CN105288737B - 一种组织工程软骨复合支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于软骨组织工程领域。本发明公开了一种基于细胞外基质源性软骨微组织构建的组织工程软骨复合支架及其制备方法。具体而言，通过对新鲜软骨进行湿法粉碎、过筛、脱细胞等工艺，制备软骨细胞外基质源性微载体，可作为种子细胞扩增载体。生物反应器下，此微载体快速扩增软骨细胞并维持其表型，同时也可以促进干细胞向软骨方向诱导分化，并形成软骨微组织。将软骨微组织填充于具有良好力学性能的三维多孔支架的孔隙中，构建成本发明所述的组织工程软骨复合支架。这种复合支架具有良好的力学性能、富含天然软骨细胞外基质成分、为种子细胞的生长提供了良好的微环境、有利于干细胞向软骨方向诱导分化，并有望加速组织工程软骨的体内构建速度。

Description

一种组织工程软骨复合支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及软骨组织工程领域。具体涉及一种基于细胞外基质源性软骨微组织构建的组织工程软骨复合支架及其制备方法。

背景技术

因创伤、炎症、退变等原因导致的关节软骨损伤是骨科常见的疾病。由于关节软骨缺乏血管、神经的支配，因此其再生和自我修复能力及其有限，一旦损伤后，难以自身修复，随着病情的继续发展，必然出现骨性关节炎。这不仅严重影响患者的生活质量，并且给患者家庭带来沉重的经济负担。因此，为早期关节软骨损伤提供的有效治疗，阻止软骨损伤的进一步发展，减少骨关节炎的发病率十分重要。

临床上软骨损伤的治疗方法有骨膜修复、微骨折技术、自体软骨移植、异体软骨移植等，但这些治疗手段均存在不同方面的局限性，还不能从根本上解决软骨损伤治疗难题。软骨组织工程技术作为一种新的治疗手段正逐渐兴起，为这一常见损伤的治疗带来了希望。但是，对于当前的软骨组织工程技术，依然存在如下不足：

第一、如何在短时间内获得足够数量的种子细胞并具有较好的软骨细胞表型是软骨组织工程面临的一大难题。自体软骨细胞移植(ACI)所需的软骨细胞取自患者关节非负重区的软骨，并且需要平面培养传代以获得足够数量的软骨细胞，回植到软骨缺损处。但是随着体外传代次数的增加，软骨细胞常常发生去分化，其分泌特异性软骨细胞外基质的能力也随之下降。微载体培养细胞具有独特的优点：具有较大的比表面积；综合了悬浮培养和贴壁培养的优点；细胞所处环境均一，扩增容易；置于生物反应器中，环境条件(温度、PH、CO₂等)容易测量和监测；培养操作可系统化、自动化，降低了污染发生的机会。因而微载体培养技术成为动物细胞大规模培养的新方法。大量研究证实微载体用于培养软骨细胞可以促进细胞增殖、维持软骨表型，而且可以使已分化的软骨细胞去分化。此外，微载体培养干细胞，有利于其向软骨方向定向分化。目前，微载体数量颇多，包括聚苯乙烯微载体、液膜微载体、中空多孔微载体、大孔明胶微载体及磁性微载体等。其成分大多为合成材料，与细胞的结合性能需要进一步提高。而且在使用时，需要用胰酶把种子细胞从微载体上消化下来，势必存在细胞外基质的损失，而且对细胞造成损失。

第二、支架的选材和构建方法有待改进；三维多孔支架在复合细胞培养过程中常碰到“空心”现象。即：多孔支架表面的细胞更易获得营养、代谢产物更易排出而大量增殖，而支架深层的细胞则因营养困难而数目较少，这显然影响组织工程软骨的构建质量；另外，研究表明以细胞外基质、胶原、海藻酸等天然生物材料构造的组织工程支架的软骨修复效果明显优于化学合成支架，但是多数天然生物支架的力学性能差，不能为组织工程软骨提供足够的应力支撑，这将导致修复组织与正常软骨整合不佳，引起周围软骨的退化，从而影响软骨修复效果。

第三、现有的组织工程软骨修复软骨缺损后，需要一个长期的机制分泌和塑形过程，使得现有软骨组织工程修复技术植入后康复期长，影响病人生活质量。如何缩短这一过程，加快软骨基质的分泌或塑形，所构建组织工程软骨的质量至关重要。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种新型的组织工程软骨复合支架及其制备方法。具体而言，以具有良好力学性能三维多孔支架作为主体支架，以软骨细胞外基质源性微载体为种子细胞扩增载体，生物反应器中共培养形成软骨微组织后，填充于三维多孔支架孔隙内，进一步构建了组织工程软骨复合支架。

以下对本发明进行详细描述：

本发明的构思在于，通过对新鲜软骨进行低温湿法粉碎、过筛、脱细胞等工艺，制备粒径为100-500μm大小的软骨细胞外基质源性微载体(Cartilage ECM derivedmicrocarrier,CEDM)，可以作为种子细胞的扩增载体。在生物反应器中，种子细胞在CEDM表面快速扩增，分泌细胞外基质，将负载有细胞的CEDM联结一起，形成软骨微组织。无需经过胰酶消化，直接软骨微组织与具有良好力学性能的三维多孔支架复合，构建成组织工程软骨复合支架,可用于临床上修复关节软骨缺损。

一种组织工程软骨复合支架，是通过将负载有种子细胞的软骨细胞外基质源性微载体填充于三维多孔支架孔隙内复合构建而成的。

一种组织工程软骨复合支架的制备方法，具体如下：

1)将新鲜关节软骨置进行低温湿法粉碎并过筛，得到直径100-500μm的软骨细胞外基质源性微粒后，进行脱细胞处理，去除免疫原性，制备得到软骨细胞外基质源性微载体。

2)将软骨细胞外基质源性微载体和种子细胞置于生物反应器中共培养，形成软骨微组织。

3)将三维多孔支架(力学性能与正常软骨组织力学性能相近)置于培养皿中，并浸没于水凝胶前体液中。

4)将步骤2)得到的软骨微组织填充于上述三维多孔支架的孔隙(孔隙直径大小600-2000μm)中，并向培养皿中添加水凝胶致凝剂，使软骨微组织与三维多孔支架结合成一个复合支架。

5)将培养皿置于37℃培养箱中孵育(10-30)分钟后，清洗，最终获得所述组织工程软骨复合支架。

本发明中所述的关节软骨主要来自人或其他哺乳动物，如牛、猪或羊等。

本发明中所述的低温湿法粉碎，是指将获取的新鲜关节软骨用无菌生理盐水反复冲洗干净后，与无菌三蒸水(体积为关节软骨体积的2-6倍)混合，并加入碎冰块，4℃条件下，置于粉碎机内进行粉碎。

本发明中过筛时所用筛是筛孔直径为100μm和500μm的不锈钢筛。

本发明中所述的脱细胞方法采用的是化学脱细胞方法，具体如下：将软骨细胞外基质源性微粒加入1％(w/v,g/mL)SDS溶液中(重量体积比(g/mL)为1：5，其中软骨细胞外基质源性微粒的重量为湿重),置于摇床内，4℃条件下振荡8小时。用无菌三蒸水反复冲洗后，再将软骨细胞外基质源性微粒加入DNA酶(50U/mL)和RNA酶(1U/mL)的混合溶液(软骨细胞外基质源性与酶混合溶液的重量体积比(g/mL)为1：5，其中软骨细胞外基质源性微粒的重量为湿重)中，37℃条件下，置于摇床中振荡4小时。

步骤1)还包括：将封装好的软骨细胞外基质源性微载体置于25kGy Co⁶⁰射线下进行辐射灭菌后，存放于4℃条件下，备用。

本发明中所述的种子细胞为软骨细胞或干细胞。

本发明所述的共培养是指将种子细胞和软骨细胞外基质源性微载体以(1-8)×10⁶细胞/100mg(湿重)的混合比例置于生物反应器中培养。

本发明中所述的生物反应器优选为旋转式三维生物反应器，或振荡式生物反应器等。

本发明中所述的生物反应器的转速设置为20-50rpm，每转1分钟，间歇30分钟。24小时后，转速设置为50-100rpm，持续转动。生物反应器置于37℃5％CO₂条件下。培养基每2-3天更换一次。

本发明中所述的三维多孔支架优选为具有良好性能的3D打印多孔PLGA支架或多孔脱钙骨基质支架等。

本发明的所述的水凝胶前体液优选为海藻酸钠溶液或纤维蛋白原溶液，其浓度为1.2％-2.4％(w/v,g/mL)。

本发明所述的水凝胶致凝剂优选为CaCl₂溶液或凝血酶溶液，其浓度为2％-4％(w/v,g/mL)。

步骤5)中，吸除孵育完成后的培养皿中多余的液体，用无菌PBS液洗3-5遍。

本发明的优势和创新之处在于：

本发明通过对新鲜软骨进行低温湿法粉碎、过筛、脱细胞等工艺成功制备了细胞外基质源性微载体。此微载体富含软骨细胞外基质，具有良好的生物相容性。在生物反应器培养条件下，种子细胞(软骨细胞、干细胞)能够帖附微载体表面，并在短时间内大量扩增。随着培养时间的延长，组织细胞分泌的细胞外基质将微载体联结在一起，形成软骨微组织。随后，无需经胰酶消化收集种子细胞，直接将软骨微组织填充于具有良好生物力学强度的三维多孔支架的孔隙中，形成组织工程软骨复合支架。这种组织工程软骨构建方法具有如下优点：

1)软骨细胞外基质源性微载体作为扩增种子细胞的载体，具有良好的生物相容性，能够在短时间内大量扩增种子细胞。进一步形成的软骨微组织可以不经胰酶消化直接用于构建组织工程软骨，这避免了胰酶消化对细胞造成损伤，同时减少了细胞外基质的流失；

2)细胞外基质源性微载体为种子细胞细胞提供了一个天然的软骨微环境，有利于种子细胞生长，并可促进干细胞成软骨分化；

3)具有良好力学性能的三维多孔支架赋予了复合支架良好的力学强度，为组织工程软骨提供足够的应力支撑，进而利于新生软骨在体内的塑性并和周围组织整合；

4)软骨微组织由负载有种子细胞的微载体组成，填充于三维多孔支架中，使得细胞均匀的加载于支架内部，避免了“空心现象”的发生；

5)此种组织工程软骨复合支架富含软骨细胞外基质，种子细胞分泌的细胞外基质不再是“从零开始”，有望加快组织工程软骨的构建速度。

附图说明

图1是软骨细胞外基质源性微载体的甲苯胺蓝染色图。

图2是软骨细胞外基质源性微载体的扫描电镜图。

图3是软骨细胞外基质源性微载体脱细胞前的33258染色图。

图4是软骨细胞外基质源性微载体脱细胞后的33258染色图。

图5软骨细胞外基质源性微粒扩增大鼠骨髓干细胞1天后结果。

图6软骨细胞外基质源性微粒扩增大鼠骨髓干细胞7天后结果。

图7是3D打印PLGA多孔支架的电镜图。

图8是组织工程软骨复合支架的电镜图。

具体实施方式

实施例1：软骨细胞外基质源性微载体的制备

将获取的500g新鲜猪关节软骨用无菌生理盐水反复冲洗干净后，与一定量无菌三蒸水混合，置于粉碎机内进行粉碎。分别过筛孔直径为100μm和500μm的不锈钢筛子，得到直径100μm-500μm的软骨细胞外基质源性微粒。4℃下加入1％SDS溶液，置于摇床内，持续振荡8小时。用无菌三蒸水冲洗掉残存SDS溶液后，再将微粒加入5ml DNA酶(50U/mL)和RNA酶(1U/mL)溶液中，37℃条件下，置于摇床中振荡4小时，去除细胞成分。将脱细胞后的软骨细胞外基质源性微粒进行彻底清洗，去除残留的脱细胞液。封装好后置于25kGy C_O ⁶⁰射线下进行辐射灭菌，即得到无菌的软骨细胞外基质源性微粒。

本发明制备的软骨细胞外基质源性微粒呈圆形或椭圆形(图1，2)，甲苯胺蓝染色呈强阳性(图1)，证实其富含糖胺聚糖。

软骨细胞外基质源性微载体的脱细胞方法

将获取的新鲜猪关节软骨用粉碎机进行湿法粉碎。分别过筛孔直径为100μm和500μm的不锈钢筛子，得到直径100μm-500μm的软骨细胞外基质源性微粒。分别使用1％Triton、3％Triton、0.5％SDS、1％SDS、2％SDS的脱细胞溶液对软骨细胞外基质源性微粒进行处理，方法同上。再用DNA酶(50U/mL)和RNA酶(1U/mL)溶液处理，方法同上。

DNA含量、GAG含量、总胶原含量等检测结果表明，与其它组对比，1％SDS组不仅可以比较彻底的去除细胞成分，而且能保留较多的GAG和胶原等细胞外基质成分。33258染色示去细胞前，软骨细胞外基质源性微粒内可见大量软骨细胞残留(图3)；脱细胞后，未见明显残存DNA碎片(图4)。

组织工程软骨复合支架的制备

将新鲜的猪关节软骨进行湿法粉碎、过筛、脱细胞、Co⁶⁰灭菌，制备得直径100μm-500μm的软骨细胞外基质源性微载体(方法同上)。将100mg软骨细胞外基质源性微载体和50ml含有2×10⁶大鼠软骨细胞的DMEM细胞悬液混合，置于旋转式三维生物反应器的反应舱(Rotary Cell Culture Systems，RCCS-D)中共培养。为了利于细胞帖附到微粒上，生物反应器的转速设置为20rpm，每转1分钟，间歇30分钟。24小时后，转速设置为50rpm，持续转动。生物反应器置于37℃5％CO₂条件下。培养基每2-3天更换一次。共培养1天后，可见大部分软骨细胞已帖附到微载体表面(图5)。培养7天后，可见软骨细胞在微载体表面大量扩增，并保持较高的细胞活性(图6)。将孔隙直径约为1000μm的3D打印PLGA多孔支架(图7)置于培养皿中，并浸没于1.2％(w/v)海藻酸钠溶液中。收集负载有软骨细胞的软骨细胞外基质源性微粒填充于PLGA多孔支架的孔隙中。向培养皿中添加适量102mmol CaCl₂溶液，使上述溶液形成凝胶。将培养皿置于37℃培养箱中30分钟后，吸除多余的液体，用无菌PBS液洗三遍，即获得本发明所述组织工程软骨复合支架(图8)。

实施例2

按照实施例1中的方法制备得直径100μm-500μm的软骨细胞外基质源性微载体。

将100mg软骨细胞外基质源性微载体和50ml含有1×10⁶大鼠骨髓间充质干细胞的DMEM细胞悬液混合，置于旋转式三维生物反应器的反应舱(Rotary Cell CultureSystems，RCCS-D)中共培养。为了利于细胞帖附到微粒上，生物反应器的转速设置为30rpm，每转1分钟，间歇30分钟。24小时后，转速设置为80rpm，持续转动。生物反应器置于37℃5％CO₂条件下。培养基每2-3天更换一次。

将孔隙直径约为600μm的3D打印PLGA多孔支架置于培养皿中，并浸没于1.8％(w/v)海藻酸钠溶液中。收集负载有软骨细胞的软骨细胞外基质源性微粒填充于PLGA多孔支架的孔隙中。向培养皿中添加适量102mmol 2％(w/v)CaCl₂溶液，使上述溶液形成凝胶。将培养皿置于37℃培养箱中10分钟后，吸除多余的液体，用无菌PBS液洗三遍，即获得本发明所述组织工程软骨复合支架。

实施例3

按照实施例1中的方法制备得直径100μm-500μm的软骨细胞外基质源性微载体。

将100mg软骨细胞外基质源性微载体和50ml含有8×10⁶大鼠软骨细胞的DMEM细胞悬液混合，置于旋转式三维生物反应器的反应舱(Rotary Cell Culture Systems，RCCS-D)中共培养。为了利于细胞帖附到微粒上，生物反应器的转速设置为50rpm，每转1分钟，间歇30分钟。24小时后，转速设置为100rpm，持续转动。生物反应器置于37℃5％CO₂条件下。培养基每2-3天更换一次。

将孔隙直径约为2000μm的多孔脱钙骨基质支架置于培养皿中，并浸没于2.4％(w/v)纤维蛋白原溶液中。收集负载有软骨细胞的软骨细胞外基质源性微粒填充于多孔脱钙骨基质支架的孔隙中。向培养皿中添加适量102mmol 4％(w/v)凝血酶溶液，使上述溶液形成凝胶。将培养皿置于37℃培养箱中20分钟后，吸除多余的液体，用无菌PBS液洗三遍，即获得本发明所述组织工程软骨复合支架。

Claims (10)

1.一种组织工程软骨复合支架的制备方法，具体如下：

1)将新鲜关节软骨置进行低温湿法粉碎并过筛，得到直径100μm-500μm的软骨细胞外基质源性微粒后，进行脱细胞处理，去除免疫原性，制备得到软骨细胞外基质源性微载体；

2)将软骨细胞外基质源性微载体和种子细胞置于生物反应器中共培养，形成软骨微组织；

3)将三维多孔支架置于培养皿中，并浸没于水凝胶前体液中；

4)将步骤2)得到的软骨微组织填充于上述三维多孔支架的孔隙中，并向培养皿中添加水凝胶致凝剂，使软骨微组织与三维多孔支架结合成一个复合支架；

5)将培养皿置于37℃培养箱中孵育10-30分钟后，清洗，最终获得所述组织工程软骨复合支架。

2.如权利要求1所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述的低温湿法粉碎，是指将获取的新鲜关节软骨用无菌生理盐水反复冲洗干净后，与无菌三蒸水混合，并加入碎冰块，4℃条件下，置于粉碎机内进行粉碎。

3.如权利要求1所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述的脱细胞方法采用的是化学脱细胞方法，具体如下：将软骨细胞外基质源性微粒加入1％SDS溶液中,置于摇床内，4℃条件下振荡8小时，用无菌三蒸水反复冲洗后，再将软骨细胞外基质源性微粒加入DNA酶和RNA酶的混合溶液中，37℃条件下，置于摇床中振荡4小时。

4.如权利要求1所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，步骤1)还包括：将封装好的软骨细胞外基质源性微载体置于25kGy Co⁶⁰射线下进行辐射灭菌后，存放于4℃条件下，备用。

5.如权利要求1所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述的共培养是指将种子细胞和软骨细胞外基质源性微载体以1-8×10⁶种子细胞/100mg软骨细胞外基质源性微载体的混合比例置于生物反应器中培养。

6.如权利要求1所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述的生物反应器的转速设置为20-50rpm，每转1分钟，间歇30分钟，24小时后，转速设置为50-100rpm，持续转动，生物反应器置于37℃5％CO₂条件下，培养基每2-3天更换一次。

7.如权利要求1所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述的三维多孔支架为3D打印多孔PLGA支架或多孔脱钙骨基质支架；所述的水凝胶前体液为海藻酸钠溶液或纤维蛋白原溶液；所述的水凝胶致凝剂为CaCl₂溶液或凝血酶溶液。

8.一种组织工程软骨复合支架，是通过权利要求1-7任一项所述的组织工程软骨复合支架的制备方法将负载有种子细胞的软骨细胞外基质源性微载体填充于三维多孔支架孔隙内复合构建而成的。

9.如权利要求8所述的组织工程软骨复合支架，其特征在于，所述的种子细胞为软骨细胞或干细胞。

10.如权利要求8所述的组织工程软骨复合支架，其特征在于，所述的软骨细胞外基质源性微载体的直径为100-500μm，所述的三维多孔支架孔隙的直径为600-2000μm。