore la resistencia mecanica. En realizaciones alternativas, el hidrogel se puede impregnar dentro de un sustrato poroso, para obtener la resistencia mecanica del sustrato, junto con las propiedades de administracion util del hidrogel.

[0061] Redes degradables de formacion in situ tambien son adecuadas para uso en la invencion (vease, por ejemplo, Anseth, K.S. #et al#., J. Controlled Release, 2002; 78: 199 209; Wang, D. #et al#., Biomaterials, 2003; 24:39693980, Publicacion de patente de EE.UU. 2002/0022676 a He et al.). Estos materiales se formulan como fluidos adecuados para inyeccion, y luego pueden inducirse por una variedad de medios (por ejemplo, cambio en la temperatura, pH, exposicion a la luz) para formar redes de hidrogel degradables in situ o in vivo.

[0062] El marco puede ser un fieltro, que puede estar compuesto de un hilo de multifilamento hecho de un material bioabsorbible, por ejemplo, copolfmeros de PGA, PLA, PCL o mezclas, o acido hialuronico. El hilo se convierte en un fieltro utilizando tecnicas de procesamiento textil estandar que consta de engaste, corte, cardado y puncion. Las celulas de la invencion pueden sembrarse en los andamios de espuma que pueden ser estructuras compuestas. Ademas, el marco tridimensional puede ser moldeado en una forma util, tal como una estructura espedfica en o alrededor del IVD a repararse, reemplazarse, o aumentarse.

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[0063] El marco puede ser tratado antes de la inoculacion de las celulas de la invencion con el fin de mejorar la union celular. Por ejemplo, antes de la inoculacion con las celulas de la invencion, las matrices de nylon pueden ser tratadas con acido acetico 0,1 molar y se incubaron en polilisina, PBS, y/o colageno para recubrir el nylon. El poliestireno puede ser tratado de forma similar utilizando acido sulfurico.

[0064] Ademas, las superficies externas del marco tridimensional pueden ser modificadas para mejorar la union o el crecimiento de las celulas y la diferenciacion del tejido, tales como por recubrimiento de plasma del marco o adicion de una o mas protemas (por ejemplo, colagenos, fibras elasticas, fibras reticulares), glicoprotemas, glicosaminoglicanos (por ejemplo, sulfato de heparina, condroitina-4-sulfato, condroitina-6-sulfato, sulfato de dermatano, sulfato de queratina), una matriz celular, y/u otros materiales tales como, pero no limitado a, gelatina, alginatos, agar, agarosa, y gomas vegetales, entre otros.

[0065] El andamio puede estar compuesto de o tratado con materiales que lo hacen no trombogenico. Estos tratamientos y materiales tambien pueden promover y mantener el crecimiento endotelial, la migracion y la deposicion de matriz extracelular. Ejemplos de estos materiales y tratamientos incluyen, pero no se limitan a los materiales naturales tales como protemas de la membrana basal, tales como laminina y colageno de tipo IV, materiales sinteticos tales como epTFE, y siliconas de poliuretanourea segmentadas, tales como PURSPAN® (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, CA). Estos materiales pueden ser tratados adicionalmente para hacer que el andamio sea no trombogenico. Tales tratamientos incluyen agentes antitromboticos tales como heparina, y tratamientos que alteran la carga superficial del material tal como recubrimiento por plasma.

[0066] Diferentes proporciones de los diferentes tipos de colageno, por ejemplo, depositados sobre el marco pueden afectar el crecimiento de celulas de tejido espedfico u otras que pueden inocularse mas tarde en el marco o que pueden crecer sobre la estructura in vivo. Alternativamente, el marco puede inocularse con una mezcla de celulas que sintetizan los tipos de colageno adecuados deseados. Dependiendo del tejido a cultivar, el tipo de colageno apropiado para inocularse en el marco o producirse por las celulas sembradas pueden seleccionarse. Por ejemplo, las cantidades relativas de las fibras colagenas y elasticas presentes en el marco pueden modularse mediante el control de la relacion de celulas productoras de colageno para celulas productoras de elastina en el inoculo inicial.

[0067] El marco tridimensional sin semillas o inoculado puede ser para el trasplante o la implantacion de cualquiera de las celulas cultivadas obtenidas a partir de la matriz o la propia matriz cultivada in vivo. Los andamios tridimensionales pueden usarse para reemplazar o aumentar el tejido existente, para introducir tejido nuevo o alterado, para modificar protesis artificiales, o unir tejidos o estructuras biologicas.

[0068] Las celulas se pueden administrar (por ejemplo, inyectar) en una IVD a traves de una aguja, tal como una pequena aguja de calibre. En algunas formas de realizacion, la aguja tiene un diametro de alrededor de calibre 22 o menos, a fin de mitigar la posibilidad de herniar la IVD. Cuando la inyeccion de volumenes en el nucleo pulposo, es deseable que el volumen de farmaco suministrado sea no mas de aproximadamente 3 ml, preferiblemente no mas de aproximadamente 1 ml, mas preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 0,5 ml. Cuando se inyecta en estas cantidades mas pequenas, se cree que el volumen anadido no causara un aumento de presion apreciable en el nucleo pulposo. Si el volumen de la inyeccion directa de la formulacion es suficientemente alto para provocar que una preocupacion de la sobrepresurizacion del nucleo pulposo, entonces se prefiere que al menos una porcion del nucleo pulposo se retire antes de la inyeccion directa. En algunas realizaciones, el volumen de nucleo pulposo eliminado es sustancialmente similar al volumen de la formulacion a inyectar. Por ejemplo, el volumen de nucleo pulposo eliminado puede estar dentro de aproximadamente 80-120% del volumen de la formulacion a inyectarse. En algunas realizaciones, las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical se concentran antes de administrarse.

[0069] Las celulas utiles en los metodos, composiciones y kits proporcionados en este documento se pueden derivar de cordon umbilical de mairnfero recuperado en o poco despues de la terminacion de cualquiera de un embarazo a termino o prematuro, por ejemplo, despues de la expulsion despues del nacimiento o la extirpacion quirurgica despues de una cesarea. Sangre y residuos se eliminan del tejido del cordon umbilical antes del aislamiento de las celulas, por ejemplo, por lavado con cualquier medio o tampon adecuado.

[0070] Las celulas pueden aislarse de tejido del cordon umbilical por la fuerza mecanica o por digestion enzimatica. Las enzimas preferidas son las metaloproteasas, proteasas neutras y proteasas mucolfticas. Por ejemplo, varias combinaciones de colagenasa, dispasa, y la hialuronidasa se pueden utilizar para disociar las celulas del tejido del cordon umbilical. El experto en la tecnica apreciara que muchos de tales tratamientos enzimaticos son conocidos en la tecnica para el aislamiento de celulas de diversas fuentes de tejido. Por ejemplo, la serie LIBERASE® Blendzyme (Roche) de combinaciones de enzimas son adecuadas para uso en los presentes procedimientos. Otras fuentes de enzimas son conocidas, y el experto en la tecnica tambien puede obtener tales enzimas directamente desde sus fuentes naturales. El experto en la tecnica tambien se bien preparado para evaluar enzimas nuevas o adicionales o combinaciones de enzima para su utilidad en el aislamiento de las celulas de la invencion. Tratamientos enzimaticos preferidos son 0,5, 1, 1,5, o 2 horas de duracion o mas.

[0071] Las celulas aisladas se pueden utilizar para iniciar cultivos celulares. Las celulas aisladas se transfirieron a

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recipientes de cultivo de tejidos esteriles o bien no recubiertos o recubiertos de matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colageno (nativo desnaturalizado, atello, o reticulado), gelatina, fibronectina y otras protemas de la matriz extracelular. Celulas derivadas de tejido del cordon umbilical se cultivan en cualquier medio de cultivo capaz de sostener el crecimiento de las celulas tales como, pero no limitados a, DMEM (glucosa alta o baja), DMEM avanzado, DMEM/MCDB 201, medio basal de Eagle, medio F10 de Ham (F10), medio F12 de Ham (F12), Medio de Hayflick, Medio de Dulbecco modificado por Iscove, Medio de Crecimiento de Celulas Madre Mesenquimales (mScGM), DMEM/F12, RPMI 1640, y CELL-GRO-FREE. El medio de cultivo se puede complementar con uno o mas componentes incluyendo, por ejemplo, suero bovino fetal, preferiblemente alrededor de 2-15% (v/v); suero equino; suero humano; suero de ternera fetal; betamercaptoetanol, preferiblemente de aproximadamente 0,001% (v/v); uno o mas factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1), factor inhibidor de leucocitos (LIF) y eritropoyetina; aminoacidos, incluyendo L-valina; y uno o mas agentes antibioticos y/o antimicoticos para controlar la contaminacion microbiana, tal como, por ejemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina, ya sea solo o en combinacion.

[0072] Las celulas se siembran en recipientes de cultivo a una densidad para permitir el crecimiento celular. En una realizacion, las celulas se cultivaron a aproximadamente 0 a aproximadamente 5 por ciento en volumen de CO2 en aire. En algunas realizaciones, las celulas se cultivaron a aproximadamente 2 a aproximadamente 25 por ciento O2 en el aire, preferentemente aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento O2 en el aire. Las celulas preferiblemente se cultivan a aproximadamente 25 a aproximadamente 40°C y mas preferiblemente se cultivan a 37°C. El medio en el recipiente de cultivo puede ser estatico o agitado, por ejemplo, usando un biorreactor. Las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical se cultivan preferiblemente bajo estres oxidativo bajo (por ejemplo, con la adicion de glutation, vitamina C, catalasa, vitamina E, N-acetileisteina), lo que significa ningun o poco dano de radicales libres a las celulas cultivadas.

[0073] Celulas derivadas de tejido de cordon umbilical pueden pasarse o eliminarse a un recipiente de cultivo separado que contiene medio fresco del mismo o de diferente tipo que el utilizado inicialmente, donde la poblacion de celulas se puede expandir mitoticamente. Las celulas de la invencion se pueden usar en cualquier punto entre el paso 0 y la senescencia. Las celulas preferiblemente se pasan entre aproximadamente 3 y aproximadamente 25 veces, se pasan mas preferiblemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 veces, y preferiblemente se pasan 10 o 11 veces. La clonacion y/o subclonacion se pueden realizar para confirmar que una poblacion clonal de las celulas ha sido aislada.

[0074] En una realizacion de la invencion, las celulas pueden ser cultivadas (expandidas) en un microveldculo. Los microsoportes son partmulas, perlas o granulos utiles para la union y crecimiento de celulas dependientes de anclaje en cultivo. Los microvehmuloes pueden ser solidos, porosos o un nucleo solido con un revestimiento poroso. Microveldculoes adecuados ejemplares incluyen, pero no se limitan a Cytodex 1®, Cytodex 2®, Cytodex 3® (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway NJ) o HILLEX® (SoloHill Engineering, Inc. Ann Arbor, MI). Microveldculoes adecuados ejemplares y componentes microveldculoes se describen en la Publicacion de Patente de Estados Unidos N° 2008/016632.

[0075] Diferentes tipos de celulas presentes en el tejido del cordon umbilical pueden fraccionarse en subpoblaciones. Esto puede conseguirse usando tecnicas estandar para la separacion celular incluyendo, pero no limitado al tratamiento enzimatico; clonacion y seleccion de tipos celulares espedficos, por ejemplo pero no limitado a la seleccion basada en marcadores morfologicos y/o bioqmmicos; el crecimiento selectivo de las celulas deseadas (seleccion positiva), destruccion selectiva de celulas no deseadas (seleccion negativa); separacion basada en la aglutinabilidad celular diferencial en la poblacion mezclada como, por ejemplo, con la aglutinina de soja; procedimientos de congelacion-descongelacion; propiedades de adherencia diferencial de las celulas en la poblacion mixta; filtracion; centrifugacion convencional y zonal; elutriacion centnfuga (centrifugacion contra streaming); unidad de separacion por gravedad; distribucion en contracorriente; electroforesis; por fluorescencia de celulas activadas (FACS); y similares.

[0076] Ejemplos de celulas aisladas de tejido del cordon umbilical se depositaron en la American Type Culture Collection el 10 de junio de 2004, y se asignan numeros de acceso ATCC de la siguiente manera: (1) a la designacion de la cepa UMB 022803 (P7) se le asigno el N° de Acceso PTA6067; y (2) a la designacion de la cepa UMB 022803 (P17) se le asigno el N° de Acceso PTA6068.

[0077] Las celulas de la medula derivadas de tejido umbilical pueden ser caracterizadas por, por ejemplo, las caractensticas de crecimiento (por ejemplo, capacidad de duplicacion de la poblacion, tiempo, pasajes a la senescencia de duplicacion), analisis cariotipo (por ejemplo, cariotipo normal; linaje materno o neonatal), citometna de flujo (por ejemplo, analisis FACS), inmunohistoqmmica y/o inmunocitoqmmica (por ejemplo, para la deteccion de epttopos), perfiles de expresion genica (por ejemplo, ensayos de chips de genes; reaccion de cadena de la polimerasa (por ejemplo, PCR con transcriptasa inversa, PCR en tiempo real, y PCR convencional)), matrices de protemas, secrecion de protemas (por ejemplo, por ensayo de coagulacion de plasma o el analisis de medio condicionado PDC, por ejemplo, por ensayo inmunoenzimatico (ELISA)), reaccion mixta de linfocitos (por ejemplo,

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como medida de la estimulacion de PBMCs), y/u otros metodos conocidos en la tecnica.

[0078] En diversos aspectos, las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical tienen una o mas de las siguientes caractensticas de crecimiento: requerir L-valina para el crecimiento en cultivo; son capaces de crecimiento en atmosferas que contengan oxfgeno de aproximadamente 5% a al menos aproximadamente 20%; tienen el potencial de por lo menos aproximadamente 40 duplicaciones en cultivo antes de llegar a la senescencia; y/o adjuntar y expandir en un recipiente de cultivo de tejido revestido o no revestido, en el que el recipiente de cultivo de tejido recubierto comprende un recubrimiento de gelatina, laminina, colageno, poliornitina, vitronectina o fibronectina.

[0079] En algunas realizaciones, las celulas tienen un cariotipo normal, que se mantiene como se pasan las celulas. El cariotipo es particularmente util para identificar y distinguir las celulas neonatales de las maternas derivadas de placenta. Los metodos para la determinacion del cariotipo estan disponibles y conocidos por los expertos en la tecnica.

[0080] En algunas realizaciones, las celulas pueden ser caracterizadas por la produccion de ciertas protemas, incluyendo la produccion de al menos uno de factor tisular, vimentina, y actina de musculo liso alfa; y la produccion de al menos uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFRalfa, PD-L2 y HLA-A, B, marcadores de superficie celular de C, tal como se detecta mediante, por ejemplo, citometna de flujo. En otras realizaciones, las celulas pueden ser caracterizadas por la falta de produccion de al menos uno de marcadores de superficie celular CD31, CD34, CD45, CD8O, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G, y HLA-DR, HLA-DP, y/o HLA-DQ, tal como se detecta por cualquier medio adecuado, tales como citometna de flujo. En algunas realizaciones, las celulas que producen al menos dos de factor tisular, vimentina, y actina de musculo liso alfa se prefieren. En algunas realizaciones, se prefieren celulas que producen tres del factor de protemas de tejido, vimentina, y actina de musculo liso alfa.

[0081] En algunas realizaciones, las celulas tienen, en relacion con una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimal, o una celula de medula osea de cresta ilfaca, el aumento de expresion de un gen que codifica al menos una de la interleucina 8; reticulon 1; quimiocinas (CXC motivo) ligando 1 (actividad estimuladora del crecimiento del melanoma, alfa); quimiocina (motivo CXC) ligando 6 (granulocitos de protema quimiotactica 2); quimiocina (motivo CXC) ligando 3; factor de necrosis tumoral, protema inducida alfa 3.

[0082] En aun otras realizaciones, las celulas tienen, en relacion con una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimal, o una celula de medula osea de cresta ilfaca, la reduccion de expresion de un gen que codifica al menos uno de: homeobox de estatura corta 2; choque termico de 27 kDa protema 2; quimiocinas (motivo CXC) ligando 12 (factor 1 derivado de celulas estromales); elastina (estenosis aortica supravalvular, smdrome de WilliamsBeuren); Homo sapiens ARNm; ADNc DKFZp586M2O22 (a partir del clon DKFZp586M2O22); homeobox mesenquimo 2 (homeobox de crecimiento de detencion espedfica); homologo homeobox sine oculis 1 (Drosophila); cristalina, alfa B; activador asociado desalinado de la morfogenesis 2; protema DKFZP586B2420; similar a neuralina 1; tetranectina (protema de union del plasminogeno); homologfa src tres (SH3) y dominio rico en cistema; colesterol 25-hidroxilasa; factor de transcripcion relacionado runt 3; receptor de interleucina 11, alfa; promotor de procolageno cendopeptidasa; homologo de frizzled 7 (Drosophila); gen hipotetico BC008967; colageno, tipo VIII, alfa 1; tenascina C (hexabrachion); protema homeobox Iroquois 5; hefaestina; integrina, beta 8; glicoprotema de vesmula sinaptica 2; neuroblastoma, supresion de tumorigenicidad 1; protema de union de factor de crecimiento de la insulina 2, 36kDa; Homo sapiens aDnc FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744; factor de tipo receptor de citoquina 1; potasio intermedio/pequena conductancia del canal activado por calcio, subfamilia N, miembro 4; integrina, beta 7; coactivador transcripcional con motivo de union a PDZ (TAZ); homologo homeobox sine oculis 2 (Drosophila); protema KIAA1034; protema de membrana asociada a vesmula 5 (miobrevina); protema de la matriz extracelular de tipo fibulina que contiene EGF 1; respuesta de crecimiento temprano 3; homeobox no distal 5; protema hipotetica FLJ20373; reductasa aldoceto familia 1, miembro C3 (deshidrogenasa hidroxiesteroide 3-alfa, tipo II); biglicano; coactivador transcripcional con motivo de union a PDZ (TAZ); fibronectina 1; proencefalina; integrina, tipo beta 1 (con dominios de tipo EGF de repeticion); Homo sapiens ARNm de longitud completa de ADNc inserto del clon Euroimage 1968422; EphA3; protema K1AA0367; receptor del peptido natriuretico C/guanilato ciclasa C (peptido atrionatriuretico receptor C); protema hipotetica FLJ14054; Homo sapiens ARNm; ADNc DKFZp564B222 (a partir del clon DKFZp564B222); BCL2/adenovirus E1B 19kDa protema de interaccion de tipo 3; AE protema de union 1; y el citocromo c oxidasa subunidad VIIa polipeptido 1 (musculo).

[0083] En algunas realizaciones, las celulas pueden ser caracterizadas por la secrecion de al menos una de MCP-1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HBEGF, BDNF, TPO, MIP1b, RANTES, y TIMP-1. En algunas realizaciones, las celulas pueden ser caracterizadas por la falta de secrecion de al menos una de TGF-beta2, ANG2, PDGFbb, MIP1a y VEGF, como se detecta por ELISA.

[0084] En algunas realizaciones preferidas, la celula comprende dos o mas de las caractensticas anteriormente enumeradas de crecimiento, produccion de marcadores de protema/superficie, expresion genica o secrecion de sustancias. En algunas realizaciones, las celulas que comprende, tres, cuatro, o cinco o mas de las caractensticas preferidas. En algunas realizaciones, las celulas comprenden seis, siete, u ocho o mas de las caractensticas preferidas. En algunas realizaciones, se prefieren las celulas que comprenden la totalidad de las caractensticas

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anteriores. En otras realizaciones, las celulas derivadas del cordon umbilical tienen cualquiera de las caractensticas descritas en la patente de Estados Unidos Nos 7.510.873 y 7.524.489.

[0085] Entre las celulas que se prefieren para su uso con los diversos aspectos de la invencion estan las celulas que tienen las caractensticas descritas anteriormente, y mas particularmente aquellas en las que las celulas tienen cariotipos normales y mantienen cariotipos normales con pases, y donde las celulas expresan cada uno de las marcadores CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, y HLA-A,B,C, donde las celulas producen las protemas inmunologicamente detectables que corresponden a los marcadores enumerados. Tambien se prefieren aquellas celulas que, ademas de lo anterior, no producen protemas correspondientes a cualquiera de los marcadores CD31, CD34, CD45, C117, CD141, o HLA-DR,DP,DQ, tal como se detecta por cualquier medio adecuado en la tecnica, tal como citometna de flujo. Muy preferidas son las celulas que no expresan CD117 o HLA-DR o telomerasa.

[0086] En algunos aspectos preferidos, los metodos comprenden la administracion de un hidrogel y celulas obtenidas o aisladas a partir de tejido del cordon umbilical humano a un IVD degenerado, en el que las celulas son capaces de autorrenovacion y expansion en cultivo, requieren L-valina para el crecimiento, pueden crecer en al menos aproximadamente 5% de oxfgeno, no producen CD117 o HLA-DR o telomerasa, expresas actina de musculo liso alfa, y expresan, con relacion a fibroblastos humanos, celulas madre mesenquimales o celula de medula osea de cresta ilfaca, aumento de los niveles de interleucina 8 y reticulon 1. Las celulas aisladas de tejido de cordon umbilical humano pueden expandirse en cultivo antes de la administracion. En algunas realizaciones, las celulas obtenidas a partir de tejido de cordon umbilical humano tienen el potencial de diferenciarse en celulas de un fenotipo IVD, tales como, pero no limitado a, un fenotipo de celulas de anillo fibroso o un fenotipo de celulas del nucleo pulposo. Las celulas derivadas de tejido de cordon umbilical pueden integrarse en IVD del paciente, o, alternativamente, pueden proporcionar soporte para el crecimiento o la estimulacion para diferenciar celulas madre IVD naturalmente presentes. La supervivencia de las celulas administradas no es determinante del exito o resultados de su uso donde hay una mejora en la enfermedad o condicion relacionada con degeneracion IVD y/o la salud general del paciente. En algunas realizaciones, las celulas preferiblemente al menos parcialmente integran, se multiplican, o sobreviven en el paciente. En algunas realizaciones, el paciente experimenta los beneficios de la terapia, por ejemplo de la capacidad de las celulas para apoyar el crecimiento de otras celulas, incluyendo las celulas madre o celulas progenitoras presentes en el IVD y/o los tejidos circundantes, desde el crecimiento interno del tejido o la vascularizacion del tejido, y/o de la presencia de factores beneficiosos celulares, quimiocinas, citocinas y similares, pero las celulas no se integran o se multiplican en el paciente. En algunos aspectos, el paciente se beneficia del tratamiento terapeutico con las celulas, pero las celulas no sobreviven por un penodo prolongado en el paciente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las celulas disminuyen gradualmente en numero, la viabilidad o la actividad bioqmmica. En algunas realizaciones, una disminucion de este tipo puede ser precedida por un periodo de actividad, por ejemplo el crecimiento, division o actividad bioqmmica. En algunas realizaciones, celulas senescentes, no viables o incluso muertas son capaces de tener un efecto terapeutico beneficioso.

[0087] Ciertas celulas que tienen el potencial de diferenciarse a lo largo de las lmeas que conducen a diferentes fenotipos son inestables y por lo tanto pueden diferenciarse espontaneamente. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se prefieren las celulas que no se diferencian de forma espontanea. Por ejemplo, algunas celulas preferidas, cuando se cultivan en medio de crecimiento, son sustancialmente estables con respecto a los marcadores de celulas producen en su superficie, y con respecto al patron de expresion de diversos genes, por ejemplo como se determina usando perfiles de expresion genica usando, por ejemplo, acido nucleico o ensayos de polipeptidos. Tales celulas permanecen sustancialmente constantes, por ejemplo en sus caractensticas de marcador de superficie, sobre los pases, a traves de multiples duplicaciones de la poblacion.

[0088] En algunas realizaciones, los metodos proporcionados en este documento inducen a las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical para diferenciarse a lo largo de una via celular IVD, hacia fenotipos de celulas IVD, o progenitores o parientes mas primitivos de los anteriores. Las celulas derivadas de tejido de cordon umbilical pueden integrarse en IVD del paciente, o, alternativamente, pueden proporcionar soporte para el crecimiento o la estimulacion de diferenciar para celulas madre IVD naturalmente presentes. La supervivencia de las celulas administradas no es determinante del exito o los resultados de su uso donde hay mejora en la enfermedad o condicion relacionada con degeneracion IVD y/o la salud general del paciente. En algunas realizaciones, las celulas preferiblemente al menos parcialmente integran, se multiplican, o sobreviven en el paciente. En algunas realizaciones, el paciente experimenta los beneficios de la terapia, por ejemplo de la capacidad de las celulas para apoyar el crecimiento de otras celulas, incluyendo las celulas madre o celulas progenitoras presentes en el IVD y/o los tejidos circundantes, desde el crecimiento interno del tejido o la vascularizacion del tejido, y/o la presencia de factores beneficiosos celulares, quimiocinas, citocinas y similares, pero las celulas no se integran o se multiplican en el paciente. En algunos aspectos, el paciente se beneficia del tratamiento terapeutico con las celulas, pero las celulas no sobreviven por un penodo prolongado en el paciente. Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, las celulas disminuyen gradualmente en numero, la viabilidad o la actividad bioqmmica. En algunas realizaciones, una disminucion de este tipo puede ser precedida por un periodo de actividad, por ejemplo el crecimiento, division o actividad bioqmmica. En algunas realizaciones, celulas senescentes, no viables o incluso muertas son capaces de tener un efecto terapeutico beneficioso.

[0089] Los metodos comprenden ademas la evaluacion del paciente para mejoras en la estructura y/o funcion IVD,

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y/o mejoras en la salud en general. Tales evaluaciones pueden proceder de acuerdo a cualquier medio adecuado en la tecnica, incluyendo los descritos y ejemplificados en el presente documento.

[0090] En algunas realizaciones, las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical se administran conjuntamente con uno o mas de otros tipos de celulas, incluyendo, pero no limitado a, otras celulas multipotentes o pluripotentes, o condrocitos, condroblastos, osteocitos, osteoblastos, osteoclastos, celulas que recubren el hueso, o celulas de medula osea. Las celulas de diferentes tipos se pueden mezclar con las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical inmediatamente o poco antes de la administracion, o se pueden cocultivar juntos durante un penodo de tiempo antes de la administracion. En algunas realizaciones, una poblacion de celulas derivadas de tejido del cordon umbilical apoya la supervivencia, proliferacion, el crecimiento, el mantenimiento, la maduracion, la diferenciacion, y/o el aumento de la actividad de uno o mas de otros tipos de celulas administradas en conjunccion con las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical, y/o vice versa.

[0091] Celulas derivadas de tejido del cordon umbilical proporcionan soporte trofico a otros tipos de celulas con las que se administran, y/o viceversa. En algunas realizaciones, es deseable que las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical y las celulas cocultivadas esten en contacto. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la siembra de las celulas como una poblacion heterogenea de celulas en medio de cultivo o sobre un sustrato de cultivo adecuado. Alternativamente, las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical primera pueden cultivarse hasta la confluencia y se emplea como un sustrato para las celulas cocultivadas. En otras realizaciones, las celulas cocultivadas pueden cultivarse en contacto con un medio acondicionado, matriz extracelular y/o lisado celular de las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical.

[0092] Celulas derivadas de tejido del cordon umbilical se pueden administrar en combinacion con un agente biologicamente activo, tal como un agente que modula la proliferacion, diferenciacion, y/o otras actividades celulares. El agente puede administrarse antes, despues, o simultaneamente como las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical. El agente particular elegido puede ser a discrecion del profesional medico que dirige el tratamiento del paciente, y puede variar de acuerdo a las necesidades particulares o la condicion del paciente. El agente elegido puede utilizarse para diversos fines, tales como, pero no limitado a, la facilitacion de la administracion de las celulas, la mejora de la reparacion y/o regeneracion de la IVD, la mejora de la salud general del paciente, la reduccion del dolor, la reduccion o la prevencion del rechazo de las celulas trasplantadas, y similares.

[0093] Los ejemplos de agentes que pueden administrarse con celulas derivadas de tejido del cordon umbilical incluyen, pero no se limitan a, vitaminas y otros suplementos nutricionales; agentes antitrombogenicos; agentes antiapoptoticos; agentes antiinflamatorios; inmunosupresores (por ejemplo, ciclosporina, rapamicina); antioxidantes; hormonas; glicoprotemas; fibronectina; peptidos y protemas; hidratos de carbono (simples y/o complejos); proteoglicanos; oligonucleotidos (ADN y/o ARN sentido y/o antisentido); protemas morfogeneticas oseas (BMPs); factores de diferenciacion; anticuerpos (por ejemplo, los anticuerpos a agentes infecciosos, tumores, farmacos u hormonas); y reactivos de terapia genica. En algunas realizaciones, el agente es una sustancia, tal como un analgesico, antiinflamatorio, narcotico, relajante muscular, o una combinacion de los mismos que alivia uno o mas smtomas de una enfermedad o condicion relacionada con degeneracion IVD.

[0094] En algunas realizaciones, el agente adicional es un factor trofico u otro agente que ejerce un efecto trofico contra las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical, frente a celulas adicionales administradas con las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical, contra las celulas IVD endogenas (por ejemplo, celulas de anillo fibroso, celulas de nucleo pulposo), y/o contra otras celulas endogenas (por ejemplo, celulas progenitoras de tejido conectivo). En algunas realizaciones, el factor trofico es uno que es secretado por las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical, en cuyo caso se puede derivar a partir de preparaciones de tales Celulas derivadas de tejido de cordon umbilical o de otra fuente. Ejemplos de tales factores o agentes incluyen, pero no se limitan a, los miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos, incluyendo el factor de crecimiento de fibroblastos acido y basico (FGF1 y FGF2) y FGF4; miembros del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), incluyendo PDGF-AB, PDGF-BB y PDGF-AA; EGF, miembros del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), incluyendo IGF-I y II; la superfamilia TGF-beta, incluyendo TGF-beta1, 2 y 3 (incluyendo MP52), factor inductor de osteoide (OIF), angiogenina, endotelinas, factor de crecimiento de hepatocitos y factor de crecimiento de queratinocitos; miembros de la familia de protemas morfogeneticas oseas (bMp), tales como BMP-1, BMP-3, BMP-2, OP-1, BMP- 2A, BMP-2B, BMP-4, BMP-7 y BMP-14; HBGF1 y HBgF2; factores de diferenciacion de crecimiento (GDFs); miembros de la familia hedgehog de protemas, incluyendo indio, sonico y erizo del desierto; ADMP-1; GDF-5; TIMP- 1 y miembros de la familia estimulante de colonias de los factores (CSF), incluyendo CSF-1, G-CSF y GM-CSF; y analogos e isoformas de los mismos.

[0095] En algunas realizaciones, el factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste de TGF-beta, TGF- beta1, FGF, bFGF, e IGF-1. Se cree que estos factores de crecimiento promueven la regeneracion del nucleo pulposo, estimulan la proliferacion y/o diferenciacion de condrocitos, y promueven la secrecion de matriz extracelular. En algunas realizaciones, el factor de crecimiento es TGF-beta. Mas preferiblemente, TGF-beta se administra en una cantidad de entre aproximadamente 10 ng/ml y aproximadamente 5.000 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 50 ng/ml y aproximadamente 500 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 100 ng/ml y aproximadamente 300 ng/ml.

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[0096] En algunas realizaciones, concentrado de plaquetas se proporciona como un agente terapeutico adicional. En algunas realizaciones, el concentrado de plaquetas es autologo. En algunas realizaciones, el concentrado de plaquetas es rico en plasma en plaquetas (PRp). PRP es ventajoso, ya que contiene factores de crecimiento que pueden reestimular el crecimiento de la ECM, y porque su matriz de fibrina proporciona un andamio adecuado para el nuevo crecimiento del tejido. En algunas realizaciones, el agente adicional es un lisado celular, una fraccion celular soluble, una fraccion celular rica en membranas, medios de cultivo celular (por ejemplo, medio acondicionado), o de la matriz extracelular derivada de celulas derivadas de tejido de cordon umbilical u otras celulas.

[0097] Celulas derivadas de tejido del cordon umbilical pueden administrarse junto con un inhibidor de reductasa de HMG-CoA, incluyendo, pero no limitado a simvastatina, pravastatina, lovastatina, fluvastatina, cerivastatina y atorvastatina.

[0098] Celulas derivadas de tejido del cordon umbilical se pueden disenar geneticamente para expresar uno o mas agentes, tales como, pero no limitado a, uno o mas de los agentes terapeuticos adicionales que se describen en este documento. Las celulas de la invencion pueden modificarse por ingeniena genetica utilizando cualquiera de una variedad de vectores, incluyendo, pero no limitado a la integracion de vectores virales, por ejemplo, vector de retrovirus o vectores virales adenoasociados; vectores de replicacion no integradores, por ejemplo, vectores de virus papiloma, vectores SV40, vectores adenovirales; o vectores virales de replicacion defectuosa. Otros metodos de introduccion de ADN en las celulas incluyen el uso de liposomas, electroporacion, una pistola de partmulas, o por inyeccion directa de ADN.

[0099] Celulas huesped se transforman o se transfectan con ADN controlado por, o en asociacion operativa con, uno o mas elementos apropiados de control de expresion tales como secuencias promotoras o potenciadoras, terminadores de transcripcion, sitios de poliadenilacion, entre otros, y un marcador seleccionable de preferencia.

[0100] Despues de la introduccion del ADN extrano, las celulas manipuladas pueden dejarse crecer en medio enriquecido y despues se cambiaron a medios selectivos. El marcador seleccionable en el ADN extrano confiere resistencia a la seleccion y permite que las celulas integren de forma estable el ADN extrano como, por ejemplo, en un plasmido, en sus cromosomas y crecen para formar focos, que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en lmeas celulares. Este metodo se puede utilizar ventajosamente para disenar lmeas celulares, que expresan el producto del gen.

[0101] Cualquier promotor puede ser usado para conducir la expresion del gen insertado. Por ejemplo, promotores virales incluyen, pero no se limitan al promotor/potenciador CMV, SV4O, virus del papiloma, virus Epstein-Barr o promotor del gen de la elastina. Preferiblemente, los elementos de control utilizados para controlar la expresion del gen de interes deben permitir la expresion regulada del gen de modo que el producto se sintetiza solo cuando sea necesario in vivo. Si se desea la expresion transitoria, los promotores constitutivos se utilizan preferiblemente en un vector no integrador y/o de replicacion defectuosa. Alternativamente, los promotores inducibles se podnan utilizar para conducir la expresion del gen insertado cuando sea necesario. Los promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a aquellos asociados con protemas de metelotioneina y de choque termico.

[0102] Las celulas de la invencion pueden modificarse por ingeniena genetica para expresion de factores "knock out" o "knock down" que promueven la inflamacion o rechazo en el sitio de implante. Tecnicas moduladoras negativas para la reduccion de los niveles de expresion del gen diana o los niveles de actividad del producto del gen diana se discuten a continuacion. "Modulacion negativa", como se usa aqrn, se refiere a una reduccion en el nivel y/o actividad de producto de gen diana en relacion con el nivel y/o actividad del producto del gen diana en ausencia del tratamiento modulador. La expresion de un gen puede ser reducido o eliminado utilizando una serie de tecnicas que incluyen, por ejemplo, inhibicion de la expresion mediante la inactivacion del gen completo (comunmente denominado "knockout") utilizando la tecnica de recombinacion homologa. Por lo general, un exon que codifica una region importante de la protema (o un exon 5' a la region) se interrumpe por un marcador seleccionable positivo, por ejemplo, neo, la prevencion de la produccion de ARNm normal a partir del gen diana y que resulta en la inactivacion del gen. Un gen tambien puede ser inactivado mediante la creacion de una delecion en parte de un gen, o mediante la supresion del gen entero. Mediante el uso de una construccion con dos regiones de homologfa al gen diana que son muy separadas en el genoma, las secuencias que intervienen las dos regiones se pueden eliminar (Mombaerts #et al#., Proc Nat Acad Sci EE.UU., 1991; 88:3084-3087).

[0103] ARN antisentido, de interferencia pequena, ADNzimas y moleculas de ribozima que inhiben la expresion del gen diana tambien pueden usarse de acuerdo con la invencion para reducir el nivel de actividad del gen diana. Por ejemplo, moleculas de ARN antisentido, que inhiben la expresion de los principales complejos de genes de histocompatibilidad (HLA), han demostrado ser mas versatiles con respecto a las respuestas inmunes. Aun mas, moleculas de triple helice pueden utilizarse en la reduccion del nivel de actividad del gen diana.

[0104] Estas y otras tecnicas se describen en detalle por LG Davis et al. (eds), Basic Methods in Molecular Biology, segunda ed., Appleton & Lange, Norwalk, Conn., (1994) 2.

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[0105] IL-1 es un potente estimulador de la resorcion del cartflago y de la produccion de mediadores inflamatorios por los condrocitos (Campbell #et al#., J. Immun, 1991; 147 (4): 1238-1246). Usando cualquiera de las tecnicas anteriores, la expresion de IL-1 puedo ser eliminado o derribado en las celulas de la invencion para reducir el riesgo de la resorcion del cartflago implantado o la produccion de mediadores inflamatorios por las celulas de la invencion. Igualmente, la expresion de moleculas MHC de clase II puede ser eliminada o derribada con el fin de reducir el riesgo de rechazo del tejido implantado.

[0106] Una vez que las celulas de la invencion han sido disenadas geneticamente, pueden ser directamente implantadas con el hidrogel en el paciente para permitir el tratamiento de una enfermedad o condicion relacionada a degeneracion IVD, por ejemplo mediante la produccion de un producto que tiene un efecto terapeutico contra uno o mas smtomas de la enfermedad o afeccion, tal como un producto genico antiinflamatorio. Alternativamente, las celulas modificadas por ingeniena genetica se pueden usar para producir nuevo tejido in vitro, que se implanta a continuacion en el sujeto, como se describe en el presente documento.

[0107] En algunos aspectos, se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden celulas derivadas de tejido de cordon umbilical, como se describe en el presente documento, y un vehuculo farmaceuticamente aceptable. Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en este documento pueden inducir celulas derivadas de tejido del cordon umbilical para diferenciarse a lo largo de una via celular IVD o linaje, por ejemplo para mostrar un fenotipo de nucleo pulposo celular y/o un fenotipo de celulas de anillo fibroso. En algunas realizaciones, las composiciones farmaceuticas proporcionadas en esta modulan los procesos celulares de celulas endogenas IVD y/o celulas de los tejidos circundantes, incluyendo pero no limitado a la division celular, la diferenciacion y la expresion genica. En algunas realizaciones, las composiciones farmaceuticas proporcionadas en este documento promueven la reparacion y la regeneracion de un IVD degenerado.

[0108] Kits para el tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad o dano de al menos un IVD se proporcionan. Los kits comprenden un vehfculo farmaceuticamente aceptable, celulas obtenidas a partir de tejido de cordon umbilical humano en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o condicion, tal como aquellas celulas que se describen y se ejemplifican en este documento, y las instrucciones para usar el kit en un metodo para tratar un paciente que tiene una enfermedad o condicion relacionada con degeneracion IVD. Los kits pueden comprender ademas al menos un reactivo e instrucciones para el cultivo de las celulas. Los kits pueden comprender ademas una poblacion de al menos otro tipo de celula y/o al menos un agente.

[0109] En algunos aspectos, los kits comprenden un vehuculo farmaceuticamente aceptable, un lisado, matriz extracelular, o medio acondicionado preparado a partir de celulas obtenidas a partir de tejido de cordon umbilical humano, cuyas celulas tienen las caractensticas que se describen y se ejemplifican en este documento. Los kits son utiles para facilitar la reparacion y/o regeneracion de un IVD que esta danado o enfermo.

[0110] Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir la invencion con mayor detalle. Estan destinados a ilustrar, no limitar, la invencion. Ademas, como se usa en los siguientes ejemplos y en otros lugares en la especificacion, las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical utiles en los metodos de la invencion pueden ser aisladas y caracterizadas de acuerdo con la descripcion de la Patente de Estados Unidos Nos 7.510.873 y 7.524.489.

EJEMPLO I

Aislamiento de celulas derivadas de tejido del cordon umbilical

[0111] Los cordones umbilicales se obtuvieron de National Disease Research Interchange (NDRI, Filadelfia, PA). Se obtuvieron los tejidos despues de partos normales. El protocolo de aislamiento de celulas se realizo asepticamente en una campana de flujo laminar. Para eliminar la sangre y los residuos, el cable se lavo en tampon fosfato salino (PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) en presencia de antimicoticos y antibioticos (100 unidades/mililitro penicilina, 100 microgramos/mililitro de estreptomicina, 0,25 microgramos/mililitro de anfotericina B). Los tejidos entonces se disociaron mecanicamente en placas de cultivo de tejido de 150 cm2 en presencia de 50 mililitros de medio (DMEM- Baja glucosa o DMEM-Alta glucosa; Invitrogen), hasta que el tejido se troceo en una pulpa fina. Los tejidos picados se transfirieron a tubos de 50 ml conicos (aproximadamente 5 gramos de tejido por tubo). Despues, el tejido fue digerido ya sea en medio de DMEM-Baja glucosa o medio de DMEM-Alta glucosa, conteniendo cada uno antimicoticos y antibioticos como se describe anteriormente. En algunos experimentos, una mezcla de enzimas de colagenasa y dispasa se utilizo ("C:D;" colagenasa (Sigma, St Louis, MO), 500 unidades/mililitro; y dispasa (Invitrogen), 50 unidades/mililitro en DMEM: medio bajo de glucosa). En otros experimentos una mezcla de colagenasa, dispasa y hialuronidasa ("C:D:H") se utilizo (colagenasa, 500 unidades/mililitro; dispasa, 50 unidades/mililitro; y hialuronidasa (Sigma), 5 unidades/mililitro, en DMEM:-Baja glucosa). Los tubos conicos que contiene el tejido, enzimas medianas y la digestion se incubaron a 37°C en un agitador orbital (Environ, Brooklyn, NY) a 225 rpm durante 2 horas.

[0112] Despues de la digestion, los tejidos se centrifugaron a 150 xg durante 5 minutos, se aspiro el sobrenadante. El sedimento se resuspendio en 20 mililitros de medio de crecimiento (DMEM: Baja glucosa (Invitrogen), 15 por ciento (v/v) suero bovino fetal (FBS; suero bovino definido; Lote#AND18475; Hyclone, Logan, UT), 0,001% (v/v) 2-

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mercaptoetanol (Sigma), 1 mililitro por 100 mililitros de antibiotico/antimicotico como se describio anteriormente. La suspension celular se filtro a traves de un filtro de celulas de nylon de 70-micrometros (BD Biosciences). Un enjuague adicional de 5 mililitros que comprende Medio de Crecimiento se paso a traves del tamiz. La suspension celular se paso por un filtro de celulas de nylon de 40 micrometros (BD Biosciences) y se extrajo con un enjuague de 5 mililitros adicionales de medio de crecimiento.

[0113] El filtrado se volvio a suspender en medio de crecimiento (volumen total 50 mililitros) y se centrifugo a 150 xg durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiro y las celulas se resuspendieron en 50 mililitros de medio de crecimiento fresco. Este proceso se repitio dos veces mas.

[0114] Tras la centrifugacion final, el sobrenadante se aspiro y el sedimento celular se resuspendio en 5 mililitros de medio de crecimiento fresco. Se determino el numero de celulas viables mediante tincion con azul tripan. Las celulas se cultivan a continuacion bajo condiciones estandar.

[0115] Las celulas aisladas a partir de cordones umbilicales se sembraron a 5.000 celulas/cm2 en matraces de T-75 cm2 revestidas de gelatina (Corning Inc., Corning, NY) en medio de crecimiento con antibioticos/antimicoticos como se describio anteriormente. Despues de 2 dfas (en varios experimentos, las celulas se incubaron de 2-4 dfas), medio gastado se aspiro de los matraces. Las celulas se lavaron con PBS tres veces para eliminar los residuos y las celulas derivadas de sangre. Las celulas entonces se rellenaron con medio de crecimiento y se dejaron crecer hasta la confluencia (aproximadamente 10 dfas desde el pase 0) para el paso 1. En pasajes posteriores (del paso 1 a 2 y asf sucesivamente), las celulas alcanzaron subconfluencia (75-85 por ciento de confluencia) en 45 dfas. Para estos pasajes posteriores, las celulas se sembraron a 5000 celulas/cm2. Las celulas se cultivaron en un incubador humidificado con 5 por ciento de dioxido de carbono y oxfgeno del aire, a 37°C.

EJEMPLO 2

Evaluacion de marcadores de superficie de celulas humanas derivadas tras el parto por citometna de flujo

[0116] El tejido del cordon umbilical se caracterizo usando citometna de flujo para proporcionar un perfil para la identificacion de celulas obtenidas del mismo.

[0117] Las celulas fueron cultivadas en Medio de Crecimiento (Gibco Carlsbad, CA) con penicilina/estreptomicina. Las celulas fueron cultivadas en matraces de cultivo tisular tratadas con plasma T75, T150, T225 y (Corning, Corning, NY) hasta la confluencia. Las superficies de crecimiento de los frascos fueron revestidas con gelatina mediante incubacion de 2% (p/v) de gelatina (Sigma, St. Louis, MO) durante 20 minutos a temperatura ambiente.

[0118] Las celulas adherentes en matraces se lavaron en PBS y se desprendieron con tripsina/EDTA. Las celulas se recogieron, se centrifugaron, y se resuspendieron en 3% (v/v) de FBS en PBS a una concentracion celular de 1x107 por mililitro. De acuerdo a las especificaciones del fabricante, el anticuerpo para el marcador de superficie celular de interes (vease mas adelante) se anadio a un centenar de microlitros de suspension de celulas y la mezcla se incubo en la oscuridad durante 30 minutos a 4°C. Despues de la incubacion, las celulas se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el anticuerpo no unido. Las celulas se resuspendieron en 500 microlitros de PBS y se analizaron por citometna de flujo. El analisis de citometna de flujo se realizo con un instrumento citometro (Becton Dickinson, San Jose, CA).

[0119] Se utilizaron los siguientes anticuerpos a marcadores de superficie celular:

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Anticuerpo Fabricante Numero de catalogo

CD10: BD Pharmingen (San Diego, CA) 555375

CD13: BD Pharmingen 555394

CD31: BD Pharmingen 555446

CD34: BD Pharmingen 555821

CD44: BD Pharmingen 555478

CD45RA: BD Pharmingen 555489

CD73: BD Pharmingen 550257

CD90: BD Pharmingen 555596

CD1 17: BD Pharmingen 340529

CD141: BD Pharmingen 559781

PDGFR-alfa: BD Pharmingen 556002

HLA-A,B,C: BD Pharmingen 555553

HLA-DR,DP,DQ: BD Pharmingen 555558

IgG-FITC: Sigma (St. Louis, MO) F-6522

IgG-PE: Sigma P-4685

[0120] Las celulas se analizaron en los pasajes 8, 15, y 20, y las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical de diferentes donantes se compararon entre sl Ademas, las celulas cultivadas en matraces revestidas de gelatina se compararon con celulas cultivadas en frascos no recubiertos.

[0121] Las Celulas derivadas de tejido de cordon umbilical mostraron expresion positiva de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A,B,C, indicada por el aumento de los valores de fluorescencia con respecto al control IgG. Estas celulas fueron negativas para la expresion detectable de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, y HLA-DR, DP, DQ, indicada por los valores de fluorescencia comparable al control de IgG. Las variaciones en los valores de fluorescencia de las curvas de positivos se representaron. La media (es dedr, CD13) y rango (es dedr, CD90) de las curvas positivas mostraron alguna variacion, pero las curvas paredan normales, lo que confirma una poblacion homogenea. Ambas curvas exhibieron individualmente valores mayores que el control de IgG.

[0122] Celulas en el paso 8, 15, y 20 expresaron CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A,B,C, indicadas por el aumento de fluorescencia con respecto al control IgG. Estas celulas fueron negativas para CD31, CD34, CD45, CDI 17, CD141, y HLA-DR, DP, DQ, indicadas por los valores de fluorescencia consistentes con el control de IgG.

[0123] Los aislados de donantes separados cada uno mostraron expresion positiva de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A,B,C, que se refleja en el aumento de los valores de fluorescencia con respecto al control IgG. Estas celulas fueron negativas para la expresion de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, y HLA-DR, DP, DQ con valores de fluorescencia consistentes con el control de IgG.

[0124] Las celulas expandidas en gelatina y matraces sin recubrir fueron positivas para la expresion de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A,B,C, con aumento de los valores de fluorescencia con respecto al control IgG. Estas celulas fueron negativas para la expresion de CD31, CD34, CD45, CD1 17, CD141, y HLA-DR, DP, DQ, con valores de fluorescencia consistentes con el control de IgG.

[0125] Asf, celulas derivadas de tejido del cordon umbilical son positivas para CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, HLA-A,B,C y negativas para CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ. Esta identidad fue consistente entre las variaciones de variables que incluyen el donante, paso, y revestimiento de superficie de recipiente de cultivo. Se observo alguna variacion en medios y rangos de curva de histograma de valor de fluorescencia individual, pero todas las curvas positivas bajo todas las condiciones ensayadas fueron normales y expresaron valores de fluorescencia mayores que el control de IgG, lo que confirma que las celulas comprenden una poblacion homogenea que tiene la expresion positiva de los marcadores.

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EJEMPLO 3

Caracterizacion inmunohistoquimica de fenotipos de celulas

[0126] Se cosecho tejido del cordon umbilical humano y se fijo en immersion fijada al 4% (p/v) de paraformaldetndo durante la noche a 4°C. La inmunohistoqmmica se realizo utilizando anticuerpos dirigidos contra los siguientes epftopos: vimentina (1: 500; Sigma, St. Louis, MO), desmina (1: 150, generado contra conejo; Sigma; o 1: 300, generado contra raton; Chemicon, Temecula, CA), actina muscular lisa alfa (SMA; 1: 400; Sigma), citoqueratina 18 (CK18; 1: 400; Sigma), factor de von Willebrand (vWF; 1: 200; Sigma), y CD34 (CD34 humano Clase III; 1: 100; DAKOCarpinteria, CA). Ademas, se ensayaron los siguientes marcadores: GROalfa antihumano - PE (1: 100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), GCP-2 antihumano (1: 100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), LDL anti-humano oxidada del receptor 1 (Ox-LDL R1; 1: 100; Santa Cruz Biotech), y NOGO-A antihumano (1: 100; Santa Cruz Biotech). Las muestras fijadas se recortaron con un bistun y se colocaron dentro del compuesto de incrustacion OCT (Tissue-Tek OCT; Sakura, Torrance, CA) en un bano de hielo seco que contiene etanol. Los bloques congelados fueron entonces seccionados (espesor de 10 pm) utilizando un criostato estandar (Leica Microsystems) y montado en portaobjetos de vidrio para tincion.

[0127] La inmunohistoqmmica se realizo similarmente a los estudios anteriores (Messina et al., Exper Neurol.; 2003; 184: 816-29). En resumen, las secciones de tejido se lavaron con solucion salina con fosfato (PBS) y se expusieron a una solucion de bloqueo de protema que contiene PBS, 4% (v/v) de suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA), y 0,3% (v/v) de Triton (Triton X-100; Sigma) durante 1 hora para acceder a antfgenos intracelulares. En casos en los que se encuentra el epftopo de interes en la superficie celular (CD34, ox-LDL R1), Triton se omitio en todos los pasos del procedimiento con el fin de evitar la perdida de epftopo. Ademas, en los casos en que el anticuerpo primario se planteo en contra de cabra (GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A), 3% (v/v) de suero de burro se utilizo en lugar de suero de cabra durante todo el procedimiento. Los anticuerpos primarios, se diluyeron en solucion de bloqueo, se aplicaron a las secciones durante un penodo de 4 horas a temperatura ambiente. Se eliminaron las soluciones de anticuerpo primario, y los cultivos se lavaron con PBS antes de la aplicacion de las soluciones de anticuerpo secundario (1 hora a temperatura ambiente) que contema bloque junto con IgG - Texas Red anti-raton de cabra (1: 250; Molecular Probes, Eugene, OR) y/o IgG - Alexa 488 anti-conejo cabra (1: 250; Molecular Probes) o IgG - FiTc anti-cabra de burro (1: 150; Santa Cruz Biotech). Los cultivos se lavaron, y se aplico 10 DAPI micromolar (Molecular Probes) durante 10 minutos para visualizar los nucleos celulares.

[0128] La fluorescencia se visualizo usando el filtro de fluorescencia correspondiente en un microscopio de epifluorescencia invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). La tincion positiva fue representada por la senal de fluorescencia por encima de la tincion de control. Imagenes representativas fueron capturadas utilizando una camara de video a color digital y software de IMAGE-PRO® (Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Para muestras de tincion triple, cada imagen fue tomada utilizando un solo filtro de emision a la vez.

[0129] Marcadores de vimentina, desmina, SMA, CK18, vWF, y CD34 se expresaron en un subconjunto de las celulas que se encuentran dentro del cordon umbilical. En particular, expresion de vWF y CD34 estaban restringidos a los vasos sangumeos contenidos en el cable. Las celulas CD34+ estaban en la capa mas interna (lado de lumen). La expresion de vimentina se encontro en toda la matriz y los vasos sangumeos de la cuerda. SMA se limito a la matriz y paredes exteriores de la arteria y vena, pero no contenida en los propios vasos. CK18 y desmina fueron observadas dentro de los vasos solamente, limitandose la desmina a las capas media y exterior. La expresion de GROalfa, GCP-2, ox-LDL R1, y NOGO-A no se observaron dentro de tejido del cordon umbilical.

EJEMPLO 4

Analisis de ensayo de oligonucleotidos

[0130] Ensayos Affymetrix GeneChip® se utilizaron para comparar los perfiles de expresion genica de celulas derivadas de tejido del cordon umbilical con fibroblastos, celulas madre mesenquimatosas humanas, y otra lmea celular derivada de la medula osea humana. Este analisis proporciona una caracterizacion de las celulas derivadas del posparto e marcadores moleculares unicos identificados para estas celulas.

[0131] Cordones umbilicales humanos se obtuvieron a partir del National Disease Research Interchange (NDRI, Filadelfia, PA) a partir de un parto normal a termino con el consentimiento del paciente. Se recibieron los tejidos y las celulas fueron aisladas como se describio anteriormente. Las celulas fueron cultivadas en medio de crecimiento (usando DMEM-LG) sobre matraces de plastico de cultivo tisular revestidas de gelatina. Los cultivos se incubaron a 37°C con 5% de CO2

[0132] Fibroblastos dermicos humanos fueron adquiridos de Cambrex Incorporated (Walkersville, MD; Numero de lote 9F0844) y ATCC CRL-1501 (CCD39SK). Ambas lmeas se cultivaron en medio DMEM/F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) con 10% (v/v) de suero bovino fetal (Hyclone) y penicilina/estreptomicina (Invitrogen). Las celulas se cultivaron en el plastico tratado con tejido estandar.

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[0133] Las celulas madre mesenquimatosas humanas (hMSC) se compraron de Cambrex Incorporated (Walkersville, MD; numeros de lote 2F1655, 2F1656 y 2F1657) y se cultivaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante en medio MSCGM (Cambrex). Las celulas se cultivaron sobre plastico cultivado por tejido estandar a 37°C con 5% de CO2.

[0134] Medula osea de cresta i^aca humana se recibio de NDRI con el consentimiento del paciente. La medula se proceso de acuerdo con el metodo descrito por Ho, et al. (WO 2003/025149). La medula se mezclo con tampon de lisis (155 mM NH4CL, 10mM KHCO3, y 0,1 mM EDTA, pH 7,2) en una proporcion de medula osea de 1 parte a 20 partes tampon de lisis. La suspension de celulas se sometio a vortice, se incubo durante 2 minutos a temperatura ambiente, y se centrifugo durante 10 minutos a 500 x g. El sobrenadante se descarto y el sedimento celular se resuspendio en Minimal Essential Medium-alfa (Invitrogen) suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal y glutamina 4 mM. Las celulas se centrifugaron de nuevo y el sedimento celular se resuspendio en medio fresco. Las celulas mononucleares viables se contaron usando exclusion de tripan-azul (Sigma, St. Louis, MO). Las celulas mononucleares se siembran en matraces de plastico cultivado por tejido a 5 x 104 celulas/cm2. Las celulas se incubaron a 37°C con 5% de CO2 a ya sea O2 atmosferica estandar o en 5% O2. Las celulas se cultivaron durante 5 dfas sin un cambio de medio. Los medios y las celulas no adherentes se retiraron despues de 5 dfas de cultivo. Las celulas adherentes se mantuvieron en el cultivo.

[0135] Cultivos de crecimiento activo de las celulas se retiraron de los frascos con un raspador de celulas en PBS fno. Las celulas se centrifugaron durante 5 minutos a 300 x g. El sobrenadante se retiro y las celulas se resuspendieron en PBS fresco y se centrifugaron de nuevo. Se elimino el sobrenadante y el sedimento celular se congelo inmediatamente y se almaceno a 80°C. ARNm celular se extrajo y se transcribio en ADNc, que despues se transcribio en ARNc y marcado con biotina. El ARNc marcado con biotina se hibrido con ensayos de oligonucleotidos HG-U133A GeneChip (Affymetrix, Santa Clara CA). La coleccion de hibridacion y los datos se realizaron de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Los analisis se realizaron usando " Analisis de significancia de microensayos" (SAM) version 1,21 software de ordenador (Universidad de Stanford; Tusher et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 2002; 98: 511 621).

[0136] Se analizaron catorce poblaciones diferentes de celulas. Las celulas junto con informacion de pasaje, sustrato de cultivo, y los medios de cultivo se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1. Las celulas analizadas por el estudio de microensayos. Las lineas celulares se muestran por codigo de identificacion junto con el paso en el momento de analisis, sustrato de crecimiento celular y medio de crecimiento

Poblacion celular: Paso Sustrato Medio

Cordon umbilical (022803): 2 Gelatina DMEM, 15% FBS, 2-ME

Cordon umbilical (042103): 3 Gelatina DMEM, 15% FBS, 2-ME

Cordon umbilical (071003): 4 Gelatina DMEM, 15% FBS, 2-ME

ICBM (070203) (5% O2): 3 Plastico MEM, 10% FBS

ICBM (062703) (std. O2): 5 Plastico MEM, 10% PBS

ICBM (062703) (5% O2): 5 Plastico MEM, 10% PBS

hMSC (Lote 2F1655): 3 Plastico MSCGM

hMSC (Lote 2F1656): 3 Plastico MSCGM

hMSC (Lote 2171657): 3 Plastico MSCGM

hFibroblasto (9F0844): 9 Plastico DMEM-F12, 10% FBS

hFibroblasto (CCD39SK): 4 Plastico DMEM-F12, 10% FBS

[0137] Los datos fueron evaluados por un analisis de componentes principales, el analisis de los 290 genes que son expresados diferencialmente en las celulas. Este analisis permite una comparacion relativa de las similitudes entre las poblaciones. La Tabla 2 muestra las distancias euclidianas que se calcularon para la comparacion de las parejas de celulas. Las distancias euclidianas se basan en la comparacion de las celulas a partir de los 290 genes que son expresados diferencialmente entre los tipos de celulas. La distancia euclidiana es inversamente proporcional a la similitud entre la expresion de los 290 genes (es dear, cuanto mayor sea la distancia, menor la similitud que existe)

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Tabla 2. Distancias euclidianas para los pares de celulas.

Par celular: Distancia euclidianas

ICBM-hMSC: 24,71

Placenta-umbilical: 25,52

ICBM-fibroblastos: 36,44

ICBM-placenta: 37,09

Fibroblasto-MSC: 39,63

ICBM-umbilical: 40,15

Fibroblastos umbilical: 41,59

MSC-Placenta: 42,84

MSC-Umbilical: 46,86

ICBM-placenta: 48,41

[0138] Las tablas 3 y 4 a continuacion muestran la expresion de genes aumentados en las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical (Tabla 3), y la reduccion en las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical (Tabla 4). La columna titulada "Conjunto de sondas ID" se refiere al codigo de identificacion del fabricante para conjuntos de varias sondas de oligonucleotidos localizados en un sitio en particular en el chip, que se hibridan con el gen llamado (columna "Gen"), que comprenden una secuencia que se puede encontrar dentro de la NCBI (GenBank) de base de datos en el numero de acceso especificado (columna "Numero de adhesion NCBI").

Tabla 3. Genes que muestran tener expresion especificamente aumentada en las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical en comparacion con otras lineas celulares ensayadas.

Genes aumenta en las celulas derivadas de tejido de cordon umbilical

Conjunto de sondas ID: Nombre del gen Numero de adhesion NCBI

202859_x_at: interleucina 8 NM_000584

211506_s_at: interleucina 8 AF043337

210222_s_at: reticulon 1 BC000314

204470_at: quimiocina (motivo CXC) ligando 1 (actividad estimuladora del crecimiento melanoma NM_001511

206336_at: quimiocina (motivo CXC) ligando 6 (protema quimotactica de granulocitos 2) NM_002993

207850_at: quimiocina (motivo CXC) ligando 3 NM_002090

203485_at: reticulon 1 NM_021136

202644_s_at: factor de necrosis tumoral, protema inducida por alfa 3 NM_006290

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Genes disminuidos en el tejido del cordon umbilical y celulas derivada de placenta

Conjunto de sondas ID: Nombre del gen Numero de adhesion NCBI

210135_s_at: homeobox de baja estatura 2 AF022654,1

205824_at: protema 27 kDa choque termico 2 NM 001,541,1

209687_at: quimiocina (motivo CXC) ligando 12 (factor derivado de celulas estromales 1) U19495,1

203666_at: quimiocina (motivo CXC) ligando 12 (factor derivado de celulas estromales 1) NM 000,609,1

212670_at: elastina (estenosis aortica supravalvular, Williams- Beuren smdrome de Down) AA479278

213381_at: ARNm Homo sapiens; ADNc DKFZp586M2022 (de DKFZp586M2022 clonar) N91149

206201_s_at: homeobox mesenquima 2 (homeobox de crecimiento de detencion espedfica) NM 005,924,1

205817_at: sine homologo oculis homeobox 1 (Drosophila) NM 005.982,1

209283_at: cristalina, alfa B AF007 162,1

212793_at: desalinado activador asociado de la morfogenesis 2 13244 BF5

213488_at: protema DKFZP586B2420 AL050143.1

209763_at: similar a neuralina 1 AL049 176

205200_at: tetranectina (plasminogeno protema de union) NM 003.278,1

205743_at: src homologfa tres (SH3) y dominio rico en cistema NM_003 149,1

200921_s_at: De celulas B translocacion gen 1, anti-proliferativa NM_00l731.1

206932_at: colesterol 25-hidroxilasa NM 003.956,1

204198_s_at: factor de transcripcion relacionados con runt-3 AA54 1630

219747_at: hipotetica FLJ23191 protema NM 024.574,1

204773_at: interleucina 11 receptor, alfa NM 004.512,1

202465_at: procolageno C-endopeptidasa potenciador NM 002.593,2

203706-s-at: homologo de frizzled 7 (Drosophila) NM 003.507,1

212736_at: hipotetico BC008967 gen BE299456

214587_at: colageno, tipo VIII, alfa 1 BE877796

201645_at: tenascina C (hexabrachion) NM_002160,1

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(continuacion)

Conjunto de: Nombre del gen Numero de

sondas ID: adhesion NCBI

210239_at: protema homeobox Iroquois 5 U90304,l

203903_s__ at: Hefaestina NM_014799,1

205816_at: integrina, beta 8 NM_002214,1

203069_at: glicoprotema de vesmula sinaptica 2 NM_014849,1

213909_at: Homo sapiens ADNc FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744 AU_147799

206315_at: citoquina similar al receptor de factor 1 NM_004750,1

204401_at: potasio intermedio/pequena conductancia de calcio NM_002250,

: canal activado, N subfamilia, miembro 4 1

216331_at: integrina, alfa 7 AK022548,1

209663_s_at: integrina, alfa 7 AF072132,1

213125_at: protema DKFZP586LI51 AW007573

202133_at: co-activador transcripcional con PDZ vinculante motivo (TAZ) AA081084

206511_s_at: sine oculis homologo homeobox 2 (Drosophila) NM_016932,1

213435_at: protema KIAA1034 AB028957,1

206115_at: respuesta de crecimiento temprano 3 NM_004430,1

213707_s_at: distal-less homeobox 5 NM_005221,3

218181_s_at: protema hipotetica FLJ20373 NM_017792,1

209160_at: aldo-ceto reductasa familia 1, miembro de C3 (3-alfa hidroxisteroide_dehidrogenasa, _type _II) AB018580,1

213905_x_at: biglicano AA845258

201261_x_at: biglicano BC002416,l

202132_at: co-activador transcripcional con PDZ vinculante motivo (TAZ) AA081084

214701_s_at: fibronectina 1 AJ276395,1

213791_at: proencefalina NM_006211,1

205422_s_at: integrina, beta-I (con repeticion similar a EGF dominios) NM_004791,1

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(continuacion)

Nombre del gen: Numero de adhesion NCBI

214927_at: Homo sapiens ARNm de longitud completa clon de ADNc inserto EUR01MAGE 1968422 AL359052,1 -

206070_s_at: EphA3 AF213459,1

212805_at: protema K1AA0367 AB002365,1

219789_at: receptor del peptido natriuretico C/guanilato ciclasa C (_C _receptor atrionatriuretico_peptido) A1628360

219054 en: protema hipotetica FLJ 14054 NM 024.563,1

213429_at: ARNm Homo sapiens; ADNc DKFZp564B222 (de clonar DKFZp564B222) AW025579

204929_s_at: protema de membrana asociada a vesmulas 5 (Miobrevina) NM_006634,1

201843_s_at: EGF que contienen matriz extracelular de tipo fibulina protema 1 NM_004105,2

221478_at: BCL2/adenovirus E1B l9kDa protema de interaccion tipo 3 AL132665.1

201792_at: protema de union AE I NM 001129,2

204570_at: citocromo c oxidasa subunidad Vila polipeptido I (musculo) NM_001864.1

201621_at: neuroblastoma, supresion de tumorigenicidad I NM_005380,1

202718_at: protema de union a factor de crecimiento similar a la insulina 2, 36kDa NM_000597,1

[0139] Las Tablas 5, 6 y 7 muestran la expresion de genes aumentados en fibroblastos humanos (Tabla 5), celulas ICBM (Tabla 6), y MSCs (Tabla 7).

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fosfatasa doble especificidad 2

protema K1AA0527

Homo sapiens ADNc FLJ23224 fis clon ADSU02206

dinema citoplasmico, polipeptido intermedio 1

anquirina 3, nodo de Ranvier (anquirina G)

inhibina, beta A (activina A activina AB polipeptido alfa

ectonucleotido pirofosfatasa/fosfodiesterasa 4 (funcion putativa)

protema KIAA1053

protema asociada a microtubulos 1A

protema de dedo zinc 41

protema HSPCO

Homo sapiens ADNc: FLJ23564 fis, clon LNG10773

ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp564AO72 (a partir del clon DKFZp564A072)

protema LIM (similar a enigma de union C de quinasa de protema de rata

inhibidor potenciador de gen polipeptido de kappa en celulas B, protema asociada al complejo de quinasa

protema hipotetica FLJ22004 secuencias humana ARNm (clon CTG-A4)

ESTs, moderadamente similares a factor de tipo receptor de citoquina 2 precursor del CRL2 de receptor de citoquina [Homo sapiens] factor de crecimiento transformante, beta 2

protema hipotetica MGC29643

antfgeno identificado por anticuerpo monoclonal MRC OX-2 protema de retinopatfa putativa vinculada por X

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•protema con repeticion de anquirina cardiaca

•MHC de clase I region ORF

•integrina, alfa 10

•protema hipotetica FLJ22362

•UDP-N-acetilo-alfa-D-galactosamina: polipeptido N-acetilgalactosaminiltransferasa 3 (GaINAc-T3)

•Protema inducida por interferon 44

•SRY (region determinante del sexo Y)-caja 9 (displasia campomelica, inversion de sexo autosomico)

•protema asociada a queratina 1-1

•hipocalcina de tipo 1

dentada 1 (smdrome de Alagille)

•proteoglicano 1, granulo secretor

Tabla 7. Genes que se mostraron tener una mayor expresion en las celulas MSC en comparacion con las otras lineas celulares ensayadas

•interleucina 26

•maltasa-glucoamilasa (alfa-galactosidasa)

•subfamilia nuclear de receptores 4, grupo A, miembro 2

•v-fos FMJ murino osteosarcoma viral homologo de oncogen

•protema hipotetica DC42

•subfamilia nuclear de receptores 4, grupo 4, miembro 2

•FBJ murino viral osteosarcoma oncogen viral homologo B

•WNT1 senalizacion inducible protema de ruta 1

•secuencia transformadora derivada de lmea celular MCF.2

•canal de potasio, subfamilia K, miembro 15

•cartflago de clase emparejada homeoprotema 1

•Homo sapiens ADNc FLJ12232 fis, clon MAMMA1001206

•Homo sapiens ADNc FLJ34668 fis, clon LIVER2000775

•jun B proto-oncogen

•Celulas B CLL/linfoma 6 (protema de dedo zinc 51)

•protema de dedos zinc 36, tipo C3H, homologo (raton)

[0140] El analisis anterior incluye celulas derivadas de tres cables de diferentes cordones umbilicales y dos lmeas diferentes de fibroblastos dermicos, tres lmeas de celulas madre mesenquimales, y tres lmeas de celulas de medula osea de la cresta ilfaca. El ARNm que se expreso por estas celulas se analizo utilizando una matriz de oligonucleotidos que contema sondas para 22.000 genes. Los resultados mostraron que 290 genes se expresan

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diferencialmente en estos cinco tipos de celulas diferentes. Estos genes incluyen siete genes incrementados espedficamente en las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical. Se encontro que 54 genes teman niveles espedficamente mas bajos de expresion en las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical, en comparacion con los otros tipos de celulas. La expresion de genes seleccionados ha sido confirmada por PCR. Estos resultados demuestran que celulas derivadas de tejido del cordon umbilical tienen un perfil de expresion de genes distintos, por ejemplo, en comparacion con celulas derivadas de medula osea y fibroblastos.

EJEMPLO 5

Marcadores de celulas en celulas derivadas de tejido del cordon umbilical

[0141] Como se demostro anteriormente, se identificaron genes "de firma" para las celulas derivadas del posparto: LDL oxidada de receptor 1, interleucina-8, renina, reticulon, ligando del receptor de quimioquinas 3 (CXC ligando 3), y la protema quimiotactica de granulocitos 2 (GCP-2). Estos genes "de firma" se expresaron en niveles relativamente altos en celulas derivadas del posparto.

[0142] Los procedimientos descritos en este ejemplo se llevaron a cabo para verificar los datos de microensayos y encontrar concordancia/discordancia entre el gen y la expresion de protemas, asf como para establecer una serie de ensayo fiable para la deteccion de identificadores unicos para celulas derivadas de tejido del cordon umbilical.

[0143] Celulas derivadas de tejido del cordon umbilical (cuatro aislados), y fibroblastos dermicos humanos normales (NHDF; neonatales y adultos) se cultivaron en Medio de Crecimiento con penicilina/estreptomicina en un matraz T75 revestido de gelatina. Las celulas madre mesenquimaticas (MSC) se cultivaron en kit de bala de Medio de Crecimiento de Celulas Madre Mesenquimales (MSCGM; Cambrex, Walkersville, MD).

[0144] Para el protocolo IL-8, las celulas se descongelaron a partir de nitrogeno lfquido y se colocaron en placas en matraces revestidas de gelatina a 5.000 celulas/cm2, se cultivaron durante 48 horas en medio de crecimiento y despues se cultivaron durante 8 horas en 10 mililitros de medio de privacion de suero (DMEM-baja glucosa (Gibco, Carlsbad, CA), penicilina/estreptomicina (Gibco, Carlsbad, CA) y 0,1% (p/v) albumina de suero bovino (BSA; Sigma, St. Louis, MO)). Despues de este tratamiento, se extrajo el aRn y los sobrenadantes se centrifugaron a 150 x g durante 5 minutos para eliminar los desechos celulares. Los sobrenadantes se congelaron a 80°C para el analisis ELISA.

[0145] Las celulas de posparto derivadas del cordon umbilical, asf como fibroblastos humanos derivados de prepucio neonatal humano se cultivaron en Medio de Crecimiento en matraces T75 revestidos de gelatina. Las celulas se congelaron a paso 11 en nitrogeno lfquido. Las celulas se descongelaron y se transfirieron a tubos de centnfuga de 15 mililitros. Despues de centrifugacion a 150 x g durante 5 minutos, se descarto el sobrenadante. Las celulas se resuspendieron en 4 mililitros de medio de cultivo y se contaron. Las celulas se cultivaron en un matraz de 75 cm2 que contiene 15 mililitros de medio de crecimiento a 375.000 celulas/matraz durante 24 horas. El medio se cambio a un medio de privacion de suero durante 8 horas. El medio de privacion de suero se recogio al final de la incubacion, se centrifugo a 14.000 x g durante 5 minutos (y se almacena a 20°C).

[0146] Para estimar el numero de celulas en cada frasco, 2 mililitros de tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, CA) se anadio a cada matraz. Despues de las celulas desprendidas del matraz, la actividad de tripsina se neutralizo con 8 mililitros de medio de crecimiento. Las celulas se transfirieron a un tubo de centnfuga de 15 mililitros y se centrifugaron a 150 x g durante 5 minutos. Se elimino el sobrenadante y 1 mililitro de Medio de Crecimiento se anadio a cada tubo para resuspender las celulas. El numero de celulas se estimo usando un hemocitometro.

[0147] La cantidad de IL-8 secretada por las celulas en el medio de privacion de suero se analizo utilizando ensayos ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Todos los ensayos se ensayaron de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

[0148] Se extrajo ARN de celulas derivadas de tejido de cordon umbilical confluentes y fibroblastos o para la expresion de IL-8 a partir de celulas tratadas como se describio anteriormente. Las celulas se lisaron con 350 microlitros de tampon RLT que contiene beta-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (RNeasy® Mini Kit, Qiagen, Valencia, CA). Se extrajo el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (RNeasy® Mini Kit; Qiagen, Valencia, CA) y se sometio a tratamiento con ADNasa (2,7 U/muestra) (Sigma St. Louis, MO). El ARN se eluye con 50 microlitros de agua tratada con DEPC y se almaceno a 80°C.

[0149] El ARN tambien fue extrafdo de tejido del cordon umbilical humano. El tejido (30 miligramos) se suspendio en 700 microlitros de tampon que contema 2-mercaptoetanol RLT. Las muestras fueron mecanicamente homogeneizadas y la extraccion de RNA se procedio segun la especificacion del fabricante. El ARN se extrajo con 50 microlitros de agua tratada con DEPC y se almaceno a 80°C. El ARN se invirtio y se transcribio usando hexameros aleatorios con los reactivos de transcripcion inversa TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) a 25°C durante 10 minutos, 37°C durante 60 minutos, y 95°C durante 10 minutos. Las muestras se almacenaron a

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20°C.

[0150] Los genes identificados por microensayo ADNc como regulados de forma unica en las celulas despues del parto (genes de firma incluyendo receptor de LDL oxidada, interleucina-8, renina y reticulon), se investigaron adicionalmente usando PCR convencional y en tiempo real.

[0151] PCR se realizo en muestras ADNc usando productos de expresion genetica Assays-on-DemandTM: receptor de LDL oxidada (Hs00234028); renina (Hs00166915); reticulon (Hs00382515); CXC ligando 3 (Hs00171061); GCP-2 (Hs00605742); IL-8 (Hs00174103); y GaPDH (Applied Biosystems, Foster City, CA) se mezclaron con aDnc y la mezcla maestra TaqMan Universal PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando un sistema de deteccion de secuencia 7000 con ABI Prism 7000 SDS software (Applied Biosystems, Foster City, CA). condiciones del ciclo termico fueron inicialmente 50°C durante 2 mm y 95°C para 10 mm, seguido por 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C por 1 mm. Los datos de PCR se analizaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Boletm del usuario n° 2 de Applied Biosystems para ABI Prism 7700 Sequence Detection System).

[0152] PCR convencional se realizo utilizando un ABI PRISM 7700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Boston, Massachusetts, EE.UU.) para confirmar los resultados de PCR en tiempo real. PCR se realizo usando 2 microlitros de solucion a ADNc, 1 x tampon de reaccion PCR mezcla universal AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA) y desnaturalizacion inicial a 94°C durante 5 minutos. La amplificacion se optimiza para cada conjunto de cebadores. Para IL-8, CXC ligando 3, y reticulon (94°C durante 15 segundos, 55°C durante 15 segundos y 72°C durante 30 segundos durante 30 ciclos); para renina (94°C durante 15 segundos, 53°C durante 15 segundos y 72°C durante 30 segundos durante 38 ciclos); para el receptor de LDL oxidada y GAPDH (94°C durante 15 segundos, 55°C durante 15 segundos y 72°C durante 30 segundos durante 33 ciclos). Los cebadores usados para la amplificacion se enumeran en la Tabla 8. La concentracion de cebador en la reaccion de PCR final fue 1 micromolar a excepcion de GAPDH, que fue de 0,5 micromolar. cebadores GAPDH fueron los mismos que PCR en tiempo real, excepto que la sonda TaqMan no se agrego por el fabricante a la reaccion de PCR final. Las muestras se corrieron en 2% (p/v) en gel de agarosa y se tineron con bromuro de etidio (Sigma, St. Louis, MO). Las imagenes fueron capturadas utilizando una lamina de 667 Universal Twinpack (VWR International, South Plainfield, NJ), utilizando una camara Polaroid de longitud focal (VWR International, South Plainfield, NJ).

Tabla 8: Cebadores utilizados

Nombre de imprimacion Cebadores

Receptor de LDL oxidada S:5'-GAGAAATCCAAAGAGCAAATGG3' (SEQ ID NO:1)

A:5'-AGAATGGAAAACTGGAATAGG-3' (SEQ ID NO: 2)

S:5'-TCTTCGATGCTTCGGATTCC-3' (SEQ ID NO: 3)

A:5-GAATTCTCGGAATCTCTGTTG-3' (SEQ ID NO: 4

S:5'-TTACAAGCAGTGCAGAAAACC-3' (SEQ ID NO: 5)

A:5'-AGTAAACATTGAAACCACAGCC3' (SEQ ID NO: 6

S:5'-TCTGCAGCTCTGTGTGAAGG-3' (SEQ ID NO: 7)

A:5'-CTTCAAAACTTCTCCACAACC3' (SEQ ID NO: 8)

Quimiocina (CXC) ligando S:5'-CCCACGCCACGCTCTCC3' (SEQ ID NO: 9)

3

A:5'-TCCTGTCAGTTGGTGCTCC-3' (SEQ ID NO: 10)

Renina

Reticulon

Interleucina-8

[0153] Las celulas se fijaron con 4% fno (p/v) de paraformaldehudo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Un aislado en el pase 0 (P0) (directamente despues del aislamiento) y dos aislados en el paso 11 (P11), y se utilizaron fibroblastos (P11). La inmunocitoqmmica se realizo utilizando anticuerpos dirigidos contra los siguientes epftopos: vimentina (1: 500, Sigma, St. Louis, MO), desmina (1: 150; Sigma - elevado contra conejo; o 1: 300; Chemicon, Temecula, CA - levantado contra raton), actina de musculo liso alfa (SMA; 1: 400; Sigma), citoqueratina 18 (CK18; 1: 400; Sigma), factor de von Willebrand (vWF; 1: 200; Sigma), y CD34 (humano CD34 Clase III; 1:100; Dako, Carpinteria, CA). Ademas, los siguientes marcadores fueron probados en celulas de posparto de paso 11: GRO alfa PE antihumano (1: 100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), GCP-2 antihumano (1: 100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), receptor I de LDL oxidada antihumana (Ox-LDL R1; 1: 100; Santa Cruz Biotech), y NOGAA antihumano (1: 100; de Santa Cruz, Biotech).

[0154] Los cultivos se lavaron con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se expusieron a una solucion de bloqueo de protema que contiene PBS, 4% (v/v) de suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA), y 0,3% (v/v) de

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Triton (Triton X-100; Sigma, St. Louis, MO) durante 30 minutes para acceder a antigenos intracelulares. Cuando el epftopo de interes se encuentra en la superficie celular (CD34, Ox-LDL R1), Triton X-100 se omitio en todos los pasos del procedimiento con el fin de evitar la perdida de epftopo. Ademas, en los casos en que el anticuerpo primario se planteo en contra de cabra (GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A), 3% (v/v) de suero de burro se utilizo en lugar de suero de cabra. Los anticuerpos primarios, se diluyeron en solucion de bloqueo, se aplicaron a los cultivos durante un pertedo 1 de hora a temperatura ambiente. Las soluciones de anticuerpos primarios se retiraron y se lavaron los cultivos con PBS antes de la aplicacion de las soluciones de anticuerpo secundario (1 hora a temperatura ambiente) que contema bloque junto con IgG - Texas Red anti-raton de cabra (1: 250; Molecular Probes, Eugene, OR) y/o IgG - Alexa 488 anti-conejo de cabra (1: 250; Molecular Probes) o IgG - FITC anticabra de burro (1: 150, Santa Cruz Biotech). Despues, los cultivos se lavaron y se aplico 10 micromolar DAPI (Molecular Probes) durante 10 minutos para visualizar los nucleos celulares.

[0155] Despues de la inmunotincion, la fluorescencia se visualizo usando un filtro de fluorescencia correspondiente en un microscopio de epifluorescencia invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). En todos los casos, la tincion positiva represento senal de fluorescencia por encima de la tincion de control donde todo el procedimiento descrito anteriormente fue seguido con la excepcion de la aplicacion de una solucion de anticuerpo primario. Imagenes representativas fueron capturadas utilizando una camara de video a color digital y software de IMAGEPRO® (Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Para muestras de tincion triple, cada imagen fue tomada utilizando un solo filtro de emision a la vez. Montajes en capas se prepararon a continuacion, utilizando el software Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA).

[0156] Celulas adherentes en matraces se lavaron en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) y separadas con tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, CA). Las celulas se recogieron, se centrifugaron, y se resuspendieron 3% (v/v) de fBs en PBS a una concentracion celular de 1x107 por mililitro. Cien alteuotas de microlitros fueron administradas a tubos conicos. Las celulas tenidas para anftgenos intracelulares se permeabilizaron con tampon de perm/lavado (BD Pharmingen, San Diego, CA). El anticuerpo se anadio a alteuotas como por especificaciones de fabricacion y las celulas se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a 4°C. Despues de la incubacion, las celulas se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el exceso de anticuerpo. Las celulas que requieren un anticuerpo secundario se resuspendieron en 100 microlitros de 3% de FBS. se anadio el anticuerpo secundario, de acuerdo con las especificaciones de fabricante y las celulas se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a 4°C. Despues de la incubacion, las celulas se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el exceso de anticuerpo secundario. Las celulas lavadas se resuspendieron en 0,5 mililitros de PBS y se analizaron por citometna de flujo. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: receptor 1 de LDL oxidada (sc-5813; Santa Cruz, Biotech), GROa (555042; BD Pharmingen, Bedford, MA), Raton IgGI kappa, (P4685 y M5284; Sigma), IgG de Burro contra Cabra (SC3 743;. Santa Cruz, Biotech). La citometna de flujo se realizo con FACScalibur (Becton Dickinson San Jose, CA).

[0157] Los datos obtenidos de PCR en tiempo real se analizaron por el metodo AACT y se expresaron en una escala logarftmica. Los niveles de reticulon y expresion del receptor de LDL oxidada fueron mas altos en las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical en comparacion con otras celulas. No hay diferencia significativa en los niveles de expresion de CXC ligando 3 y GCP-2 se encontraron entre las celulas derivadas del posparto y controles. Los resultados de PCR en tiempo real fueron confirmadas por PCR convencional. La secuenciacion de los productos de PCR validaron aun mas estas observaciones. No se encontro diferencia significativa en el nivel de expresion de CXC ligando 3 entre las celulas derivadas del posparto y controles utilizando los cebadores de PCR CXC ligando 3 convencionales mencionadas anteriormente.

[0158] La produccion de la citoquina de IL-8 en las celulas despues del parto fue elevada tanto en celulas cultivadas por Medio de Crecimiento y celulas derivadas del posparto privadas de suero. Todos los datos de PCR en tiempo real se validaron con PCR convencional y mediante la secuenciacion de productos de PCR.

[0159] Cuando los sobrenadantes de las celulas cultivadas en medio exento de suero se examinaron para la presencia de IL-8, se detectaron cantidades mas altas en medios derivados de las celulas umbilicales y algunos aislados de celulas de la placenta (Tabla 9). No se detecto IL-8 en un medio derivado de fibroblastos dermicos humanos.

Tabla 9. Cantidad de protema IL-8 medida por ELISA

Tipo de celula: IL-8

hFibro: ND

Umb Aislado 1: 2058,42 ± 144,67

UMB Aislado 2: 2368,86 ± 22,73

Valores picogramos/millones de celulas n = 2 sem ND = No Detectado

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[0160] Celulas derivadas del tejido del cordon umbilical humano en el pase 0 se examinaron para la produccion de protemas seleccionadas mediante analisis inmunocitoqmmico. Inmediatamente despues del aislamiento (paso 0), las celulas se fijaron con paraformaldetudo al 4% y se expusieron a anticuerpos para seis protemas: Factor de von Willebrand, CD34, citoqueratina 18, desmina, actina de musculo liso alfa, y vimentina. Celulas derivadas de tejido de cordon umbilical fueron positivas para actina de musculo liso alfa y vimentina, con el patron de tincion consistente a traves del paso 11.

[0161] La concordancia entre los niveles de expresion de genes medidos por microensayo y PCR (tanto en tiempo real como convencional) se ha establecido para cuatro genes: receptor 1 de LDL oxidada, renina, reticulon y TL8. La expresion de estos genes se regula diferencialmente en el nivel de ARNm en PPDCs, con IL-8 tambien se regularon diferencialmente a nivel de protemas. Las celulas derivadas del tejido de cordon umbilical humano en el pase 0 se examinaron para la expresion de actina de musculo liso alfa y vimentina, y fueron positivas para ambas. El patron de tincion fue preservado a traves del paso 11.

EJEMPLO 6

Evaluacion inmunologica in vitro de celulas derivadas de posparto

[0162] Se evaluaron in vitro celulas derivadas del posparto (PPDCs) por sus caractensticas inmunologicas en un esfuerzo para predecir la respuesta inmunologica que, en su caso, estas celulas provocanan en el trasplante in vivo. PPDCs se analizaron por citometna de flujo para la presencia de HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD8O, CD86, y B7- H2. Estas protemas se expresaron por las celulas que presentan antigenos (APC) y son necesarias para la estimulacion directa de las celulas ingenuas CD4+ T (Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, quinta Ed. (Saunders, Philadelphia, 2003; p. 171)). Las lmeas celulares tambien se analizaron por citometna de flujo para la expresion de HLA-G (Abbas y Lichtman, 2003, supra), CD 178 (Coumans, et al., Journal of Immunological Methods, 1999; 224: 185196), y PD-L2 (Abbas y Lichtman, 2003, supra; Brown, et al., The Journal of Immunology, 2003; 170: 1257-1266). Se cree que la expresion de estas protemas por las celulas que residen en los tejidos de placenta median el estado inmunoprivilegiado de tejidos de la placenta en el utero. Para predecir el grado en que placenta y lmeas de celulas derivadas de tejido de cordon umbilical provocan una respuesta inmune in vivo, las lmeas celulares se examinaron en una reaccion de linfocitos mixtos de sentido unico (MLR).

[0163] Las celulas se cultivaron hasta la confluencia en Medio de Crecimiento que contema penicilina/estreptomicina en matraces T75 (Corning, Corning, NY) recubiertos con 2% de gelatina (Sigma, St. Louis, MO).

[0164] Las celulas se lavaron en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) y se separaron con tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, MO). Las celulas se recogieron, se centrifugaron, y se resuspendieron en 3% (v/v) de FBS en PBS a una concentracion celular de 1x107 por mililitro. El anticuerpo (Tabla 10) se anadio a un centenar de microlitros de suspension de celulas segun las especificaciones del fabricante y se incubo en la oscuridad durante 30 minutos a 4°C. Despues de la incubacion, las celulas se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el anticuerpo no unido. Las celulas se volvieron a suspender en quinientos microlitros de PBS y se

Tabla 10. Anticuerpos

Anticuerpo: Fabricante Numero de catalogo

HLA-DRDPDQ: BD Pharmingen (San Diego, CA) 555558

CD8O: BD Pharmingen (San Diego, CA) 557227

CD86: BD Pharmingen (San Diego, CA) 555665

B7-H2: BD Pharmingen (San Diego, CA) 552502

HLA-G: Abcam (Cambridgeshire, RU) ab 7904-100

analizaron mediante citometna de flujo utilizando un instrumento FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA).

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[0165] Viales criopreservadas de celulas derivadas de tejido de cordon umbilical de paso 10 etiquetadas como lmea celular fueron enviados sobre hielo seco a CTBR (Senneville, Quebec) para realizar una reaccion mixta de linfocitos usando CTBR SOP N° CAC-031. Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) fueron recogidas de donantes voluntarios multiples femeninos y masculinos. PBMC alergenico estimulador (donante), PBMC autologo, y las lmeas celulares posparto fueron tratadas con mitomicina C. Se anadieron celulas estimuladoras autologos y tratadas con mitomicina C a PBMCs respondedores (receptores) y se cultivaron durante 4 dfas. Despues de la incubacion, [3H]timidina se anadio a cada muestra y se cultivo durante 18 horas. Despues de la cosecha de las celulas, el AdN radiomarcado se extrajo, y la incorporacion de [3H]timidina se midio utilizando un contador de centelleo.

[0166] El mdice de estimulacion para el donante alogenico (SIAD) se calculo como la proliferacion media del receptor mas donante alogenico tratado con mitomicina C dividido por la proliferacion de lmea de base del receptor. El mdice de estimulacion de la PPDC se calculo como la proliferacion del receptor mas lmea de celulas posparto tratadas con mitomicina C dividida ppor la proliferacion de lmea de base del receptor.

[0167] Seis donantes de sangre de voluntarios humanos se examinaron para identificar un unica donante alogeneico que exhibira una respuesta de proliferacion robusta en una reaccion de limfocito mixto con otros cinco donantes de sangre. Este donante se selecciono como donante de control positivo alogeneico. Los cinco donantes de sangre restantes se seleccionaron como destinatarios. El donante de control positivo alogeneico y las lmeas celulares de placenta se trataron con mitomicina C y se cultivaron en una reaccion de limfocito mixto con los cinco receptores alogeneicos individuales. Las reacciones se realizaron en triplicado utilizando dos placas de cultivo de celulas con tres receptores por placa (Tabla 11). El mdice de estimulacion medio se vario entre 6,5 (placa 1) a 9 (placa 2) y los controles positivos de donante alogeneico se vario entre 42,75 (placa 1) a 70 (placa 2) (Tabla 12).

_________Tabla 11. Datos de reaccion de limfocito mixto - Lmea celular A (cordon umbilical)____________

DPM para ensayo de proliferacion

Placa ID: Placa 1

Numero: Sistema Replicas

analftico: de cultivo 1 2 3 Media SD CV

: La proiiferacibn de la linea de base de receptor 1074 406 391 623.7 390.07 62.5

IM04-2478: Control de la autoeetimulacibn (celulas eatologous tratadas con milomicira C) Donante alogdmco MLR de IM04-2477 (tratado con mitomicina C) 672 510 1402 861.3 475.19 55.2

MLR con linea celular (tipo celular A tratado con mitomicina C): 43777 48391 38231 43466.3 5087.12 11.7



: 2914 5622 6109 4881.7 1721.36 35.3

SI (donante): 70

SI (linea celular): 6

: La proliferacion de la linea de base de receptor 530 508 527 521,7 11.93 2.3

: Control de la autoestimulacibn (cblulas eatologous tratadas con milomicira C) 701 567 1111 793,0 283.43 35.7

IM04-2479: Donante alogOnico MLR de IM04-2477 (tratado con mitomicina C)

MLR con linea celular (tipo celular A tratado con mitomicina C): 25593 24732 22707 24344 0 1481.61 6.1



: 5086 3932 1497 3505.0 1832.21 52.3

SI (donante: ) 47

SI (linea celular): 7

: La proliferacion de la linea oe base de receptor 1192 854 1330 1125.3 244.90 21.8

IM04-2480: Control de la autoestimulacibn (cOlolas eatologous tratadas con milomicira C) Donanto alogOnico MLR de IM04-2477 (tratado con mitomicina C) 2963 993 2197 2051.0 993.08 48.4

MLR con linea celular (tipo celular A tratado con mitomicina C): 25416 29721 23757 26298.0 3078.27 11.7



: 2596 5076 3426 3699.3 1262.39 34.1

SI (donante): 23

SI (linea celular): 3

: La proliferacion de la linea ce base de receptor 695 451 555 567.0 122.44 21.6

: Control de la autoeetimulaciOn (cOlulas eatologous tratadas con milomicira C) 738 1252 464 818.0 400.04 48.9

IM04-2481: Donanto alogOnico MLR do M04 2477 (tratado con mitomicina C)

MLR con linea celular (tipo celular A tratado con mitomicina C): 13177 24885 15444 17835.3 6209.52 34.8



: 4495 3671 4674 4280.0 534 95 12.5

SI (donante): 31

SI (linea celular): 8

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(continuacion)

ID Plate: Placa 2

Numero analitico: Siscema de cultivo Reolicas 1 2 3 Media SD CV

IM04-2482: La prolrteradOn de la llnea d« base de receptor Control de ia autoestimuiaddn (celulas eatoiogous iratadas cor miiomicina C) Donante alogdnico MLR de IM04-2477 (tratado con mitomicina C) MLR con Knea ceiuiar (tipo celular A tratado con mitomicina C) 432 533 274 1459 633 598 24286 30823 31346 2762 1502 6723 413.0 896.7 28818.3 3662.3 130.54 487.31 3933.82 2724.46 31.6 54.3 13.7 74.4

SI (donante) SI (llnea celula: 0 70 9

IM04-2477 (dorarte &&Q&' col: La proliferacibn do la llnea de base de receptor Control de la autoestimulacibn (cblulas eatoiogous tratadas con miiomicina C) 312 419 349 567 604 374 360.0 515.0 54.34 123.50 15.1 24.0

Llnea celular lipo A: La proliferacibn do la llnea do base de receptor Control de la autoestimulacibn (cblulas eatoiogous tratadas con miiomicina C) 5101 3735 2973 1924 4670 2153 3936.3 2882.3 1078.19 1466,04 27.4 50.9

Tabla 12. Indice de estimulacion medio de celulas derivadas de tejido de cordon umbilical y un donante alogenico en una reaccion mixta de linfocitos con cinco receptores alogenicos individuales.

Indice promedio de Estimulacion

: Recipiente Ombligo

Placa 1 (receptores 1-4): 42,75 6,5

Placa 2 (receptor 5): 70 9

[0168] Histogramas de celulas derivadas de tejido del cordon umbilical analizadas por citometna de flujo muestran citometna de expresion negativa de HLA-DR, DP, DQ, CD8O, CD86, y B7-H2, como se ha senalado por valor de fluorescencia coherente con la IgG de control, lo que indica que las lmeas celulares umbilicales carecen de las moleculas de superficie celular requerida para estimular directamente las celulas T CD4+. Los histogramas de las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical analizadas por flujo muestran citometna de expresion positiva de PD-L2, como se indico por el aumento del valor de la fluorescencia con respecto al control IgG, y la expresion negativa de CD178 y HLA-G, como se ha senalado por valor de fluorescencia coherente con el control de IgG.

[0169] En las reacciones de linfocitos mixtos realizadas con lmeas de celulas derivadas de tejido de cordon umbilical el mdice medio de estimulacion vario de 6,5 a 9, y la de los controles positivos alogenicas vario de 42,75 a 70. Las lmeas de celulas derivadas de tejido de cordon umbilical fueron negativas para la expresion de las protemas estimulantes HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86, y B7-H2, medidas por citometna de flujo. Las lmeas de celulas derivadas de tejido de cordon umbilical fueron negativas para la expresion de protemas inmunomoduladoras HLA-G y CD178 y positivas para la expresion de PD-L2, medidas por citometna de flujo. PBMCs de donantes alogenicos contienen celulas que presentan antfgeno expresando HLA-DR, DQ, CD8, CD86, y B7-H2, permitiendo de este modo la estimulacion de celulas T ingenuas CD4+. La ausencia de moleculas de superficie de celulas que presentan antfgeno en placenta y celulas derivadas de tejido de cordon umbilical requeridas para la estimulacion directa de las celulas T CD4+ ingenuas y la presencia de PD-L2, una protema inmunomoduladora, puede explicar el mdice de baja estimulacion exhibido por estas celulas en un MLR en comparacion con controles alogenicos.

EJEMPLO 7

Secrecion de factores troficos por celulas derivadas de tejido del cordon umbilical

[0170] se midio la secrecion de factores troficos seleccionados de celulas derivadas de tejido de cordon umbilical. Factores seleccionados para la deteccion inclman: (1) los conocidos por tener actividad angiogenica, tal como el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (Rosen et al., Ciba Found Symp., 1997; 212:215-26), protema quimiotactica de monocitos 1 (MCP-1) (Salcedo et al., Blood, (2000; 96: 3440), interleucina-8 (IL-8) (Li et al., J. Immunol, 2003; 170: 3369-76), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Hughes et al., Ann Thorac Surg, 2004; 77: 812-8), la matriz de metaloproteinasa 1 (TIMP-1), angiopoyetina 2 (ANG2), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento epidermico de union por heparina (HB-EGF), factor 1 alfa derivado por stromal (SDF-1alfa); (2) los conocidos por tener actividad neurotrofica/neuroprotectora, tal como el factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF) (Cheng et al., Dev Biol, 2003; 258: 319-33), interleucina 6 (IL-6), protema quimiotactica de granulocitos 2 (GCP-2), factor de crecimiento transformante beta 2 (TGFbeta2); y (3) los conocidos por tener actividad de quimioquinas, tales como protema inflamatoria de macrofagos 1 alfa (MIP1a), protema inflamatoria de macrofagos 1beta (M1P1b), quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1), Rantes (regulados en

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la activacion, celula T normal expresada y secretada), I309, timo y quimiocina regulada por activacion (TARC), eotaxina, quimioquina derivada de macrofagos (MDC), IL-8.

[0171] Las celulas de cordon umbilical, asf como fibroblastos humanos derivados de prepucio neonatal humano se cultivaron en Medio de Crecimiento con penicilina/estreptomicina en matraces T75 recubiertos de gelatina. Las celulas fueron crioconservadas en el paso 11 y se almacenaron en nitrogeno lfquido. Despues de la descongelacion de las celulas, el medio de crecimiento se anadio a las celulas, seguido de la transferencia a un tubo de centnfuga de 15 ml y centrifugacion de las celulas a 150 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se descarto. El sedimento celular se resuspendio en 4 mililitros de medio de crecimiento, y se contaron las celulas. Las celulas se sembraron a 375.000 celulas/matraz de 75 cm2 que contienen 15 mililitros de medio de crecimiento y se cultivaron durante 24 horas. El medio se cambio a un medio libre de suero (DMEM-baja glucosa (Gibco), 0,1% (p/v) de albumina de suero bovino (Sigma), penicilina/estreptomicina (Gibco)) durante 8 horas. medio libre de suero acondicionado se recogio al final de la incubacion por centrifugacion a 14.000 x g durante 5 minutos y se almaceno a 20°C. Para estimar el numero de celulas en cada matraz, las celulas se lavaron con PBS y se desconectaron usando 2 mililitros de tripsina/EDTA. Actividad de tripsina fue inhibida por adicion de 8 mililitros de Medio de Crecimiento. Las celulas se centrifugaron a 150 x g durante 5 minutos. Se elimino el sobrenadante, y las celulas se resuspendieron en 1 mililitro de Medio de Crecimiento. El numero de celulas se estimo usando un hemocitometro.

[0172] Las celulas fueron cultivadas a 37°C en 5% de dioxido de carbono y oxfgeno atmosferico. Celulas derivadas de placenta (lote 101503) tambien se cultivaron en 5% de oxfgeno o beta-mercaptoetanol (BME). La cantidad de MCP-1, IL-6, VEGF, SDF-1alfa, GCP-2, IL-8, y TGF-beta 2 producidas por cada muestra de celulas se midio mediante un ensayo ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Todos los ensayos se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

[0173] Las quimiocinas (MIP1a, MIPIb, MCP-1, Rantes, I309, TARC, eotaxina, MDC, 1L8), BDNF, y factores angiogenicos (HGF, KGF, bFGF, VEGF, TIMP1, ANG2, PDGF-bb, TPO, HBF-EGF, se midieron usando matrices de proteoma SEARCHLIGHT® (Pierce Biotechnology Inc.). Las matrices de proteoma son ELISAs de sandwich multiplexados para la medicion cuantitativa de dos a 16 protemas por pocillo. Las matrices se producen mediante la deteccion de un patron 2 x 2, 3 x 3, o 4 x 4 de cuatro a 16 anticuerpos de captura diferentes en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Despues de un procedimiento de sandwich ELISA, toda la placa se forma para capturar senal quimioluminiscente generada en cada punto dentro de cada pocillo de la placa. La cantidad de senal generada en cada punto es proporcional a la cantidad de protema diana en el estandar original o muestra.

[0174] MCP-1 e IL-6 fueron secretadas por celulas derivadas de tejido de cordon umbilical y fibroblastos dermicos (Tabla 13). SDF-1alfa fue secretada por fibroblastos. GCP-2 e IL-8 fueron secretadas por las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical cultivadas en presencia de BME o 5% de O2. GCP-2 tambien se secreto por los fibroblastos humanos. TGF-beta2 no era detectable por matriz de ELISA.

Tabla 13. Resultados del ensayo de ELISA

: MCP 1 IL-6 VEG F SDF- 1a GCP-2 IL-8 TGF beta2

Fibroblastos: 17 ± 1 61 ± 3 +1 (J) CM CM 19 ± 1 21 ± 1 ND ND

Cordon umbilical (022803): 1150 ± 74 +1 "3- CO CD CM OO ^ CM ND ND 160 ± 1 1 2058 ± 145 ND

Cordon umbilical (071003): OO K) 4^ -M CD 4^ 1+ +1 CD LO CO CO ND ND 2184 98 +1 a> CD CO CO CM CM ND

Los valores presentados son picogramos/mililitro/millon de celulas (n=2, sem) ND = No detectado.

[0175] TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIP1b, MCP1, RANTES, I309, TARC, MDC, y la IL-8 se secretaron a partir de celulas derivadas de tejido del cordon umbilical (Tablas 14 y 15). Ningun Ang2, VEGF, o PDGF-bb se detecto.

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Tabla 14. Resultados de ensayo multiplexado ELISA SearchLight®

: TIMP1 ANG2 PDGFb b TPO KGF HGF FGF VEGF HBEGF BDNF

Hfb: 1930 6,3 ND ND 230, 5 5,0 ND ND 27,9 1,3 ND

U1: £ T LO 00 ND ND 1240 0,0 5,8 559, 3 148, 7 ND 9,3 165,7

U3: 2185 0,0 ND ND 1134 0,5 9,0 195, 6 30,8 ND 5,4 388,6

hFB = fibroblastos humanos. U1 = celulas derivadas de tejido de cordon umbilical (022803), U3 = celulas derivadas de tejido de cordon umbilical (071003), ND = no detectado.

Tabla 15. Resultados de ensayo SearchLi: ght® multiplexado ELISA

: MIP1a MIP1b MCP 1 RANT ES I309 TARC Eotaxi na MDC IL8

HFB: ND ND 39,6 ND ND 0,1 ND ND 204,9

P1: 79,5 ND 228,4 4,1 ND 3,8 12,2 ND 413,5

U1: ND 8,0 1694, 2 ND 22,4 37,6 ND 18,9 51930,1

P3: ND ND 102,7 ND ND 0,4 ND ND 63,8

U3: ND 5,2 2018, 7 41,5 11,6 21,4 ND 4,8 10515,9

[0176] Celulas derivadas de tejido del cordon umbilical secretan una serie de factores troficos altamente beneficiosos. Algunos de estos factores troficos, tales como TIMP1, un inhibidor catabolico, desempena un papel cntico en la prevencion de la degradacion de la matriz extracelular por metaloproteasas de matriz. HGF, bFGF, MCP-1 e IL-8, juegan un papel importante en las funciones de supervivencia celular y la diferenciacion celular. Otros factores troficos, tales como BDNF e IL-6, tienen papeles importantes en regeneracion neural.

EJEMPLO 8

Inhibicion de la expresion inducida por IFN-gamma de HLA-DR DP, DQ en celulas derivadas de tejido del cordon umbilical humano ampliadas por los inhibidores de la reductasa HMG-CoA

[0177] Las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical humano de cultivo expandido (022803 P4) se sembraron en placas de cultivo tisular de 6 pocillos y se cultivaron en Medios de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)-bajo glucosa, suero bovino fetal al 15% (FBS), penicilina/estreptomicina (P/S), beta-mercaptoetanol (BME) a aproximadamente 70% de confluencia. Las celulas se trataron entonces con medios que contienen 10|jM de inhibidor de reductasa HMG-CoA respectivo (acido simvastatico (Alexis Biochemicals, Lausen, Suiza) formulado como reactivos madre 10mM en DMSO) o vehfculo DMSO - 0,1% (Sigma, St. Louis, MO) y se incubo durante la noche. El medio se retiro por aspiracion y se reemplazo con medio que contema 500U/ml rhIFN-gamma (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ) y 10jM de inhibidor de reductasa HMG-CoA respectivo y se incubaron durante 3 dfas. En el tercer dfa, las celulas se recogieron con tripsina. [0178] Las celulas recogidas se lavaron una vez con PBS y se resuspendieron en 100 jl de 3% FBS en PBS con 20jl HLA-DR,DP,DQ etiquetado por FITC (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) o anticuerpo IgG etiquetado por FlTc (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) y se incubaron durante una hora. Las celulas se lavaron una vez en PBS y se resuspendieron en PBS 500jl y se analizaron en un citometro de flujo FACSCalibur (BS Biosciences, Franklin Lakes, NJ).

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Tabla 16. Expresion de HLA-DR, DP, DQ de HUTC medida por valores de intensidad de fluorescencia FITC de inhibidor de reductasa pretratado con HMG-CoA y tratado adicionalmente con citoquina IFN-gamma inflamatoria.

HMG-CoA reductasa inhibidor: Control de IgG IFN-gamma-tratado Sin tratamiento por citoquinas

Tratamiento: Media Desv Est Media Desv Est Media Desv Est

No tratado: 4,88 5,12 274,23 219,04 5,56 8,97

0,1% control portador DMSO: 4,09 5,67 294,08 257,08 5,54 5,46

Simvastatina: 4,4 2,38 5,57 3,98 5,66 3,25

[0179] Como se muestra en la Tabla 16, no tratado y 0,1% vefffculo de DMSO de celulas derivadas de tejido de cordon umbilical humano de control incubadas con la citoquina inflamatoria IFN-gamma mostro un aumento en expresion HLA-DR, DP, DQ como se ve por el aumento de la fluorescencia detectada por el flujo de citometna. Celulas derivadas de tejido de cordon umbilical humano pretratadas con un inhibidor de reductasa HMG-CoA y posteriormente incubadas con IFN mostraron expresion HLA-DR, DP, DQ similar a los controles de vefffculoes y no tratados.

[0180] Estos datos indican que la reductasa HMG-CoA inhibe la expresion inflamatoria mediada por citoquina de HLA-Dr, DP, DQ en celulas derivadas de tejido del cordon umbilical humano.

EJEMPLO 9

Eficacia de celulas derivadas de tejido del cordon umbilical (hUTC) en un modelo de conejo de la degeneracion del disco intervertebral

[0181] Se realizo un estudio para determinar si las celulas derivadas de tejido umbilical humano (hUTC) son eficaces en un modelo de conejo de degeneracion de disco intervertebral (IVD). Se inyectaron celulas en el sitio de lesion y dimensiones de disco evaluadas mediante formacion de imagenes de rayos X. El analisis de los tejidos se realizo en la necropsia.

[0182] Para evaluar los efectos de las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical humano (hUTC) en la degeneracion de discos intervertebrales (IVD), hUTC se inyectaron en un IVD perforado. Radiograffas bisemanales se obtuvieron y se analizaron para el cambio de altura del disco en comparacion con el control tratado con vefffculo lesionado. El tratamiento con hUTC resulto en un incremento de altura del disco asf como aumento de la tasa de recuperacion en comparacion con los controles del vefffculo.

[0183] La creacion de modelo de degeneracion del disco: Conejos NZW hembra a los 6 meses de edad fueron seleccionados sin ningun tipo de sesgo sistemico. Los animales fueron etiquetados y se pesaron antes de la inscripcion e inmediatamente antes de la necropsia. Los conejos recibieron glicopirolato (0,01 a 0,02 mg/kg SQ) antes de la sedacion para reducir las secreciones orotraqueales y disminuir bradicardia asociada con la anestesia. La buprenorfina (buprenorfina HCl 0,03 mg/kg) se administro antes de la operacion como un analgesico preventivo. Los conejos se anestesiaron mediante la administracion de hidrocloruro de ketamina (25 mg/kg) y maleato de acepromazina (1 mg/kg, 10 mg/ml) para facilitar la intubacion endotraqueal. Una radiograffa preoperatoria fue tomada como un control de lmea de base. Una dosis de xilacina a 5 mg/kg se administro por via subcutanea o por via intramuscular despues de completarse las radiograffas preoperatorias. Los animales se mantuvieron por inhalacion de isoflurano (inducido en el 23%, y se mantuvieron a 0,52%).

[0184] Se colocaron los conejos (que pesaban 3,5 kg) en una posicion de decubito prono lateral. Siguiendo preparacion y drapeado, los IVDs lumbares fueron expuestos a traves de un enfoque retroperitoneal posterolateral mediante diseccion roma del musculo psoas. Se expusieron las superficies anteriores de tres IVDs lumbares consecutivos (L2/3, L3/4 y L4/5). Usando una aguja 18G con un dispositivo de tapon que permite que la aguja entre a una profundidad de 5 mm, el anillo fibroso se pincho en el aspecto ventral en el nucleo pulposo en niveles L2/3 y L4/5. Una grapa vascular y una sutura se colocaron en el musculo psoas en el nivel l3/4 como marcadores. La herida quirurgica creada fue reparada en capas. La piel se cerro con grapas.

[0185] Despues de la operacion, una radiograffa postoperatoria fue tomada para confirmar el nivel de la puncion. Se administro 1,5 mg de meloxicam por via oral (un dfa antes de la cirugfa y 2-3 dfas despues de la operacion). Un analgesico (buprenorfina HCl 0,01 - 0,03 mg/kg) se administro hasta dos veces al dfa durante 2-3 dfas, segun sea necesario, en consulta con el personal veterinario. Despues de la recuperacion de la anestesia, los conejos fueron

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devueltos a sus jaulas y movilizados ad lib. Chaquetas de conejo se utilizaron en conejos para evitar que entren en contacto con y perturben la incision quirurgica y retiren las grapas.

[0186] Evaluacion de los tratamientos: Cuatro semanas despues de la cio^a inicial (puncion anular), un procedimiento quirurgico similar se hizo desde el lado opuesto para evitar el sangrado de la cicatriz formada a partir de la primera operacion. Una vez que los discos de degeneracion quirurgica se confirmaron por rayos X y la inspeccion visual, PBS, 1.000.000 o 100.000 celulas se inyectaron intradiscalmente en el area de nucleo pulposo con una microjeringa usando una aguja 28G, tanto en niveles L2/3 como L4/5 para cada conejo. L3/4 se dejo como control no perforado, no tratado. Despues de la reparacion de la herida quirurgica, los conejos fueron devueltos a sus jaulas y estrechamente vigilados. Como se describio previamente, un analgesico y antibiotico se administro durante tres dfas. Cada conejo recibio 1,5 mg de meloxicam por via oral (un dfa antes de la cirugfa y 23 dfas despues de la operacion). El comportamiento, el apetito y el cambio en el peso corporal fueron monitorizados y la personal veterinario y los investigadores monitorizaron el estres postquirurgico.

[0187] Todos los materiales de inyeccion se prepararon en condiciones esteriles. hUTC de calidad para investigacion (Lote Q030306), evaluados en cuanto a esterilidad, micoplasma, cariotipo, y los patogenos se utilizaron para este estudio. Celulas criogenicamente almacenadas se descongelaron rapidamente y se diluyeron en PBS. Las celulas se centrifugaron y el sobrenadante se elimino. Las celulas se resuspendieron en PBS y se contaron para lograr una concentracion final de celulas de cualquiera de 100.000 o 10.000 celulas por microlitro. Tripano azul se utilizo para evaluar la viabilidad. Diez microlitros de celulas se cargaron en microjeringas preesterilizadas y se inyectaron en el IVD como se describio anteriormente.

[0188] A las 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16 semanas postpuncion y el sacrificio a las 16 semanas postpuncion, se tomaron radiograffas para medir la altura IVD despues de la administracion de hidrocloruro de ketamina (25 mg/kg) y maleato de acepromazina (1 mg/kg).

[0189] A las 16 semanas despues de la puncion anular inicial (correspondiente a la semana 12, despues de la inyeccion (celulas)), ocho conejos en cada grupo se anestesiaron con hidrocloruro de ketamina (25 mg/kg) y maleato de acepromazina (1 mg/kg) y la eutanasia con una dosis en exceso de pentobarbital (90 mg/kg, eutanasia solucion B: Henry Schein Inc., Melville, NY).

[0190] Pelfculas radiograficas obtenidas antes de la puncion, en cada punto de tiempo despues de la puncion, y en la eutanasia se digitalizaron y se midieron la altura de altura del cuerpo y el disco vertebral. La altura IVD se expreso como el DHI de acuerdo con metodos publicados (Chujo et al., Spine, 2006; 31: 290.917; Masuda et al., Spine, 2006; 31: 742-54). Un investigador ortopedico, cegado al grupo de tratamiento, interpretado de forma independiente todas las imagenes de la radiograffa. Las radiograffas digitalizadas, mediciones, incluyendo la altura del cuerpo vertebral y la altura IVD, se analizaron mediante el programa personalizado para el software MATLAB (Natick, mA). Los datos fueron transportados al software Excel y la altura IVD se expreso como mdice de altura de disco (DHI = altura IVD / altura del cuerpo IVD adyacente) basado en el metodo de Lu et al., Spine, 22: 182 834 (1997), con una ligera modificacion. La altura media IVD (DHI) se calculo promediando las mediciones obtenidas a partir de las porciones anterior, medio y posterior del IVD y dividiendose por la media de las alturas de los cuerpos vertebrales adyacentes. %DHI se expreso como (DHI postoperatorio/DHI preoperatorio) x 100. Ademas, %DHI se normalizo utilizando el nivel L3/4 como el nivel de control. El % de DHI normalizado = (nivel experimental %DHI / L3/4 %DHI) x 100. Tambien se calculo la tasa de recuperacion de la siguiente manera: (%DHI (punto de tiempo) - %DHI (4W [puncion])) / (100%DHI (4W [puncion])).

[0191] La significacion de las diferencias entre las medias de los datos de mediciones radiograficas se analizo mediante medidas ANOVA de dos vfas repetidas, o ANOVA unidireccional y PLSD de Fisher como una prueba post hoc. Todos los datos se expresan como la media ± error estandar. El analisis estadfstico se realizo utilizando el paquete de programas de Statview (Version 5.0, SPSS, Chicago, IL) con un nivel de significancia de p<0,05.

[0192] fndice de altura del disco se evaluo cada dos semanas como se describio anteriormente. Los discos con menos de un deficit de 10% fueron excluidos del estudio. Datos (mostrados en la Tabla 17) indican la altura del disco se aumento con una dosis hUTC de 100.000 celulas y se disminuyo con una dosis de 1.000.000 celulas en comparacion con el control entre 212 semanas despues del trasplante (6-16 semanas postpuncion) (p<0,05 hUTC (1.000.000) vs. hUTC (100.000) 2, 4, 6, y 14 semanas despues del trasplante; p <0,01 8 semanas despues del trasplante).

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Tabla 17. Efecto de hUTC en la altura de disco

Altura de disco (%): 0 Pre OP 2 2W-P 4 4W-P 6 2W 8 4W 10 6W 12 8W 14 10W 16 12W

Control: 100,0 79,4 79,3 78,9 79,5 78,5 77,1 74,8 78,5

Control-SE: 0,0 3,2 2,8 2,1 2,6 3,4 4,6 3,6 2,0

1.00E+06: 100,0 76,6 76,6 74,8 74,6 72,7 70,8 74,4 72,9

SE: 0,0 2,2 1,5 2,1 1,8 2,1 1,4 1,8 2,8

1,00E+05: 100,0 84,8 76,6 83,7 83,8 81,3 86,0 82,4 82,2

SE: 0,0 1,7 2,6 2,7 3,3 1,9 3,1 4,2 3,8

[0193] La tasa de recuperacion se midio como se describio anteriormente. Los discos con menos de un deficit de 10% fueron excluidos del estudio. Los datos (mostrados en la Tabla 18) indican que la tasa de recuperacion se aumento con una dosis hUTC de 100.000 y la disminucion con una dosis de 1.000.000 en comparacion con el control entre 2-12 semanas despues del trasplante (6-16 semanas postpuncion). (P <0,05 de control vs. hUTC (100.000 celulas) 2 y 14 semanas despues del trasplante; p <0,01 12 semanas de postrasplante).

Tabla 18. Efecto de hUTC en la Tasa de recuperacion (%

Velocida d de recupera cion: 0 Pre OP 2 2W-P 4 4W-P 6 2W 8 4W 10 6W 12 8W 14 10W 16 12W

Control: 0,0 0,0 0,0 -0,1 -0,1 -0,1 -0,1 -0,3 -0,2

Control- SE: 0,0 0,0 0,0 0,1 0,2 0,2 0,3 0,2 0,2

1.00E+06 %: 0,0 0,0 0,0 -0,1 -0,1 -0,2 0,3 -0,1 -0,2

SE: 0,0 0,0 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

1,00E+05 %: 0,0 0,0 0,0 0,3 0,2 0,1 0,4 0,3 0,3

SE: 0,0 0,0 0,0 0,1 0,2 0,1 0,2 0,1 0,1

[0194] Por lo tanto, se evaluaron los efectos de hUTC sobre la degeneracion de IVD en un modelo de conejo de degeneracion de IVD mediante la inyeccion hUTC en un IVD pinchado en dosis de 1.000.000 y 100.000 celulas/inyeccion. Radiograffas bisemanales se obtuvieron y se analizaron para el cambio de altura del disco como comparacion con el control no tratado perforado. Los datos indicaron que el tratamiento con hUTC a una concentracion de 100.000 dio como resultado un aumento de la altura del disco, donde el tratamiento con una concentracion de 1.000.000 altura del disco disminuida en comparacion con el control tratado por PBS (Tabla 17). El analisis adicional de los datos revelo que la velocidad de recuperacion (la cantidad de recuperacion/disminucion total de DHI % normalizado) de los discos tratados con hUTC (100.000) era mayor que la de control (Tabla 18).

EJEMPLO 10

Expresion de la proteinas de matriz extracelular por celulas derivadas de tejido de cordon umbilical humano in vitro

[0195] Se realizo un estudio para determinar el grado de expresion de las tres proteinas de la matriz extracelular agrecano, colageno I y colageno II por hUTC in vitro. Las celulas se ensayaron solas y despues de la estimulacion con los factores troficos, TGF-beta, GDF-5 y PDGF-BB.

[0196] Los cultivos de celulas derivadas de tejido umbilical humano (hUTC; lote 120304) se mantuvieron en cultivo bajo condiciones estandar. En resumen, las celulas se sembraron a 5000 celulas por cm cuadrado en matraces T con pasaje y resiembra cada 34 dfas. Las celulas para el experimento de factor trofico se encapsularon en perlas de alginato y se trataron con factores al medio de crecimiento estandar. Los cultivos se complementaron con acido ascorbico a 100 pg/ml. Factores probados fueron PDGF-BB a 10 ng/ml, TGF-beta1 en 5 nglml y GDF-5 a 200 ng/mI. Cinco grupos de tratamiento fueron creados, hUTC solo, hUTC con GDF-5, hUTC con TGF-beta1, hUTC con PDGF- BB y hUTC con TGF-beta1 y GDF-5.

[0197] Despues de 2 semanas en cultivo, las celulas fueron liberadas de alginato, se lavaron, se sedimentaron y se congelaron. Se aislo el ARN y la transcripcion inversa se realizo para generar ADNc. Las muestras se analizaron por PCR en tiempo real para la expresion de agrecano, colageno de tipo I y de tipo II.

[0198] Los resultados de los analisis de PCR en tiempo real muestran la expresion bajo cinco condiciones de cultivo

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diferentes. Los resultados se muestran en la Tabla 19 y se expresan como expresion relativa a hUTC sin tratamiento de factor de crecimiento. Los cultivos tratados con PDGF-BB y GDF-5 con TGF-beta1 mostraron una expresion comparable de agrecano, colageno I y colageno II. Las celulas tratadas con TGFbetal mostraron cierta induccion de colageno I y colageno II y agrecano de aproximadamente 1020 veces. La induccion mas alta de se observo con el tratamiento GDF-5. Las celulas mostraron un aumento de aproximadamente 50 veces en agrecano y colageno de tipo I y un aumento de mas de 300 veces en la expresion de colageno de tipo II.

Tabla 19. Expresion de protemas: de matriz extracelular por hUTC in vitro.

: ARNm relativo

: Agrecano Colageno I Colageno II

hUTC: 1 1 1

hUTC + GDF-5: 56 45 387

hUTC + GDF-5/beta TGF: y° 1 113

hUTC + PDGF: 1 <1 <1

hUTC + TGF beta: 23 7 13

EJEMPLO 11

Expresion de telomerasa en las celulas derivadas del cordon umbilical

[0199] Funciones de telomerasa para sintetizar repeticiones telomericas que sirven para proteger la integridad de los cromosomas y para prolongar la vida replicativa de las celulas (Liu, K, et al., PNAS, 1999; 96: 5147-5152). La telomerasa consta de dos componentes, plantilla de ARN de telomerasa (hTER) y la transcriptasa inversa de la telomerasa (hTER). La regulacion de la telomerasa es determinada por la transcripcion de hTERT, pero no hTERT. La reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) para hTERT ARNm, por tanto, es un metodo aceptado para determinar la actividad de la telomerasa de las celulas.

[0200] Aislamiento de celulas. Se llevaron a cabo experimentos de PCR en tiempo real para determinar la produccion de la telomerasa de las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical humano. Se prepararon celulas derivadas de tejido de cordon umbilical humano, de acuerdo a los ejemplos expuestos anteriormente. Generalmente, cordones umbilicales obtenidos a partir del National Disease Research Interchange (Philadelphia, Pa.) despues de un parto normal se lavaron para eliminar la sangre y los residuos y se disociaron mecanicamente. Despues, el tejido se incubo con enzimas de digestion, incluyendo la colagenasa, dispasa y hialuronidasa en medio de cultivo a 37°C. Celulas derivadas de tejido de cordon umbilical humano se cultivaron de acuerdo con los metodos establecidos en los ejemplos anteriores. Las celulas madre mesenquimales y fibroblastos de la piel dermicos normales (cc-2509 lote n° 9F0844) se obtuvieron de Cambrex, Walkersville, Md. Una lmea celular de carcinoma embrionario testicular humano pluripotente (teratoma) celulas nTera-2 (NTERA-2 cl.Dl), (vease, Plaia et al., Stem Cells, 2006; 24 (3): 531546) se adquirio de ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron de acuerdo con los metodos establecidos anteriormente.

[0201] Aislamiento de ARN total. Se extrajo el ARN de las celulas usando kit RNeasy® (Qiagen, Valencia, Ca.). El ARN se eluye con 50 microlitros de agua tratada con DEPC y se almaceno a 80°C. El ARN se transcribio de forma inversa usando hexameros aleatorios con los reactivos de transcripcion inversa TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) a 25°C durante 10 minutos, 37°C durante 60 minutos y 95°C durante 10 minutos. Las muestras se almacenaron a 20°C.

[0202] PCR en tiempo real. PCR se realizo en muestras de ADNc utilizando el Applied Biosystems AssaysOnDemand™ (tambien conocido como ensayos de expresion genetica TaqMan®) de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Applied Biosystems). Este kit comercial es ampliamente utilizado para el ensayo de la telomerasa en las celulas humanas. Brevemente, hTERT (gen humano de la telomerasa) (HS00162669) y GAPDH humana (control interno) se mezclaron con ADNc y la mezcla maestra TaqMan Universal PCR usando un sistema de deteccion de secuencia 7000 con software ABI Prism 7000 SDS (Applied Biosystems). Condiciones del ciclo termico fueron inicialmente 50°C durante 2 minutos y 95°C durante 10 minutos seguido por 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 minuto. Los datos de PCR se analizaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

[0203] Las celulas derivadas de tejido de cordon umbilical humano (ATCC N° de Acceso PTA6067), fibroblastos y celulas madre mesenquimales se ensayaron por hTERT y 18S ARN. Como se muestra en la Tabla 20, hTERT, y por lo tanto la telomerasa, no se detecto en celulas derivadas de tejido de cordon umbilical humano.

Tabla 20

: hTERT 18S ARN

Celulas umbilicales (022803): ND +

Fibroblastos: ND +

ND- no detectado; + senal detectada

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[0204] Las celulas derivadas de tejido de cordon umbilical humano (aislado 022803, ATCC N° de Acceso PTA6067) y celulas nTera-2 se ensayaron y los resultados no mostraron expresion de telomerasa en dos lotes de celulas derivadas de tejido de cordon umbilical humano mientras que la lmea de celulas de teratoma revelo un alto nivel de expresion (Tabla 21).

Tabla 21

Tipo de celulas: hTERT GAPDH Norma hTERT

: Exp. 1 Exp. 2 Exp. 1 Exp. 2

nTera2: 22,8 5 27,31 16,41 16,31 0,61

022803: - - 22,97 22,79 -

[0205] Por lo tanto, se puede concluir que las celulas derivadas de tejido del cordon umbilical humano de la presente invencion no expresan telomerasa.

EJEMPLO 12

Inveccion de celulas derivadas de tejido del cordon umbilical humano en el nucleo pulposo altera el curso de la degeneracion del disco intervertebral in vivo-

[0206] Este ejemplo investiga la utilidad de la inyeccion de celulas derivadas de tejido umbilical humano (hUTC) directamente en el nucleo pulposo (NP) en un modelo in vivo quirurgico de degeneracion IVD. Los hUTC se inyectaron con y sin un vetnculo de hidrogel. Este estudio es uno de los primeros en investigar la IRM y respuestas biomecanicas al tratamiento en este modelo de degeneracion.

Metodos

[0207] Como se describe mas en detalle a continuacion, se utilizaron treinta conejos blancos de Nueva Zelanda esqueleticamente maduros (control n = 6, puncion n = 6, vetnculo de hidrogel n = 6, celulas + tampon PBS n = 6, celulas + vetnculo de hidrogel n = 6) en un modelo de conejo de anulotoirna previamente validado para la degeneracion del disco intervertebral (vease Sobajima et al. Spine 2005; 30 (1): 15-24). Los discos L2-3, fueron pinchados L3-4, L4-5 y se pincharon con una aguja 16G para inducir degeneracion y despues se trataron posteriormente con celulas derivadas de tejido del cordon umbilical humano con o sin un vetnculo de hidrogel. IRMs de la columna vertebral seriadas obtenidas a las 0, 3, 6, y 12 semanas se analizaron utilizando una bobina de rodilla 3T para la evidencia de la degeneracion de acuerdo con la metodologfa previamente validada. Los conejos se sacrificaron a las 12 semanas y los discos L4-5 se analizaron histologicamente. Propiedades viscoelasticas de los discos de L3-4 se analizaron mediante pruebas de desplazamiento normalizadas a carga uniaxial. Curvas de fluencia se modelaron matematicamente de acuerdo con un modelo exponencial de dos fases previamente validado.

Conejos

[0208] Treinta conejos blancos de Nueva Zelanda esqueleticamente maduros sanos fueron utilizados en este estudio (hembra, 1 ano de edad, 5 kg de peso). Se dividieron en el control no perforado (n = 6), puncion (n = 6), puncion seguida de la inyeccion de vetnculo solo (n = 6), puncion seguida de la inyeccion de las celulas en tampon de PBS (n = 6), y la puncion seguida de la inyeccion de celulas en vetnculo (n = 6).

Preparacion de la muestra

[0209] Tejido del cordon umbilical humano se obtuvo de un donante que ha dado su consentimiento de someterse a la administracion ya sea por via vaginal o por cesarea. Se aislaron celulas derivadas de tejido del cordon umbilical humano (hUTC) y se expandieron desde el cordon umbilical de un solo donante. Brevemente, el cordon umbilical se desmenuzo manualmente y se digirio con una mezcla de 0,5 unidades/ml de colagenasa (Nordmark), 5,0 Unidades/ml, dispasa (Roche Diagnostics), y 2 unidades/ml de hialuronidasa (ISTA Pharmaceuticals) hasta digerirse casi por completo. La suspension celular se paso a traves de un tamiz para eliminar el tejido no digerido, y las celulas se centrifugaron y se sembraron a 5.000 celulas por cm2 en matraces de porcino revestidas de gelatina en Medios de Crecimiento 1 (DMEM-baja glucosa (Cambrex/SAFC Biosciences), 15% (vol/vol) suero bovino fetal definido (FBS; HyClone, Logan, UT), 0,001% betamercaptoetanol (Sigma), 50 U/ml penicilina y 50 pg/ml de estreptomicina (Lonza)). Las celulas se expandieron en matraces T estaticas, bajo condiciones de cultivo tisular estandar en oxfgeno atmosferico con dioxido de carbono al 5% a 37° hasta alcanzar cinco duplicaciones de la poblacion (PD) y se peraltaron. Las celulas se expandieron en matraces T estaticas a aproximadamente 12 PD acumuladas en el Medio de Crecimiento 2 (DMEM-baja glucosa, 15% (vol/vol) de suero bovino fetal definido (FBS; HyClone), 100 U/ml de penicilina, y 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen)) y se almacenaron. Las celulas fueron entonces expandidas adicionalmente en HILLEX® II microvetnculos (SoloHill Engineering) en matraces de agitacion (Corning, NY) en medio de crecimiento 2. Los matraces de agitacion que conteman celulas se colocaron en placas

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spinner fijadas a 60 rpm y las celulas se cultivaron bajo condiciones estandar en oxfgeno atmosferico con dioxido de carbono al 5% a 37°C hasta que alcanzaron aproximadamente 2.530 duplicaciones de poblacion total acumulativas. Las celulas se recogieron a partir de microvehmuloes utilizando TrypLE™ (Invitrogen), criopreservadas y almacenadas a temperaturas criogenicas. Las almuotas del banco de celulas se descongelaron para las pruebas de caracterizacion que inclrnan la viabilidad, la recuperacion, la esterilidad, la endotoxina, micoplasma, cariologfa y inmunofenotipo de marcador de superficie celular para garantizar la seguridad y la identidad. Las celulas se ensayaron a un paso temprano para patogenos virales por un metodo basado en PCR para detectar secuencias espedficas de acidos nucleicos para HIV-1, HIV-2, CMV, HBV, HCV, HTLV y EBV. Las celulas se almacenaron a temperaturas criogenicas hasta su uso y se prepararon para inyeccion inmediatamente antes de la administracion. Inmediatamente antes de las inyecciones a los animales, los viales de celulas se descongelaron en un bano de agua a 37 °C, y despues se lavaron con PBS. Las almuotas de la suspension de celulas se retiraron y se mezclan con azul de tripano y se contaron con un hemocitometro. La concentracion celular se ajusto a la densidad apropiada para la administracion. La solucion de vehmulo era o bien PBS o un vehmulo formador de hidrogel in situ derivado de los componentes de la cola de fibrina EVICEL® (sellador de fibrina EVICEL® (humano), Omrix Pharmaceuticals, Ltd.). Para cargar celulas en el hidrogel, las celulas se mezclaron con fibrinogeno humano (6,8-10,6 mg/ml) en PBS. Este reactivo se mezclo con trombina humana (0,4-0,6 U/ml) en PBS. La gelificacion se produjo poco despues de la mezcla.

Cirugia de puncion

[0210] En una sala de operaciones veterinaria, en condiciones quirurgicas esteriles y anestesia general, las espinas lumbares de los conejos fueron expuestas desde una aproximacion anterolateral izquierda. Se identifico el disco intervertebral L4-5 basado en su posicion relativa a la cresta ilfaca, y se pincho con una aguja de calibre 16 a una profundidad de 5 mm de tal manera que la punta de la aguja estaba en el centro del disco. La aguja entro en el disco paralelo a las placas terminales con el cefalica apuntado con bisel. Discos L3-4 y L2-3 se identificaron posteriormente por visualizacion directa y palpacion, y se punzo como anteriormente. Despues de la cirugfa, los conejos fueron alojados en grandes jaulas privadas que permiten el movimiento sin restricciones. La anulotoirna de IVD de un conejo por este metodo induce una lenta cascada de degeneracion, fiable, reproducible, demostrable por IRMs ponderadas de serie T2 (vease Masuda et al. Spine 2005; 30 (1): 514).

Cirugia de inyeccion

[0211] Los conejos en los grupos de tratamiento volvieron a cirugfa 3 semanas despues de la cirugfa inicial de puncion. La columna se expuso desde un abordaje anterolateral derecho (contralateral a la cirugfa de puncion anterior). Una jeringa Hamilton de microlitros 100 (1710TPLT; producto n° 81041) y una aguja aguda de calibre Hamilton 30 de punta afilada con un cubo de plastico (KF 730 NDL 6/paquete, 30G/2"; producto n° 90130) se utilizaron para las inyecciones terapeuticas en el centro de la NP. Para el grupo de vehmulo, 15 microlitros de hidrogel se hizo entrar en la jeringa, y se inyecto lentamente en cada disco (en menos de 4,5 minutos para facilitar la inyeccion de lfquido antes de la gelificacion). para las celulas + grupo de tampon (solucion salina tamponada de fosfato), celulas 105 en 15 microlitros de PBS esteril se inyectaron en cada disco. Para las celulas en el grupo de vehmulo, se inyectaron 105 celulas en 15 microlitros de vehmulo de hidrogel. Las inyecciones se realizaron bajo la grna de brazo C para confirmar que la aguja estaba en el centro del disco. Todas las inyecciones se realizaron a una velocidad deliberadamente lenta y constante durante el transcurso de un minuto para evitar un rapido incremento en la presion del disco y la extrusion posterior de los materiales. Los conejos fueron cerrados, revividos, y cuidados de la manera descrita para la cirugfa de puncion.

Imagen de resonancia magnetica

[0212] IRMs sagitales se obtuvieron en el tiempo 0 (antes de la puncion anular), 3 semanas (antes de la cirugfa de la inyeccion), 6 semanas, y 12 semanas (antes del sacrificio). Un iman de 3 Tesla Siemens y una bobina de rodilla estandar humana se utilizaron para obtener imagenes ponderadas de T1 (TR = 650 ms, TE = 14 ms, grosor de corte = 0,6 mm) y imagenes ponderadas T2 (TR = 3.800 ms, TE = 114 ms, grosor de corte = 0,6 mm). Los conejos fueron sedados y colocados en la bobina de la rodilla en la posicion supina. Las imagenes ponderadas T1 se utilizaron para comprobar cualitativamente la presencia de anomalfas oseas de la columna vertebral. Las imagenes ponderadas T2 se utilizaron para cuantificar la cantidad de degeneracion en los discos. La rebanada sagital media de las secuencias ponderadas T2 fue identificada por un medico entrenado en base a la anchura del cuerpo vertebral, la medula espinal, y las apofisis espinosas. Se empleo un metodo de segmentacion automatizado previamente validado para identificar el NP como la region de interes (vease Bechara et al. Am J Neuroradiology 2010; 31 (9): 1640-1644). El mdice de IRM se calcula como la suma del area de pfxeles multiplicada por la intensidad de pfxeles para cada pixel dentro de la region de interes. El porcentaje de area NP e mdice relativo IRM a los valores de control en la semana 0 se promediaron a traves de los tres discos de interes y se representaron frente a los puntos de tiempo. La significacion estadfstica se calculo con una prueba T de Student (p <0,05).

Sacrificio y procesamiento de la muestra

[0213] Todos los conejos fueron sacrificados 12 semanas despues de la cirugfa de puncion inicial (despues de

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obtenerse la IRM final). Inmediatamente despues de la muerte, las espinas fueron disecadas en bloque. El disco L4- 5 se preparo para el analisis histologico. Los discos se fijaron y se descalcificaron con DECALCIFIER I® (Surgipath Medical Indus., Inc.) durante dos semanas, luego deshidratados en procesador de tejidos de histologfa y embebidos en parafina. A continuacion, los discos se seccionaron a un espesor de 5 pm en el plano sagital. Las secciones se tineron con hematoxilina y eosina (H&E) (Sigma) usando el protocolo de histologfa estandar, y se fotografiaron usando un microscopio Nikon E800.

Biomecanica

[0214] Despues del sacrificio, el disco L3-4 se disecciono como una unidad espinal funcional (FSU, hueso-disco- hueso) para el analisis biomecanico. Las muestras se limpiaron de elementos posteriores, en resina epoxi, y se montaron con accesorios personalizados en una maquina de ensayo axial controlada con un Matlab (Matlab R2008a, The Mathworks, Inc., Natick, MA) programa de logica difusa. Todos los discos fueron envueltos en gasa empapada de salina para minimizar la deshidratacion, y la prueba se realizo en el mismo dfa que el sacrificio. Los espedmenes fueron acondicionados previamente con 20 ciclos de carga de compresion (de 0 a 1,0 MPa, 0,1 mm/s) y despues se sometieron a compresion constante (1,0 MPa) durante 1100 segundos. Este objetivo de carga se selecciono debido a que es comparable a las presiones experimentadas por IVD humana en las actividades de la vida diaria (ajustada para el tamano mas pequeno de los discos de conejo) (Wilke et al. Spine 1999; 24 (8): 755762). La fase inicial de rampa se definio como los primeros 200 microsegundos de la prueba, mientras que la fase de fluencia se definio como el resto de la prueba. Despues de las pruebas, las curvas de fluencia fueron equipadas con un modelo exponencial bifasico

imagen1

donde d(t) es el desplazamiento axial en el tiempo, Lo es la carga axial aplicada, Si y S2 son coeficientes elasticos de amortiguacion (N/mm), y qi y q2 son coeficientes de amortiguacion viscosos (Ns/mm). Curvas promedias se generaron y se equiparon con el modelo exponencial para cada condicion.

Resultados

Conejos

[0215] No se observaron efectos adversos en ningun grupo como resultado de tratamiento.

Resonancias magneticas

[0216] Las resonancias magneticas ponderadas sagital medio T1 de los discos L2-3, L3-4, y L4-5 no mostraron cambios significativos ni formacion de osteofitos. Las resonancias magneticas de sagital medio ponderadas T2 de los discos en el grupo de pinchado degeneraron (la ROI se oscurecio y se desplomo de 0 a 12 semanas), en comparacion con los controles no perforados. Todos los tres grupos de tratamiento demostraron menos degeneracion, cualitativamente, que el grupo de perforado, como se muestra en las Figuras 1 y 2. Los discos pinchados (y no tratados) mostraron la mayor degeneracion con una disminucion de 59% en el area NP y una disminucion del 64% en mdice de resonancia magnetica a traves de los puntos de tiempo. Los tres grupos de tratamiento mostraron menos degeneracion basandose tanto en el area NP total e mdice de IRM que el grupo de pinchado. El grupo de vehmulo + celulas tuvo la menor disminucion de la superficie y el mdice de IRM entre los grupos tratados y se pareda mas al grupo de control (Figura 3). A las 0 y 3 semanas no hubo diferencias estadfsticamente significativas en el mdice de resonancia magnetica o area entre control frente a cualquiera de los tres grupos de tratamiento y de puncion, o entre puncion vs. grupos de tratamiento. A las 6 y 12 semanas las diferencias tanto en el mdice de resonancia magnetica como en el area entre el control y la puncion fue estadfsticamente significativa, como era de esperar de un modelo de degeneracion valida. Los grupos de control y de soporte mostraron diferencias estadfsticamente significativas en el mdice IRM a 6 y 12 semanas, y en la zona a las 12 semanas. Los grupos de celulas de control y de tampon + eran estadfsticamente y significativamente diferentes en el mdice de resonancia magnetica a las 12 semanas. Los grupos de celulas de control y de tamon + fueron estadfsticamente y significativamente diferentes tanto en el mdice IRM como el area a las 6 y 12 semanas. Los grupos de puncion y vehmulos no mostraron diferencias estadfsticamente significativas en la cuantificacion de resonancia magnetica a traves de los puntos de tiempo. Los grupos de celulas de puncion y tampon + fueron estadfsticamente significativamente diferentes tanto en el mdice IRM como en el area a las 6 y 12 semanas. Los grupos de celulas de puncion y vehmulo + fueron significativamente diferentes en el mdice IRM y el area a las 12 semanas.

Biomecanica

[0217] Las curvas que representan desplazamientos totales de carga normaliza (fase inicial de rampa y fase de

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fluencia posterior) se muestran en la Figura 4. Hay una tendencia hacia diferencias entre los grupos. Espedficamente, la curva generada por los grupos de control es similar al vehnculo + grupo de celulas, el grupo pinchado es similar al tampon + grupo de celulas, y el grupo del vehnculo se encuentra entre estos grupos. La mayor parte de la variabilidad entre los grupos fue desde la fase inicial de rampa. A pesar de estas tendencias, cuando la fase de fluencia de la curva se encaja con un modelo exponencial de dos fases, los coeficientes de amortiguamiento primeros y viscosos finales y elasticos no dieron ninguna diferencia estadfsticamente significativa (datos no mostrados).

Histologia

[0218] Cortes sagitales representativos de disco L4-5 se tineron con hematoxilina y eosina (H&E) y se inspeccionaron a magnificacion 20x y 100x (Figuras 5, 6 y 7). Discos de control mantuvieron su arquitectura. Como era de esperar, los discos perforados demostraron perdida de celularidad y fibrosis en el NP, sugestivos de degeneracion. Discos perforados tratados con el vehnculo de hidrogel resultaron en cierta perdida de celularidad pero mantuvieron una matriz extracelular robusta. El tratamiento con celulas + tampon demostro preservacion relativa de area NP, aunque se observo fibrosis significativa. El tratamiento con celulas + vehnculo resulto en la mejora de la celularidad y la arquitectura en comparacion con discos perforados.

Discusion

[0219] Este ejemplo contiene una amplia y variada gama de medidas de resultado, incluyendo nueva tecnologfa de resonancia magnetica y la biomecanica, no solo para cuantificar degeneracion del disco invertertebral (IDD), sino tambien para mostrar una respuesta a un tratamiento dirigido por la degeneracion del disco. Como se discutio en detalle en este ejemplo, los grupos de tratamiento demostraron propiedades viscoelasticas que eran distintas de control y valores perforados.

[0220] En base a los criterios de IRM, histologicos, y biomecanicos, la inyeccion de discos lumbares intertebrales de conejo (IVD) sometidos a IDD con hUTC en un vehnculo tiene un efecto beneficioso en comparacion con cualquiera de vehnculo solo o celulas + tampon solo. Los tres tratamientos parecieron beneficiosos en comparacion con discos perforados no tratados. En la RM, el area de nucleo pulposo (NP) y el mdice para los tres grupos de tratamiento estaba entre las condiciones de control (no degenerado), y de puncion (mas degenerada), lo que indica que el tratamiento ayudo parcialmente a retrasar la altura del disco y los cambios de intensidad de la senal. La carga axial genero curvas de desplazamiento que eran distintas apareciendo para cada condicion. La histologfa mostro restauracion variable de la arquitectura de disco y celularidad con el tratamiento.

[0221] Las celulas + grupo PBS generaron datos de IRM que cayeron entre los valores de control y perforados, y tema un aspecto muy similar a los datos de IRM del grupo de vehnculo. Sin embargo, esta curva de desplazamiento del grupo era mas similar al estado pinchado, lo que sugiere que a pesar de este tratamiento ayudo a restaurar parcialmente area de NP y de intensidad de la senal en la RM, que no era muy eficaz en la restauracion de las propiedades mecanicas nativas del disco.

[0222] El grupo de vehnculo solo genero datos IRM que cayeron entre los valores perforados y no perforados. En el presente ejemplo, la curva de desplazamiento para el grupo de hidrogel tambien se redujo entre el estado perforado y no perforado, que indica que el vehnculo de hidrogel era capaz de restaurar algunas propiedades mecanicas al disco independiente de cualquier smtesis de la matriz extracelular por las celulas nativas o trasplantadas. La histologfa del grupo de vehnculo tiene mas celularidad lo que podna esperarse de un tratamiento no celular, lo que posiblemente indica que el hidrogel proporciona un refugio seguro en el que las celulas nativas podnan prosperar.

[0223] Las celulas + grupo de vehnculo incorporaron tanto el trasplante de celulas como la inyeccion de hidrogel de los otros dos grupos. Este grupo tema una tendencia consistente, pero no significativa hacia medidas degenerativas de resonancia magnetica que eran mejores que los otros dos grupos de tratamiento (mas parecidos al estado de control, aunque sigue siendo significativamente diferente de los valores de control). Este grupo tambien tuvo una curva de desplazamiento que era mas similar a la curva de control, lo que sugiere la mejor respuesta mecanica. La histologfa de este grupo tema un notable incremento en la celularidad en comparacion con el grupo de perforado y una preservacion relativa en arquitectura, pero no hay pruebas de la fibrosis.

[0224] No hubo evidencia histologica de una respuesta inmune generada a partir de trasplante de celulas humanas en un disco de conejo. Ninguno de los conejos tratados exhibio signos de enfermedad, y no hubo evidencia histologica de una respuesta inflamatoria.

[0225] El tejido de posparto umbilical humano es una fuente atractiva para celulas terapeuticas al ser tejido de donante facilmente disponible y las celulas se recogen facilmente sin los conflictos eticos que estan asociados con celulas madre embrionarias o fetales.

[0226] En resumen, el grupo pinchado se sometio a resonancia magnetica y pruebas histologicas de la degeneracion en comparacion con los controles no perforados, como se esperaba. Los grupos de tratamiento fueron sometidos a

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menos IRM y evidencia histologica de la degeneracion que el grupo de pinchado. Los grupos de tratamiento demostraron propiedades viscoelasticas que eran distintas de valores de control y perforados. Este estudio muestra que la inyeccion de IVDs lumbares de conejo perforados sometidos a la degeneracion con (a) hUTC e (b) hidrogel ralentiza el curso de la degeneracion IVD. La inyeccion de las celulas en hidrogel retarda la progresion de la degeneracion mas de cualquiera de (a) hUTC solo o (b) de hidrogel solo. Por lo tanto, este estudio demuestra que el tratamiento de los discos intervertebrales de conejo se punza con celulas derivados de tejido del cordon umbilical humano (hUTC), con y sin una solucion de vefnculo de hidrogel, ayuda a restaurar IRM, propiedades histologicas y biomecanicas a valores cercanos a los de los controles no perforados.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0227]

<110> BROWN, LAURA GOSIEWSKA, ANNA KIHM, ANTHONY J.

KRAMER, BRIAN

<120> TRATAMIENTO DE DEGENARATION DE DISCO INTERVERTEBRAL USANDO CELULAS DERIVADAS DE TEJIDO DEL CORDON UMBILICAL

<130> 18668-332000 (0244C1WO)

<140>

<141> 2012-5-18

<150> 13/111,933 <151> 2011-5-19

<150> 12/337,439 <151> 2008-12-17

<150> 61/016,849 <151> 2007-12-27

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Imprimacion sintetica <400> 1

gagaaatcca aagagcaaat gg 22

<210> 2 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Imprimacion sintetica <400> 2

agaatggaaa actggaatag g 21 <210> 3 <211> 20 <212> ADN

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<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Imprimacion sintetica <400> 3

tcttcgatgc ttcggattcc 20 <210>4 <211> 21 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Imprimacion sintetica <400> 4

gaattctcgg aatctctgtt g 21 <210> 5 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Imprimacion sintetica <400> 5

ttacaagcag tgcagaaaac c 21 <210> 6 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Imprimacion sintetica <400> 6

agtaaacatt gaaaccacag cc 22 <210>7 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Imprimacion sintetica <400> 7

tctgcagctc tgtgtgaagg 20

<210>8 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Imprimacion sintetica <400> 8

cttcaaaaac ttctccacaa cc 22 <210>9 <211> 17 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Imprimacion sintetica <400> 9

cccacgccac gctctcc 17 <210> 10 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Imprimacion sintetica <400> 10

tcctgtcagt tggtgctcc 19

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REIVINDICACIONES

1. Un hidrogel y una poblacion homogenea aislada de celulas obtenidas a partir de tejido del cordon umbilical humano, o una composicion farmaceutica que comprende dicho hidrogel y poblacion homogenea aislada de celulas, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o condicion relacionada con la degeneracion del disco intervertebral, en la que el tratamiento comprende la mejora de la celularidad y la arquitectura de un disco degenerado,

en el que el tejido del cordon umbilical esta sustancialmente libre de sangre y la poblacion homogenea aislada de celulas es capaz de autorrenovacion y expansion en cultivo, tiene el potencial de diferenciarse y no expresa CD117 o telomerasa.
2. El hidrogel y la poblacion de celulas o composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 1, en la que la poblacion aislada de celulas tiene una o mas de las siguientes caractensticas:

(a) expresa reticulon, ligando del receptor de quimioquinas 3, y/o protema quimiotactica de granulocitos;

(b) no produce CD31, CD34 y HLA-DR;

(c) expresa, con relacion a un fibroblasto humano, celulas madre mesenquimales, o celulas de medula osea de cresta ilfaca, niveles incrementados de interleucina 8 y reticulon 1; y

(d) expresa CD10, CD13, CD44, CD73, y CD90.
3. El hidrogel y la poblacion de celulas o composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, donde el tratamiento comprende la administracion de la composicion farmaceutica por inyeccion.
4. La composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 1, donde la composicion farmaceutica comprende ademas al menos otro tipo celular y/o al menos un agente.
5. El hidrogel y la poblacion de celulas o composicion farmaceutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tratamiento comprende la administracion del hidrogel y la poblacion de celulas o composicion farmaceutica en un disco intervertebral degenerado, opcionalmente en el nucleo pulposo o en el anillo fibroso del disco intervertebral.
6. El hidrogel y la poblacion de celulas o composicion farmaceutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas la induccion de la poblacion homogenea aislada de celulas obtenidas de tejido del cordon umbilical humano para al menos parcialmente diferenciarse in vitro, donde opcionalmente la poblacion homogenea aislada de celulas se induce para diferenciarse en celulas que muestran un fenotipo de celulas de anillo fibroso o un fenotipo de celulas del nucleo pulposo.
7. El hidrogel y la poblacion de celulas para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tratamiento comprende la administracion del hidrogel simultaneamente con, o antes de, o despues de la poblacion homogenea aislada de celulas obtenidas a partir de tejido del cordon umbilical humano.
8. El hidrogel y la poblacion de celulas para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tratamiento comprende la administracion de la poblacion homogenea aislada de celulas dentro de un dispositivo implantable.
9. El hidrogel y la poblacion de celulas para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tratamiento comprende ademas la administracion de al menos otro tipo de celulas simultaneamente con, o antes de, o despues de la poblacion homogenea aislada de celulas obtenidas a partir de tejido del cordon umbilical humano.
10. El hidrogel y la poblacion de celulas o composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 4 o 9, donde el al menos otro tipo de celula se ha disenado para expresar al menos un producto exogeno del gen, en el que opcionalmente el producto del gen exogeno es un factor trofico.
11. El hidrogel y la poblacion de celulas para el uso de la reivindicacion 10, donde el producto de gen exogeno modula la expresion de una o mas protemas de matriz extracelular.
12. El hidrogel y la poblacion de celulas para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tratamiento comprende ademas la administracion de al menos un agente.
13. El hidrogel y la poblacion de celulas o composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 4 o la reivindicacion 12, donde el al menos un agente es un factor trofico, opcionalmente seleccionado del grupo que consiste de TGF-beta, GDF-5, PDGF-BB y TIMP-1, donde opcionalmente el factor trofico ejerce efecto atrofico en la poblacion celular homogenea aislada obtenida a partir de tejido del cordon umbilical humano.
14. El hidrogel y la poblacion de celulas o composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 1, donde el hidrogel comprende fibrinogeno y trombina y/o cola de fibrina.