WO2006121043A1

WO2006121043A1 - 間葉系幹細胞の培養方法および生体組織補填体の製造方法

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Publication number: WO2006121043A1
Application number: PCT/JP2006/309320
Authority: WO
Inventors: Konghua Lin
Original assignee: Olympus Corporation
Priority date: 2005-05-09
Filing date: 2006-05-09
Publication date: 2006-11-16
Also published as: US20100028997A1; EP1881062A4; EP1881062B1; EP1881062A1; US7972767B2; EP2210937A1

Abstract

　移植される生体組織前駆細胞中に含有される血清量を低減しながら、十分な増殖を図り、かつ、生体組織前駆細胞に効率的に分化させる。血清を含有する培地内で間葉系幹細胞を増殖させる第１の培養ステップと、該第１の培養ステップにおける培地よりも血清の濃度の低い培地内で間葉系幹細胞を生体組織前駆細胞に分化させる第２の培養ステップとを備える間葉系幹細胞の培養方法を提供する。

Description

明細書

間葉系幹細胞の培養方法および生体組織補填体の製造方法

技術分野

[0001] この発明は、間葉系幹細胞の培養方法および生体組織補填体の製造方法に関するものである。

背景技術

[0002] 骨髄液等に含まれて!/、る間葉系幹細胞 (MSC)は、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、神経細胞、腱細胞等、様々な細胞に分化可能な多分化能を有して、るため、細胞治療や再生医療の細胞ソースとして注目を集めて、る。しかしながら、骨髄液等力採取可能な間葉系幹細胞はごく微量であるため、臨床治療に用いる場合には、骨髄液内から集めた間葉系幹細胞を濃縮して力分離し、短期間で大量に増殖させることが重要である。

[0003] 間葉系幹細胞を効率よく増殖させる方法として、例えば、特許文献 1および特許文献 2に開示されてヽる方法が知られて!/、る。

これらの方法は、間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として繊維芽細胞増殖因子を培地に添加するものである。

また、間葉系幹細胞を培養する場合に用いられる培地には、牛胎児血清あるいはヒト血清が用いられるのが一般的である。

[0004] また、骨髄液中の間葉系幹細胞を濃縮'分離して力も培養する方法としては、採取した骨髄液を遠心した後に、その上澄み液を除去し、残った沈殿部分のみを培養容器に播種して底面に接着させた状態で増殖させる方法が知られて、る。この場合に、培養容器の底面に接着している間葉系幹細胞の播種密度が適正となるように調節する培養方法が提案されている (例えば、特許文献 3参照。 )₀

特許文献 1：国際公開第 WO02Z22788A1号公報

特許文献 2 :国際公開第 WO01Z48147A1号公報

特許文献 3：特開 2004— 254519号公報

発明の開示 [0005] し力しながら、牛胎児血清がヒトの体に移植される生体組織前駆細胞中に含まれることは好ましくなぐまた、患者の採血量の観点から、十分な量のヒト血清を使用することが制限される場合も多い。その一方で、患者力採取した微量の間葉系幹細胞を十分な細胞数まで増殖させるには、培地内における牛胎児血清あるいはヒト血清の使用は必要不可欠である。

[0006] また、間葉系幹細胞を培養容器の底面に接着させて培養する場合、間葉系幹細胞の増殖に伴って、細胞の接着する底面の面積が足りなくなるため、より広い底面積を有する培養容器への切替作業あるいは、複数の培養容器への切替作業 ( ヽゎゆる継代作業)を行う必要がある。継代作業は、トリプシンのようなタンパク質分解酵素を用いて間葉系幹細胞を培養容器の底面力剥離させる作業を伴うものであり、間葉系幹細胞に損傷を与える可能性がある。また、複数の培養容器の切替を伴うため、間葉系幹細胞が何らかの細菌や塵埃と接触する可能性が高くなるという不都合も考えられる。さらに、継代作業は、培養容器の底面に接着している間葉系幹細胞を剥離させ、新たな培養容器に接着させて培養を継続させる作業であるため、継代作業自体に時間がかかり、培養期間が長期化する不都合もある。

[0007] 本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体に移植される生体組織前駆細胞中に含有される血清量を低減しながら、十分な増殖を図り、かつ、生体組織前駆細胞に効率的に分化させることのできる間葉系幹細胞の培養方法および生体組織補填体の製造方法を提供することを目的として!ヽる。

[0008] また、本発明は、継代作業をなくして、間葉系幹細胞へのダメージを軽減し、コンタミネーシヨンのリスクを低減することができるとともに、培養操作を簡略ィ匕して培養期間を短縮し、効率的な増殖を図ることにより採取骨髄量を低減して患者に力かる負担を低減することができる間葉系幹細胞の培養方法を提供することを目的としている。

[0009] 上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。

本発明の第 1の態様は、血清を含有する培地内で間葉系幹細胞を増殖させる第 1 の培養ステップと、該第 1の培養ステップにおける培地よりも血清の濃度の低、培地内で間葉系幹細胞を生体組織前駆細胞に分化させる第 2の培養ステップとを備える間葉系幹細胞の培養方法である。 [0010] 本発明の第 1の態様によれば、第 1の培養ステップにおいて、血清を含む培地内において、血清の作用により間葉系幹細胞が必要細胞数まで増殖させられた後に、第

2のステップにお、て、血清の濃度の低!、培地内にお、て生体組織前駆細胞への分化が行われる。

発明者は、研究の結果、間葉系幹細胞の生体組織前駆細胞への分化段階においては、むしろ血清が存在しない方が効率的な分ィ匕を行うことができることを見いだした。したがって、間葉系幹細胞が必要細胞数まで増殖した後には、培地として血清濃度の低いものを採用することにより、従来行われていたような増殖時と同様の濃度の血清を含む培地を用いて培養するよりも、間葉系幹細胞を効率的に生体組織前駆細胞に分ィ匕させることができる。

[0011] 上記本発明の第 1の態様においては、第 2の培養ステップにおける培地内の血清の濃度がほぼゼロであることが好まし、。

このようにすることで、第 2の培養ステップにおいて、血清の影響をなくすことができ、生体組織前駆細胞への分ィ匕をさらに効率的に行うことができる。

[0012] また、上記本発明の第 1の態様においては、第 2の培養ステップにおける培地内の血清の濃度がゼロより大き、こととしてもよ、。

このようにすることで、第 2の培養ステップにおいて、血清の影響を残すことができる。その結果、生体組織前駆細胞への分ィヒの効率が濃度ゼロの場合よりも若干低下することとなるが、その分、血清の作用により間葉系幹細胞の増殖を継続させることができる。したがって、継続的に生体組織前駆細胞を供給し続ける用途においては、間葉系幹細胞を増殖させつつ、生体組織前駆細胞への分化を行わせることができるので、効果的である。

[0013] 上記本発明の第 1の態様においては、前記血清が牛胎児血清であることとしてもよぐまた、前記血清がヒト血清であることとしてもよい。

牛胎児血清を使用する場合に、第 2の培養ステップにおける培地内の血清濃度をゼロにすることにより、生体に移植される生体組織前駆細胞内に牛胎児血清が含まれることを防止できる。

また、ヒト血清を使用する場合に、第 2の培養ステップにおける培地内の血清濃度を少なくすることにより、患者からの血清の採取量を低減し、患者に係る負担を低減できる。

[0014] また、本発明の第 2の態様は、上記第 1の態様に係るいずれかの間葉系幹細胞の培養方法の第 2の培養ステップにお、て、間葉系幹細胞を生体適合性の材料からなる生体組織補填材に播種して培養する生体組織補填体の製造方法である。

本発明の第 2の態様によれば、血清の含有濃度を低減した生体組織補填体を製造することができる。

[0015] 本発明の第 3の態様は、培地内に間葉系幹細胞と造血幹細胞とを浮遊させ、間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を 1： 10〜1： 100の範囲に維持しつつ培養する間葉系幹細胞の培養方法である。

[0016] 本発明の第 3の態様によれば、間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率が 1： 10〜1： 100の範囲に維持される。間葉系幹細胞は、骨髄中においては種々の細胞とともに共存しており、間葉系幹細胞も浮遊した状態に維持されている。このことから、間葉系幹細胞を生きた生体内に近、状態で培養すれば、浮遊状態にぉ、ても増殖することが推測され、研究の結果、間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を上記範囲に維持することにより、生体外においても生体内と同様の条件が達成されて、間葉系幹細胞を効率的に培養することができることが判明した。このようにすることで、間葉系幹細胞を培養容器の底面に接着させる必要がなぐ継代作業が不要となり、間葉系幹細胞へのダメージを軽減し、コンタミネーシヨンのリスクを低減し、培養操作を簡略化して培養期間を短縮し、効率的な増殖を図ることにより採取骨髄量を低減して患者に力かる負担を低減することができる。

[0017] 上記本発明の第 3の態様においては、培地内の間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を監視し、間葉系幹細胞の比率が造血幹細胞の 1Z10倍より多い場合に、造血幹細胞の比率を増カロさせる液体因子を添加することとしてもよい。

このようにすることで、間葉系幹細胞の比率が増加した場合に液体因子を添加して造血幹細胞の比率を増力 tlさせ、生きた生体内に近い状態で間葉系幹細胞を効率的に増殖させることが可能となる。間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率の監視は、フロ一サイトメトリー (FACS)により行われる。例えば、間葉系幹細胞数は、細胞表面マ一力である CD29, CD90, SH3で、造血幹細胞数は、 Stem— kit (BD)で FACS により測定を行う。これにより両者の比率をモニタすることができる。

[0018] この場合に、造血幹細胞の比率を増加させる液体因子力 l〜100ngZmLの SC F (Stem Cell Factor) , l〜50ng/mLの IL— 3 (Interleukin— 3)、 l〜50ngZmLの I L— 6、 l〜50ngZmLの IL— 10、 10〜300ng/mLの FL (Flt- 3L)および l〜50n gZmLの TPO (Thrombopoietin)の混合液からなることが好まし！/、。

[0019] また、上記本発明の第 3の態様においては、培地内の間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を監視し、造血幹細胞の比率が間葉系幹細胞の 100倍より多い場合に、間葉系幹細胞の比率を増カロさせる液体因子を添加することとしてもよい。

このようにすることで、造血幹細胞の比率が増加した場合に液体因子を添加して間葉系幹細胞の比率を増力 tlさせ、生きた生体内に近い状態で間葉系幹細胞を効率的に増殖させることが可能となる。

[0020] この場合に、間葉系幹細胞の比率を増加させる液体因子力 1〜： LOOngZmLの P DGF (Platelet— Derived Growth Factor)、 1〜： L00ng/mLの bFGF (Basic Fibrob last Growth Factor)および 5〜3000 gZmLのビタミン Cの混合液からなることが好ましい。

[0021] また、本発明は上記第 1の態様または第 2の態様と上記第 3の態様とを組み合わせたものであってもよい。すなわち、本発明の第 4の態様は、血清を含有する培地内で間葉系幹細胞と造血幹細胞とを浮遊させ、間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を 1 ： 10〜1： 100の範囲に維持しつつ培養する第 1の培養ステップと、該第 1の培養ステップにおける培地よりも血清の濃度の低い培地内で間葉系幹細胞を生体組織前駆細胞に分化させる第 2の培養ステップとを備える間葉系幹細胞の培養方法である。

[0022] 本発明の第 4の態様によれば、第 1の培養ステップにおいて、血清を含む培地内において、血清の作用により間葉系幹細胞が必要細胞数まで増殖させられた後に、第 2のステップにお、て、血清の濃度の低!、培地内にお、て生体組織前駆細胞への分ィ匕が行われる。間葉系幹細胞が必要細胞数まで増殖した後には、培地として血清濃度の低いものを採用することにより、従来行われていたような増殖時と同様の濃度の血清を含む培地を用いて培養するよりも、間葉系幹細胞を効率的に生体組織前駆細胞に分ィ匕させることができる。

[0023] また、本発明の第 4の態様によれば、間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率が 1： 10 〜1 : 100の範囲に維持される。このようにすることで、間葉系幹細胞を培養容器の底面に接着させる必要がなぐ継代作業が不要となり、間葉系幹細胞へのダメージを軽減し、コンタミネーシヨンのリスクを低減し、培養操作を簡略化して培養期間を短縮し、効率的な増殖を図ることにより採取骨髄量を低減して患者に力かる負担を低減することができる。

[0024] 上記本発明の第 4の態様においては、前記血清が牛胎児血清であることとしてもよぐまた、前記血清がヒト血清であることとしてもよい。

[0025] 上記本発明の第 4の態様においては、培地内の間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を監視し、間葉系幹細胞の比率が造血幹細胞の 1Z10倍より多い場合に、造血幹細胞の比率を増カロさせる液体因子を添加することとしてもよい。

[0026] この場合に、造血幹細胞の比率を増加させる液体因子力 l〜100ngZmLの SC F (Stem Cell Factor) , l〜50ng/mLの IL— 3 (Interleukin— 3)、 l〜50ngZmLの I L— 6、 l〜50ngZmLの IL— 10、 10〜300ng/mLの FL (Flt- 3L)および l〜50n gZmLの TPO (Thrombopoietin)の混合液からなることが好まし！/、。 [0027] また、上記本発明の第 4の態様においては、培地内の間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を監視し、造血幹細胞の比率が間葉系幹細胞の 100倍より多い場合に、間葉系幹細胞の比率を増カロさせる液体因子を添加することとしてもよい。

[0028] この場合に、間葉系幹細胞の比率を増加させる液体因子力 1〜： LOOngZmLの P DGF (Platelet— Derived Growth Factor)、 1〜： L00ng/mLの bFGF (Basic Fibrob last Growth Factor)および 5〜3000 gZmLのビタミン Cの混合液からなることが好ましい。

[0029] また、本発明の第 5の態様は、上記第 4の態様に係るいずれかの間葉系幹細胞の培養方法の第 2の培養ステップにお、て、間葉系幹細胞を生体適合性の材料からなる生体組織補填材に播種して培養する生体組織補填体の製造方法である。

本発明の第 5の態様によれば、血清の含有濃度を低減した生体組織補填体を製造することができる。また、本発明の第 5の態様によれば、間葉系幹細胞へのダメージを軽減し、コンタミネーシヨンのリスクを低減し、培養操作を簡略化して培養期間を短縮し、効率的な増殖を図ることにより採取骨髄量を低減して患者に力かる負担を低減して生体組織補填体を製造することができる。

[0030] 本発明は、生体に移植される生体組織前駆細胞中に含有される血清量を低減しながら、十分な増殖を図り、かつ、生体組織前駆細胞に効率的に分化させることができるという効果を奏する。

[0031] また、本発明は、継代作業をなくして、間葉系幹細胞へのダメージを軽減し、コンタミネーシヨンのリスクを低減することができるとともに、培養操作を簡略ィ匕して培養期間を短縮し、効率的な増殖を図ることにより採取骨髄量を低減して患者に力かる負担を低減することができると、う効果を奏する。

図面の簡単な説明

[0032] [図 1]本発明の第 1の実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の実施例における A LP活性測定結果を示すグラフである。 [図 2]本発明の第 1の実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の実施例における力ルシゥム濃度測定結果を示すグラフである。

[図 3]本発明の第 1の実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の実施例における D NA濃度測定結果を示すグラフである。

[図 4]図 1の ALP活性を図 3の DNA濃度により補正した DNA当たりの ALP活性を示すグラフである。

[図 5]図 2のカルシウム濃度測定結果を図 3の DNA濃度測定結果を用いて補正した細胞 1個当たりのカルシウム濃度測定結果を示すグラフである。

[図 6]本発明の第 2の実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の実施例における A LP活性測定結果を示すグラフである。

[図 7]本発明の第 2の実施形態に係る他の間葉系幹細胞の培養方法の実施例における ALP活性測定結果を示すグラフである。

[図 8]本発明の第 2の実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の実施例における力ルシゥム濃度測定結果を示すグラフである。

[図 9]本発明の第 2の実施形態に係る他の間葉系幹細胞の培養方法の実施例におけるカルシウム濃度測定結果を示すグラフである。

[図 10]本発明の第 2の実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の実施例における DNA濃度測定結果を示すグラフである。

[図 11]本発明の第 2の実施形態に係る他の間葉系幹細胞の培養方法の実施例における DNA濃度測定結果を示すグラフである。

[図 12]本発明の第 3の実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法による培養結果を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

(第 1の実施形態）

以下、本発明の第 1の実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法について説明する。

本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法は、第 1の培養ステップと第 2の培養ステップとから構成され、患者力も採取した間葉系幹細胞を培養して、生体組織前駆細胞、例えば、骨芽細胞に分ィ匕させる方法である。

[0034] 第 1の培養ステップは、牛胎児血清を含有する第 1の培地内に間葉系幹細胞を投入し、所定の培養条件下で培養することにより、間葉系幹細胞を必要細胞数まで増殖させるステップである。

第 2の培養ステップは、牛胎児血清を含有しない第 2の培地内に、第 1の培養ステップで培養した間葉系幹細胞を投入し、骨芽細胞に分ィ匕させるステップである。

[0035] 本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法によれば、牛胎児血清を含有する第 1の培地内における第 1の培養ステップにおいて、間葉系幹細胞が牛胎児血清の作用により、効率的に増殖させられて、早期に必要細胞数まで到達させることができる。その後、牛胎児血清を含有しない第 2の培地内における第 2の培養ステップにおいて、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分ィ匕が牛胎児血清によって阻害されることなく効率的に行われることになる。

[0036] また、第 1の培養ステップにおいて増殖させられた間葉系幹細胞は、洗浄により培地を除去され、トリプシン等の蛋白質分解酵素により培養容器から剥離された後に遠心分離されて集められ、第 2の培地内に投入される。したがって、第 2の培地内に投入される際に間葉系幹細胞に付着していた第 1の培地内の牛胎児血清は取り除かれており、第 2の培養ステップにおいては、牛胎児血清が存在しない第 2の培地内において間葉系幹細胞の骨芽細胞への分ィ匕が効率的に行われることになる。

[0037] その結果、第 2の培養ステップを経て得られる骨芽細胞には牛胎児血清が付着しておらず、そのまま患者の体内に移植することができる。

なお、本実施形態においては、第 2の培地内の牛胎児血清の濃度をゼロに設定したが、これに代えて、第 1の培地内の牛胎児血清濃度よりも低くゼロより大きい濃度の範囲内にお!ヽて牛胎児血清を含んで!/ヽる場合にお!ヽても、骨芽細胞への分化誘導を促進できる効果があるとともに、患者に移植される骨芽細胞内の牛胎児血清濃度を低減できる効果がある。

[0038] 次に、本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の一実施例について説明する本実施例においては、第 1の培地は、初代培養用培地および第 1回目培地交換用培地として、 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) , 10%FBS (Fetal Bovine Serum )、 bFGF (lOngZmL)、ビタミン C (50 μ g/mL)、 dexamethasone (10nM) 、 gentamicin (50 μ g/mL)および amphotercinB (0. 25 μ g/mL)からなる培地 (以下、 VFD培地と略す。）を用い、第 2回目以降の培地交換用培地および継代用培地として、 DMEM、 10%FBS、 bFGF (10ng/mL)、ビタミン C (50 μ g/mL)、 genta micin (50 μ g/mL)および amphotercinB (0. 25 μ g/mL)からなる培地（以下、 VF 培地と略す。）を用いた。

[0039] 第 2の培地としては、 DMEM,ビタミン C (50 μ g/mL)、 dexamethasone (10"^?M) 、 β -glycerophosphate ( β— GP) (lOmM)、 gentamicin (50 μ gz mLおよ O、ampho tercinB (0. 25 gZmL)力もなる培地（以下、 FBS0%OS培地と略す。）を用いた。なお、比較例として、 DMEM, 10%FBS、ビタミン C (50 μ g/mL)、 dexamethaso ne (10^_7M)、 β—GP (10mM)、 gentamicin (50 At gZmL)および amphotercinB (0 . 25 /z gZmL)からなる培地（以下、 FBS10%OS培地と略す。）を用いた場合について検討した。

[0040] 第 1の培養ステップは、以下の要領で行った。

1. 患者力も採取した骨髄液を遠心分離機（1500rpm、 5分間)を用いて遠心分離し、上清を除去する。

2. ピペットで骨髄溶液をよく混合して、 150mLストレージボトルに移し、 VFD培地をカロえて 120mUこする。

3. ピペッティングにより攪拌し、 15mLずつ 8枚の 75cm²フラスコに分注し、フラスコの蓋を閉める。

4. フラスコを 37°Cに設定した COインキュベータに入れて 3〜4日間培養する。

2

5. 各フラスコ中の培地を 10. 5mL (70%)取り除き、新たな VFD培地 10. 5mLを加えることで第 1回目の培地交換を行う。

6. フラスコを 37°Cに設定した COインキュベータに入れて 3〜4日間培養する。

2

7. 各フラスコ中の培地を 15mL (全量）取り除き、新鮮な VF培地 15mLをカ卩えることで第 2回目の培地交換を行う。

8. フラスコを 37°Cに設定した COインキュベータに入れて 3〜4日間行う培養と、培地交換とを繰り返す。

[0041] 第 1の培養ステップにおいて必要細胞数が得られた時点で第 2の培養ステップを行第 2の培養ステップは、以下の要領で行った。

1. 第 1の培養ステップにおいて得られた間葉系幹細胞は、フラスコ内の培地を取り除き、洗浄した後に、トリプシン溶液によって剥離し、遠心分離によって回収する。その後、第 2の培地に投入して細胞懸濁液を作成する。

2. 12wellプレートに、培地量 2mLZwell、播種密度 1 X 10⁴cells/cm²となるように播種する。

3. 37°Cに設定した COインキュベータに入れて培養し、 3〜4日ごとに培地交換を

2

行う。

[0042] この場合において、間葉系幹細胞の接着後における牛胎児血清の影響を観察するために、 FBS0%OS培地を用いる第 2の培養ステップにおいては、培養初期に 4 時間程度、 FBS10%OS培地を用いて、間葉系幹細胞を接着させてから、 FBS0% OS培地に切り替える場合と、第 2の培養ステップの最初は FBS10%OS培地を用い、培養 7日目に FBS0%OS培地に切り替える場合の 2つの場合について検討した。また、比較例としては、第 2の培養ステップの最初力も FBS10%OS培地を用い続ける従来の場合を例示した。

[0043] 分析は、 ALP活性測定、 DNA濃度測定およびカルシウム濃度測定により行った。

ALP活性測定は、以下の要領で行った。

1. 得られた細胞を生理食塩水で 3回洗浄する。

2. 0. 2%Tritonを 400 μ LZwellで添加する。

3. セルスクレーバで細胞を剥離する。

4. 全細胞を回収する。

5. ホモジナイザで細胞を破砕する。

6. 遠心分離を行!、（8000rpm、 5分）、上清をサンプルとする。

7. ALP活性測定キット (ラボアツセィ ALP：和光純薬工業製)を用いて、 ALP活性を測定する。 [0044] DNA濃度測定は、以下の要領で行った。

1. 得られた細胞を生理食塩水で 3回洗浄する。

2. 0. 2%Tritonを 400 μ LZwellで添加する。

3. セルスクレーバで細胞を剥離する。

4. 全細胞を回収する。

5. ホモジナイザで細胞を破砕する。

7. DNA濃度測定キット（Fluorescent

DNA Quantitiation Kit : BIO RAD社製）を用いて、 DNA濃度を測定する。

[0045] カルシウム濃度測定は、以下の要領で行った。

1. 得られた細胞を生理食塩水で 3回洗浄する。

2. 0. 2%Tritonを 400 μ LZwellで添カ卩し、室温で 180分間抽出する。

3. 各サンプルを回収し、カルシウム濃度測定キット（カルシウム C—テストヮコ一：和光純薬工業製)を用いて、カルシウム濃度を測定する。

[0046] 図 1に ALP活性測定結果を示す。

これによれば、第 2の培養ステップの最初力も FBS10%OS培地を用いた場合には、 FBS10%OS培地のまま培養し続けた場合および開始後 7日目に FBS0%OS培地に切り替えた場合のいずれも力同等のパターンで ALP活性が変化していることがわかる。一方、第 2の培養ステップの最初力も FBS0%OS培地を用いた場合には、全体的に ALP活性が低いことがわかる。

[0047] 図 2にカルシウム濃度測定結果を示す。

これによれば、第 2の培養ステップの最初から FBS10%OS培地を用い、 FBS10 %OS培地のまま培養し続ける従来の培養方法の場合には、培養時間の経過とともにカルシウム蓄積量が飽和していることがわかる。一方、第 2の培養ステップの開始後 7日目に FBS10%OS培地力も FBS0%OS培地に切り替えた場合、および、第 2 の培養ステップの最初力も FBS0%OS培地を用いた本実施形態の場合の、ずれも力特に培養期間の経過とともに、従来の培養方法よりも、カルシウム蓄積量が大幅に増加していることがわかる。 [0048] 図 3に DNA濃度測定結果を示す。

これによれば、第 2の培養ステップの最初力も FBS10%OS培地を用いた場合には、 FBS10%OS培地のまま培養し続けた場合および開始後 7日目に FBSO%OS培地に切り替えた場合のいずれも力同等のパターンで DNA濃度が変化していることがわかる。一方、第 2の培養ステップの最初力も FBS0%OS培地を用いた場合には、全体的に DNA濃度が低いことがわかる。

[0049] DNA濃度測定結果により、牛胎児血清の使用条件によって細胞増殖速度が異なつて、ることがわ力つたので、 ALP活性とカルシウム蓄積量にっ、て正確な比較を行うために、図 1の ALP活性と図 2のカルシウム濃度測定結果を図 3の DNA濃度測定結果で割ることにより、細胞 1個当たりの ALP活性とカルシウム蓄積量を求め、それぞれ図 4および図 5に示した。

[0050] 図 4に示すように、 DNA濃度で補正した ALP活性によれば、第 2の培養ステップの最初から FBSO%OS培地を用いた場合、および培養 7日目力ら FBSO%OS培地に切り替えた場合のいずれも力従来の FBS10%OS培地を用いた場合と比較して、 ALP活性が 11日目まで同じ傾向で増加している。また、 DNA濃度で補正した ALP 活性は、その後、牛胎児血清の条件によって変化している。

図 1に比べ、 DNA濃度で補正した FBSO%OS培地の ALP活性が高くなり、 11日目まで他の条件と同じであった。 11日目以降、他の条件より ALP活性が低いものの、一定レベルに維持された。これが次のカルシウム蓄積 (石灰化）に寄与していると考えられる。

[0051] 図 5に DNA濃度で補正したカルシウム濃度を示す。

これによれば、第 2の培養ステップにおいて、最初力も FBSO%OS培地を用いた場合、および開始 7日目力 FBSO%OS培地に切り替えた場合のいずれも力従来の FBS10%OS培地による培養方法と比較して、培養時間の経過とともに、細胞 1個当たりのカルシウム蓄積量が大幅に増大していることがわかる。

[0052] 以上の結果から、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する際に、牛血清培地を含有しない無血清培地に切り替えることにより、牛血清培地を使用し続ける従来の培養方法と同等以上の骨芽細胞を効率的に得ることができる。し力も、得られた骨芽細胞における牛血清培地の含有量が低減されるので好ましい。特に、培養時間が長時間になるほど、多くの骨芽細胞を得ることができる。

[0053] したがって、第 2の培養ステップにお、て、間葉系幹細胞を生体適合性の材料、例えば、 j8リン酸三カルシウム多孔体等のリン酸カルシウム多孔体力なる生体組織補填材に播種して培養する培養骨の製造方法によれば、牛血清培地を含まな、培養骨を効率的に製造することができる。

[0054] (第 2の実施形態）

次に、本発明の第 2の実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法について説明する。

本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法は、ヒト自己血清を使用したケースを想定したものである。第 1の実施形態では牛胎児血清を使用したため、牛胎児血清を取り除く目的で第 2の培養ステップにおいて牛胎児血清濃度をゼロに切り替える方策をとつた。しかし、ヒト自己血清を使用した場合、その濃度をゼロにする必要はない。逆に、血清が存在した方が細胞増殖に効果があるという観点から、血清を残した方がよいと考えられた。そこで、どのくらい血清があれば、細胞の増殖と分化に影響を及ぼさないかを検討した。

[0055] 本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養法法によれば、 10〜15%ヒト自己血清を含有する第 1の培地内における第 1の培養ステップにおいて、間葉系幹細胞が高濃度の自己血清により効率的に増殖させられる。その結果間葉系幹細胞を早期に必要細胞数まで到達させることができる。その後、低濃度の自己血清を含有する第 2の培地内における第 2の培養ステップにおいて、間葉系幹細胞の細胞数を維持しながら骨芽細胞への分ィ匕を行うことになる。

[0056] また、第 1の培養ステップにおいて増殖させられた間葉系幹細胞は、洗浄により培地を除去され、トリプシン等の蛋白質分解酵素により培養容器から剥離された後に遠心分離されて集められ、第 2の培地内に投入される。第 2の培養ステップにおいては、ヒト血清濃度が低、第 2の培地内にぉ、て間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化が効率的に行われることになる。

[0057] その結果、第 2の培養ステップにおいて使用するヒト血清の採取量を削減することができ、患者に係る負担を低減できるという利点がある。

また、本実施形態においては、第 2の培地内のヒト血清濃度をゼロより大きい濃度の範囲内で第 1の培地内のヒト血清濃度よりも低くすることとしたため、最終的に患者に移植される骨芽細胞にヒト血清が含有されることとなるが、間葉系幹細胞のソースである患者と同一人力も採取したヒト血清を用いるので何ら問題はない。

[0058] 逆に、ヒト血清濃度がゼロとならない範囲で第 2の培地内に含有されていた方がよい場合もある。すなわち、第 2の培養ステップにおいて間葉系幹細胞を完全に骨芽細胞に分化させるのではなぐ一部の間葉系幹細胞を増殖させつつ、他の一部の間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることで、骨芽細胞を継続的に提供し続けることが可能となる。したがって、骨芽細胞を継続的に提供し続けることが必要な用途にお V、ては、ヒト血清濃度がゼロとならな!/、範囲で第 2の培地内に含有されて、ることが好ましい。

[0059] 次に、本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の一実施例について説明する本実施例においては、 2種類の間葉系幹細胞 A, Bを用いる。

第 1の培地は、第 1の実施形態における第 1の培地中の 10%FBSの代わりに 15 % ヒト自己血清を用いたものと同じである。

[0060] 第 2の培地としては、 DMEM、 5%ヒト血清、ビタミン C (50 μ g/mL)、 dexamethas one (10^_7M)、 β—GP (10mM)、 gentamicin ^O At gZmL)および amphotercinB ( 0. 25 μ gZmL)からなる培地（以下、 HS5%OS培地と略す。）と、ヒト血清の濃度を 10%とした HS10%OS培地の 2種類を用意した。また、比較例としてヒト血清の濃度を 15%とした従来の HS15%OS培地を用意した。

[0061] 第 1の培養ステップ、第 2の培養ステップは、第 1の実施形態と同様である。

ただし、第 2の培養ステップにおいては、異なる濃度のヒト自己血清の 3種類の第 2 の培地を継続して使用した。

ALP活性測定方法、カルシウム濃度測定方法および DNA濃度測定方法は、ずれも上述した通りである。

[0062] 図 6、図 8および図 10に、間葉系幹細胞 Aの ALP活性測定結果、カルシウム濃度測定結果および DNA濃度測定結果を示す。また、図 7、図 9および図 11に間葉系幹細胞 Bの ALP活性測定結果、カルシウム濃度測定結果および DNA濃度測定結果を示す。

これらの図 6〜図 11によれば第 2の培地中のヒト血清濃度の大小にかかわらず、ヽずれの間葉系幹細胞 A, Bの場合にも、ほぼ同様な ALP活性、カルシウム濃度および DNA濃度の傾向を示すことがわかった。

[0063] すなわち、間葉系幹細胞を増殖させる第 1の培養ステップにおいては、比較的高い濃度のヒト血清が必要であり、従来は、第 2の培養ステップにおいても同様の濃度のヒト血清を含有する培地を用いていたが、本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法によれば、より少ない量のヒト血清を用いて、従来と同等の骨芽細胞を得ることができる。したがって、患者力も採取するヒト血清の採取量を低く抑えて患者の負担を大幅に低減しつつ、従来と同等の骨芽細胞を得ることができるという効果がある。

[0064] また、本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法を用いて培養骨を製造する場合においても、上記と同様に、少ないヒト血清で従来と同等の培養骨を効率的に製造することができる。

[0065] なお、上記各実施形態にお!、ては、第 2の培養ステップにお、て間葉系幹細胞から骨芽細胞への分ィ匕誘導する場合について説明した力これに限定されるものではなぐ他の任意の生体組織前駆細胞への分化誘導に適用することにしてもよい。同様に、生体組織補填体としては培養骨に限定されるものではなぐ他の任意の生体組織補填体の製造に適用することができる。

[0066] また、上記実施形態においては、ヒト血清の濃度をゼロより大きい濃度の範囲で低減する場合について説明したが、これに代えて、第 2の培地内のヒト血清濃度をゼロにしても、所定の効果を得ることができることが予想される。

[0067] (第 3の実施形態）

次に、本発明の第 3の実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法について説明する。

本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法は、まず、培養容器内に貯留した培地内に患者カゝら採取した骨髄液を投入し、 37°Cに保った状態で、攪拌する。培養容器の内壁には、接着性の間葉系幹細胞が付着しないようにコーティングが施されている。

[0068] 患者力も採取した骨髄液内には、間葉系幹細胞と造血幹細胞とが、 1： 10〜1： 10 0の割合で存在している。したがって、骨髄液を投入して開始される培養開始時には、培養容器内における間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率が生体内に近い状態になっている。また、培養容器内の培地を攪拌することにより、間葉系幹細胞および造血幹細胞は培地内において浮遊し、し力も、培養容器の内壁に間葉系幹細胞の付着を防止するコーティングが施されているので、間葉系幹細胞は培地内において浮遊状態に維持される。これも、生体内に近い状態になっている。

[0069] 本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法においては、培地内における間葉系幹細胞と造血幹細胞の比率を監視する。例えば、間葉系幹細胞数は、細胞表面マ一力である CD29, CD90, SH3で、造血幹細胞数は Stem— Kit (BD)で F ACSにより測定を行うことで、培養物中の間葉系幹細胞数と造血幹細胞数を監視することができる。そして、培地中の造血幹細胞数が多くなつてきたときは、間葉系幹細胞を増カロさせる液体因子を添加し、培地中の造血幹細胞数が少なくなつてきたときは、造血幹細胞を増加させる液体因子を添加する。

[0070] 間葉系幹細胞を増加させる液体因子としては、 l〜100ngZmLの PDGF (Platelet -Derived urowth Factor)、 l〜100ngZmLの bFGF (Basic Fibroblast

Growth Factor)および 5〜3000 μ gZmLのビタミン Cの混合液を挙げることができる。また、造血幹細胞を増加させる液体因子としては、 l〜100ngZmLの SCF (Stem Cell Factor)、 l〜50ngZmLの IL— 3 (Interleukin— 3)、 l〜50ngZmLの IL— 6、 1 〜50ng/mLの IL—10、 10〜300ng/mLの FL (Flt- 3L)および l〜50ng/mL の TPO (Thrombopoietin)の混合液を挙げることができる。

[0071] このように、本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法によれば、培養中における培地内の間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を常に生体内に近い状態に維持するので、培養容器に接着させることなぐ生体内と同様に間葉系幹細胞を浮遊させたままの状態で、生体内と同様に効率的に間葉系幹細胞を増殖させることができる。

[0072] すなわち、本実施形態に係る培養方法によれば、間葉系幹細胞を培養容器に接着させることなく浮遊させたまま培養するので、培養容器を切り替える継代作業が不要となり、該継代作業に伴う不都合、つまり、間葉系幹細胞に与えるダメージやコンタミネーシヨンリスクの低減を図ることができるという利点がある。

また、手間と時間を要する継代作業を不要とすることにより、培養操作を簡便化することができるとともに、培養期間を短縮して早期に効率的に間葉系幹細胞を必要細胞数まで増殖させることができる。

[0073] さらに、生体内に近い状態で間葉系幹細胞を効率的に増殖させるので、骨髄液の採取量を低減することができ、したがって、患者に力かる負担を低減することができるという利点もある。

[0074] 表 1および図 12に、間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を生体内と同様の状態に維持して浮遊培養した結果を示す。具体的には、 125UZmLのへパリンを含む骨髄液を 37°Cインキュベータ内で培養した結果、 68時間後の間葉系幹細胞の数は初期の 2. 3倍も増殖した。その結果、骨髄中の各細胞の比率、特に間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を生体内と同様の状態に維持することによって、浮遊状態でも間葉系幹細胞を増殖させることが可能であることがわ力つた。

[0075] [表 1]

細胞数/ we I I

培養平均標準時間 1 2 3 偏差

0H 6 1 1 1 0 9 3

68H 1 8 2 2 2 2 2 1 2

Claims

請求の範囲

[1] 血清を含有する培地内で間葉系幹細胞を増殖させる第 1の培養ステップと、

該第 1の培養ステップにおける培地よりも血清の濃度の低い培地内で間葉系幹細胞を生体組織前駆細胞に分化させる第 2の培養ステップとを備える間葉系幹細胞の培養方法。

[2] 第 2の培養ステップにおける培地内の血清の濃度がほぼゼロである請求項 1に記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[3] 第 2の培養ステップにおける培地内の血清の濃度がゼロより大きい請求項 1に記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[4] 前記血清が、牛胎児血清である請求項 2に記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[5] 前記血清が、ヒト血清である請求項 1から請求項 3のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[6] 請求項 1から請求項 5の、ずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法の第 2の培養ステップにお、て、間葉系幹細胞を生体適合性の材料からなる生体組織補填材に播種して培養する生体組織補填体の製造方法。

[7] 培地内に間葉系幹細胞と造血幹細胞とを浮遊させ、

間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を 1： 10〜1： 100の範囲に維持しつつ培養する間葉系幹細胞の培養方法。

[8] 培地内の間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を監視し、

間葉系幹細胞の比率が造血幹細胞の 1Z10倍より多い場合に、造血幹細胞の比率を増加させる液体因子を添加する請求項 7に記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[9] 造血幹細胞の比率を増加させる液体因子力 l〜100ngZmLの SCF、 l〜50ng

/mLの IL— 3、 l〜50ng/mLの IL— 6、 l〜50ng/mLの IL— 10、 10〜300ng

ZmLの FLおよび l〜50ngZmLの TPOの混合液力なる請求項 8に記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[10] 培地内の間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を監視し、

造血幹細胞の比率が間葉系幹細胞の 100倍より多い場合に、間葉系幹細胞の比率を増加させる液体因子を添加する請求項 7から請求項 9のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[11] 間葉系幹細胞の比率を増加させる液体因子が、 1〜： LOOngZmLの PDGF、 1〜1

OOngZmLの bFGFおよび 5〜3000 μ gZmLのビタミン Cの混合液からなる請求項

10に記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[12] 血清を含有する培地内で間葉系幹細胞と造血幹細胞とを浮遊させ、間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を 1： 10〜1： 100の範囲に維持しつつ培養する第 1の培養ステツプと、

[13] 第 2の培養ステップにおける培地内の血清の濃度がほぼゼロである請求項 12に記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[14] 第 2の培養ステップにおける培地内の血清の濃度がゼロより大きい請求項 12に記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[15] 前記血清が、牛胎児血清である請求項 13に記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[16] 前記血清が、ヒト血清である請求項 12から請求項 14のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[17] 培地内の間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を監視し、

間葉系幹細胞の比率が造血幹細胞の 1Z10倍より多い場合に、造血幹細胞の比率を増加させる液体因子を添加する請求項 12から請求項 16のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[18] 造血幹細胞の比率を増加させる液体因子力 l〜100ngZmLの SCF、 l〜50ng

ZmLの FLおよび l〜50ngZmLの TPOの混合液力もなる請求項 17に記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[19] 培地内の間葉系幹細胞と造血幹細胞との比率を監視し、

造血幹細胞の比率が間葉系幹細胞の 100倍より多い場合に、間葉系幹細胞の比率を増加させる液体因子を添加する請求項 12から請求項 18のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[20] 間葉系幹細胞の比率を増加させる液体因子が、 1〜： LOOngZmLの PDGF、 1〜1

19に記載の間葉系幹細胞の培養方法。

[21] 請求項 12から請求項 20のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法の第 2の培養ステップにお!、て、間葉系幹細胞を生体適合性の材料からなる生体組織補填材に播種して培養する生体組織補填体の製造方法。