CN113559126A - 利用胎盘干细胞治疗疼痛 - Google Patents

Abstract

本文提供了患有疼痛(例如，神经性疼痛)的个体的治疗方法，包括向所述个体施用治疗有效量的组织培养塑料制品贴壁胎盘干细胞(PDAC^TM)。

Description

利用胎盘干细胞治疗疼痛

相关申请

本申请为2012年5月31日提交的、发明名称为“利用胎盘干细胞治疗疼痛”、申请号为201280037087.9的中国发明专利申请的分案申请。

本申请主张2011年6月1日提交的美国临时专利申请No.61/492,314、2011年10月18日提交的美国临时专利申请No.61/548,663和2012年2月3日提交的美国临时专利申请No.61/594,985的优先权，以上每一篇专利的公开内容以其全部并入本文作为参考。

1.技术领域

本文提供了利用分离的胎盘干细胞缓解疼痛的方法，以及治疗患有疼痛的个体的方法。

2.背景技术

由于哺乳动物胎盘丰富并且通常作为医学废物被丢弃，因此它们是医学上有用的干细胞的独特来源。在医学领域需要用于抑制疼痛的改进组合物和方法。因此，本文提供了在疼痛治疗中有用的胎盘干细胞和包含胎盘干细胞的组合物，以及利用它们治疗疼痛的方法。

3.发明内容

在一个方面，本文提供了治疗个体中疼痛或异常感觉情况，如感觉不良(dysaesthesia)、异常性疼痛(allodynia)和痛觉过敏的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的胎盘干细胞，或以胎盘干细胞为条件的培养基，其中所述治疗有效量是足以引起所述疼痛的可检测改善的量。在一种具体的实施方式中，所述方法包括鉴别需要疼痛减轻的个体，或遭受疼痛折磨的个体。在另一种具体的实施方式中，所述方法还包括在施用所述胎盘干细胞之前确定所述个体中疼痛的一个或多个第一水平，以及在施用所述胎盘干细胞之后确定所述个体中疼痛的一个或多个第二水平，其中与所述疼痛的一个或多个第一水平相比，所述治疗有效量的胎盘干细胞降低了所述疼痛的一个或多个第二水平。在一种更具体的实施方式中，所述治疗有效量的胎盘干细胞引起比由于施用安慰剂所引起的改善更好的或更持久的疼痛的可检测改善。在一种更具体的实施方式中，所述疼痛的一个或多个第一水平和所述疼痛的一个或多个第二水平是通过疼痛评估量表来确定的。在一种更具体的实施方式中，该疼痛评估量表为数字疼痛强度量表(Numeric Pain Intensity Scale)；疼痛性质评估量表(Pain Quliaty Assessment Scale)；简单描述性疼痛强度量表(SimpleDescriptive Pain Intensity Scale)；视觉模拟量表(Visual Analog Scale)；Wong-Baker脸谱疼痛分级量表(Wong-Baker FACES Pain Rating Scale)；FLACC量表；CRIES量表；或COMFORT量表。

在另一种具体的实施方式中，所述方法还包括在施用所述胎盘干细胞之前确定个体中疼痛的一种或多种生理学指标的第一水平，以及在施用所述胎盘干细胞之后确定该个体中疼痛的一种或多种生理学指标的第二水平，其中与第一水平相比，该治疗有效量的胎盘干细胞降低了第二水平。在一种更具体的实施方式中，所述疼痛的生理学指标是个体的心率。在一种更具体的实施方式中，在施用后个体中的心率比施用前该个体中的心率更低。在另一种更具体的实施方式中，所述疼痛的生理学指标是所述个体的心脏收缩。在一种更具体的实施方式中，在施用后个体的心脏收缩比施用前该个体中的心脏收缩更低。在另一种更具体的实施方式中，所述疼痛的生理学指标是个体的心脏舒张。在一种更具体的实施方式中，在施用后个体的心脏舒张比施用前该个体中的心脏舒张更低。

在治疗疼痛的方法的另一种实施方式中，所述疼痛为神经性疼痛。在一种具体的实施方式中，所述神经性疼痛是由糖尿病性神经病变引起的。在另一种具体的实施方式中，所述神经性疼痛是由所述个体中的神经损伤造成的。在另一种具体的实施方式中，所述神经性疼痛是由药物引起的。在某些具体的实施方式中，所述药物是含铂抗癌药物或另一种化学治疗药物或者包含含铂抗癌药物或另一种化学治疗药物，其中该含铂抗癌药物例如奥沙利铂、卡铂或顺铂，该另一种化学治疗药物例如紫杉醇或长春新碱。在另一种实施方式中，所述神经性疼痛是由病毒引起的，例如，病毒性疾病，如水痘带状疱疹、疱疹(例如，单纯性疱疹)或人类免疫缺陷性病毒(HIV)。在另一种实施方式中，所述疼痛是由放射性损伤引起的，例如，作为癌症治疗的一部分的放射性损伤。在另一种具体的实施方式中，所述神经性疼痛是由炎症引起的，例如，神经性炎症、神经炎。

在治疗疼痛的方法的另一种实施方式中，所述疼痛为炎症性疼痛。在另一种实施方式中，所述疼痛为骨痛。在一种具体的实施方式中，所述骨痛与癌症有关或者由癌症引起。在另一种实施方式中，所述疼痛是由癌症引起的。在另一种实施方式中，所述疼痛是由外阴痛引起的或者与外阴痛有关。在另一种实施方式中，所述疼痛是由间质性膀胱炎引起的或者与间质性膀胱炎有关。在另一种实施方式中，所述疼痛对类固醇治疗无反应。在另一种实施方式中，所述疼痛对非类固醇抗炎治疗无反应。在另一种实施方式中，所述疼痛对阿片样药物治疗无反应。在另一种实施方式中，所述疼痛对鸦片制剂治疗无反应。

在另一个方面，本文提供了用于在治疗个体中疼痛中有用的治疗有效量的胎盘干细胞或以胎盘干细胞为条件的培养基，其中所述治疗有效量是足以引起所述疼痛中的可检测改善的量。在一种实施方式中，在所述使用前所述个体中疼痛的水平和所述使用后个体中所述疼痛的水平是通过疼痛评估量表来确定的，例如，数字疼痛强度量表；疼痛性质评估量表；简单描述性疼痛强度量表；视觉模拟量表；Wong-Baker脸谱疼痛分级量表；FLACC量表；CRIES量表；或COMFORT量表。在另一种实施方式中，在所述使用前个体中所述疼痛的水平和所述使用后个体中所述疼痛的水平是通过疼痛的一个或多个身体指标来确定的。在一种具体的实施方式中，疼痛的所述生理学指标是个体的心率，例如，所述使用后比所述使用前所述个体中的所述心率更低。在另一种具体的实施方式中，疼痛的所述生理学指标是所述个体的心脏收缩，例如，所述使用后比所述使用前所述个体中的所述心脏收缩更低。在另一种具体的实施方式中，疼痛的所述生理学指标是所述个体中的心脏舒张，例如，所述使用后比所述使用前所述个体中的所述心脏舒张更低。在某些实施方式中，所述疼痛是神经性疼痛。在一种更具体的实施方式中，所述神经性疼痛是由糖尿病性神经病变引起的。在一种更具体的实施方式中，所述神经性疼痛是由所述个体中的神经损伤引起的。在另一种更具体的实施方式中，所述神经性疼痛是由炎症引起的。在另一种更具体的实施方式中，所述神经性疼痛是由药物引起的。在一种更具体的实施方式中，所述药物是含铂抗癌药物或者包含含铂抗癌药物，例如，该含铂抗癌药物是奥沙利铂、卡铂或顺铂，或者该含铂抗癌药物包含奥沙利铂、卡铂或顺铂。在另一种具体的实施方式中，所述药物是紫杉醇或者包含紫杉醇。在其他具体的实施方式中，所述疼痛是炎症性疼痛、骨痛(例如，骨痛与癌症有关或由癌症引起的)、由癌症引起的疼痛、由外阴痛引起的疼痛或者与外阴痛有关的疼痛、由间质性膀胱炎引起的疼痛或者与间质性膀胱炎有关的疼痛或者由退行性关节病(如骨关节炎)引起的疼痛。在某些实施方式中，所述疼痛对类固醇治疗无反应。在某些其他实施方式中，所述疼痛对非类固醇抗炎治疗无反应。在某些其他实施方式中，所述疼痛对阿片样药物治疗无反应。在某些其他实施方式中，所述疼痛对非特异性或者混合的μ/δ阿片样药物治疗无反应。

在上述实施方式中任一种的一种具体实施方式中，所述胎盘干细胞是CD10⁺、CD34^–和CD105⁺。在一种更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞另外是CD200⁺，例如，所述胎盘干细胞是CD10⁺、CD34^–、CD105⁺和CD200⁺。在一种更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞另外是CD45^–和CD90⁺。在一种更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞另外是CD80^–和CD86^–。在其他的具体实施方式中，所述胎盘干细胞表达CD200而不表达HLA-G；或者表达CD73、CD105和CD200；或者表达CD200和OCT-4；或者表达CD73和CD105而不表达HLA-G。在本文所述胎盘干细胞中任一种的一种具体实施方式中，所述胎盘干细胞是HLA-A,B,C⁺。在本文所述实施方式中任一种的具体实施方式中，所述胎盘干细胞另外是OCT-4⁺。在某些实施方式中，将所述胎盘干细胞配制以局部施用。在某些其他实施方式中，将所述胎盘干细胞配制以全身施用，例如，静脉内或动脉内施用。

3.1定义

如本文所使用的，当涉及说明的数值时，术语“约”表示所说明的数值正或负10％内的值。

如本文所使用的，术语“来源/来源于”表示分离自或表示纯化自。例如，胎盘来源贴壁细胞分离自胎盘。术语“来源/来源于”涵盖了由直接分离自组织(例如胎盘)的细胞培养的细胞以及由原代分离物培养或扩增的细胞。

如本文所使用的，“免疫定位”表示在(例如)流式细胞术、荧光活化细胞分选、磁性细胞分选、原位杂交、免疫组织化学等中使用免疫蛋白(例如，抗体或其片段)的化合物(例如，细胞标志物)的检测。

如本文所使用的，术语“SH2”是指结合标志物CD105上的表位的抗体。因此，被称为SH2⁺的细胞是CD105⁺。

如本文所使用的，术语“SH3”和“SH4”是指结合标志物CD73上所存在的表位的抗体。因此，被称为SH3⁺和/或SH4⁺的细胞是CD73⁺。

如本文所使用的，如果在(例如)干细胞的收集和/或培养期间从干细胞中除去了至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少99％的干细胞与之天然相联系的其他细胞，那么干细胞就被“分离”。“分离的”细胞群体表示与所述细胞群体来源的组织(例如，胎盘)的其他细胞基本分离的细胞群体。如果在(例如)干细胞群体的收集和/或培养期间从所述干细胞群体中除去了至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少99％的所述干细胞群体与之天然相联系的细胞，则(例如)干细胞的群体是“分离的”。

如本文所使用的，术语“胎盘干细胞”是指不考虑原代培养后的传代次数，来源于(例如，分离自)哺乳动物胎盘的干细胞或祖细胞，其贴壁至组织培养基底(例如，组织培养塑料板或者纤连蛋白涂覆的组织培养板)。然而，如本文所使用的术语“胎盘干细胞”不表示滋养层细胞(trophoblast)、细胞滋养细胞(cytrophoblast)、胚胎生殖细胞或胚胎干细胞，如本领域技术人员知道的这些细胞。如果细胞保留了干细胞的至少一种性质，例如，与一种或多种类型干细胞有关的标志物或基因表达谱；在培养中复制至少10-40次的能力；多潜能性，例如，体外、体内或体外和体内分化为三种胚层中的一种或多种的细胞的能力；缺乏成熟(即分化的)细胞特性等，则认为该细胞是“干细胞”。术语“胎盘干细胞”和“胎盘来源的干细胞”可以互换使用。除非在本文中另作说明，否则术语“胎盘”包括脐带。在某些实施方式中，本文所公开的胎盘干细胞是体外多能的(即所述细胞在分化条件下能够体外分化)、体内多能的(即所述细胞能够体内分化)或两者。

如本文所使用的，当特定标志物是可检测的时，则干细胞对该标志物是“阳性的”。例如，由于CD73在胎盘干细胞上是以比背景(与(例如)任何给定测定的同型对照或实验阴性对照相比)可检测地更大的量可检测的，因此胎盘干细胞对于(例如)CD73是阳性的。在由细胞所提供或表达情况下标志物可用于将该细胞与至少一种其他细胞类型进行区分或可用于选择或分离该细胞时，该细胞对于标志物也是阳性的。

如本文所使用的，“免疫调节”和“免疫调节的”表示引起免疫应答的可检测变化或具有引起所述变化的能力，和引起免疫应答的可检测变化的能力。

4.附图说明

图1示出了CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞、载体或加巴喷丁(GBP)降低神经性疼痛模型中疼痛的效力。X轴：条件；Y轴：根据Von Frey细丝分类测定的敏感性(异常性疼痛)改善。“D”：天数。GBP：加巴喷丁。MPK：毫克每千克。BL：基线。

图2示出了在神经性疼痛动物模型中由CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞(1×10⁶、3×10⁶或10×10⁶个细胞/次施用)、载体或加巴喷丁(GBP)的施用所产生的总疼痛减轻(TOPAR)程度。星号表示与单独的载体施用相比的显著结果。

图3A-图3D示出了CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞对通过26g力Von Frey纤维所测量的机械性异常性疼痛的影响(A)：施用4×10⁶个胎盘干细胞(正方形)和载体(菱形)后，同侧四肢的后爪回缩频率。(B)：施用4×10⁶个胎盘干细胞(正方形)和载体(直线)后，对侧四肢的后爪回缩频率。(C)：胎盘干细胞对同侧四肢的机械性异常性疼痛降低的剂量依赖性作用。(D)：胎盘干细胞对疼痛降低反应者百分比的剂量依赖性作用。*P<0.05；**p<0.01相对于载体。对于图3C和图3D，第一柱(最左侧)代表载体；第二柱代表4×10⁶个胎盘干细胞；第三柱代表1×10⁶个胎盘干细胞；和第四柱(最右侧)代表4×10⁵个胎盘干细胞。

图4A-图4B表明在第4天，在引流淋巴结处，CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞抑制树突状细胞的募集、活化和分化。(A)：胎盘干细胞处理组具有较低的CD11c、CD86和CD80基因表达。(B)：胎盘干细胞处理组具有较低的IL-12基因表达。*P<0.05；**p<0.01相对于载体。对于图4A和图4B，第一柱(最左侧)代表载体；第二柱(最右侧)代表胎盘干细胞。

图5A-图5C表明CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞抑制T细胞活化，调节T细胞分化和细胞因子谱。(A)：在第4天，在引流淋巴结处，胎盘干细胞处理组具有较低的CD3和CD69基因表达。(B)在第4天，在引流淋巴结处，胎盘干细胞处理组具有显著较低的IFNγ基因表达。(C)：在第4天，在引流淋巴结处，胎盘干细胞处理组具有较高的IL-10，但是具有较低的IL-17基因表达。*P<0.05；**p<0.01相对于载体。对于图5A、图5B和图5C，第一柱(最左边)代表载体；第二柱(最右边)代表胎盘干细胞。

图6A-图6B表明在第8天，在同侧坐骨神经中，CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞(PSC)抑制IL-17mRNA(A)和蛋白质(B)的表达。*P<0.05相对于载体。

图7A-图7D表明在第8天，CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞抑制免疫细胞向同侧坐骨神经的浸润。(A)：胎盘干细胞抑制巨噬细胞浸润(Emr1)和活化(CD68)。(B)：胎盘干细胞抑制树突状细胞浸润(CD11c)和活化(CD80、IL-12b)。(C)：胎盘干细胞抑制T细胞浸润(CD3d)和活化(CD69)。(D)：坐骨神经单细胞悬液的流式细胞术分析显示胎盘干细胞抑制T细胞(CD3)和巨噬细胞(ED2)浸润。*P<0.05相对于载体。对于图7A、图7B和图7C，第一柱(最左边)代表载体；第二柱(最右边)代表胎盘干细胞。对于图7D，第一柱(最左边)代表初始细胞；中间的棒代表载体；和第三柱(最右边)代表胎盘干细胞。

图8A-图8L表明在第8天，CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞抑制向同侧坐骨神经的炎症性浸润。正常、载体和胎盘干细胞处理的动物中H&E染色(A-C)、CD68(D-F)、CD8(G-I)和CD4(J-L)。箭头表示A、B和C中的神经束膜；星号表示神经外膜。放大100×，比例尺200mM。

图9表示在第8天，同侧坐骨神经中CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞抑制CCL2、CCL12和CXCL1的mRNA表达。第一柱(最左边)代表载体；第二柱(最右边)代表胎盘干细胞。

图10A-图10D示出了神经损伤程序(D6)后并且在处理(D10、D16、D25和D30)后，基线处大鼠爪子对26g刺激的反应次数。(A)CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞施用后，对CCI诱发的疼痛所观察到的显著疼痛降低。(C)CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞施用后，对CCI诱发的疼痛所观察到的显著疼痛降低。(B，D)显示了对对侧爪子的作用。

图11A-图11B示出了在神经损伤程序(D7)后和治疗(D11、D21、D26和D34)后，在基线(BL)处，大鼠能够在旋转杆上保持的持续时间(至多180秒)。(A)CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞静脉内(IV)处理和对照组。(B)CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞肌内(IM)处理和对照组。

5.具体实施方式

5.1治疗疼痛的方法

本文描述了治疗疼痛的方法，包括施用胎盘来源的细胞，例如，胎盘干细胞，例如，下文5.4节中所述的或如下文实施例7中所述制备的胎盘干细胞。在具体的实施方式中，在本文所述的用于治疗疼痛的方法中使用的胎盘干细胞是CD10⁺、CD34^–、CD105⁺和CD200⁺。在其他的具体实施方式中，在本文所述的治疗疼痛的方法中使用的胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测地更高的水平表达ELOVL2、ST3GAL6、ST6GALNAC5和/或SLC12A8基因。在某些实施方式中，在本文所述的方法中使用的胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测地更高的水平表达CPA4、TCF21和/或VTN基因。在某些实施方式中，在本文所述的方法中使用的胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测地更高的水平表达B4GALT6、FLJ10781和/或NUAK1基因。在一种具体实施方式中，所述胎盘干细胞还以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测地更高的水平表达C11orf9基因。

5.1.1治疗疼痛的方法

通常将疼痛定义为与真实或可能的组织损伤有关或由这些损伤引起的不愉快的感觉和情绪体验。Merskey H,Bogduk N主编,Classification of Chronic Pain,International Association for the Study of Pain(IASP)Task Force on Taxonomy,IASP Press:Seattle,209-214,1994。由于疼痛的感知是非常主观的，因此它是最难以有效诊断和治疗的病理之一。

在一个方面，本文提供了治疗患有疼痛的个体的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的胎盘干细胞，或以胎盘干细胞为条件的培养基，其中所述治疗有效量是足以引起所述疼痛或与所述疼痛有关的症状中的可检测改善的量。在一种实施方式中，所述方法还包括在施用所述胎盘干细胞之前确定个体中疼痛的第一水平，以及在施用所述胎盘干细胞之后确定所述个体中疼痛的第二水平，其中与所述疼痛的第一水平相比，所述治疗有效量的胎盘干细胞降低了所述疼痛的所述第二水平。

在某些实施方式中，当施用时，所述治疗有效量的胎盘干细胞与安慰剂的施用相比引起所述个体中疼痛更好的或更持久的改善。

在某些实施方式中，所述疼痛是伤害性疼痛。通常当组织损伤、疾病或炎症后释放有害刺激物(如炎症性化学介质)时引起伤害性疼痛，并且通过损伤位点处的功能正常的感觉感受器(伤害感受器)检测伤害性疼痛。参见，例如，Koltzenburg,M.Clin.J.of Pain16:S131-S138(2000)。伤害性疼痛的原因的实例包括，但不限于，化学灼伤或热灼伤、皮肤切口和挫伤、骨关节炎、类风湿性关节炎、肌腱炎和肌盘膜痛。在某些实施方式中，通过炎症刺激伤害性疼痛。

在某些其他实施方式中，所述疼痛是神经性疼痛。神经性疼痛反映神经系统的损伤或损害，并且已被定义为“由神经系统中原发性损害或功能障碍引起或造成的疼痛。Merskey H,Bogduk N主编,Classification of Chronic Pain,InternationalAssociation for the Study of Pain(IASP)Task Force on Taxonomy,IASP Press:Seattle,209-214,1994。在一种具体实施方式中，所述神经性疼痛的特征在于周围神经元兴奋性的改变。在其他具体的实施方式中，所述神经性疼痛包括，但不限于，与糖尿病性神经病变有关的疼痛、带状疱疹神经痛、三叉神经痛、炎症(例如，神经性炎症、神经炎)和中风后疼痛。在某些实施方式中，神经性疼痛是持续的、偶发的，并且被描述为灼痛、麻刺、刺痛、急痛、电极状、戳痛、挤压、深部疼痛或痉挛。在某些其他实施方式中，患有神经性疼痛的个体还另外经历了部分或完全感觉缺陷、异常或不熟悉的不愉快感觉(感觉不良)、由非有害刺激物产生的疼痛或对超阈刺激反应的不成比例的疼痛感知(痛觉过敏)。

在另一种具体实施方式中，所述神经性疼痛是复杂性局部疼痛综合征(CRPS)。在一种具体实施方式中，CRPS影响不存在神经损伤的四肢(I型CRPS)。在一种更具体的实施方式中，所述I型CRPS包括反射交感性营养不良(RSD)。在一种更具体的实施方式中，所述RSD是I期RSD或“早期RSD”。在早期RSD中，疼痛比对损伤所期望的要更严重，并且它具有灼烧或疼痛性质。它可能依赖于四肢、身体接触或情绪低落而提高。受影响的区域通常会水肿，并且可能会是高温或低温的，并且可能会显示出指甲和毛发生长的提高。放射照片可以显示出早期骨变化。在另一种更具体的实施方式中，所述RSD是II期RSD或“确定的RSD”。在一种更具体的实施方式中，除疼痛之外，确定的RSD包括水肿组织的硬化；具有网状青斑或青紫症的皮肤的多汗；脱发；指甲脊起、破裂或易断；干燥的手的发展；和/或皮肤和皮下组织的显著萎缩。疼痛仍是主要特征。在另一种更具体的实施方式中，所述RSD是III期RSD或“晚期RSD”。在一种更具体的实施方式中，所述晚期RSD包括向邻近扩散的疼痛；不可逆的组织损伤；皮肤薄且光亮；和在放射照片上可见的骨脱矿物质化。

在另一种具体的实施方式中，所述神经性疼痛是由药物引起的疼痛，例如，化学治疗药物或抗癌药物。在一种具体实施方式中，所述药物是含铂药物、紫杉烷、埃博霉素、植物碱或沙利度胺，或者包含含铂药物、紫杉烷、埃博霉素、植物碱或沙利度胺。在一种更具体的实施方式中，所述药物是或者包含硼替佐米、卡铂(例如，

)、顺铂(例如，

)、阿糖胞苷(例如，

Ara-C)、多西他赛(例如，

)、依托泊苷/VP-16

吉西他滨(例如，

)、

(甲磺酸艾日布林)、六甲三聚氰胺(例如，

)、紫杉醇(例如，

ABRAXANE^TM)、奥沙利铂(例如，

)、苏拉明、沙利度胺(例如，

)、长春碱(例如，

)、长春新碱(例如，

VINCASAR

Vincrex)或长春瑞滨

在某些其他具体实施方式中，所述药物是抗生素。在某些其他实施方式中，所述药物是他汀类药物(抑制素，statin)。

在某些其他具体实施方式中，所述药物是或者包括氨氯地平(例如，

Lotril或Lotrel)、阿托伐他汀(例如，

)、度洛西汀(例如，

)、普瑞巴林

别嘌醇(例如，

)、AMINODIPINBERGLATE、胺碘酮(例如，

)、阿洛地平，阿米替林(例如，ELAVIL^TM、ENDEP^TM、VANATRIP^TM)、甲硝唑(例如，

METROGEL^TM)、呋喃妥因(例如，

NITRO MACRO)、哌克昔林，

环丙沙星(例如，

)、双硫仑(例如，ANTABUSE)、唑吡坦(例如，

)、丁螺环酮(例如，BUSPAR)、氯硝西泮(例如，KLONOPIM、CEBERKLON、VALPAX)、阿普唑仑(例如，

)、苯妥英

西酞普兰(例如，CELEXA)、度洛西汀(例如，

)、文拉法辛(例如，EFFEXOR，EFFEXOR

)、去甲替林(例如，AVENTYL HCL，PAMELOR)、舍曲林(例如，

)、帕罗西汀(例如，PAXIL，PAXIL

)、阿替洛尔(例如，TENORMIN、SENORMIN)、培哚普利(例如，ACEON)、雷米普利(例如，

)、氯沙坦(例如，

)、肼屈嗪(例如，

)、氢氯噻嗪(例如，HYDRODIURIL^TM、EZIDE^TM、HYDRO-PAR^TM、MICROZIDE^TM)、赖诺普利(例如，

)、替米沙坦(例如，MICARDIS^TM)、哌克昔林，哌唑嗪(例如，

)、赖诺普利(例如，

)、洛伐他汀(例如，

)、

罗素伐他汀(例如，

)、氟伐他汀(例如，

)、辛伐他汀(例如，

)、西立伐他汀(例如，LIPOBAY^TM)、吉非贝齐(例如，

)、普伐他汀(例如，

PRAVIGARDPAC^TM)、d4T(司他夫定，例如，

)、ddC(扎西他滨；例如，

)、ddI(去羟肌苷，例如，

)、异烟肼(例如，

)、二氨苯砜(DDS、氨苯砜)。

在某些实施方式中，所述神经性疼痛不是由药物引起的疼痛，例如，化学治疗药物或抗癌药物。在一种具体实施方式中，所述神经性疼痛不是由含铂药物、紫杉烷、埃博霉素、植物碱或沙利度胺所引起的疼痛。在一种更具体的实施方式中，所述神经性疼痛不是由以下药物引起的疼痛：硼替佐米、卡铂(例如，

)、顺铂(例如，

)、阿糖胞苷(例如，

Ara-C)、多西他赛(例如，

)、依托泊苷/VP-16

吉西他滨(例如，

)、

(甲磺酸艾日布林)、六甲三聚氰胺(例如，

)、紫杉醇(例如，

ABRAXANE^TM)、奥沙利铂(例如，

)、苏拉明、沙利度胺(例如，

)、长春碱(例如，

)、长春新碱(例如，

Vincrex)或长春瑞滨

在另一种具体的实施方式中，所述CRPS影响存在神经损伤的四肢(II型CRPS)。在一种更具体的实施方式中，所述CRPS II包括灼痛。在另一种具体的实施方式中，所述CRPS包括交感神经维持的疼痛综合征。在某些实施方式中，CRPS的症状包括，但不限于，疼痛、自主神经功能障碍、浮肿、运动障碍、营养不良、萎缩、灼痛、异常性疼痛(轻触疼痛)。在某些实施方式中，CRPS相关疼痛伴随着肿胀和关节压痛、出汗增多、对温度敏感和/或皮肤变色。

在某些其他具体实施方式中，所述神经性疼痛是由营养不良所引起的或与营养不良有关的神经性疼痛。在更具体的实施方式中，所述营养不良是维生素B12(钴胺素、氰钴胺素)缺乏。在另一种更具体的实施方式中，所述营养不良是维生素B6(吡哆醇、磷酸吡哆醛)缺乏。在另一种更具体的实施方式中，所述营养不良是维生素B1(硫胺素)缺乏。在另一种具体的实施方式中，患有由营养不良引起的神经性疼痛的个体进行了肥胖症治疗手术。在另一种具体的实施方式中，所述神经性疼痛是由酒精中毒或患有疼痛的个体饮酒所造成的或是与之相关的。

在某些实施方式中，所述疼痛是由外阴痛所造成的或者与外阴痛有关。外阴痛是外阴疼痛，例如，不明确地由外阴或阴道炎或者皮肤病引起的疼痛。在一种实施方式中，外阴痛中的疼痛定位在外阴区域，例如，在前庭区，如外阴前庭炎或前庭痛。在另一种实施方式中，外阴痛中的疼痛可以延伸至阴蒂，例如，阴蒂痛(clitorodynia)。造成外阴痛的原因的实例包括，但不限于，性交疼痛、刺激外阴的神经的损伤或刺激，炎症的遗传倾向性、过敏症、自身免疫病症(例如，红斑狼疮或干燥综合征)、感染(例如，酵母感染、HPV或细菌性阴道病)和神经病。外阴痛的示例性症状非限制地包括外阴、大阴唇、小阴唇或前庭处或周围的弥散性疼痛或烧灼感。

在某些实施方式中，所述疼痛是由间质性膀胱炎所造成的或者与间质性膀胱炎有关。间质性膀胱炎(也称为膀胱疼痛综合征)是慢性病况，其特征通常为(例如)与膀胱有关的疼痛或压迫，与排尿有关的疼痛、刺激性排尿、排尿频率、紧急程度，或者骨盆疼痛或压迫。间质性膀胱炎的病理和发病原因尚不清楚。然而，已提出了几种可能的原因，例如，血管阻塞、自身免疫、炎症、膀胱内膜渗漏、肥大细胞、压力，以及遗传、神经原和内分泌原因。在一种实施方式中，可以通过(例如)骨盆疼痛紧急性/频率(PUF)患者调查或KCl测试(也称为钾敏感性测试)来做出间质性膀胱炎的诊断。

在某些其他实施方式中，所述疼痛是内脏痛。

在某些其他实施方式中，所述疼痛是术后疼痛，如由手术期间对组织所造成的创伤所引起的疼痛。

在某些其他实施方式中，所述疼痛是混合性疼痛，例如，是具有伤害性和神经性成分的慢性疼痛。在具体的实施方式中，所述混合性疼痛是癌症痛或下腰痛。

在某些其他实施方式中，所述疼痛是偏头痛或头痛，例如，血管性头痛、集束性头痛或中毒性头痛。

在具体的实施方式中，与疼痛有关的所述症状包括(但不限于)自主神经功能障碍、运动不能、虚弱、颤动、肌肉痉挛、张力障碍、营养不良、萎缩、强直、关节压痛、出汗增多、对温度敏感、轻触(异常性疼痛)、皮肤变色、高温或低温、指甲和毛发生长的提高、早期骨变化、具有网状青斑或青紫症的多汗；脱发；指甲脊起、破裂或易断；手干；弥散性骨质疏松、不可逆性组织损伤、皮肤薄且光亮、关节挛缩和显著的骨脱矿物质化。

在某些实施方式中，根据本文所述的方法向个体施用胎盘干细胞导致所述个体中疼痛降低，同时没有与指示/用于疼痛治疗的一种或多种药物(例如，加巴喷丁)有关的伴随的副作用。在具体的实施方式中，根据本文所述的方法的胎盘干细胞的使用导致施用了胎盘干细胞的个体中疼痛的降低，但是不导致所述个体的感觉和/或运动协调的缺乏。

5.1.2疼痛评估量表

在一种实施方式中，向患有疼痛的个体施用的胎盘干细胞的治疗有效量是导致所述个体中疼痛可检测降低的量。所述降低可以是对个体可检测的，对观察者可检测的，或两者。在本文所提供的治疗方法的某些实施方式中，个体中的疼痛水平是根据一种或多种个体疼痛量表，例如，由医生指导或作为治疗前检查的一部分由所述个体评价的。在某些其他实施方式中，个体中的疼痛水平是由观察者使用一种或多种观察者疼痛量表评价的。当根据胎盘干细胞施用前后的方法评价疼痛水平时，优选地将相同量表用于每次评价。可以在胎盘干细胞施用前对个体中的疼痛评价一次或一次以上，例如，2、3、4或5次，并且在胎盘干细胞施用后评价一次或一次以上，例如，2、3、4或5次。

在一种实施方式中，通过0-10数字疼痛强度量表评价个体中的疼痛。在该量表中，零等于无疼痛，而10等于最疼痛。在某些实施方式中，例如，在疼痛性质评估量表中，将疼痛分为不止一种数字描述，例如，0-10表示感受到的疼痛的“热痛”程度，0-10表示感受到的疼痛的“剧痛”程度，0-10表示感受到的疼痛的“锐痛”程度，0-10表示感受到的疼痛的“钝痛”程度，0-10表示感受到的疼痛的“冷痛”程度，0-10表示感受到的疼痛的“敏感痛”程度，0-10表示感受到的疼痛的“触痛”程度，0-10表示感受到的疼痛的“痒痛”程度，0-10表示感受到的疼痛的“射痛”程度，0-10表示感受到的疼痛的“麻痛”程度，0-10表示感受到的疼痛的“刺痛”程度，0-10表示感受到的疼痛的“电击疼”程度，0-10表示感受到的疼痛的“绞痛”程度，0-10表示感受到的疼痛的“搏动痛”程度，0-10表示感受到的疼痛的“放射性痛”程度，0-10表示感受到的疼痛的“酸痛”程度，0-10表示感受到的疼痛的“重痛”程度和/或0-10表示感受到的疼痛的“不愉快的疼痛”程度。

在另一种实施方式中，通过简单描述性疼痛强度量表评价个体中的疼痛。在该量表中，将疼痛描述为，例如，“无疼痛”、“轻微疼痛”、“中度疼痛”、“严重疼痛”、“极严重疼痛”或“有可能的最疼痛”。

在另一种实施方式中，通过视觉模拟量表评价个体中的疼痛。在视觉模拟量表中，向个体提供由垂直线组成的图；线的一端标记为“无疼痛”，而另一端标记为“有可能的最疼痛”。要求个体在线的两端之间标记点，从而表明由所述个体察觉的疼痛水平。

在另一种实施方式中，通过Wong-Baker脸谱疼痛分级量表评价个体中的疼痛。在面部表情量表中，由一系列卡通面部表情表示疼痛水平，所述卡通面部表情通常有六个面部表情，显示高兴并逐渐变为更不高兴。在具体的实施方式中，面部表情的潜台词为短语，如“无疼痛”、“有点疼痛”、“疼痛较严重”、“疼痛更严重”、“疼痛非常严重”和“疼痛最严重”。在另一种具体的实施方式中，面部表情的潜台词单独为短语，如“无疼痛”、“轻微、烦恼的疼痛”、“使人不安、不舒服、讨厌的疼痛”、“使人痛苦、耐受的疼痛”、“剧烈、厌恶、可怕的疼痛”和“有可能最严重的、难忍的、折磨人的疼痛”，或者与数字0至10等级结合。

在某些实施方式中，通过FLACC(面部表情、肢体动作、活动、哭喊和可安慰性)量表评价个体中的疼痛。在具体的实施方式中，从(例如)0至2对五种特征中的每一种打分，其中2表示疼痛，0表示无疼痛。得分可以单独使用或总计使用。

在某些其他实施方式中，通过CRIES(哭闹、SaO₂(血红蛋白饱和)所需的O₂、生命体征升高(血压和心率)、面部表情和失眠)量表评价个体中的疼痛。在具体的实施方式中，从(例如)0至2对五种特征中的每一种打分，其中2表示疼痛，0表示无疼痛。得分可以单独使用或总计使用。

在某些实施方式中，通过COMFORT量表评价个体中的疼痛，所述量表评价了9种不同的特征(警觉度、安静、呼吸困难、哭闹、身体运动度、肌张力、面部紧张度、血压和心率)、每个特征按照1-5级打分，其中1表示无疼痛或疼痛最小，而5表示最疼痛。得分可以单独使用或总计使用。

5.1.3疼痛的生理学指标

如本文所使用的，“疼痛的治疗”等可以包括完全消除疼痛；通过遭受疼痛的个体的疼痛显著降低；通过客观标准(例如，心率、血压、肌张力等)的疼痛或疼痛指征的可检测降低；或任意两种或全部三种的组合。在某些其他实施方式中，可以在胎盘干细胞施用之前或之后或者之前和之后，通过生理学标准(例如，压力的生理学标准)来评价个体中的疼痛。这些生理学标准可以包括客观可测量的标准，如心率或血压，例如，与个体中非疼痛状态相比或者与预期规范(例如，心脏收缩压120和心脏舒张压80；每分钟搏动60次)相比，心率或血液升高。这些生理学标准还可以，或者作为替代，包括主观可测量的标准，如面部表情、肌肉紧张(肌张力)、出汗、发抖等。

因此，在某些实施方式中，施用于患有疼痛的个体的治疗有效量的胎盘干细胞引起所述个体的心率可检测的降低，例如，降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％；心率从每分钟搏动120次(bpm)或以上降低至低于110bpm；从110bpm或以上降低至低于100bpm；从100bpm或以上降低至低于90bpm；从90bpm或以上降低至低于80bpm；从120bpm或以上降低至低于100bpm；从110bpm以上降低至低于90bpm；从100bpm或以上降低至低于80bpm；从130bpm或以上降低至低于100bpm；从120bpm或以上降低至低于90bpm；从110bpm或以上降低至低于80bpm；或者从120bpm或以上降低至低于80bpm。

在某些其他实施方式中，当施用于患有疼痛的个体时，治疗有效量的胎盘干细胞引起所述个体的血压可检测的降低，例如，个体的心脏收缩压、心脏舒张压，或两者降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％；个体心脏收缩压从200或以上降低至低于190；心脏收缩压从190或以上降低至低于180；心脏收缩压从180或以上降低至低于170；心脏收缩压从170或以上降低至低于160；心脏收缩压从160或以上降低至低于150；心脏收缩压从150或以上降低至低于140；心脏收缩压从140或以上降低至低于130；心脏收缩压从200或以上降低至低于180；心脏收缩压从190或以上降低至低于170；心脏收缩压从180或以上降低至低于160；心脏收缩压从170或以上降低至低于150；心脏收缩压从160或以上降低至低于140；心脏收缩压从150或以上降低至低于130；心脏收缩压从200或以上降低至低于170；心脏收缩压从190或以上降低至低于160；心脏收缩压从180或以上降低至低于150；心脏收缩压从170或以上降低至低于140；心脏收缩压从160或以上降低至低于130；心脏收缩压从200或以上降低至低于160；心脏收缩压从190或以上降低至低于150；心脏收缩压从180或以上降低至低于140；心脏收缩压从200或以上降低至低于130；心脏收缩压从200或以上降低至低于150；心脏收缩压从190或以上降低至低于140；心脏收缩压从180或以上降低至低于130；心脏收缩压从200或以上降低至低于140；心脏收缩压从190或以上降低至低于130；或者心脏收缩压从200或以上降低至低于130；个体心脏舒张压从140或以上降低至低于130；心脏舒张压从130或以上降低至低于120；心脏舒张压从120或以上降低至低于110；心脏舒张压从110或以上降低至低于100；心脏舒张压从100或以上降低至低于90；心脏舒张压从140或以上降低至低于120；心脏舒张压从110或以上降低至低于90；心脏舒张压从140或以上降低至低于110；心脏舒张压从130或以上降低至低于100；心脏舒张压从120或以上降低至低于90；心脏舒张压从140或以上降低至低于100；心脏舒张压从130或以上降低至低于90；或者心脏舒张压从140以上降低至低于90。

在某些实施方式中，当施用于患有疼痛的个体时，治疗有效量的胎盘干细胞一起所述个体中一种或多种细胞因子(例如，促炎细胞因子)的量可检测的降低。在一种具体实施方式中，根据本文所述的方法向患有疼痛的个体施用胎盘干细胞使得所述个体中IL-2、IL-6、IL-12、IL-17和/或干扰素-γ或其任意组合的量减少。可以使用本领域中已知的任何方法完成对个体中细胞因子降低的评价，例如，可以使用(例如)ELISA来测量个体血浆中的细胞因子水平。

在某些实施方式中，当施用于患有疼痛的个体时，治疗有效量的胎盘干细胞引起所述个体中一种或多种细胞因子可检测的增加。在一种具体实施方式中，根据本文所述的方法向患有疼痛的个体施用胎盘干细胞使得所述个体中IL-10的量的增加。可以使用本领域中已知的任何方法完成对个体中细胞因子水平提高的评价，例如，可以使用(例如)ELISA来测量个体血浆中的细胞因子水平。

在某些实施方式中，当施用于患有疼痛的个体时，治疗有效量的胎盘干细胞引起所述个体中一种或多种趋化因子的量可检测的降低。在一种具体实施方式中，根据本文所述的方法向患有疼痛的个体施用胎盘干细胞使得所述个体中CCL2、CCL12和/或CXCL1或其任意组合的量降低。可以使用本领域中已知的任何方法完成对个体中趋化因子的评价，例如，可以使用(例如)ELISA来测量个体血浆中的趋化因子水平。

在某些实施方式中，当施用于患有疼痛的个体时，治疗有效量的胎盘干细胞引起所述个体中一种或多种细胞类型中活化和/或分化的可检测降低。在一种具体实施方式中，根据本文所述的方法向患有疼痛的个体施用胎盘干细胞使得所述个体中树突状细胞、T细胞和/或巨噬细胞或其任意组合的活化和/或分化的降低。可以使用本领域中已知的任何方法完成对个体中特异性细胞类型的活化和/或分化的评价，例如，所述个体的特定区域中存在的特异性细胞标志物的测量，例如，与血液细胞有关的或与特异性组织/器官中发现的细胞有关的特异性细胞标志物的测量/评价。

5.2与疼痛有关或者成为疼痛原因的炎症反应的抑制

炎症不是疼痛的单一来源。然而，在某些实施方式中，胎盘干细胞可用于改善与炎症有关或由炎症引起的疼痛。在一种实施方式中，本文提供了个体中疼痛改善的方法，包括使个体中的免疫细胞与有效量的胎盘干细胞接触，其中所述有效量是(1)可检测地抑制所述个体中免疫应答和(2)可检测地降低所述个体中疼痛的量。在具体的实施方式中，所述胎盘干细胞可检测地抑制混合淋巴细胞反应(MLR)测定或回归测定中T细胞的增殖。可以通过(例如)向所述个体(例如)局部、全身或区域性(或者通过这些的组合)施用胎盘干细胞来完成接触。因此，本文提供了个体中疼痛改善的方法，包括使个体中的免疫细胞与有效量的胎盘干细胞接触，其中所述有效量是(1)可检测地调节(例如，抑制)所述个体中免疫和/或炎症反应和(2)可检测地降低所述个体中疼痛的量。在一种具体实施方式中，用有效量的胎盘干细胞接触个体中免疫细胞使得所述个体中IL-2、IL-6、IL-12、IL-17和/或干扰素-γ或其任意组合的量的减少。在另一种具体实施方式中，用有效量的胎盘干细胞接触所述个体中的免疫细胞使得所述个体中CCL2、CCL12和/或CXCL1或其任意组合的量的减少。在另一种具体实施方式中，用有效量的胎盘干细胞接触个体中的免疫细胞使得所述个体中IL-10的量增加。

在另一种实施方式中，本文提供了个体中疼痛改善的方法，包括将有效量的胎盘干细胞施用于所述个体，其中所述有效量是(1)可检测地调节(例如，抑制)所述个体中免疫和/或炎症反应和(2)可检测地降低所述个体中疼痛的量。在一种具体实施方式中，所述胎盘干细胞可检测地抑制混合淋巴细胞反应(MLR)测定或回归测定中T细胞的增殖。所述施用可以局部、全身或区域性(或通过这些的组合)进行。在一种具体实施方式中，向个体施用有效量的胎盘干细胞使得所述个体中IL-2、IL-6、IL-12、IL-17和/或干扰素-γ或其任意组合的量减少。在另一种具体实施方式中，向个体施用有效量的胎盘干细胞使得所述个体中CCL2、CCL12和/或CXCL1或其任意组合的量减少。在另一种具体实施方式中，向个体施用有效量的胎盘干细胞使得所述个体中IL-10的量增加。

在该方法的背景中，“免疫细胞”表示(适应性或天然)免疫系统的任何细胞，具体地为T细胞和NK(自然杀伤)细胞、树突状细胞和巨噬细胞。因此，在所述方法的多种实施方式中，胎盘干细胞与多个免疫细胞接触，其中所述多种免疫细胞是或包括多种T细胞(例如，多种CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞)和/或自然杀伤细胞。在该方法的背景中，“免疫应答”可以是免疫细胞对通常由免疫细胞所感知的刺激物的任何应答，例如，对抗原存在性的应答。在多种实施方式中，免疫应答可以是对非己抗原(如输注或移植物中存在的抗原)或对自身抗原(如在自身免疫病中)应答的T细胞(例如，CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞)的增殖。免疫应答还可以是移植物内所含的T细胞的增殖。免疫应答还可以是自然杀伤(NK)细胞的任何活性、树突状细胞的成熟、T细胞的分化、巨噬细胞偏向(skewing)M1或M2系等。

用于降低或改善疼痛(例如，通过降低炎症)的胎盘干细胞还可以来源于单个物种，例如，预期受体的物种或将降低或抑制其功能的免疫细胞的物种，或者可以来源于多个物种。

在多种实施方式中，与不存在胎盘干细胞的免疫功能相比，所述接触足以将受疼痛困扰的个体中的免疫功能(例如，对抗原应答的T细胞增殖)或炎症抑制至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。可以使用(例如)来自所述个体的T细胞样品在体外测定(参见下文)中确定体内背景中的这种抑制；即，可以对于受体个体中胎盘干细胞的具体数目和免疫细胞的数目将体外测定中的抑制程度外推至个体中的抑制程度。

可以在(例如)包含以约10:1:2的比值混合的CD4⁺或CD8⁺T细胞、树突状细胞(DC)和胎盘干细胞的MLR中测试胎盘干细胞，其中用染料(例如，区分为子代细胞的CFSE)对T细胞染色，并且其中允许T细胞增殖约6天。T细胞和/或DC细胞可以获自待治疗个体，例如，可以对所述个体是自体同源(autologous)的，或者可以对所述个体是同种异体(allogeneic)的。如果与在存在DC但不存在胎盘干细胞的情况下的T细胞增殖相比，在存在胎盘干细胞的情况下6天时T细胞增殖可检测地降低，则所述胎盘干细胞是免疫抑制性的。在MLR的一种实施方式中，例如，胎盘干细胞可以融化或从培养物中收获。将约20,000个胎盘干细胞重悬浮于100μl培养基(RPMI 1640、1mM HEPES缓冲液、抗生素和5％混合的人血清)中，并允许在孔底部附着2小时。从整个周围血单核细胞Miltenyi磁珠分离CD4⁺和/或CD8⁺T细胞。所述细胞是CFSE染色的，并且每孔加入总计100,000个T细胞(仅CD4⁺T细胞、仅CD8⁺T细胞或相等量的CD4⁺和CD8⁺T细胞)。将孔中体积恢复至200μl，并且允许进行MLR。

在某些实施方式中，在施用至遭受疼痛的个体之前确定了胎盘干细胞的抗炎活性(即，免疫抑制活性)。这可以通过(例如)确定用于改善疼痛所施用的胎盘干细胞样品的免疫抑制活性来完成。这种活性可以通过(例如)在(例如)MLR或回归测定中测试胎盘干细胞样品或胎盘干细胞来确定。在一种实施方式中，用样品进行MLR，并且在所述测定中确定了由样品胎盘干细胞所显示的免疫抑制程度。疼痛改善程度预期与样品胎盘干细胞的免疫抑制活性相关。因此，MLR可以用作确定特定胎盘干细胞群体或胎盘干细胞改善由炎症所引起的疼痛的绝对和相对能力的方法。

可以改变MLR的参数以提供更多的数据或更好地确定胎盘干细胞样品或胎盘干细胞免疫抑制，并因此改善疼痛的能力。例如，由于胎盘干细胞的免疫抑制似乎大致与测定中存在的胎盘干细胞数目成比例地增加，因此，在一种实施方式中，可以使用两种或更多种数目的胎盘干细胞进行MLR，例如，每次反应1×10³、3×10³、1×10⁴和/或3×10⁴个胎盘干细胞。在测定中，还可以改变相对于T细胞数目的胎盘干细胞的数目。例如，所述测定中胎盘干细胞和T细胞可以以(例如)约10:1至约1:10，优选地约1:5的任何比例存在，但也可以使用相对更大数目的胎盘干细胞或T细胞。

可以以类似的方式使用回归测定或BTR测定。

相对于个体中已知或预期的免疫细胞(例如，T细胞)数目，可以以约10:1至约1:10，优选地约1:5的比值向个体施用胎盘干细胞。然而，在非限制性实例中，胎盘干细胞可以以约10,000:1、约1,000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1,000或约1:10,000的比值施用于个体。一般地，可以施用约1×10⁵至约1×10⁸个胎盘干细胞/千克受体，优选地约1×10⁶至约1×10⁷个胎盘干细胞/千克受体以使免疫抑制起效。在多种实施方式中，施用于个体或受试者的胎盘干细胞包含至少、大约或不超过1×10⁵、3×10⁵、1×10⁶、3×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、1×10⁸、3×10⁸、1×10⁹、3×10⁹个胎盘干细胞或更多个胎盘干细胞。

胎盘干细胞还可以与一种或多种第二类型的干细胞(例如，来自骨髓的间质干细胞)一起施用。可以将这些第二干细胞与所述胎盘干细胞以(例如)约1:10至约10:1之间的比值施用于个体。

为了有利于胎盘干细胞和免疫细胞体内接触或接近，可以通过足以使胎盘干细胞和免疫细胞彼此接触的任何途径将胎盘干细胞施用于个体。例如，可以将胎盘干细胞(例如)静脉内、肌内、腹膜内、眼内、肠胃外、鞘内、皮下或直接至器官(如胰腺)施用于个体。可以在疼痛位点或在导致疼痛的神经损伤位点，将胎盘干细胞施用至遭受疼痛的个体的区域。对于体内施用，可以将胎盘干细胞配制为药物组合物，如下文5.8.1.2节中所述。

在另一个方面，施用于遭受疼痛的个体的胎盘干细胞已通过基因工程表达一种或多种抗炎细胞因子。在具体的实施方式中，所述抗炎细胞因子包括IL-10。

5.3第二治疗性组合物和第二疗法

在任何上述治疗个体中疼痛的方法中，所述方法可以包括第二治疗性组合物或第二疗法的施用，例如，抗疼痛药物或疗法。在一种优选的实施方式中，第二活性剂能够缓解疼痛，抑制或调节炎症反应，提供镇静效果或抗神经痛效果，或确保患者舒适。

在某些实施方式中，第二治疗性组合物包括，但不限于，阿片类止痛剂、非麻醉性止痛剂、抗炎剂、cox-2抑制剂、α-肾上腺素能受体激动剂或拮抗剂、氯胺酮、麻醉剂、NMDA拮抗剂、免疫调节剂、免疫抑制剂、抗抑郁药、抗惊厥药、抗高血压药、抗焦虑药、钙通道阻断剂、肌肉松弛剂、皮质类固醇、高压氧、JNK抑制剂、已知可缓解疼痛的其他治疗剂，及其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、笼形物、前体药物和药理学活性代谢产物。

在某些实施方式中，第二治疗性组合物是阿片样药物。阿片样药物可用于(例如)治疗严重疼痛。阿片类止痛剂的实例包括，但不限于，羟考酮(例如，

)、硫酸吗啡(例如，MS

和/或

)、哌替啶(例如，

)和芬太尼透皮贴(例如，

)和其他已知的常规药物。羟考酮(例如，

)是阿片样药物的长效形式并且可以在(例如)早期和晚期CRPS中使用。

可以将非麻醉止痛剂和抗炎剂用于(例如)怀孕和哺乳期间的疼痛治疗。可以在(例如)早期疼痛综合征中使用非甾体抗炎药物(NSAID)。抗炎剂的实例包括，但不限于，乙酰水杨酸(例如，阿司匹林)、布洛芬(例如，

等)、酮洛芬(例如，

)、罗非考昔(例如，

)、萘普生钠(例如，

等)、酮咯酸(例如，

)或其他已知的常规药物。特异性cox-2抑制剂是塞来考昔(例如，CELEBREX)。

抗抑郁剂的第二治疗性化合物的实例包括，但不限于，去甲替林

阿米替林

丙米嗪

多塞平

氯米帕明

氟西汀

舍曲林

奈法唑酮

文拉法辛

曲唑酮

安非他酮

和其他已知的常规药物。参见，例如，Physicians’Desk Reference,329,1417,1831和3270页(第57版,2003)。

抗惊厥剂的第二治疗性化合物的实例包括，但不限于，卡马西平、奥卡西平、加巴喷丁

苯妥英、丙戊酸钠、氯硝西泮、托吡酯、拉莫三嗪、唑尼沙胺和噻加宾。参见，例如，Physicians’Desk Reference,2563(第57版,2003)。

其他的第二治疗性化合物包括，但不限于，皮质类固醇(例如，泼尼松、地塞米松或氢化可的松)、口服活性Ib类抗心律不齐剂(例如，美西律)、钙通道阻断剂(例如，硝苯地平)、β-阻断剂(例如，普萘洛尔)、α-阻断剂(例如，酚苄明)和α2-肾上腺素能激动剂(例如，可乐定)，其还可以结合免疫调节化合物使用。参见，例如，Physicians’Desk Reference,1979,2006和2190(第57版,2003)。

在另一种具体实施方式中，所述第二疗法包括免疫调节化合物，其中所述免疫调节化合物是3-(4-氨基-1-氧-1,3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮；3-(4'-氨基异吲哚啉-1'-酮)-1-哌啶-2,6-二酮；4-(氨基)-2-(2,6-二氧(3-哌啶基))-异吲哚啉-1,3-二酮；或者α-(3-氨基邻苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺。在一种更具体的实施方式中，所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物

其中，X和Y中的一个是C＝O，X和Y中的另一个是C＝O或CH₂，并且R²是氢或低级烷基，或者它们可药用盐、水合物、溶剂化物、笼形物、对映异构体、非对映体、外消旋物或立体异构体的混合物。在另一种更具体的实施方式中，所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物

其中，X和Y中的一个是C＝O，而另一个是CH₂或C＝O；

R¹是H、(C₁–C₈)烷基、(C₃–C₇)环烷基、(C₂–C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基、(C₀-C₄)烷基–(C₁-C₆)杂环烷基、(C₀-C₄)烷基–(C₂-C₅)杂芳基、C(O)R³、C(S)R³、C(O)OR⁴、(C₁-C₈)烷基–N(R⁶)₂、(C₁-C₈)烷基–OR⁵、(C₁-C₈)烷基–C(O)OR⁵、C(O)NHR³、C(S)NHR³、C(O)NR³R^3’、C(S)NR³R^3’或(C₁-C₈)烷基–O(CO)R⁵；

R²是H、F、苄基、(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₈)烯基或(C₂-C₈)炔基；

R³和R^3’独立地为(C₁-C₈)烷基、(C₃-C₇)环烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基、(C₀-C₄)烷基–(C₁-C₆)杂环烷基、(C₀-C₄)烷基–(C₂-C₅)杂芳基、(C₀-C₈)烷基–N(R⁶)₂、(C₁-C₈)烷基–OR⁵、(C₁-C₈)烷基–C(O)OR⁵、(C₁-C₈)烷基–O(CO)R⁵或C(O)OR⁵；

R⁴是(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、(C₁-C₄)烷基–OR⁵、苄基、芳基、(C₀-C₄)烷基–(C₁-C₆)杂环烷基或(C₀-C₄)烷基–(C₂-C₅)杂芳基；

R⁵是(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基或(C₂-C₅)杂芳基；

每次出现的R⁶独立地为H、(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₈)烯基、(C₂-C₈)炔基、苄基、芳基、(C₂-C₅)杂芳基或(C₀-C₈)烷基–C(O)O–R⁵或者R⁶基团可以结合以形成杂环烷基；

n是0或1；和

*代表手性碳中心；

或者它们可药用盐、水合物、溶剂化物、笼形物、对映异构体、非对映体、外消旋物或立体异构体的混合物。在另一种更具体的实施方式中，所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物

其中：

X和Y中的一个是C＝O，而另一个是CH₂或C＝O；

R是H或CH₂OCOR’；

(i)R¹、R²、R³或R⁴中的每一个均彼此独立地为卤素、1至4个碳原子的烷基或1至4个碳原子的烷氧基，或者(ii)R¹、R²、R³或R⁴中的一个是硝基或-NHR⁵，并且R¹、R²、R³或R⁴中的其余的为氢；

R⁵是氢或1至8个碳原子的烷基；

R⁶是氢、1至8个碳原子的烷基、苯并、氯或氟；

R’是R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹)；

R⁷是间亚苯基或对亚苯基或者-(C_nH_2n)-，其中n的值为0至4；

所采用的每个R⁸和R⁹均彼此独立地为氢或1至8个碳原子的烷基，或者R⁸和R⁹一起为四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基或-CH₂CH₂X₁CH₂CH₂–，其中X₁是-O-、-S-或-NH-；

R¹⁰是氢、1至8个碳原子的烷基或苯基；和

*代表手性碳中心；

或者它们可药用盐、水合物、溶剂化物、笼形物、对映异构体、非对映体、外消旋物或立体异构体的混合物。在具体的实施方式中，第二治疗性化合物是来那度胺或者玻马利度胺。

可以施用上述治疗剂的任意组合。可以将这些治疗剂与胎盘干细胞任意组合同时或作为单独的治疗过程施用。

应注意，以上所列的一些第二治疗性化合物(例如，氟西汀)尽管具有有益效果，但是其本身可能会在少数接受者中导致作为副作用的神经性疼痛。通常，认为施用这些化合物是安全的；然而，本领域的技术人员(例如，医师)能够确定与进一步神经性疼痛的风险相比，施用这些第二治疗性化合物的相对益处。

可以以药物组合物(例如，适合于静脉内、肌内或腹膜内注射的药物组合物)的形式，将胎盘干细胞施用于遭受疼痛的个体。可以将胎盘干细胞以单一剂量或多个剂量施用于个体。当以多个剂量施用胎盘干细胞时，所述剂量可以是旨在缓解疼痛的治疗性方案的一部分，或者可以是旨在治疗疼痛潜在原因的长期治疗性方案的一部分。在胎盘干细胞与第二治疗剂或者与第二种类型的干细胞一起施用的实施方式中，所述胎盘干细胞和第二治疗剂和/或第二种类型的干细胞可以同时施用或不同时施用，例如，所述施用可以发生在彼此的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50分钟内，或者彼此的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20或22小时内，或者彼此的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天内。

5.4胎盘干细胞和胎盘干细胞群体

本文所提供的治疗患有疼痛的个体或改善个体中疼痛的方法包括向遭受疼痛的个体施用胎盘干细胞。在某些实施方式中，足够数量的胎盘干细胞还具有可检测地抑制免疫功能的能力，例如，混合淋巴细胞反应测定或回归测定中CD4⁺和/或CD8⁺T细胞的增殖。

胎盘干细胞在来源上可以是胎儿的或母体的(即，可以具有母体或胎儿的基因型)。胎盘干细胞群体或包含胎盘干细胞的细胞群体可以包含仅是胎儿或母体来源的胎盘干细胞，或者可以包含胎儿和母体来源的胎盘干细胞的混合群体。可以通过以下所讨论的形态学、标志物和培养特征来鉴别和选择胎盘干细胞和包含胎盘干细胞的细胞群体。

5.4.1物理和形态学特征

当在原代培养或在细胞培养中培养时，如本文所述使用的胎盘干细胞贴壁到组织培养基底上，例如，组织培养容器表面(例如，组织培养塑料制品)。培养中的胎盘干细胞呈现出一般成纤维样星形外观，其中多个胞质突从中央细胞体中伸出。然而，由于胎盘干细胞显示出比成纤维细胞数目更多的这些过程，因此胎盘干细胞在形态上与相同条件下培养的成纤维细胞是可区分的。在形态上，胎盘干细胞还与造血干细胞是可区分的，造血干细胞在培养时一般呈现出更圆的或卵石形态。

5.4.2细胞表面、分子和遗传标志物

在本文所公开的方法(例如，治疗疼痛的方法)中有用的分离的胎盘干细胞(例如，分离的多能胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群体)是组织培养塑料贴壁人胎盘干细胞，其具有多能细胞或干细胞的特征并且表达可用于鉴别和/或分离所述细胞或包含所述干细胞的细胞群体的多种标志物。本文所述的分离的胎盘干细胞和胎盘细胞群体(例如，两种或更多种分离的胎盘干细胞)包括直接获自胎盘或其任何部分(例如，绒毛膜、胎盘绒毛叶等)的胎盘干细胞和含有胎盘细胞的细胞群体。分离的胎盘细胞群体还包括培养物中的(即两种或更多种)分离的胎盘干细胞群体和容器(例如，袋)中的细胞群体。本文所述的分离的胎盘干细胞不是骨髓来源间充质细胞、脂肪来源间质干细胞或获自脐带血、胎盘血或周围血液的间充质细胞。在本文和(例如)美国专利No.7,311,904；7,311,905和7,468,276中；以及在美国专利申请公开No.2007/0275362中说明了在本文所述的方法和组合物中有用的胎盘细胞，例如，胎盘多能细胞和胎盘干细胞，以上专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。

在某些实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是CD34^–、CD10⁺和CD105⁺，如通过流式细胞术所检测的。在另一种具体的实施方式中，分离的CD34^–、CD10⁺、CD105⁺胎盘干细胞具有分化为神经表型细胞、成骨表型细胞和/或软骨形成表型细胞的潜能。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD34^–、CD10⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外还是CD200⁺，即所述胎盘干细胞是CD10⁺、CD34^–、CD105⁺和CD200⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD34^–、CD10⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外还是CD45^–或CD90⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD34^–、CD10⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外还是CD45^–和CD90⁺，如通过流式细胞术所检测的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD34^–、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞另外还是CD90⁺或CD45^–，如通过流式细胞术所检测的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD34^–、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞另外还是CD90⁺和CD45^–，如通过流式细胞术所检测的，即所述细胞是CD34^–、CD10⁺、CD45^–、CD90⁺、CD105⁺和CD200⁺。在另一种具体的实施方式中，所述CD34^–、CD10⁺、CD45^–、CD90⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞另外还是CD80^–和CD86^–。在任何本文所述的实施方式的某些具体实施方式中，所述胎盘干细胞另外还是OCT-4⁺。

分离的胎盘干细胞通常不表达α平滑肌肌动蛋白(αSMA)。分离的胎盘干细胞通常表达MHC I型分子，例如，HLA-A,B,C。

在某些实施方式中，所述胎盘干细胞是CD34^–、CD10⁺、CD105⁺和CD200⁺，和CD38^–、CD45^–、CD80^–、CD86^–、CD133^–、MHC II型^–(例如，HLA-DR,DP,DQ^–)、SSEA3^–、SSEA4^–、CD29⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺、HLA-A,B,C⁺、PDL1⁺、ABC-p⁺和/或OCT-4⁺中的一种或多种，如通过流式细胞术所检测的。在其他实施方式中，任何如上所述的CD34^–、CD10⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外是CD29⁺、CD38^–、CD44⁺、CD54⁺、SH3⁺或SH4⁺中的一种或多种。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘干细胞另外是CD44⁺。在任何上述分离的CD34^–、CD10⁺、CD105⁺胎盘干细胞的另一种具体的实施方式中，所述细胞另外是CD117^–、CD133^–、KDR^–(VEGFR2^–)、HLA-A,B,C⁺、HLA-DP,DQ,DR^-或编程死亡-1配体(PDL1)⁺中的一种或多种，或它们的任意组合。

在另一种实施方式中，所述CD34^–、CD10⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外是CD13⁺、CD29⁺、CD33⁺、CD38^–、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD62E^–、CD62L^–、CD62P^–、SH3⁺(CD73⁺)、SH4⁺(CD73⁺)、CD80^–、CD86^–、CD90⁺、SH2⁺(CD105⁺)、CD106/VCAM⁺、CD117^–、CD144/VE-钙粘素^low、CD184/CXCR4^-、CD200⁺、CD133^–、OCT-4⁺、SSEA3^–、SSEA4^–、ABC-p⁺、KDR^–(VEGFR2^-)、HLA-A,B,C⁺、HLA-DP,DQ,DR^–、HLA-G^–或编程死亡-1配体(PDL1)⁺中的一种或多种，或它们的任意组合。在另一种实施方式中，所述CD34^–、CD10⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外是CD13⁺、CD29⁺、CD33⁺、CD38^-、CD44⁺、CD45^–、CD54/ICAM⁺、CD62E^–、CD62L^–、CD62P^–、SH3⁺(CD73⁺)、SH4⁺(CD73⁺)、CD80^–、CD86^–、CD90⁺、SH2⁺(CD105⁺)、CD106/VCAM⁺、CD117^–、CD144/VE-钙粘素^low、CD184/CXCR4^–、CD200⁺、CD133^–、OCT-4⁺、SSEA3^–、SSEA4^–、ABC-p⁺、KDR^–(VEGFR2^–)、HLA-A,B,C⁺、HLA-DP,DQ,DR^–、HLA-G^–和编程死亡-1配体(PDL1)⁺。

在另一种具体的实施方式中，任何本文所述的胎盘干细胞另外是ABC-p⁺，如通过流式细胞术所检测的，或OCT-4⁺(POU5F1⁺)，如通过反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)所确定的，其中ABC-p是胎盘特异性ABC转运蛋白(也称为乳腺癌耐药蛋白(BCRP)或耐米托蒽醌蛋白(MXR))，并且OCT-4是八聚物-4蛋白(POU5F1)。在另一种具体的实施方式中，本文所述的任何胎盘干细胞另外是SSEA3^–或SSEA4^–，如通过流式细胞术确定的，其中SSEA3是阶段特异性胚胎抗原3，而SSEA4是阶段特异性胚胎抗原4。在另一种具体的实施方式中，本文所述的任何胎盘干细胞另外是SSEA3^–和SSEA4^–。

在另一种具体的实施方式中，本文所述的任何胎盘干细胞是或者另外是MHC-I⁺(例如，HLA-A,B,C⁺)、MHC-II^–(例如，HLA-DP,DQ,DR^–)或者HLA-G^–中的一个或多个。在另一种具体的实施方式中，本文所述的任何胎盘干细胞另外是MHC-I⁺(例如，HLA-A,B,C⁺)、MHC-II^–(例如，HLA-DP,DQ,DR^–)和HLA-G^–。

本文还提供了分离的胎盘干细胞群体或细胞群体，例如，包含(例如，富含)在本文所公开的方法和组合物中有用的分离的胎盘干细胞的胎盘细胞群体。优选的细胞群体是包含分离的胎盘干细胞的那些，其中所述细胞群体包含(例如)至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％分离的CD10⁺、CD105⁺和CD34^–胎盘干细胞；即，所述群体中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的细胞是分离的CD10⁺、CD105⁺和CD34^–胎盘干细胞。在具体的实施方式中，所述分离的CD34^–、CD10⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外是CD200⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD34^–、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞另外是CD90⁺或CD45^–，如通过流式细胞术所检测的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD34^–、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞另外是CD90⁺和CD45^–，如通过流式细胞术所检测的。在另一种具体的实施方式中，任何如上所述的分离的CD34^–、CD10⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外是CD29⁺、CD38^–、CD44⁺、CD54⁺、SH3⁺或SH4⁺中的一种或多种。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD34^–、CD10⁺、CD105⁺胎盘干细胞或分离的CD34^–、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞另外是CD44⁺。在任何包含上述分离的CD34^–、CD10⁺、CD105⁺胎盘干细胞的细胞群体的具体实施方式中，所述分离的胎盘干细胞另外是CD13⁺、CD29⁺、CD33⁺、CD38^–、CD44⁺、CD45^–、CD54⁺、CD62E^-、CD62L^–、CD62P^-、SH3⁺(CD73⁺)、SH4⁺(CD73⁺)、CD80^–、CD86^–、CD90⁺、SH2⁺(CD105⁺)、CD106/VCAM⁺、CD117^–、CD144/VE^–钙粘素^low、CD184/CXCR4^–、CD200⁺、CD133^–、OCT-4⁺、SSEA3^–、SSEA4^–、ABC-p⁺、KDR^–(VEGFR2^–)、HLA-A,B,C⁺、HLA-DP,DQ,DR^–、HLA-G^-或编程死亡-1配体(PDL1)⁺中的一种或多种，或它们的任意组合。在另一种具体的实施方式中，所述CD34^–、CD10⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外是CD13⁺、CD29⁺、CD33⁺、CD38^–、CD44⁺、CD45^–、CD54/ICAM⁺、CD62E^–、CD62L^–、CD62P^–、SH3⁺(CD73⁺)、SH4⁺(CD73⁺)、CD80^–、CD86^–、CD90⁺、SH2⁺(CD105⁺)、CD106/VCAM⁺、CD117^–、CD144/VE-钙粘素^low、CD184/CXCR4^–、CD200⁺、CD133^–、OCT-4⁺、SSEA3^–、SSEA4^-、ABC-p⁺、KDR^–(VEGFR2^–)、HLA-A,B,C⁺、HLA-DP,DQ,DR^–、HLA-G^-和编程死亡-1配体(PDL1)⁺。

在某些实施方式中，所述细胞群体中分离的胎盘干细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^–、CD38^–、CD44⁺、CD45^–、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^–、SSEA4^–、OCT-4⁺和ABC-p⁺中的一种或多种或者全部，其中所述分离的胎盘干细胞是通过胎盘组织的物理和/或酶促破坏获得的。在一种具体实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是OCT-4⁺和ABC-p⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是OCT-4⁺和CD34^–，其中所述分离的胎盘干细胞具有以下特征中的至少一种：CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^–、CD54⁺、CD90⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^–和SSEA4^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是OCT-4⁺、CD34^–、CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^–、CD54⁺、CD90⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^–和SSEA4^–。在另一种实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是OCT-4⁺、CD34^–、SSEA3^–和SSEA4^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是OCT-4⁺和CD34^–，以及SH2⁺或SH3⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是OCT-4⁺、CD34^–、SH2⁺和SH3⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是OCT-4⁺、CD34^–、SSEA3^–和SSEA4^–，以及SH2⁺或SH3⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是OCT-4⁺和CD34^–，以及SH2⁺或SH3⁺，并且是CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^–、CD54⁺、CD90⁺、SSEA3^–或SSEA4^–中的至少一种。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是OCT-4⁺、CD34^–、CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^–、CD54⁺、CD90⁺、SSEA3^–和SSEA4^–，并且是SH2⁺或SH3⁺中的任一种。

在另一种实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺和OCT-4⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD90⁺、CD34^–、CD45^–、SSEA3^–或SSEA4^–。在另一种实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^–和SSEA4^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^–和SSEA4^–、CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD90⁺、OCT-4⁺、CD34^–或CD45^–。

在另一种实施方式中，在本文所公开的方法和组合物中有用的分离的胎盘干细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^–、CD44⁺、CD45^–、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺和SH4⁺；其中所述分离的胎盘干细胞另外是OCT-4⁺、SSEA3^–或SSEA4^–中的一种或多种。

在某些实施方式中，分离的胎盘干细胞是CD200⁺或HLA-G^–。在具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是CD200⁺和HLA-G^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞另外是CD73⁺和CD105⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–或CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD73⁺和CD105⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD200⁺或HLA-G^-胎盘干细胞在允许胚状体样体形成的条件下在包含所述分离的胎盘干细胞的胎盘细胞群体中促进了胚状体样体的形成。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是从非所述胎盘干细胞的胎盘细胞中分离的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是从不显示该标志物的组合的胎盘细胞中分离的。

在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含(例如，富含)CD200⁺、HLA-G^–胎盘干细胞的细胞群体。在具体的实施方式中，所述群体是胎盘细胞群体。在多种实施方式中，所述细胞群体中至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％的细胞是分离的CD200⁺、HLA-G^–胎盘干细胞。优选地，所述细胞群体中至少约70％的细胞是分离的CD200⁺、HLA-G^–胎盘干细胞。更优选地，至少约90％、95％或99％的所述细胞是分离的CD200⁺、HLA-G^–胎盘干细胞。在所述细胞群体的具体实施方式中，所述分离的CD200⁺、HLA-G^–胎盘干细胞还是CD73⁺和CD105⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD200⁺、HLA-G^–胎盘干细胞还是CD34^–、CD38^-或CD45^-。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD200⁺、HLA-G^–胎盘干细胞还是CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD73⁺和CD105⁺。在另一种实施方式中，当在允许胚状体样体形成的条件下培养时，所述细胞群体产生一个或多个胚状体样体。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体是从未胎盘干细胞的胎盘细胞中分离的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD200⁺、HLA-G^–胎盘干细胞是从不表现出这些标志物的胎盘细胞中分离出来的。

在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的所述分离的胎盘干细胞是CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是HLA-G^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是CD34^–、CD38^–或CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是CD34^–、CD38^-和CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是CD34^–、CD38^–、CD45^–和HLA-G^–。在另一种具体的实施方式中，当所述群体在允许胚状体样体形成的条件下培养时，所述分离的CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺胎盘干细胞在包含分离的胎盘干细胞的胎盘细胞群体中有利于一个或多个胚状体样体的形成。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是从非分离的胎盘干细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是从不表现出这些标志物的胎盘细胞中分离出来的。

在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含(例如，富含)分离的CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞的细胞群体。在多种实施方式中，所述细胞群体中至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％的细胞是分离的CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞。在另一种实施方式中，所述细胞群体中至少约70％的所述细胞是分离的CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞。在另一种实施方式中，所述细胞群体中至少约80％、90％、95％或99％的细胞是分离的CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞。在所述群体的具体实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是HLA-G^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–或CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–、CD45^–和HLA-G^–。在另一种具体的实施方式中，当在允许胚状体样体形成的条件下培养时，所述细胞群体产生一个或多个胚状体样体。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘干细胞群体是从非胎盘干细胞的胎盘细胞中分离的。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘干细胞群体是从不表现出这些特征的胎盘细胞中分离出来的。

在某些其他实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^–、CD38^–、CD44⁺、CD45^–、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^–、SSEA4^–、OCT-4⁺、HLA-G^–或ABC-p⁺中的一种或多种。在具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^–、CD38^-、CD44⁺、CD45^–、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^–、SSEA4^–和OCT-4⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD54⁺、SH2⁺、SH3⁺和SH4⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD54⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺和OCT-4⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD34^–、CD38^–、CD44⁺、CD45^–、CD54⁺、CD90⁺、HLA-G^–、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是OCT-4⁺和ABC-p⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺和OCT-4⁺。在另一种实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是OCT-4⁺、CD34^–、SSEA3^–和SSEA4^–。在具体的实施方式中，所述分离的OCT-4⁺、CD34^–、SSEA3^–和SSEA4^-胎盘干细胞另外是CD10⁺、CD29⁺、CD34^–、CD44⁺、CD45^–、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺和SH4⁺。在另一种实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是OCT-4⁺和CD34^–，以及SH3⁺或SH4⁺。在另一种实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是CD34^–，以及CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD90⁺或OCT-4⁺。

在另一种实施方式中，分离的胎盘干细胞是CD200⁺和OCT-4⁺。在具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是CD73⁺和CD105⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是HLA-G^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞是CD34^–、CD38^–或CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞是CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞是CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G^–。在另一种具体的实施方式中，当所述群体在允许胚状体样体形成的条件下培养时，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞通过包含胎盘干细胞的胎盘细胞群体有利于一个或多个胚状体样体产生。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞是从非所述胎盘干细胞的胎盘细胞中分离的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞是从不表现出这些特征的胎盘细胞中分离出来的。

在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含(例如，富含)CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞的细胞群体。在多种实施方式中，所述细胞群体中至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％的细胞是分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞。在另一种实施方式中，至少约70％的所述细胞是所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞。在另一种实施方式中，所述细胞群体中至少约80％、90％、95％或99％的细胞是所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞。在所述分离的群体的具体实施方式中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞另外是CD73⁺和CD105⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞另外是HLA-G^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G^–。在另一种具体的实施方式中，当在允许胚状体样体形成的条件下培养时，所述细胞群体产生一个或多个胚状体样体。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体是从非分离的CD200⁺、OCT-4⁺胎盘细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体是从不表现出这些标志物的胎盘细胞中分离出来的。

在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的所述分离的胎盘干细胞是CD73⁺、CD105⁺和HLA-G^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺和HLA-G^–胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–或CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^–胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^–胎盘干细胞另外是OCT-4⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^–胎盘干细胞另外是CD200⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^–胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–、CD45^–、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一种具体的实施方式中，当所述群体在允许胚状体样体形成的条件下培养时，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^–胎盘干细胞在包含所述胎盘干细胞的胎盘细胞群体中有利于胚状体样体的形成。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^–胎盘干细胞是从非分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^–胎盘干细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^–胎盘干细胞是从不表现出这些标志物的胎盘细胞中分离出来的。

在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含(例如，富含)分离的CD73⁺、CD105⁺和HLA-G^–胎盘干细胞的细胞群体。在多种实施方式中，所述细胞群体中至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％的细胞是分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^–胎盘干细胞。在另一种实施方式中，所述细胞群体中至少约70％的细胞是分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^–胎盘干细胞。在另一种实施方式中，所述细胞群体中至少约90％、95％或99％的细胞是分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^–胎盘干细胞。在上述群体的具体实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^–胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–或CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^–胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^–胎盘干细胞另外是OCT-4⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-胎盘干细胞另外是CD200⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–、CD45^–、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体是从非CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^–胎盘干细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体是从不表现出这些标志物的胎盘细胞中分离出来的。

在另一种实施方式中，当所述群体在允许胚状体样体形成的条件下培养时，所述分离的胎盘干细胞是CD73⁺和CD105⁺，并且在包含所述CD73⁺、CD105⁺细胞的分离的胎盘细胞群体中有利于一个或多个胚状体样体的形成。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–或CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外是OCT-4⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外是OCT-4⁺、CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞是从非所述细胞的胎盘细胞中分离的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞是从不表现出这些特征的胎盘细胞中分离出来的。

在另一种实施方式中，当所述群体在允许胚状体样体形成的条件下培养时，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含(例如，富含)作为CD73⁺、CD105⁺的分离的胎盘干细胞的细胞群体并且在包含所述细胞的分离的胎盘细胞群体中有利于一个或多个胚状体样体的形成。在多种实施方式中，所述细胞群体中至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％的细胞是所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞。在另一种实施方式中，所述细胞群体中至少约70％的细胞是所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞。在另一种实施方式中，所述细胞群体中至少约80％、90％、95％或99％的细胞是所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞。在上述群体的具体实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–或CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外是OCT-4⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外是CD200⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–、CD45^–、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体是从非所述分离的CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞的胎盘细胞中分离的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体是从不表现出这些标志物的胎盘细胞中分离出来的。

在另一种实施方式中，当所述细胞群体在允许胚状体样体形成的条件下培养时，所述分离的胎盘干细胞是OCT-4⁺，并且在包含所述胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群体中有利于一个或多个胚状体样体的形成。在具体的实施方式中，所述分离的OCT-4⁺胎盘干细胞另外是CD73⁺和CD105⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的OCT-4⁺胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–或CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的OCT-4⁺胎盘干细胞另外是CD200⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的OCT-4⁺胎盘干细胞另外是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的OCT-4⁺胎盘干细胞是从非OCT-4⁺胎盘细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的OCT-4⁺胎盘干细胞是从不表现出这些特征的胎盘细胞中分离出来的。

在另一种实施方式中，当所述群体在允许胚状体样体形成的条件下培养时，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含(例如，富含)作为OCT-4⁺的分离的胎盘干细胞的细胞群体并且在包含所述细胞的分离的胎盘细胞群体中有利于一个或多个胚状体样体的形成。在多种实施方式中，所述细胞群体中至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％的细胞是所述分离的OCT-4⁺胎盘干细胞。在另一种实施方式中，所述细胞群体中至少约70％的细胞是所述分离的OCT-4⁺胎盘干细胞。在另一种实施方式中，所述细胞群体中至少约80％、90％、95％或99％的细胞是所述分离的OCT-4⁺胎盘干细胞。在上述群体的具体实施方式中，所述分离的OCT-4⁺胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–或CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的OCT-4⁺胎盘干细胞另外是CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述分离的OCT-4⁺胎盘干细胞另外是CD73⁺和CD105⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的OCT-4⁺胎盘干细胞另外是CD200⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的OCT-4⁺胎盘干细胞另外是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体是从未所述胎盘干细胞的胎盘细胞中分离的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体是从不表现出这些标志物的胎盘细胞中分离出来的。

在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘干细胞是分离的HLA-A,B,C⁺、CD45^–、CD133^–和CD34^–胎盘干细胞。在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含分离的胎盘干细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的细胞是分离的HLA-A,B,C⁺、CD45^–、CD133^–和CD34^–胎盘干细胞。在具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体是从非HLA-A,B,C⁺、CD45^–、CD133^–和CD34^–胎盘干细胞的胎盘细胞中分离的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞在来源上是非母体的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞群体基本不含母体组分；例如，所述分离的胎盘干细胞群体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞在来源上是非母体的。

在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘干细胞是分离的CD10⁺、CD13⁺、CD33⁺、CD45^–、CD117^–和CD133^–胎盘干细胞。在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含分离的胎盘干细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的细胞是分离的CD10⁺、CD13⁺、CD33⁺、CD45^–、CD117^–和CD133^–胎盘干细胞。在具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群体是从非所述分离的胎盘干细胞的胎盘细胞中分离的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD10⁺、CD13⁺、CD33⁺、CD45^–、CD117^–和CD133^–胎盘干细胞在来源上是非母体的，即具有胎儿基因型。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞群体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、80％、95％、98％或99％的所述细胞在来源上是非母体的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群体是从不表现出这些特征的胎盘细胞中分离出来的。

在另一种实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是分离的CD10⁺、CD33^–、CD44⁺、CD45^–和CD117^–胎盘细胞。在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含(例如，富含)分离的胎盘细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的细胞是分离的CD10⁺、CD33^–、CD44⁺、CD45^–和CD117^–胎盘细胞。在具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体是从非所述细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞在来源上是非母体的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的所述胎盘干细胞在来源上是非母体的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群体是从不表现出这些标志物的胎盘细胞中分离出来的。

在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘干细胞是分离的CD10⁺、CD13^–、CD33^–、CD45^–和CD117^–胎盘干细胞。在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含(例如，富含)分离的CD10⁺、CD13^–、CD33^–、CD45^–和CD117^–胎盘干细胞的细胞群体，其中所述群体中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的细胞是CD10⁺、CD13^–、CD33^–、CD45^–和CD117^–胎盘干细胞。在具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群体是从非所述胎盘干细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞在来源上是非母体的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞在来源上是非母体的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群体是从不表现出这些特征的胎盘细胞中分离出来的。

在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘干细胞是HLA A,B,C⁺、CD45^–、CD34^–和CD133^–，并且另外是CD10⁺、CD13⁺、CD38⁺、CD44⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD200⁺和/或HLA-G^–，和/或对CD117是阴性的。在另一种实施方式中，在本文所述的方法中有用的细胞群体是包含分离的胎盘干细胞的细胞群体，其中所述群体中至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或约99％的细胞是作为HLA A,B,C^–、CD45^–、CD34^–、CD133^–的分离的胎盘干细胞，并且另外对CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200是阳性的，和/或对CD117和/或HLA-G是阴性的。在具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群体是从非所述胎盘干细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞在来源上是非母体的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述胎盘干细胞在来源上是非母体的。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群体是从不表现出这些特征的胎盘细胞中分离出来的。

在另一种实施方式中，分离的胎盘干细胞是作为CD200⁺和CD10⁺的分离的胎盘干细胞，如通过抗体结合所确定的，并且是CD117^–，如通过抗体结合和RT-PCR两者所确定的。在另一种实施方式中，分离的胎盘干细胞是作为CD10⁺、CD29^–、CD54⁺、CD200⁺、HLA-G^–、MHC I型⁺和β-2^–微球蛋白⁺的分离的胎盘干细胞。在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘干细胞是胎盘干细胞，其中至少一种细胞标志物的表达比相同数目的间质干细胞(例如，骨髓源间质干细胞)高至少两倍。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞在来源上是非母体的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞在来源上是非母体的。

在另一种实施方式中，分离的胎盘干细胞是作为CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^–、CD54/ICAM⁺、CD62E^–、CD62L^–、CD62P^–、CD80^–、CD86^–、CD103^–、CD104^–、CD105⁺、CD106/VCAM⁺、CD144/VE-钙粘素^low、CD184/CXCR4^–、β2-微球蛋白^low、MHC-I^low、MHC-II^–、HLA-G^low和/或PDL1^low中的一种或多种的分离的胎盘干细胞。在具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是至少CD29⁺和CD54⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是至少CD44⁺和CD106⁺。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是至少CD29⁺。

在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体包含分离的胎盘干细胞，并且所述细胞群体中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是分离的胎盘干细胞，所述分离的胎盘干细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^–、CD54/ICAM⁺、CD62-E^–、CD62-L^–、CD62-P^–、CD80^–、CD86^–、CD103^–、CD104^–、CD105⁺、CD106/VCAM⁺、CD144/VE-钙粘素^dim、CD184/CXCR4^–、β2-微球蛋白^dim、HLA-I^dim、HLA-II^–、HLA-G^dim和/或PDL1^dim胎盘干细胞中的一种或多种。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^–、CD54/ICAM⁺、CD62-E^–、CD62-L^–、CD62-P^–、CD80^–、CD86^–、CD103^–、CD104^–、CD105⁺、CD106/VCAM⁺、CD144/VE-钙粘素^dim、CD184/CXCR4^–、β2-微球蛋白^dim、MHC-I^dim、MHC-II^–、HLA-G^dim和PDL1^dim胎盘干细胞。在某些实施方式中，当通过干扰素γ(IFN-γ)诱导时，所述胎盘干细胞表达HLA-II标志物。

在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘干细胞是作为CD10⁺、CD29⁺、CD34^–、CD38^–、CD44⁺、CD45^–、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^–、SSEA4^–、OCT-4⁺和ABC-p⁺中的一种或多种或者全部的分离的胎盘干细胞，其中ABC-p是胎盘特异性ABC转运蛋白(也称为乳腺癌耐药蛋白(BCRP)或耐米托蒽醌蛋白(MXR))，其中所述分离的胎盘干细胞是通过已排出脐带血并灌注以除去残余血液的哺乳动物(例如，人)胎盘的灌注获得的。

在任何上述实施方式的另一个具体实施方式中，通过流式细胞术确定了所列举的细胞标志物的表达(例如，分化或免疫原性标志物簇)。在另一种具体的实施方式中，通过RT-PCR确定标志物的表达。

基因谱确认分离的胎盘干细胞和分离的胎盘干细胞群体与其他细胞(例如，间质干细胞，例如，骨髓源间质干细胞)是可区分的。根据一种或多种基因的表达，本文所述的分离的胎盘干细胞可以不同于(例如)骨髓源间质干细胞，与骨髓源间质干细胞相比，在分离的胎盘干细胞中所述基因的表达显著更高。具体地，根据一种或多种基因的表达，在本文提供的治疗方法中有用的分离的胎盘干细胞可以不同于骨髓源间质干细胞，当细胞在相同条件下生长时，在分离的胎盘干细胞中所述基因的表达显著高于(即至少两倍高于)相等个数的骨髓源间质干细胞中的表达，其中所述一种或多种基因为ACTG2、ADARB1、AMIGO₂、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、ZC3H12A或任何上述基因的组合。参见(例如)美国专利申请公开No.2007/0275362，该专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。在某些具体的实施方式中，通过(例如)RT-PCR或微阵列分析(例如，使用U133-A微阵列(Affymetrix))确定了所述一种或多种基因的所述表达。

在另一种具体的实施方式中，当在包含DMEM-LG(例如，得自Gibco)；2％胎牛血清(例如，得自Hyclone Labs)；1×胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)；1×亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)；10^-9M地塞米松(例如，得自Sigma)；10^-4M抗坏血酸2-磷酸酯(例如，得自Sigma)；10ng/mL表皮生长因子(例如，得自R&D Systems)；10ng/mL和血小板源性生长因子(PDGF-BB)(例如，得自R&D Systems)的培养基中培养多次群体倍增(例如，约3至约35次之间任何次数的群体倍增)时，所述分离的胎盘干细胞表达所述一个或多个基因。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞特异性基因是CD200。

这些基因的具体序列可见于GenBank 2008年3月的登录号NM_001615(ACTG2)、BC065545(ADARB1)、(NM_181847(AMIGO₂)、AY358590(ARTS-1)、BC074884(B4GALT6)、BC008396(BCHE)、BC020196(C11orf9)、BC031103(CD200)、NM_001845(COL4A1)、NM_001846(COL4A2)、BC052289(CPA4)、BC094758(DMD)、AF293359(DSC3)、NM_001943(DSG2)、AF338241(ELOVL2)、AY336105(F2RL1)、NM_018215(FLJ10781)、AY416799(GATA6)、BC075798(GPR126)、NM_016235(GPRC5B)、AF340038(ICAM1)、BC000844(IER3)、BC066339(IGFBP7)、BC013142(IL1A)、BT019749(IL6)、BC007461(IL18)、(BC072017)KRT18、BC075839(KRT8)、BC060825(LIPG)、BC065240(LRAP)、BC010444(MATN2)、BC011908(MEST)、BC068455(NFE2L3)、NM_014840(NUAK1)、AB006755(PCDH7)、NM_014476(PDLIM3)、BC126199(PKP-2)、BC090862(RTN1)、BC002538(SERPINB9)、BC023312(ST3GAL6)、BC001201(ST6GALNAC5)、BC126160orBC065328(SLC12A8)、BC025697(TCF21)、BC096235(TGFB2)、BC005046(VTN)和BC005001(ZC3H12A)。

在某些具体的实施方式中，当细胞在相同条件下生长时，所述分离的胎盘干细胞以比相同数目的骨髓源间质干细胞可检测更高的水平表达ACTG2、ADARB1、AMIGO₂、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN和ZC3H12A中的每一个。

在具体的实施方式中，在本文所述的方法中使用的胎盘干细胞以比通过相同数目的骨髓源间质干细胞(BM-MSC)的所述基因的表达可检测更高的水平表达ELOVL2基因。在另一种具体的实施方式中，在本文所述的方法中使用的胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测更高的水平表达ST3GAL6基因。在另一种具体的实施方式中，在本文所述的方法中使用的胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测更高的水平表达ST6GALNAC5基因。在另一种具体的实施方式中，在本文所述的方法中使用的胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测更高的水平表达SLC12A8基因。在某些实施方式中，所述胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测更高的水平表达ARTS-1、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3或TGFB2基因。在某些实施方式中，所述胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测更高的水平表达ARTS-1、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3和TGFB2基因全部或表达它们的任意组合。在某些实施方式中，所述胎盘干细胞另外是CD10⁺、CD34^–、CD105⁺和CD200⁺。在某些实施方式中，所述胎盘干细胞的至少70％是非母体来源的。

在具体的实施方式中，在本文所述的方法中使用的胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测地更高的水平表达ELOVL2、ST3GAL6、ST6GALNAC5和SLC12A8基因全部或表达它们的任意组合。在某些实施方式中，所述胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测更高的水平表达ARTS-1、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3或TGFB2基因。在某些实施方式中，所述胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测更高的水平表达ARTS-1、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3和TGFB2基因全部或表达它们的任意组合。在某些实施方式中，所述胎盘干细胞另外是CD10⁺、CD34^–、CD105⁺和CD200⁺。在某些实施方式中，所述胎盘干细胞的至少70％是非母体来源的。

在某些实施方式中，在本文所述的方法中使用的胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测地更高的水平表达CPA4、TCF21或VTN基因。在具体的实施方式中，在本文所述的方法中使用的胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测更高的水平表达CPA4、TCF21和VTN基因全部或表达它们的任意组合。在某些实施方式中，所述胎盘干细胞另外是CD10⁺、CD34^–、CD105⁺和CD200⁺。在某些实施方式中，所述胎盘干细胞的至少70％是非母体来源的。

在某些实施方式中，在本文所述的方法中使用的胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测更高的水平表达B4GALT6、FLJ10781或NUAK1基因。在具体的实施方式中，所述胎盘干细胞还以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测地更高的水平表达C11orf9基因。在某些实施方式中，所述胎盘干细胞另外是CD10⁺、CD34^–、CD105⁺和CD200⁺。在某些实施方式中，所述胎盘干细胞的至少70％是非母体来源的。

在具体的实施方式中，在本文所述的方法中使用的胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测更高的水平表达B4GALT6、FLJ10781和NUAK1基因全部或表达它们的任意组合。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘干细胞还以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测更高的水平表达C11orf9基因。在具体的实施方式中，在本文所述的方法中使用的胎盘干细胞以比通过相同数目的BM-MSC的所述基因的表达可检测更高的水平表达B4GALT6、FLJ10781、NUAK1和C11orf9基因全部或表达它们的任意组合。在某些实施方式中，所述胎盘干细胞另外是CD10⁺、CD34^–、CD105⁺和CD200⁺。在某些实施方式中，所述胎盘干细胞的至少70％是非母体来源的。

在具体的实施方式中，所述胎盘干细胞以比相同数目的骨髓源间质干细胞可检测更高的水平表达CD200和ARTS1(1型氨肽酶调节子肿瘤坏死因子)；ARTS-1和LRAP(白血球源性精氨酸氨肽酶)；IL6(白介素-6)和TGFB2(转化生长因子β2)；IL6和KRT18(角蛋白18)；IER3(即刻早期反应蛋白3)、MEST(中胚层特异性转录本同源物)和TGFB2；CD200和IER3；CD200和IL6；CD200和KRT18；CD200和LRAP；CD200和MEST；CD200和NFE2L3(核因子(红细胞源2)样蛋白3)；或CD200和TGFB2，其中在培养中所述骨髓源间质干细胞经历了与所述分离的胎盘干细胞所经历的传代次数相等的传代次数。在其他具体的实施方式中，所述胎盘干细胞以比相同数目的骨髓源间质干细胞可检测更高的水平表达ARTS-1、CD200、IL6和LRAP；ARTS-1、IL6、TGFB2、IER3、KRT18和MEST；CD200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3和TGFB2；ARTS-1、CD200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3和TGFB2；或IER3、MEST和TGFB2，其中在培养中所述骨髓源间质干细胞经历了与所述分离的胎盘干细胞所经历的传代次数相等的传代次数。

可以通过标准技术评价上述提及的基因的表达。例如，可以通过常规方法分别选择并构建基于所述基因序列的探针。可以在(例如)包含一种或多种基因的探针的微阵列(例如，Affymetrix

人基因组U133A 2.0阵列或Affymetrix

人基因组U133 Plus 2.0(Santa Clara,California))上评价基因的表达。由于可以使用众所周知的标准技术容易地产生对修改的序列特异的探针，因此即使特定GenBank登录号的序列被修改，但仍可以评价这些基因的表达。

这些基因的表达水平可用于确认分离的胎盘干细胞群体的身份，鉴别细胞群体(由于包含至少多个分离的胎盘干细胞)等。身份确认的分离的胎盘干细胞群体可以是无性系的，例如，分离的胎盘干细胞群体是从单个分离的胎盘细胞扩增的，或者是胎盘干细胞的混合群体，例如，包含从多个分离的胎盘细胞扩增的分离的胎盘干细胞的细胞群体，或者包含如本文所述的分离的胎盘干细胞和至少一种其他类型细胞的细胞群体。

这些基因的表达水平可用于选择分离的胎盘干细胞群体。例如，如果在来自细胞群体的样品中以上所列的一种或多种基因的表达显著高于相等骨髓源间质干细胞群体中的表达，则可以选择细胞群体，例如，克隆扩增的胎盘干细胞。这种选择可以是来自多个分离的胎盘干细胞群体，来自身份未知的多个细胞群体等的群体。

与(例如)骨髓源间质干细胞对照中所述一种或多种基因的表达水平相比，根据一种或多种这类基因的表达水平，可以选择分离的胎盘干细胞。在一种实施方式中，将包含相等个数的骨髓源间质干细胞的样品中所述一种或多种基因的表达水平用作对照。在另一种实施方式中，在一定条件下测试的分离的胎盘干细胞的对照是表示在所述条件下骨髓源间质干细胞中所述一种或多种基因的表达水平的数值。

本文所述的分离的胎盘干细胞在原代培养中或者在包含(例如)DMEM-LG(Gibco)、2％胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories)、1×胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)、1×亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)、10^-9M地塞米松(Sigma)、10^-4M抗坏血酸2-磷酸酯(Sigma)、10ng/ml表皮生长因子(EGF)(R&D Systems)、10ng/ml血小板源性生长因子(PDGF-BB)(R&DSystems)和100U青霉素/1000U链霉素的培养基中增殖期间显示出上述特征(例如，细胞表面标志物和/或基因表达谱的组合)。

在本文所公开的任何胎盘干细胞的某些实施方式中，所述细胞是人细胞。在本文所公开的任何胎盘细胞的某些实施方式中，所述细胞标志物特征或基因表达特征是人标志物或人基因。

在所述分离的胎盘干细胞或包含所述分离的胎盘干细胞的细胞群体的另一种具体的实施方式中，所述细胞或群体已扩增(例如)传代了至少，大约或者不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次，或者增殖了至少，大约或者不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次群体倍增。在所述分离的胎盘干细胞或包含所述分离的胎盘干细胞的细胞群体的另一种具体的实施方式中，所述细胞或群体是原代分离物。在分离的胎盘干细胞或包含本文所公开的分离的胎盘干细胞的细胞群体的另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞在来源上是胎儿的(即，具有胎儿的基因型)。

在某些实施方式中，所述分离的胎盘干细胞在生长培养基(即，配制以促进增殖的培养基)中培养期间(例如，在生长培养基中增殖期间)不分化。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞不需要饲养层来进行增殖。在另一种具体的实施方式中，仅由于饲养细胞层的缺少，所述分离的胎盘干细胞在不存在饲养层的情况下培养时不分化。

在另一种实施方式中，所述分离的胎盘细胞对醛脱氢酶(ALDH)是阳性的，如通过醛脱氢酶活性测定所评价的。这些测定是本领域中已知的(参见，例如，Bostian和Betts,Biochem.J.,173,787,(1978))。在具体的实施方式中，所述ALDH测定使用

(Aldagen,Inc.,Ashland,Oregon)作为醛脱氢酶活性的标志物。在具体的实施方式中，约3％至约25％的胎盘干细胞对ALDH是阳性的。在另一种实施方式中，所述分离的胎盘干细胞显示出比具有大致相同细胞个数并且在相同条件下培养的骨髓源间质干细胞群体高至少三倍或至少五倍的ALDH活性。

在包含本文所述的分离的胎盘干细胞的任何细胞群体的某些实施方式中，所述细胞群体中的胎盘干细胞基本不含具有母体基因型的细胞；例如，所述群体中至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的胎盘干细胞具有胎儿基因型。在包含本文所述的分离的胎盘干细胞的任何细胞群体的某些其他实施方式中，包含所述胎盘干细胞的细胞群体基本不含具有母体基因型的细胞；例如，所述群体中至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的细胞具有胎儿基因型。

在任何上述分离的胎盘干细胞或包含分离的胎盘干细胞的细胞群体的具体实施方式中，细胞(例如，所述群体中所有细胞或至少约95％或约99％的细胞)的染色体组型是正常的。在任何上述胎盘干细胞或群体或胎盘干细胞的另一个具体实施方式中，所述胎盘干细胞是非母体来源的。

在本文所公开的胎盘细胞的任何实施方式的具体实施方式中，所述胎盘细胞是遗传稳定的，其显示出正常的二倍体染色体数和正常的染色体组型。

可以将具有任何上述标志物组合的分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群体以任何比例混合。可以将任何两种或更多种所述分离的胎盘干细胞群体混合以形成分离的胎盘干细胞群体。例如，分离的胎盘干细胞群体可以包含由如上所述的标志物组合之一所定义的第一分离的胎盘干细胞群体和由如上所述的标志物组合的另一个所定义的第二分离的胎盘干细胞群体，其中所述第一和第二群体以约1:99、2:98、3:97、4:96、5:95、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2或约99:1的比值混合。以类似的方式，可以将任何三种、四种、五种或更多种上述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群体混合。

可以通过(例如)使用或不使用酶促消化(参见5.3.3节)或灌注(参见5.3.4节)的胎盘组织破坏来获得在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘干细胞。例如，可以根据以下方法产生分离的胎盘干细胞群体，所述方法包括灌注已排出脐带血并灌注以除去残余血液的哺乳动物胎盘；用灌注溶液灌注所述胎盘；和收集所述灌注溶液，其中灌注后的所述灌注溶液包含含有分离的胎盘干细胞的胎盘细胞群体；和从所述细胞群体分离所述胎盘干细胞。在具体的实施方式中，将灌注溶液通过脐静脉和脐动脉并在其从胎盘流出后收集。在另一种具体的实施方式中，将灌注溶液通过脐静脉并从脐动脉收集，或者通过脐动脉并从脐静脉收集。

在多种实施方式中，包含在得自胎盘灌注的细胞群体内的所述分离的胎盘干细胞是所述胎盘干细胞群体的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少99.5％。在另一种具体的实施方式中，通过灌注收集的分离的胎盘干细胞包含胎儿细胞和母细胞。在另一种具体的实施方式中，通过灌注收集的分离的胎盘干细胞是至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少99.5％的胎儿细胞。

在另一种具体的实施方式中，本文提供了包含通过灌注收集(分离)的如本文所述的分离的胎盘干细胞群体的组合物，其中所述组合物包含用于分离所述胎盘干细胞的灌注溶液的至少一部分。

可以通过以下方法产生本文所述的分离的胎盘干细胞群体：用组织破坏酶消化胎盘组织以获得包含胎盘干细胞的胎盘细胞群体，和从所述胎盘细胞的剩余物中分离或基本分离多个胎盘干细胞。可以将全部或任何部分的胎盘消化以获得本文所述的分离的胎盘干细胞。在具体的实施方式中，例如，所述胎盘组织可以是整个胎盘(例如，包括脐带)、羊膜、绒毛膜、羊膜和绒毛膜的组合，或任何上述的组合。在其他具体的实施方式中，所述组织破坏酶是胰蛋白酶或胶原酶。在多种实施方式中，包含在得自胎盘消化的细胞群体内的所述分离的胎盘干细胞是所述胎盘细胞群体的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少99.5％。

如上所述的分离的胎盘干细胞群体和分离的胎盘干细胞群体一般可以包含约、至少或不超过1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多个分离的胎盘干细胞。在本文所述的治疗方法中有用的分离的胎盘干细胞群体包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的活的分离的胎盘干细胞，例如，如通过(例如)台盼蓝排阻法所确定的。

对于任何上述胎盘干细胞或胎盘干细胞群体，所述细胞或胎盘干细胞群体是或者可以包含已传代了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20代或更多代，或者扩增了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次群体倍增或更多次群体倍增的细胞。

在任何上述胎盘干细胞或胎盘干细胞群体的具体实施方式中，所述群体中细胞或至少约95％或约99％的细胞的染色体组型是正常的。在任何上述胎盘干细胞或胎盘干细胞群体的另一个具体实施方式中，所述细胞或所述细胞群体中的细胞是非母体来源的。

可以将具有任何上述标志物组合的分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群体以任何比例混合。可以将任何两种或更多种上述胎盘干细胞群体分离或富集以形成胎盘干细胞群体。例如，包含由如上所述的标志物组合之一所定义的第一胎盘干细胞群体的分离的胎盘干细胞群体可以与由如上所述的标志物组合的另一个所定义的第二胎盘干细胞群体混合，其中所述第一和第二群体以约1:99、2:98、3:97、4:96、5:95、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2或约99:1的比值混合。以类似的方式，可以将任何三种、四种、五种或更多种上述胎盘干细胞或胎盘干细胞群体混合。

在上述胎盘干细胞的具体实施方式中，所述胎盘干细胞组成性分泌IL-6、IL-8和单核细胞化学引诱蛋白(MCP-1)。

如上所述的胎盘细胞群体可以包含约、至少或不超过1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、2×10⁷、2.5×10⁷、3×10⁷、3.5×10⁷、4×10⁷、4.5×10⁷、5×10⁷、5.5×10⁷、6×10⁷、6.5×10⁷、7×10⁷、7.5×10⁷、8×10⁷、8.5×10⁷、9×10⁷、9.5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多个胎盘干细胞。在某些实施方式中，如上所述的胎盘细胞群体可以包含约1×10⁵至约1×10⁶、约1×10⁵至约1×10⁷、约1×10⁶至约1×10⁷、约1×10⁶至约1×10⁸、约1×10⁷至约1×10⁸、约1×10⁷至约1×10⁹、约1×10⁸至约1×10¹⁰、约1×10⁹至约1×10¹⁰或约1×10¹⁰至约1×10¹¹个胎盘干细胞。

在某些实施方式中，在暴露于1至100ng/mL VEGF 4至21天后，在本文所提供的方法中有用的所述胎盘干细胞不表达CD34，如通过免疫定位所检测的。在具体的实施方式中，所述胎盘干细胞贴壁至组织培养塑料制品。在另一种具体的实施方式中，例如，当在(例如)基质(如MATRIGEL^TM)上，在存在血管生成因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、上皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的情况下培养时，所述胎盘干细胞诱导内皮细胞形成芽或管样结构。

在另一个方面，本文所提供的胎盘干细胞或细胞群体(例如，胎盘干细胞种群)，或所述细胞群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的细胞是胎盘干细胞的细胞群体将(例如)VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR或半乳凝素-1中的一种或多种或全部分泌到所述细胞生长的培养基中。在另一种实施方式中，与含氧量正常的情况(例如，约20％或约21％的O₂)相比，胎盘干细胞在低含氧量(例如，小于约5％的O₂)的情况下表达较高水平的CD202b、IL-8和/或VEGF。

在另一种实施方式中，本文所述的任何胎盘干细胞或包含胎盘干细胞的细胞群体可以导致在与所述胎盘干细胞接触的内皮细胞群体中形成芽或管样结构。在具体的实施方式中，例如，当在存在细胞外基质蛋白(如I型和IV型胶原)和/或血管生成因子(如血管内皮生长因子(VEGF)、上皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))的情况下在(例如)如胎盘胶原或MATRIGEL^TM的基质中或上培养至少4天时，所述胎盘干细胞与人内皮细胞共培养，从而形成芽或管样结构或支持内皮细胞芽的形成。在另一种实施方式中，当在存在细胞外基质蛋白(如I型或IV型胶原)的情况下在(例如)基质(如胎盘胶原或MATRIGELTM)中或上培养时，本文所述的包含胎盘干细胞的任何细胞群体分泌血管生成因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板源生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或白细胞介素-8(IL-8)并借此可以诱导人内皮细胞形成芽或管样结构。

在另一种实施方式中，包含胎盘干细胞的任何上述细胞群体分泌血管生成因子。在具体的实施方式中，所述细胞群体分泌血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板源生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或白细胞介素-8(IL-8)。在其他具体的实施方式中，包含胎盘干细胞的细胞群体分泌一种或多种血管生成因子并借此诱导人内皮细胞在体外伤口愈合测定中迁移。在其他具体的实施方式中，包含胎盘干细胞的细胞群体诱导人内皮细胞、内皮祖细胞、肌细胞或成肌细胞成熟、分化或增殖。

5.4.3选择和产生胎盘细胞群体

在某些实施方式中，可以选择胎盘干细胞群体，其中所述种群是免疫抑制的。在一种实施方式中，例如，免疫抑制性胎盘干细胞可以选自多种胎盘细胞，其包括选择胎盘细胞群体，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的所述细胞是CD10⁺、CD34^–、CD105⁺胎盘干细胞，CD10⁺、CD34^–、CD200⁺胎盘干细胞，或CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞，并且其中所述胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中可检测地抑制T细胞增殖。在具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD45^–和CD90⁺的胎盘干细胞。

在另一种实施方式中，本文提供了从多种胎盘细胞选择多种免疫抑制性胎盘干细胞的方法，其包括选择胎盘干细胞群体，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的所述细胞是CD200⁺、HLA-G^–胎盘干细胞，并且其中所述胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中可检测地抑制T细胞增殖。在具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD73⁺和CD105⁺的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34^–、CD38^–或CD45^–的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD73⁺和CD105⁺的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择还包括选择多种胎盘细胞，例如，如上所述的胎盘干细胞，所述胎盘细胞在允许形成胚状体样体的条件下培养时形成一个或多个胚状体样体。

在另一种实施方式中，本文提供了从多种胎盘细胞选择多种免疫抑制性胎盘细胞的方法，其包括选择多种胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的所述细胞是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞，并且其中所述胎盘细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中可检测地抑制T细胞增殖。在具体的实施方式中，所述选择包括选择还是HLA-G^–的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34^–、CD38^–或CD45^–的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34^–、CD38^–和CD45^–的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34^–、CD38^–、CD45^–和HLA-G^–的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择另外包括选择在允许形成胚状体样体的条件下培养时产生一个或多个胚状体样体的胎盘干细胞群体。

在另一种实施方式中，本文还提供了从多种胎盘细胞选择多种免疫抑制性胎盘干细胞的方法，其包括选择多种胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的所述细胞是CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞，并且其中所述胎盘细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中可检测地抑制T细胞增殖。在具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD73⁺和CD105⁺的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括选择还是HLA-G^–的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34^–、CD38^–和CD45^–的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G^–的胎盘干细胞。

在另一种实施方式中，本文提供了从多种胎盘细胞选择多种免疫抑制性胎盘干细胞的方法，其包括选择多种胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的所述细胞是CD73⁺、CD105⁺和HLA-G^–胎盘干细胞，并且其中所述胎盘细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中可检测地抑制T细胞增殖。在具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34^–、CD38^–或CD45^–的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34^–、CD38^–和CD45^–的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD200⁺的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34^–、CD38^–、CD45^–、OCT-4⁺和CD200⁺的胎盘干细胞。

在另一种实施方式中，本文还提供了从多种胎盘细胞选择多种免疫抑制性胎盘干细胞的方法，其包括选择多种胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的所述细胞是CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞，并且其中所述多种在允许形成胚状体样体的条件下形成了一种或多种胚状体样体。在具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34^–、CD38^–或CD45^–的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34^–、CD38^–和CD45^–的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括选择还是OCT-4⁺的胎盘干细胞。在更具体的实施方式中，所述选择包括选择还是OCT-4⁺、CD34^–、CD38^–和CD45^–的胎盘干细胞。

在另一种实施方式中，本文提供了从多种胎盘细胞选择多种免疫抑制性胎盘干细胞的方法，其包括选择多种胎盘干细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的所述分离的胎盘细胞是OCT4⁺胎盘干细胞，并且其中所述多种在允许形成胚状体样体的条件下形成了一种或多种胚状体样体。在具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD73⁺和CD105⁺的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34^–、CD38^–或CD45^–的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD200⁺的胎盘干细胞。在更具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^–、CD38^–和CD45^–的胎盘干细胞。

根据本文所提供的方法，可以产生免疫抑制性群体，或者多种胎盘细胞。例如，本文提供了产生细胞群体的方法，其包括选择如上所述的任何多种胎盘干细胞，和将所述多种胎盘细胞与其他细胞(例如其他胎盘细胞)分离。在具体的实施方式中，本文提供了产生细胞群体的方法，其包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)贴壁至基底，(b)表达CD200并且不表达HLA-G；或者表达CD73、CD105和CD200；或者表达CD200和OCT-4；或者表达CD73、CD105并且不表达HLA-G；或者表达CD73和CD105并且当所述群体在允许胚状体样体形成的条件下培养时，有利于包含胎盘干细胞的胎盘细胞群体中一种或多种胚状体样体的形成；或者表达OCT-4并且当所述群体在允许胚状体样体形成的条件下培养时，有利于包含胎盘干细胞的胎盘细胞群体中一种或多种胚状体样体的形成；和(c)在MLR(混合淋巴细胞反应)或回缩测定中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和选择所述胎盘干细胞，或将所述胎盘干细胞与其他细胞分离以形成细胞群体。

在一种更具体的实施方式中，可以通过以下方法产生免疫抑制性胎盘干细胞群体，其包括选择胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)贴壁至基底，(b)表达CD200并且不表达HLA-G，和(c)在MLR(混合淋巴细胞反应)中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和将所述胎盘干细胞与其他细胞分离以形成细胞群体。在另一种具体的实施方式中，所述方法包括选择胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)贴壁至基底，(b)表达CD73、CD105和CD200，和(c)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和将所述胎盘干细胞与其他细胞分离以形成细胞群体。在另一种具体的实施方式中，本文提供了产生细胞群体的方法，其包括选择胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)贴壁至基底，(b)表达CD200和OCT-4，和(c)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和将所述胎盘干细胞与其他细胞分离以形成细胞群体。在另一种具体的实施方式中，本文提供了产生细胞群体的方法，其包括选择胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)贴壁至基底，(b)表达CD73和CD105，(c)当在允许形成胚状体样体的条件下培养时，形成胚状体样体，和(d)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和将所述胎盘干细胞与其他细胞分离以形成细胞群体。在另一种具体的实施方式中，所述方法包括选择胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)贴壁至基底，(b)表达CD73和CD105，并且不表达HLA-G，和(c)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和将所述胎盘干细胞与其他细胞分离以形成细胞群体。在另一种具体的实施方式中，所述方法包括选择胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)贴壁至基底，(b)表达OCT-4，(c)当在允许形成胚状体样体的条件下培养时，形成胚状体样体，和(d)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和将所述胎盘细胞与其他细胞分离以形成细胞群体。

在产生免疫抑制性胎盘干细胞群体的方法的具体实施方式中，所述T细胞和所述胎盘干细胞以约5:1的比值在所述MLR中存在。在所述方法中使用的胎盘干细胞可以来源于整个胎盘，或基本来源于羊膜，或羊膜和绒毛膜。在另一种具体的实施方式中，与不存在所述胎盘干细胞的所述MLR中适量的T细胞增殖相比，在所述MLR中所述胎盘干细胞将CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖抑制了至少50％、至少75％、至少90％或至少95％。所述方法另外可以包括能够进行免疫调节的胎盘干细胞群体的选择和/或产生，所述免疫调节例如，其他免疫细胞的活性(例如，自然杀伤(NK)细胞的活性)的抑制。

5.4.4疼痛模型

在某些实施方式中，本文所述的胎盘干细胞的特征在于它们(例如)在动物疼痛模型中降低或改善疼痛的能力。例如，当产生一批或一批次胎盘干细胞时，可以使用一种或多种动物疼痛模型测试该批或批次的样品。然后，可以选择从中已获得了在疼痛测定中产生可接受的疼痛降低的样品的胎盘干细胞以用于进一步使用，例如，用于改善任何类似的疼痛，或改善特定类型的疼痛。应理解所测试的胎盘干细胞仅需在认为是治疗有效的一种测定中测试和/或显示出效力；在多个或全部动物疼痛模型中测试是不必需的。在某些实施方式中，可以在与一种或多种相关疼痛类型有关的疼痛测定，或与治疗特定患者群体有关的疼痛中测试胎盘干细胞样品。

在某些实施方式中，所述胎盘干细胞可以在(例如)乙酸诱导的内脏疼痛模型中进行测试。可以(例如)通过以约10mL/kg的剂量体积向小鼠腹膜内施用乙酸，并且在乙酸施用之前施用载体或胎盘干细胞(例如，1×10⁶至1×10⁸)来进行该研究。在弃去前5分钟后，记录后续20分钟的翻滚次数。每次实验包含以下的组：载体+2-5次剂量的胎盘干细胞+阳性对照；n＝10/组。

在某些其他实施方式中，可以使用将L5和L6脊神经紧紧结扎从而导致稳定并且持久的神经性疼痛的Chung脊神经结扎模型来测试胎盘干细胞样品。

在某些其他实施方式中，可以利用周围神经病的紫杉醇(Toxol)测定来测试胎盘干细胞样品，其中在施用一系列紫杉醇注射剂后，在大鼠中疼痛随时间发展。

在某些其他实施方式中，可以利用Bennet神经性疼痛(异常性疼痛)模型测试胎盘干细胞样品，其中通过受影响后爪对轻微机械刺激的剧烈回缩来显示通过围绕坐骨神经之一施加松散结扎而诱发的疼痛。

在某些其他实施方式中，可以利用卡拉胶施用诱发的疼痛模型来测试胎盘干细胞样品。

在某些其他实施方式中，可以利用神经性疼痛(例如，异常性疼痛)的完全弗氏佐剂模型来测试胎盘干细胞样品。例如，每组可以使用5只大鼠，初始剂量为(例如)1×10⁶至1×10⁷i.v.，并通过CFA-诱导的后爪痛觉过敏的减小来确定效力。采用非配对学生氏t检验比较载体对照和处理组。可以将其他疼痛药物用作阳性对照(mg/kg，口服)，例如，阿司匹林>100；环胞霉素A>100；地塞米松>30；加巴喷丁约200；吲哚美辛>10；或者吗啡30。

在某些其他实施方式中，可以使用苯醌(PQ)作为疼痛产生化合物来测试胎盘干细胞样品，例如，每个条件使用5只小鼠，初始剂量(例如)为1×10⁶至1×10⁷i.v.，预处理1小时，随后确定5分钟观察期中PQ(2mg/kg i.p.)引起的翻滚的减少。

在某些其他实施方式中，可以利用(例如)术后疼痛的后爪切口模型来测试胎盘干细胞样品。

在某些其他实施方式中，可以利用甩尾模型来测试胎盘干细胞样品，其中在胎盘干细胞施用前后评价对甩尾痛觉刺激的反应。

本文所提供的疼痛测定仅仅是非限制性实例；也可以使用本领域中已知的其他测定。

5.4.5在培养物中的生长

就任何哺乳动物细胞而言，胎盘细胞(例如，本文所述的胎盘干细胞)的生长部分取决于选择用于生长的特定培养基。在最适宜条件下，胎盘干细胞通常在3-5天中数量加倍。在培养期间，本文所提供的胎盘干细胞在培养物中贴壁至基底上，例如，组织培养容器(例如，塑料组织培养皿、纤连蛋白涂覆的塑料制品等)的表面上，并且形成单层。

当在适合的条件下进行培养时，包含本文所提供的胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群体可以形成胚状体样体(embryoid-like body)，即细胞的立体簇(three-dimensionalcluster)在贴壁干细胞层的顶部生长。胚状体样体内的细胞表达与极早期干细胞有关的标志物，例如，OCT-4、Nanog、SSEA3和SSEA4。如本文所述的胎盘干细胞不贴壁至培养基底，胚状体样体内的细胞通常不贴壁至培养基底，但是在培养期间保持与贴壁细胞连接。由于在不存在贴壁干细胞的情况下不形成胚状体样体，因此胚状体样体细胞的活力取决于贴壁的胎盘干细胞。因此，贴壁胎盘细胞有利于包含贴壁胎盘细胞的胎盘细胞群体中一种或多种胚状体样体的生长。间质干细胞，例如，骨髓来源间质干细胞在培养中不会发展出胚状体样体。

5.4.6分化

在某些实施方式中，在本文所提供的治疗个体中疼痛的方法中有用的胎盘细胞可分化为不同的定型细胞系。例如，在某些实施方式中，胎盘细胞可以分化为脂肪形成、软骨形成、神经原或成骨谱系的细胞。可以(例如)通过本领域中已知用于将(例如)骨髓来源间质干细胞分化为相似细胞系的任何方法，或通过在本文其他地方描述的方法完成这种分化。在(例如)美国专利No.7,311,905和美国专利申请公开No.2007/0275362中公开了将胎盘细胞分化为特定细胞系的具体方法，所述专利的公开内容以它们全部内容作为参考并入本文。

本文所提供的胎盘干细胞可以显示出体外、体内或者体外和体内分化为特定细胞系的能力。在一种具体的实施方式中，当置于引起或促进向特定细胞系分化的条件中时，本文所提供的胎盘干细胞可以体外分化，但是不会可检测地体内分化，例如，在NOD-SCID小鼠模型中。

5.5获得胎盘干细胞的方法

5.5.1干细胞收集组合物

可以根据本文所提供的方法收集和分离胎盘干细胞。一般地，胎盘干细胞是使用生理学可用的溶液(例如，干细胞收集组合物)从哺乳动物胎盘获得的。在2005年12月29日提交的题为“用于收集和保存胎盘细胞的改善的组合物以及使用所述组合物的方法(Improved Compositin for Collecting and Preseving Placental cells and Methodsof Using the Composition)”的相关美国临时专利申请No.60/754,969中详细描述了干细胞收集组合物。

干细胞收集组合物可以包括适合于干细胞的收集和/或培养的任何生理学可用的溶液，例如，盐溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水、克氏溶液、改良的克氏溶液、伊格尔氏溶液、0.9％NaCl等)、培养基(例如，DMEM、HDMEM等)等。

干细胞收集组合物可以包含趋于维持胎盘干细胞的一种或多种成分，即在从收集到培养期间防止胎盘干细胞死亡或延缓胎盘干细胞死亡、减少细胞种群中死亡的胎盘干细胞的数目等。这些成分可以是(例如)细胞凋亡抑制剂(例如，半胱氨酸天冬氨酸酶抑制剂或JNK抑制剂)；血管扩张剂(例如，硫酸镁、抗高血压药、心房钠尿肽(ANP)、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼屈嗪、三磷腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等)；坏死抑制剂(例如，2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊基氨基-马来酰亚胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐或氯硝西泮)；TNF-α抑制剂；和/或携氧全氟化碳(例如，全氟辛基溴化物、全氟癸基溴化物等)。

干细胞收集组合物可以包含一种或多种组织降解酶，例如，金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、核糖核酸酶或脱氧核糖核酸酶等。这些酶包括，但不限于，胶原酶(例如，胶原酶I、II、III或IV、获自溶组织梭状芽孢杆菌(Clostridium histolyticum)的胶原酶等)；分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性酶、胰蛋白酶、释放酶、玻璃酸酶等。

干细胞收集组合物可以包含杀菌或细菌抑制有效量的抗生素。在某些非限制性实施方式中，所述抗生素是大环内酯(例如，妥布霉素)、头孢菌素(例如，头孢氨苄、环己烯胺头孢菌素、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉霉素、红霉素、青霉素(例如、青霉素V)或喹诺酮(例如，氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素等。在具体的实施方式中，所述抗生素对革兰氏(+)和/或革兰氏(-)细菌是有活性的，例如，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。

干细胞收集组合物还可以包含一种或多种下列化合物：腺苷(约1mM至约50mM)；D-葡萄糖(约20mM至约100mM)；镁离子(约1mM至约50mM)；分子量大于20,000道尔顿的大分子，在一种实施方式中，其以足以维持内皮完整性和细胞活力的量存在(例如，合成或天然存在的胶体，如葡聚糖的多糖或聚乙二醇，其以约25g/l至约100g/l或者约40g/l至约60g/l存在)；抗氧化剂(例如，丁基羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E，其以约25mM至约100mM存在)；还原剂(例如，以约0.1mM至约5mM存在的N-乙酰半胱氨酸)；防止钙进入细胞的试剂(例如，以约2mM至约25mM存在的维拉帕米)；硝酸甘油(例如，约0.05g/L至约0.2g/L)；抗凝剂，在一种实施方式中，其以足以帮助防止残余血液凝结的量存在(例如，以约1,000单位/升至约100,000单位/升的浓度存在的肝素或水蛭素)；或含有阿米洛利的化合物(例如，阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、六亚甲基阿米洛利、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利，其以约1.0μM至约5μM存在)。

5.5.2胎盘的收集和处理

一般而言，在分娩后胎盘去除后不久回收人胎盘。在一种优选的实施方式中，在知情同意后并且在获得患者的完整病历(并且该病历与胎盘有关)后从患者回收胎盘。优选地，病历在产后继续。该病历可用于配合由此收获的胎盘或干细胞的后续使用。例如，根据病历，人胎盘细胞可用于与胎盘有关的婴儿或者婴儿的父母、兄弟姐妹或其他亲属的个性化医疗。

在回收胎盘干细胞前，除去脐带血和胎盘血。在某些实施方式中，产后回收胎盘中的脐带血。可以对胎盘进行常规脐带血回收过程。通常，借助于重力使用针或插管对胎盘抽血(参见，例如，Anderson,美国专利No.5,372,581；Hessel等人,美国专利No.5,415,665)。通常将针或插管置于脐静脉中，并且可以轻轻地按摩胎盘以帮助从胎盘中排出脐带血。可以商业化进行这种脐带血回收，例如，LifeBank Inc.，Cedar Knolls,N.J.，ViaCord，CordBlood Registry and Cryocell。优选地，将胎盘重力放血而无需其他操作，从而使脐带血回收期间的组织破坏的程度最小。

通常，将胎盘从分娩或产房送至另一个位置(例如，实验室)以用于通过(例如)灌注或组织降解以回收脐带血和收集胎盘干细胞。优选地，将胎盘在无菌、隔热的运输装置(将胎盘温度维持在20-28℃之间)中运输，例如，通过将近端脐带夹紧的胎盘置于无菌自封塑料袋中，然后置于保温容器中。在另一种实施方式中，在基本如2005年9月19日提交的未决美国专利申请No.11/230,760中所述的脐带血收集试剂盒中运输胎盘。优选地，在分娩后的4至24小时将胎盘运输到实验室。在某些实施方式中，在脐带血回收之前将近端脐带夹紧，优选地，在胎盘中插入的4-5cm(厘米)内。在其他实施方式中，在脐带血回收后但在胎盘的其他处理前将近端脐带夹紧。

在收集胎盘干细胞之前，可以将胎盘储存在无菌条件下和室温或5℃至25℃(摄氏度)的温度下。在灌注胎盘以除去任何残留脐带血之前，可以将胎盘储存大于48小时的一段时间，并且优选地储存4至24小时的一段时间。优选地，将胎盘在5℃至25℃(摄氏度)的温度下储存在抗凝剂溶液中。适合的抗凝剂溶液在本领域中是公知的。例如，可以使用肝素或华法令钠溶液。在一种优选的实施方式中，所述抗凝剂溶液包括肝素溶液(例如，1:1000溶液中的1％(w/w))。优选地，在收集胎盘细胞之前将放血的胎盘储存不超过36小时。

一般地在如上所述收集并制备之后，可以采用任何本领域已知的方式(例如，可以灌注或破坏，例如，用一种或多种组织破坏酶消化)处理哺乳动物胎盘或其部分以获得干细胞。

5.5.3胎盘组织的物理破坏和酶促消化

在一种实施方式中，使用(例如)上述5.6.1节中所述的干细胞收集组合物，通过物理破坏(例如，酶促消化)从哺乳动物胎盘收集胎盘干细胞。例如，可以在与(例如)缓冲液、培养基或干细胞收集组合物接触的同时，例如，将胎盘或其部分挤压、剪切、剁碎、切块、切碎、浸软等，并且随后用一种或多种酶消化组织。还可以将胎盘或其部分物理破坏并用一种或多种酶水解，并且然后将所得材料浸没于缓冲液、培养基或干细胞收集组合物或与缓冲液、培养基或干细胞收集组合物混合。可以使用任何物理破坏方法，但前提条件是所述破坏方法在所述器官中留下多个，更优选地大多数，并且更优选地至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的活细胞，如通过(例如)台盼蓝排阻法所确定的。

通常，可以通过小块胎盘组织(例如，体积为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000立方毫米的胎盘组织块)的破坏获得胎盘细胞。

可以使用单个一酶或酶组合进行酶促消化。在一种实施方式中，胎盘组织的酶促消化使用基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和用于透明质酸消化的粘多糖酶的组合，如胶原酶、分散酶和玻璃酸酶的组合或者释放酶(Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,Ind.)和玻璃酸酶的组合。可以用于破坏胎盘组织的其他酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶或弹性酶。可以通过血清中α2微球蛋白抑制丝氨酸蛋白酶，并因此用于消化的媒介通常是不含血清的。通常在酶消化程序中使用EDTA和脱氧核糖核酸酶以提高细胞回收的效率。优选地，稀释消化物以避免将干细胞限制在粘稠的消化液内。

用于组织消化酶的典型浓度包括(例如)对于胶原酶I和胶原酶IV的50-200U/mL，对于分散酶的1-10U/mL和对于弹性酶的10-100U/mL。蛋白酶可以组合使用，即在相同消化反应中使用两种或更多种蛋白酶，或者可以顺序使用以释放胎盘细胞。例如，在一种实施方式中，首先用2mg/ml的适量的胶原酶I将胎盘或其部分消化30分钟，然后以0.25％的浓度使用胰蛋白酶在37℃消化10分钟。优选地，在使用其他酶之后，连续使用丝氨酸蛋白酶。

在另一种实施方式中，还可以通过将螯合剂(例如，乙二醇双(2-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA))加入至包含干细胞的干细胞收集组合物中，或者加入到其中在胎盘干细胞的分离之前用干细胞收集组合物破坏和/或消化组织的溶液中来破坏组织。

将理解当将包含胎儿和母体细胞两者(例如，当胎盘的一部分包含绒毛膜或绒毛叶时)的整个胎盘或胎盘的一部分消化以获得胎盘干细胞时，所收集的胎盘细胞将包含来源于胎儿和母体来源两者的胎盘细胞的混合。当不包含或包含数目可忽略的母体细胞(例如，羊膜)的胎盘部分用于获得胎盘干细胞时，所收集的胎盘干细胞将几乎只包含胎儿胎盘干细胞。

5.5.4胎盘灌注

还可以通过哺乳动物胎盘灌注获得胎盘干细胞。例如，在Hariri,美国专利申请公开No.2002/0123141以及2005年12月29日提交的题目为“用于收集和保存胎盘细胞的改善的组合物以及使用所述组合物的方法(Improved Composition for Cllecting andPreserving Placental Cells and Methods of Using the Composition)”的相关美国临时专利申请No.60/754,969中公开了灌注哺乳动物胎盘以获得干细胞的方法。

可以通过使用(例如)干细胞收集组合物作为灌注溶液(例如)通过胎盘脉管系统灌注来收集胎盘干细胞。在一种实施方式中，通过将灌注溶液通过脐动脉和脐静脉之一或两者来灌注哺乳动物胎盘。可以使用(例如)重力流动至胎盘来完成灌注溶液通过胎盘的流动。优选地，使用泵(例如，蠕动泵)迫使灌注溶液通过胎盘。可以(例如)用连接到无菌连接装置(如，无菌管)的插管(例如，

或塑料插管)插入脐静脉。将无菌连接装置连接到灌注歧管。

在为灌注做准备时，优选地以使脐动脉和脐静脉位于胎盘最高点的方式定向(例如，悬挂)胎盘。可以通过将灌注液体(例如，本文所提供的干细胞收集组合物)穿过胎盘脉管系统或通过胎盘脉管系统和周围组织来灌注胎盘。在一种实施方式中，同时将脐动脉和脐静脉连接至通过柔性连接器连接至灌注溶液储罐的吸移管。将灌注溶液通过至脐静脉和动脉。灌注溶液从血管壁流出和/或穿过血管壁至胎盘的周围组织，并且从连接至妊娠期间母体子宫的胎盘表面收集至适合的开放容器中。还可以将灌注溶液引入通过脐带开口并允许从与母体子宫壁连接的胎盘壁中的开口中流出或渗出。在另一种实施方式中，将灌注溶液通过脐静脉并从脐动脉收集，或者通过脐动脉并从脐静脉收集。

在一种实施方式中，在灌注期间将近端脐带夹紧，并且更优选地，在胎盘中脐带插入的4-5cm(厘米)内夹紧近端脐带。

一般而言，放血过程中来自哺乳动物胎盘的第一次收集的灌注液被脐带血和/或胎盘血的残留红细胞染色；这部分灌注液可以丢弃。随着灌注的进行，灌注液变得更无色并且残留的脐带血细胞被清洗出胎盘。

可以根据要收集的胎盘干细胞的数目、胎盘的尺寸、对单个胎盘进行收集的次数等改变用于收集胎盘干胎盘的灌注液的量。在多种实施方式中，灌注液的体积可以是50mL至5000mL、50mL至4000mL、50mL至3000mL、100mL至2000mL、250mL至2000mL、500mL至2000mL或750mL至2000mL。通常，在放血后用700-800mL的灌注液灌注胎盘。

可以在几小时或几天的过程中对胎盘灌注多次。当将胎盘灌注多次时，可以将其在无菌条件下在容器或其他适合的器皿中维持或培养，并用干细胞收集组合物或标准灌注溶液(例如，生理盐溶液，如加入或未加入抗凝剂(例如，肝素、华法令钠、香豆素、双香豆素)和/或加入或未加入抗微生物剂(例如，β-巯基乙醇(0.1mM)；抗生素，如链霉素(例如，40-100μg/ml)、青霉素(例如，40U/ml)、两性霉素B(例如，0.5μg/ml))的磷酸盐缓冲盐水(“PBS”))灌注。在一种实施方式中，将分离的胎盘维持或培养一段时间而不收集灌注液，从而在灌注液的灌注和收集之前将该胎盘维持或培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或者2或3或更多天。可以将灌注的胎盘维持额外的一次或多次，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个小时，并用(例如)700-800mL灌注液灌注第二次。可以将胎盘灌注1、2、3、4、5或更多次，例如，每1、2、3、4、5或6小时一次。在优选的实施方式中，重复胎盘的灌注和灌注溶液(例如，干细胞收集组合物)的收集直至回收的有核细胞的数目低于100个细胞/毫升。可以各自在不同时间点进一步处理灌注液以回收时间依赖性胎盘干细胞群体。还可以将来自不同时间点的灌注液混合。

不希望受任何理论束缚，在放血并灌注胎盘足够时间后，相信胎盘干细胞迁移至放血并灌注的胎盘微循环中，在此它们是可收集的，优选地通过灌注清洗至收集容器中。灌注分离的胎盘不仅用于除去残留的脐带血，而且为胎盘提供了适当的营养物，包括氧。可以用相似的溶液培养和灌注胎盘，所述溶液用于除去残留的脐带血细胞，优选地，其不加入抗凝血剂。

可以通过用包含一种或多种蛋白酶或其他组织破坏酶的溶液灌注来将干细胞与胎盘分离。在具体的实施方式中，使胎盘或其部分恢复到25-37℃，并在200mL培养基中与一种或多种组织破坏酶一起孵育30分钟。收集来自灌注液的细胞，使其恢复至4℃，并用包含5mM EDTA、2mM二硫苏糖醇和2mMβ-巯基乙醇的冷抑制剂混合物清洗。几分钟后，用在本文其他地方所述的冷(例如，4℃)干细胞收集组合物清洗胎盘干细胞。

使用盘法(即，其中在灌注液从胎盘母体侧流出后收集灌注液)的灌注导致产生了胎儿和母体细胞的混合物。因此，通过该方法收集的细胞包含胎儿和母体来源的胎盘干细胞的混合群体。相反，仅通过胎盘脉管系统的灌注(其中灌注液通过一个或两个胎盘血管并仅通过剩余的血管收集)导致收集了几乎只有胎儿来源的胎盘干细胞群体。

5.5.5胎盘细胞的分离、分选和鉴别

无论是通过灌注还是酶促消化获得的，开始可以通过聚蔗糖梯度离心将来自哺乳动物胎盘的干细胞从其他细胞中纯化(即从中分离)。这种离心作用可以按照对于离心速度等的任何标准规程进行。在一种实施方式中，例如，通过在室温下以5000×g离心15分钟从灌注液回收了收集自胎盘的细胞，该离心作用将细胞与(例如)污染碎片和血小板分离。在另一种实施方式中，将胎盘灌注液浓缩至约200ml，轻轻地在聚蔗糖上方成层，并在22℃以约1100×g离心20分钟，并且收集细胞的低密度中间层以用于其他处理。

可以将细胞颗粒在新鲜的干细胞收集组合物中或者在适合于干细胞维持的培养基(例如，含有2U/ml肝素和2mM EDTA的IMDM无血清培养基(GibcoBRL,NY))中再悬浮。可以(例如)根据生产商推荐的程序使用Lymphoprep(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)分离总单核细胞部份。

如本文所使用的，“分离”胎盘干细胞表示除去至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞，这些细胞是在完整哺乳动物胎盘中胎盘干细胞通常相关联的细胞。

可以通过使用(例如)含有0.2％EDTA(Sigma,St.Louis MO)的0.05％的胰蛋白酶溶液的差异胰酶消化进一步或初始分离通过灌注或消化获得的胎盘干细胞。由于胎盘干细胞通常在约5分钟内从塑料表面脱去，而其他贴壁群体通常需要超过20-30分钟的孵育，因此可能会出现差别胰酶消化。可以在胰酶消化和使用(例如)胰蛋白酶中和溶液(TNS,Cambrex)的胰蛋白酶中和之后收获分离的胎盘干细胞。

在胎盘干细胞分离的一种实施方式中，将(例如)约5-10×10⁶个胎盘细胞的等份分别置于几个T-75烧瓶中，优选纤连蛋白涂覆的T75烧瓶。在这种实施方式中，可以用可商购的间质干细胞生长培养基(MSCGM)(Cambrex)培养细胞，并将其置于组织培养箱(37℃，5％CO₂)中。10到15天后，通过用PBS清洗从烧瓶中除去非贴壁细胞。然后，用MSCGM替换PBS。优选地，每天针对多种贴壁细胞类型的存在检验烧瓶，并且尤其是，针对成纤维样细胞簇的鉴别与扩增检验烧瓶。

可以(例如)通过使用标准细胞检测技术(如流式细胞术、细胞分选、免疫细胞化学(例如，用组织特异或细胞标志物特异的抗体染色)、荧光活化细胞分选(FACS)、磁性活化细胞分选(MACS))测量形态和细胞表面标志物的变化，通过使用光学或共聚焦显微镜检查法检查细胞形态和/或通过使用本领域中公知的技术(如PCR和基因表达谱)测量基因表达的变化来监测从哺乳动物胎盘收集的细胞的数目和类型。这些技术也可以用于鉴别对一种或多种特定标志物呈阳性的细胞。例如，使用抗CD34抗体，人们可以使用上述技术确定细胞是否包含与(例如)同型对照相比，可检测数量的CD34；如果包含，则所述细胞是CD34⁺。同样，如果细胞产生通过RT-PCR可检测的足够的OCT-4RNA或者产生比终末分化细胞显著更多的OCT-4RNA，则该细胞是OCT-4⁺。抗细胞表面标志物(例如，CD标志物，如CD34)的抗体和干细胞特异性基因(如OCT-4)的序列是本领域中公知的。

可以使用荧光活化细胞分选仪(FACS)来分选(例如，进一步分离)胎盘细胞，特别是已通过Ficoll分离、差异贴壁或两者组合分离的细胞。荧光活化细胞分选(FACS)是根据颗粒的荧光性能分离包括细胞在内的颗粒的公知方法(Kamarch,1987,Methods Enzymol,151:150-165)。各个颗粒中荧光部分的激光激发导致产生少量电荷，其使得正负颗粒与混合物电磁分离。在一种实施方式中，用不同的荧光标记物标记细胞表面标志物特异的抗体或配体。通过细胞分选仪处理细胞，从而允许根据它们与所使用的抗体结合的能力分离细胞。可以将FACS分选的颗粒直接沉积到96孔板或384孔板的各个孔中以有利于分离和克隆。

在一种分选方案中，可以根据标志物CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4和/或HLA-G，或者在本文其他地方所列的其他标志物中的任一种的表达，分选胎盘干细胞。这可以与根据它们在培养中的贴壁特性选择干细胞的程序结合完成。例如，可以在根据标志物表达的分选之前或之后完成胎盘干细胞的贴壁选择。在一种实施方式中，例如，首先根据它们的CD34表达分选胎盘干细胞；保留CD34^–细胞，并且将是CD200⁺或HLA-G⁺的细胞与所有其他CD34^–细胞分离。在另一种实施方式中，可以基于他们的CD200和/或HLA-G的表达或缺乏来分选胎盘干细胞；例如，可以分离显示出这些标志物中任一个的细胞用于后续使用。在一种具体的实施方式中，可以根据它们的CD73和/或CD105表达，或者通过抗体SH2、SH3或SH4识别的表位，或者CD34、CD38或CD45表达的缺乏进一步分选表达(例如)CD200和HLA-G的细胞。例如，在一种实施方式中，通过CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38和CD45的表达或表达缺乏来分选胎盘干细胞，并且将CD200⁺、HLA-G^–、CD73⁺、CD105⁺、CD34^–、CD38^–和CD45^–胎盘干细胞与其他胎盘细胞分离以用于以后使用。

在另一种实施方式中，可以使用磁珠将细胞(例如，胎盘干细胞)与其他胎盘细胞分离。可以使用磁活化细胞分选术(MACS)技术来分选细胞，该技术是基于其结合磁珠(0.5-100μm直径)的能力分离颗粒的方法。可以在磁性微球上进行多种有用的修饰，包括共价添加(covalent addition)特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后，将磁珠与细胞混合以使其结合。然后，将细胞穿过磁场以分离出具有特异性细胞表面标志物的细胞。在一种实施方式中，然后可以将这些细胞分离并与和抗其他细胞表面标志物的抗体结合的磁珠再混合。将这些细胞再次通过磁场，从而分离出与两种抗体结合的细胞。然后，可以将这些细胞稀释至单独的盘中，如用于无性系分离的微量滴定盘。

还可以根据细胞形态和生长特征来鉴别和/或分选胎盘干细胞。例如，可以将培养中的胎盘干细胞鉴别为具有(例如)成纤维样外观和/或根据(例如)成纤维样外观进行选择。还可以将胎盘干细胞鉴定为具有形成胚状体样体的能力和/或根据它们形成胚状体样体的能力进行选择。在一种实施方式中，例如，可以将处于成纤维样形状，表达CD73和CD105并且在培养中产生一个或多个胚状体样体的胎盘细胞与其他胎盘细胞分离。在另一种实施方式中，将在培养中产生一个或多个胚状体样体的OCT-4⁺胎盘细胞与其他胎盘细胞分离。

在另一种实施方式中，可以通过集落形成单位测定鉴别胎盘干细胞和显示其特征。集落形成单位测定通常是本领域中已知的，如MESENCULT^TM培养基(Stem CellTechnologies,Inc.,Vancouver British Columbia)。

可以使用本领域中已知的标准技术评价胎盘干细胞的存活力、增殖潜能和寿命，所述标准技术如台盼蓝排阻测定、荧光素二乙酸酯吸收测定、碘化丙啶吸收测定(以评价存活力)；和胸苷吸收测定、MTT细胞增殖测定(以评价增殖)。可以通过本领域中公知的方法确定寿命，如通过确定扩大培养中群体倍增的最大次数。

还可以使用本领域中已知的其他技术将胎盘干细胞与其他胎盘细胞分离，所述技术例如所需细胞的选择性生长(阳性选择)、不希望细胞的选择性破坏(阴性选择)；基于混合群体中差异细胞可凝集性的分离，如(例如)使用大豆凝集素；冻融程序；过滤；常规和区带离心；离心淘选(逆流离心)；单位重力分离；逆流分配；电泳等。

5.6胎盘干细胞的培养

5.6.1培养基

分离的胎盘干细胞或胎盘细胞群体或从中生长出胎盘细胞的细胞或胎盘组织可以用于引起或接种细胞培养。一般将细胞转移至未用胞外基质或配体涂覆或用其涂覆的无菌组织培养容器中，所述胞外基质或配体如层粘连蛋白、胶原(例如，天然或变性的胶原)、明胶、纤连蛋白、鸟氨酸、玻连蛋白和胞外膜蛋白(例如，MATRIGEL(BD Discovery Labware,Bedford,Mass.))。

可以在本领域中认为是对干细胞培养可用的任何培养基中和任何条件下培养胎盘干细胞。优选地，所述培养基包含血清。胎盘干细胞可以在以下培养基中培养，例如，含有ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)、LA⁺BSA(亚油酸-牛血清白蛋白)、葡萄糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1和青霉素/链霉素的DMEM-LG(达尔伯克氏改良基础培养基，低葡萄糖)/MCDB 201(小鸡成纤维细胞基础培养基)；包含10％胎牛血清(FBS)的DMEM-HG(高葡萄糖)；包含15％FBS的DMEM-HG；包含10％FBS、10％马血清和氢化可的松的IMDM(伊思考夫改良达尔伯克氏培养基)；包含10％FBS、EGF和肝素的M199；包含10％FBS、GlutaMAX^TM和庆大霉素的α-MEM(最低必需培养基)；包含10％FBS、GlutaMAX^TM和庆大霉素的DMEM等。优选的培养基是含有2％FBS、ITS、LA⁺BSA、葡萄糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF和青霉素/链霉素的DMEM-LG/MCDB-201。

其中可用于培养胎盘干细胞的其他培养基包括DMEM(高或低葡萄糖)、伊格尔基础培养基、汉姆氏F10培养基(F10)、汉姆氏F-12培养基(F12)、伊思考夫改良的达尔伯克氏培养基、间质干细胞生长培养基(MSCGM)、莱博维茨L-15培养基(Liebovitz's L-15medium)、MCDB、DMEM/F12、RPMI 1640、高级DMEM(Gibco)、DMEM/MCDB201(Sigma)和CELL-GRO FREE。

所述培养基可以单独或组合补充一种或多种成分，其包括(例如)血清(例如，胎牛血清(FBS)，优选地约2-15％(v/v)；马(马)血清(ES)；人血清(HS))；β-巯基乙醇(BME)，优选地约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如，血小板源性生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮生长因子(VEGF)和促红细胞生成素(EPO)；氨基酸，其包括L-缬氨酸；和控制微生物污染的一种或多种抗生素和/或抗霉菌剂，如(例如)青霉素、链霉素硫酸盐、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。

任何本文所公开的培养法和培养基也可用于培养和增殖胎盘干细胞。

5.6.2胎盘干细胞的扩增和增殖

一旦胎盘干细胞已分离(例如，与干细胞或干细胞群体在体内通常与之相连的至少50％的胎盘细胞分离)，则所述干细胞或干细胞群体可以体外增殖和扩增。类似地，一旦产生了胎盘干细胞，则这些细胞还可以体外增殖和扩增。例如，可以在组织培养容器(例如，盘、烧瓶、多孔板等)中将胎盘干细胞培养足以使所述胎盘干细胞增殖至70-90％汇合(即，直至所述胎盘干细胞以及它们的子代占据组织培养容器的培养表面积的70-90％)的一段时间。

可以将胎盘干细胞以允许细胞生长的密度接种到培养容器中。例如，可以将胎盘干细胞以低密度(例如，约1,000至约5,000个细胞/cm²)至高密度(例如，约50,000个细胞/cm²或以上)接种。在一种优选的实施方式中，在空气中在约0至约5体积％的CO₂下培养胎盘干细胞。在一些优选的实施方式中，将胎盘干细胞在空气中在约2至约25％的O₂下培养，优选地，在空气中在约5至约20％的O₂下培养。优选地，将胎盘干细胞在约25℃至约40℃培养，优选地，在37℃培养。优选地，将胎盘干细胞在培育箱中培养。培养基可以是静止的或搅拌的，例如，使用生物反应器。优选地，胎盘干细胞在低氧胁迫(例如，加入谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸等)条件下生长。

一旦获得70％-90％的汇合，则可以将胎盘干细胞传代。例如，可以使用本领域中公知的技术将细胞酶促处理(例如，胰蛋白酶化)以将它们从组织培养表面上分离。通过吸取除去胎盘干细胞并对细胞计数后，将约20,000-100,000个干细胞，优选地约50,000个胎盘干细胞传代至含有新鲜培养基的新培养容器中。通常，新培养基与从中除去干细胞的培养基类型相同。本文提供了已传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20次或更多次的胎盘干细胞群体，或它们的组合。

5.7胎盘干细胞的保存

可以保存胎盘干细胞，即可以将它们置于使其长期保存的条件或抑制通过(例如)细胞凋亡或坏死细胞死亡的条件下。

可以使用(例如)包含细胞凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟化碳的组合物保存胎盘干细胞，如美国专利申请公开No.2007/0190042中所述。

在一种实施方式中，本文提供了保存胎盘干细胞的方法，其包括将所述胎盘干细胞与包含细胞凋亡抑制剂和携氧全氟化碳的干细胞收集组合物接触，其中所述细胞凋亡抑制剂以与未接触细胞凋亡抑制剂的胎盘干细胞群体相比足以降低或防止胎盘干细胞群体中细胞凋亡的量和时间存在。在具体的实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂是半胱氨酸天冬氨酸酶抑制剂。在另一种具体的实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂是JNK抑制剂。在更具体的实施方式中，所述JNK抑制剂不调节所述胎盘干细胞的分化或增殖。在另一种实施方式中，所述干细胞收集组合物包含处于单独的相中的所述细胞凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一种实施方式中，所述干细胞收集组合物包含处于乳浊液中的所述细胞凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一种实施方式中，所述干细胞收集组合物另外包含乳化剂，例如，卵磷脂。在另一种实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂和所述全氟化碳在与干细胞接触时处于约0℃至约25℃之间。在另一种更具体的实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂和所述全氟化碳在与干细胞接触时处于约2℃至10℃之间，或者约2℃至约5℃之间。在另一种更具体的实施方式中，在所述胎盘干细胞的输送期间进行所述接触。在另一种更具体的实施方式中，在所述干细胞种群的冻融期间进行所述接触。

在另一种实施方式中，可以通过以下方法保存胎盘干细胞，所述方法包括将所述胎盘干细胞与细胞凋亡抑制剂和器官保存化合物接触，其中所述细胞凋亡抑制剂以与未接触细胞凋亡抑制剂的胎盘干细胞相比足以降低或防止胎盘干细胞凋亡的量和时间存在。在具体的实施方式中，所述器官保存化合物是UW溶液(在美国专利No.4,798,824中描述；也称为ViaSpan；还参见，Southard等人,Transplantation 49(2):251-257(1990))或Stern等人,美国专利No.5,552,267中所述的溶液.在另一种实施方式中，所述器官保存化合物是羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖或它们的组合。

在另一种实施方式中，在灌注期间将用于产生胎盘干细胞的胎盘干细胞与包含细胞凋亡抑制剂和携氧全氟化碳的干细胞收集组合物、器官保存化合物或它们的组合接触。在另一种实施方式中，在组织破坏处理(例如，酶促消化)期间接触用于产生胎盘干细胞的所述胎盘干细胞。在另一种实施方式中，在通过灌注收集后或在通过组织破坏(例如，酶促消化)收集后，将胎盘细胞与所述干细胞收集化合物接触。

通常，在胎盘干细胞收集、富集和分离期间，优选地减少或消除由于缺氧和机械应力所造成的细胞胁迫。因此，在所述方法的另一种实施方式中，在收集、富集或分离期间将用于产生胎盘干细胞的胎盘干细胞在所述保存期间在缺氧条件下暴露小于6小时，其中缺氧条件是低于正常血氧浓度的氧浓度。在更具体的实施方式中，在所述保存期间将所述胎盘干细胞在所述缺氧条件下暴露小于两小时。在另一种更具体的实施方式中，在收集、富集或分离期间将所述胎盘干细胞在所述缺氧条件下暴露小于1小时，或小于30分钟，或不暴露于缺氧条件。在另一种具体的实施方式中，在收集、富集或分离期间未将所述胎盘干细胞暴露于切应力。

本文所述的胎盘干细胞以及用于产生胎盘干细胞的胎盘干细胞可以在(例如)小容器(例如，安瓿)中的冷冻保存培养基中冷冻保存。适合的冷冻保存培养基包括(但不限于)包含(例如)生长培养基或细胞冷冻培养基(例如，可商购的细胞冷冻培养基，例如，C2695、C2639或C6039(Sigma))的培养基。冷冻保存培养基优选地包含浓度为(例如)约10％(v/v)的DMSO(二甲亚砜)。冷冻保存培养基可以包含其他试剂，例如，Plasmalyte、添加或未添加甘油的甲基纤维素。优选地，在冷冻保存期间将所述干细胞以约1℃/min冷却。优选的冷冻保存温度为约-80℃至约-180℃，优选地约-125℃至约-140℃。在融化使用前，可以将冷冻保存的细胞转移至液氮。在一些实施方式中，例如，一旦安瓿达到约-90℃，则将它们转移至液氮储存区。优选地，在约25℃至约40℃的温度下，优选地在约37℃的温度下融化冷冻保存的细胞。

5.8胎盘细胞的使用

5.8.1包含胎盘细胞的组合物

本文所提供的治疗疼痛的方法可以使用包含胎盘干细胞或从胎盘干细胞获得的生物分子的组合物。同样地，本文所提供的胎盘干细胞群体可以与在(例如)研究或治疗中使用的任何生理学可用或医学可用的化合物、组合物或装置混合。

5.8.1.1冷冻保存的胎盘细胞

可以保存，例如冷冻保存本文所提供的胎盘细胞以备随后使用。用于细胞(如干细胞)冷冻保存的方法在本领域中是熟知的。可以将胎盘干细胞制备成易于施用至个体的形式。例如，本文所述的胎盘干细胞可以包含在适合于医学使用的容器内。这种容器可以是(例如)无菌塑料袋、烧瓶、瓶、小瓶或从中可以容易地分配胎盘细胞群体的其他容器。例如，所述容器可以是血袋或者是适合于液体静脉内施用至受者的其他医学上可用的塑料袋。优选地，所述容器是允许胎盘干细胞冷冻保存的容器。

冷冻保存的胎盘干细胞可以包含来源于单个供体或多个供体的胎盘干细胞。所述胎盘干细胞可以是与预定受体完全HLA匹配的或者是部分或完全HLA不匹配的。

因此，在一种实施方式中，本文提供了容器中包含胎盘干细胞的组合物。在具体的实施方式中，将胎盘干细胞冷冻保存，或者胎盘干细胞已冷冻保存。在另一种具体的实施方式中，所述容器是袋、烧瓶、小瓶或瓶。在更具体的实施方式中，所述袋是无菌塑料袋。在更具体的实施方式中，所述袋适合于，允许或有利于所述胎盘干细胞的静脉内施用。所述袋可以包含互相连接以允许在施用之前或期间胎盘干细胞和一种或多种其他溶液(例如，药物)混合的多个腔或隔室。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含有利于混合的干细胞群体冷冻保存的一种或多种化合物。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘干细胞包含在生理学可用的水溶液内。在更具体的实施方式中，所述生理学可用的水溶液是0.9％NaCl溶液。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘干细胞与所述胎盘干细胞的受体是HLA匹配的。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘干细胞与所述胎盘干细胞的受体是至少部分HLA匹配的。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘干细胞来自多个供体。

5.8.1.2药物组合物

可以将分离的胎盘干细胞群体或包含分离的胎盘干细胞的细胞群体配制到用于在(例如)本文所提供的治疗方法中体内使用的药物组合物中。这些药物组合物包含药物可用载体(例如，盐溶液或用于体内施用的其他可用的生理学可用溶液)中的胎盘干细胞或含有分离的胎盘干细胞的细胞群体。包含本文所述的分离的胎盘干细胞的药物组合物可以包含本文其他处所述的任何分离的胎盘干细胞群体或分离的胎盘干细胞，或者任意组合。所述药物组合物可以包含胎儿、母体或胎儿和母体两者的分离细胞。本文所提供的药物组合物还可以包含获自单个个体脐带或胎盘或者获自多个个体脐带或胎盘的分离的胎盘干细胞。可以将在本文其他地方描述的任何胎盘干细胞配制到药物组合物中，如下所述。

本文所提供的药物组合物可以包含任意个数的分离的胎盘干细胞。例如，在多种实施方式中，单一单位剂量的分离的胎盘干细胞可以包含大约，至少或不超过1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、2×10⁷、2.5×10⁷、3×10⁷、3.5×10⁷、4×10⁷、4.5×10⁷、5×10⁷、5.5×10⁷、6×10⁷、6.5×10⁷、7×10⁷、7.5×10⁷、8×10⁷、8.5×10⁷、9×10⁷、9.5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多个分离细胞。在某些实施方式中，单一单位剂量的分离的胎盘干细胞可以包含大约，至少或不超过1×10⁵至约1×10⁶、约1×10⁵至约1×10⁷、约1×10⁶至约1×10⁷、约1×10⁶至约1×10⁸、约1×10⁷至约1×10⁸、约1×10⁷至约1×10⁹、约1×10⁸至约1×10¹⁰、约1×10⁹至约1×10¹⁰或约1×10¹⁰至约1×10¹¹个胎盘干细胞。在特定的实施方式中，胎盘干细胞存在于适合于全身(例如，静脉内(IV))施用的药物组合物中。在其他具体的实施方式中，胎盘干细胞存在于适合于局部施用的药物组合物中。

可以将包含单一或多个单位剂量的分离的胎盘干细胞的药物组合物结合本文所述的方法施用。在一种实施方式中，施用可以包括单一单位剂量的胎盘干细胞的施用。在另一种实施方式中，施用可以包括多个单位剂量的胎盘干细胞的施用。可以通过(例如)单次或多次注射，例如，1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50次局部或全身注射实现施用。

本文所提供的药物组合物包含细胞群体，所述细胞群体包含50％或以上的活细胞(即所述群体中至少50％的细胞是功能性的或活的)。优选地，在所述群体中至少60％的细胞是有活力的。更优选地，在所述药物组合物中的所述群体中至少70％、80％、90％、95％或99％的细胞是有活力的。

本文所提供的药物组合物可以包含(例如)有利于移植的一种或多种化合物(例如，抗T细胞受体抗体、免疫抑制剂等)；稳定剂，如白蛋白、葡聚糖40、明胶、羟乙基淀粉、勃脉力(plasmalyte)等。

在一种实施方式中，当配制为可注射溶液时，所述药物组合物包含约1％至1.5％的HSA和约2.5％的葡聚糖。在优选的实施方式中，所述药物组合物在包含5％HSA和10％葡聚糖(可选地包含免疫抑制剂，例如，(例如)10mg/kg的环胞霉素A)的溶液中包含约5×10⁶个细胞/毫升至约2×10⁷个细胞/毫升。

在其他实施方式中，药物组合物(例如溶液)包含多个细胞(例如，分离的胎盘干细胞)，其中所述药物组合物包含约1.0±0.3×10⁶个细胞/毫升至约5.0±1.5×10⁶个细胞/毫升。在其他实施方式中，所述药物组合物包含约1.5×10⁶个细胞/毫升至约3.75×10⁶个细胞/毫升。在其他实施方式中，所述药物组合物包含约1×10⁶个细胞/mL至约50×10⁶个细胞/mL、约1×10⁶个细胞/mL至约40×10⁶个细胞/mL、约1×10⁶个细胞/mL至约30×10⁶个细胞/mL、约1×10⁶个细胞/mL至约20×10⁶个细胞/mL、约1×10⁶个细胞/mL至约15×10⁶个细胞/mL或约1×10⁶个细胞/mL至约10×10⁶个细胞/mL。在某些实施方式中，所述药物组合物不包含可见的细胞块(即，无大细胞块)，或者基本没有这样可见的块。如本文所使用的，“大细胞块”表示无需放大即可见(例如，肉眼可见)的细胞聚集体，并且一般是指大于约150微米的细胞聚集体。在一些实施方式中，所述药物组合物包含约2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％或10％的葡聚糖，例如，葡聚糖-40。在具体的实施方式中，所述组合物包含约7.5％至约9％的葡聚糖-40。在具体的实施方式中，所述组合物包含约5.5％的葡聚糖-40。在某些实施方式中，所述药物组合物包含约1％至约15％的人血清白蛋白(HSA)。在具体的实施方式中，所述药物组合物包含约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的HSA。在具体的实施方式中，所述细胞已冷冻保存并融化。在另一种具体的实施方式中，所述细胞已通过70μM至100μM过滤器过滤。在另一种具体的实施方式中，所述组合物不包含可见的细胞块。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含少于约200个细胞块/10⁶个细胞，其中所述细胞块仅在显微镜(例如，光学显微镜)下可见。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含少于约150个细胞块/10⁶个细胞，其中所述细胞块仅在显微镜(例如，光学显微镜)下可见。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含少于约100个细胞块/10⁶个细胞，其中所述细胞块仅在显微镜(例如，光学显微镜)下可见。

在具体的实施方式中，药物组合物包含约1.0±0.3×10⁶个细胞/毫升、约5.5％葡聚糖-40(w/v)、约10％HSA(w/v)和约5％DMSO(v/v)。

在其他实施方式中，药物组合物在包含10％葡聚糖-40的溶液中包含多个细胞(例如，多个分离的胎盘干细胞)，其中所述药物组合物包含约1.0±0.3×10⁶个细胞/毫升至约5.0±1.5×10⁶个细胞/毫升，并且其中所述组合物不包含肉眼可见的细胞块(即，不包含大细胞块)。在一些实施方式中，药物组合物包含约1.5×10⁶个细胞/毫升至约3.75×10⁶个细胞/毫升。在具体的实施方式中，所述细胞已冷冻保存并融化。在另一种具体的实施方式中，所述细胞已通过70μM至100μM过滤器过滤。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含少于约200个微细胞块(即，仅通过放大可见的细胞块)/10⁶个细胞。在另一种具体的实施方式中，所述药物组合物包含少于约150个微细胞块/10⁶个细胞。在另一种具体的实施方式中，所述药物组合物包含少于约100个微细胞块/10⁶个细胞。在另一种具体的实施方式中，所述药物组合物包含小于15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％的DMSO，或小于1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的DMSO。

本文还提供了包含细胞的组合物，其中所述组合物是通过本文所公开的方法之一产生的。例如，在一种实施方式中，药物组合物包含细胞，其中所述药物组合物是通过以下方法产生的，其包括过滤包含胎盘干细胞的溶液以形成过滤的含细胞溶液；例如，在冷冻保存之前用第一溶液将过滤的含细胞溶液稀释至约1至50×10⁶、1至40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶或1至10×10⁶个细胞/毫升；和用包含葡聚糖但是不包含人血清白蛋白(HSA)的第二溶液稀释所得的过滤的含细胞溶液以产生所述组合物。在某些实施方式中，所述稀释将不超过约15×10⁶个细胞/毫升。在某些实施方式中，所述稀释将不超过约10±3×10⁶个细胞/毫升。在某些实施方式中，所述稀释将不超过约7.5×10⁶个细胞/毫升。在其他某些实施方式中，如果在稀释之前过滤的含细胞溶液包含小于约15×10⁶个细胞/毫升，则过滤是任选的。在其他某些实施方式中，如果在稀释之前过滤的含细胞溶液包含小于约10±3×10⁶个细胞/毫升，则过滤是任选的。在其他某些实施方式中，如果在稀释之前过滤的含细胞溶液包含小于约7.5×10⁶个细胞/毫升，则过滤是任选的。

在具体的实施方式中，将细胞在使用第一稀释溶液的所述稀释和使用所述第二稀释溶液的所述稀释之间冷冻保存。在另一种具体的实施方式中，所述第一稀释溶液包含葡聚糖和HSA。所述第一稀释溶液或第二稀释溶液中的葡聚糖可以是任何分子量的葡聚糖，例如，分子量从约10kDa至约150kDa的葡聚糖。在一些实施方式中，所述第一稀释溶液或所述第二溶液中的所述葡聚糖为约2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％或10％的葡聚糖。在另一种具体的实施方式中，所述第一稀释溶液或所述第二稀释溶液中的葡聚糖是葡聚糖-40。在另一种具体的实施方式中，所述第一稀释溶液和所述第二稀释溶液中的葡聚糖是葡聚糖-40。在另一种具体的实施方式中，所述第一稀释溶液中的所述葡聚糖-40是5.0％的葡聚糖-40。在另一种具体的实施方式中，所述第一稀释溶液中的所述葡聚糖-40是5.5％的葡聚糖-40。在另一种具体的实施方式中，所述第二稀释溶液中的所述葡聚糖-40是10％的葡聚糖-40。在另一种具体的实施方式中，包含HSA的所述溶液中的所述HSA是1至15％的HSA。在另一种具体的实施方式中，包含HSA的所述溶液中的所述HSA为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的HSA。在另一种具体的实施方式中，包含HSA的所述溶液中的所述HSA是10％的HSA。在另一种具体的实施方式中，所述第一稀释溶液包含HSA。在更具体的实施方式中，所述第一稀释溶液中的所述HSA是10％的HSA。在另一种具体的实施方式中，所述第一稀释溶液包含冷冻保护剂。在更具体的实施方式中，所述冷冻保护剂是DMSO在另一种具体的实施方式中，所述第二稀释溶液中的所述葡聚糖-40为约10％的葡聚糖-40。在另一种具体的实施方式中，包含细胞的所述组合物包含约7.5％至约9％的葡聚糖。在另一种具体的实施方式中，药物组合物包含约1.0±0.3×10⁶个细胞/毫升至约5.0±1.5×10⁶个细胞/毫升。在另一种具体的实施方式中，药物组合物包含约1.5×10⁶个细胞/毫升至约3.75×10⁶个细胞/毫升。

在另一种实施方式中，通过以下方法制备了药物组合物，其包括(a)在冷冻保存之前，过滤包含胎盘干细胞的含细胞溶液以产生过滤的含细胞溶液；(b)以约1至50×10⁶、1至40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶或1至10×10⁶个细胞/毫升冷冻保存所述过滤的含细胞溶液中的细胞；(c)融化细胞；和(d)用葡聚糖-40溶液以约1:1至约1:11(v/v)稀释过滤的含细胞溶液。在某些实施方式中，如果在步骤(a)之前，细胞数小于约10±3×10⁶个细胞/毫升，则过滤是任选的。在更具体的实施方式中，步骤(b)中的细胞以约10±3×10⁶个细胞/毫升冷冻保存。在更具体的实施方式中，在包含约5％至约10％的葡聚糖-40和HSA的溶液中冷冻保存步骤(b)中的细胞。在某些实施方式中，步骤(b)中的所述稀释将不超过约15×10⁶个细胞/毫升。

在另一种实施方式中，通过以下方法制备了药物组合物，其包括(a)将PDAC^TM在包含10％HSA的5.5％葡聚糖-40溶液中悬浮以形成含细胞溶液；(b)通过70μM过滤器过滤含细胞溶液；(c)用包含5.5％葡聚糖-40、10％HSA和5％DMSO的溶液将含细胞溶液稀释至约1至50×10⁶、1至40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶或1至10×10⁶个细胞/毫升；(d)冷冻保存所述细胞；(e)融化所述细胞；和(f)用10％葡聚糖-40以1:1至1:11(v/v)稀释含细胞溶液。在某些实施方式中，步骤(c)中的所述稀释将不超过约15×10⁶个细胞/毫升。在某些实施方式中，步骤(c)中的所述稀释将不超过约10±3×10⁶个细胞/毫升。在某些实施方式中，步骤(c)中的所述稀释将不超过约7.5×10⁶个细胞/毫升。

在另一种实施方式中，通过以下方法制备了包含细胞的组合物，其包括(a)将多个胎盘干细胞离心以收集细胞；(b)将细胞在5.5％葡聚糖-40中再悬浮；(c)将细胞离心以收集所述细胞；(d)将细胞在包含10％HSA的5.5％葡聚糖-40溶液中再悬浮；(e)通过70μM过滤器过滤所述细胞；(f)用5.5％葡聚糖-40、10％HSA和5％DMSO将细胞稀释至约1至50×10⁶、1至40×10⁶、1至30×10⁶、1至20×10⁶、1至15×10⁶或1至10×10⁶个细胞/毫升；(g)冷冻保存所述细胞；(h)融化所述细胞；和(i)用10％葡聚糖-40以1:1至1:11(v/v)稀释所述细胞。在某些实施方式中，步骤(f)中的所述稀释将不超过约15×10⁶个细胞/毫升。在某些实施方式中，步骤(f)中的所述稀释将不超过约10±3×10⁶个细胞/毫升。在某些实施方式中，步骤(f)中的所述稀释将不超过约7.5×10⁶个细胞/毫升。在其他某些实施方式中，如果细胞数小于约10±3×10⁶个细胞/毫升，则过滤是可选的。

本文所述的组合物(例如，包含分离的胎盘细胞的药物组合物)可以包含任何本文所述的分离的胎盘干细胞。

可以使用适合于细胞产品施用的其他可注射制剂。

在某些实施方式中，可以在冷冻保存之前或之后将胎盘干细胞包封在(例如)海藻酸盐中。在某些其他实施方式中，胎盘干细胞可以与富含血小板血浆混合，例如，以用于局部注射或局部施用来应用。在具体的实施方式中，所述富含血小板血浆是自体富含血小板血浆，例如，对将施用胎盘干细胞的患有疼痛的个体是自体同源的。在其他具体的实施方式中，所述富含血小板血浆对将施用胎盘干细胞的患有疼痛的个体是同种异体的。在另一种具体的实施方式中，所述富含血小板血浆来源于胎盘灌注液。在其他具体的实施方式中，组合物中胎盘干细胞与富血小板血浆的体积与体积之比，或者胎盘干细胞数目与血小板数目之比为约10:1至1:10之间；约100:1至1:100之间；或者为约1:1。

在一种实施方式中，药物组合物包含具有胎儿基因型的基本或完全非母体来源的分离的胎盘细胞或PDAC^TM；例如，至少约90％、95％、98％、99％或约100％是非母体来源的。

在一种具体的实施方式中，药物组合物另外包含不是获自胎盘的干细胞。

本文所提供的所述组合物(例如，药物组合物)中的分离的胎盘干细胞可以包含来源于单个供体或多个供体的胎盘干细胞。所述分离的胎盘细胞可以是与预定受体完全HLA匹配的或者是部分或完全HLA不匹配的。

5.9胎盘干细胞条件培养基

本文所提供的胎盘干细胞(包括脐带干细胞)可用于产生条件培养基，例如，用于患有疼痛的个体的治疗或个体中疼痛的改善。在多种实施方式中，所述条件培养基包含其中胎盘干细胞已生长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天的培养基。在其他实施方式中，所述条件培养基包含其中胎盘干细胞已生长至至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％汇合，或多达100％汇合的培养基。在另一种实施方式中，所述条件培养基包含其中已培养了胎盘干细胞和非胎盘、非脐带干细胞的培养基。

5.10包含胎盘细胞的基质

本文还提供了包含胎盘干细胞的基质、水凝胶、支架等。可以将本文所提供的胎盘干细胞接种到天然基质上，例如，胎盘生物材料，如羊膜材料。这种羊膜材料可以是(例如)直接从哺乳动物胎盘上切下的羊膜；固定或热处理的羊膜、基本干燥(即，<20％的H2O)的羊膜、绒毛膜、基本干燥的绒毛膜、基本干燥的羊膜和绒毛膜等。在Hariri，美国专利申请公开No.2004/0048796中描述了其上可以接种胎盘干细胞的优选的胎盘生物材料。

可以将本文所提供的胎盘细胞悬浮在适合于(例如)注射的水凝胶溶液中。适合这些组合物的水凝胶包括自组装肽，如RAD16。胎盘干细胞还可以与(例如)海藻酸盐或富血小板血浆，或其他含纤维蛋白基质混合以用于局部注射。在一种实施方式中，可以使包含胎盘干细胞的水凝胶溶液在(例如)模具中硬化以形成具有分散于其中的细胞的移植用基质。还可以在该基质中培养胎盘干细胞从而使细胞在植入前通过有丝分裂扩增。水凝胶可以是(例如)通过共价键、离子键或氢键交联以产生捕获水分子以形成凝胶的立体开放网格结构的(天然或合成)有机聚合物。水凝胶形成材料包括多糖(如海藻酸盐及其盐)、肽、聚膦嗪和聚丙烯酸酯，它们通过阴离子交联或者是嵌段聚合物(如聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物)，其分别是通过温度或pH交联的。在一些实施方式中，所述水凝胶或基质是可生物降解的。

在一些实施方式中，所述基质包含原位可聚合凝胶(参见，例如，美国专利申请公开2002/0022676；Anseth等人,J.Control Release,78(1-3):199-209(2002)；Wang等人,Biomaterials,24(22):3969-80(2003))。

在一些实施方式中，具有带电侧基的聚合物或其一价离子盐在水溶液(如水、缓冲盐溶液或酒精水溶液)中至少是部分可溶的。具有可以与阳离子反应的酸性侧基的聚合物的实例是聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(醋酸乙烯酯)和磺化聚合物，如磺化聚苯乙烯。还可以使用具有通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯基醚单体或聚合物反应形成的酸性侧基的共聚物。酸性基团的实例是羧基、磺酸基、卤化(优选地，氟化)醇基、酚OH基和酸性OH基。

可以将胎盘干细胞接种到立体框架或支架上并体内移植。该框架可以与任何一种或多种刺激组织形成或否则提高或改善在本文其他处描述的治疗方法的实践的生长因子、细胞、药物或其他组分结合移植。

可以在本文所述的治疗方法中使用的支架的实例包括无纺垫、多孔泡沫或自组装肽。可以使用由乙醇酸和乳酸(例如，PGA/PLA)的合成可吸收共聚物(VICRYL,Ethicon,Inc.,Somerville,N.J.)组成的纤维来形成非纺织垫。还可以将通过如冷冻干燥或冻干法(参见，例如，美国专利No.6,355,699)的工艺形成的由(例如)聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物组成的泡沫用作支架。

在另一种实施方式中，所述支架是或包含纳米纤维支架，例如，静电纺丝纳米纤维支架。在更具体的实施方式中，所述纳米纤维支架包含聚(L-乳酸)(PLLA)、I型胶原、偏二氟乙烯和三氟乙烯的共聚物(PVDF-TrFE)、聚(-己内酯)、聚(L-丙交酯-共聚-ε-己内酯)[P(LLA-CL)](例如，75:25)和/或聚(3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基戊酸酯)(PHBV)和I型胶原的共聚物。产生纳米纤维支架，例如，静电纺丝纳米纤维支架的方法是本领域已知的。参见，例如，Xu等人,Tissue Engineering 10(7):1160-1168(2004)；Xu等人,Biomaterials 25:877-886(2004)；Meng等人,J.Biomaterials Sci.,Polymer Edition 18(1):81-94(2007)。

还可以将本文所述的胎盘干细胞接种到生理学可用的陶瓷材料上或与之接触，所述陶瓷材料包括，但不限于，磷酸一钙、磷酸二钙、磷酸三钙、α-磷酸三钙、β-磷酸三钙和磷酸四钙、羟基磷灰石、氟磷灰石、硫酸钙、氟化钙、氧化钙、碳酸钙、磷酸镁钙、生物活性玻璃(如

)及其混合物。目前可商购的多孔生物相容性陶瓷材料包括

(CanMedica Corp.,Canada)、

(Merck Biomaterial France,France)、

(Mathys,AG,Bettlach,Switzerland)和矿化胶原骨移植产品，如HEALOSTM(DePuy,Inc.,Raynham,MA)和

RHAKOSS^TM和

(Orthovita,Malvern,Pa.)。所述框架可以是天然和/或合成材料的混合物、共混物或复合材料。

在另一种实施方式中，可以将胎盘干细胞接种到毡制物上或者与毡制物接触，所述毡制物可以由(例如)生物可吸收材料(如PGA、PLA、PCL共聚物或共混物)或者透明质酸制成的复丝组成。

在另一种实施方式中，可以将本文所述的胎盘干细胞接种到可以是复合结构的泡沫支架上。这些泡沫支架可以模制成有用的形状。在一些实施方式中，在胎盘细胞接种之前用(例如)0.1M乙酸处理所述框架，然后在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中培育以提高细胞贴壁。可以(如)通过血浆涂覆基质或一种或多种蛋白(例如，胶原、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如，硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白等)、细胞基质和/或其他材料(如，但不限于，明胶、海藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物树胶等)的加入来修饰基质的外表面以改善细胞的附着或生长和组织的分化。

在一些实施方式中，所述支架包含使其为非血栓形成性的材料或用该材料处理。这些处理和材料还可以促进并保持内皮的生长、迁移和胞外基质的沉积。这些材料和处理的实例包括，但不限于，天然材料，如基底膜蛋白(如层粘连蛋白和IV型胶原蛋白)；合成材料，如EPTFE和嵌段聚氨酯脲硅酮(polyurethaneurea silicones)，如PURSPAN^TM(ThePolymer Technology Group,Inc.,Berkeley,Calif.)。所述支架还可以包含抗血栓形成试剂，如肝素；还可以在用胎盘干细胞接种之前处理所述支架以改变表面电荷(例如，用血浆涂覆)。

5.10.1基因工程修饰的胎盘干细胞

在另一个方面，本文提供了基因工程修饰的胎盘细胞，例如，以产生所关心的核酸或多肽。可以(例如)使用病毒基载体完成基因修饰，所述病毒基载体包括(但不限于)非整合型复制载体，例如，乳头状瘤病毒载体、SV40载体、腺病毒载体；整合型病毒载体，例如，逆转录病毒载体或腺相关病毒载体；或者复制缺陷型病毒载体。将DNA引入细胞的其他方法包括脂质体、电穿孔、粒子枪、直接DNA注射等的使用。

可以(例如)使用通过一种或多种适当的表达控制元件或与它们操纵性结合控制的DNA来转化或转染干细胞，所述表达控制元件例如启动子或增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化位点、内部核糖体进入位点。优选地，这种DNA引入了可选择标志物。引入外源DNA后，基因工程干细胞可以(例如)在富集培养基中生长，然后转移到选择培养基。在一种实施方式中，用于工程设计胎盘细胞的DNA包含编码所关心的多肽的核苷酸序列，所述多肽例如细胞因子、生长因子、分化剂或治疗性多肽。

用于工程设计干细胞的DNA可以包含本领域中已知的任何启动子以驱使哺乳动物细胞(例如人细胞)中核苷酸序列的表达。例如，启动子包括(但不限于)CMV启动子/增强子、SV40启动子、乳头状瘤病毒启动子、埃-巴二氏病毒启动子、弹性蛋白基因启动子等。在具体的实施方式中，所述启动子是可调控的，从而只有当需要时才表达所述核苷酸序列。启动子可以是诱导型的(例如，与金属硫蛋白和热激蛋白有关的那些)或组成型的。

在另一种具体的实施方式中，启动子是组织特异的或表现出组织特异性。这些启动子的实例包括，但不限于，髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等人,1987,Cell 48:703)(少突神经胶质细胞)；弹性酶I基因控制区(Swit等人,1984,Cell 38:639；Ornitz等人,1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399；MacDonald,1987,Hepatology7:425)(胰腺腺泡细胞)；胰岛素基因控制区(Hanahan,1985,Nature 315:115)(胰腺β-细胞)；肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani,1985,Nature 314:283)(骨骼肌)。

可以工程设计胎盘细胞以“敲除(knock out)”或“抑制(knock down)”一种或多种基因的表达。可以通过(例如)表达抑制来减弱源自细胞的基因的表达，所述表达抑制是通过(例如)同源重组所导致的基因完全失活所实现的。在一种实施方式中，例如，通过阳性可选择标志物(例如neo)中断了编码蛋白质重要区域的外显子，或5'至该区域的外显子，从而防止从靶标基因产生正常mRNA并因此导致该基因失活。还可以通过产生基因的部分缺失或通过使整个基因缺失来使基因失活。通过使用具有在基因组中远离的与靶标基因同源的两个区域的构件，可以使插入所述两个区域的序列缺失(Mombaerts等人,1991,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88:3084)。还可以使用抑制靶标基因表达的反义、DNA酶、小干扰RNA和核糖酶分子来降低干细胞中靶标基因活性水平。例如，抑制主要组织适合性基因群(HLA)表达的反义RNA分子已表明是对于免疫反应最多用的。可以使用三螺旋分子来降低靶标基因活性水平。参见，例如，L.G.Davis等人主编,1994,BASIC METHODS IN MOLECULARBIOLOGY,第二版,Appleton&Lange,Norwalk,Conn.，该文献作为参考并入本文。

在一种具体的实施方式中，可以用包含编码所关心多肽的核苷酸序列的核酸分子来基因修饰胎盘细胞，其中所关心多肽的表达是通过外源因子可控的，例如多肽、有机小分子等。这种多肽可以是治疗性多肽。在一种更具体的实施方式中，所关心的多肽是IL-12或白介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)。在另一种更具体的实施方式中，所关心的多肽是白介素-1受体拮抗剂和二氢叶酸还原酶(DHFR)的融合体，并且外源因子是抗叶酸物，例如，甲氨蝶呤。一旦与甲氨蝶呤接触，这些构件在表达IL-1Ra或IL-1Ra和DHFR的融合体的胎盘细胞的工程设计中是有用的。该构件可以在(例如)类风湿性关节炎的治疗中使用。在该实施方式中，一旦暴露于抗叶酸物(如甲氨蝶呤)，则IL-1Ra和DHFR的融合体是翻译上调的。因此，在另一种具体的实施方式中，用于基因工程设计胎盘细胞的核酸可以包含编码第一多肽和第二多肽的核苷酸序列，其中所述第一和第二多肽在存在外源因子的情况下表达为翻译上调的融合多肽。所述多肽可以短暂或长期表达(例如，在数周或数月内)。

这种核酸分子另外可以包含编码允许对工程设计的干细胞进行阳性选择或允许对工程设计的干细胞显像的多肽的核苷酸序列。在另一种更具体的实施方式中，所述核苷酸序列编码(例如)在适当显像条件下发荧光的多肽，例如，荧光素酶(Luc)。在一种更具体的实施方式中，这种核酸分子可以包含IL-1Ra-DHFR-IRES-Luc，其中IRES是内部核糖体进入位点。

5.10.2永生化胎盘干细胞系

可以通过用含有生长促进基因(即编码在适合的条件下促进胎盘干细胞生长的蛋白的基因)的载体转染使胎盘干细胞有条件地永生化，从而生长促进蛋白的产生和/或活性是通过外部因素可调控的。在优选的实施方式中，所述生长促进基因是致癌基因，例如，但不限于，V-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多瘤大T抗原、E1a腺病毒或人乳头状瘤病毒的E7蛋白。

可以通过将生长促进基因置于外部可调控启动子(例如，可以通过(例如)用启动子对它起反应的化合物与细胞接触控制启动子活性)的控制之下来实现生长促进蛋白的外部调控。在一种实施方式中，可以使用四环素(tet)控制的基因表达系统(参见Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551,1992；Hoshimaru等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:1518-1523,1996)。在不存在tet的情况下，该载体内的tet-控制的反式激活因子(tTA)强烈激活从ph_CMV*-1(融合至tet操纵子序列的来自人巨细胞病毒的最小启动子)的转录。tTA是大肠杆菌(Escherichia coli)的转座子-10来源tet耐受操纵子的抑制因子(tetR)和单纯疱疹病毒VP16的酸性域的融合蛋白。tet的无毒低浓度(例如，0.01-1.0μg/mL)几乎完全消除了tTA的反式激活。

在一种实施方式中，所述载体还含有编码可选择标志物(例如，赋予抗药性的蛋白)的基因。细菌新霉素抗性基因(neo^R)是可以在本文所述的方法中使用的一个这种标志物。可以通过本领域那些技术人员所知的方式，如向生长培养基添加(例如)100-200μg/mLG418来选择携带neo^R的细胞。

可以通过本领域技术人员已知的任何多种方式来实现转染，其包括(但不限于)反转录病毒感染。一般地，可以通过与从载体的生产细胞系所收集的条件培养基和含有N2添加剂的DMEM/F12的混合物孵育来转染细胞培养物。例如，可以在(例如)体外五天后通过在一体积条件培养基和两体积含有N2添加剂的DMEM/F12中孵育约20小时来感染如上所述制备的胎盘细胞培养。然后，可以如上所述选择具有可选择标志物的转染细胞。

转染后，将培养传代至允许增殖(例如，允许至少30％的细胞在24小时的周期内倍增)的表面上。优选地，所述基底是由用聚鸟氨酸(10μg/mL)和/或层粘连蛋白(10μg/mL)涂覆的组织培养塑料制品组成的聚鸟氨酸/层粘连蛋白基底、聚赖氨酸/层粘连蛋白基底或用纤连蛋白处理的表面。然后，每3-4天用可以或可以不补充一种或多种增殖增强因子的生长培养基饲养培养物。当培养小于50％汇合时，可以将增殖增强因子加入至生长培养基。

当80％-95％汇合时，可以使用标准技术(如通过胰酶消化)使条件永生化胎盘干细胞系传代。在一些实施方式中，直至约第二十次传代，维持选择(例如，通过对含有新霉素抗性基因的细胞加入G418)是有益的。还可以将细胞在液氮中冷冻以用于长期储存。

可以从如上所述制备的条件永生化人胎盘干细胞系分离无性细胞系。一般地，可以使用标准技术(如通过限度稀释或使用克隆环)分离这些无性细胞系并扩增。一般地，可以如上所述饲养无性细胞系并使其传代。

一般地，可以通过在有利于分化的培养条件下抑制生长促进蛋白的产生和/或活性来诱导条件永生化人胎盘干细胞系(其可以但不需要是无性系的)分化。例如，如果编码生长促进蛋白的基因受外界可调控启动子的控制，则可以改变条件(例如，温度或培养基组成)以抑制所述生长促进基因的转录。对于以上所讨论的四环素控制基因表达系统，可以通过四环素的加入来抑制生长促进基因的转录从而实现分化。一般地，4-5天的1μg/mL的四环素足以引起分化。为了促进进一步分化，可以在生长培养基中包含其他试剂。

6.实施例

6.1实施例1：使用胎盘干细胞成功治疗神经性疼痛

该实施例表明CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞(PDAC^TM)对于减轻神经性疼痛是有效的。

使用大鼠神经性疼痛模型。将体重175-200g的雄性Sprague Dawley大鼠分成三个实验动物组，使其静脉内接受1×10⁶、3×10⁶或1×10⁷个PDAC^TM。阴性对照动物只接受载体。阳性对照动物在手术后第11、14、18、21、25、28和35天接受50mg/kg或者100mg/kg加巴喷丁(疼痛减轻剂)。

手术程序：在第0天(D0)，通过氯胺酮(85mg/kg)/赛拉嗪(5mg/kg)混合物的IP注射引起麻醉。将大鼠的左侧竖脊肌与L4至S2棘突分离。用小骨钳小心地除去L6横突，从而可见地鉴别L4-L6脊神经。分离左侧L5和L6脊神经，并用5-0丝线扎紧。然后，使动物恢复。

在D7，作为基线评价所有组的疼痛敏感性。在D11、D14、D18、D21、D25、D28和D35对所有动物再次评价疼痛敏感性。

在实施疼痛施加程序之前，在D-1，将每只大鼠在Plexiglas室内放置10-15分钟的驯化周期。如下所示，评价大鼠对在最细8g细丝多至最粗15g细丝(8g、10g、15g)的范围内的Von Frey细丝分类的敏感性。将各von Frey细丝从底部方向和上部施加于测试动物，并且尖头接触大鼠后腿的每只爪(面朝下)连续五次或者直至出现反应。以最短90秒的间隔，用每个所选的不同细丝重复该测试。如果大鼠在一段时间内将爪抬起至少3次，则认为是最小疼痛敏感水平。

在术后第11、14、17、21、24和28天进行加巴喷丁治疗和所有动物的测试。在每个测试日处理接受加巴喷丁的动物，并在每天大致相同的时间，在每次剂量施用后两小时进行测试。在第7-8天表现出由缺乏任一后肢中肌张力或缺乏回缩反射缩证明的运动缺陷的动物不包括在本研究中。

为了评价实验期间的疼痛敏感性，将大鼠在Plexiglas室内放置15-20分钟的驯化周期。随后，除了开始将最细的von Frey细丝接触后爪连续5次或直至出现反应之外，如以上用于建立基线疼痛阈值的方法，使用最细0.6g细丝多至最粗15g(0.6g、1.4g、2g、4g、6g、8g、10g、15g)的范围内的von Frey细丝评价大鼠的触觉异常性疼痛(来自通常不疼的刺激的疼痛)。如果不出现反应，则以同样方式应用下一最粗细丝，重复直至获得回缩反应。一旦获得了回缩反应，则用前一降低的细丝重复测试爪直至观察到无反应。连续细丝之间的间隔保持不超过约90秒。以这种方式测试每只动物的两只后爪；先是右腿(注射腿)，然后是左腿。将引起反应所需的作用力的最小量记为回缩阈值，单位为克。

在每个测试日(D11、D14、D17、D21、D24、D28和D35)，腹膜内(IP)施用加巴喷丁(GBP)。在第7天或第8天，静脉内(IV)施用PDAC^TM。

下表1提供了测试活动的时间线。

表1.时间线

*可以在第7天或第8天进行

结果

与载体处理动物相比，尤其是在D21、D28和D35，以10×10⁷的剂量水平施用PDAC^TM显著改善了测定中的敏感性得分；也就是说，动物显示出降低的异常性疼痛。参见图1。该剂量的结果与50mg/kg GBP的相当。作为治疗后机械敏感性降低的曲线下面积(AUC)，计算了称为TOPAR(总疼痛减轻)的总疼痛减轻得分。该分析确认PDAC^TM显著改善了疼痛敏感性得分。参见图2。因此，这些分析确认PDAC^TM可用于治疗疼痛。

6.2实施例2：建立PDAC^TM在癌症疼痛和炎症性疼痛治疗中的有效性的临床前研究

该实施例描述了显示CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞(PDAC^TM)在癌症疼痛和炎症性疼痛治疗中的有效性的研究。

6.2.1骨癌疼痛

使用5周龄的放置在无菌屏障中的免疫受损的(immunocompromised)雄性小鼠(CB17-SCRF；Taconic Laboratories)。在鼠龄6周时，进行机械和热敏感性的基线测量。在第二天，用100mg/kg氯胺酮和20mg/kg赛拉嗪使小鼠麻醉，并在左心室接种100μL无血清DMEM/F12中的5×10⁴个PC3-ML细胞。该程序一致地在>80％的接种小鼠的胫骨和股骨中产生了骨肿瘤；然而，除了在肾上腺中产生小肿瘤之外，PC3-ML细胞不转移至任何软组织器官。将PC3-ML经过细胞工程设计以稳定表达绿色荧光蛋白(eGFP)的亮变体，从而使得能够通过荧光显微术可视化观察细胞在骨骼中的散布。

起初，在PC13-ML细胞接种后的第1、4、7、10、14、21和28天测量机械和热超敏性以确定疼痛发展和持续的时间过程。一旦鉴别在疼痛敏感性中发生了可定量和统计学显著的变化，则检查胎盘干细胞的作用。疼痛发生后施用胎盘干细胞，并在研究期间进行周期性疼痛评价。以(例如)0.1×10⁶个细胞、0.6×10⁶个细胞和1.5×10⁶个细胞/剂量的剂量将PDAC^TM施用于实验小鼠。对照动物只接受载体。因此，例如，如果平均在接种后第12天在疼痛敏感性中发生统计学显著变化，则在疼痛测试前，在这一天以三种剂量中的一种施用PDAC^TM，并且在第13、16、23和30天进行疼痛评价。可选地，如果在复发后在疼痛超敏性中出现初始衰减，则该研究包括PDAC^TM的第二次施用。

在研究的第一阶段(即，在疼痛发展后施用PDAC^TM)未显示出疼痛敏感性变化的小鼠不包括在该研究中。

6.2.2化疗引起的疼痛

该研究显示了CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞对由紫杉醇引起的神经性疼痛的有效性。在该研究中，对小鼠(C57BL/6J)注射作为化疗剂的紫杉醇。已证明了紫杉醇在人和动物中产生神经性疼痛(参见，例如，Authier等人,“Animal models ofchemotherapy-evoked painful peripheral neuropathies,”Neurotherapeutics 6:620-629(2009)；Gauchan等人,2009；Golden和Johnson,2004)。

在紫杉醇施用之前确定小鼠中的基线敏感性。然后，对小鼠施用一定剂量的紫杉醇(5mg/kg,i.p.)，并在第1、4、7、10和14天测量机械和热超敏性。在该模型中，疼痛敏感性通常在14天达到峰值，并持续长达35天。测试前，在第14天，将PDAC^TM以(例如)0.1×10⁶个细胞、0.6×10⁶个细胞和1.5×10⁶个细胞/剂量的剂量施用于实验小鼠。对照动物只接受载体。在第15、21、28和35天对所有动物进行疼痛敏感性评价。阳性对照动物接受以有效剂量施用的加巴喷丁或吗啡。

6.2.3炎症性疼痛模型

该研究显示了CD10⁺、CD34^–、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞对炎症性疼痛模型中疼痛的有效性。

小鼠(C57BL/6J)在后爪脚底表面接受20μL炎症性剂量的完全弗氏佐剂(CFA；50％溶于盐水)的皮下注射。疼痛敏感性通常在CFA注射后3小时达到峰值，并且可以持续长达14天。在CFA施用后3小时，以(例如)0.1×10⁶个细胞、0.6×10⁶个细胞和1.5×10⁶个细胞/剂量的剂量将PDAC^TM施用于实验小鼠。阳性对照小鼠施用了疼痛减轻有效量的非类固醇抗炎药物，例如，塞来考昔

然后，在第1、3、7和14天测量机械和热超敏性。

对于以上每个疼痛研究，使用如以上实施例1中所述的von Frey细丝评价机械异常性疼痛。使用Hargreaves程序评价热敏感性。当动物站立在Plexiglas室上时，通过将辐射热源聚焦在所述动物后爪的脚底表面上并测量由于热而撤回爪的等待时间，Hargreaves测定测量了自由移动的动物中的伤害敏感性。将使用丙酮评价冷敏感性；在该方法中，将一滴丙酮应用于后爪，然后蒸发，并测量爪从表面回缩的等待时间。

在每个研究中，将PDAC^TM IV施用至尾静脉。每个研究中的对照载体是5％葡聚糖-40在盐水缓冲液中的溶液。

6.3实施例3：使用PDAC^TM治疗神经性疼痛

6.3.1静脉内施用

病例1

个体在与紫杉醇施用有关的四肢中表现出神经性疼痛。主治肿瘤学家表示强烈要求说明紫杉醇疗法的维持。使用疼痛质量评估量表进行疼痛评价，其中在0-10的范围内对每种所指明的疼痛类型表明疼痛性质。还记录了总得分。在疼痛评价后，通过静脉内输注向个体施用1×10⁹个CD34^–、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞(PDAC^TM)的生理盐水溶液。在随后7天，监控所述个体的任何不利事件，并在施用后第7天再次评价疼痛。将每个单独的疼痛质量得分以及整体总疼痛得分与施用前的得分进行比较。如果施用后大部分疼痛性质得分或总得分不降低，则可选地通过静脉内输注向所述个体提供第二次施用的1×10⁹个PDAC^TM在生理盐水中的溶液。然后，在紫杉醇疗法过程中监控所述个体，并郄可选地在随后的6个月内进行监控；在通过疼痛性质评估量表确定紫杉醇相关疼痛增加的任何时间，重复施用PDAC^TM。

病例2

78岁老年糖尿病患者个体表现出主要位于腿部的糖尿病性神经病变，并明显牵连坐骨神经，从而使得行走困难。在所述个体就坐时和所述个体行走时，使用数字疼痛评估量表评价所述个体的疼痛。在疼痛评价后，通过静脉内输注向个体施用1×10⁹个CD34^–、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞(PDAC^TM)的生理盐水溶液。在随后7天，监控所述个体的任何不利事件，并在施用后第7天再次评价疼痛，同样是在所述个体就坐时和所述个体行走时进行评价的。如果所述个体在就坐时，行走时或两种情况下表现出疼痛减轻，则认为施用成功。可选地，如果所述个体在就坐时或行走时表现出改善，但不能同时表现出改善，则可以对所述个体施用与所述第一次剂量相同的第二次剂量的PDAC^TM。然后，在随后6个月内，每1-2周监控所述个体，并且当根据数字疼痛评估量表确定疼痛恶化时，进行后续施用。

病例3

62岁个体表现出带状疱疹神经痛。所述个体的诊疗记录确认了先前在所述个体的右侧背部区域伴有皮疹和疱疹脓疱的带状疱疹病历。然而，在皮疹和脓疱治愈后一个月，与带状疱疹有关的疼痛仍未解决。使用数字疼痛评估量表评价所述个体的疼痛。在疼痛评价后，通过静脉内输注向个体施用1×10⁹个CD34^–、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞(PDAC^TM)的生理盐水溶液。在随后7天，监控所述个体的任何不利事件，并在施用后第7天再次评价疼痛。

病例4

个体在与上述损伤有关的四肢中表现出神经性疼痛。主治外科医生证明麻醉药和NSAID不能治疗这种病况。使用疼痛性质评估量表进行疼痛评价，其中在0-10的范围内对每种所指明的疼痛类型说明疼痛性质。还记录了总得分。在疼痛评价后，通过静脉内输注向个体施用1×10⁹个CD34^–、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞(PDAC^TM)的生理盐水溶液。在随后7天，监控所述个体的任何不利事件，并在施用后第7天再次评价疼痛。将每个单独的疼痛性质得分以及整体总疼痛得分与施用前的得分进行比较。如果施用后大部分疼痛性质得分或总得分不降低，则可选地通过静脉内输注向所述个体提供第二次施用的1×10⁹个PDAC^TM在生理盐水中的溶液。然后，在紫杉醇疗法过程中监控所述个体，并且可选地在随后的6个月内进行监控；在通过疼痛性质评估量表确定紫杉醇相关疼痛增加的任何时间，重复施用PDAC^TM。

6.3.2局部施用

62岁个体表现出带状疱疹神经痛。所述个体的诊疗记录确认了先前伴有皮疹和疱疹脓疱的带状疱疹病历。然而，在皮疹和脓疱治愈后一个月，与带状疱疹有关的疼痛仍未解决。使用数字疼痛评估量表评价所述个体的疼痛。在疼痛评价后，在所述个体受带状疱疹影响的区域的神经干附近，以一系列10次注射，向所述个体施用富含血小板血浆溶液中的3×10⁷个CD34^–、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞(PDAC^TM)。在随后7天，监控所述个体的任何不利事件，并在施用后第7天再次评价疼痛。

6.4实施例4：使用PDAC^TM治疗外阴痛

41岁女性个体表现出外阴痛。治疗前，用棉签和温和的手指触诊确定准确的疼痛部位。使用数字疼痛评估量表评价所述个体的疼痛。在疼痛评价后，通过叶鞘内施用至疼痛位点，向所述个体施用富含血小板血浆溶液中的1×10⁹个CD34^–、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞(PDAC^TM)。在随后7天，监控所述个体的任何不利事件，并在施用后第7天再次评价疼痛。

6.5实施例5：使用PDAC^TM治疗间质性膀胱炎

29岁女性个体被诊断为间质性膀胱炎。使用数字疼痛评估量表评价所述个体的疼痛。在疼痛评价后，在膀胱颈的任一侧以及在检查期间所述个体已鉴别为触痛的其他骨盆部位，通过膀胱内路径向所述个体施用富含血小板血浆溶液中的1×10⁹个CD34^–、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞(PDAC^TM)。在随后7天，监控所述个体的任何不利事件，并在施用后第7天再次评价疼痛。在施用后的第7天，还通过尿分析和间质性膀胱炎的生物标志物对所述个体进行评价。

6.6实施例6：使用PDAC^TM的大鼠中周围神经炎疼痛的减轻

该实施例描述了使用大鼠神经炎模型来评价CD34^–、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞(PDAC^TM)对神经性疼痛的影响以及评价可介导细胞反应的可能离体变化的研究。神经炎模型是已确立的由周围神经炎引起的神经性疼痛模型。在该模型中，周围神经炎是在大鼠的坐骨神经附近区域中引起的。在2-3天内，在神经靶器官(后爪)中发展出疼痛，并在约8天内消除。

实验程序

使用了初始称重为约250-300g的3月龄雄性Sprague Dawley大鼠。在该研究中包括了4个组：40万、100万或400万的PDAC^TM和载体对照。大鼠的最小和最大体重在±20％的范围内。

在手术麻醉(50mg/kg氯胺酮和7.5mg/kg赛拉嗪，IM注射)的情况下，大鼠总坐骨神经(common sciatic nerve)在大腿中段暴露并用以200μl 1％λ卡拉胶(Sigma-AldrichCAS号：9064-57-7)浸透的无菌生物相容性载体包裹。手术后3天，作为疼痛的检测测量，评价了动物后爪的机械超敏性。通过评价对校准的von Frey纤维的回缩反应来测量触觉异常性疼痛。根据施加的作用力，在本研究中使用了三种纤维：低(8g)、中(16g)和高作用力纤维(26g)。将每种纤维应用于两只后爪的脚底表面5次，并计算反应百分比。

在周围神经炎诱导后的第4天，在异常性疼痛评价后立即以40万、100万或400万剂量的PDAC^TM或者用载体处理动物。通过尾静脉，静脉内提供治疗。在处理后的多个时间点，通过应用与手术后第3天相同的程序评价动物的机械异常性疼痛。在第0、3、4、6和8天，评价疼痛水平。分析了包括坐骨神经、引流淋巴结和血浆在内的组织样品。

结果

结果表明在第4、6和8天，与载体组相比，400万和100万剂量的PDAC^TM显著降低了疼痛，而40万的PDAC^TM在第4天显示出疼痛减轻的趋势。离体组织分析表明PDAC^TM通过抑制抗原递呈细胞(包括树突状细胞和巨噬细胞)的激活抑制了引流淋巴结中T细胞的致敏和激活。在引流淋巴结以及同侧坐骨神经中，PDAC^TM降低了干扰素γ、IL-17，而提高了IL-10，这表明PDAC^TM介导了T细胞分化。此外，在同侧坐骨神经中，在PDAC^TM处理的动物中观察到了显著较少的白细胞浸润。

6.7实施例7：胎盘干细胞的产生

本实施例示出了胎盘干细胞的分离

概述：将胎盘组织切割并水解，然后进行原代和扩增培养以获得产生多种细胞剂量的扩增细胞产物。将细胞储存在两级细胞库中并作为冷冻细胞产物分配。将来源于单个供体胎盘的所有细胞剂量定义为一个批次，并且在专用房间和100级层流净化罩内使用无菌技术每次处理一个胎盘批次。将细胞产物定义为CD105⁺、CD200⁺、CD10⁺和CD34^–，其具有正常的染色体组型并且不含或基本不含母体细胞。

6.7.1获得干细胞

组织切割和消化：在娩出后24小时内获得胎盘。胎盘组织获自羊膜、羊膜和绒毛膜的组合或绒毛膜。将组织切成约1mm大小的小块。将切成块的组织在37℃在1mg/ml胶原酶1A中消化1小时，然后在37℃在胰蛋白酶-EDTA中消化30分钟。在5％FBS的PBS溶液中清洗三次后，将组织在培养基中重悬浮。

原代培养：将消化的组织悬浮在培养基中并置于Corning T-烧瓶中，并将其在维持在37℃，5％CO2中的加湿室中孵育。培养5天后，补充一半培养基。通过2周的培养，形成了高密度细胞集落。用胰蛋白酶-EDTA收获集落，然后用2％FBS的PBS溶液将其灭活。将细胞离心并重悬浮于培养基中以用于接种扩增培养。将这些细胞定义为倍增0次的0代细胞。

扩增培养：将从原代培养收获的，从扩增培养收获的或从细胞库融化的细胞用于接种扩增培养。以50ml/min/盘，用通过无菌过滤器的在空气中的5％CO₂处理CellFactories(NUNC^TM)10分钟，并在维持在37℃，5％CO₂中的加湿孵育箱中加热。在血球计数器上用台盼蓝对细胞种子计数，并记录细胞数、存活力、传代次数和累计倍增次数。将细胞在培养基中悬浮至约2.3×10⁴个细胞/毫升，并在Cell Factories中接种110ml/盘。3-4天后并且又在培养5-6天时，除去培养基并用新鲜培养基替换，然后用在空气中的5％CO₂再次处理。当细胞达到约10⁵个细胞/cm²，用胰蛋白酶-EDTA收获细胞，随后用2％FBS的PBS溶液灭活。然后，将细胞离心并重悬浮于培养基中。

冷冻保存：用胰蛋白酶-EDTA从培养中收获要冷冻的细胞，并用2％FBS的PBS溶液灭活，并在血球计数器上计数。离心后，用10％DMSO在FBS中的溶液将细胞重悬浮至约100万个细胞/毫升的浓度(用于细胞库集合的细胞)和1000万个细胞/毫升的浓度(各个冷冻细胞剂量)。将细胞溶液转移到冷冻容器内，并将其置于-80℃制冷器中的异丙醇浴中。第二天，将细胞转移至液氮。

6.8实施例8：胎盘干细胞特异性基因的鉴别

如实施例7从羊膜-绒毛膜(AC)和脐带(UC)所制备的，将来自胎盘干细胞的基因表达模式与多能骨髓源间质干细胞(BM)和皮肤成纤维细胞(DF)的基因表达模式进行比较，其中后者认为是终末分化的。将细胞生长传代1次，传代中等次数和传代多次(包括直至衰老)。结果表明群体倍增次数对基因表达起主要影响。鉴别了一组基因，其在AC和UC中上调，并且在BM和DF中下调或缺失，并且独立于传代次数表达。在下文中，在本实施例中，胎盘干细胞和脐带干细胞将统称为AC/UC干细胞。

6.8.1方法和材料

6.8.1.1细胞和细胞培养

BM(Cat#PT-2501)和DF(Cat#CC-2511)购自Cambrex。AC和UC来源于0代组织培养瓶。通过供体胎盘的消化获得了烧瓶中的AC和UC。以6000个细胞/cm²在T-75培养瓶中接种，并且当汇合时，将细胞传代。通过台盼蓝细胞计数估计群体倍增。在3、11-14和24-38次群体倍增后，测定培养物的基因表达。

6.8.1.2RNA、微阵列和分析

除了一个培养物在溶胞前先胰蛋白酶化之外，将细胞在它们的组织培养瓶中直接溶胞。用来自QIAGEN的RNeasy试剂盒分离总RNA。用Agilent 2100生物分析仪确定RNA完整性和浓度。将10mg来自每个培养物的总RNA在Affymetrix

平台上杂交。将总RNA转化为标记的cRNA，并根据生产商的方法杂交至寡核苷酸人基因组U133A 2.0阵列。用Affymetrix MAS 5.0软件处理图像文件，并用Agilent GeneSpring 7.3软件归一化和分析。

6.8.2结果

6.8.2.1用于微阵列分析的BM-MSC，AC/UC干细胞和DF培养时间点的选择

为了建立仅对AC/UC干细胞的基因表达模式，将两个干细胞系AC(6)和UC(6)与BM-MSC和DF平行培养。为了最大程度鉴别归因于细胞来源的基因表达谱并最大程度减小外源影响，使用相同标准将所有细胞在相同培养基中生长、接种和继代培养。在3次群体倍增、11-14次倍增或者35次倍增或衰老(哪个先到就进行哪个)后，收获细胞。培养时在AC/UC干细胞中的表达不随时间变化并且相对于BM和DF上调的基因是AC/UC干细胞特异性基因的候选。

在3次群体倍增后，收集和收获样品(BM、AC(6)和UC(6))；这些样品被认为是“短”时间培养物。不收集短期DF样品。对所有细胞类型收集中等长度培养，11至14次倍增。在约35次群体倍增或在衰老前(哪个先到就进行哪个)对所有细胞系收集长期培养。对于BM，衰老在15次倍增前发生，并且对于DF，在25次倍增前发生。购得的BM和DF细胞在基因分析前扩增多次，并因此不能认为是早期阶段。然而，在操作上，将生长3次倍增的BM(BM-03)认为是短期培养。同样地，BM-11在操作上被称为是中等长度培养，但是由于在14次倍增时发生了衰老，因此BM-11在生物学上很可能是长期培养。

6.8.2.2分级聚类显示BM、AC/UC干细胞和DF之间的关联性

微阵列分析鉴别了基因表达模式，并且分级聚类(HC)尝试找出二维—基因处于第一维，而不同的条件(不同的RNA样品)处于第二维—背景中的相似性。在该实验中使用的GeneChips包含超过22,000个探针组(称为“全基因列表”)，但是这些组中的多个查询了在任何条件下均不表达的基因。为了减少全部基因列表，去除所有样品中不表达或以低水平表达(原始值小于250)的基因以获得8215个基因的列表。

6.8.2.3用于鉴别AC/UC干细胞特异性基因的过滤法

在所有AC/UC样品中保持不变并且在BM和DF中下调的基因被认为是AC/UC干细胞特异性的。将两种过滤法合并以产生58个AC/UC干细胞特异性基因的列表(表2)。

表2：58种胎盘干细胞或脐带干细胞特异性基因

首先，通过选择相对于所有BM和DF样品，在8种AC/UC干细胞条件的至少7种中过表达≥3倍的那些基因，鉴别出了58个基因。对8种AC/UC干细胞条件中的8种过滤获得了类似的列表。第二种过滤法使用了Affymetrix MAS 5.0软件所提供的“不存在”和“存在”调用。通过鉴别在所有BM和DF条件中不存在并且在AC-03、AC-11、UC-03和UC-11中存在的基因，产生了列表。后一种AC/UC干细胞条件中的基因调用不是规定的。

两个列表显著重叠并将其合并。通过消除(1)在大部分或全部AC/UC干细胞条件下以极低水平表达的几个基因和(2)Y染色体上携带的基因，对合并的列表进一步修整。通过FISH分析确认在本研究中使用的AC和UC细胞是雄性的，而BM和DF来源于雌性供体。表3显示了所得的46个AC/UC干细胞特异性基因的列表。

表3.通过本体论列出的AC/UC特异性基因

该列表的46个基因编码了一组蛋白质，所述蛋白质提供了多个实体组。最具代表性的组是细胞粘附，其含有8个基因。没有基因编码参与DNA复制或细胞分裂的蛋白。还列出了对上皮细胞具有特异性的16个基因。

6.8.3讨论

鉴别了对胎盘干细胞特异并且与骨髓来源间质细胞可区分的表达模式。在操作上，这种模式包括相对于所有BM和DF样品在所有胎盘干细胞样品中过表达的46种基因。

实验设计比较了短期、中期和长期培养的细胞。对于AC和UC细胞，每个培养周期具有特征性差异表达基因组。在短期和早期阶段(AC-03和UC-03)，在8次群体倍增后，200个上调基因退回至平均。

通过快速细胞分裂定义了中等长度培养的基因表达，并且此时差异表达的基因与早期阶段中差异表达的那些非常不同。在AC-11和UC-11以及BM-03和DF-14中上调的基因中的多个涉及染色体复制和细胞分裂。基于基因表达，BM-03在生物学上似乎是中期培养。在该中期，细胞类型特异性基因表达被细胞增殖所遮蔽。另外，几乎每一个在短期AC或UC培养中过表达的基因在中期和晚期条件中下调。143个基因在该高增殖期中上调≥5倍，其构成了约1.7％的表达的基因。

长期培养代表了最终或衰老阶段。在该阶段中，细胞已耗尽了它们分化的能力，并且特别是对于AC和UC，差异表达基因的绝对数目显著降低。这可能是由于细胞完全适应了它们的培养环境并因此降低了生物合成的负荷。意外地，晚期BM和DF培养物未显示出该相同行为；相对于AC和UC以及归一化值1，BM-11和DF-24中大量基因差异表达。AC和UC与BM和DF是可区分的，最值得注意地是在长期培养中。

本文所述的胎盘干细胞特异性基因列表是多样的。COL4A1和COL4A2是协调调控的，并且KRT18和KRT8似乎也是共表达的。所述基因中有8个编码了参与细胞与细胞接触的蛋白，其中三个(DSC3、DSG2和PKP2)定位至桥粒(锚定至中间丝细胞骨架蛋白(如角蛋白18和角蛋白8)的细胞间接触点)。细胞-与-细胞紧密接触是上皮细胞和内皮细胞的特征，并且通常与成纤维细胞无关。表3列表了总计46个基因中具有上皮细胞特征的16个基因。胎盘干细胞通常被描述为成纤维细胞样小纺锤形细胞。这种形态通常不同于BM和DF，特别是在较低细胞密度时。还注意到在AC/UC干细胞中存在并且在所有BM和DF样品中缺失的CD200的表达模式。

46个基因中的这种基因亚组构成了将AC/UC干细胞与骨髓源间质干细胞或成纤维细胞相区分的一组分子生物标志物。

6.9实施例9：使用胎盘干细胞在大鼠中与周围神经炎有关的异常性疼痛和神经炎症

反应的降低

该实施例表明胎盘干细胞通过可能包括树突状细胞归巢、激活和分化的抑制；IL-10的诱导；和T细胞调节的机制减轻了神经炎症性疼痛。

6.9.1材料和方法

6.9.1.1动物和手术程序

使用在研究开始时约250-300g的3月龄雄性Sprague Dawley大鼠进行研究；组中最小和最大体重在组平均体重的±20％的范围内。

对于手术程序，用腹膜内施用的氯胺酮(50mg/kg)和赛拉嗪(7.5mg/kg)溶液使大鼠麻醉。在麻醉验证后，对手术区域剃毛，随后用碘伏和酒精擦拭。如上所述，进行手术(参见Herzberg等人,Pain,1999,83:169-82)。简言之，通过钝器解剖，经过股二头肌，在大腿中段水平暴露出常见的坐骨神经，并轻轻地将其与邻近组织分离。用无菌止血氧化纤维素绷带(约3mm宽，25mm长)包裹神经(SURGICEL^TM，“棉制”型；Ethicon,J&J,NJ,USA)。通过将弯钳在神经下方(特别注意要避免拉伸神经)通过，抓住绷带一端并在神经下方拉动绷带来应用SURGICEL^TM。然后，将所抓住的一端轻轻地在神经上方折叠，并将另一端在相反方向上折叠。将SURGICEL^TM松散地围绕神经包裹，并因此不导致任何神经收缩。应用前，将0.2cc 1％的卡拉胶注入SURGICEL^TM绷带以诱导局部炎症反应。在第3天治疗前，将大鼠随机分配至每个处理组。

6.9.1.2触觉异常性疼痛评价

通过评价对校准的von Frey纤维的回缩反应来测量触觉异常性疼痛。在该研究中，根据所施加的作用力，使用了三种纤维：低(8g)、中(16g)和高作用力纤维(26g)。将每种纤维应用于爪5次，并如上所述计算反应的得分百分比(参见Flatters等人,Pain,2004,109:150-61)。

6.9.1.3胎盘干细胞制备和施用

如实施例7中所述，制备了CD34^–、CD10⁺、CD200⁺和CD105⁺胎盘干细胞。

在将左侧坐骨神经暴露于周围神经炎后的第3天，在37℃水浴中融化冷冻保存的胎盘干细胞。通过台盼蓝确定细胞存活力，其中平均存活力为约95％。然后，在50ml锥形管中用Plasmalyte(Baxter Healthcare Corporation)将细胞稀释至4×10⁶、1×10⁶或4×10⁵个细胞/毫升。随后，将细胞吸入带有26G针头的1ml注射器中。融化后2小时内，通过尾静脉施用1ml胎盘干细胞或载体。在第0、3、4、6和8天评价疼痛水平。

6.9.1.4动物组织

处理后一天(第4天)，收集腹股沟淋巴结并快速冷冻用于RNA分离。在第8天，收获坐骨神经。对于基因表达分析，将坐骨神经快速冷冻以用于RNA分离。对于流式细胞术分析，将坐骨神经放置在湿冰上的D-PBS中。通过心脏穿刺，将血抽至EDTA收集管中。立即以1300RCF将血液样品离心10分钟。然后，收集血浆并快速冷冻。

6.9.1.5RNA提取和定量PCR

将冷冻的大鼠坐骨神经和引流淋巴结称重，并使用获自Qiagen的TissueRuptor在对单位重量适量的溶胞缓冲液中匀浆。根据生产商的规程，使用Qiagen的RNeasy脂肪组织试剂盒从均质化的大鼠坐骨神经和引流淋巴结中提取总RNA。通过NanoDrop ND-1000(Thermo Fisher Scientific)确定总RNA浓度。使用获自Invitrogen的SuperScript III，从分离的RNA合成cDNA。对于基因表达，将用于大鼠的各个TaqMan基因表达测定用于CD11c、CD86、CD80、CD3d、CD69、IL-12、IFN-γ、IL-10和IL-17。使用GAPDH表达将相对基因表达归一化并使用2-ΔΔCt法计算变化倍数。

6.9.1.6细胞因子测量

使用得自Invitrogen的大鼠cytokine10-plex试剂盒进行血浆细胞因子测量，所述试剂盒检验GM-CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α。根据生产商的规程，测试血浆样品。简言之，将抗体结合珠加入到所提供的真空过滤板中。随后，用工作清洗溶液清洗珠。将标准品或动物样品加入到每个孔中，并将板在室温下在轨道震荡器上避光孵育2小时。将孔清洗两次，并加入生物素化检测抗体。在室温下培育1小时并清洗后，将R-藻红蛋白结合的抗生蛋白链菌素加入板中30分钟。将板清洗3次，并使用STarStaion 2.3软件在Luminex 100上进行数据采集。对于IL-17ELISA，将坐骨神经称重并置于300.25μl培养基中，该培养基含有：300μl Cellytic-MT哺乳动物组织溶胞/提取试剂(Sigma Chemical Co.)和0.25μl蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Chemicl Co.)。然后，将样品均质化并离心(12,500×g，10分钟)。收集上清液，并通过ELISA(R&D Systems Inc.)确定IL-17水平。

6.9.1.7坐骨神经单细胞悬液和流式细胞术

获得新鲜的坐骨神经样品，并将其放置在湿冰上的D-PBS中。使用木瓜蛋白酶神经解离试剂盒和获自Miltenyi Biotech.的gentleMACS匀浆器，将神经解离成单细胞悬液。简言之，将单个坐骨神经放置在具有1950μl 37℃预热的酶混合物的C-管(MiltenyiBiotech)中。将C管放置在gentleMACS上，并运行“m-brain-01”程序。将管放置在旋转器上并在37℃孵育15分钟。对坐骨神经运行gentleMACS程序“m_brain_02”。然后，加入30μl酶混合物2。在37℃下，将神经温和旋转孵育10分钟。对神经样品运行gentleMACS“m_brain_03”，然后在37℃孵育10分钟。将所得悬液通过40μ细胞过滤器。以300×g使细胞成粒，并将其重悬浮于FACS缓冲液(PBS-1％FBS)中。使用0.5μg FITC小鼠抗大鼠CD3(BD Biosciences)和0.5μg PE-小鼠抗大鼠巨噬细胞亚型(ED2样抗原，BD Biosciences)对单细胞悬液染色。将匹配的同型对照用来设置闸门(gating)。

6.9.1.8免疫组织化学

按照免疫组织化学和免疫荧光的标准规程，实施免疫染色。神经炎诱导后8天，从两侧收获坐骨神经。简言之，如所述，将坐骨神经在HOPE缓冲液中固定(参见，Olert J,Wiedorn KH,Goldmann T,Kuhl H,Mehraein Y,Scherthan H,

按照免疫组织化学和免疫荧光的标准规程，实施免疫染色。神经炎诱导后8天，从两侧收获坐骨神经。简言之，如所述，将坐骨神经在HOPE缓冲液中固定(参见，Olert等人,Pathol Res Pract,2001,197:823–6)。在封闭溶液(含有1×酪蛋白、0.3％Triton X-100和5％马血清的PBS)中将组织切片(5微米)封闭30分钟。然后，将切片与以下第一抗体中的一个或两个一起培育过夜：CD68(ED1克隆，小鼠单克隆IgG1，Santa Cruz Biotechnology)、CD4(山羊多克隆IgG，Santa Cruz Biotechnology)和CD8(小鼠单克隆IgG2a，Santa CruzBiotechnology)。在PBS中清洗三次后，将载玻片在适当的第二抗体中在室温下孵育30分钟：与Alexa Fluor 488结合的山羊-抗-小鼠IgG2a(1:500,Invitrogen)、与Alexa Fluor488结合的山羊-抗-小鼠IgG1(1:500,Invitrogen)、与Alexa Fluor 488结合的驴抗山羊(1:500,Invitrogen)。对于核染色，在最后一次PBS清洗后，将600nM DAPI溶液(Sigma)施加10分钟。在PBS中清洗后，将载玻片在水介质中封固以用于荧光(载体)。用配备有高分辨率数字照相机Nikon DXM1200F的E800型NIKON Eclipse显微镜捕获免疫组织化学图像，所述数字照相机连接至安装了用于图像捕获和存档的NIS Elements软件的PC。

6.9.1.9数据分析

数据表示为平均值±SEM。使用5.0版StatView软件(SAS Institute Inc.,SanFrancisco,California,USA)，对数据制表并分析。在所有分析中，将显著性α(双侧)设置为0.05。用重复测量方差分析(ANOVA)和随后的事后检定来分析行为数据。对于离体分析，将双侧学生氏t检验用于鉴别载体和细胞处理组之间的差异。

6.9.2结果

6.9.2.1胎盘干细胞减轻机械性异常性疼痛

将三种不同的校准单丝(包括8g、16g和26g)用于测试机械性异常性疼痛。在处理前第3天，对16g和26g刺激的反应是稳定并且可重复的，但是许多大鼠对8g刺激不起反应。因此，仅将从对16g和26g刺激的反应采集的数据用于数据分析。如所期望的，与神经炎诱导前第0天相比，所述程序后的第3天，发展了对刺激(异常性疼痛)反应的显著增加。在处理前该阶段，在载体和胎盘干细胞处理组之间未观察到显著差异。尽管载体对26g刺激的机械敏感性无影响，但是4×10⁶的胎盘干细胞将后爪回缩从第3天的93.3％±2.98显著降低至分别在第6天和第8天的46.7％±6.80和36.7％±5.37(图3A)。在16g刺激时，观察到了胎盘干细胞类似的疼痛降低趋势，其中后爪回缩从57.8±10.24％降低至分别在第6天和第8天的22.2±7.03％和26.7±3.33％。对侧爪未观察到显著影响(图3B)。

还检验了胎盘干细胞对神经炎诱导的机械性异常性疼痛降低的剂量影响。尽管在第4、6和8天，与载体组相比，4×10⁶和1×10⁶的胎盘干细胞显著降低了机械性异常性疼痛，但是4×10⁵的胎盘干细胞仅在第4天显示出疼痛减轻趋势(图3C)。对胎盘干细胞治疗起反应的动物的百分比同样表现出剂量依赖性(图3D)。

6.9.2.2胎盘干细胞抑制树突状细胞的募集、激活和分化

为了阐明胎盘干细胞介导的抗神经炎症机制，检验了引流淋巴结中的树突状细胞。如图4A中所示，胎盘干细胞处理组降低了CD11c的表达。同时，胎盘干细胞抑制了树突状细胞激活标志物CD86和CD80。与CD11c、CD86和CD80的抑制一致，在引流淋巴结中，胎盘干细胞还显著降低了作为分化的树突状细胞所分泌的重要促炎细胞因子的IL-12的表达(图4B)。

6.9.2.3胎盘干细胞抑制T细胞致敏并调节T细胞分化

考虑到胎盘干细胞赋予的受损的树突状细胞的归巢和激活能力，我们预期随后可能会影响通过树突状细胞的T细胞致敏。的确，与对照组相比，胎盘干细胞处理组中T细胞受体CD3和T细胞激活标志物CD69的表达均显著降低(图5A)，这表明引流淋巴结中的T细胞增殖和激活受胎盘干细胞抑制。

此外，检验T-辅助细胞亚群以测试胎盘干细胞对T细胞分化是否有影响。如图5B和图5C所示，胎盘干细胞显著抑制引流淋巴结中的干扰素γ(IFNγ)，这表明胎盘干细胞抑制Th-1 T细胞分化。另外，引流淋巴结(图5C)和同侧坐骨神经(图6A和图6B)中IL-17的表达受胎盘干细胞下调。另一方面，在引流淋巴结(图6C)以及血浆(表4)中观察到了通过胎盘干细胞的抗炎细胞因子IL-10的上调。在血浆中所测试的9种促炎细胞因子中，4种促炎细胞因子(包括IFNγ、IL-2、IL-6和IL-12)受胎盘干细胞下调，而在胎盘干细胞和载体组之间未观察到IL-1β的差异(表4)。其他细胞因子(包括GM-CSF、IL-1α、IL-4和TNF-α)低于血浆中的检测水平。

表4.第8天时的血浆细胞因子水平(pg/ml)(n＝5)

*P<0.05

6.9.2.4胎盘干细胞抑制同侧坐骨神经中免疫细胞浸润

接着，检验了白细胞向同侧坐骨神经的浸润。在胎盘干细胞处理组中，巨噬细胞标志物Emr1和CD68下调，这表明较少的巨噬细胞募集和激活(图7A)。树突状细胞浸润和激活也受胎盘干细胞的抑制，如通过CD11c、CD80和IL-12表达的下调所显示的(图7B)。此外，T细胞浸润和激活也受胎盘干细胞的抑制，如通过胎盘干细胞处理组中CD3和CD69表达的降低所显示的(图7C)。与上述基因表达结果一致，同侧坐骨神经的单细胞悬液的流式细胞术分析显示在胎盘干细胞处理组中仅检测到1.5％的CD3⁺细胞和3.9％的ED2⁺细胞，相比之下，在载体组中检测到了13.3％的CD3⁺和8.0％的ED2细胞(图7D)。H&E染色显示与正常和胎盘干细胞处理动物相比，载体组中严重的神经弓突浮肿和炎症性浸润(图8A-C)。与载体相比，胎盘干细胞处理组中CD68(图8D-F)、CD8(图8G-I)和CD4(图8J-L)的表达均降低。

此外，在同侧坐骨神经中，趋化因子(包括CCL2、CCL12和CXCL1)受到胎盘干细胞抑制(图9)。

6.9.2.5结论

总之，该实施例表明胎盘干细胞降低了周围神经炎所引起的机械性异常性疼痛。此外，通过抑制树突状细胞归巢至引流淋巴结和通过降低树突状细胞的激活，胎盘干细胞在引流淋巴结中抑制T细胞致敏并调节T细胞分化。

6.10实施例10：使用胎盘干细胞在大鼠中与周围神经炎有关的异常性疼痛和神经炎症反应的降低

该实施例表明胎盘干细胞可以降低神经性疼痛。

6.10.1材料和方法

6.10.2动物和手术程序

在该研究中包括了77只3月龄的雄性Sprague Dawley大鼠，在研究开始时这些大鼠约200-250g重。组中的最小和最大体重在组平均体重的±20％的范围内。在驯化几天后，对大鼠进行了疼痛行为(触觉异常性疼痛)和运动感觉评价(转棒试验)的基线测量。所有大鼠经历了坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)；在手术后第6天验证了疼痛发展，在第7天验证了感觉运动行为。在手术后第8天，将大鼠随机分配到各个处理组(表5)。在手术后第6、10、16、25和30天评价疼痛水平。在第11、21、26和34天评价了运动感觉协调性。在第35天，将大鼠安乐死，收集坐骨神经(两侧)并包埋在石蜡中。将脾和淋巴结快速冷冻，并收集处理成血浆的大量血液。

对于手术程序，用IP施用的氯胺酮(50mg/kg)和赛拉嗪(7.5mg/kg)溶液使大鼠麻醉。在麻醉验证后，对手术区域剃毛，并随后用碘伏和酒精擦拭消毒。使大鼠眼睛润滑。

表5.处理组，每个组中施用的体积和大鼠个数PSC表示胎盘干细胞；GBP表示加巴喷丁。

组	处理	体积	N
				1	载体，iv	1.00cc	10
2	PSC 4×10<sup>6</sup>iv	1.00cc	10
				3	PSC 1×10<sup>6</sup>iv	1.00cc	9
4	载体，im	0.25cc	10
				5	PSC 4×10<sup>5</sup>im	0.25cc	10
6	PSC 4×10<sup>4</sup>im	0.25cc	10
				7	GBP 100mg/ml，ip	0.25cc	9
8	PBS(GBP的载体)，ip	0.25cc	9

6.10.1.2胎盘干细胞

如实施例7中所述，制备了CD34^–、CD10⁺、CD200⁺和CD105⁺胎盘干细胞。

6.10.1.3慢性压迫性损伤

如前所述，进行手术(参见，Bennett和Xie,Pain,1988,33:87-107)。简言之，通过钝器解剖，经过股二头肌，在大腿中段水平暴露出常见的坐骨神经，并轻轻地将其与邻近组织分离。在邻近坐骨三叉部处，对约7mm的神经轻轻除去附着组织，用3根结扎线(4/0铬制肠线)围绕神经松散扎住，每根线之间间隔1.0-1.5mm。将结扎线扎住，从而使得神经仅受到压迫，并且通过浅表神经弓突脉管系统(superficial epineural vasculature)的循环不会停止。对肌肉使用3/0Vicryl缝合线，并且对皮肤使用伤口夹，将切口层状闭合。

6.10.1.4行为测试

使用触觉异常性疼痛测试评价疼痛水平。在该测试中，测量了对校准的Von Frey纤维的回缩反应。根据施加的作用力，在本研究中使用了三种纤维：低(8g)、中(16g)和高作用力纤维(26g)。将每种纤维应用于爪5次，并计算反应的得分百分比(参见Flatters等人,Pain,2004,109:150–161)。基线水平处最可靠和可重复的得分是对26g的反应；因此，对26g数据进行统计分析。

用转棒试验评价运动感觉协调性。在该试验中，将啮齿动物放置在转棒上，并逐渐提高转速。记录啮齿动物在转棒上保持的能力(时间，单位秒)。所使用的速度为4-40rpm(最大180秒)，其掉落高度小于30cm。转棒试验的目的是评价啮齿动物的运动感觉协调性。测试对影响运动功能的药物灵敏，并且有助于评价药物的镇静作用。

6.10.1.5加巴喷丁

在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备加巴喷丁。所使用的剂量为100mg/ml，并且将0.25mL腹膜内(IP)注射到250g大鼠中。将相同体积的PBS IP注射至对照组。

6.10.1.6数据分析

使用5.0版StatView软件(SAS Institute Inc.,San Francisco,California,USA)，对数据制表并分析。在所有分析中，将显著性α(双侧)设置为0.05。仅对在所有时间点具有数据的大鼠计算行为统计量。将重复测量方差分析(ANOVA)和随后的事后检定用于疼痛和运动感觉协调性得分。通过与基线水平比较验证疼痛发展。通过与手术后第6天的疼痛水平相比较，得出对疼痛有影响。

6.10.2结果

6.10.2.1疼痛行为—触觉异常性疼痛

如图10中所示，手术后6天，在所有组中显示出反应(表示疼痛)的显著提高。

在研究期间，在第10、16、25和30天，肌内(IM)施用4×10⁴个胎盘干细胞显著降低了疼痛(图10C)。静脉内(IV)施用胎盘干细胞显著降低疼痛。具体地，在第16、25和30天，IV施用4×10⁶个胎盘干细胞显著减轻了疼痛；和IV施用1×10⁶个胎盘干细胞显示出在第16天显著的疼痛减轻作用(图10A)。如所期望的，在第10、16、25和30天，全身施用加巴喷丁显著减轻了疼痛(图10A，图10C)。

6.10.2.2运动感觉协调性—转棒试验

如图11所示，加巴喷丁处理对照组显示在转棒上所花的时间显著减少(运动感觉协调性改变)，而胎盘干细胞处理组的载体运动感觉协调性在IV(图11A)或IM(图11B)施用后不受影响(类似于载体处理组)。

6.10.2.3结论

胎盘干细胞的IV或IM施用减轻了坐骨神经慢性压迫性损伤所引起的神经性疼痛。胎盘干细胞对疼痛减轻的作用与加巴喷丁类似。然而，加巴喷丁引起了显著的运动感觉协调性缺陷，而胎盘干细胞却不会。

等同性：

本文所公开的组合物和方法不限于本文所述的具体实施方式的范围。事实上，根据以上说明和附图，除所述那些之外，所述组合物和方法的多种改变对于那些本领域技术人员将是显而易见的。这些改变旨在包括在所附权利要求的范围内。

在本文中引用了多篇出版物、专利和专利申请，以上出版物、专利和专利申请的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。

Claims (75)

1.一种治疗个体中疼痛的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的胎盘干细胞，其中所述治疗有效量是足以引起所述疼痛中的可检测改善的量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括在所述胎盘干细胞施用之前确定所述个体中疼痛的一个或多个第一水平，以及在所述胎盘干细胞施用后确定所述个体中疼痛的一个或多个第二水平，其中与所述疼痛的一个或多个第一水平相比，所述治疗有效量的胎盘干细胞降低了所述疼痛的所述一个或多个第二水平。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述疼痛的一个或多个第一水平和所述疼痛的一个或多个第二水平是通过疼痛评估量表来确定的。

4.根据权利要求4所述的方法，其中，所述疼痛评估量表为数字疼痛强度量表；疼痛性质评估量表；简单描述性疼痛强度量表；视觉模拟量表；Wong-Baker脸谱疼痛分级量表；FLACC量表；CRIES量表；COMFORT量表；或通过使患者经历冷、热或机械刺激所引起的诱发疼痛测量。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括在所述胎盘干细胞施用之前确定所述个体中疼痛的一种或多种生理学指标的第一水平，以及在所述胎盘干细胞施用后确定所述个体中疼痛的一种或多种生理学指标的第二水平，其中与所述第一水平相比，所述治疗有效量的胎盘干细胞降低了所述第二水平。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述疼痛的生理学指标是所述个体的心率。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，在所述施用后，所述个体的心率比所述施用前所述个体的心率更低。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述疼痛的生理学指标是所述个体的心脏收缩。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，在所述施用后，所述个体的心脏收缩比所述施用前所述个体的心脏收缩更低。

10.根据权利要求5所述的方法，其中，所述疼痛的生理学指标是所述个体的心脏舒张。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，在所述施用后，所述个体的心脏舒张比所述施用前所述个体的所述心脏舒张更低。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述胎盘干细胞是CD10⁺、CD34^–、CD105⁺胎盘干细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述胎盘干细胞另外是CD200⁺。

14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，其中，所述胎盘干细胞另外是CD45^–和CD90⁺。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中，所述胎盘干细胞另外是CD80^–和CD86^–。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述胎盘干细胞表达CD200而不表达HLA-G；或者表达CD73、CD105和CD200；或者表达CD200和OCT-4；或者表达CD73和CD105而不表达HLA-G。

17.根据权利要求1或12-14中任一项所述的方法，其中，所述胎盘干细胞是HLA-A,B,C⁺。

18.根据权利要求1或12所述的方法，其中，所述胎盘干细胞以比相同数目的骨髓来源间质干细胞(BM-MSC)可检测地更高的水平表达ELOVL2、ST3GAL6、ST6GALNAC5或SLC12A8基因。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述胎盘干细胞以比相同数目的BM-MSC可检测地更高的水平表达ARTS-1、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3或TGFB2基因。

20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述疼痛是神经性疼痛。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述神经性疼痛是由糖尿病性神经病变引起的。

22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述神经性疼痛是由所述个体中的神经损伤引起的。

23.根据权利要求20所述的方法，其中，所述神经性疼痛是由药物引起的。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述药物是含铂抗癌药物或者包含含铂抗癌药物。

25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述含铂抗癌药物是奥沙利铂、卡铂或顺铂或者包含奥沙利铂、卡铂或顺铂。

26.根据权利要求23所述的方法，其中，所述药物是紫杉醇或者包含紫杉醇。

27.根据权利要求20所述的方法，其中，所述神经性疼痛是由炎症引起的。

28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述炎症是神经炎。

29.根据权利要求1所述的方法，其中，所述疼痛是炎症性疼痛。

30.根据权利要求1所述的方法，其中，所述疼痛是骨痛。

31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述骨痛与癌症有关或者由癌症引起。

32.根据权利要求1所述的方法，其中，所述疼痛是由癌症引起的。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中，所述疼痛对类固醇治疗无反应。

34.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中，所述疼痛对非类固醇抗炎治疗无反应。

35.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中，所述疼痛对阿片样药物治疗无反应。

36.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中，所述疼痛对鸦片制剂治疗无反应。

37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中，将所述胎盘干细胞配制用于局部施用。

38.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中，将所述胎盘干细胞配制用于全身、静脉内或动脉内施用。

39.用于在治疗个体疼痛中使用的治疗有效量的胎盘干细胞，其中，所述治疗有效量是足以引起所述疼痛中的可检测改善的量。

40.根据权利要求39所述的胎盘干细胞，其中，在所述使用前所述个体中所述疼痛的水平和在所述使用后所述个体中所述疼痛的水平是通过疼痛评估量表来确定的。

41.根据权利要求40所述的胎盘干细胞，其中，所述疼痛评估量表为数字疼痛强度量表；疼痛性质评估量表；简单描述性疼痛强度量表；视觉模拟量表；Wong-Baker脸谱疼痛分级量表；FLACC量表；CRIES量表；或COMFORT量表。

42.根据权利要求39所述的胎盘干细胞，其中，在所述使用前所述个体中所述疼痛的水平和在所述使用后所述个体中所述疼痛的水平是通过疼痛的一个或多个身体指标确定的。

43.根据权利要求42所述的胎盘干细胞，其中，所述疼痛的生理学指标是所述个体的心率。

44.根据权利要求43所述的胎盘干细胞，其中，所述使用后所述个体的所述心率比所述使用前的更低。

45.根据权利要求39所述的胎盘干细胞，其中，所述疼痛的生理学指标是所述个体的心脏收缩。

46.根据权利要求45所述的胎盘干细胞，其中，所述使用后所述个体中的所述心脏收缩比所述使用前的更低。

47.根据权利要求39所述的胎盘干细胞，其中，所述疼痛的生理学指标是所述个体的心脏舒张。

48.根据权利要求47所述的胎盘干细胞，其中，所述使用后所述个体中的所述心脏舒张比所述使用前的更低。

49.根据权利要求39-48中任一项所述的胎盘干细胞，其中，所述胎盘干细胞是CD10⁺、CD34^–、CD105⁺胎盘干细胞。

50.根据权利要求49所述的胎盘干细胞，其中，所述胎盘干细胞另外是CD200⁺。

51.根据权利要求49或权利要求50所述的胎盘干细胞，其中，所述胎盘干细胞另外是CD45^–和CD90⁺。

52.根据权利要求49-51中任一项所述的胎盘干细胞，其中，所述胎盘干细胞另外是CD80^–和CD86^–。

53.根据权利要求39-52中任一项所述的胎盘干细胞，其中，所述胎盘干细胞表达CD200而不表达HLA-G；或者表达CD73、CD105和CD200；或者表达CD200和OCT-4；或者表达CD73和CD105而不表达HLA-G。

54.根据权利要求39-53中任一项所述的胎盘干细胞，其中，所述胎盘干细胞是HLA-A,B,C⁺。

55.根据权利要求39-55中任一项所述的胎盘干细胞，其中，所述胎盘干细胞以比相同数目的骨髓来源间质干细胞(BM-MSC)可检测地更高的水平表达ELOVL2、ST3GAL6、ST6GALNAC5或SLC12A8基因。

56.根据权利要求39-56中任一项所述的胎盘干细胞，其中，所述胎盘干细胞以比相同数目的BM-MSC可检测地更高的水平表达ARTS-1、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3或TGFB2基因。

57.根据权利要求39所述的胎盘干细胞，其中，所述疼痛是神经性疼痛。

58.根据权利要求57所述的胎盘干细胞，其中，所述神经性疼痛是由糖尿病性神经病变引起的。

59.根据权利要求57所述的胎盘干细胞，其中，所述神经性疼痛是由所述个体中的神经损伤引起的。

60.根据权利要求57所述的胎盘干细胞，其中，所述神经性疼痛是由药物引起的。

61.根据权利要求60所述的胎盘干细胞，其中，所述药物是含铂抗癌药物或者包含含铂抗癌药物。

62.根据权利要求61所述的胎盘干细胞，其中，所述含铂抗癌药物是奥沙利铂、卡铂或顺铂或者包含奥沙利铂、卡铂或顺铂。

63.根据权利要求61所述的胎盘干细胞，其中，所述药物是紫杉醇或者包含紫杉醇。

64.根据权利要求57所述的胎盘干细胞，其中，所述神经性疼痛是由炎症引起的。

65.根据权利要求64所述的胎盘干细胞，其中，所述炎症是神经炎。

66.根据权利要求39所述的胎盘干细胞，其中，所述疼痛是炎症性疼痛。

67.根据权利要求39所述的胎盘干细胞，其中，所述疼痛是骨痛。

68.根据权利要求67所述的胎盘干细胞，其中，所述骨痛与癌症有关或者由癌症引起。

69.根据权利要求39所述的胎盘干细胞，其中，所述疼痛是由癌症引起的。

70.根据权利要求39-69中任一项所述的胎盘干细胞，其中，所述疼痛对类固醇治疗无反应。

71.根据权利要求39-69中任一项所述的胎盘干细胞，其中，所述疼痛对非类固醇抗炎治疗无反应。

72.根据权利要求39-69中任一项所述的胎盘干细胞，其中，所述疼痛对阿片样药物治疗无反应。

73.根据权利要求39-69中任一项所述的胎盘干细胞，其中，所述疼痛对鸦片制剂治疗无反应。

74.根据权利要求39-73中任一项所述的胎盘干细胞，其中，将所述胎盘干细胞配制用于局部施用。

75.根据权利要求39-73中任一项所述的胎盘干细胞，其中，将所述胎盘干细胞配制用于全身、静脉内或动脉内施用。

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