JP4804031B2 - 間葉系幹細胞の培養方法および生体組織補填体の製造方法 - Google Patents
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Description
これらの方法は、間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として繊維芽細胞増殖因子を培地に添加するものである。
また、間葉系幹細胞を培養する場合に用いられる培地には、牛胎児血清あるいはヒト血清が用いられるのが一般的である。
本発明は、血清およびデキサメタゾンを含有する培地内で間葉系幹細胞を増殖させる第1の培養ステップと、デキサメタゾンを含有し前記第1の培養ステップにおける培地よりも血清の濃度の低い培地内で間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる第2の培養ステップとを備える間葉系幹細胞の培養方法を提供する。
発明者は、研究の結果、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化段階においては、むしろ血清が存在しない方が効率的な分化を行うことができることを見いだした。したがって、間葉系幹細胞が必要細胞数まで増殖した後には、培地として血清濃度の低いものを採用することにより、従来行われていたような増殖時と同様の濃度の血清を含む培地を用いて培養するよりも、間葉系幹細胞を効率的に骨芽細胞に分化させることができる。
このようにすることで、第2の培養ステップにおいて、血清の影響をなくすことができ、骨芽細胞への分化をさらに効率的に行うことができる。
このようにすることで、第2の培養ステップにおいて、血清の影響を残すことができる。その結果、骨芽細胞への分化の効率が濃度ゼロの場合よりも若干低下することとなるが、その分、血清の作用により間葉系幹細胞の増殖を継続させることができる。したがって、継続的に骨芽細胞を供給し続ける用途においては、間葉系幹細胞を増殖させつつ、骨芽細胞への分化を行わせることができるので、効果的である。
牛胎児血清を使用する場合に、第2の培養ステップにおける培地内の血清濃度をゼロにすることにより、生体に移植される骨芽細胞内に牛胎児血清が含まれることを防止できる。
また、ヒト血清を使用する場合に、第2の培養ステップにおける培地内の血清濃度を少なくすることにより、患者からの血清の採取量を低減し、患者に係る負担を低減できる。
また、上記発明においては、前記第2の培養ステップにおける培地のデキサメタゾンの添加濃度は、前記第1の培養ステップにおけるデキサメタゾンの添加濃度よりも大きくてもよい。
本発明によれば、血清の含有濃度を低減した生体組織補填体を製造することができる。
本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法は、第1の培養ステップと第2の培養ステップとから構成され、患者から採取した間葉系幹細胞を培養して、生体組織前駆細胞、例えば、骨芽細胞に分化させる方法である。
第2の培養ステップは、牛胎児血清を含有しない第2の培地内に、第1の培養ステップで培養した間葉系幹細胞を投入し、骨芽細胞に分化させるステップである。
なお、本実施形態においては、第2の培地内の牛胎児血清の濃度をゼロに設定したが、これに代えて、第1の培地内の牛胎児血清濃度よりも低くゼロより大きい濃度の範囲内において牛胎児血清を含んでいる場合においても、骨芽細胞への分化誘導を促進できる効果があるとともに、患者に移植される骨芽細胞内の牛胎児血清濃度を低減できる効果がある。
本実施例においては、第1の培地は、初代培養用培地および第1回目培地交換用培地として、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)、10%FBS(Fetal Bovine Serum )、bFGF(10ng/mL)、VC(50μg/mL)、Dex(10nM)、gentamicin(50μg/mL)およびamphotercinB(0.25μg/mL)からなる培地(以下、VFD培地と略す。)を用い、第2回目以降の培地交換用培地および継代用培地として、DMEM、10%FBS、bFGF(10ng/mL)、VC(50μg/mL)、gentamicin(50μg/mL)およびamphotercinB(0.25μg/mL)からなる培地(以下、VF培地と略す。)を用いた。
なお、比較例として、DMEM、10%FBS、VC(50μg/mL)、Dex(10−7M)、GP(10mM)、gentamicin(50μg/mL)およびamphotercinB(0.25μg/mL)からなる培地(以下、FBS10%OS培地と略す。)を用いた場合について検討した。
1. 患者から採取した骨髄液を遠心分離機(1500rpm、5分間)を用いて遠心分離し、上清を除去する。
2. ピペットで骨髄溶液をよく混合して、150mLストレージボトルに移し、VFD培地を加えて120mLにする。
3. ピペッティングにより攪拌し、15mLずつ8枚の75cm2フラスコに分注し、フラスコの蓋を閉める。
4. フラスコを37℃に設定したCO2インキュベータに入れて3〜4日間培養する。
5. 各フラスコ中の培地を10.5mL(70%)取り除き、新たなVFD培地10.5mLを加えることで第1回目の培地交換を行う。
6. フラスコを37℃に設定したCO2インキュベータに入れて3〜4日間培養する。
7. 各フラスコ中の培地を15mL(全量)取り除き、新鮮なVF培地15mLを加えることで第2回目の培地交換を行う。
8. フラスコを37℃に設定したCO2インキュベータに入れて3〜4日間行う培養と、培地交換とを繰り返す。
第2の培養ステップは、以下の要領で行った。
1. 第1の培養ステップにおいて得られた間葉系幹細胞は、フラスコ内の培地を取り除き、洗浄した後に、トリプシン溶液によって剥離し、遠心分離によって回収する。その後、第2の培地に投入して細胞懸濁液を作成する。
2. 12wellプレートに、培地量2mL/well、播種密度1×104cells/cm2となるように播種する。
3. 37℃に設定したCO2インキュベータに入れて培養し、3〜4日ごとに培地交換を行う。
また、比較例としては、第2の培養ステップの最初からFBS10%OS培地を用い続ける従来の場合を例示した。
ALP活性測定は、以下の要領で行った。
1. 得られた細胞を生理食塩水で3回洗浄する。
2. 0.2%Tritonを400μL/wellで添加する。
3. セルスクレーパで細胞を剥離する。
4. 全細胞を回収する。
5. ホモジナイザで細胞を破砕する。
6. 遠心分離を行い(8000rpm、5分)、上清をサンプルとする。
7. ALP活性測定キット(ラボアッセイALP:和光純薬工業製)を用いて、ALP活性を測定する。
1. 得られた細胞を生理食塩水で3回洗浄する。
2. 0.2%Tritonを400μL/wellで添加する。
3. セルスクレーパで細胞を剥離する。
4. 全細胞を回収する。
5. ホモジナイザで細胞を破砕する。
6. 遠心分離を行い(8000rpm、5分)、上清をサンプルとする。
7. DNA濃度測定キット(Fluorescent DNA Quantitiation Kit:BIO RAD社製)を用いて、DNA濃度を測定する。
1. 得られた細胞を生理食塩水で3回洗浄する。
2. 0.2%Tritonを400μL/wellで添加し、室温で180分間抽出する。
3. 各サンプルを回収し、カルシウム濃度測定キット(カルシウムC−テストワコー:和光純薬工業製)を用いて、カルシウム濃度を測定する。
これによれば、第2の培養ステップの最初からFBS10%OS培地を用いた場合には、FBS10%OS培地のまま培養し続けた場合および開始後7日目にFBS0%OS培地に切り替えた場合のいずれもが、同等のパターンでALP活性が変化していることがわかる。一方、第2の培養ステップの最初からFBS0%OS培地を用いた場合には、全体的にALP活性が低いことがわかる。
これによれば、第2の培養ステップの最初からFBS10%OS培地を用い、FBS10%OS培地のまま培養し続ける従来の培養方法の場合には、培養時間の経過とともにカルシウム蓄積量が飽和していることがわかる。一方、第2の培養ステップの開始後7日目にFBS10%OS培地からFBS0%OS培地に切り替えた場合、および、第2の培養ステップの最初からFBS0%OS培地を用いた本実施形態の場合のいずれもが、特に培養期間の経過とともに、従来の培養方法よりも、カルシウム蓄積量が大幅に増加していることがわかる。
これによれば、第2の培養ステップの最初からFBS10%OS培地を用いた場合には、FBS10%OS培地のまま培養し続けた場合および開始後7日目にFBS0%OS培地に切り替えた場合のいずれもが、同等のパターンでDNA濃度が変化していることがわかる。一方、第2の培養ステップの最初からFBS0%OS培地を用いた場合には、全体的にDNA濃度が低いことがわかる。
図1に比べ、DNA濃度で補正したFBS0%OS培地のALP活性が高くなり、11日目まで他の条件と同じであった。11日目以降、他の条件よりALP活性が低いものの、一定レベルに維持された。これが次のカルシウム蓄積(石灰化)に寄与していると考えられる。
これによれば、第2の培養ステップにおいて、最初からFBS0%OS培地を用いた場合、および開始7日目からFBS0%OS培地に切り替えた場合のいずれもが、従来のFBS10%OS培地による培養方法と比較して、培養時間の経過とともに、細胞1個当たりのカルシウム蓄積量が大幅に増大していることがわかる。
本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法は、ヒト自己血清を使用したケースを想定したものである。第1の実施形態では牛胎児血清を使用したため、牛胎児血清を取り除く目的で第2の培養ステップにおいて牛胎児血清濃度をゼロに切り替える方策をとった。しかし、ヒト自己血清を使用した場合、その濃度をゼロにする必要はない。逆に、血清が存在した方が細胞増殖に効果があるという観点から、血清を残した方がよいと考えられた。そこで、どのくらい血清があれば、細胞の増殖と分化に影響を及ぼさないかを検討した。
また、本実施形態においては、第2の培地内のヒト血清濃度をゼロより大きい濃度の範囲内で第1の培地内のヒト血清濃度よりも低くすることとしたため、最終的に患者に移植される骨芽細胞にヒト血清が含有されることとなるが、間葉系幹細胞のソースである患者と同一人から採取したヒト血清を用いるので何ら問題はない。
本実施例においては、2種類の間葉系幹細胞A,Bを用いる。
第1の培地は、第1の実施形態における第1の培地中の10%FBSの代わりに15%ヒト自己血清を用いたものと同じである。
ただし、第2の培養ステップにおいては、異なる濃度のヒト自己血清の3種類の第2の培地を継続して使用した。
ALP活性測定方法、カルシウム濃度測定方法およびDNA濃度測定方法はいずれも上述した通りである。
これらの図6〜図11によれば第2の培地中のヒト血清濃度の大小にかかわらず、いずれの間葉系幹細胞A,Bの場合にも、ほぼ同様なALP活性、カルシウム濃度およびDNA濃度の傾向を示すことがわかった。
Claims (7)
- 血清およびデキサメタゾンを含有する培地内で間葉系幹細胞を増殖させる第1の培養ステップと、
デキサメタゾンを含有し前記第1の培養ステップにおける培地よりも血清の濃度の低い培地内で間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる第2の培養ステップとを備える間葉系幹細胞の培養方法。 - 第2の培養ステップにおける培地内の血清の濃度がほぼゼロである請求項1に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 第2の培養ステップにおける培地内の血清の濃度がゼロより大きい請求項1に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 前記血清が、牛胎児血清である請求項2に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 前記血清が、ヒト血清である請求項1から請求項3のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 前記第2の培養ステップにおける培地のデキサメタゾンの添加濃度は、前記第1の培養ステップにおけるデキサメタゾンの添加濃度よりも大きい請求項1から請求項5のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 請求項1から請求項6のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法の第2の培養ステップにおいて、間葉系幹細胞を生体適合性の材料からなる生体組織補填材に播種して培養する生体組織補填体の製造方法。
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