ES2628129T3 - Tratamiento de la enfermedad vascular periférica utilizando células derivadas del posparto - Google Patents

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Abstract

Células derivadas del posparto derivadas de tejido del cordón umbilical humano libre de sangre, para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene isquemia periférica, en el que las células: son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo; tienen el potencial de diferenciarse en células de al menos un fenotipo de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular; requieren L-valina para el crecimiento; pueden crecer en al menos aproximadamente un 5 % de oxígeno; tienen una expresión aumentada de interleucina 8 y de reticulón 1 en relación con una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimatosa o una célula de la médula ósea de la cresta ilíaca; producen CD10, CD13, CD44, CD73 y CD90; y no producen CD45 y CD117.

Description

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Tratamiento de la enfermedad vascular periferica utilizando celulas derivadas del posparto Descripcion
CAMPO DE LA INVENCION
La invencion se refiere al campo de la terapia regenerativa o basada en celulas para pacientes con enfermedad vascular periferica, especialmente aquellos con isquemia periferica. En particular, la invencion proporciona celulas derivadas de tejido de cordon umbilical humano posparto que tiene la capacidad de estimular y soportar la angiogenesis, mejorar el flujo sangumeo, regenerar, reparar y mejorar el musculo esqueletico danado por un acontecimiento isquemico periferico y proteger el musculo esqueletico frente al dano isquemico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
A lo largo de la memoria descriptiva se citan diversas publicaciones, incluyendo patentes, solicitudes publicadas, artmulos tecnicos y artmulos academicos.
La enfermedad vascular periferica (DVP) puede deberse a una oclusion aterosclerotica de los vasos sangumeos, particularmente en las extremidades y areas distales del corazon, que da como resultado una disminucion del flujo sangumeo e insuficiente perfusion de oxfgeno a los tejidos en las proximidades y en zonas posteriores a la oclusion. La PVD se manifiesta con frecuencia en los vasos sangumeos ilfacos, vasos sangumeos femorales y poplfteos, y vasos sangumeos subclavios, y sus efectos pueden agravarse por trombos, embolias o traumatismos. Se estima que aproximadamente 8-12 millones de personas en Estados Unidos, especialmente entre la poblacion anciana y aquellos con diabetes, estan afectados por PVD.
Entre los smtomas mas frecuentes de PVD incluyen calambres en las extremidades superiores e inferiores, entumecimiento, debilidad, fatiga muscular, dolor en los miembros y extremidades, hipotermia en los miembros extremidades, decoloracion de las extremidades, piel seca o escamosa e hipertension. El smtoma mas frecuente es la claudicacion, o sensacion de dolor, opresion y fatiga en los musculos posteriores al vaso sangumeo ocluido que se produce durante algun tipo de ejercicio, tal como caminar, pero desaparece espontaneamente despues de un penodo de descanso.
En terminos de fisiopatologfa, los vasos sangumeos ocluidos causan isquemia de los tejidos en el sitio y distal a la obstruccion. Esta isquemia se denomina, generalmente, isquemia periferica, lo que significa que se produce en lugares distales al corazon. La gravedad de la isquemia es una funcion del tamano y el numero de obstrucciones, este la obstruccion cerca de un musculo u organo y si hay suficiente vasculatura redundante. En los casos mas graves, la isquemia da como resultado la muerte de los tejidos afectados y puede dar lugar a la amputacion de los miembros afectados o incluso la muerte del paciente.
Los metodos actuales para el tratamiento de los casos mas graves de PVD incluyen regfmenes quimioterapeuticos, angioplastia, insercion de endoprotesis vasculares, cirugfa reconstructiva, injertos de derivacion coronaria, reseccion de tejidos afectados o amputacion. Desafortunadamente, para muchos pacientes, estas intervenciones muestran un exito limitado y muchos pacientes experimentan un empeoramiento de las condiciones o smtomas.
En la actualidad, existe interes en utilizar celulas madre, que pueden dividirse y diferenciarse, o celulas musculares de otras fuentes, incluyendo celulas de musculos lisos y esqueleticos, para ayudar a la reparacion o reversion de dano tisular. Se puede utilizar el trasplante de celulas madre como herramienta clmica para reconstituir un tejido diana, restableciendo de este modo la funcionalidad fisiologica y anatomica. La aplicacion de la tecnologfa de celulas madre es amplia e incluye ingeniena de tejidos, liberacion de terapia genica y terapia celular, es decir, liberacion de agentes bioterapeuticos en un lugar objetivo a traves de celulas vivas o componentes celulares suministrados exogenamente que producen o contienen dichos agentes (para una revision, vease Tresco, P.A. et al., (2000) Advanced Drug Delivery Reviews 42:2-37). La identificacion de celulas madre ha estimulado la investigacion dirigida a la generacion selectiva de tipos espedficos de celulas para la medicina regenerativa.
Un obstaculo para la realizacion del potencial terapeutico de la tecnologfa de celulas madre ha sido la dificultad de obtener un numero suficiente de celulas madre. El tejido embrionario o fetal es una fuente de celulas madre. Se han aislado celulas madre y progenitoras embrionarias de varias especies de mairnferos, incluyendo seres humanos, y se ha demostrado que varios tipos de celulas de este tipo son capaces de autorrenovacion y expansion, asf como diferenciacion en un numero de diferentes linajes celulares. Pero la derivacion de celulas madre de fuentes embrionarias o fetales ha planteado muchos problemas eticos y morales que es deseable evitar al identificar otras fuentes de celulas multipotenciales o pluripotenciales.
Los tejidos posparto, tal como el cordon umbilical y la placenta, han generado interes como fuente alternativa de celulas madre. Por ejemplo, se han descrito metodos para la recuperacion de celulas madre mediante perfusion de la placenta o recoleccion de sangre o tejido de cordon umbilical. Una limitacion de la obtencion de celulas madre de estos metodos ha sido un volumen inadecuado de sangre de cordon umbilical o de cantidad de celulas obtenidas,
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asf como heterogeneidad o carencia de caracterizacion de las poblaciones de celulas obtenidas a partir de esas fuentes.
En el documento US 2005/0058631 se describen celulas posparto derivadas de tejido placentario.
Una fuente fiable, bien caracterizada y abundante de poblaciones sustancialmente homogeneas de tales celulas que tienen la capacidad de diferenciarse en una serie de musculos esqueleticos, pericitos o linajes vasculares sena una ventaja en diversas aplicaciones diagnosticas y terapeuticas para la reparacion, regeneracion y mejora del musculo esqueletico, para la estimulacion y/o soporte de la angiogenesis, y para la mejora del flujo sangumeo posterior a un acontecimiento isquemico periferico, particularmente en pacientes con PVD.
SUMARIO DE LA INVENCION
La invencion proporciona celulas derivadas de posparto derivadas de tejido del cordon umbilical humano libre de sangre, para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene isquemia periferica, en el que las celulas:
son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo; tienen el potencial de diferenciarse en celulas de al menos un vascular, pericito o endotelio vascular; requieren L-valina para el crecimiento;
puede crecer en al menos aproximadamente un 5 % de oxfgeno; tienen una expresion aumentada de interleucina 8 y de reticulon fibroblasto, una celula madre mesenquimatosa o una celula de la producen CD10, CD13, CD44, CD73 y CD90; y no producen CD45 y CD117.
La invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene isquemia periferica, que comprende un vehnculo farmaceuticamente aceptable y celulas derivadas del posparto de la invencion.
La invencion tambien proporciona un kit para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene isquemia periferica, comprendiendo el kit un vetnculo farmaceuticamente aceptable, una poblacion de celulas derivadas del posparto como se ha definido anteriormente e instrucciones para usar el kit en un metodo de tratamiento del paciente.
Un aspecto de la divulgacion presenta un metodo para tratar a un paciente que tiene una enfermedad vascular periferica, comprendiendo el metodo administrar al paciente las celulas derivadas del posparto una cantidad eficaz para tratar la enfermedad vascular periferica, en el que las celulas derivadas del posparto se obtienen de placenta humana o tejido de cordon umbilical sustancialmente exento de sangre, en el que las celulas son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo y tienen el potencial de diferenciarse en celulas de al menos un fenotipo de musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericito o endotelio vascular; en el que las celulas requieren L-valina para su crecimiento y pueden crecer en al menos aproximadamente 5 % de oxfgeno; en el que las celulas comprenden ademas al menos una de las siguientes caractensticas: (a) potencial para al menos aproximadamente 40 duplicaciones en cultivo; (B) union y expansion en un vaso de cultivo de tejidos recubierto o no recubierto, en el que el vaso de cultivo de tejidos recubiertos comprende un revestimiento de gelatina, laminina, colageno, poliornitina, vitronectina o fibronectina; (c) produccion de al menos uno de factor tisular, vimentina y alfa-actina de musculo liso; (d) produccion de al menos uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A, B, C; (e) ausencia de produccion de al menos uno de CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7- H2, HLA-G y HLA-DR, DP, DQ, segun se detecta mediante citometna de flujo; (f) expresion de un gen, que, en relacion con una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimatosa o una celula de la medula osea de cresta ilfaca, se incrementa para al menos uno de un gen que codifica: interleucina 8; reticulon 1; ligando 1 de quimiocina (motivo C-X-C) (actividad estimulante del crecimiento del melanoma, alfa); ligando 6 de quimiocina (motivo C - X - C) (protema 2 quimiotactica de granulocitos); ligando 3 de quimiocina (motivo C - X - C); factor de necrosis tumoral, protema 3 inducida por alfa; miembro 2 de la superfamilia de lectina de tipo C; tumor de Wilms 1; miembro A2 de la familia de aldehndo deshidrogenasa 1; renina; receptor 1 de lipoprotemas de baja densidad oxidadas; clon IMAGE: 4179671 de Homo sapiens; protema quinasa C zeta; protema hipotetica DKFZp564F013; regulado negativamente en el cancer de ovario 1; y el gen de Homo sapiens del clon DKFZp547k1113 (g) la expresion de un gen que, en relacion con una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimatosa o una celula de medula osea de cresta ilfaca, se encuentra reducida para al menos uno de un gen que codifica: homeocaja 2 de estatura baja; protema del choque termico de 27 kDa; ligandos 12 de quimiocina (motivo C-X-C) (factor 1 derivado de celulas estromales); elastina (estenosis aortica supravalvular, smdrome de Williams-Beuren); ARNm de Homo sapiens; ADNc de DKFZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022); homeocaja 2 del mesenquima (homeocaja espedfica del cese de crecimiento); homologo 1 de la homeocaja sine oculis (Drosophila); alfa B cristalina; activador 2 asociado “disheveled” de la morfogenesis 2; protema DKFZP586B2420; similar a neuralina 1; tetranectina (protema de union a plasminogeno); dominio 3 de homologfa con src (SH3) y rico en cistemas; colesterol 25- hidroxilasa; factor de transcripcion relacionado con el enanismo 3; receptor de interleucina 11, alfa; potenciador de la procolageno C-endopeptidasa; homologo Frizzled 7 (Drosophila); gen
fenotipo de musculo esqueletico, musculo liso
1 en relacion con una celula humana que es un medula osea de la cresta ilfaca;
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hipotetico BC008967; colageno, tipo VIII, alfa 1; tenascina C (hexabraquina) ; protema 5 de la homeocaja iroquesa; hefaestina; integrina, beta 8; glucoprotema 2 de vesmulas sinapticas; neuroblastoma, supresion de tumorigenicidad 1; protema 2 de union al factor de crecimiento similar a la insulina de 36kDa; ADNc de Homo sapiens FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744; factor 1 similar a receptores de citocinas; canal activado por calcio de conductancia intermedia/pequena de potasio, subfamilia N, miembro 4; integrina, beta 7; coactivador transcripcional con motivo de union a PDZ (TAZ) ; homologo 2 de la homeocaja de sine oculis (Drosophila); ; protema KIAA1034; protema 5 de membrana asociada a vesmula (miobrevina) ; protema 1 de la matriz extracelular similar a fibulina que contiene EGF; respuesta 3 de crecimiento temprano; homeocaja 5 de distal-less; protema hipotetica FLJ20373; miembro C3 de la familia 1 de la aldo-ceto reductasa (3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo II); biglicano; coactivador transcripcional con motivo de union a PDZ (TAZ) ; fibronectina 1; proencefalina; integrina, beta similar a 1 (con dominios de repeticion similares a EGF); clon de ADNc de inserto de longitud completa de ARNm de Homo sapiens EUROIMAGE 1968422; EphA3; protema KIAA0367; receptor C de peptido natriuretico/guanilato ciclasa C (receptor C de peptido natriuretico); protema hipotetica FLJ14054; ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp564B222 (del clon DKFZp564B222) ; similar a la protema 3 de interaccion con BCL2/adenovirus E1B de 19 kDa; protema 1 de union a AE; y/o polipeptido 1 de la subunidad VIIa de citocromo c oxidasa (musculo); similar a neuralina 1; B gen 1 de translocacion celular; protema hipotetica FLJ23191; y DKFZp586L151; (h) secrecion de al menos una de MCP-1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1a, RANTES y TIMP1; y (i) ausencia de secrecion de al menos uno de TGF-beta2, ANG2, PDGFbb, MIP1b, I309, MDC y VEGF, detectado mediante ELISA.
En una realizacion particular, la enfermedad vascular periferica es isquemia periferica. En ciertas realizaciones, las celulas se inducen in vitro para diferenciarse en musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericito o celulas de linaje endotelial vascular antes de la administracion. En otras realizaciones, las celulas se manipulan geneticamente para producir un producto genico que estimula el tratamiento de la enfermedad vascular periferica.
En algunas realizaciones del metodo, las celulas se administran con al menos otro tipo celular, que puede incluir celulas del musculo esqueletico, celulas progenitoras del musculo esqueletico, celulas del musculo liso vascular, celulas progenitoras del musculo liso vascular, pericitos, celulas endoteliales vasculares, celulas progenitoras del endotelio vascular u otras celulas madre multipotenciales. El otro tipo de celula puede administrarse simultaneamente o antes o despues de las celulas derivadas del posparto.
En otras realizaciones, las celulas se administran con al menos otro agente, que puede ser un agente antitrombogenico, un agente antiinflamatorio, un agente inmunosupresor, un agente inmunomodulador, un agente proangiogenico o un agente antiapoptotico, por ejemplo. El otro agente puede administrarse simultaneamente o antes o despues de las celulas derivadas del posparto.
Preferentemente se administran en los sitios de la isquemia periferica o proximal a los mismos, pero tambien se pueden administrar en sitios distales a la isquemia periferica. Pueden administrarse mediante inyeccion, infusion, un dispositivo implantado en el paciente o mediante implantacion de una matriz o armazon que contiene las celulas. Las celulas pueden ejercer un efecto trofico, tal como proliferacion, en el musculo esqueletico, musculo liso vascular o endotelio vascular del paciente. Las celulas pueden inducir la migracion de las celulas del musculo esqueletico, las celulas del musculo liso vascular, las celulas endoteliales vasculares, las celulas progenitoras del musculo esqueletico, los pericitos, las celulas progenitoras del musculo liso vascular o las celulas progenitoras del endotelio vascular al sitio o sitios de la enfermedad vascular periferica, tal como isquemia periferica.
Otro aspecto de la invencion presenta composiciones farmaceuticas y kits para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad vascular periferica, que comprende un vehmulo farmaceuticamente aceptable y las celulas derivadas del posparto descritas anteriormente. En algunas realizaciones preferidas, las preparaciones comprenden FGF y HGF. Las composiciones farmaceuticas y los kits se disenan y/o se formulan para practicar los metodos de la divulgacion como se ha descrito anteriormente.
De acuerdo con otro aspecto de la divulgacion, los metodos descritos anteriormente se pueden practicar usando una preparacion hecha de las celulas derivadas del posparto, en los que la preparacion comprende un lisado celular de las celulas derivadas del posparto, una matriz extracelular de las celulas derivadas del posparto o un medio acondicionado en el que se cultivaron las celulas derivadas del posparto. Se prefiere que tales preparaciones comprendan FGF y HGF.
Otros aspectos de la divulgacion incluyen composiciones farmaceuticas y kits que contienen preparaciones que comprenden lisados celulares, matrices extracelulares o medios acondicionados de las celulas derivadas del posparto.
Otras caractensticas y ventajas de la invencion se entenderan con referencia a la descripcion detallada y ejemplos siguientes.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra el efecto del lote hUTC n.° 120304, MSC y fibroblastos sobre la proliferacion de celulas
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endoteliales. Las celulas endoteliales se sembraron en el fondo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos a una densidad de 5000 celulas/cm2 (10.000 celulas/pocillo) y hUTC lote n.° 120304, MSC o fibroblastos dentro de los insertos transwell a una densidad de 5000 celulas/cm2 (1.650 celulas/inserto) en medio de cocultivo (Hayflick 80 % + EGM-2MV 20 % o Hayflick 50 % + EGM-2MV 50 %). Despues de 7 dfas de cocultivo, las celulas se cosecharon y se contaron usando un instrumento de Guava. Las celulas endoteliales tambien se mantuvieron en medio EGM-2MV como control positivo. A, HUVEC. B, HCAEC. C, HIAEC.
La figura 2 muestra el efecto del lote hUTC n.° 120304, y anticuerpos neutralizantes sobre la proliferacion de celulas endoteliales. Se sembraron HUVEC o HCAEC en el fondo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos a una densidad de 5000 celulas/cm2 (10.000 celulas/pocillo) y hUTC lote n.° 120304, dentro de los insertos transwell a una densidad de 5000 celulas/cm2 (1.650 celulas/inserto) en medio de cocultivo (Hayflick 50 % + EGM-2MV 50 %). Tambien se anadieron anticuerpos neutralizantes a FGF (7 pg/ml), HGF (1 pg/ml) o VEGF (1 pg/ml) en este momento. Despues de 7 dfas de cocultivo, las celulas se cosecharon y se contaron usando un instrumento de Guava. Las celulas endoteliales tambien se mantuvieron en medio EGM-2MV como control positivo. Se muestran las celulas tratadas con factor de crecimiento solo y factor de crecimiento mas anticuerpos neutralizantes. A, HUVEC. B, HCAEC.
La figura 3 muestra el efecto del lisado de celulas de hUTC lote n.° 120304 y de anticuerpos neutralizantes sobre la proliferacion de HUVEC. Se sembraron HUVEC en el fondo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos a una densidad de 5000 celulas/cm2 (10.000 celulas/pocillo) en medio EGM - 2MV durante 8 horas. A continuacion, se mantuvo a las celulas sin suero mediante incubacion durante la noche en 0,5 ml de medio EGM-2MV que contema FBS al 0,5 % y sin factores de crecimiento. Posteriormente, se anadieron FBS, lisados celulares de hUTC lote n.° 120304 recien preparados y anticuerpos neutralizantes de FGF (7 pg/ml) o HGF (1 pg/ml). Despues de 4 dfas de cocultivo, las celulas se cosecharon y se contaron usando un instrumento de Guava. Barras de color gris claro, controles de medios. Barras de color gris medio, HUVEC incubadas con lisado que contiene 62,5 pg de protema. Barras de color gris oscuro, HUVEC incubadas con lisado que contiene 125 pg de protema.
La figura 4 muestra el efecto de hUTC y MSC sobre la migracion de celulas endoteliales. Se sembraron HUVEC o HCAEC en los insertos transwell a una densidad de 5000 celulas/cm2 (23.000 celulas/inserto) y hUTC lote n.° 120304 o MSC en el fondo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos a una densidad de 5000 celulas/cm2 (48.000 celulas/pocillo) en medio de cocultivo (Hayflick 50 % + EGM-2MV 50 %). Despues de 7 dfas de cocultivo, se cosecharon las celulas que estaban en la parte inferior del inserto de transwell y se contaron usando un instrumento de Guava. Las celulas endoteliales tambien se mantuvieron en medio EGM-2MV como control. A, HUVEC. B, HCAEC.
La figura 5 muestra el efecto del lote hUTC n.° 120304, y anticuerpos neutralizantes sobre la migracion de celulas endoteliales. Se sembraron HUVEC o HCAEC en los insertos transwell a una densidad de 5000 celulas/cm2 (23.000 celulas/inserto) y hUTC lote n.° 120304 en el fondo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos a una densidad de 5000 celulas/cm2 (48.000 celulas/pocillo) en medio de cocultivo (Hayflick 50 % + EGM-2MV 50 %). Tambien se anadieron anticuerpos neutralizantes a FGF (7 pg/ml) o HGF (1 pg/ml) en este momento. Despues de 7 dfas de cocultivo, se cosecharon las celulas que estaban en la parte inferior del inserto de transwell y se contaron usando un instrumento de Guava. Las celulas endoteliales tambien se mantuvieron en medio EGM-2MV como control. A, HUVEC. B, HCAEC.
DESCRIPCION DETALLADA
A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones se usan diversos terminos. Dichos terminos tendran el significado habitual en la materia, a menos que se indique lo contrario. Otros terminos definidos espedficamente deben interpretarse de forma consistente con la definicion proporcionada en el presente documento.
Las celulas madre son celulas indiferenciadas definidas por la capacidad de una sola celula tanto para autorrenovarse como para diferenciarse para producir celulas descendientes, incluidas celulas progenitoras autorrenovantes, progenitoras no renovantes y celulas terminalmente diferenciadas. Las celulas madre tambien se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en celulas funcionales de diversos linajes celulares a partir de multiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), asf como para dar lugar a los tejidos de multiples capas germinales despues del trasplante y para contribuir sustancialmente a la mayona, si no todos, los tejidos despues de inyectarse en blastocistos.
Las celulas madre se clasifican por su potencial de desarrollo como: (1) totipotenciales; (2) pluripotenciales; (3) multipotenciales; (4) oligopotenciales; y (5) unipotenciales. Las celulas totipotenciales son capaces de dar lugar a todos los tipos de celulas embrionarias y extraembrionarias. Las celulas pluripotenciales son capaces de dar lugar a todos los tipos de celulas embrionarias. Las celulas multipotenciales son capaces de dar lugar a un subconjunto de linajes celulares, pero todos dentro de un tejido, organo o sistema fisiologico concreto. Por ejemplo, las celulas madre hematopoyeticas (HSC) pueden producir una descendencia que incluye HSC (autorrenovantes), progenitoras oligopotenciales limitadas a celulas sangumeas, y todos los tipos de celulas y elementos (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre. Las celulas que son oligopotenciales son capaces de dar lugar a un subconjunto mas restringido de linajes celulares que las celulas madre multipotenciales; Las celulas que son unipotenciales son capaces de dar lugar a un unico linaje celular (por ejemplo, celulas madre espermatogenicas).
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Las celulas madre tambien se clasifican en base a la fuente de la que pueden obtenerse. Una celula madre adulta es, generalmente, una celula indiferenciada multipotencial que se encuentra en tejido que comprende multiples tipos de celulas diferenciadas. La celula madre adulta puede autorrenovarse. En circunstancias normales, tambien puede diferenciarse para producir los tipos especializados de celulas del tejido del que se originaron y, posiblemente, otros tipos de tejidos. Una celula madre embrionaria es una celula pluripotencial de la masa celular interna de un embrion en fase de blastocisto. Una celula madre fetal es la que procede de tejidos o membranas fetales. Una celula madre posparto es una celula multipotencial o pluripotencial que procede sustancialmente de tejido extraembrionario disponible despues del nacimiento, a saber, la placenta y el cordon umbilical. Se ha descubierto que estas celulas poseen rasgos caractensticos de las celulas madre pluripotenciales, incluidos la rapida proliferacion y el potencial de diferenciarse a muchos linajes celulares. Las celulas madre posparto pueden ser de origen sangumeo (por ejemplo, como las obtenidas a partir de sangre de cordon umbilical) o de origen no sangumeo (por ejemplo, como las obtenidas a partir de tejidos no sangumeos del cordon umbilical y la placenta).
El tejido embrionario se define, por lo general, como tejido de origen embrionario (que en los seres humanos se refiere al penodo desde la fertilizacion hasta aproximadamente seis semanas de desarrollo). Tejido fetal se refiere a tejido de origen fetal, que en los seres humanos se refiere al penodo desde aproximadamente seis semanas de desarrollo hasta el parto. El tejido extraembrionario es el tejido asociado con, pero no procedente de, el embrion o el feto. Los tejidos extraembrionarios incluyen las membranas extraembrionarias (corion, amnios, saco vitelino y alantoides), el cordon umbilical y la placenta (que se forma a partir del corion y de la decidua basal materna).
La diferenciacion es el proceso mediante el cual una celula no especializada ("no comprometida") o menos especializada adquiere las caractensticas de una celula especializada, tal como una celula nerviosa o una celula muscular, por ejemplo. Una celula diferenciada es la que ha adquirido una posicion mas especializada ("comprometida") dentro del linaje de una celula. El termino comprometida, cuando se aplica al proceso de diferenciacion, se refiere a una celula que ha avanzado en la via de diferenciacion hasta un punto en la que, en circunstancias normales, continuara diferenciandose hasta un tipo de celula o subconjunto de tipos de celulas espedfico, y no puede, en circunstancias normales, diferenciarse a un tipo de celula diferente o volver a un tipo de celula menos diferenciada. Desdiferenciacion se refiere al proceso mediante el cual una celula vuelve a una posicion menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una celula. Tal como se utiliza en el presente documento, el linaje de una celula define la herencia de la celula, es decir, de que celulas procedfa y a que celulas puede dar lugar. El linaje de una celula coloca a la celula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciacion.
En un sentido amplio, una celula progenitora es una celula que tiene la capacidad de crear una descendencia que esta mas diferenciada que ella misma y que, sin embargo, conserva la capacidad de reponer la reserva de progenitoras. Segun esta definicion, las propias celulas madre tambien son celulas progenitoras, ya que son las precursoras mas inmediatas a las celulas terminalmente diferenciadas. Cuando se hace referencia a las celulas de la presente invencion, tal como se describen con mayor detalle mas adelante, puede utilizarse esta definicion amplia de celula progenitora. En un sentido mas estricto, una celula progenitora suele definirse como una celula que es una celula intermedia en la via de diferenciacion, es decir, que surge de una celula madre y es una celula intermedia en la produccion de un tipo de celula o un subconjunto de tipos de celulas maduras. Este tipo de celula progenitora no es capaz, en general, de autorrenovarse. Por consiguiente, si se hace referencia a este tipo de celula en el presente documento, se denominara celula progenitora no renovante o celula progenitora intermedia o celula precursora.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion se diferencia a un linaje mesodermico, ectodermico o endodermico se refiere a una celula que se compromete a un linaje mesodermico, ectodermico o endodermico espedfico, respectivamente. Entre los ejemplos de celulas que se diferencian a un linaje mesodermico o dan lugar a celulas mesodermicas espedficas se incluyen, pero no se limitan a las mismas, celulas que son adipogenicas, condrogenicas, cardiogenicas, dermatogenicas, hematopoyeticas, hemangiogenicas, miogenicas, nefrogenicas, urogenitogenicas, osteogenicas, pericardiogenicas o estromales. Entre los ejemplos de celulas que se diferencian al linaje ectodermico se incluyen, pero no se limitan a las mismas, celulas epidermicas, celulas neurogenicas y celulas neurogliagenicas. Entre los ejemplos de celulas que se diferencian al linaje endodermico se incluyen, pero no se limitan a las mismas, celulas pleurigenicas, celulas hepatogenicas, celulas que dan lugar al revestimiento del intestino y celulas que dan lugar a celulas pancreogenicas y esplacnogenicas.
Las celulas de la presente invencion se denominan, generalmente, celulas posparto o celulas derivadas posparto (PPDC). En ocasiones tambien se pueden denominar de un modo mas espedfico celulas derivadas del cordon umbilical (UDC) de la invencion o celulas derivadas de la placenta (PDC) de la divulgacion. Las PPDC de la invencion son celulas derivadas del cordon umbilical. Ademas, las celulas pueden describirse como celulas madre o progenitoras, utilizandose esta ultima expresion en el sentido amplio. El termino derivada(s) se utiliza para indicar que las celulas se han obtenido de su fuente biologica y se han cultivado o manipulado de otra manera in vitro (por ejemplo, se han cultivado en un medio de crecimiento para expandir la poblacion y/o para producir una lmea celular). Mas adelante se describen detalladamente las manipulaciones in vitro de celulas madre de cordon umbilical y las caractensticas unicas de las celulas derivadas del cordon umbilical de la presente invencion.
Pericitos, tambien conocidos en la materia como celulas Rouget o celulas murales, se refieren a las celulas que se
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encuentran tfpicamente incrustadas dentro de la membrana basal vascular de los microvasos sangumeos (Armulik A et al. (2005) Circ. Res. 97:512-23), que se cree desempenan un papel en, entre otras cosas, la comunicacion/senalizacion con las celulas endoteliales, vasoconstriccion, vasodilatacion, la regulacion del flujo sangumeo, la formacion y desarrollo de la vasculatura sangumea, la angiogenesis y la diferenciacion endotelial y detencion del crecimiento (Bergers G et al. (2005) Neuro-Oncology 7:452-64).
Se utilizan diversos terminos y expresiones para describir las celulas en cultivo. Cultivo celular se refiere, en general, a celulas sacadas de un organismo vivo y cultivadas en condiciones controladas ("en cultivo" o “cultivadas”). Un cultivo de celulas primarias es un cultivo de celulas, tejidos u organos sacados directamente de uno o mas organismos antes del primer subcultivo. Las celulas se expanden en cultivo cuando se colocan en un medio de crecimiento en condiciones que facilitan el crecimiento y/o la division celular, lo que da como resultado una poblacion mayor de las celulas. Cuando las celulas se expanden en cultivo, la tasa de proliferacion celular se mide, a veces, por la cantidad de tiempo necesario para que las celulas dupliquen su numero. Esto se conoce como tiempo de duplicacion.
Una tfnea celular es una poblacion de celulas formada mediante uno o mas subcultivos de un cultivo de celulas primarias. Cada ronda de subcultivo se denomina pase. Cuando se subcultivan las celulas, se dice que han sido sometidas a pases. Una poblacion espedfica de celulas, o una lmea celular, se denomina o caracteriza a veces por el numero de veces que se ha sometido a pases. Por ejemplo, una poblacion de celulas cultivadas que se ha sometido a pases diez veces puede denominarse cultivo P10. El cultivo primario, es decir, el primer cultivo despues del aislamiento de las celulas a partir del tejido, se designa P0. Despues del primer subcultivo, las celulas se describen como cultivo secundario (P1 o pase 1). Despues del segundo subcultivo, las celulas se convierten en un cultivo terciario (P2 o pase 2), y asf sucesivamente. Los expertos en la materia entenderan que puede haber muchas duplicaciones de poblacion durante el penodo de pases; por lo tanto, el numero de duplicaciones de la poblacion de un cultivo es superior al numero de pases. La expansion de las celulas (es decir, el numero de duplicaciones de la poblacion) durante el periodo entre pases depende de muchos factores, incluidos, pero no limitados a los mismos, la densidad de siembra, el sustrato, el medio, las condiciones de crecimiento y el tiempo entre pases.
Un medio acondicionado es un medio en el que se ha cultivado una celula o poblacion de celulas espedficas y se han extrafdo despues. Cuando las celulas se cultivan en un medio, pueden secretar factores celulares que pueden proporcionar soporte trofico a otras celulas. Dichos factores troficos incluyen, entre otros, hormonas, citocinas, protemas de la matriz extracelular (MEC), vesfculas, anticuerpos y granulos. El medio que contiene los factores celulares es el medio acondicionado.
En general, un factor trofico se define como una sustancia que estimula la supervivencia, el crecimiento, la proliferacion y/o la maduracion de una celula, o estimula el aumento de la actividad de una celula.
Cuando se hace referencia a celulas de vertebrados en cultivo, el termino senescencia (tambien senescencia replicativa o senescencia celular) se refiere a una propiedad atribuible a los cultivos celulares finitos; a saber, su incapacidad para crecer mas alla de un numero finito de duplicaciones de la poblacion (a veces denominado tfmite de Hayflick). A pesar de que la senescencia celular se describio por primera vez utilizando celulas similares a fibroblastos, la mayona de los tipos normales de celulas humanas que pueden hacerse crecer con exito en cultivo experimentan senescencia celular. La longevidad in vitro de los diferentes tipos de celulas vana, pero la longevidad maxima es, por lo general, inferior a 100 duplicaciones de la poblacion (este es el numero de duplicaciones para que todas las celulas en el cultivo se vuelvan senescentes y, por lo tanto, que hace que el cultivo sea incapaz de dividirse). La senescencia no depende del tiempo cronologico, sino que se mide por el numero de divisiones celulares, o duplicaciones de la poblacion, que ha experimentado el cultivo. Por lo tanto, las celulas que se hacen quiescentes eliminando los factores de crecimiento esenciales pueden reanudar su crecimiento y division cuando se vuelven a introducir los factores de crecimiento, y, posteriormente, llevar a cabo el mismo numero de duplicaciones que las celulas equivalentes que han crecido continuamente. Del mismo modo, cuando las celulas se congelan en nitrogeno lfquido despues de diversos numeros de duplicaciones de la poblacion y, a continuacion, se descongelan y cultivan, experimentan sustancialmente el mismo numero de duplicaciones que las celulas mantenidas sin congelar en cultivo. Las celulas senescentes no son celulas muertas o moribundas; en realidad son resistentes a la muerte celular programada (apoptosis) y se han mantenido en su estado de no division durante hasta tres anos. Estas celulas estan realmente vivas y metabolicamente activas, pero no se dividen. Todavfa no se ha descubierto si el estado de no division de las celulas senescentes es reversible con algun agente biologico, qmmico o vmco.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion medio de crecimiento se refiere a un medio suficiente para el cultivo de las celulas derivadas posparto. En particular, un medio de cultivo preferente actualmente para el cultivo de las celulas de la invencion comprende medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM). Particularmente preferentemente es DMEM con bajo contenido de glucosa (DMEM-LG) (Invitrogen, Carlsbad, CA). El DMEM-LG esta suplementado, preferentemente, con suero, lo mas preferentemente suero bovino fetal o suero humano. Tfpicamente se anade 15 % (v/v) de suero bovino fetal (por ejemplo, suero bovino fetal definido, Hyclone, Logan uT), junto con antibioticos/antimicoticos (preferentemente, 100 unidades/ml de penicilina, 100 miligramos/mililitro de estreptomicina y 0,25 microgramos/mililitro de anfotericina B; Invitrogen, Carlsbad, CA)) y 0,001 % (v/v) de 2- mercaptoethanol (Sigma, St. Louis MO). En algunos casos se usan diferentes medios de crecimiento, o se
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proporcionan diferentes complementos, y estos normalmente se indican en el texto como suplementos al medio de crecimiento. En ciertos medios definidos qmmicamente, las celulas pueden crecer sin nada de suero presente. En tales casos, las celulas pueden requerir ciertos factores de crecimiento, que pueden anadirse al medio para soportar y sostener las celulas. Los factores preferidos en el presente documento para anadir para el crecimiento en medios libres de suero incluyen uno o mas de bFGF, EGF, iGF-I y PDG. En realizaciones mas preferentes, dos, tres o todos los cuatro de los factores se anaden a medios libres de suero o definidos qmmicamente. En otras realizaciones, se anade LIF al medio libre de suero para soportar o mejorar el crecimiento de las celulas.
Tambien relacionado con la presente invencion, el termino condiciones normales de crecimiento, como se usa el presente documento, se refiere al cultivo de celulas a 37 °C, en una atmosfera estandar que comprende 5% de CO2. ,. La humedad relativa se mantiene en aproximadamente el 100 %. Aunque las condiciones anteriores son utiles para el cultivo, debe entenderse que el experto en la tecnica puede modificar tales condiciones, que apreciaran las opciones disponibles en la tecnica para cultivar celulas.
La expresion cantidad eficaz se refiere a una concentracion o cantidad de un compuesto, material o composicion, como se describe en el presente documento, que es eficaz para conseguir un resultado biologico particular. Tales resultados incluyen, pero no se limitan a los mismos, la regeneracion, reparacion o mejora del tejido esqueletico, la mejora del flujo sangumeo y/o la estimulacion y/o el soporte de la angiogenesis en pacientes con isquemia periferica. Dicha actividad eficaz se puede lograr, por ejemplo, administrando las celulas y/o las composiciones de la presente invencion a pacientes con isquemia periferica. Con respecto a los PPDC administrados a un paciente in vivo, una cantidad eficaz puede variar entre tan pocos como varios cientos o menos hasta tantos como varios millones o mas. En realizaciones espedficas, una cantidad eficaz puede variar de 103-1011, mas espedficamente al menos aproximadamente 104 celulas. Se apreciara que el numero de celulas que se van a administrar variara dependiendo de las caractensticas espedficas del trastorno que se va a tratar, incluyendo, pero sin limitaciones, el tamano o el volumen/superficie total que se va a tratar, y la proximidad del sitio de administracion a la ubicacion de la region que se va tratar, entre otros factores familiares para el biologo medico.
Los terminos trata, que trata o tratamiento se refieren a cualquier exito o indicio de exito en la atenuacion o mejona de una lesion, patologfa o afeccion, incluyendo cualquier parametro objetivo o subjetivo tal como reduccion, remision, disminucion de los smtomas o hacer que la lesion, patologfa o afeccion sea mas tolerable para el paciente, ralentizando la tasa de degeneracion o declinacion, haciendo que el punto final de la degeneracion sea menos debilitante, mejorando el bienestar ffsico o mental del sujeto, o prolongando la duracion de la supervivencia. El tratamiento o mejona de los smtomas puede basarse en parametros objetivos o subjetivos; Incluyendo los resultados de una exploracion ffsica, exploracion neurologica y/o evaluaciones psiquiatricas.
Las expresiones periodo (o tiempo) eficaz y condiciones eficaces se refieren a un penodo de tiempo u otras condiciones controlables (por ejemplo, temperatura, humedad para metodos in vitro), necesarias o preferentes para que un agente o composicion farmaceutica consiga el resultado deseado.
Los terminos paciente o sujeto se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a animales, preferentemente mairnferos, y, mas preferentemente, seres humanos, que se tratan con las composiciones farmaceuticas o terapeuticas o de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento.
Isquemia se refiere a cualquier disminucion o paro en el suministro de sangre a cualquier organo, tejido o parte del cuerpo causado por cualquier constriccion u obstruccion de la vasculatura. Episodio isquemico o acontecimiento isquemico se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier periodo de isquemia transitorio o permanente. Isquemia periferica se refiere a cualquier disminucion o paro en el suministro de sangre a cualquier organo, tejido o parte del cuerpo, excepto el corazon, causado por cualquier constriccion u obstruccion de la vasculatura. Enfermedad vascular periferica Se refiere a enfermedades de los vasos sangumeos fuera del corazon y el cerebro. A menudo implica un estrechamiento de los vasos sangumeos que llevan sangre a las extremidades y es el resultado dos tipos de trastornos de la circulacion, a saber, (1) enfermedad vascular periferica funcional, que implica espasmo a corto plazo que estrecha los vasos sangumeos; y (2) enfermedad vascular periferica organica que implica cambios estructurales en los vasos sangumeos, tales como causados por inflamacion o bloqueos grasos, por ejemplo.
La expresion vehculo o medio farmaceuticamente aceptable, que puede utilizarse de manera intercambiable con la expresion vehculo o medio biologicamente compatible, se refiere a reactivos, celulas, compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmaceuticas que no solo son compatibles con las celulas y otros agentes que se van a administrar terapeuticamente, sino que tambien son, dentro del alcance del criterio medico, adecuados para utilizarse en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritacion, respuesta alergica, u otra complicacion acorde con una relacion beneficio/riesgo razonable. Como se describe con mayor detalle en el presente documento, los vehmulos farmaceuticamente aceptables adecuados para utilizarse en la presente invencion incluyen materiales lfquidos, semisolidos (por ejemplo, geles) y solidos (por ejemplo, armazones y matrices de celulas, laminas de tubos y otros materiales tales como se conocen en la tecnica y se describen con mayor detalle en el presente documento). Los materiales semisolidos y solidos pueden disenarse para que resistan la degradacion dentro del cuerpo (no biodegradables) o pueden disenarse para que se degraden dentro del cuerpo
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(biodegradables, boerosionables). Un material biodegradable puede ser ademas biorreabsorbible o bioabsorbible, es decir, puede disolverse y absorberse en los ftquidos corporales (los implantes hidrosolubles son un ejemplo), o degradarse y, finalmente, eliminarse del cuerpo, ya sea por conversion en otros materiales o por degradacion y eliminacion a traves de vfas naturales. La velocidad de biodegradacion puede variar segun la velocidad de liberacion deseada una vez implantado en el cuerpo. La matriz actua tambien, deseablemente, como un armazon temporal hasta que se reemplaza con musculo esqueletico recien crecido, pericitos, musculo liso vascular o tejido endotelial vascular. Por lo tanto, en una realizacion, la matriz proporciona una liberacion sostenida de los otros agentes usados junto con las celulas derivadas posparto y puede proporcionar una estructura para desarrollar el crecimiento de tejido en el paciente. En otras realizaciones, la matriz simplemente proporciona un armazon temporal para el tejido en desarrollo. La matriz puede estar en forma de partfculas (macropartfculas de mas de 10 micrometros de diametro o micropartfculas de menos de 10 micrometros de diametro) o puede estar en forma de un implante estructuralmente estable, tridimensional (por ejemplo, un armazon). El implante puede ser, por ejemplo, un cubo, un cilindro, un tubo, un bloque, una peftcula, una lamina o una forma anatomica apropiada.
En el presente documento se utilizan diversos terminos y expresiones con respecto al transplante celular o de tejido. Las expresiones transferencia autologa, trasplante autologo, autoinjerto y similares se refieren a transplantes en los que el donante del transplante es tambien el receptor del transplante. Las expresiones transferencia alogenica, trasplante alogenico, aloinjerto y similares se refieren a transplantes en los que el donante del transplante es de la misma especie que el receptor del transplante, pero no es el receptor. Un transplante de celulas en el que las celulas del donante presentan coincidencia de histocompatibilidad con un receptor se denomina a veces transferencia smgenca. Las expresiones transferencia xenogenica, trasplante xenogenico, xenoinjerto y similares se refieren a transplantes en los que el donante del transplante a menudo es de una especie diferente de la del receptor del transplante.
En sus diversas realizaciones descritas en el presente documento, la presente invencion presenta composiciones farmaceuticas para su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares perifericas que utilizan celulas progenitoras y poblaciones celulares derivadas de tejidos posparto, tejido umbilical en particular. Estos metodos y composiciones farmaceuticas estan disenados para estimular y soportar la angiogenesis, mejorar el flujo sangumeo, regenerar, reparar y mejorar el musculo esqueletico danado por un acontecimiento isquemico periferico, y/o para proteger el musculo esqueletico del dano isquemico. Las celulas, poblaciones de celulas y preparaciones que comprenden lisados celulares, medios acondicionados y similares, utilizados en las preparaciones farmaceuticas y metodos de la presente divulgacion se describen con detalle en las publicaciones de patentes de Estados Unidos n.° 2005/0058631 y 2005/0054098, y tambien mas adelante en el presente documento.
Segun los metodos descritos en el presente documento, se recupera una placenta o cordon umbilical de mamfero despues o poco despues de finalizar una gestacion a termino o una gestacion prematura, por ejemplo, despues de su expulsion tras el nacimiento. El tejido posparto puede transportarse desde el lugar de nacimiento a un laboratorio en un recipiente esteril, tal como un matraz, vaso de precipitados, placa de cultivo o bolsa. El recipiente puede contener una solucion o medio, incluyendo, pero sin limitaciones, una solucion salina, tal como, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (tambien denominado medio esencial mmimo de Dulbecco) o solucion salina tamponada con fosfato (PBS), o cualquier solucion utilizada para el transporte de organos utilizados para el trasplante, tal como la solucion de la Universidad de Wisconsin o solucion perfluoroqmmica. Pueden anadirse al medio o tampon uno o mas antibioticos y/o antimicoticos, tales como, pero sin limitaciones a los mismos, penicilina, estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina. El tejido posparto puede aclararse con una solucion anticoagulante, tal como una solucion que contenga heparina. Es preferente mantener el tejido a aproximadamente 4 °C-10 °C antes de extraer las PDC. Es aun mas preferente no haber congelado el tejido antes de extraer las PDC.
El aislamiento de las PDC se produce preferentemente en un ambiente aseptico. Se separa el cordon umbilical de la placenta por medios conocidos en la tecnica. Como alternativa, el cordon umbilical y la placenta se utilizan sin separacion. La sangre y los desechos se eliminan, preferiblemente, del tejido posparto antes del aislamiento de las PPDC. Por ejemplo, el tejido posparto puede lavarse con solucion tampon, incluyendo, pero sin limitaciones, solucion salina tamponada con fosfato. El tampon de lavado puede comprender tambien uno o mas antimicoticos y/o antibioticos, tales como, pero no limitados a, penicilina, estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina.
El tejido posparto que comprende una placenta completa o un fragmento o seccion de la misma se desagrega mediante fuerza mecanica (trituracion o fuerzas de cizallamiento). En una realizacion preferida en el presente documento, el procedimiento de aislamiento tambien utiliza un proceso de digestion enzimatica. En la materia se conocen muchas enzimas utiles para el aislamiento de celulas individuales a partir de matrices de tejido complejas para facilitar el crecimiento en cultivo. Las enzimas de la digestion vanan desde ligeramente digestivas (por ejemplo, desoxirribonucleasas y la proteasa neutra, dispasa) a fuertemente digestivas (por ejemplo, papama y tripsina), y estan disponibles comercialmente. Una lista no exhaustiva de enzimas compatibles con la presente invencion incluye actividades enzimaticas mucolfticas, metaloproteasas, proteasas neutras, serina proteasas (tales como tripsina, quimotripsina o elastasa) y desoxirribonucleasas. Actualmente se prefieren las actividades enzimaticas seleccionadas de metaloproteasas, proteasas neutras y actividades mucolfticas. Por ejemplo, se sabe que las colagenasas son utiles para aislar varias celulas de tejidos. Las desoxirribonucleasas pueden digerir ADN monocatenario y pueden minimizar el aglutinamiento celular durante el aislamiento. Los metodos preferidos implican
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un tratamiento enzimatico con, por ejemplo, colagenasa y dispasa, o colagenasa, dispasa e hialuronidasa. En ciertas realizaciones, se usa una mezcla de colagenasa y la dispasa de proteasa neutra en la etapa de disociacion. Realizaciones mas espedficas emplean la digestion en presencia de al menos una colagenasa de Clostridium histolyticum, y cualquiera de las actividades de proteasa, dispasa y termolisina. Aun otras realizaciones emplean la digestion tanto con las actividades de las enzimas colagenasa y dispasa. Tambien se utilizan metodos que incluyen la digestion con una actividad hialuronidasa ademas de las actividades de colagenasa y dispasa. El experto en la tecnica apreciara que muchos de estos tratamientos enzimaticos son conocidos en la tecnica para aislar celulas de diversas fuentes de tejido. Por ejemplo, las mezclas de enzimas para la disociacion de tejidos vendidas bajo el nombre comercial de LIBERASE (Roche, Indianapolis, IN) son adecuadas para su uso en los presentes metodos. Se conocen otras fuentes de enzimas y el experto en la materia puede obtener tambien dichas enzimas directamente de sus fuentes naturales. El experto en la tecnica tambien esta preparado para evaluar enzimas o combinaciones enzimaticas nuevas o adicionales por su utilidad en el aislamiento de las celulas de la invencion. Los tratamientos enzimaticos preferentes tienen una duracion de 0,5 horas, 1 hora, 1,5 horas o 2 horas, o mas. En otras realizaciones preferentes, el tejido se incuba a 37 °C durante el tratamiento enzimatlco de la etapa de disgregacion.
En algunas formas de realizacion de la invencion, el tejido posparto se separa en fracciones que comprenden varios aspectos del tejido, tal como aspectos neonatos, neonatos/maternos y maternos de, por ejemplo, la placenta. A continuacion, las secciones separadas se disocian mediante disociacion mecanica y/o enzimatica segun los metodos descritos en el presente documento. Las celulas de linaje materno o neonatal pueden identificarse mediante cualquier medio conocido en la tecnica, por ejemplo, mediante analisis del cariotipo o hibridacion in situ para un cromosoma Y.
Pueden utilizarse celulas aisladas o tejido posparto a partir del que se multiplican las PDC para iniciar, o sembrar, cultivos celulares. Las celulas aisladas se transfieren a recipientes esteriles para cultivo tisular recubiertos o no recubiertos con una matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colageno (por ejemplo, natural o desnaturalizado), gelatina, fibronectina, y otras protemas de la matriz extracelular. Las PDC se cultivan en cualquier medio de cultivo capaz de sustentar el crecimiento de las celulas tales como, pero no limitados a, DMEM (con alto o bajo contenido de glucosa), DMEM avanzado, DMEM/MCDB 201, medio basal de Tagle, medio F10 de Ham (F10), medio F12 de Ham (F12), medio de Dulbecco modificado por Iscove, medio de crecimiento de celulas madre mesenquimatosas (MSCGM), DMEM/F12, RPMI 1640, y medio libre sin suero/medio vendido con el nombre comercial CELL-GRO-FREE (Mediatch, Inc., Herndon, VA). El medio de cultivo puede complementarse con uno o mas componentes incluidos, por ejemplo, suero bovino fetal (FBS), preferentemente aproximadamente al 2 %-15 % (v/v); suero equino (ES); suero humano (HS)); beta-mercaptoetanol (BME), preferentemente aproximadamente al 0,001 % (v/v); uno o mas factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento plaquetario (PDGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos basico (FGF), factor de crecimiento factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), factor de crecimiento insulinoide 1 (IGF-1), factor inhibidor de leucocitos (LIF) y eritropoyetina (EPO); aminoacidos, incluida L-valina; y uno o mas antibioticos y/o antimicoticos para controlar la contaminacion microbiana, tales como, por ejemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina, ya sea solos o en combinacion. El medio de cultivo comprende, preferentemente, medio de crecimiento, como se define en los ejemplos siguientes.
Las celulas se siembran en recipientes de cultivo a una densidad que permita el crecimiento celular. En una realizacion preferente, las celulas se cultivan a aproximadamente o a aproximadamente 5 por ciento en volumen de CO2 en aire. En algunas realizaciones preferentes, las celulas se cultivan a aproximadamente 2 a aproximadamente 25 por ciento de O2 en aire, preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento de O2 en el aire. Las celulas se cultivan, preferentemente, a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C, mas preferentemente se cultivan a 37 °C. Las celulas se cultivan preferentemente en una incubadora. El medio en el recipiente de cultivo puede ser estatico o agitado, por ejemplo, utilizando un biorreactor. Las PDC se cultivan preferentemente en condiciones de bajo estres oxidativo (por ejemplo, con la adicion de glutation, acido ascorbico, catalasa, tocoferol, N-acetilcistema). "Bajo estres oxidativo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a condiciones de dano mmimo o nulo por radicales libres a las celulas cultivadas.
Los metodos para seleccionar el medio de cultivo mas apropiado, la preparacion del medio y las tecnicas de cultivo celular son bien conocidos en la tecnica y se describen en diversas fuentes, incluidas Doyle et al., (eds.), 1995, CELL & TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley & Sons, Chichester; y Ho y Wang (eds.), 1991, ANIMAL CELL BIOREACTORS, Butterworth-Heinemann, Boston.
Despues de cultivar las celulas aisladas o los fragmentos de tejido durante un penodo de tiempo suficiente, las PDC se habran multiplicado, ya sea como resultado de la migracion desde el tejido posparto o la division celular, o ambos. En algunas formas de realizacion de la invencion, las PPDC se someten a pases, o se llevan a un recipiente de cultivo separado que contiene medio recien preparado del mismo o diferente tipo que el utilizado inicialmente, en el que la poblacion de celulas puede expandirse por mitosis. Las celulas de la invencion pueden utilizarse en cualquier momento entre el pase 0 y la senescencia. Preferentemente, las celulas se someten a pases entre aproximadamente 3 y aproximadamente 25 veces, mas preferentemente se someten a pases de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 veces, y preferentemente se someten a pases 10 u 11 veces. Pueden realizarse la clonacion y/o subclonacion para confirmar que se ha aislado una poblacion clonal de celulas.
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En algunos aspectos de la invencion, los diferentes tipos de celulas presentes en el tejido posparto se fraccionan en subpoblaciones a partir de las que pueden aislarse las PPDC. La fraccion o seleccion puede lograrse utilizando tecnicas estandar de separacion de celulas incluidas, pero no sin limitaciones, tratamiento enzimatico para disociar el tejido posparto en sus celulas componentes, seguido de clonacion y seleccion de tipos espedficos de celulas, por ejemplo, pero sin limitaciones, la seleccion en base a marcadores morfologicos y/o bioqmmicos; crecimiento selectivo de celulas deseadas (seleccion positiva), destruccion selectiva de celulas no deseadas (seleccion negativa); separacion en base a la aglutinabilidad celular diferencial en la poblacion mixta como, por ejemplo, con aglutinina de soja; procedimientos de congelacion y descongelacion; propiedades de adherencia diferencial de las celulas en la poblacion mixta; filtracion; centrifugacion convencional y zonal; decantacion centnfuga (centrifugacion contracorriente); separacion por gravedad unitaria; distribucion en contracorriente; electroforesis; y clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS). Para una revision de las tecnicas de seleccion clonal y separacion celular, vease Freshney, 1994, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, 3a Ed., Wiley-Liss, Inc., New York.
El medio de cultivo se cambia segun sea necesario, por ejemplo, mediante aspiracion cuidadosa del medio de la placa, por ejemplo, con una pipeta, y la reposicion con medio recien preparado. . Se continua incubando hasta que se acumula un numero o densidad suficiente de celulas en la placa. Las secciones de tejido explantado original pueden sacarse y las celulas restantes se digirieron con tripsina utilizando tecnicas convencionales o utilizando un rascador de celulas. Despues de la tripsinizacion, se recogen las celulas, se llevan a un medio recien preparado y se incuban como se ha indicado anteriormente. En algunas formas de realizacion, el medio se cambia al menos una vez aproximadamente 24 horas despues de la tripsinizacion para eliminar las celulas flotantes. Se considera que las celulas que permanecen en el cultivo son PPDC.
Las PPDC pueden crioconservarse. Por consiguiente, en una realizacion preferida descrita con mayor detalle a continuacion, las PPDC para la transferencia autologa (para la madre o el nino) pueden derivarse de tejidos posparto apropiados despues del nacimiento de un nino, y, despues, crioconservarse para estar disponibles en caso de que sean mas tarde necesarios para el trasplante.
Las PPDC pueden caracterizarse, por ejemplo, por sus caractensticas de crecimiento (por ejemplo, capacidad de duplicacion de la poblacion, tiempo de duplicacion, pases hasta la senescencia), mediante analisis del cariotipo (por ejemplo, linaje materno o neonatal), citometna de flujo (por ejemplo, analisis FACS), inmunohistoqmmica y/o inmunocitoqmmica (por ejemplo, para la deteccion de epttopos), perfiles de expresion genica (por ejemplo, matrices genicas; reaccion en cadena de la polimerasa (por ejemplo, PCR con transcriptasa inversa, PCR en tiempo real y PCR convencional)), matrices de protemas, secrecion de protemas (por ejemplo, ensayo de coagulacion de plasma o analisis de medio acondicionado de PDC, por ejemplo, mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)), reaccion linfocitaria mixta (por ejemplo, como medida de la estimulacion de las celulas mononucleares de sangre periferica alogenicas (PBMC), y/u otros metodos conocidos en la tecnica.
Los ejemplos de PPDC de la divulgacion derivadas de tejido placentario se depositaron en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA) y se les asignaron numeros de registro ATCC de la siguiente manera: (11) la denominacion de cepa PLA 071003 (P8) se deposito el 15 de junio de 2004 y se le asigno el numero de registro PTA-6074; (2) la denominacion de cepa PLA 071003 (P11) se deposito el 15 de junio de 2004 y se le asigno el numero de registro PTA-6075; y (3) la denominacion de cepa PLA 071003 (P16) se deposito el 16 de junio de 2004 y se le asigno el numero de registro PTA-6079. Los ejemplos de PPDC de la invencion derivadas de tejido de cordon umbilical se depositaron en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo el 10 de junio de 2004 y se les asignaron los numeros de registro en la ATCC de la siguiente manera: (1) a la denominacion de cepa UMB 022803 (P7) se le asigno el numero de registro PTA-6067; y (2) a la denominacion de cepa UMB 022803 (P17) se le asigno el numero de registro PTA- 6068.
En diversas realizaciones, las PPDC poseen una o mas de las siguientes caractensticas de crecimiento (1) que requieren L-valina para el crecimiento en cultivo; (2) son capaces de crecer en atmosferas que contienen oxfgeno desde aproximadamente 5 % hasta al menos aproximadamente 20 % (3) tienen el potencial de al menos aproximadamente 40 duplicaciones en cultivo antes de alcanzar la senescencia; y (4) se unen y se expanden en un recipiente de cultivo de tejidos recubierto o no recubierto, en el que el recipiente de cultivo de tejidos recubiertos comprende un recubrimiento de gelatina, laminina, colageno, poliornitina, vitronectina o fibronectina.
En ciertas realizaciones, las PPDC poseen un cariotipo normal, que se mantiene a medida que las celulas se someten a pases. El cariotipo es particularmente util para identificar y distinguir celulas neonatales de las celulas maternas derivadas de placenta. Los metodos para la realizacion cariotipo estan disponibles y son conocidos por los expertos en la tecnica.
En otras realizaciones, las PPDC pueden caracterizarse por la produccion de ciertas protemas, incluyendo (1) produccion de al menos uno de factor tisular, vimentina y alfa-actina de musculo liso; y (2) produccion de al menos uno de los marcadores de superficie celular CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A, B, C, segun se detecta por citometna de flujo. En otras realizaciones, as PPDC pueden caracterizarse por falta de produccion de al menos uno de los marcadores de superficie celular CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117,
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CD141, CD178, B7-H2, HLA-G y HLA-DR, DP, DQ , como se detecta por citometna de flujo. Son particularmente preferidas las celulas que producen al menos dos factor tisular, vimentina y alfa-actina de musculo liso. Son particularmente preferidas las celulas que producen las tres protemas de factor tisular, vimentina y alfa-actina de musculo liso.
En otras realizaciones, las PPDC pueden caracterizarse por la expresion genica, que en relacion con una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimatosa o una celula de medula osea de cresta ilfaca, se incrementa para un gen que codifica al menos una de interleucina 8; reticulon 1; ligando 1 de quimiocina (motivo C- X-C) (actividad estimulante del crecimiento del melanoma, alfa); ligando 6 de quimiocina (motivo C - X - C) (protema 2 quimiotactica de granulocitos); ligando 3 de quimiocina (motivo C - X - C); factor de necrosis tumoral, protema 3 inducida por alfa; miembro 2 de la superfamilia de lectina de tipo C; tumor de Wilms 1; miembro A2 de la familia de aldetudo deshidrogenasa 1; renina; receptor 1 de lipoprotemas de baja densidad oxidadas; clon IMAGE: 4179671 de Homo sapiens; protema quinasa C zeta; protema hipotetica DKFZp564F013; regulado negativamente en el cancer de ovario 1; y el gen de Homo sapiens del clon DKFZp547k1113.
En aun otras realizaciones, las PPDC pueden caracterizarse por la expresion genica, que en relacion con una celula humana que es fibroblasto, una celula madre mesenquimatosa o una celula de la medula osea de cresta ilfaca, se reduce para un gen que codifica al menos uno de: homeocaja 2 de estatura baja; protema del choque termico de 27 kDa; ligandos 12 de quimiocina (motivo C-X-C) (factor 1 derivado de celulas estromales); elastina (estenosis aortica supravalvular, smdrome de Williams-Beuren); ARNm de Homo sapiens; ADNc de DKFZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022); homeocaja 2 del mesenquima (homeocaja espedfica del cese de crecimiento); homologo 1 de la homeocaja sine oculis (Drosophila); alfa B cristalina; activador 2 asociado “disheveled” de la morfogenesis 2; protema DKFZP586B2420; similar a neuralina 1; tetranectina (protema de union a plasminogeno); dominio 3 de homologfa con src (SH3) y rico en cistemas; colesterol 25- hidroxilasa; factor de transcripcion relacionado con el enanismo 3; receptor de interleucina 11, alfa; potenciador de la procolageno C-endopeptidasa; homologo Frizzled 7 (Drosophila); gen hipotetico BC008967; colageno, tipo VIII, alfa 1; tenascina C (hexabraquina) ; protema 5 de la homeocaja iroquesa; hefaestina; integrina, beta 8; glucoprotema 2 de vesmulas sinapticas; neuroblastoma, supresion de tumorigenicidad 1; protema 2 de union al factor de crecimiento similar a la insulina de 36kDa; ADNc de Homo sapiens FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744; factor 1 similar a receptores de citocinas; canal activado por calcio de conductancia intermedia/pequena de potasio, subfamilia N, miembro 4; integrina, beta 7; c-activador transcripcional con motivo de union a PDZ (TAZ) ; homologo 2 de la homeocaja de sine oculis (Drosophila); ; protema KIAA1034; protema 5 de membrana asociada a vesmula (miobrevina) ; protema 1 de la matriz extracelular similar a fibulina que contiene EGF; respuesta 3 de crecimiento temprano; homeocaja 5 de distal-less; protema hipotetica FLJ20373; miembro C3 de la familia 1 de la aldo-ceto reductasa (3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo II) ; biglicano; coactivador transcripcional con motivo de union a PDZ (TAZ) ; fibronectina 1; proencefalina; integrina, beta similar a 1 (con dominios de repeticion similares a EGF); clon de ADNc de inserto de longitud completa de ARNm de Homo sapiens EUROImAgE 1968422; EphA3; protema KIAA0367; receptor C de peptido natriuretico/guanilato ciclasa C (receptor C de peptido natriuretico); protema hipotetica FLJ14054; ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp564B222 (del clon DKFZp564B222) ; similar a la protema 3 de interaccion con BCL2/adenovirus E1B de 19 kDa; protema 1 de union a AE; y/o polipeptido 1 de la subunidad VIIa de citocromo c oxidasa (musculo).
En otras realizaciones, las PPDC de la divulgacion pueden caracterizarse por la secrecion de al menos uno de MCP- 1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1a , RANTES y TIMP1. En algunas realizaciones, las PPDC pueden caracterizarse por la falta de secrecion de al menos uno de TGF-beta2, ANG2, PDGFbb, MIP1b, I309, MDC y VEGF, segun se detecta mediante ELISA.
En algunas realizaciones preferidas, las PPDC se obtienen de tejido de cordon umbilical sustancialmente libre de sangre, son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo, requieren L-valina para crecimiento, pueden crecer en al menos aproximadamente 5 % de oxfgeno, y comprenden al menos Una de las siguientes caractensticas: potencial para al menos aproximadamente 40 duplicaciones en cultivo; union y expansion en un recipiente de cultivo de tejidos recubierto o no recubierto que comprende un recubrimiento de gelatina, laminina, colageno, poliornitina, vitronectina o fibronectina; produccion de vimentina y alfa-actina de musculo liso; produccion de CD10, cD13, CD44, CD73 y CD90; y expresion de un gen, que con respecto a una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimatosa o una celula de la medula osea de cresta ilfaca, se incrementa para un gen que codifica la interleucina 8 y el reticulon 1. En algunas realizaciones, tales PPDC no producen CD45 y CD117. Las PPDC como se describen en este parrafo pueden usarse en metodos para tratar a un paciente que tiene enfermedad vascular periferica, pueden usarse en composiciones farmaceuticas para tratar enfermedad vascular periferica, por ejemplo, en los que dichas composiciones comprenden las celulas que tienen estas caractensticas y un vehmulo farmaceuticamente aceptable y se pueden usar en kits para fabricar, usar y practicar tales metodos y composiciones farmaceuticas como se describen e ilustran en el presente documento. Ademas, las PPDC como se describen en este parrafo pueden usarse para generar medios de cultivo celular acondicionados o para preparar preparaciones tales como extractos celulares y fracciones subcelulares que se pueden usar para preparar, usar y practicar tales metodos y composiciones farmaceuticas como se describen e ilustran en el presente documento.
En realizaciones preferidas, la celula comprende dos o mas de las caractensticas de crecimiento, produccion de
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marcador/protema de superficie, expresion genica o de secrecion de sustancias mencionadas anteriormente. Son mas preferidas las celulas que comprenden, tres, cuatro, cinco o mas de las caractensticas. Son aun mas preferentes las PPDC que comprenden seis, siete, u ocho o mas de las caractensticas. Son aun mas preferentes las celulas que comprenden todas las caractensticas anteriores.
Entre las celulas que se prefieren actualmente para su uso con la invencion en varios de sus aspectos son celulas posparto que tienen las caractensticas descritas anteriormente y, mas particularmente, aquellas en las que las celulas tienen cariotipos normales y mantienen cariotipos normales con pases, y, ademas, en las que las celulas expresan cada uno de los marcadores CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, y HLA-A, B, C, en los que las celulas producen las protemas inmunologicamente detectables que corresponden a los marcadores enumerados. Aun mas preferidas son las celulas que, ademas de las anteriores, no producen protemas que correspondan a ninguno de los marcadores CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, o HLA-Dr, DP, DQ, segun se detecta mediante citometna de flujo.
Ciertas celulas que tienen el potencial de diferenciarse a lo largo de lmeas que conducen a diversos fenotipos son inestables y, por lo tanto, pueden diferenciarse espontaneamente. Celulas actualmente preferidas para su uso con la invencion son aquellas que no se diferencian espontaneamente, por ejemplo, a lo largo de mioblasto, musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericito, lmeas endoteliales hemangiogenicas, angiogenicas, vasculogenicas o vasculares. Las celulas preferidas, cuando se cultivan en medio de crecimiento, son sustancialmente estables con respecto a los marcadores de celulas producidos sobre su superficie, y con respecto al patron de expresion de diversos genes, por ejemplo, como se determina usando una prueba de diagnostico medico comercializada bajo el nombre comercial GENECHIP (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA). Las celulas siguen siendo sustancialmente constantes, por ejemplo, en sus caractensticas de marcador superficial con los pases y a traves de multiples duplicaciones de poblaciones.
Otro aspecto proporcionado por la invencion caracteriza el uso de poblaciones de PPDC, descritas anteriormente. En algunas realizaciones, la poblacion de celulas es heterogenea. Una poblacion de celulas heterogenea de la invencion puede comprender al menos aproximadamente el 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o el 95 % de PPDC de la invencion. Las poblaciones de celulas heterogeneas de la invencion pueden comprender ademas citoblastos u otras celulas progenitoras, tales como mioblastos u otras celulas progenitoras de musculo, hemangioblastos o celulas precursoras de vasos sangumeos; o pueden comprender ademas celulas de musculo esqueletico completamente diferenciadas, celulas de musculo liso, pericitos o celulas endoteliales de vasos sangumeos. En algunas realizaciones, la poblacion es sustancialmente homogenea, es decir, comprende sustancialmente solo PPDC (preferentemente al menos aproximadamente el 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas PPDC). La poblacion de celulas homogenea de la divulgacion puede comprender celulas derivadas de cordon umbilical o de placenta. Las poblaciones de celulas derivadas del cordon umbilical homogeneas estan, preferentemente, libres de celulas de linaje materno. Las poblaciones de celulas derivadas de placenta homogeneas pueden ser de linaje neonatal o materno. La homogeneidad de una poblacion de celulas puede lograrse por cualquier procedimiento conocido en la tecnica, por ejemplo, por clasificacion de celulas (por ejemplo, citometna de flujo) o por expansion clonica segun procedimientos conocidos. Asf, poblaciones de PPDC homogeneas preferidas pueden comprender una lmea celular clonal de celulas derivadas posparto. Tales poblaciones son particularmente utiles cuando se ha aislado un clon de celula con funcionalidad altamente deseable.
Tambien se proporciona en el presente documento el uso de poblaciones de celulas incubadas en presencia de uno o mas factores, o en condiciones, que estimulan la diferenciacion de celulas madre a lo largo de una via muscular vascular, endotelial vascular, pericito o musculo esqueletico. Tales factores son conocidos en la tecnica y el experto en la tecnica apreciara que la determinacion de las condiciones adecuadas para la diferenciacion se puede conseguir mediante experimentacion rutinaria. La optimizacion de tales condiciones puede lograrse mediante diseno y analisis experimental estadfstico, por ejemplo, la metodologfa de superficie de respuesta permite la optimizacion simultanea de multiples variables, por ejemplo en un cultivo biologico. Los factores actualmente preferidos incluyen, pero sin limitaciones, factores de crecimiento o troficos, quimiocinas, citocinas, productos celulares, agentes desmetilantes y otros estfmulos que se sabe o se determina posteriormente que estimulan la diferenciacion, por ejemplo, de celulas madre a lo largo de elementos angiogenicos, hemangiogenicos, vasculogenicos, musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericito o linajes endoteliales vasculares.
Las PPDC tambien pueden modificarse geneticamente para producir productos genicos terapeuticamente utiles, para producir agentes angiogenicos para facilitar o sostener la formacion o crecimiento adicional de vasos sangumeos, o para producir factores para reclutar celulas progenitoras endoteliales en el area de dano isquemico. Las celulas progenitoras endoteliales facilitan la vasculogenesis y el flujo sangumeo, particularmente despues de un acontecimiento isquemico (Urbich C y Dimmeler S (2004) Circ. Res. 95: 343-53). Los factores que juegan un papel en el reclutamiento de celulas endoteliales incluyen, pero no se limitan a, VEGF, factor 1 derivado del estroma (SDF- 1), eritropoyetina (EPO), G-CSF, estatinas, estrogeno, PPARy, CXCR4, FGF y HGF. La modificacion genetica puede llevarse a cabo usando cualquiera de una variedad de vectores que incluyen, pero no se limitan a, vectores virales integrantes, por ejemplo, vector de retrovirus o vectores de virus adenoasociados; vectores replicantes no integrantes, por ejemplo, vectores del virus del papiloma, vectores de SV40, vectores adenovirales; o vectores virales con replicacion defectuosa. Otros procedimientos de introduccion de ADN en celulas incluyen el uso de
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liposomas, electroporacion, una pistola de partmulas, o por inyeccion de ADN directa.
Las celulas huesped se transforman o transfectan, preferentemente, con ADN controlado por, o en asociacion operativa con, uno o mas elementos de control de la expresion apropiados tales como secuencias promotoras o potenciadoras, terminadores de la transcripcion, sitios de poliadenilacion, entre otros, y un marcador de seleccion. Cualquier promotor puede usarse para accionar la expresion del gen insertado. Por ejemplo, los promotores virales incluyen, pero no se limitan a, un promotor del CMV/potenciador, SV 40, virus del papiloma, virus de Epstein-Barr o promotor del gen elastina. En algunas realizaciones, los elementos de control usados para controlar la expresion del gen de interes pueden permitir la expresion regulada del gen de manera que el producto se sintetice solo cuando se necesite in vivo. Si se desea expresion transitoria, se usan promotores constitutivos preferentemente en un vector no integrante y/o de replicacion defectuosa. Como alternativa, podnan usarse promotores inducibles para accionar la expresion del gen insertado cuando sea necesario. Los promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, aquellos asociados a metalotionema y protemas de choque termico.
Tras la introduccion del ADN exogeno, puede permitirse que las celulas manipuladas crezcan en medios enriquecidos y luego cambiarlas a medios selectivos. El marcador seleccionable en el ADN extrano confiere resistencia a la seleccion y permite que las celulas integren de forma estable el ADN extrano como, por ejemplo, en un plasmido, en sus cromosomas y crezcan para formar focos que, a su vez, se pueden clonar y expandir en las lmeas celulares. Este procedimiento puede usarse de forma ventajosa para modificar mediante ingeniena las lmeas celulares que expresan el producto genico.
Las celulas de la invencion pueden manipularse geneticamente para “inactivar” o “silenciar” la expresion de factores que promueven la inflamacion o rechazo en el sitio del implante. Tecnicas de modulacion negativa para la reduccion de los niveles de expresion de genes diana o niveles de actividad de productos de genes diana se tratan mas adelante. Modulacion negativa”, como se usa en el presente documento, se refiere a una reduccion en el nivel y/o actividad del producto de gen diana con respecto al nivel y/o actividad del producto del gen diana en ausencia del tratamiento modulador. La expresion de un gen nativo para una celula de musculo esqueletico, celula de musculo liso vascular, pericito, celula endotelial vascular, celula neural, o celulas progenitoras de los mismos, puede reducirse o inactivarse usando varias tecnicas que incluyen, por ejemplo, inhibicion de la expresion por inactivacion del gen usando la tecnica de recombinacion de homologos. Normalmente, un exon que codifica una region importante de la protema (o un exon 5' para esa region) se interrumpe por un marcador de seleccion positivo, por ejemplo, neo, que previene la produccion de ARNm normal del gen diana y que produce la inactivacion del gen. Un gen tambien puede inactivarse creando una delecion en parte de un gen, o delecionando el gen entero. Usando una construccion con dos regiones de homologfa con el gen diana que estan muy alejadas en el genoma, las secuencias que intervienen en las dos regiones pueden delecionarse (Mombaerts et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:3084-3087). Tambien pueden usarse antisentido, ADNzimas, ribozimas, ARN interferente pequeno (ARNip) y otras moleculas tales que inhiben la expresion del gen diana para reducir el nivel de actividad del gen diana. Por ejemplo, se ha mostrado que moleculas de ARN antisentido que inhiben la expresion de complejos del gen mayor de histocompatibilidad (HLA) son las mas versatiles con respecto a las respuestas inmunitarias. Todavfa ademas, pueden utilizarse moleculas de triple helice en la reduccion del nivel de actividad del gen diana. Estas tecnicas se describen con detalle en L.G. Davis et al. (eds), 1994, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 2a ed., Appleton & Lange, Norwalk, CN.
En otros aspectos, la divulgacion utiliza lisados celulares y fracciones solubles de celulas preparadas a partir de PPDC o poblaciones celulares heterogeneas u homogeneas que comprenden PPDC, asf como PPDC o poblaciones de las mismas que se han modificado geneticamente o que se han estimulado para diferenciarse a lo largo de una via del musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericito o del endotelio vascular. Tales lisados y fracciones de los mismos tienen muchas utilidades. El uso de tales fracciones solubles del lisado de PPDC (es decir, sustancialmente libres de membranas) in vivo, por ejemplo, permite que el medio intracelular beneficioso se use alogenicamente en un paciente sin introducir una cantidad apreciable de las protemas de la superficie celular que lo mas probablemente provoquen el rechazo, u otras respuestas inmunologicas adversas. Los procedimientos de lisado de celulas son muy conocidos en la tecnica e incluyen diversos medios de rotura mecanica, rotura enzimatica o rotura qmmica, o combinaciones de los mismos. Tales lisados celulares pueden prepararse a partir de celulas directamente en su medio de crecimiento, y asf contener factores de crecimiento secretados y similares, o pueden prepararse a partir de celulas lavadas libres de medio en, por ejemplo, PBS u otra disolucion. Las celulas lavadas pueden resuspenderse a concentraciones superiores a la densidad de poblacion original, si se prefiere.
En una realizacion se preparan lisados de celulas completas, por ejemplo, rompiendo celulas sin posterior separacion de las fracciones celulares. En otra realizacion, una fraccion de membrana celular se separa de una fraccion soluble de las celulas por procedimientos rutinarios conocidos en la tecnica, por ejemplo, centrifugacion, filtracion, o procedimientos similares.
Los lisados celulares o fracciones solubles de celulas preparadas a partir de las poblaciones de celulas derivadas del posparto pueden usarse como tales, adicionalmente concentrarse por, por ejemplo, ultrafiltracion o liofilizacion, o incluso secarse, purificarse parcialmente, combinarse con vehmulos o diluyentes farmaceuticamente aceptables como se conoce en la tecnica, o combinarse con otros compuestos tales como productos biologicos, por ejemplo,
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composiciones de protema farmaceuticamente utiles. Los lisados celulares o fracciones de los mismos pueden usarse in vitro o in vivo, solos o, por ejemplo, con celulas vivas autologas o singenicas. Los lisados, si se introducen in vivo, pueden introducirse localmente en un sitio de tratamiento, o remotamente para proporcionar, por ejemplo, factores de crecimiento celular necesarios para un paciente.
En una realizacion adicional, las PPDC pueden cultivarse in vitro para producir productos biologicos con alto rendimiento. Las PPDC que producen naturalmente un producto biologico particular de interes (por ejemplo, un factor trofico) como que se ha manipulado geneticamente para producir un producto biologico tal, puede expandirse clonalmente usando las tecnicas de cultivo descritas en el presente documento. Como alternativa, las celulas pueden expandirse en un medio que induce la diferenciacion a un linaje de musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericito o endotelial vascular. En cada caso, los productos biologicos producidos por la celula y secretados en el medio pueden aislarse facilmente del medio acondicionado usando tecnicas de separacion estandar, por ejemplo, tales como precipitacion diferencial de protemas, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa por filtracion en gel, electroforesis y HPLC, por nombrar algunos. Puede usarse un “biorreactor” para aprovechar el procedimiento de flujo para la alimentacion, por ejemplo, un cultivo tridimensional in vitro. Esencialmente, como medio fresco que se pasa a traves del cultivo tridimensional, el producto biologico se lava del cultivo y puede entonces aislarse del flujo de salida, como antes.
Como alternativa, un producto biologico de interes puede permanecer dentro de la celula y, asf su recogida puede requerir que las celulas se lisen, como se ha descrito anteriormente. El producto biologico puede entonces purificarse usando una cualquiera o mas de las tecnicas enumeradas anteriormente.
En otras realizaciones, la divulgacion utiliza medio acondicionado de PPDC cultivadas para su uso in vitro e in vivo como se describe mas adelante. El uso del medio acondicionado de PPDC permite que los beneficiosos factores troficos secretados por las PPDC se usen alogenicamente en un paciente sin introducir celulas intactas que podnan provocar el rechazo, u otras respuestas inmunologicas adversas. El medio acondicionado se prepara cultivando celulas en un medio de cultivo, luego sacando las celulas del medio.
El medio acondicionado preparado a partir de las poblaciones de celulas derivadas del posparto puede usarse como tales, adicionalmente concentrarse por, por ejemplo, ultrafiltracion o liofilizacion, o incluso secarse, purificarse parcialmente, combinarse con vetuculos o diluyentes farmaceuticamente aceptables como se conoce en la tecnica, o combinarse con otros compuestos tales como productos biologicos, por ejemplo, composiciones de protema farmaceuticamente utiles. El medio acondicionado puede usarse in vitro o in vivo, solo o combinado con celulas vivas autologas o singenicas, por ejemplo. El medio acondicionado, si se introducen in vivo, pueden introducirse localmente en un sitio de tratamiento, o remotamente para proporcionar, por ejemplo, factores de crecimiento celular o troficos necesarios para un paciente.
En otra realizacion, una matriz extracelular (ECM) producida cultivando las PPDC sobre sustratos lfquidos, solidos o semisolidos se prepara, se recoge y se utiliza como una alternativa a implantar celulas vivas en un sujeto en necesidad de reparacion o sustitucion de tejido. Las PPDC se cultivan in vitro, sobre una estructura tridimensional como se describe en cualquier parte en el presente documento, en condiciones tales que se secrete una cantidad deseada de ECM sobre la estructura. Las celulas que comprenden el nuevo tejido se eliminan y la ECM se procesa para uso posterior, por ejemplo, como una preparacion inyectable. Para realizar esto, las celulas sobre la estructura se destruyen y cualquier residuo celular se elimina de la estructura. Este proceso puede llevarse a cabo de varias formas diferentes. Por ejemplo, el tejido vivo puede ultracongelarse en nitrogeno lfquido sin un crioconservante, o el tejido puede sumergirse en agua destilada esteril de manera que las celulas exploten en respuesta a la presion osmotica.
Una vez se han destruido las celulas, las membranas celulares pueden romperse y el residuo celular se elimina mediante tratamiento con un aclarado de detergente suave, tal como EDTA, CHAPS o un detergente de ion bipolar. Como alternativo, el tejido puede digerirse enzimaticamente y/o extraerse con reactivos que descomponen las membranas celulares y permiten la eliminacion de contenidos celulares. Entre los ejemplos de tales enzimas se incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasa, dispasa, proteasas y nucleasas. Entre los ejemplos de detergentes se incluyen detergentes no ionicos tales como, por ejemplo, alquilaril polieter alcohol (TRITON X-100) , octilfenoxi polietoxi-etanol (Rohm y Haas, Filadelfia, Pa.), BRIJ-35, un lauril eter de polietoxietanol (Atlas Chemical Co., San Diego, Ca.) , polisorbato 20 (TWEEN 20) , un monolaureato de sorbitano de polietoxietanol (Rohm and Haas, Filadelfia, Pa.) , polietilen lauril eter (Rohm and Haas, Filadelfia, Pa.); y detergentes ionicos tales como dodecilsulfato de sodio, alcoholes alifaticos superiores sulfatados, alcanos sulfonados y alquilarenos sulfonados que contienen de 7 a 22 atomos de carbono en una cadena ramificada o sin ramificar.
El conjunto de ECM puede llevarse a cabo en una variedad de formas, dependiendo al menos en parte de si el nuevo tejido se ha formado sobre una estructura tridimensional que es biodegradable o no biodegradable, como en el caso de metales. Por ejemplo, si la estructura es no biodegradable, la ECM puede eliminarse sometiendo la estructura a sonicacion, chorros de agua a alta presion, raspado mecanico o tratamiento suave con detergentes o enzimas, o cualquier combinacion de los anteriores.
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Si la estructura es biodegradable, la ECM puede recogerse, por ejemplo, dejando que la estructura se degrade o disuelva en solucion. Como alternativa, si la estructura biodegradable esta compuesta por un material que puede inyectarse el mismo junto con la ECM, la estructura y la ECM pueden procesarse en conjunto para la posterior inyeccion. Como alternativa, la ECM puede eliminarse de la estructura biodegradable por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente para la recogida de ECM de una estructura no biodegradable. Todos los procedimientos de recogida se disenan preferentemente de manera que no desnaturalicen la ECM.
Despues de recogerse, la ECM puede procesarse adicionalmente. Por ejemplo, la ECM puede homogeneizarse a partfculas finas usando tecnicas muy conocidas en la tecnica, tales como por sonicacion, de manera que pueda pasar a traves de una aguja quirurgica. Los componentes de la ECM tambien pueden reticularse, si se desea, por irradiacion gamma. Preferentemente, la ECM puede irradiarse entre 0, 25 y 2 mega-radianes para esterilizar y reticular la ECM. Es posible la reticulacion qmmica usando agentes que son toxicos, tales como glutaraldehfdo, pero generalmente no se prefiere.
Las cantidades y/o relaciones de protemas, tales como los diversos tipos de colageno presentes en la ECM, pueden ajustarse mezclando la ECM producida por las celulas de la divulgacion con ECM de uno o varios de otros tipos de celulas. Ademas, sustancias biologicamente activas, tales como protemas, factores de crecimiento y/o farmacos, pueden incorporarse en la ECM. Sustancias biologicamente activas a modo de ejemplo incluyen factores tisulares de crecimiento, tales como TGF-beta, y similares, que promueven la curacion y reparacion de tejido en el sitio de la inyeccion. Tales agentes adicionales pueden utilizarse en cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente en el presente documento, por ejemplo, con lisados de celulas completas, fracciones celulares solubles, o componentes y productos purificados adicionalmente producidos por las PPDC.
En otro aspecto, en el presente documento se divulgan composiciones farmaceuticas que utilizan PPDC, poblaciones de PPDC, componentes y productos de PPDC en diversos metodos para el tratamiento de lesiones o danos causados por un episodio isquemico periferico. Ciertas realizaciones abarcan composiciones farmaceuticas que comprenden celulas vivas (PPDc solas o mezcladas con otros tipos celulares). Otras realizaciones abarcan composiciones farmaceuticas que comprenden componentes celulares de PPDC (por ejemplo, lisados celulares, fracciones de celulas solubles, medio acondicionado, ECM, o componentes de cualquiera de los anteriores) o productos (por ejemplo, factores troficos y otros factores biologicos producidos naturalmente por PPDC o por modificacion genetica, medio acondicionado del cultivo de PPDC). En cualquier caso, la composicion farmaceutica puede comprender ademas otros agentes activos, tales como agentes antiinflamatorios, agentes antiapoptoticos, antioxidantes, factores de crecimiento, factores miotroficos o farmacos miorregenerativos o mioprotectores como se conocen en la tecnica.
Ejemplos de otros componentes que se pueden anadir a las composiciones farmaceuticas de PPDC incluyen, pero no se limitan a: (1) otros farmacos miobeneficiosos o mioprotectores, o farmacos angiobeneficiosos o angioprotectores; (2) componentes seleccionados de la matriz extracelular, tales como uno o mas tipos de colageno conocidos en la tecnica, y/o factores de crecimiento, plasma rico en plaquetas y farmacos (como alternativa, las PPDC pueden modificarse geneticamente para expresar y producir factores de crecimiento); (3) agentes antiapoptoticos (por ejemplo, eritropoyetina (EPO) , mimeticuerpo de EPO, trombopoyetina, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) -I, IGF-II, factor de crecimiento de hepatocitos, inhibidores de caspasa) ; (4) compuestos antiinflamatorios (por ejemplo, inhibidores de MAP cinasas p38, inhibidores de TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 y IL-1, Pemirolast, Tranilast, Remicade (Centocor, Inc., Malvern, Pa.) , sirolimus y farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) (tales como tepoxalina, tolmetina y suprafen); (5agentes inmunosupresores o inmunomoduladores, tales como inhibidores de la calcineurina, inhibidores de mTOR, antiproliferativos, corticosteroides y diversos anticuerpos; (6) antioxidantes, tales como probucol, vitaminas C y E, coenzima Q-10, glutation, L-cistema y N-acetulcistema; (6) anestesicos locales; y (7) otros factores angiogenicos tales como Agrin, VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, NEGF-1, NEGF-2, PDGF, GDF, IGF1, IGF2, EGF y FGF; y, (8) factores que funcionan en el reclutamiento e incorporacion de celulas progenitoras endoteliales en tejido isquemico, tales como VEGF, SDF-1, EPO, G-CSF, estatinas, estrogeno, PPARy y CXCR4, por nombrar solo unos pocos.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion comprenden PPDC, componentes o productos de los mismos, incluidas las preparaciones hechas de PPDC, formuladas con un vehmulo o medio farmaceuticamente aceptable. Vehmulos farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen agua, solucion salina (tal como solucion de Ringer), alcoholes, aceites, gelatinas, polivinilpirrolidona, hidratos de carbono tales como lactosa, amilosa o almidon, esteres de acido graso e hidroximetilcelulosa. Tales preparaciones pueden esterilizarse, y si se desea, mezclarse con agentes auxiliares tales como lubricantes, conservantes, estabilizadores, humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presion osmotica, tampones y colorantes. En la tecnica se conocen transportadores farmaceuticos adecuados para su uso en la presente invencion y se describen, por ejemplo, en Pharmaceutical Sciences (17a ed., Mack Pub. Co., Easton, PA) y el documento WO 96/05309.
Tfpicamente, pero no exclusivamente, las composiciones farmaceuticas que comprenden componentes o productos de PPDC, pero no celulas vivas, se formulan como lfquidos (o como comprimidos solidos, capsulas y similares, cuando es apropiada la administracion oral). Estas pueden formularse para la administracion por cualquier via aceptable conocida en la tecnica para lograr la administracion de farmacos y moleculas biologicas en el musculo
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esqueletico, musculo liso vascular, pericito o tejido endotelial vascular diana, incluyendo, pero sin limitarse a, las v^as oral, nasal oftalmica y parenteral, incluyendo intravenosa. Entre las vfas particulares de administracion parenteral se incluyen, pero no se limitan a, intramuscular, subcutanea, intraperitoneal, intratecal, intracisternal o mediante jeringas con agujas o cateteres con o sin dispositivos de bombeo.
Las composiciones farmaceuticas que comprenden celulas vivas de PPDC se formulan tipicamente como Kquidos, semisolidos (por ejemplo, geles) o solidos (por ejemplo, matrices, armazones similares, segun sea apropiado para la ingeniena de tejido muscular vascular o esqueletico). Las composiciones lfquidas se formulan para la administracion por cualquier via aceptable conocida en la tecnica para conseguir la administracion de celulas vivas a los tejidos vasculares o del musculo esqueletico diana. Tfpicamente, incluyen inyeccion o infusion, ya sea de una manera difusa, o dirigida al sitio de lesion, dano o alteracion isquemica periferica, mediante una via de administracion que incluye, pero no se limita a, administracion intramuscular, intravenosa o intraarterial mediante jeringas con agujas y/o cateteres con o sin dispositivos de bombeo.
Las composiciones farmaceuticas que comprenden celulas vivas en un vetuculo semisolido o solido se formulan tipicamente para implantacion quirurgica en el sitio de lesion, dano o alteracion isquemica. Se apreciara que las composiciones lfquidas tambien se pueden administrar mediante procedimientos quirurgicos. En realizaciones particulares, las composiciones farmaceuticas semisolidas o solidas pueden comprender geles semipermeables, matrices, armazones celulares y similares, que pueden ser no biodegradables o biodegradables. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, puede ser deseable o apropiado secuestrar las celulas exogenas de su entorno, pero permitir que las celulas segregan y suministren moleculas biologicas (por ejemplo, factores miotroficos, factores angiotropicos o factores de reclutamiento de celulas progenitoras endoteliales) al musculo esqueletico circundante o a las celulas vasculares. En estas realizaciones, las celulas pueden formularse como implantes autonomos que comprenden PPDC vivas o poblacion de celulas que comprenden PPDC rodeadas por una barrera no degradable, selectivamente permeable que separa ffsicamente las celulas trasplantadas del tejido huesped. Tales implantes se denominan a veces "inmunoprotectores", ya que tienen la capacidad de impedir que las celulas inmunitarias y macromoleculas maten las celulas trasplantadas en ausencia de inmunosupresion farmacologicamente inducida (para una revision de tales dispositivos y metodos, vease, por ejemplo, P.A. Tresco et al., (2000) Adv. Drug Delivery Rev. 42:3-27).
En otras realizaciones, se utilizan diferentes variedades de geles y redes degradables para las composiciones farmaceuticas de la invencion. Por ejemplo, los materiales degradables particularmente adecuados para formulaciones de liberacion sostenida incluyen polfmeros biocompatibles, tales como poli(acido lactico), poli(acido lactico-acido coglicolico), metilcelulosa, acido hialuronico, colageno y similares. La estructura, seleccion y uso de polfmeros degradables en vetuculos de administracion de farmacos se han revisado en varias publicaciones, incluyendo, A. Domb et al., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3:279-292.
En otras realizaciones, puede ser deseable o apropiado liberar las celulas sobre o en un armazon o matriz biodegradable, preferiblemente biorreabsorbible o bioabsorbible. Estos biomateriales tipicamente tridimensionales contienen las celulas vivas unidas al armazon, dispersadas dentro del armazon o incorporadas en una matriz extracelular atrapada en el armazon. Una vez implantados en la region diana del cuerpo, estos implantes se integran con el tejido huesped, donde las celulas trasplantadas se establecen gradualmente (vease, por ejemplo, Tresco, PA, et al. (2000) citado anteriormente; vease tambien Hutmacher, DW (2001) J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 12:107174).
La matriz biocompatible puede estar compuesta por polfmeros biodegradables naturales, modificados naturales o sinteticos, incluyendo homopolfmeros, copolfmeros y polfmeros de bloques, asf como combinaciones de los mismos. Se observa que un polfmero se denomina generalmente basado en el monomero del que se sintetiza.
Ejemplos de polfmeros biodegradables adecuados o clases de polfmeros incluyen fibrina, colageno, elastina, gelatina, vitronectina, fibronectina, laminina, trombina, poli (aminoacido), celulosa oxidada, tropoelastina, seda, acidos ribonucleicos, acidos desoxirribonucleicos; protemas, polinucleotidos, matrices de membrana basal reconstituidas, almidones, dextranos, alginatos, hialuron, quitina, quitosano, agarosa, polisacaridos, acido hialuronico, poli (acido lactico), poli (acido glicolico), polietilenglicol, tejido descelularizado, peptidos autoensamblados, polipeptidos, glucosaminoglicanos, sus derivados y mezclas de los mismos. Tanto para el acido glicolico como para el acido lactico, se prepara tfpicamente un dfmero cfclico intermedio y se purifica antes de la polimerizacion. Estos dfmeros intermedios se denominan glicolida y lactida, respectivamente. Otros polfmeros biodegradables utiles o clases de polfmeros incluyen, sin limitacion, poliesteres alifaticos, poli (alquileno oxalatos), policarbonatos derivados de tirosina, poliiminocarbonatos, poliortoesteres, polioxieteres, poliamidoesteres, polioxieteres que contienen grupos amina, poli(propilenofumarato), polidioxanonas, policarbonatos, polioxalatos, poli (alfa-hidroxiacidos), poli (esteres), poliuretano, poli (ester uretano), poli (eter uretano), poliantudridos, poliacetatos, policaprolactonas, poli (ortoesteres), poliaminoacidos, poliamidas y mezclas y copolfmeros de los mismos. Los polfmeros biodegradables utiles adicionales incluyen, sin limitacion, estereopolfmeros de acido L- y D-lactico, copolfmeros de bis (para-carboxifenoxi) propano y acido sebacico, copolfmeros de acido sebacico, copolfmeros de caprolactona, poli (acido lactico)/poli (acido glicolico)/polietilenglicol, copolfmeros de poliuretano y poli (acido lactico), copolfmeros de alfa-aminoacidos, copolfmeros de alfa-aminoacidos y acido caproico, copolfmeros de alfa-bencil
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glutamato y polietilenglicol, copoKmeros de succinato y poli (glicoles), polifosfazeno, poli (hidroxialcanoatos) y mezclas de los mismos. Tambien se contemplan sistemas binarios y ternarios.
En general, un polfmero biodegradable adecuado para su uso como matriz esta deseablemente configurado de modo que tiene propiedades mecanicas que son adecuadas para la aplicacion prevista, permanece suficientemente intacta hasta que el tejido ha crecido y cicatrizado, no invoca una respuesta inflamatoria o toxica, se metaboliza en el cuerpo despues de cumplir con su proposito, se transforma facilmente en el producto final deseado que se va a formar, demuestra una vida util aceptable y se esteriliza facilmente.
En un aspecto de la invencion, el polfmero biocompatible usado para formar la matriz esta en forma de un hidrogel. En general, los hidrogeles son materiales polimericos reticulados que pueden absorber mas del 20 % de su peso en agua manteniendo una estructura tridimensional distinta. Esta definicion incluye polfmeros reticulados secos que se hinchan en ambientes acuosos, asf como materiales hinchados con agua. Una serie de polfmeros hidrofilos pueden ser reticulados para producir hidrogeles, sea el polfmero de origen biologico, semisintetico o totalmente sintetico. El hidrogel puede producirse a partir de un material polimerico sintetico. Tales polfmeros sinteticos se pueden adaptar a una gama de propiedades y una uniformidad predecible de lote a lote, y representan una fuente fiable de material que generalmente esta libre de problemas de inmunogenicidad. Las matrices pueden incluir hidrogeles formados a partir de peptidos autoensamblables, como los que se tratan en las patentes de Estados Unidos n.° 5.670.483 y 5.955.343, la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2002/0160471, la solicitud de PCT n.° WO02/062969.
Las propiedades que hacen que los hidrogeles sean valiosos en aplicaciones de administracion de farmacos incluyen el grado de hinchamiento en equilibrio, la cinetica de sorcion, la permeabilidad del soluto y sus caractensticas de presentacion in vivo. La permeabilidad a los compuestos depende en parte del grado de hinchamiento o del contenido de agua y de la velocidad de biodegradacion. Dado que la resistencia mecanica de un gel disminuye en proporcion directa con el grado de hinchamiento, tambien esta dentro de la contemplacion de la presente invencion que el hidrogel pueda unirse a un sustrato de manera que el sistema compuesto mejore la resistencia mecanica. En algunas realizaciones, el hidrogel puede impregnarse dentro de un sustrato poroso, con el fin de obtener la resistencia mecanica del sustrato, junto con las propiedades de suministro utiles del hidrogel.
Ejemplos no limitantes de armazon o matriz (a veces denominados colectivamente como "estructura") que se pueden usar en la presente invencion incluyen estructuras textiles tales como tejidos, tejidos, trenzas, mallas, tejidos no tejidos y tejidos deformados; espumas porosas, espumas semiporosas, pelfculas o laminas perforadas, micropartfculas, perlas y esferas y estructuras compuestas que son una combinacion de las estructuras anteriores. Las esteras no tejidas pueden formarse, por ejemplo, utilizando fibras compuestas por un copolfmero absorbible sintetico de acidos glicolico y lactico (PGA/PLA), comercializados bajo el nombre comercial suturas VICRYL (Ethicon, Inc., Somerville, NJ). Tambien se pueden usar espumas, compuestas, por ejemplo, de copolfmero de poli (epsilon-caprolactona)/acido poli (acido glicolico) (PCL/pGa), formadas por procesos tales como secado por congelacion o liofilizacion, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 6.355.699. Tambien se pueden usar hidrogeles tales como peptidos autoensamblables (por ejemplo, RAD16). Las redes degradables de formacion in situ tambien adecuadas para su uso en la invencion (vease, por ejemplo, Anseth, KS et al. (2002) J. Controlled Release 78:199-209; Wang, D. et al., (2003) Biomaterials 24:3969-3980; la publicacion de patente de Estados Unidos 2002/0022676 to He et al.). Estos materiales formadores in situ se formulan como fluidos adecuados para inyeccion, y luego se pueden inducir a formar un hidrogel por dversos medios tales como cambio de temperatura, pH y exposicion a la luz in situ o in vivo.
En otra realizacion, la estructura es un fieltro, que puede estar compuesto por un hilo multifilamento hecho de un material bioabsorbible, por ejemplo, copolfmeros o mezclas de PCL, PLA, PGA, o acido hialuronico. El hilo se convierte en un fieltro mediante tecnicas convencionales de procesamiento textil que consisten en prensado, corte, cardado y punzonado. En otra forma de realizacion, las celulas se siembran sobre regiones estructurales de espuma que pueden ser estructuras compuestas.
En muchas de las realizaciones mencionadas anteriormente, la estructura puede moldearse en una forma util, tal como la de un vaso sangumeo. Ademas, se apreciara que as PPDC pueden cultivarse en dispositivos quirurgicos o implantables preformados, no degradables, por ejemplo de una manera correspondiente a la utilizada para preparar bobinas endovasculares de GDC que contienen fibroblastos, por ejemplo (Marx, WF et al., (2001) Am. J. Neuroradiol. 22:323-333).
La matriz, armazon o dispositivo se puede tratar antes de inocular las celulas de la invencion con el fin de potenciar la fijacion celular. Por ejemplo, antes de la inoculacion, podnan tratarse matrices de nailon con acido acetico 0,1 molar e incubarse en polilisina, PBS y/o colageno para recubrir el nailon. Podna tratarse poliestireno de manera similar utilizando acido sulfurico. Las superficies externas de la estructura tambien pueden modificarse para mejorar la fijacion o el crecimiento de las celulas y la diferenciacion del tejido, tal como mediante el recubrimiento por plasma de la estructura o la adicion de una o mas protemas (por ejemplo, colagenos, fibras elasticas, fibras reticulares), glicoprotemas, glicosaminoglicanos (por ejemplo, sulfato de heparina, condroitm-4-sulfato, condroitm-6-sulfato, sulfato de dermatan, sulfato de queratina), materiales geneticos tales como citocinas y factores de crecimiento, una matriz celular y/u otros materiales, incluyendo pero sin limitarse a, gelatina, alginatos, agar, agarosa y gomas
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vegetales, entre otros, factores que afectan a la supervivencia y diferenciacion celular.
Las estructuras que contienen PPDC se preparan segun metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, las celulas se pueden cultivar libremente en un recipiente de cultivo a una subconfluencia o confluencia, se levantan del cultivo y se inoculan sobre la estructura. Ademas, pueden anadirse al medio de cultivo factores de crecimiento antes de, durante o despues de la inoculacion de las celulas para activar la diferenciacion y la formacion de tejido, si se desea. Como alternativa, pueden modificarse las estructuras de manera que se potencie el crecimiento de las celulas sobre las mismas o de manera que se reduzca el riesgo de rechazo del implante. Por lo tanto, pueden anadirse a la estructura uno o mas compuestos biologicamente activos, incluidos pero no limitados a, compuestos antiinflamatorios, inmunosupresores o factores de crecimiento, para su liberacion local.
Las PPDC, o poblaciones de celulas que comprenden PPDC, pueden usarse de diversas maneras para estimular y/o sostener la angiogenesis, especialmente en pacientes con enfermedad vascular periferica. Estas utilidades abarcan metodos in vitro, ex vivo e in vivo.
En una realizacion de la divulgacion, como se ha expuesto anteriormente, las PPDC pueden cultivarse in vitro para producir productos biologicos que son producidos naturalmente por las celulas o producidos por las celulas cuando se induce la diferenciacion en musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericito o linajes endoteliales vasculares, o producidos por las celulas mediante modificacion genetica. Por ejemplo, se descubrio que TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIP1b, MCP1, RANTES, I309, TARC, MDC e IL-8 se secretaban a partir de celulas derivadas de cordon umbilical cultivadas en medio de crecimiento. Por ejemplo, se descubrio que TlMP1, TPO, KGF, HGF, HBEGF, BDNF, MIP1a, MCP-1, RANTES, TARC, Eotaxina, e IL-8 se secretaban a partir de PPDC derivadas de placena cultivadas en medio de crecimiento (veanse los ejemplos). Ademas, las PPDC pueden producir factores para el reclutamiento de celulas progenitoras endoteliales tales como VEGF, SDF-1, EPO, G-CSF, estatinas, estrogeno, PPARy y CXCR4 y pueden ser secretados en el medio de crecimiento. Otros factores troficos, aun no detectados o no examinados, de uso en la reparacion y regeneracion vascular o de musculo esqueletico, es probable que sean producidos por las PPDC y posiblemente secretados en el medio.
A este respecto, otra realizacion de la divulgacion presenta el uso de PPDC para la produccion de medio acondicionado, ya sea a partir de PPDC indiferenciadas o de PPDC incubadas en condiciones que estimulan la diferenciacion en un musculo esqueletico o linaje vascular, Tales medios acondicionados se contemplan para su uso en cultivo in vitro o ex vivo de musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericito o celulas precursoras de endotelio vascular, o in vivo para soportar celulas transplantadas que comprenden poblaciones homogeneas de PPDC o poblaciones heterogeneas que comprenden PPDC y musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericito o progenitores endoteliales vasculares, o para reclutar celulas progenitoras endoteliales al sitio de lesion isquemica, por ejemplo.
En otra realizacion, las PPDC se usan ventajosamente en cocultivos in vitro para proporcionar soporte trofico a otras celulas, en particular, celulas de musculo esqueletico, celulas progenitoras de musculo esqueletico, celulas de musculo liso vascular, celulas progenitoras de musculo liso vascular, pericitos, celulas endoteliales vasculares o celulas progenitoras de endotelio vascular. En algunas realizaciones preferidas, el soporte trofico es la proliferacion de las celulas. Para el cocultivo, puede ser deseable que las PPDC y las otras celulas deseadas se cocultiven en condiciones en las que los dos tipos de celulas esten en contacto. Esto puede conseguirse, por ejemplo, sembrando las celulas como una poblacion heterogenea de celulas en un medio de cultivo o sobre un sustrato de cultivo adecuado. Como alternativa, las PPDC pueden cultivarse primero hasta la confluencia y emplearse como sustrato para el segundo tipo de celula deseada en cultivo. En esta ultima forma de realizacion, las celulas pueden estar ademas ffsicamente separadas, por ejemplo, por una membrana o un dispositivo similar, de manera que el otro tipo de celula pueda sacarse y utilizarse por separado despues del penodo de cocultivo. El uso de las PPDC en cocultivo para promover la expansion y diferenciacion de otros tipos de celulas puede hallar aplicabilidad en areas clmicas/terapeuticas y de investigacion. Por ejemplo, puede utilizarse el cocultivo de PDC para facilitar el crecimiento y la diferenciacion de celulas de musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericitos o celulas endoteliales vasculares en cultivo, con fines de investigacion basica o para su uso en ensayos de seleccion de farmacos, por ejemplo. El cocultivo de PDC tambien puede utilizarse para la expansion ex vivo de celulas de musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericitos o progenitores endoteliales vasculares para su administracion posterior con fines terapeuticos. Por ejemplo, las celulas de musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericitos o progenitoras endoteliales vasculares pueden recolectarse de un individuo, expandirse ex vivo en cocultivo con las PPDC, a continuacion devolverse a ese individuo (transferencia autologa) o a otro individuo (transferencia singenica o alogenica). En estas formas de realizacion, se entendera que, despues de la expansion ex vivo, la poblacion mixta de celulas que comprende las PPDC y las celulas de musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericitos o progenitoras endoteliales vasculares podna administrarse a un paciente que necesite tratamiento. Como alternativa, en situaciones en las que resulta apropiada o deseable la transferencia autologa, las poblaciones de celulas cocultlvadas pueden separarse ffsicamente en cultivo, lo que permite sacar las celulas autologas de de musculo esqueletico, musculo liso vascular o progenitoras endoteliales vasculares para administrarse al paciente.
Como se describe en las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2005/0058631, 2005/0054098 and 2005/0058630, se ha demostrado que las PPDC se trasplantan con eficacia en el cuerpo y que mejoran el flujo
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sangumeo y reducen la necrosis tisular en un modelo animal aceptado. Estos resultados apoyan una forma de realizacion preferente de la invencion, junto con los descubrimientos expuestos en la presente invencion, soportan realizaciones preferidas de la invencion, en las que las P.D. se usan en la terapia celular para tratar la lesion o dano terapeutico reparando o regenerando musculo esqueletico y/o tejido vascular en una enfermedad vascular periferica o mejorando el flujo sangumeo o estimulando y/o soportando la angiogenesis en un paciente con enfermedad vascular periferica. En una realizacion, las PpDC se trasplantan a una localizacion objetivo en el cuerpo, especialmente en o proximal a la localizacion del episodio isquemico, donde las PPDC pueden diferenciarse en uno o mas de musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericito o endotelio vascular, las PPDC pueden proporcionar soporte trofico para celulas de musculo esqueletico, celulas de musculo liso vascular, pericito o progenitores de celulas endoteliales vasculares y/o celulas de musculo esqueletico, celulas de musculo liso vascular, pericitos o celulas endoteliales vasculares in situ, las PPDC pueden producir factores para reclutar celulas progenitoras endoteliales al sitio de la lesion isquemica, o las PPDC pueden ejercer un efecto beneficioso de dos o mas formas, entre otras. Las PPDC secretan factores troficos incluyendo, pero sin limitaciones, GFGFm, IL-6, IL-8, HGF, IGF-1, TPO y similares. Las PPDC pueden ayudar en el reclutamiento de celulas progenitoras vasculares, tales como angioblastos, para estimular la formacion de nuevos vasos sangumeos.
Las PPDC pueden ejercer efectos troficos en el cuerpo del paciente al que se administran. Por ejemplo, las PPDC pueden ejercer efectos troficos sobre las celulas del musculo esqueletico, las celulas del musculo liso vascular, las celulas endoteliales vasculares, los pericitos o las celulas progenitoras de los mismos. En algunas realizaciones preferidas, el efecto trofico es la proliferacion de las celulas. Las PPDC tambien pueden inducir migracion de celulas en el cuerpo del paciente al que se administran. Dicha migracion puede facilitar la reparacion, regeneracion y tratamiento de la enfermedad vascular periferica tal como la isquemia periferica. Por ejemplo, las PPDC administradas en o cerca de un sitio de enfermedad vascular periferica pueden inducir migracion de celulas al sitio de enfermedad vascular periferica con el fin de reparar, regenerar o tratar de otro modo el tejido enfermo y sus alrededores. Las PPDC administradas de este modo pueden inducir migracion de las celulas del musculo esqueletico, las celulas del musculo liso vascular, las celulas endoteliales vasculares, los pericitos o las celulas progenitoras de los mismos. En realizaciones preferidas, las PPDC inducen la migracion de las celulas endoteliales vasculares y/o las celulas progenitoras del endotelio vascular al sitio, o al menos cerca del sitio de la enfermedad vascular periferica. En algunas realizaciones, la migracion es inducida o soportada por FGF y/o HGF, preferiblemente FGF y HGF expresados por las PPDC. Las preparaciones hechas a partir de PPDC, incluyendo lisados celulares, fracciones subcelulares, y similares, tambien pueden usarse para tratar la enfermedad vascular periferica. Tales preparaciones se pueden formular con vehmulos farmaceuticamente aceptables tales como las descritas y e ilustradas en el presente documento y se administran a pacientes en cantidades eficaces para tratar la enfermedad vascular periferica. En realizaciones preferidas, las preparaciones preparadas a partir de PPDC comprenden FGF y HGF.
Realizaciones espedficas de la invencion estan dirigidas a la reparacion directa, regeneracion, reemplazo o el soporte de la reparacion, regeneracion o reemplazo de vasos sangumeos para el tratamiento de lesion o dano isquemico periferico.
Las PPDC pueden administrarse solas (por ejemplo, como poblaciones sustancialmente homogeneas) o como mezclas con otras celulas. Como se ha descrito anteriormente, las PPDC pueden administrarse tal como se formulan en una preparacion farmaceutica con una matriz o armazon, o con vehmulos convencionales farmaceuticamente aceptables. Cuando se administran PPDC con otras celulas, pueden administrarse simultaneamente o secuencialmente con las otras celulas (antes o despues de las otras celulas). Las celulas que pueden administrarse conjuntamente con PPDC incluyen, pero sin limitacion, miocitos, celulas de musculo esqueletico, celulas progenitoras de musculo esqueletico, celulas de musculo liso vascular, celulas progenitoras de musculo liso vascular, pericitos, celulas endoteliales vasculares o celulas progenitoras de endotelio vascular y/u otras celulas madre multipotenciales. Las celulas de diferentes tipos se pueden mezclar con las PPDc inmediatamente o poco antes de la administracion, o pueden cocultivarse conjuntamente durante un penodo de tiempo previo a la administracion.
Los PPDC pueden administrarse con otros farmacos beneficiosos o moleculas biologicas, u otros agentes activos, tales como agentes antiinflamatorios, agentes antiapoptoticos, antioxidantes, factores de crecimiento, factores angiogenicos o farmacos miorregenerativos o miooprotectores como se conoce en la tecnica. Cuando se administran PPDC con otros agentes, pueden administrarse conjuntamente en una sola composicion farmaceutica, o en composiciones farmaceuticas separadas, simultanea o secuencialmente con los otros agentes (antes o despues de la administracion de los otros agentes). Los otros agentes pueden ser parte de un regimen de tratamiento que comienza antes del transplante y continua a lo largo del curso de la recuperacion, o puede iniciarse en el momento del trasplante, o incluso despues del trasplante, como un medico experto en la tecnica considere apropiado.
Ejemplos de otros componentes que se pueden administrar con PPDC incluyen, pero no se limitan a: (1) otros factores angiogenicos, farmacos angiogenicos o factores o farmacos miorregeneradores; (2) componentes seleccionados de la matriz extracelular, tales como uno o mas tipos de colageno conocidos en la tecnica, y/o factores de crecimiento, plasma rico en plaquetas y farmacos (como alternativa, las PPDC pueden modificarse geneticamente para expresar y producir factores de crecimiento); (3) agentes antiapoptoticos (por ejemplo,
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eritropoyetina (EPO) , mimeticuerpo de EPO, trombopoyetina, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) -I, IGF- II, factor de crecimiento de hepatocitos, inhibidores de caspasa) ; (4) compuestos antiinflamatorios (por ejemplo, inhibidores de MAP cinasas p38, inhibidores de TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 y IL-1, Pemirolast, Tranilast, Remicade (Centocor, Inc., Malvern, Pa.) , sirolimus y farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) (tales como tepoxalina, tolmetina y suprafen); (5agentes inmunosupresores o inmunomoduladores, tales como inhibidores de la calcineurina, inhibidores de mTOR, antiproliferativos, corticosteroides y diversos anticuerpos; (6) tales como probucol, vitaminas C y E, coenzima Q-10, glutation, L-cistema y N-acetilcistema y (6) anestesicos locales, por nombrar solo unos pocos.
En una realizacion, los PPDC se administran como celulas indiferenciadas, es decir, como cultivos en medio de crecimiento. En una realizacion de la divulgacion, las PPDC pueden administrarse despues de la exposicion en cultivo a condiciones que estimulan la diferenciacion hacia un fenotipo deseado de musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericito o endotelio vascular.
Las celulas de la invencion pueden implantarse quirurgicamente, inyectarse, introducirse (por ejemplo, por medio de un cateter, jeringa, derivacion, endoprotesis vascular, microcateter o bomba) o administrarse de otra manera directa o indirectamente al sitio de lesion, dano o alteracion isquemica. Las vfas de administracion de las celulas de la invencion o composiciones de las mismas incluyen, pero no se limitan a las vfas de administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea, intranasal, intratecal, intracisternal o mediante jeringas con agujas y/o cateteres con o sin dispositivos de bombeo.
Cuando las celulas se administran en dispositivos semisolidos o solidos, la implantacion quirurgica en un lugar preciso del cuerpo es por lo general un medio adecuado de administracion. Sin embargo, las composiciones farmaceuticas lfquidas o fluidas, pueden administrarse a traves de la sangre, o directamente en el tejido muscular afectado (por ejemplo, a traves de una zona difusamente afectada, como seffa el caso de la lesion isquemica difusa). La migracion de las PPDC puede ser guiada por senales qmmicas, factores de crecimiento o calpamas.
Las celulas o composiciones derivadas del posparto y/o matrices que comprenden las celulas derivadas del posparto pueden liberarse en al sitio a traves de un micro cateter, intracateterizacion o mediante una mini bomba. El vehffculo excipiente o portador puede ser cualquiera de los que se sabe que son farmaceuticamente aceptables para la administracion a un paciente, particularmente localmente en el sitio en el que debe inducirse la diferenciacion celular. Ejemplos incluyen medios lfquidos, por ejemplo, medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), solucion salina esteril, solucion salina esteril tamponada con fosfato, medio Leibovitz (Ll5, Invitrogen, Carlsbad, CA), dextrosa en agua esteril y cualquier otro lfquido fisiologicamente aceptable.
Las formas y regfmenes de dosificacion para administrar PPDC o cualquiera de las otras composiciones terapeuticas o farmaceuticas descritas en el presente documento se desarrollan de acuerdo con una buena practica medica, teniendo en cuenta la condicion del paciente individual, por ejemplo, la naturaleza y extension de la lesion o dano del acontecimiento isquemico periferico, la edad, el sexo, el peso corporal y la afeccion medica general, y otros factores conocidos por los medicos. Por tanto, la cantidad eficaz de una composicion farmaceutica a administrar a un paciente se determina por estas consideraciones como se conoce en la tecnica.
Se ha demostrado que las PPDC no estimulan PBMC alogenicas en una reaccion mixta de linfocitos. Por consiguiente, el transplante con PPDC alogenicas, o incluso xenogenicas, puede ser tolerado en algunos casos. En algunas realizaciones, las propias PPDC proporcionan un efecto inmunosupresor, evitando asf el rechazo del huesped de las PPDC trasplantadas. En tales casos, la inmunosupresion farmacologica durante la terapia celular puede no ser necesaria.
Sin embargo, en otros casos puede ser deseable o apropiado inmunosuprimir farmacologicamente a un paciente antes de iniciar la terapia celular. Esto puede lograrse mediante el uso de agentes inmunosupresores sistemicos o locales, o puede realizarse suministrando las celulas en un dispositivo encapsulado, como se ha descrito anteriormente. Estos y otros medios para reducir o eliminar una respuesta inmunologica a las celulas trasplantadas son conocidos en la tecnica. Como alternativa, las PPDC pueden modificarse geneticamente para reducir su inmunogenicidad, como se ha mencionado anteriormente.
Puede determinarse la supervivencia de las PPDC trasplantadas en un paciente vivo mediante el uso de diversas tecnicas de exploracion, por ejemplo, exploraciones mediante tomograffa axial computarizada (TAC o TC), resonancia magnetica (RM) o tomograffa por emision de positrones (TEP). La determinacion de la supervivencia del trasplante tambien puede realizarse post mortem extrayendo el tejido de musculo esqueletico o vascular, y examinandolo visualmente o con un microscopio. Como alternativa, las celulas pueden tratarse con tinciones que sean espedficas para las celulas de musculo esqueletico, celulas de musculo liso vascular, pericitos o celulas endoteliales vasculares. Las celulas trasplantadas tambien pueden identificarse mediante la incorporacion previa de colorantes indicadores tales como microesferas marcadas con rodamina o fluorescema, Fast Blue, bisbenzamida, microparffculas ferricas, o productos genicos indicadores introducidos geneticamente, tales como beta-galactosidasa o beta-glucuronidasa.
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En otro aspecto, la divulgacion proporciona kits que utilizan las PPDC, poblaciones de PPDC, componentes y productos de las PPDC en diversos metodos para estimular y/o sostener la angiogenesis, para mejorar el flujo sangumeo, para regenerar, reparar y mejorar el musculo esqueletico lesionado o danado por un acontecimiento isquemico periferico, como se ha descrito anteriormente. Cuando se usan para el tratamiento de danos o lesiones causadas por un acontecimiento isquemico u otro tratamiento programado, los kits pueden incluir una o mas poblaciones de celulas, incluyendo al menos PPDC y un vehmulo farmaceuticamente aceptable (lfquido, semisolido o solido). Los kits pueden incluir opcionalmente un medio de administracion de las celulas, por ejemplo mediante inyeccion. Los kits pueden incluir adicionalmente instrucciones para el uso de las celulas. Los kits preparados para su uso en hospitales de campana, tal como para uso militar, pueden incluir suministros para todo el procedimiento, incluidos los armazones tlsulares, las suturas quirurgicas, y similares, en los que las celulas se utilizaran junto con la reparacion de lesiones agudas. Los kits para ensayos y metodos in vitro como se describen en el presente documento pueden contener uno o mas de entre (1) las PPDC o componentes o productos de las PPDC, (2) reactivos para poner en practica el metodo in vitro, (3) otras celulas o poblaciones de celulas, cuando proceda, e (4) instrucciones para llevar a cabo el metodo in vitro.
El ejemplo siguiente describe la invencion con mayor detalle. Este ejemplo pretende ilustrar adicionalmente, no limitar, aspectos de la invencion descritos en el presente documento.
Ejemplo 1
Eficacia de las celulas posparto derivadas de cordon umbilical en el modelo murino de isquemia periferica de la pata trasera
Materiales y metodos
Cultivo y aislamiento de celulas umbilicales. Se prepararon celulas derivadas de cordon umbilical (UDC) como se describe las publicaciones de patentes de Estados Unidos 2005/0058631 o 2005/0054098. Las celulas se cultivaron hasta el pase 10 u 11 (aproximadamente 20 - 25 veces duplicaciones de poblacion) y despues se conservaron criogenicamente.
Grupos de tratamiento del modelo de Isquemia:
1. PBS, control negativo
2. Plasmido de expresion para el factor de crecimiento endotelial vascular (pVEGF), control positivo
3. Celulas de la lmea celular n.° 1, 5x105 celulas totales
4. Celulas de la lmea celular n.° 1, 1 x 106 celulas totales
5. Celulas de la lmea celular n.° 2, 1 x 106 celulas totales
6. Celulas de la lmea celular n.° 1, cultivadas, 1 x 106 celulas totales Lmea celular 1: U120304 p10,
Lmea celular 2: U072804A p11
Preparacion de la muestra para la inyeccion. Las celulas se descongelaron inmediatamente antes de la inyeccion (grupos 3-5), o se cultivaron durante 24-30 horas (grupo 6). Se contaron las celulas y se determino la viabilidad mediante tincion con azul tripan y contando con un hemocitometro. Se resuspendio toda la dosis de celulas o plasmido (100 |jg) en 100 jl de pBs y se cargo en una jeringuilla de tuberculina de 300 jl con una aguja de calibre 27 para inyeccion en los ratones.
Cirugia. El dfa 0, se indujo quirurgicamente isquemia aguda del miembro posterior en ratones atfmicos, desnudos por ligacion unilateral y escision de la arteria iliofemerol izquierda. Los ratones se dividieron en 6 grupos de al menos n = 8 para tratamiento con UDC o controles. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a los grupos de tratamiento para los grupos 1-5. Debido a que el grupo 6 se anadio tarde en el estudio, no se produjo aleatorizacion. Ademas, los conflictos de programacion impidieron la realizacion de microCT/PET simultaneamente con el estudio original. Este analisis se realizo sobre un grupo de 8 animales adicionales (4 de control y 4 celulas cultivadas 1) inscritos despues de la finalizacion del estudio de 21 dfas.
Inyecciones celulares. Un dfa despues de la cirugfa, los ratones fueron anestesiados para el analisis de imagen por Doppler laser de la region plantar. Mientras que los ratones estaban todavfa bajo anestesia, las celulas se inyectaron en 5 sitios en el miembro izquierdo (isquemico): (1) 20 pl en el tibial anterior; (2) 2 x 20 jl en gastrocnemio; y (3) 2 x 20 jl en el recto femoral del haz de cuadriceps.
Analisis. Se realizaron imagenes por laser Doppler los dfas 1, 4, 8, 14 y 21. A los 21 dfas, se sacrificaron los ratones y se extirparon los musculos tibiales anteriores (TA), gastrocnemio y cuadriceps y se criofijaron para seccionar finamente y tincion inmunohistoqmmica con anticuerpo CD31. El analisis MicroCT/PET utilizando gas fluorometano para determinar el estado de perfusion de los musculos se realizo a los 8 dfas. Se sacrifico a estos ratones inmediatamente despues y se procesaron los musculos de los miembros posteriores para la inmunohistoqmmica CD31 en secciones delgadas criofijadas.
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Criterios de exclusion. Los ratones que presentaban una necrosis grave del dedo del pie el dfa 1 despues de la cirugfa se excluyeron del estudio antes de las inyecciones. Tambien se excluyo a los ratones en cualquier momento del estudio debido a necrosis severa (por ejemplo, necrosis total del pie) o si experimentaron perdida de peso intensa exhibieron signos de dolor extremo.
Resultados
El objetivo de estos experimented fue determinar si las UDC protegfan los tejidos de la lesion en un moldeo en roedor de isquemia en la extremidad trasera. Este modelo se realizo creando una lesion en el flujo sangumeo femoral e inyectando celulas en el area aproximadamente 24 horas despues de la lesion. Los resultados se evaluaron estimando la perfusion de los miembros de estos animales y comparandola con el miembro contralateral que no resulto lesionado. Los tejidos tambien se recogieron de estos animales al final del estudio para evaluar la vasculatura y la lesion en los animales. Este estudio tambien se realizo con celulas humanas en ratones desnudos para evitar el rechazo xenogeno de las celulas implantadas.
Los resultados presentados en la figura 1 muestran que las CDU confenan un beneficio a los ratones, ya que se mejoro la perfusion en los animales tratados con las celulas cultivadas los dfas 4 y 8, mientras que el flujo sangumeo tambien mejoro en los animales tratados con las celulas 120304 descongeladas Inmediatamente antes de la inyeccion el dfa 8. Las celulas 072804A no mostraron beneficio en ningun momento, lo que sugiere una diferencia entre estos dos lotes de celulas. Generalmente, los animales mostraron mejoras a lo largo del tiempo, lo que indica que esta cepa de animales tiene cierto grado de capacidad de reparacion nativa. Estos animales tambien eran relativamente jovenes, lo que puede ser un factor en sus capacidades regenerativas innatas.
Los musculos TA se recogieron al final del estudio, y las secciones se probaron con un anticuerpo anti CD31 para detectar las celulas endoteliales vasculares. Los resultados representativos se muestran en la figura 2. Los resultados muestran que los animales de control de PBS presentaron una necrosis macroscopica y una vasculatura limitada en la extremidad isquemica (por ejemplo raton 26 y 43) mientras que los miembros tratados con UDC mostraron niveles relativos mas altos de tincion CD31 y niveles reducidos de necrosis. Los resultados tambien sugieren que los animales tratados con UDC cultivadas mostraron una vasculatura mejorada en comparacion con los controles (control de PBS y, en algunos casos, la extremidad normal (no lesionada)). Se observo un aumento de la tincion de CD 31 en la extremidad isquemica pero tratada en comparacion con la extremidad normal. Los animales tratados con el plasmido VEGF y Umb072804A mostraron resultados similares a los del control con PBS.
Sumario
Estos resultados proporcionan evidencia de que las celulas derivadas del cordon umbilical pueden ser efectivas para mejorar el flujo sangumeo y para reducir la necrosis tisular en un modelo de isquemia de extremidad posterior de roedor. El estudio incluyo dos lotes diferentes de celulas umbilicales que se descongelaron inmediatamente antes de la inyeccion, y los resultados sugirieron que podnan existir diferencias entre los lotes. Las celulas que paredan tener cierta actividad tambien se cultivaron durante aproximadamente 48 horas antes de la inyeccion y se incluyeron en otro grupo de tratamiento. Estas celulas parecen ser las mas efectivas y esto sugiere que el cultivo cambia el perfil de actividad de las celulas. Los resultados de la histologfa tambien proporcionan pruebas de que el tratamiento puede proporcionar efectos protectores. Los resultados no proporcionan suficiente informacion con respecto al mecanismo por el cual las uDc ejercen sus efectos. Sin pretender quedar ligado a teona o mecanismo de accion particular alguno, se cree que las celulas pueden ejercer su efecto estimulando el crecimiento de nuevos vasos sangumeos o protegiendo el tejido muscular de la progresion del dano, por ejemplo, mediante la proteccion frente a la apoptosis o reclutamiento de agentes activos endogenos. Se necesitan estudios adicionales para investigar el mecanismo de accion preciso.
Referencias
1) Rehman, J. et al. (2004) Circulation 109:1292-1298 Ejemplo 2
Ensayo de formacion de red endotelial
La angiogenesis, o formacion de nueva vasculatura, es necesaria para el crecimiento de nuevo tejido. La induccion de la angiogenesis es un objetivo terapeutico importante en muchos estados patologicos. Para identificar la potencial actividad angiogenica de las celulas derivadas de posparto en ensayos in vitro se siguio un metodo bien establecido de siembra de celulas endoteliales sobre una placa de cultivo recubierta con un sustrato de cultivo de celulas biologicas con el nombre comercial MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, MA), un extracto de membrana basal (Nicosia y Ottinettl (1990) In vitro Cell Dev. Biol. 26(2): 119-28). El tratamiento de las celulas endoteliales en MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, MA) con factores angiogenicos estimulara a las celulas para formar una red que es similar a los capilares. Este es un ensayo in vitro comun para el ensayo de estimuladores e
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inhibidores de la formacion de vasos sangumeos (Ito et al. (1996) Int. J. Cancer 67(1):148-52). Los experimented hicieron uso de un sistema de cocultivo con las celulas derivadas del posparto sembradas en insertos de pocillo de cultivo. Estos insertos permeables permiten el intercambio pasivo de componentes de los medios entre el endotelio y los medios de cultivo derivados del posparto.
Materiales v metodos
Cultivo celular
Celulas derivadas de tejido posparto. Se recibieron placentas y cordones umbilicales humanos y se aislaron las celulas como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 1). Las celulas se cultivaron en medio de crecimiento (medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM Invitrogen, Carlsbad, CA), suero bovino fetal al 15 % (v/v) (Hyclone, Logan UT), 100 unidades/mililitro de penicilina, 100 microgramos/mililitro de estreptomicina (Invitrogen), 2-mercaptoetanol al 0,001% (v/v) (Sigma, St. Louis, MO)) en matraces de plastico de cultivo tisular recubiertos con gelatina. Los cultivos se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2. %. Las celulas utilizadas para los experimentos se encontraban entre los pases 4 y 12.
Se digirieron con tripsina celulas de posparto en crecimiento activo, se contaron y se sembraron en insertos de cultivo tisular de 6,5 milfmetros de diametro COSTAR TRANSWELL (Corning, Corning, NY) a razon de 15.000 celulas por inserto. Las celulas se cultivaron en los insertos durante 48-72 horas en medio de crecimiento a 37 °C en condiciones de crecimiento estandar.
Celulas madre mesenquimatosas humanas (hMSC). Se adquirieron hMSC de Cambrex (Walkersvllle, MD) y se cultivaron en MSCGM (Cambrex). Los cultivos se Incubaron en condiciones de crecimiento estandar.
Se digirieron con tripsina las MSC en crecimiento activo y se contaron y se sembraron en insertos de cultivo tisular de 6,5 milfmetros de diametro COSTAR TRANSWELL (Corning, Corning, NY) a razon de 15.000 celulas por inserto. Las celulas se cultivaron en los insertos durante 48-72 horas en medio de crecimiento en condiciones de crecimiento estandar.
Celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Se obtuvieron HUVEC de Cambrex (Walkersvllle, MD). Las celulas se cultivaron en cultivos separados, en medios para celulas endoteliales EGM o EBM (Cambrex). Las celulas se cultivaron sobre plastico de cultivo tisular convencional en condiciones de crecimiento estandar. Las celulas utilizadas en el ensayo se encontraban entre los pases 4 y 10.
Celulas endoteliales de arteria coronaria humana (HCAEC). Se obtuvieron de Cambrex Incorporated (Walkersville, MD). Estas celulas tambien se mantuvieron en cultivos separados, en formulaciones de medios EGM o EBM. Las celulas se cultivaron sobre plastico de cultivo tisular convencional en condiciones de crecimiento estandar. Las celulas utilizadas para los experimentos se encontraban entre los pases 4 y 8.
Ensayos de formacion de red endotelial (MATRIGEL). Se recubrieron placas de cultivo con MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, MA) segun las especificaciones del fabricante. En resumen, se descongelo MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, MA) a 4 °C y se alicuotaron aproximadamente 250 microlitros y se distribuyeron uniformemente en cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos enfriada (Corning). A continuacion, la placa se incubo a 37 °C durante 30 minutos para permitir que el material solidificara. Se digirieron con tripsina los cultivos de celulas endoteliales en crecimiento activo y se realizo el recuento. Las celulas se lavaron dos veces en medios de crecimiento con FBS al 2 %, seguido de centrifugacion, resuspension y aspiracion del sobrenadante. Las celulas se sembraron en los pocillos recubiertos a razon de 20.000 celulas por pocillo en aproximadamente 0,5 mililitros de Medio de crecimiento con FBS al 2 % (v/v). A continuacion, las celulas se incubaron durante aproximadamente 30 minutos para permitir que las celulas se asentaran.
A continuacion, los cultivos de celulas endoteliales se trataron con bFGF humano 10 nanomolar (Peprotech, Rocky Hill, NJ) o con VEGF humano 10 nanomolar (Peprotech, Rocky Hill, NJ) para que hiciera de control positivo para la respuesta de las celulas endoteliales. Se anadieron insertos Transwell sembrados con celulas derivadas de la placenta a pocillos apropiados con medio de crecimiento con FBS al 2 % en la camara del inserto. Los cultivos se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 % durante aproximadamente 24 horas. La placa de pocillos se saco de la incubadora y se tomaron imagenes de los cultivos de celulas endoteliales con un microscopio invertido Olympus (Olympus, Melville, NY).
Resultados
En un sistema de cocultivo con celulas derivadas de la placenta, las celulas derivadas de cordon umbilical, HUVEC, forman redes de celulas (datos no mostrados). Las celulas HUVEC forman redes de celulas limitadas en experimentos de cocultivo con hMSC y con bFGF 10 nanomolar (no mostrado). Las celulas HUVEC sin ningun tratamiento mostraron muy poca o nula formacion de redes (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que las celulas derivadas de posparto liberan factores angiogenicos que estimulan las HUVEC.
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En un sistema de cocultivo con celulas derivadas de la placenta, las celulas derivadas de cordon umbilical, CAEC, forman redes de celulas (datos no mostrados).
En la Tabla 2-1 se muestran los niveles de factores angiogenicos conocidos liberados por las celulas derivadas de posparto en medio de crecimiento. Se sembraron celulas derivadas de posparto sobre insertos como se ha descrito anteriormente. Las celulas se cultivaron a 37°C en oxfgeno atmosferico durante 48 horas en los insertos y, a continuacion, se cambiaron a un medio con FBS al 2 % y se devolvieron a 37 °C durante 24 horas. Se extrajo el medio, se congelo inmediatamente y se almaceno a -80 °C, y se analizo mediante el ensayo ELISA multiplexado SEARCHLIGHT (Pierce Chemical Company, Rockford, IL). Los resultados mostrados son los promedios de las mediciones por duplicado. Los resultados demuestran que las celulas derivadas de posparto no liberan niveles detectables de factor de crecimiento plaquetario bb (PDGF-bb) ni factor de crecimiento epidermico de union a heparina (HBEGF). Las celulas sf liberan cantidades mensurables de inhibidor tisular de metaloproteasa-1 (TIMP-1), angiopoyetina 2 (ANG2), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).
Tabla 2-1. Posibles factores angiogenicos liberados a partir de celulas derivadas de posparto
TIMP1 ANG2 PDGFBB TPO KGF HGF FGF VEGF HBEGF
(pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml)
Plac (P4)
91655,3 175,5 < 2,0 275,5 3,0 58,3 7,5 644,6 < 1,2
Plac (P11)
1592832,4 28,1 < 2,0 1273,1 193,3 5960,3 34,8 12361,1 1,7
Cord. Umb. (P4)
81831,7 < 9,8 < 2,0 365,9 14,1 200,2 5,8 < 4,0 < 1,2
Medio solo
< 9,8 25,1 < 2,0 < 6,4 < 2,0 < 3,2 < 5,4 < 4,0 < 1,2
Las celulas derivadas de posparto se cultivaron en 24 horas en medios con FBS al 2 % en oxfgeno atmosferico. El medio se extrajo y se ensayo mediante ensayo ELISA multiplexado SEARCHLIGHT (Pierce). Los resultados son las medias de un analisis por duplicado. Los valores son las concentraciones en los medios presentadas en picogramos por mililitro de los medios de cultivo. Plac: celulas derivadas de placenta; cord. umb.: celulas derivadas de cordon umbilical.
En la Tabla 2-2 se muestran los niveles de factores angiogenicos conocidos liberados por las celulas derivadas de posparto. Se sembraron celulas derivadas de posparto sobre insertos como se ha descrito anteriormente. Las celulas se cultivaron en medio de crecimiento 5 % en oxfgeno durante 48 horas en los insertos y, a continuacion, se cambiaron a un medio con FBS al 2 % y se devolvieron a incubacion con 5 % de O2 durante 24 horas. Se extrajo el medio, se congelo inmediatamente y se almaceno a -80 °C, y se analizo mediante el ensayo ELISA multiplexado SEARCHLIGHT (Pierce Chemical Company, Rockford, IL). Los resultados mostrados son los promedios de las mediciones por duplicado. Los resultados demuestran que las celulas derivadas de posparto no liberan niveles detectables de factor de crecimiento plaquetario bb (PDGF-BB) ni factor de crecimiento epidermico de union a heparina (HBEGF). Las celulas sf liberan cantidades mensurables de inhibidor tisular de metaloproteasa-1 (TIMP-1), angiopoyetina 2 (ANG2), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).
Tabla 2-2. Posibles factores angiogenicos liberados a partir de celulas derivadas de posparto.
TIMP1 ANG2 PDGF-BB TPO KGF HGF FGF VEG HB-EGF
(pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml)
Plac (P4)
72972,5 253,6 < 2,0 743,1 2,5 30,2 15,1 1495,1 < 1,2
Plac (P11)
458023,1 55,1 < 2,0 2562,2 114,2 2138,0 295,1 7521,3 1,8
Cord. Umb.
50244,7 < 9,8 < 2,0 403,3 10,7 156,8 5,7 < 4,0 < 1,2
(P4)
Medio solo
< 9,8 25,1 < 2,0 < 6,4 < 2,0 < 3,2 < 5,4 < 4,0 < 1,2
Las celulas derivadas de posparto se cultivaron en 24 horas en medios con FBS al 2 % en 5 % de oxfgeno. El medio se extrajo y se ensayo mediante ensayo ELISA multiplexado SEARCHLIGHT (Pierce). Los resultados son las medias de un analisis por duplicado. Los valores son las concentraciones en los medios presentadas en picogramos por mililitro de los medios de cultivo. Plac: celulas derivadas de placenta; cord. umb.: celulas derivadas de cordon umbilical.
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Sumario.
Los resultados demuestran que las celulas derivadas de posparto pueden estimular tanto las celulas de vena umbilical humana como las endoteliales de arteria coronaria para que formen redes en un ensayo MATRIGEL in vitro (BD Discovery Labware, Bedford, MA). Este efecto es similar al observado con factores angiogenicos conocidos en este sistema de ensayo. Estos resultados sugieren que las celulas derivadas del posparto son utiles para estimular la angiogenesis in vivo.
Ejemplo 3
Efecto si hUTC sobre la proliferacion y migracion in vitro de celulas endoteliales
Se llevaron a cabo estudios para determinar los efectos de las celulas derivadas del tejido umbilical humano (hUTC) sobre la proliferacion y migracion de las celulas endoteliales in vitro. Estos efectos se examinaron cocultivando hUTC y celulas endoteliales e incubando cultivos de celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) con lisados de hUTC. Los resultados presentados aqu muestran que las hUTC inducen incrementos en la proliferacion y migracion de las celulas endoteliales. Ademas, los datos sugieren que estos efectos estan mediados, en parte, por el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF).
Materiales y metodos
Cultivo celular
El lote n.° 120304 de celulas derivadas de tejido umbilical humanas crioconservadas se descongelo en el pase 8-9 y se sembro en matraces recubiertos con gelatina y se cultivo en medio de crecimiento Hayflick (DMEm - bajo contenido en glucosa [Gibco, numero de catalogo 11885-084], 15 % v/v de suero bovino fetal [FBS, Hyclone, numero de catalogo SH30070.03], 0,001% v/v de beta-mercaptoetanol [Sigma, numero de catalogo M7154] y 50 U/ml de penicilina y 50 microgramos/ml de estreptomicina [Gibco, 3810 - 74 - 0]). Para los estudios detallados en el presente documento, las celulas utilizadas fueron en el pase 10 u 11. Se obtuvieron celulas endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC, numero de catalogo C2517A), celulas endoteliales de la arteria coronaria humana (HCAEC, numero de catalogo CC2585) y celulas endoteliales de la arteria ilfaca humana (HIAEC, numero de catalogo CC2545) de Cambrex y se cultivaron en medio de crecimiento endotelial (EGM-2MV, numero de catalogo 3202) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Tambien se adquirieron celulas madre mesenquimatosas humanas (MSC, numero de catalogo PT-2501) de Cambrex y se mantuvieron en medio de crecimiento de celulas madre mesenquimatosas (MSCGM, numero de catalogo PT-3001) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los fibroblastos dermicos humanos (CCD9) eran de ATCC y se mantuvieron en medio DMEM/F12 que contema FBS al 10% y penicilina-estreptomicina 1U/ml.
Para el pase rutinario, las celulas se lavaron una vez con solucion salina tamponada con fosfato (PBS, Invitrogen, numero de catalogo 14190) y se separaron por tripsinizacion (0,25 % de tripsina-EDTA, Invitrogen, numero de catalogo 25200-056). Las celulas se contaron usando un instrumento de Guava (Guava Technologies, Hayward, CA) y se sembraron a una densidad de 5000 celulas/cm2. Las celulas se pasaron de forma rutinaria 3-4 veces a la semana.
Factores de crecimiento y anticuerpos
El factor de crecimiento de fibroblastos basico humano recombinante (bFGF, numero de catalogo 100-18B) y el factor de crecimiento de hepatocitos humanos recombinantes (HGF, numero de catalogo 100-39) eran de Peprotech y el factor de crecimiento endotelial vascular humano recombinante (VEGF, numero de catalogo 293-VE) de R y D Systems. Se adquirieron anticuerpos contra bFGF (numero de catalogo abl 1937), HGF (numero de catalogo ab10678) y VEGF (numero de catalogo ab9570) de Abcam (Cambridge, MA).
Preparacion del lisado celular
Los lisados celulares se prepararon a partir de granulados celulares congelados de hUTC n.° 120304 de anteriores crecimientos. Brevemente, el lote n.° 120304 de hUTC se cultivo durante 4 dfas, se cosecho mediante tripsinizacion y se sedimento por centrifugacion. A continuacion, las celulas se lavaron con PBS 3 veces y se resuspendieron en PBS a 1 x 107 celulas/ml. Se introdujeron alfcuotas de 1 ml de suspensiones en tubos de microcentnfuga de 1,5 ml siliconados esteriles y se centrifugaron a 300 rpm durante 5 minutos. Se aspiro el PBS y se almacenaron granulos de celulas a -80 °C hasta su uso.
Para preparar los lisados celulares, los tubos que conteman los sedimentos celulares se sumergieron en nitrogeno lfquido (LN2) durante 60 segundos y luego se sumergieron inmediatamente en un bano de agua a 37 °C durante 60 segundos o hasta que se descongelaron, pero no mas de 3 minutos. Esta etapa se repitio 3 veces. Despues de esta etapa, las muestras congeladas-descongeladas se centrifugaron a 13000 rcf a 4 °C durante 10 minutos y luego se colocaron sobre hielo. El sobrenadante se retiro cuidadosamente y se transfirio a un tubo esteril nuevo siliconado de
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1,5 ml. La etapa de centrifugacion se repitio 3 veces y el sobrenadante resultante se reunio. La concentracion de protema se determino usando el protocolo de microensayo del kit de ensayo de protema Quickstart Bradford (Biorad, numero de catalogo 500-0201). Para estudiar el efecto del lisado celular sobre la proliferacion de HUVEC.
Medicion de la proliferacion celular
Las celulas se recogieron y se sembraron en placas directamente en la formulacion de medio indicada a una concentracion de 5000 celulas/cm2 Para experimented de cocultivo, se usaron transwells de 24 pocillos (numero de catalogo Corning 3413) con celulas endoteliales colocadas en el fondo del pocillo (10.000 celulas/pocillo) y hUTC, MSC o fibroblastos encerrados dentro de los insertos transwell (1650 celulas/Insertos transwell). En los pertedos de tiempo indicados, los insertos que conteman hUTC, MSC o fibroblastos se eliminaron y se desecharon. Las celulas endoteliales se cosecharon anadiendo 90 pl de tripsina a cada pocillo. Las celulas se liberaron pipeteando hacia arriba y hacia abajo y luego se transfirieron a una placa de 96 pocillos limpia. La tripsina se inhibio mediante la adicion de 90 pl de medio. Las celulas se tineron por adicion de 20 pl de solucion de tincion (18 pl de medio + 1 pl de Reactivo Flex de Guayaba Viacount + 1 pl de DMSO) y se cuantificaron usando un instrumento de Guayaba (Guava Technologies, Hayward, CA).
Para estudios sobre el efecto del lisado celular de hUTC n.° 120304 sobre la proliferacion de HUVEC, se sembraron HUVEC en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos a una densidad de 10.000 celulas/pocillo en medio EGM-2MV durante 8 h. A continuacion, se mantuvo a las celulas sin suero mediante incubacion durante la noche en 0,5 ml de medio EGM-2MV que contema FBS al 0,5 % y sin factores de crecimiento. Posteriormente, se anadieron FBS, lisados celulares de hUTC lote n.° 120304 que conteman 62,5 |jg o 125 |jg de protema recien preparados y anticuerpos neutralizantes de FGF (7 pg/ml) o HGF (1 pg/ml). Despues de 4 dfas de cocultivo, las celulas se cosecharon y se contaron usando un instrumento de Guava.
Para estudios sobre los mecanismos potenciales del aumento mediado por hUTC de la proliferacion de celulas endoteliales, se incluyeron anticuerpos neutralizantes de FGF (7 pg/ml), HGF (1 pg/ml) y VEGF (1 pg/ml) en cocultivos de HUVEC Y HCAEC con hUTC. Los anticuerpos se anadieron al medio de cultivo celular cuando las celulas se sembraron en placas inicialmente. Despues de 7 dfas de cocultivo, las celulas se cosecharon y se contaron usando un instrumento de Guava.
Evaluacion de la migracion celular
Para la medicion de la migracion celular, se utilizo un transwell de 6 pocillos (numero de catalogo Corning 3428). Las celulas se sembraron directamente en la formulacion de medio indicada a una concentracion de 5000 celulas/cm2. Las celulas endoteliales se sembraron dentro de los insertos de transwell (23.000 celulas/inserto de transwell) y el lote n°. 120304 de hUTC o las MSC se sembraron en placas en el fondo del pocillo (48.000 celulas/pocillo). La migracion se evaluo despues de 7 dfas de cocultivo contando el numero de celulas en la parte inferior del transwell. En resumen, los transwells se transfirieron a un pocillo limpio y se lavaron una vez con pBs. Las celulas de la parte inferior del pocillo se cosecharon anadiendo tripsina al fondo del pocillo. La tripsina fue inhibida por la adicion de medios de crecimiento completos y de celulas recogidas mediante centrifugacion. A continuacion, las celulas se resuspendieron en 25 pl de medio y 20 pl de este se usaron para obtener recuentos de celulas usando un instrumento de Guava.
Para estudios sobre los mecanismos potenciales del aumento mediado por hUTC en la migracion de celulas endoteliales, se incluyeron anticuerpos neutralizantes de FGF (7 pg/ml) y hGf (1 pg/ml) en cocultivos de HUVEC y HCAEC con el lote n.° 120304 de hUTC. Los anticuerpos se anadieron al medio de cultivo celular cuando las celulas se sembraron en placas inicialmente. Despues de 7 dfas de cocultivo, se cosecharon las celulas que estaban en la parte inferior del inserto de transwell y se contaron usando un instrumento de Guava.
Resultados
Efecto de hUTC sobre la proliferacion de celulas endoteliales
Se utilizo un sistema de cocultivo para estudiar los efectos de hUTC sobre la proliferacion de celulas endoteliales. Esto se realizo usando un conjunto de transwell con celulas endoteliales sembradas en el fondo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y hUTC sembradas en placas dentro de los insertos transwell. En estos experimentos se usaron dos formulaciones de medios diferentes (composicion de medios detallada en Materiales y Metodos): Hayflick 80 % + EGM-2MV 20 % (H80) o Hayflick 50 % + EGM-2MV 50 % (H50). Despues de 6 o 7 dfas de cocultivo, se retiraron los insertos de transwell, se recogieron celulas endoteliales mediante tripsinizacion y se contaron usando el instrumento de Guava.
El efecto del lote hUTC n.1 120304 sobre la proliferacion de celulas endoteliales cultivadas en H80 en comparacion con H50 se muestra en la Figura 1. La proliferacion de HUVEC mantenidos en H50 fue mayor que los mantenidos en H80 (Figura 1A), mientras que HCAEC y HIAEC mostraron un crecimiento similar en estos cocultivo medios formulaciones (Figura 1B y Figura 1C). En ambas formulaciones de medios, el cocultivo de celulas endoteliales con
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el lote # 120304 de hUTC dio lugar a aumentos significativos en el numero de celulas despues de 7 dfas. Todos los estudios de cocultivo posteriores de hUTC y celulas endoteliales se realizaron en la formulacion de medio Hayflick 50% + EGM-2MV 50% (H50).
Las MSC y los fibroblastos tambien se probaron en cocultivos con celulas endoteliales para determinar si otros tipos de celulas tienen la capacidad de influir en la proliferacion de celulas endoteliales. Como se muestra en la Figura 1A, no hubo diferencias en la proliferacion de HUVEC en-medios de cocultivo (H50 o H80) y los que fueron cocultivadas con MSC o con fibroblastos Lo mismo ocurrio con los HCAEC (Figura 1B) y los HIAEC (Figura 1C) donde el cocultivo con el lote n.° 120304 de hUTC dio como resultado una proliferacion celular aumentada mientras que no se observaron diferencias entre las celulas en medio de cocultivo (H50 o H80) que se cocultivaron con MSC.
Para investigar los mecanismos potenciales del aumento mediado por hUTC en la proliferacion de celulas endoteliales, se incluyeron anticuerpos neutralizantes de FGF (7 pg/ml), HGF (1 pg/ml) y VEGF (1 pg/ml) en cocultivos de HUVEC y HCAEC con hUTC. Los resultados en las figuras 2A y 2B muestran que tanto en HUVEC como en HCAEC, la adicion de anticuerpos neutralizantes a FGF y HGF redujo el aumento en el numero de celulas inducido por el lote n.° 120304 de hUTC. A las concentraciones que se utilizaron para estos estudios, estos anticuerpos neutralizantes bloquearon la proliferacion de HUVEC inducida por los factores de crecimiento (Figura 2A). Es interesante observar que un anticuerpo neutralizante de VEGF no tuvo un efecto significativo sobre la proliferacion celular inducida por cocultivo de ambos HUVEC (Figura 2A) y HCAEC (Figura 2B) con hUTC lote n.° 120304. En estudios separados, la proliferacion del lote n.° 120304 de hUTC no se vio afectada por la adicion de anticuerpos neutralizantes a FGF y VEGF al medio de cultivo (datos no mostrados).
Efecto del lisado celular de hUTC n.° 120304 sobre la proliferacion de HUVEC
Tambien se realizaron estudios para determinar el efecto del lisado celular sobre la proliferacion de HUVEC. Las HUVEC se sembraron en placas de 24 pocillos en medio EGM-2MV durante 8 h a una densidad de 5000 celulas/cm2. A continuacion, se mantuvo a las celulas sin suero mediante incubacion durante la noche en 0,5 ml de medio EGM-2MV que contema suero bovino fetal (FBS) al 0,5 % y sin factores de crecimiento. Despues de la incubacion, se anadieron concentraciones variables de lisado celular de hUTC # 120304 recien preparado. En algunos casos, tambien se incluyeron FGF, HGF y anticuerpos neutralizantes. Despues de 4 dfas de cocultivo, las HUVEC se cosecharon y se contaron usando un instrumento de Guava.
La Figura 3 muestra que la adicion de lisados celulares condujo a un aumento en el numero de celulas HUVEC en comparacion con las celulas mantenidas sin suero (0,5 % de FBS) y el aumento en el numero de celulas fue proporcional a la cantidad de lisado celular anadido La menor concentracion de lisado celular utilizado (62,5 pg/ml) dio como resultado un numero de celulas comparable a las celulas incubadas en condiciones optimas de medio (10% de FBS)). Ademas, la adicion de un anticuerpo neutralizante a FGF o HGF modero el aumento en el numero de celulas inducido por las 2 concentraciones diferentes de lisado celular. Estos resultados son consistentes con los resultados obtenidos en cocultivos de HUVEC con hUTC lote n.° 120304.
Efecto de hUTC sobre la migracion de celulas endoteliales
La migracion de las celulas endoteliales se evaluo determinando el numero de celulas que se han movido a traves de una membrana transwell (tamano de poro = 8 micrometres). Las celulas respondedoras, celulas endoteliales, se sembraron en insertos transwell de 6 pocillos y se colocaron HUTC en el fondo del pocillo. Despues de un penodo de cocultivo, las celulas que estaban en la parte inferior del transwell fueron cosechadas y contadas. La Figura 4A muestra la migracion de HUVEC que fueron cocultivadas con hUTC y MSC. El lote n.° 120304 de hUTC indujo el movimiento de HUVEC a la parte inferior del transwell mientras que los MSC no lo hicieron (Figura 4A). El mismo resultado se observo con HCAEC donde cocultivo con hUTC lote # 120304 dio lugar a mas celulas migrando a traves del transwell en relacion con el control de medios (Figura 4B).
El efecto del lote hUTC n.° 120304 sobre el comportamiento migratorio de HUVEC y HCAEC se ensayo adicionalmente con el uso de anticuerpos neutralizantes de FGF y HGF. Como se muestra en la Figura 5A, estos anticuerpos redujeron la migracion de HUVEC inducida por el lote n.° 120304 de hUTC. En cocultivos de HCAEC con hUTC lote # 120304, un anticuerpo neutralizante a hGf bloqueado hUTC lote # 120304 mediada por el aumento de la migracion celular mientras que un anticuerpo neutralizante a FGF no (Figura 5B).
Sumario
Los resultados descritos en el presente documento describen los efectos de los hUTC sobre el comportamiento proliferativo y migratorio de las celulas endoteliales In vitro. Los estudios se realizaron utilizando cocultivos del lote # 120304 de hUTC y celulas endoteliales o incubacion directa de celulas endoteliales con lisado celular preparado a partir del lote n.° 120304 de hUTC.
Para estudios de proliferacion, se probaron los efectos del lote n.° 120304 de hUTC y se usaron tres tipos de celulas endoteliales de diferentes lechos vasculares como celulas respondedoras. El cocultivo con hUTC resulto en una
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proliferacion mejorada de celulas endoteliales. El cocultivo con MSC o fibroblastos dio como resultado numeros de celulas comparables a los controles de los medios. La respuesta proliferativa de HUVEC al lote # 120304 de hUTC se amortiguo mediante la adicion de anticuerpos neutralizantes a FGF y HGF, pero no por neutralizacion del anticuerpo contra VEGF. Esto implica que la induccion de proliferacion por el lote n.° 120304 de hUTC esta mediada por FGF y HGF. Vale la pena senalar que la incubacion de HUVEC con lisado de lote n.° 120304 de hUTC reflejo el efecto observado con cocultivos.
La migracion se cuantifico contando el numero de celulas que estaban en la parte inferior de un transwell y tanto HUVEC y HCAEC fueron utilizados como celulas respondedoras. A diferencia de los estudios con proliferacion, las respuestas migratorias de estas celulas son ligeramente diferentes. El lote n.° 120304 de HUTC indujo la migracion de HUVEC y HCAEC. MSC no indujo la migracion de HUVEC sugiriendo especificidad de esta respuesta a hUTC. Los anticuerpos contra FGF y HGF negaron el efecto del lote hUTC n.° 120304 sobre la migracion de HUVEC mientras que solo el anticuerpo contra HGF afecto a la migracion de HCAEC sugiriendo diferencias entre los dos tipos de celulas endoteliales.
En resumen, los datos muestran que los hUTC inducen proliferacion y migracion de celulas endoteliales In vitro. El uso de anticuerpos neutralizantes implica tanto FGF como HGF en estos efectos observados. Sin embargo, tambien pueden estar implicados otros factores en el comportamiento proliferativo y migratorio de las celulas endoteliales.
La presente invencion no se limita a las realizaciones descritas e ilustradas anteriormente. Se puede variar y modificar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (29)

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    Reivindicaciones
    1. Celulas derivadas del posparto derivadas de tejido del cordon umbilical humano libre de sangre, para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene isquemia periferica, en el que las celulas:
    son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo;
    tienen el potencial de diferenciarse en celulas de al menos un fenotipo de musculo esqueletico, musculo liso vascular, pericito o endotelio vascular; requieren L-valina para el crecimiento;
    pueden crecer en al menos aproximadamente un 5 % de oxfgeno;
    tienen una expresion aumentada de interleucina 8 y de reticulon 1 en relacion con una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimatosa o una celula de la medula osea de la cresta ilfaca; producen CD10, CD13, CD44, CD73 y CD90; y no producen CD45 y CD117.
  2. 2. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en las que las celulas se manipulan geneticamente para producir un producto genico que promueve el tratamiento de la isquemia periferica.
  3. 3. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en las que el tratamiento comprende administrar las celulas con al menos otro tipo celular.
  4. 4. Las celulas para el uso de la reivindicacion 3, en las que el otro tipo de celula es una celula de musculo esqueletico, celula progenitora de musculo esqueletico, celula de musculo liso vascular, celula progenitora de musculo liso vascular, pericito, celula endotelial vascular, celula progenitora de endotelio vascular u otra celula madre multipotencial.
  5. 5. Las celulas para el uso de la reivindicacion 3, en las que al menos otro tipo celular se administra simultaneamente con, o antes o despues, las celulas derivadas del posparto.
  6. 6. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en las que el tratamiento comprende administrar las celulas con al menos otro agente.
  7. 7. Las celulas para el uso de la reivindicacion 6, en las que el agente es un agente antitrombogenico, un agente antiinflamatorio, un agente inmunosupresor, un agente inmunomodulador, un agente proangiogenico o un agente antiapoptotico.
  8. 8. Las celulas para el uso de la reivindicacion 6, en las que el agente se administra simultaneamente con, o antes o despues, las celulas derivadas del posparto.
  9. 9. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en las que el tratamiento comprende administrar las celulas en los sitios de la isquemia periferica.
  10. 10. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en las que el tratamiento comprende administrar las celulas derivadas del posparto mediante inyeccion, infusion, un dispositivo implantado en el paciente o mediante implantacion de una matriz o armazon que contiene las celulas.
  11. 11. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en las que las celulas ejercen un efecto trofico sobre el musculo esqueletico del paciente.
  12. 12. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en las que las celulas ejercen un efecto trofico sobre el musculo liso vascular del paciente.
  13. 13. Las celulas para el uso de la reivindicacion 12, en las que el efecto trofico es la proliferacion de las celulas del musculo liso vascular.
  14. 14. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en las que las celulas ejercen un efecto trofico sobre el endotelio vascular del paciente.
  15. 15. Las celulas para el uso de la reivindicacion 14, en las que el efecto trofico es la proliferacion de las celulas del endotelio vascular.
  16. 16. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en las celulas inducen la migracion de celulas endoteliales vasculares, celulas progenitoras de endotelio vascular, celulas de musculo liso vascular, celulas progenitoras de musculo liso vascular y/o pericitos a los sitios de la isquemia periferica.
  17. 17. Una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene isquemia periferica, que
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    comprende un vehuculo farmaceuticamente aceptable y celulas derivadas del posparto segun se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
  18. 18. La composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 17, que comprende al menos otro tipo celular.
  19. 19. La composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 18, en las que el otro tipo de celula es una celula de musculo esqueletico, celula progenitora de musculo esqueletico, celula de musculo liso vascular, celula progenitora de musculo liso vascular, pericito, celula endotelial vascular, celula progenitora de endotelio vascular u otra celula madre multipotencial.
  20. 20. La composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 17, que comprende al menos otro agente.
  21. 21. La composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 20, en las que el agente es un agente antitrombogenico, un agente antiinflamatorio, un agente inmunosupresor, un agente inmunomodulador o un agente antiapoptotico.
  22. 22. La composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 17, formulada para administracion mediante inyeccion o infusion.
  23. 23. La composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 17, en la que las celulas estan encapsuladas dentro de un dispositivo implantable.
  24. 24. La composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 17, en la que las celulas estan encapsuladas contenidas dentro de una matriz o armazon.
  25. 25. Un kit para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene isquemia periferica, comprendiendo el kit un vehuculo farmaceuticamente aceptable, una poblacion de celulas derivadas del posparto como se define en la reivindicacion 1 e instrucciones para usar el kit en un metodo de tratamiento del paciente.
  26. 26. El kit para el uso de la reivindicacion 25, que comprende ademas al menos un reactivo e instrucciones para cultivar las celulas derivadas del posparto.
  27. 27. El kit para el uso de la reivindicacion 25, que comprende ademas una poblacion de al menos otro tipo celular.
  28. 28. El kit para el uso de la reivindicacion 25, que comprende ademas al menos otro agente para tratar la isquemia periferica.
  29. 29. El kit para el uso de la reivindicacion 25, en el que las celulas inducen migracion de las celulas progenitoras del endotelio vascular a los sitios de la isquemia periferica.
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