CN111166937A - 脱细胞细胞外基质及其制备方法和生物墨水 - Google Patents

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彭礼庆
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Abstract

本发明公开了一种脱细胞细胞外基质及其制备方法和生物墨水。制备方法包括：提供生物组织碎块；对组织碎块进行无菌处理；将无菌的组织碎块经湿法粉碎制成悬浮浆料；将悬浮浆料进行差速离心处理，获得脱细胞细胞外基质；将脱细胞细胞外基质制成混悬液，经无菌超声粉碎处理，获得具有目标颗粒粒径的脱细胞细胞外基质。

Description

脱细胞细胞外基质及其制备方法和生物墨水
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种脱细胞细胞外基质及其制备方法和生物墨水。
背景技术
由于创伤、退变等因素导致的半月板损伤十分常见。在解剖学结构中，内侧1/3半月板为无血供区，导致其进行再生和自我修复能力有限，且半月板损伤形态多样，其损伤形态也对其再生及自我修复有着重要影响。因此，该部分半月板一旦损伤，随着病情的继续发展，必然导致退行性关节变化，甚至出现骨性关节炎等并发症。
组织工程技术为半月板损伤的再生修复提供了希望。其中，组织工程支架作为种子细胞和生物信号分子的载体，对半月板损伤的再生修复具有非常重要的作用。为了获得更优质的组织工程半月板支架，需要提供改进的脱细胞细胞外基质。
发明内容
第一方面，本发明提供一种脱细胞细胞外基质的制备方法，其包括：
提供生物组织碎块；
对组织碎块进行无菌处理；
将无菌的组织碎块经湿法粉碎制成悬浮浆料；
将悬浮浆料进行差速离心处理，获得脱细胞细胞外基质(Decellularizedextracellular matrix，dECM)；
将dECM制成混悬液，经无菌超声粉碎处理，获得具有目标颗粒粒径的dECM。
在本发明第一方面的实施例中，可采用间歇脉冲模式对dECM进行无菌超声粉碎处理，其中，超声振幅为65％～75％，处理时间为80s～120s，间歇脉冲模式为：脉冲时间为3s～7s，间歇时间为3s～7s。进一步地，超声振幅为70％，处理时间为90s，间歇脉冲模式为：脉冲时间为5s，间歇时间为5s。
在本发明第一方面的前述任一实施例中，超声粉碎处理可在周围温度为0℃～5℃条件下进行。
在本发明第一方面的前述任一实施例中，混悬液的浓度可为3g/100mL～5g/100mL。
在本发明第一方面的前述任一实施例中，悬浮浆料的浓度可为1g/100mL～3g/100mL，差速离心处理可包括：
将悬浮浆料在20℃～25℃下以1200rpm～1500rpm离心3min～5min，获得第一上清液；
将第一上清液在20℃～25℃下以1800rpm～2000rpm离心10min～15min，获得第二上清液；
将第二上清液在0℃～4℃下以5000rpm～6000rpm离心15min～20min，获得第三上清液；
将第三上清液在0℃～4℃下以9000rpm～10000rpm离心25min～30min，获得沉淀；
将所述沉淀制成悬浮液，在0℃～4℃下以9000rpm～10000rpm对沉淀离心处理3～4次，每次离心处理的时间为25min～30min。
在本发明第一方面的前述任一实施例中，无菌处理可包括：
使用过氧化氢溶液对组织碎块漂洗3～4次，每次5min～8min；
使用无菌的蒸馏水和/或磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffered Saline，PBS)对组织碎块漂洗3～4次，每次5min～8min。
在本发明第一方面的前述任一实施例中，组织碎块的体积≤1mm3。
在本发明第一方面的前述任一实施例中，生物组织碎块包括半月板组织碎块，dECM包括脱细胞半月板细胞外基质(Decellularized meniscus extracellular matrix，dMECM)。
本发明第二方面提供一种脱细胞细胞外基质，其是通过本发明第一方面的制备方法制得的。
本发明第三方面提供一种生物墨水，其包含本发明第二方面的脱细胞细胞外基质。
在本发明第一方面的前述任一实施例中，生物墨水可包含水凝胶材料和dECM，水凝胶材料可包括甲基丙烯酰胺基明胶(Methacrylated Gelalin，GelMA)、透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)和藻酸盐(Alginate)中的一种或多种。
相对于现有技术，本发明至少具有以下有益效果：
本发明的制备方法先采用湿法粉碎、差速离心的方法制备dECM，然后通过超声粉碎处理来调控dECM的颗粒粒径在所需范围内，由此能在获得具有目标颗粒粒径的dECM的同时，极大限度地保留细胞外基质的完整成分。
进一步地，采用本发明的dECM的生物墨水，能构建更优质的组织工程复合支架(如半月板支架)，从而使该支架为细胞提供良好的微环境，因此能促进组织缺损的再生修复。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据附图获得其他的附图。
图1为不同超声粉碎处理时间下dMECM的颗粒粒径分布曲线图。
图2为不同处理方式下dMECM的颗粒粒径分布曲线图。
图3为不同处理方式下dMECM的扫描电镜(SEM)图像，其中，a为未经处理的dMECM(空白对照组)，b是经超声粉碎处理的dMECM(实验组)，c是经酶消化处理的dMECM(对比组)。
图4为不同处理方式下dMECM的I型胶原免疫荧光染色的共聚焦图片，其中，e为未经处理的dMECM(空白对照组)，f是经超声粉碎处理的dMECM(实验组)，g经酶消化处理的dMECM(对比组)。
图5为SEM观察的生物墨水的打印扩展比示意图，其中，a为GelMA/dMECM生物墨水的打印大体观；b为GelMA/dMECM生物墨水的打印镜下观；c为GelMA生物墨水的打印大体观；b为GelMA生物墨水的打印镜下观；e为两种生物墨水的打印扩展比统计分析图。镜下观的标尺为1mm，大体观的标尺为1cm。
图6为GelMA/dMECM生物墨水打印的结构体中细胞活性共聚焦图片，从左到右依次为活细胞，死细胞，融合图。
图7为GelMA/dMECM生物墨水打印的结构体培养1天和14天的细胞活性统计分析图。
具体实施方式
为了使本申请的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合具体实施例对本申请进行详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本申请，并非为了限定本申请。
为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“一种或多种”中“多种”的含义是两个以上。
本申请的上述发明内容并不意欲描述本申请中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇申请中的多处，通过一系列实施例提供了指导，这些实施例可以以各种组合形式使用。在各个实例中，列举仅作为代表性组，不应解释为穷举。
组织工程学是综合应用工程学和生命科学的原理与技术，在根据组织工程学修复组织的技术中，可以在体外预先构建一个有生物活性的组织种植体(如组织工程半月板支架)，然后植入体内，达到修复组织缺损和重建组织功能的目的。
为了推动将组织工程支架应用于临床组织损伤(如半月板损伤)的治疗，本发明人进行了大量的研究，发现采用天然的dECM有望为细胞生长提供天然的仿生微环境，并且有利于维持细胞固有形态和功能，促进种子细胞的黏附、增殖和分化，因此其在组织修复和再生中可起到关键作用。然而，现有的冷冻干燥手段是对组织材料进行冷冻干燥，再经物理研磨得到dECM。尽管冷冻干燥手段能较大限度地保留细胞外基质的成分，但是dECM的颗粒粒径较大，导致采用该dECM的支架不能很好地仿生细胞生长的天然微环境。尤其是，采用3D生物打印制备结构更精细且更仿生的支架，也希望dECM具有较小的颗粒粒径。
采用胃蛋白酶消化研磨后的dECM，能得到粒径较小的dECM。但是胃蛋白酶消化时间长，尤其是在消化过程中，难免对细胞外基质成分进行消化，造成成分损失。因此，采用胃蛋白酶消化等化学处理手段来调整dECM的粒径，会不利地影响支架的有效成分和用于临床组织损伤修复的性能。
本发明人进一步做了大量研究，发现采用湿法粉碎、差速离心处理生物组织材料，结合超声粉碎处理，能在获得具有目标颗粒粒径的dECM的同时，更有效地保留细胞外基质的完整成分。
因此，本发明第一方面提供一种脱细胞细胞外基质的制备方法，该方法包括提供生物组织原料的步骤S100、无菌处理步骤S200、湿法粉碎步骤S300、差速离心处理步骤S400和无菌超声粉碎处理步骤S500。
提供生物组织原料的步骤S100包括：提供生物组织碎块。
在步骤S100，生物组织可以是半月板组织、软骨组织、脂肪组织等。生物组织可来自于人、猪、牛、兔、羊等。
在一些实施例中，组织碎块的体积≤1mm3。使组织碎块具有较小的体积，有利于后续步骤的处理，其中能简化后续步骤的操作，和/或提高后续步骤的效率。
可选地，生物组织碎块可包括半月板组织碎块，得到的dECM包括dMECM。作为示例，可以将新鲜的半月板(如猪半月板)剪去多余的滑膜组织，并将其剪成体积约为或小于1mm×1mm×1mm的碎块。
无菌处理步骤S200包括：对组织碎块进行无菌处理。
在步骤S200，可以采用任何不会明显损害细胞外基质成分的方法来对组织碎块进行无菌处理。在一些实施例中，步骤S200可采用过氧化氢溶液(又称双氧水)对组织碎块进行灭菌，然后采用蒸馏水和/或无菌的PBS对组织碎块进行清洗。过氧化氢溶液清洗能对组织碎块起到很好的灭菌效果。蒸馏水和/或PBS清洗能除去过氧化氢残留，以使组织内的pH值保持在正常范围内，从而维持细胞外基质成分的稳定。
作为具体的示例，步骤S200可包括：
S210，使用过氧化氢溶液对组织碎块漂洗3～4次，每次5min～8min。优选地，步骤S210使用的过氧化氢溶液为医用级。进一步地，过氧化氢溶液中过氧化氢的质量分数为2％～4％，如3％。
S220，使用蒸馏水和/或无菌PBS对经步骤S210漂洗后的组织碎块漂洗3～4次，每次5min～8min。
在步骤S220，蒸馏水优选三蒸水。三蒸水是经过三次蒸馏收集的水。
在步骤S220可使用本领域公知的PBS。如美国Corning Cellgro公司的PBS。
在一些实施例中，在步骤S220可使用蒸馏水(如三蒸水)对经步骤S210漂洗后的组织碎块漂洗。
步骤S200优选在无菌的容器中进行。
经步骤S200处理后得到无菌的组织碎块。在本文中，术语“无菌”指的是达到医学上的无菌要求。
湿法粉碎步骤S300包括：将无菌的组织碎块经湿法粉碎制成悬浮浆料。
在步骤S300，湿法粉碎是以水为介质，机械粉碎组织碎块。水例如是蒸馏水，优选三蒸水。采用湿法粉碎能避免或大幅减少机械粉碎过程产生的热量，从而保护细胞外基质成分。
步骤S300可以采用本领域已知的方法和装置进行。例如匀浆机。作为示例，取组织碎块样品送细菌培养；经证实无菌后，将无菌的组织碎块加入蒸馏水，用匀浆机破碎成悬浮浆料。
在一些实施例中，在步骤S300，悬浮浆料的质量浓度可以为1g/100mL～3g/100mL，如1g/100mL。
差速离心处理步骤S400包括：将步骤S300所得悬浮浆料进行差速离心处理，获得dMECM。
在步骤S400，差速离心是对悬浮浆料中的颗粒进行多级离心分离处理，且后一级离心分离处理的离心速度和时间均大于前一级离心分离处理的离心速度和时间。通过差速离心处理，能有效地去除组织中的细胞，同时保留天然的半月板外基质成分。
优选地，离心速度小于5000rpm时，离心处理的温度可以为20℃～25℃；离心速度在5000rpm以上时，离心处理的温度可以为0℃～4℃。
在一些优选的实施例中，步骤S400可包括：
S410，将悬浮浆料在20℃～25℃下以1200rpm～1500rpm离心3min～5min，获得第一上清液。
S420，将第一上清液在20℃～25℃下以1800rpm～2000rpm下离心10min～15min，获得第二上清液。
S430，将第二上清液在0℃～4℃下以5000rpm～6000rpm下离心15min～20min，获得第三上清液。
S440，将第三上清液在0℃～4℃下以9000rpm～10000rpm下离心25min～30min，获得沉淀。
S450，将沉淀制成悬浮液，在0℃～4℃下以9000rpm～10000rpm对沉淀离心处理3～4次，每次离心处理的时间为25min～30min。在步骤S450，可以将沉淀与蒸馏水或PBS混合，制成悬浮液。其中，蒸馏水优选三蒸水。悬浮液的浓度可以为1g/100mL～3g/100mL，如1g/100mL。
rpm即r/min(转/分)。
步骤S400可采用低温高速离心机进行，例如赛默飞，Sorvall RC6+型离心机。作为具体的示例，在低温高速离心机中，在20℃以1500rpm对悬浮浆料离心5min，取上清液在20℃下以2000rpm离心15min，再次取上清液在4℃下以6000rpm离心20min，最后取上清液在4℃下以10000rpm离心30min，收集沉淀。然后将沉淀与三蒸水混匀，继续在4℃下以10000rpm离心30min，重复3次。
通过采用适当的差速离心处理的温度、转速和时间，能极大地去除组织中的细胞，同时很好地保留天然的外基质成分，且使所得dECM具有良好的生物相容性。
步骤S400得到的dECM可以制成混悬液。混悬液可以是将dECM分散于水中制得。水例如为蒸馏水，优选三蒸水。混悬液的浓度例如为3g/100mL～5g/100mL，如3g/100mL。也可以将混悬液保存备用，保存温度可以为4℃。
无菌超声粉碎处理步骤S500能进一步调整dECM的颗粒粒径。步骤S500包括：将上述混悬液经无菌超声粉碎处理，获得具有目标颗粒粒径的dECM。
相较于使用胃蛋白酶消化来处理细胞外基质，超声方式处理简单便捷，且机械化操作过程的可控性较好，省时省力。尤其是，采用超声粉碎处理更容易调控dECM的颗粒粒径。例如，可通过改变超声时间(如数秒)即可制备不同粒径的dECM。更尤其是，超声粉碎处理细胞外基质是一种物理方法，其对细胞外基质成分的损伤小，能够很大限度地保留细胞外基质的成分。
在一些优选的实施例中，在步骤S500中，采用间歇脉冲模式对dECM进行无菌超声粉碎处理，其中，超声振幅为65％～75％，处理时间为80s～120s，间歇脉冲模式为：脉冲时间为3s～7s，间歇时间为3s～7s。
通过使超声振幅、超声时间在适当范围内，能进一步减小超声粉碎处理过程对dECM的破坏。在超声过程中设置适当的脉冲时间和间歇时间，能大幅度减小超声过程的热效应，从而大大降低细胞外基质成分发生变性的概率。因此，这样能进一步提高细胞外基质的成分的完整性。
在一些优选的实施例中，超声粉碎处理在周围温度为0℃～5℃条件下进行。其中可将装有混悬液的容器(如试管)置于冷却介质中，以在周围温度为0℃～5℃条件下进行超声粉碎处理。在低温环境下进行超声处理，能提高散热速率，进一步减小超声过程对dECM的破坏。优选地，将装有混悬液的容器(如试管)置于冰槽中进行超声粉碎处理。
步骤S500可使用超声波破碎仪(如美国Qsonica，Q125)对dECM进行超声粉碎处理。优选地，对超声粉碎仪进行无菌处理。
作为具体的示例，首先将超声破碎仪放入生物安全柜进行紫外线消毒，并将超声探头进行高温高压消毒；然后将装有混悬液的试管放入冰槽，设置超声振幅为70％，采用间歇脉冲模式对dECM进行无菌超声粉碎处理90s，其中间歇脉冲模式：脉冲时间为5s，间歇时间为5s。
经步骤S500处理后的dECM能获得适当的颗粒粒径，同时还保留了更加完整的细胞外基质成分，从而使其能更好地发挥作用。
在一些优选的实施例中，经步骤S500处理后的dECM的颗粒粒径≤400μm。可选地，粒径在200μm以下的颗粒占颗粒总量的90％～100％，优选95％～100％。这样可以实现更精细的打印效果。
在本文中，采用生物组织制备dECM的过程和dECM的超声粉碎处理过程，均优选地在无菌条件下进行。这样能得到无菌的dECM，因此可以省去后续灭菌处理(主要包括滤膜过滤和Co60射线消毒)，能进一步减小对dECM的破坏。
本发明的制备方法更加简单快捷，能够获得具有所需粒径的dECM，而且使细胞外基质成分更有效地保留下来。
本发明第二方面的实施例提供一种脱细胞细胞外基质，其是通过上述的制备方法制得的。因此，该dECM也具有相应的有益效果。
本发明第三方面的实施例提供一种生物墨水，其包含本发明第二方面的任意一种或几种dECM。
生物墨水可以蒸馏水和/或PBS为分散剂。蒸馏水优选三蒸水。PBS可以是前文所述的PBS。
在一些实施例中，生物墨水可通过生物3D打印机的喷头挤出，用于打印组织工程支架。进一步地，生物墨水所含dECM中，粒径在200μm以下的颗粒占颗粒总量的95％～100％。此时可采用内径200μm～500μm的打印喷头进行打印。
生物墨水由于采用具有所需粒径的dECM，因此具有较高的可打印性，能顺利打印出更细的水凝胶纤维，提高打印精度。打印得到的支架中的孔径较小，且其结构更精细。尤其是，dECM具有适当的粒径，且较为完整地保留了天然的细胞外基质成分，由此使得支架能为细胞的黏附、生长、迁移、增殖及分化提供良好的天然微环境，从而有利于提高损伤的再生修复效果。可选地，支架为半月板支架，用于半月板损伤的再生修复。
在一些实施例中，生物墨水还可包含水凝胶材料。水凝胶材料可包括甲基丙烯酰胺基明胶(GelMA)、透明质酸(HA)和藻酸盐中的一种或多种。该生物墨水的可打印性得到进一步改善，采用其打印的水凝胶纤维能获得较高的打印分辨率。生物墨水的打印精度较高，能进一步提高支架的结构精细度，具有更好的微结构。
在一些实施例中，生物墨水中，水凝胶材料的浓度为10g/100mL～15g/100mL，dECM的浓度为0.5g/100mL～1g/100mL。生物墨水中水凝胶材料和dECM的浓度在适当范围内，其打印精度能进一步提高。进一步地，水凝胶材料包括GelMA，dECM包括dMECM。
进一步地，生物墨水中还可包含浓度为0.2g/100mL～0.25g/100mL固化剂。作为示例，水凝胶材料包括GelMA和HA中的一种或多种，固化剂可包括光引发剂。进一步地，光引发剂可包括苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂盐(LAP)。该引发剂有利于获得较高的交联效率。尤其是，采用LAP能使水凝胶纤维的交联密度适当，从而有利于使支架获得良好的力学性能和孔隙结构。
在一些实施例中，生物墨水中还可包含种子细胞。优选地，种子细胞的浓度可为0.75×106个/mL～1×106个/mL。采用该生物墨水可实现活细胞打印，且细胞成活率高。
作为示例，种子细胞可包括纤维软骨细胞、透明软骨细胞、弹性软骨细胞和间充质干细胞中的一种或多种。其中间充质干细胞可包括半月板来源的间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胚胎间充质干细胞、脐带间充质干细胞、滑膜间充质干细胞等中的一种或多种。种子细胞可来源于人体或其它动物，如猪、兔、羊、牛等。在一些实施例中，种子细胞可包括半月板纤维软骨细胞(Meniscal Fibrochondrocytes，MFCs)。
在这些实施例中，在生物墨水中还可含有适量的培养液，以为细胞提供营养。培养液例如是含FBS(fetal bovine serum，胎牛血清)的DMEM/F12培养液，如含10％～20％FBS的DMEM/F12培养液。
实施例
下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。
实施例1
将新鲜的猪半月板剪去多余的滑膜组织，并将其剪成体积≤1mm×1mm×1mm的组织碎块。
将半月板组织碎块装入无菌的容器中，使用医用过氧化氢溶液(3重量％)对半月板组织碎块漂洗3次，每次5min。再使用三蒸水对半月板组织碎块漂洗3次，每次5min。
取上述处理后的半月板组织碎块样品送细菌培养。经证实无菌后，将无菌的半月板组织碎块加入三蒸水中，用匀浆机破碎成悬浮浆料。该悬浮浆料的质量浓度为1g/100mL。
在赛默飞，Sorvall RC6+型低温高速离心机中，在20℃下以1500rpm对悬浮浆料离心5min，取上清液在20℃下以2000rpm离心15min，再次取上清液在4℃下以6000rpm离心20min，最后取上清液在4℃下以10000rpm离心30min，收集沉淀。然后将沉淀与三蒸水混匀，继续在4℃下以10000rpm离心30min，重复3次。得到dMECM。
将所得dMECM与三蒸水混合，制成浓度为3g/100mL的混悬液。4℃保存。
将美国Qsonica，Q125型超声破碎仪放入生物安全柜进行紫外线消毒，并将超声探头进行高温高压消毒。然后将装有混悬液的试管放入冰槽，设置超声振幅为70％，采用间歇脉冲模式对dMECM进行无菌超声粉碎处理90s，其中间歇脉冲模式为：脉冲时间为5s，间歇时间为5s。获得具有目标颗粒粒径的dMECM。
实施例2
与实施例1不同的是，无菌超声粉碎处理的时间为30s。
实施例3
与实施例1不同的是，无菌超声粉碎处理的时间为60s。
实施例4
与实施例1不同的是，无菌超声粉碎处理的时间为180s。
对比例1
与实施例1不同的是，采用胃蛋白酶消化的方式来调控所得dMECM的颗粒粒径，包括：在100mL浓度为0.01mol/L的盐酸溶液中加入1gdMECM干粉和100mg胃蛋白酶，在室温条件下用磁力搅拌器搅拌48h。之后用NaOH中和到pH为7.4，于4℃保存。
测试部分
(1)dMECM的颗粒粒径测试
采用美国beckman counter公司的LS13320型激光粒度分析仪对材料进行粒径分布分析。实验使用通用液体模块进行测试，测试范围是0.04μm～2000μm，仪器装载样品遮光率为2％，测试泵速为58％，仪器运行测试每个样品为60s。
图1示出了实施例1-4不同的超声处理时间下所获得的dMECM的颗粒粒径分布曲线图。从图中可以看出，随着超声处理时间的延长，dMECM的颗粒粒径明显减小，分布趋于集中。改变超声的总处理时间，即能方便地调控dMECM的颗粒粒径。而通过使超声处理时间在适当范围内，能获得具有更好的粒径分布的dMECM，这能更有利地为细胞提供良好的天然微环境。
图2示出了超声粉碎处理前的dMECM(即未处理的dMECM)、实施例1超声粉碎处理后的dMECM、及对比例1使用胃蛋白酶消化处理后的dMECM的颗粒粒径分布曲线图。从图中可以看出，超声粉碎处理和胃蛋白酶消化处理均能减小dMECM的颗粒粒径，可满足更精细的生物打印对粒径的要求，即绝大部分粒径＜200μm。
(2)dMECM的扫描电镜观察和I型胶原免疫荧光染色
扫描电镜观察使用日本日立公司(Hitachi,Tokyo,Japan)的S-4800型扫描电镜。
I型胶原免疫荧光染色：将未处理的dMECM、实施例1超声粉碎处理后的dMECM、对比例1使用胃蛋白酶消化处理后的dMECM的混悬液各200μL分别均匀涂于盖玻片上，风干；用10％山羊血清室温孵育10min，倾去，勿洗；滴加鼠抗兔I型胶原一抗(1:1000稀释)，4℃过夜；PBS洗10分钟；滴加羊抗鼠荧光二抗(1:100稀释)，室温1小时，冲洗，观察。其中，I型胶原一抗为美国Novus Biologicals公司提供。荧光二抗为北京中杉金桥生物技术有限公司提供。共聚焦显微镜为德国Leica公司的TCS SP8型。
图3示出了未处理的dMECM、实施例1超声粉碎处理后的dMECM、及对比例1使用胃蛋白酶消化处理后的dMECM的SEM图片(标尺为1μm)。图4示出了未处理的dMECM、实施例1超声粉碎处理后的dMECM、及对比例1使用胃蛋白酶消化处理后的dMECM的I型胶原免疫荧光染色的荧光显微镜图像(标尺为500μm)。由图3和图4来判断超声粉碎处理和胃蛋白酶消化处理对细胞外基质成分的影响。
从图3的a，b，c可以明显看出，未处理的dMECM呈现为连续交错的大分子链，超声处理后主要是相对较小的分子链，而胃蛋白酶处理后多变成块状和短链分子。
从图4的e，f，g可以明显看出，未处理的dMECM和经超声粉碎处理后的dMECM均保留了大部分I型胶原，而胃蛋白酶处理后的dMECM仅保留了很少的I型胶原。
由此可以看出，本发明的制备方法先采用湿法粉碎、差速离心的方法制备dMECM，然后通过超声粉碎处理来调控dMECM的颗粒粒径在所需范围内。采用本发明的制备方法，能在获得具有目标颗粒粒径的dMECM的同时，极大限度地保留细胞外基质的完整成分。
实施例5
将GelMA干粉加入PBS(美国Corning Cellgro；pH值7.4，25℃)中，60℃水浴溶解2h，之后在4℃静置5min，然后再次于60℃水浴溶解2h，GelMA完全溶解，获得浓度为20g/100mL的GelMA溶液。
将上述实施例1制备的3g/100mL的dMECM混悬液和GelMA溶液按比例混合，并加入2.5g/100mL的LAP溶液，用PBS配制成含有10g/100mL的GelMA、0.5g/100mL的dMECM和0.25g/100mL的LAP的生物墨水。
GelMA干粉和LAP溶液均由上普博源(北京)生物科技有限公司提供。
实施例6
将上述实施例1制备的3g/100mL的dMECM混悬液和实施例5制备的20g/100mL的GelMA溶液按比例混合，并加入2.5g/100mL的LAP溶液和含20％FBS(北京元亨圣马生物科技有限公司)的DMEM/F12培养液(美国Corning公司)，配制成含有10g/100mL的GelMA、0.5g/100mL的dMECM和0.25g/100mL的LAP的生物墨水。在水凝胶材料中加入1×106个/mL的MFCs，得到负载MFCs的生物墨水。
MFCs的培养包括：将1月龄的新西兰白兔用耳缘静脉空气栓塞法处死小兔，常规膝关节备皮，碘伏酒精消毒，铺单，膝关节内侧入路切开皮肤，并游离皮下组织，打开关节囊，将髌骨外翻，切取半月板并放入加有双抗(青霉素-链霉素)的PBS内。将装有新鲜半月板组织的培养皿置于超净台内，然后转移入青霉素小瓶，PBS反复清洗3次。用眼科剪将半月板尽量剪碎，最终剪成体积小于1mm×1mm×1mm的组织碎块。加入10倍于半月板体积的0.2％Ⅱ型胶原酶(美国sigma-aldrich公司)。然后将混悬液置于37℃、5％CO2培养箱内，每隔3h收集一次酶解的混悬液，再重新加入新的0.2％Ⅱ型胶原酶，重复4次；收集的混悬液用含20％FBS(北京元亨圣马生物科技有限公司)的DMEM/F12培养液(美国Corning公司)终止胶原酶消化。离心并以0.75×106个原代细胞的密度将其种植于75cm2的培养瓶内，待细胞长至80％～90％融合，用0.25％的胰酶(美国sigma-aldrich公司)消化后传代培养。
本实施例取P3代细胞用胰酶消化后计数，之后使用低温高速离心机以1200rpm离心5min；然后用生物墨水对细胞进行重悬，得到负载MFCs的生物墨水。
对比例2
与实施例5不同的是，生物墨水中不含dMECM。
测试部分
(1)生物墨水的打印分辨率测试
分别以实施例5和对比例2的生物墨水为原料，使用3D生物打印机(biomaker，上普博源(北京)生物科技有限公司)进行打印。采用内径200μm的打印喷头，打印速度5mm/s，打印温度为15℃。
由图5可以看出，本发明的生物墨水的打印精细度更好。由图5分析可知，本发明的生物墨水的打印扩展比为2.49，明显小于GelMA生物墨水的扩展比2.62。这表明本发明的生物墨水的打印分辨率得到明显提高。采用本发明的生物墨水打印的支架能获得更加精细的结构。其中，扩展比＝打印得到的纤维丝径/喷头内径。
(2)生物墨水的细胞相容性测试
以实施例6中负载MFCs的生物墨水为原料，使用3D生物打印机(biomaker，上普博源(北京)生物科技有限公司)进行逐层打印，获得4层结构的正方体简易模型，相邻两层之间的水凝胶纤维丝之间基本垂直。每层打印完成后，用打印机自带蓝光以90mW/cm2的光强进行光预交联2s；所有层打印完成后，以90mW/cm2的光强进行光交联10s。打印喷头为TT，内径500μm，打印速度5mm/s，喷头温度为20℃。
将简易模型加入含10％FBS的DMEM/F12培养液中培养7天、14天后取材，其中每3天换液。采用活/死细胞染色试剂盒(美国Biovision公司)染色，用共聚焦显微镜(德国Leica公司的TCS SP8型)拍照观察，评估生物相容性。结果如图6和图7所示，培养7天后细胞活性达到90.92％，培养14天后细胞活性为96.87％。证明了本发明的生物墨水的生物相容性较高，因此采用其的打印支架由此能具有良好的生物相容性，有利于细胞生存、增殖和再分化。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种脱细胞细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
提供生物组织碎块；
对所述组织碎块进行无菌处理；
将无菌的组织碎块经湿法粉碎制成悬浮浆料；
将所述悬浮浆料进行差速离心处理，获得脱细胞细胞外基质dECM；
将所述dECM制成混悬液，经无菌超声粉碎处理，获得具有目标颗粒粒径的dECM。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用间歇脉冲模式对所述dECM进行所述无菌超声粉碎处理，其中，超声振幅为65％～75％，处理时间为80s～120s，间歇脉冲模式为：脉冲时间为3s～7s，间歇时间为3s～7s；
进一步地，所述超声振幅为70％，所述处理时间为90s，所述脉冲时间为5s，所述间歇时间为5s。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述超声粉碎处理在周围温度为0℃～5℃条件下进行。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述混悬液的浓度为3g/100mL～5g/100mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述悬浮浆料的浓度为1g/100mL～3g/100mL，所述差速离心处理包括：
将所述悬浮浆料在20℃～25℃下以1200rpm～1500rpm离心3min～5min，获得第一上清液；
将所述第一上清液在20℃～25℃下以1800rpm～2000rpm离心10min～15min，获得第二上清液；
将所述第二上清液在0℃～4℃下以5000rpm～6000rpm离心15min～20min，获得第三上清液；
将所述第三上清液在0℃～4℃下以9000rpm～10000rpm离心25min～30min，获得沉淀；
将所述沉淀制成悬浮液，在0℃～4℃下以9000rpm～10000rpm对所述沉淀离心处理3～4次，每次离心处理的时间为25min～30min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述无菌处理包括：
使用过氧化氢溶液对所述组织碎块漂洗3～4次，每次5min～8min；
使用无菌的蒸馏水和/或PBS对所述组织碎块漂洗3～4次，每次5min～8min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述生物组织碎块包括半月板组织碎块，所述dECM包括脱细胞半月板细胞外基质dMECM。
8.一种脱细胞细胞外基质，其特征在于，所述脱细胞细胞外基质是通过如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的。
9.一种生物墨水，其特征在于，所述生物墨水包含如权利要求8所述的dECM。
10.根据权利要求9所述的生物墨水，其特征在于，所述生物墨水包含水凝胶材料和所述dECM，所述水凝胶材料包括甲基丙烯酰胺基明胶GelMA、透明质酸HA和藻酸盐中的一种或多种。
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