CN107376025B - 一种用于软骨损伤修复的细胞-支架复合材料制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于软骨损伤修复的细胞‑支架复合材料制备方法及应用，属于骨组织工程和再生医学领域。该制备的细胞‑支架复合材料的种子细胞采用具有多向分化潜能特性的、安全性较好的重编程细胞，支架采用魔芋葡甘聚糖和透明质酸钠混合制备的生物材料，细胞与支架通过共培养方法获得细胞‑支架复合材料。该复合材料制备方法较为简单，制备的细胞‑支架复合材料能够有效修复软骨损伤，在骨组织工程和再生医学领域，尤其是在关节软骨修复领域具有广阔的应用前景。

Description

一种用于软骨损伤修复的细胞-支架复合材料制备方法及 应用
技术领域
本发明涉及一种用于软骨损伤修复的细胞-支架复合材料制备方法及应用，属于骨组织工程和再生医学领域。
背景技术
软骨组织是一种蛋白多糖、胶原和透明质酸等物质含量丰富的组织，但血液供应和软骨细胞数量缺乏，因此，软骨组织一旦受损，即便是微小的软骨损伤也难以自然修复或愈合。目前，临床上常用的关节软骨损伤修复方法主要有软骨和软骨下骨去除、微骨折和软骨下骨钻孔、自体骨软骨移植和同种异体骨软骨移植、软骨或骨膜移植等（刘效仿，等. 中华创伤骨科杂志，2014,16(6):537-539）。在这些方法中，由于自体骨软骨移植方法具有安全、有效等优点，是临床最为常用的治疗方法，但是该方法最大的弊端在于，自体骨软骨采集不但会给患者带来新的创伤，同时也给患者带来严重的心理和生理负担。而异体骨软骨移植虽然可成为临床上治疗软骨损伤的替代材料，但由于供体限制，难以大幅应用，同时还可能存在严重的免疫排斥反应和疾病传播风险。微骨折和软骨下骨钻孔也是较为常用的软骨修复方法，能够通过微骨折和软骨下骨钻孔使干细胞到达缺损部位，但由于局部环境和机械应力差异，干细胞容易产生纤维软骨修复，只能暂时或短期缓解病人疼痛。因此，寻求一种新的、切实可行的软骨治疗和修复方法是当前研究的主要方向和目标。软骨组织工程学的兴起和快速发展为治疗关节软骨疾病和缺损提供了一种新的思路和途径。
软骨组织工程的基本原理是将软骨种子细胞种植于可生物降解、组织相容性较好的生物材料上形成细胞-生物材料复合物，通过体外培养，种植在生物材料上的细胞不断生长和增殖，然后再把细胞-生物材料复合物移植入软骨缺损部位，随着生物材料的自行降解和吸收，种植的细胞不断增殖并分泌细胞因子和基质，从而实现对软骨损伤部位的治疗和修复（Vacanti CA, et al., Plast Reconstr Surg, 1991, 88(5): 753-759; Cao Y, etal., Transplant Proc, 1994, 26(6): 3390-3392）。生物支架材料作为种子细胞的载体，它所形成的三维空间结构不仅为细胞提供气体交换，排除废料的场所，同时也为细胞的大量增殖提供足够的空间；而细胞作为软骨损伤修复的种子，在移植到软骨缺损部位后不仅大量增殖，更为重要的是能够分泌细胞外基质和细胞因子，这不仅促进支架材料的降解和吸收，同时所分泌的部分成份能够对软骨损伤部位进行填充。由此可见，种子细胞和生物支架是软骨组织工程最重要的两个要素，因此，良好的种子细胞和生物支架以及二者及与组织良好的生物相容性是软骨有效修复的关键。
目前认为，理想的种子细胞应当具备以下基本条件：（1）取材方便，对机体损伤小；（2）体内、外生长和增殖能力较强，能够在较短时间内获得足够数量的细胞；（3）体内、外的成骨能力较强；（4）具有稳定的生物学功能，成骨后能够稳定保持与正常骨细胞相似的生物学特性并维持一定时间；（5）良好的材料和组织相容性，能够在支架材料上大量增殖，在体内环境能保持良好的生物学特性。当前，种子细胞的来源主要有成骨细胞、骨髓基质细胞、基因修饰细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞等。
成骨细胞是来源于骨组织或骨膜等组织的细胞类型，其在体内、外均具有较强的成骨能力（Vacanti CA, et al., Transplant Proc, 1993, 25: 1019-1021; CastoldiM, et al., Cell Biol Int, 1997, 21(1):7-16），其培养条件也相对简单，细胞易存活（Hankey DP, et al., Acta Orthop Scand, 2001, 72(4): 395-403）。但是成骨细胞取材会对供体造成额外损伤，且成骨细胞易于衰老，在临床上难以推广应用。
骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells, BMSCs）相对容易获得，体外培养较为容易，常用来修复骨骼肌组织损伤和大块骨缺损（Bianco P, et al., Stem Cells,2001, 19(3):180-192; Quarto R, et al., N Engl J Med, 2001, 344(5): 385-386）。但是，BMSCs是多个细胞类群的集合，具有不确定的分化特征，且随着培养时间的延长，BMSCs易于失去增殖潜能以及细胞衰老等问题（Banfi A, et al., Tissue Eng, 2002, 8(6): 901-910）。
基因修饰细胞是指利用基因工程技术将种子细胞进行基因修饰，以实现种子细胞特定的分化能力。研究表明，经过基因修饰的骨髓基质细胞、间充质干细胞能够较好向成骨细胞分化，参与新骨的生成（Marie PJ, et al., Histol Histopathol, 2002, 17(3):877-885; Cheng SL, et al., Calcif Tissue Int, 2001, 68(2): 87-94）。但是，基因修饰细胞大多需要病毒载体介导才能产生，安全性较差，且基因修饰细胞的培养条件要求较高。
目前，很多类型的干细胞在特定条件下均能够分化为软骨细胞，参与软骨的生成，这些类型的干细胞主要包括胚胎干细胞以及上述的间充质干细胞等。胚胎干细胞的分化潜能最为全面，但其免疫原性也最差，在体内易形成畸胎瘤，且涉及严重的伦理争议。间充质干细胞的组织分布虽较为广泛，但其来源和数量常受限制（Phinney DG，Journal ofcellular biochemistry, 2002, 85(S38): 7-12；Covas D, et al., Brazilian Journalof Medical and Biological Research, 2003, 36(9): 1179-1183; Kestendjieva S,et al., Cell biology international, 2008, 32(7): 724-732; Hattori H, et al.,Cells Tissues Organs, 2004, 178(1): 2-12; Kuroda R, et al., Arthritis &Rheumatism, 2006, 54(2): 433-442; Alessandri G, et al., The lancet, 2004, 364(9448): 1872-1883; Yamazaki H, et al., Stem Cells, 2007, 25(1): 78-87）。
诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells, iPSCs）的发明开辟了干细胞来源的新途径，为组织工程和再生医学领域种子细胞的来源提供了新的方法，目前，利用iPSCs已分化出多个类型的细胞和组织，这其中包括骨和软骨组织（Hong SG, et al.,Cell Reports, 2014 , 7 (4) :1298-1309）。由于iPSCs具有多潜能分化特性且不涉及伦理问题，在临床上进行包括软骨损伤等组织损伤治疗和修复方面具有广阔的应用前景。但是目前产生iPSCs的方法普遍存在一些问题，利用四转录因子介导方法产生的iPSCs在重编程水平上更接近胚胎干细胞，但是，该方法需要病毒载体的介导和基因组的改变，产生的iPSCs的安全性相对较差；利用mRNA和microRNA等小分子介导产生的iPSCs的安全性好，但由于这些诱导物质易于降解，因此，在诱导过程中需要不断加入mRNA和microRNA等物质，因而，该重编程方法的实验操作较为繁琐、难度相对较大、重复性也相对较差；化学小分子物质能够显著提高重编程的效率，诱导方法也较为简单，目前已有研究报道利用全化学分子诱导细胞重编程的可行性，但仍存在较大困难，且化学分子对基因组的稳定性目前仍不十分清楚。
基于此，本发明方法基于建立的一种利用鱼卵母细胞提取物诱导成纤维细胞表观重编程为诱导多能干细胞的方法，该方法具有以下显著特点：一是在诱导过程中仅添加鱼卵母细胞提取液进行诱导，实验操作相对较为简单；二是重编程过程不涉及载体介导和基因导入，产生的诱导多能干细胞安全性好；三是重编程效率相对较高，易于重复；四是获得的重编程细胞分化潜能较为全面，目前已通过体内、外研究证实可分化为成骨细胞、神经细胞、脂肪细胞等。利用此重编程方法获得的重编程细胞在骨组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前景。
生物支架是骨组织工程的另一重要要素，目前，应用于软骨损伤修复的支架材料主要包括天然的透明质酸、胶原、明胶、魔芋葡甘聚糖、壳聚糖等，人工合成材料包括聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸等。这些单一材料均存在体内降解和吸收速度过快或过慢以及生物相容性较差等问题，目前仍未找到一种理想的用于软骨损伤修复的支架材料。根据各种材料的特性，将两种或两种以上的材料进行混合制备成出性能更加优良的复合材料是软骨组织工程生物支架发展的重要方向。
魔芋葡甘聚糖（Konjac glucomannan，KGM）是取自于魔芋茎块中的一种中性多糖，不但具有较好的交联性、成膜性和凝胶性，同时还具有良好的生物降解性和一定的生物学活性，此外，特殊的分子结构使其具有较好的吸湿性和透水性（许东颖，等. 材料导报，2008，22(11)：47-50）。基于上述魔芋葡甘聚糖的结构和生物特性，常用作生物膜材料、外用材料、药物控释材料等，近几年在组织工程支架材料领域的研究也日益活跃。
透明质酸(Hyaluronicacid，HA)是一种线性大分子的酸性粘多糖，广泛存在于动物和人的胎盘、羊水、晶状体、关节软骨、皮肤真皮层等组织。因其具有独特的分子结构和理化性质，在机体内发挥多种重要的生理功能，包括对细胞和细胞器的润滑与滋养作用、润滑关节、调节血管壁的通透性，调节蛋白质、水、电解质扩散及运转，促进创伤愈合，减少疤痕形成等；此外，透明质酸还能够为细胞提供代谢的微环境，是胞外基质的重要组份。鉴于上述特性，目前，透明质酸已是骨组织工程重要的支架材料之一。
基于此，本发明方法基于魔芋葡甘聚糖和透明质酸两种材料相结合制备出的KGM/HA复合支架材料。
综上，利用鱼卵母细胞提取物诱导的重编程细胞结合KGM/HA生物支架可能是软骨损伤修复的一个较为可行的方法和策略。在软骨组织工程中，细胞-生物支架复合材料的制备是一个重要环节，常由于细胞和支架自身性质、培养方法不当等原因而难以使细胞在支架表面进行粘附、生长和增殖，此外，所形成的细胞-支架复合材料与组织的生物相容性也是影响软骨损伤修复效果的重要因素。目前，仍没有找到细胞与支架以及与组织生物相容性等方面均良好的软骨损伤修复材料和方法。基于此，针对上述存在的问题，本发明提出一种基于重编程细胞和KGM/HA支架的、用于软骨损伤修复的细胞-支架复合材料制备方法，本复合材料制备方法简单，将复合材料移植给模型动物的骨损伤部位具有较好的软骨修复特性，本发明方法在软骨组织工程领域具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于针对软骨组织工程中细胞、生物支架材料选择，细胞-支架复合材料制备方法、复合材料与组织生物相容性等存在的问题，提出了一种基于重编程细胞和KGM/HA支架的、用于软骨损伤修复的细胞-支架复合材料制备方法。
本发明所提供的一种用于软骨损伤修复的细胞-支架复合材料制备方法包括以下步骤。
（1）重编程细胞的制备主要包括鱼卵母细胞提取物的制备、成纤维细胞的制备、重编程细胞的产生三个部分。
（2）KGM/HA支架的制备其材料主要为魔芋葡甘聚糖和透明质酸钠，二者通过冷冻干燥法制备。
（3）重编程细胞与KGM/HA支架复合材料制备将所述步骤（1）中制备的重编程细胞与所述步骤（2）中制备的KGM/HA支架进行共培养，使重编程细胞粘附于KGM/HA支架表面，并进行生长和增殖。
（4）重编程细胞与KGM/HA支架复合材料特性鉴定将所述步骤（3）中制备的细胞-支架复合材料进行特性鉴定，鉴定指标主要包括KGM/HA支架对细胞的毒性检测、细胞在支架上的粘附、生长情况及形态特征。
本发明的另一目的是提供一种用于软骨损伤修复的细胞-支架复合材料制备方法的应用。
本发明所提供的一种用于软骨损伤修复的细胞-支架复合材料制备方法的应用包括以下步骤。
（1）细胞-支架复合材料的制备细胞-支架复合材料的制备方法根据所述的本发明提供的一种用于软骨损伤修复的细胞-支架复合材料制备方法进行。
（2）软骨损伤部位软骨损伤包括感染、疾病和创伤等。
（3）细胞-支架复合材料的软骨损伤部位移植通过外科手术方式将与软骨损伤部位匹配的细胞-支架复合材料移植到软骨损伤部位，缝合伤口、消毒。
（4）细胞-支架复合材料对软骨损伤的修复作用鉴定通过组织切片方法鉴定细胞-支架复合材料对骨损伤的修复作用。
本发明具有实质性特点和显著进步，本发明针对骨组织工程中种子细胞和生物支架存在的问题，种子细胞使用了鱼卵母细胞提取物诱导的、具有多分化潜能的、安全性相对较好的重编程细胞，生物支架使用了降解速度相对可控、生物相容性相对较好的复合材料KGM/HA，基于二者特性发明了重编程细胞与KGM/HA支架复合材料的制备方法及应用。本发明方法属于软骨组织工程技术，鉴于鱼卵母细胞提取物诱导的重编程细胞和KGM/HA复合支架的特性，重编程细胞与KGM/HA支架形成的复合材料在软骨组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是鱼卵母细胞提取物诱导兔皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞的技术路线示意图。
图2是兔皮肤成纤维细胞形态图。
图3是重编程细胞表达的干细胞标志基因免疫组化结果。
图4是制备的KGM/HA支架光学显微结构图。
图5是扫描电镜下细胞-支架复合材料的结构特征图。
图6是KGM/HA支架对细胞形态、生长和增殖影响情况图。
图7是不同处理组治疗的骨损伤组织X-ray图。
图8是细胞-支架复合材料移植修复组和支架移植修复组的组织切片结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。实施例仅为了便于更好理解本发明而不局限于本发明范围。
实施例1。
鱼卵母细胞提取物诱导兔皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞。
本实施例成纤维细胞来源于兔背部的皮肤组织，鱼卵母细胞提取物诱导兔皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞研究的技术路线如附图1所示，包括如下步骤。
（1）鱼卵母细胞提取物的制备选择卵母细胞卵黄充满时相的昆明当地产鲫鱼，用75％的酒精浸泡15～20分钟，在无菌的条件下取出鱼卵，置入预冷的研钵中，将研钵置于冰上进行研磨，充分研碎后，按体积约1:1的比例加入预冷的生理盐水，4℃条件下1000rpm离心10min，然后4℃条件下3000rpm离心10min，取上清，使用0.22微米孔滤器进行过滤，利用考马斯亮蓝法测定制备的鱼卵母细胞提取物的蛋白含量，根据测得的蛋白浓度用预冷的DMEM/F12培养基稀释成10mg/ml，4℃保存备用，当进行成纤维细胞诱导时，将浓度为10mg/ml的鱼卵母细胞提取物稀释成10~20μg/ml的浓度使用。
（2）皮肤采集选择大约6月龄、健康的兔背部皮肤组织，在75%酒精反复消毒条件下剪取约1×1cm2备用，实验用兔由成都军区昆明总医院实验动物中心提供，并通过成都军区昆明总医院实验动物管理委员会批准，该材料仅用于本研究。
（3）兔皮肤成纤维细胞的制备将所述步骤（2）中采集的皮肤组织用生理盐水反复冲洗后置于含有100U/ml氨苄青霉素和100mg/ml硫酸链霉素的PBS溶液中清洗三次，弃脂肪和结缔组织，将组织剪碎成0.5~1mm3大小的组织块，加入含有胶原酶200U/ml、透明质酸酶300U/ml的DMEM培养基，置于4℃条件下过夜。按1:1的比例加入含有0.25%胰酶和0.02%EDTA的PBS消化液，置于37℃条件、180rpm的空气摇床中20min，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基10ml终止反应；1000rpm离心10min后弃上清、收集细胞，用DMEM培养基洗脱2次后，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基调整为每毫升约2×105个细胞接种，将细胞置于37℃、5%CO2、 90%湿度条件下培养，每2天更换一次培养液。通过鉴定、培养、传代至第四代兔皮肤成纤维细胞，且成纤维细胞达到80%细胞融合、细胞形态正常、轮廓清晰时进行鱼卵母细胞重编程。兔皮肤成纤维细胞形态特征如附图2所示。
（4）兔皮肤成纤维细胞的鱼卵母细胞提取物诱导当所述步骤（3）中制备的兔成纤维细胞贴壁后，每2天更换一次培养液，当成纤维细胞生长至80%细胞融合时，用0.25%的胰酶消化、洗涤，按照每毫升约2×105个细胞进行传代培养至第4代，待细胞贴壁后，加入蛋白浓度为10~20μg/ml的卵母细胞提取液进行诱导72小时。
（5）重编程细胞特征鉴定经过所述步骤（4）中鱼卵母细胞提取物对兔皮肤成纤维细胞的诱导，诱导后的成纤维细胞呈贴壁生长，细胞形态逐渐发生变化，呈现梭形、三角形、多角形等形态，细胞核较大，呈扁圆形。诱导后的兔成纤维细胞呈现骨髓间充质干细胞的一些特征。免疫组化结果显示，重编程细胞表达干细胞标志基因Sox2、Oct4/3、Nanog，这说明重编程具备了干细胞的特性，具有向其它类型细胞分化的潜能。重编程细胞干细胞标志基因免疫组化结果如附图3所示。
通过本实施例所述的五个步骤，获得了鱼卵母细胞提取物诱导的、安全性相对较好的兔重编程细胞。
实施例2。
KGM/HA生物支架的制备。
本实施例KGM/HA生物支架的制备材料包括魔芋葡甘聚糖和透明质酸钠，其制备方法为：将0.06g HA粉分散于40 ml水中，磁力搅拌，加入0.08ml NH3·H2O调整pH值，按正交试验表设计加入1.50g的KGM，同时继续磁力搅拌，直至搅拌自行终止、密封；70℃下水浴熟化，相同条件下脱碱；再将其置于低温冷冻储存箱中，在-20℃条件下冷冻24h后取出，最后在冷冻干燥机中干燥，制得复合多孔支架KGM/HA。
利用光学显微分析和定量金相法分析发现，制备的KGM/HA支架适宜于干细胞生长的100μm~250μm孔径占支架总孔径的80%~90%，且孔径分布相对较为均匀，适宜于重编程细胞的生长；KGM/HA支架抗压强度平均在0.4MP以上，具有一定的抗压强度，满足植入前支架的基本力学要求；扫描电镜结果显示支架孔径贯通性好，适宜于重编程细胞在支架表面均匀粘附、生长和增殖。制备的KGM/HA支架光学显微结构如附图4所示。
实施例3。
重编程细胞与KGM/HA支架复合材料的制备。
将实施例1中制备的重编程细胞和实施例2中制备的KGM/HA支架进行共培养，制备重编程细胞-KGM/HA支架复合材料，其方法和步骤为：（1）将所述实施例2中制备好的、经过无菌处理的KGM/HA支架置于细胞培养六孔板中；（2）用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基混悬所述实施例1中制备的重编程细胞，并调整其浓度为每毫升1×106个重编程细胞；（3）将调整好浓度的重编程细胞接种于所述步骤（1）中六孔板中的无菌KGM/HA复合材料上，每孔接种5ml；（4）将所述步骤（3）中接种好重编程细胞的六孔培养板置于37℃、5%CO2、90%湿度条件下培养，每两天更换一次培养液，培养10天；（5）培养10天后，小心吸净所述步骤（4）中六孔板中的培养基，加入2ml戊二醛溶液固定细胞，冷冻干燥后喷金，扫描电子显微镜下观察细胞在支架上的形态及生长和黏附情况。扫描电镜下制备的细胞-支架复合材料结构特征如附图5所示。
扫描电镜结果显示，重编程细胞与KGM/HA支架共培养10天后，重编程细胞能够贴附生长在支架的孔壁及材料表面，细胞相互粘连成片，细胞伪足在材料表面延伸并吸附于材料表面，细胞生长情况良好，且细胞在支架表面大量增殖，细胞呈星形、三角形、多角形及长梭形等多种形态，细胞相互连接和重叠，形成层叠结构。
实施例4。
KGM/HA支架对重编程细胞的毒性实验。
KGM/HA支架对重编程细胞毒性检测方法和步骤为。
（1）在无菌条件下，将所述实施例3中制备的无菌的KGM/HA复合支架材料分别放入生理盐水中，在37℃的恒温箱中孵育24小时，过滤、稀释等制备成不同浓度的浸提液。
（2）调整所述实施例2中制备的重编程细胞数量为4×105/ml后分别接种于96孔培养板中，分别加入不同浓度的KGM/HA复合支架材料浸提液，每组各设7个重复，置37℃、5%CO2培养箱中培养48h后，每孔各吸取上清液50µl，然后加入30µl 1.25mg/ml MTT，置37℃、5% CO2培养箱中继续培养4h，然后，每孔加入100µl DMSO，用酶联免疫检测仪测定波长为595nm处的OD值，根据OD值求出细胞的增殖度，细胞增殖度（RGR）计算公式如下。
Figure 4
（3）根据计算所得的细胞增殖度，依据毒性反应分级标准并结合细胞形态学特征来评定浸提液对重编程细胞的毒性程度。毒性反应分级标准如下表。
Figure 885556DEST_PATH_IMAGE002
（4）毒性程度判定标准：1）无毒细胞形态正常，呈梭形或不规则三角形，贴壁生长良好；2）轻度毒性细胞贴壁生长好，但可见少数细胞圆缩，偶见悬浮细胞；3）中度毒性细胞贴壁生长不佳，细胞圆缩较多，达 1/3 以上，见悬浮死细胞；4）重度毒性细胞基本不贴壁，90%以上为死细胞。
KGM/HA支架对重编程细胞的形态和增殖影响情况如附图6。如附图6可以看出，将浸提液培养重编程细胞至48小时后，重编程细胞大量增殖，铺满整个培养瓶底，细胞形态呈梭形和束状排列。7组不同浓度KGM/HA浸提液对细胞的增殖度均在94%-99%之间，根据毒性反应分级标准，均处于1级反应，由此，KGM/HA支架浸提液浓度在0.25mg/ml~3.0mg/ml时对培养细胞无明显毒性作用。
实施例5。
重编程细胞-KGM/HA支架复合材料对兔桡骨缺损的修复作用。
本实施例将所述实施例3中制备好的重编程细胞-KGM/HA支架复合材料移植给兔桡骨缺损部位，观察所述实施例3中制备的复合材料在体内的骨修复情况。本实施例中使用的兔子为18只6月龄、体重为2.0-2.5kg的新西兰大白兔，雌雄不限，兔子来源于成都军区昆明总医院实验动物中心，兔子的使用通过了成都军区昆明总医院实验动物伦理委员会的批准。本实施例的方法和步骤包括：造模时，先于兔耳静脉注射苯巴比妥（30mg/Kg）和氯胺酮（10mg/kg）进行麻醉，去左下肢毛，四肢固定于手术台上，上气囊止血带，碘伏消毒，铺巾、单，打气200mmHg止血后，纵行切开桡骨近端外侧皮肤、筋膜，显露桡骨干骺端骨皮质，用特制不锈钢锯造桡骨骨缺损Ф5×15mm。
本实施例实验分为3组（每组6只）：A组为对照组，用特制不锈钢锯造Ф5×15 mm桡骨缺损，不进行治疗，仅缝合伤口； B组为KGM/HA支架治疗组，用特制不锈钢锯造Ф5×15mm桡骨缺损，用Ф5×15mm大小KGM/HA材料填充桡骨缺损处后缝合；C组为重编程细胞-KGM/HA支架复合材料治疗组，用特制不锈钢锯造Ф5×15mm桡骨缺损，用所述实施例3中制备的Ф5×15mm大小的细胞-支架复合材料填充桡骨缺损处后缝合伤口。三组于术后当天进行X-ray检测，以确认材料在正确位置；移植后4、8和12周分别再次进行X-ray检测，观察骨损伤修复情况，并于3个月后对桡骨缺损部位进行取材，采用X-ray和组织切片法观察细胞-支架复合材料对骨缺损的修复情况。不同处理组治疗后损伤骨组织的X-ray结果如附图7所示。细胞-支架复合材料移植修复组和支架移植修复组的组织切片结果如附图8所示。
X-ray结果显示，重编程细胞-KGM/HA支架复合材料移植组，在移植复合材料的第4周时出现钙沉积，在第8周时骨缺损的一端可见传导修复；KGM/HA支架材料组，在第4周时，未出现钙沉积，在第8周时出现钙沉积；对照组在第4周和第8周时均未出现钙沉积。
组织切片结果显示，重编程细胞-KGM/HA支架复合材料移植组，在修复部位可见有成骨细胞、骨小梁和血管生成，细胞-支架复合材料联合移植不引起炎症反应，对正常组织结构特征无显著影响，这说明重编程细胞-KGM/HA支架复合物与机体组织具有良好的生物相容性，其对骨损伤部位有一定的治疗和修复作用；移植KGM/HA支架材料组在修复部位无成骨细胞和骨小梁生成，且出现明显的炎症反应和组织坏死。

Claims (5)

1.一种用于软骨损伤修复的细胞-支架复合材料，其特征在于细胞为鱼卵母细胞提取物诱导兔皮肤成纤维细胞产生的重编程细胞，支架为魔芋葡甘聚糖和透明质酸钠通过冷冻干燥法制备的复合支架KGM/HA；制备方法为：
(1)将经过无菌处理的KGM/HA支架置于细胞培养六孔板中；
(2)用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基混悬重编程细胞，并调整其浓度为每毫升1×106个重编程细胞；
(3)将调整好浓度的重编程细胞接种于六孔板中的无菌KGM/HA复合材料上，每孔接种5mL；
(4)将步骤(3)中接种好重编程细胞的六孔培养板置于37℃、5％CO2、90％湿度条件下培养，每两天更换一次培养液，培养10天；
(5)小心吸净步骤(4)中六孔板中的培养基，加入2mL戊二醛溶液固定细胞；冷冻干燥后喷金，扫描电子显微镜下观察细胞在支架上的形态及生长和黏附情况，扫描电镜结果显示，重编程细胞贴附生长在支架的孔壁及材料表面，细胞相互粘连成片，细胞伪足在材料表面延伸并吸附于材料表面，细胞生长情况良好，且细胞在支架表面大量增殖，细胞呈星形、三角形、多角形及长梭形多种形态，细胞相互连接和重叠，形成层叠结构。
2.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于鱼卵母细胞提取物诱导兔皮肤成纤维细胞产生重编程细胞的方法为：
(1)鱼卵母细胞提取物的制备：选择卵母细胞卵黄充满时鲫鱼，用75％的酒精浸泡15～20分钟，在无菌的条件下取出鱼卵，置入预冷的研钵中，将研钵置于冰上进行研磨，充分研碎后，按体积1:1的比例加入预冷的生理盐水，4℃条件下1000rpm离心10min，然后4℃条件下3000rpm离心10min，取上清，使用0.22微米孔滤器进行过滤，利用考马斯亮蓝法测定制备的鱼卵母细胞提取物的蛋白含量，根据测得的蛋白浓度用预冷的DMEM/F12培养基稀释成10mg/mL，4℃保存备用；
(2)皮肤采集：选择6月龄、健康的兔背部皮肤组织，在75％酒精反复消毒条件下剪取1×1cm2备用；
(3)兔皮肤成纤维细胞的制备：将采集的皮肤组织用生理盐水反复冲洗后置于含有100U/mL氨苄青霉素和100mg/mL硫酸链霉素的PBS溶液中清洗三次，弃脂肪和结缔组织，将组织剪碎成0.5～1mm3大小的组织块，加入含有胶原酶200U/mL、透明质酸酶300U/mL的DMEM培养基，置于4℃条件下过夜；按1:1的比例加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液，置于37℃条件、180rpm的空气摇床中20min，用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基10mL终止反应；1000rpm离心10min后弃上清、收集细胞，用DMEM培养基洗脱2次后，用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基调整为每毫升2×105个细胞接种，将细胞置于37℃、5％CO2、90％湿度条件下培养，每2天更换一次培养液；通过鉴定、培养、传代至第四代兔皮肤成纤维细胞，且成纤维细胞达到80％细胞融合、细胞形态正常、轮廓清晰时进行鱼卵母细胞重编程；
(4)兔皮肤成纤维细胞的鱼卵母细胞提取物诱导：待传代至第四代兔皮肤成纤维细胞的细胞贴壁后，加入蛋白浓度为10～20μg/mL的卵母细胞提取液进行诱导72小时；
(5)重编程细胞特征鉴定。
3.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于复合支架KGM/HA的制备方法为：将0.06g HA粉分散于40mL水中，磁力搅拌，加入0.08mL NH3·H2O调整pH值，加入1.50g的KGM，同时继续磁力搅拌，直至搅拌自行终止、密封；70℃下水浴熟化，相同条件下脱碱；再将其置于低温冷冻储存箱中，在-20℃条件下冷冻24h后取出，最后在冷冻干燥机中干燥，制得复合支架KGM/HA。
4.一种权利要求1所述用于软骨损伤修复的细胞-支架复合材料的制备方法，其特征在于制备方法为：
(1)支架为魔芋葡甘聚糖和透明质酸钠通过冷冻干燥法制备的复合支架KGM/HA，将经过无菌处理的KGM/HA支架置于细胞培养六孔板中；
(2)细胞为鱼卵母细胞提取物诱导兔皮肤成纤维细胞产生的重编程细胞，用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基混悬重编程细胞，并调整其浓度为每毫升1×106个重编程细胞；
(3)将调整好浓度的重编程细胞接种于六孔板中的无菌KGM/HA复合材料上，每孔接种5mL；
(4)将步骤(3)中接种好重编程细胞的六孔培养板置于37℃、5％CO2、90％湿度条件下培养，每两天更换一次培养液，培养10天；
(5)小心吸净步骤(4)中六孔板中的培养基，加入2mL戊二醛溶液固定细胞。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于还包括重编程细胞、KGM/HA支架复合材料的特征鉴定，特征鉴定包括KGM/HA支架的细胞毒性鉴定、细胞在KGM/HA复合材料上的形态学观察、细胞与KGM/HA复合材料的相容性鉴定。
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