RU2819284C2 - Способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов субъекта - Google Patents
Способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов субъекта Download PDFInfo
- Publication number
- RU2819284C2 RU2819284C2 RU2022117576A RU2022117576A RU2819284C2 RU 2819284 C2 RU2819284 C2 RU 2819284C2 RU 2022117576 A RU2022117576 A RU 2022117576A RU 2022117576 A RU2022117576 A RU 2022117576A RU 2819284 C2 RU2819284 C2 RU 2819284C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- periosteum
- collagen membrane
- cells
- spheroids
- tissue
- Prior art date
Links
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 title claims abstract description 58
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 title claims abstract description 58
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000007547 defect Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 48
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 45
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 21
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 239000010936 titanium Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical group O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 claims abstract description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims abstract description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 59
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 9
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 claims description 3
- 230000002520 cambial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 abstract description 9
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 12
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 9
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 7
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 7
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 7
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 4
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 4
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 4
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 4
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 3
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 3
- 210000005009 osteogenic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 3
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 3
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 3
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 210000003275 diaphysis Anatomy 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000002758 humerus Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004876 tela submucosa Anatomy 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101001093100 Drosophila melanogaster Scaffold protein salvador Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- -1 FGF-β Proteins 0.000 description 1
- 101150019331 FGF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 206010040844 Skin exfoliation Diseases 0.000 description 1
- 102000043168 TGF-beta family Human genes 0.000 description 1
- 108091085018 TGF-beta family Proteins 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000004097 bone metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000035618 desquamation Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000005489 elastic deformation Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000035194 endochondral ossification Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000000642 iatrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 235000001705 insufficient nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000032631 intramembranous ossification Effects 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 1
- 238000002278 reconstructive surgery Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000824 sesamoid bone Anatomy 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 1
- AVPCPPOOQICIRJ-UHFFFAOYSA-L sodium glycerol 2-phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OCC(CO)OP([O-])([O-])=O AVPCPPOOQICIRJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000024664 tolerance induction Effects 0.000 description 1
- 229940099456 transforming growth factor beta 1 Drugs 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к медицинской технике, а именно к способу получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов субъекта. В способе коллагеновую мембрану размещают на дне культурального сосуда с боковой крышкой и пропитывают коллагеновую мембрану культуральной питательной средой. Далее размещают на коллагеновой мембране сверху прямоугольную выполненную из титана раму с размером сечения 4×4 мм при высоте рамы 0,5 мм, рамой прижимают края коллагеновой мембраны к дну флакона. Сверху на коллагеновую мембрану, ограниченную внутренними стенками рамы, укладывают горизонтальный слой клеточных сфероидов, состоящих из агрегированных культивированных аутологичных клеток надкостницы, в один ряд. Культивируют сфероиды на поверхности коллагеновой мембраны в процессе созревания тканеинженерной конструкции в питательной среде: DMEM или DMEM-F12 450 мл, L-глутамина 292 мг, тромболизата 50 мл, пенициллина 100 ед./мл, стрептомицина 100 мкг/мл при 100 % влажности и с 5 % содержанием СО2 в воздушной смеси над слоем питательной среды внутри культурального флакона, в течение 6-7 суток с заменой культуральной питательной среды не менее 2 раз. Техническим результатом является разработка способа получения биоискусственной надкостницы, содержащей культивированные остеогенные клетки надкостницы и обладающей регенеративным остеогенным потенциалом при пересадке в живой организм. 4 з.п. ф-лы.
Description
Область техники
Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, ортобиологии, травматологии и ортопедии, стоматологии, пластической и восстановительной хирургии.
Уровень техники
Надкостница представляет собой тонкую соединительнотканную пластинку мезен-химного происхождения, покрывающую все поверхности костей, кроме суставных, сухожильных прикреплений и поверхностей сесамовидных костей. Прочное крепление надкостницы к подлежащей кости обеспечивается коллагеновыми волокнами Шарпея, которые доходят до внешних периферических и интерстициальных пластинок кости. За небольшой толщиной надкостницы скрывается ее сложное строение, которое обеспечивает выполнение множества функций, включая механическую защиту кости, механосенсорику, функции резервуара биохимических молекул для инициации каскадной передачи сигналов, формирование ниши остеогенных клеток для роста, физиологической и репаративной регенерации кости, а также питание костной ткани многочисленными сосудами надкостницы и иннервация надкостницы и прилежащей костной ткани многочисленными нервными волокнами. Следует отметить, что нервная система является важным регулятором костного метаболизма, в том числе посредством центрального контроля активности остеогенных клеток надкостницы.
Надкостница важна не только для остеогенеза, но при определенных искусственных условиях надкостница может обеспечить репаративный хондрогенез, что существенно расширяет спектр возможностей регенеративных технологий с использованием надкостницы или ее живого эквивалента.
Определенные клетки надкостницы (Periosteum-derived cells (PDCs)) обладают свойствами стволовых клеток, для них характерны самообновление (отсутствие признаков старения до 80 удвоения популяции) и мультипотентность (дифференцируются в фибробласты, остеобласты, хондроциты, адипоциты и скелетные миоциты). Внутренний слой камбия богат клетками и состоит в основном из остеогенных клеток на различных стадиях развития (покоящихся, пролиферирующих, дифференцирующихся предшественников) и остеобластов, которые окружены гораздо более тонким коллагеновом матриксе, по сравнению с внешним фиброзным слоем [Li, Chunyi and Peter Fennessy. "The periosteum: a simple tissue with many faces, with special reference to the antler-lineage periostea." Biology direct vol. 16, 1 17. 18 Oct. 2021, doi:10.1186/s13062-021-00310-w].
Многие проблемы травматологии и ортопедии, стоматологии и пластической хирургии, связанные с костными и хрящевыми посттравматическими дефектами, превышающими размеры критических дефектов, могут быть эффективно решены за счет изготовления биоискусственной персонифицированной надкостницы, исследуются варианты изготовления из различных типов клеток, материалов с разными свойствами, предназначенные для различных методик трансплантации того или иного полученного конструкта. Крайне важно отметить, что сразу после повреждения костей, например диафиза длинной трубчатой кости, его кортикального слоя, травмированная надкостница претерпевает ряд изменений, которые инициируют как эндохондральное, так и внутримембранозное образование кости в месте повреждения.
Быстро развивающаяся область биотехнологий, включая тканевую инженерию надкостницы, направлена на синтез биоискусственной или бионической надкостниц, способных обеспечить, как саму возможность заживлений костных дефектов, так и ускорения этих процессов. Материалы биоискусственной надкостницы могут стремиться к достижению параметров натуральной надкостницы как по структуре, так и по функциям, что позволяет надеяться на хороший терапевтический и регенеративный потенциалы разрабатываемых тканеинженерных конструктов.
Индукция регенерации тканей надкостницы и кости с помощью биомиметической тканеинженерной надкостницы, по мнению ряда авторов, является идеальным целевым процессом для восстановления кости (Zhang W., Wang N., Yang M., Sun T., Zhang J., Zhao Y., Huo N., Li Z. Periosteum and development of the tissue-engineered periosteum for guided bone regeneration. J Orthop Translat. 2022 Feb. 16; 33:41-54. doi: 10.1016/j.jot.2022.01.002. PMID: 35228996; PMCID: PMC8858911).
Известна группа изобретений, в которой предложены способ получения трансплантата на основе клеточных сфероидов из культивируемых клеток надкостницы и трансплантат для восстановления скелетных соединительных тканей субъекта, полученный указанным способом. Сфероиды в этих изобретениях предназначены для заполнения посттравматических дефектов скелетных тканей и стимуляции костной, в первую очередь трансплантационной регенерации (Патент №2744664 С1 Российская Федерация, МПК C12N 5/077, A61F 2/30. Способ производства сфероидов из культивируемых клеток надкостницы для обеспечения репаративного остеогенеза: №2020109215: заявл. 02.03.2020: опубл. 12.03.2021 / А.В. Ковалев, М.М. Сморчков; заявитель ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "МЕЖДУНАРОДНЫЙ ЦЕНТР МЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ И РАЗРАБОТОК". - EDN LPAATA).
Чжао и соавт. разработали конструкцию тканеинженерной надкостницы, которая по данным авторов играет роль в остеогенезе и ангиогенезе при лечении экспериментальных костных дефектов. Их тканеинженерная надкостница представляет собой гибкую конструкцию, созданную путем объединения остеогенно-индуцированных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга кролика с бесклеточным каркасом подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи. Третий пассаж МСК был выбран для остеогенной дифференцировки. МСК индуцировали в течение 3 недель в DMEM (Invitrogen), содержащей 10 % FBS (Sijiqing) с добавлением 50 мг/л аскорбата натрия, 10 ммоль/л β-глицеролфосфата натрия и 10 нм/л дексаметазона (все от Sigma-Aldrich).) при 37°С во влажной камере с 5 % СО2. Листы бесклеточных каркасов подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи расстилали на дно культуральных чашек, а затем дезинфицировали ультрафиолетовым светом в течение более чем 1 часа. Чистую фетальную бычью сыворотку добавляли к предварительно смоченным листам бесклеточных каркасов подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи более чем на 12 часов. Затем на предварительно смоченную поверхность этих листов добавляли 500 мкл суспензии остеогенно-индуцированных МСК с плотностью 1×106 клеток/мл и инкубировали в течение 4 ч, чтобы обеспечить прикрепление клеток. К клеткам добавляли дополнительную среду DMEM с 10 % фетальной бычьей сыворотки, и культуру инкубировали при 37°С в среде с 5 % СО2 и влажностью 95 % в течение 10-15 дней для образования биоактивного тканеинженерного конструкта. Среду меняли каждые 2-3 дня (Zhao L, Zhao J, Tuo Z, Ren G. Repair of long bone defects of large size using a tissue-engineered periosteum in a rabbit model. J Mater Sci Mater Med. 2021;32(9): 105. Published 2021 Aug 21. doi: 10.1007/s 10856-021-06579-7).
Однако эта вышеописанная и известная тканеинженерная надкостница имеет следующие недостатки: мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, несмотря на общее эмбриональное происхождение с камбиальными клетками надкостницы не являются тканеспецифичным типом клеток для этой соединительнотканной пластинки в живом организме. Известно, что PDCs демонстрируют гораздо более высокую скорость пролиферации, чем мезенхимальные стволовые клетки, происходящие из костного мозга, и эти клетки надкостницы поддерживают линейный рост в течение более чем 30 удвоений популяции, демонстрируя длинные теломеры без признаков старения примерно до 80 удвоений популяции, что существенно лучше аналогичных показателей, характерных для МСК костного мозга. В целом, в постнатальном периоде PDCы проявляют большую клоногенность, способность к росту и дифференцировке в остеогенном и хондрогенном направлениях, чем мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (Li, Chunyi, and Peter Fennessy. "The periosteum: a simple tissue with many faces, with special reference to the antler-lineage periostea." Biology direct vol. 16,1 17. 18 Oct. 2021, doi: 10.1186/s13062-021-00310-w).
В конструкции используется ксеногенный материал - бесклеточным каркасом подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи, что несет все риски, связанные с любыми материалами ксеногенного происхождения.
Используемые клетки более специализированы, подобное состояние снижает пластичность клеток, одновременным снижая пролиферативный и регенеративный потенциал клеток, что отрицательно сказывается на кинетике наращивания клеточной биомассы, уменьшается ее выход при остальных равных условиях культивировании.
Использование в питательной среде фетальной бычьей сыворотки уменьшает эффективность культивирования из-за известных проблем со стандартизацией этого типа ксеногенных продуктов, а также влияния фетальной сыворотки на дифференцировку клеток и ускорение старения культур клеток мезенхимного происхождения.
Таким образом, несмотря на известные способы получения различных конструкций тканеинженерной надкостницы, все эти конструкции характеризуются рядом недостатков и ограничений, а также остается много препятствий, в том числе, связанных с приживлением, участием в тканеспецифической полноценной репаративной регенерации скелетных тканей, недостаточным кровоснабжением конструктов, недостаточным питанием и дыханием пересаженных клеток в тканеинженерных конструктах на этапе приживления и малой эффективности индукции костной регенерации в живом организме на месте костного дефекта, поэтому сохраняется необходимость в разработке и создании новых способов получения тканеинженерной надкостницы и решения указанных проблем.
Раскрытие изобретения
Задачами настоящего изобретения является разработка способа получения персонифицированного биотрансплантата - тканеинженерной надкостницы из агрегатов аутологичных культивированных клеток надкостницы - клеточных сфероидов, объединенных с коллагеновой мембраной и альгинатного геля с цитокинами, обладающего влиянием на остеогенную дифференцировку клеток.
Техническим результатом данного изобретения является разработка способа получения биоискусственной надкостницы - тканеинженерной конструкции в виде эластичной тонкой пластины на основе коллагеновой мембраны и клеточных сфероидов из аутологичных культивированных клеток надкостницы, прилипших к мембране, слившихся между собой и частично распластанных, часть клеток проникает в межволоконные пространства коллагеновой мембраны с формированием объединяющего тканеинженерную конструкцию коллагенового остова. В состав трансплантата входит альгинатный гель (полученный путем смешивания 2 % (масса/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl2 в 10 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с помощью стерильного Y-образного смесителя. Гель отверждался в течение 1 мин и имел модуль Юнга 0,17 МПа. Факторы роста (TGF-β1 и FGF-2) были включены в состав геля в концентрации 10 нг/мл), способствующий реализации регенеративных потенций конструкта в живом организме. Гель вноситься в конструкцию интраоперационно, заполняя пространство костного дефекта, ограниченное коллагеновой мембраной со сфероидами. Полученная таким способом тканеинженерная надкостница содержит культивированные остеогенные клетки надкостницы и обладает регенеративным остеогенным потенциалом при пересадке в живой организм.
Способ получения указанной тканеинженерной конструкции включает следующие этапы:
а) размещение на дне культурального сосуда с боковой крышкой коллагеновой мембраны и ее пропитывание культуральной питательной средой:
б) установка титановой рамы (размер сечения бруска рамы - боковая сторона - 0,5 мм ширина - 4 мм, скрепленных между собой под прямым углом) сверху на коллагеновую мембрану, мембрана расправляется и рамой прижимается ко дну культурального флакона, во флакон вносится культуральная питательная среда, размер титановой рамы соответствует размеру коллагеновой мембраны;
в) в пространство, образуемое коллагеновой мембраной и внутренними боковыми краями титановой рамы, проводится укладка одного ряда клеточных сфероидов из аутологичных культивированных клеток надкостницы, для чего клеточные сфероиды в суспензии с помощью аппликатора наносятся на коллагеновую мембрану, сфероиды осаждаются под собственным весом, распределяются титановой полоской длина которой соответствует размерам раны по поверхности мембраны до полного заполнения слоя в 1 сфероид по высоте по всей площади мембраны, ограниченной внутренними краями рамы, для выравнивания слоя сфероидов полоска перемещается по верхней поверхности ребер рамы;
г) 3D культивирование сфероидов на поверхности коллагеновой мембраны проводиться в течении 5 суток в питательной среде состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/F12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, 50 мл тромболизата, пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл (при 100 % влажности над слоем питательной среды внутри культурального флакона и 5 % СО2 в воздушной газовой смеси), замена питательной среды во флаконе проводиться не менее 1 раз в 3 суток;
д) края коллагеновой мембраны прошиваются хирургическими рассасывающимися нитями для последующего крепления к свободным краям надкостницы реципиента вокруг костного дефекта при трансплантации этой тканеинженерной конструкции, слой сфероидов располагается снаружи, коллагеновая мембрана обращена к центру костного дефекта, внутреннее пространство ограниченное коллагеновой мембраной и поверхностями костного дефекта заполняется с помощью шприца гелем, который получен путем смешивания 2 % (масса/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl2 в 10 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с помощью стерильного Y-образного смесителя, гель отверждается в течение 1 мин и имеет модуль Юнга 0,17 МПа, в составе геля присутствуют факторы роста TGF-β1 и FGF-2 в количестве 10 нг/мл каждый.
Определение и термины
Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой подмножество гетерогенных некроветворных фибробластоподобных клеток, которые могут дифференцироваться в клетки нескольких клонов, такие как хондроциты, остеобласты, адипоциты, миобласты и другие. Эти мультипотентные МСК могут быть обнаружены почти во всех тканях, но в основном расположены в периваскулярных нишах, играя важную роль в восстановлении и регенерации тканей. Кроме того, МСК взаимодействуют с иммунными клетками как врожденной, так и адаптивной иммунной системы, модулируя иммунный ответ и обеспечивая иммуносупрессию и индукцию толерантности.
Трансформирующий фактор роста бета (англ. Transforming growth factor beta, TGF-beta) - белок (представитель цитокинов), который контролирует пролиферацию, клеточную дифференцировку и другие функции в большинстве клеток. Трансформирующий ростовой фактор, бета-1 (TGF - бета-1) - белок человека, поливалентный цитокин, являющийся первым описанным членом семейства ТРФ-бета, которое, в свою очередь, является частью обширного суперсемейства ТРФ-бета. TGF-β1 проявляет все основные типы биологической активности, присущие всем изоформам. Первоначально TGF-β1 был описан как фактор, вызывающий рост фибробластов у грызунов. TGF-β1-непрямой митоген для некоторых ме-зенхимных клеток.
Основной фактор роста фибробластов (англ. Basic fibroblast growth factor, bFGF, FGF-β, FGF2), представляет собой фактор роста и сигнальный белок, кодируемый геном FGF2. Он связывается и оказывает действие через специфические белки рецептора фактора роста фибробластов (FGFR), сами по себе являющиеся семейством близкородственных молекул, обладает широкой митогенной активностью и активностью выживания клеток и участвует во множестве биологических процессов, включая эмбриональное развитие, рост клеток, морфогенез, восстановление тканей, рост опухоли и инвазию. Гепарансульфат, активирует bFGF, тем самым опосредуя образование новых кровеносных сосудов, процесс, известный как ангиогенез.
Скаффолд - это важная часть тканеинженерной конструкции - каркас, временная поддержка, постепенно разрушающаяся в живом организме после пересадки, который используется для того, чтобы клетки прилипли к нему и образовали конструкт определенной формы, несущий живые клетки для пересадки в живой организм с целью ремонта или замещения органов.
Гель - физическое студенистое состояние вещества, обладающее некоторыми свойствами твердых тел (способность сохранять форму, прочность, упругость).
Модуль Юнга (синонимы: модуль продольной упругости, модуль нормальной упругости) - физическая величина, характеризующая способность материала сопротивляться растяжению, сжатию при упругой деформации.
Дефект кости - отсутствие участка костной ткани, обусловленное травмой или ятрогенным вмешательством (резекция кости).
Подробное раскрытие изобретения.
Использование сфероидов, позволяет повысить регенеративный потенциал конструкции за счет преимуществ, присущих клеточным сфероидам в сравнении с разрозненными клетками в виде суспензии, используемые при трансплантации путем инъекций, или же при нанесении отдельных клеток на скаффолд, а именно происходит: увеличение жизнеспособности клеток в сфероидах; формируется микросреда внутри сфероидов, приближающая клетки в составе сфероида к условиям микроокружения ин виво; создается высокая клеточная емкость тканеинженерной конструкции, что способствует инициации костной регенерации; характерна большая биосовместимость; в отличие от разрозненных клеток, клетки в сфероидах более вовлечены в механотрансдукцию; высокая способность сфероидов к биоинтеграции, а также обеспечиваются более благоприятные условия к органотипичной дифференцировке клеток в составе сфероида. Соединение сфероидов со скаффолдами - это новейший подход в тканевой инженерии. Каркасы в этом случае должны предоставлять волоконный остов внеклеточного матрикса, к которому мигрирующие из сфероидов клетки могут прикрепляться, пролиферировать и дифференцироваться, при этом каркас обеспечивает механическую прочность конструкции и ее гибкость, а сфероиды оптимизируют внутриклеточную передачу сигналов, улучшая процесс дифференцировки, что, в свою очередь, позволяет клеткам участвовать в остеогенезе после трансплантации. В данном изобретении предложен способ получения тканеинженерной надкостницы, которая предназначена для инициации костной регенерации по способу поднадкостничной костной репаративной регенерации, описанной в экспериментальной модели при изучении костеобразовательных возможностей надкостницы диафиза трубчатых костей (Студитский А. Н. Восстановление органов и тканей животного организма (биологическая теория регенерации): стенограмма публичной лекции, прочитанной в Центральном лектории Общества в Москве. - М.: Знание, 1952. - 40 с. (Всесоюзное общество по распространению политических и научных знаний. Серия 2. 1952. № 58). Условиями костной регенерации в этой животной модели являлись: вылущивание кости с сохранением суставных хрящей и надкостницы; надкостница и суставные хрящи оставляются на своем прежнем месте; в эксперименте удаляли («вылущивание из-под надкостницы») плечевые, бедренные, берцовые кости кроликов, собак, кур; в ходе эксперимента под надкостницей на месте костного дефекта формируется «грубая модель будущей кости», которая состоит в значительной мере из хряща; при дальнейшем наблюдении под влиянием мышечной нагрузки - движений - из грубой костно-хрящевой модели возникает сформированная плечевая, бедренная или берцовая кости со всеми особенностями строения, присущими нормальному костному органу.
Способ получения тканеинженерной конструкции надкостницы позволяет реализовать биомиметический подход в тканевой инженерии, когда биоискусственный продукт после трансплантации обеспечивает костную регенерацию по известному сценарию поднадкост-ничной остеорегенерации, и представляет собой частный вариант тканевой инженерии развития.
Пример осуществления изобретения
У кроликов-самцов калифорнийской породы массой 1 кг в ходе экспериментальной операции иссекался лоскут надкостницы с передней поверхности большеберцовой кости. Из надкостницы выделялась клеточная культура адгезивных клеток. Клеточные сфероиды стандартного размера были получены с использованием трехмерного культивирования клеток надкостницы в агарозных лунках (MicroTissues Inc.®).
В качестве скаффолда использовалась коллагеновая мембрана ТМО «ЛИОПЛАСТ-С», которая извлекалась из стерильной упаковки и размещалась на дне культуральные флакона (матраса для клеточных культур) с поддающейся повторной герметизации боковой крышкой. Такой флакон позволяет производить любые манипуляции с тканеинженерной конструкцией в стерильных условиях внутри ламинарного шкафа. Для удержания коллагеновой мембраны в правильном положении проводилась установка титановой рамы сверху на коллагеновую мембрану, мембрана расправляется рамой прижимается ко дну культурального флакона, причем размер титановой рамы соответствует размеру коллагеновой мембраны таким образом, чтобы под рамой оказывалась лишь узкая полоска по краям мембраны. Пространство, образуемое коллагеновой мембраной и внутренними боковыми краями титановой рамы, используется для внесения сфероидов. Проводится укладка одного ряда клеточных сфероидов из аутологичных культивированных клеток надкостницы, клеточные сфероиды в суспензии с помощью аппликатора наносятся сверху на коллагеновую мембрану, сфероиды осаждаются под собственным весом, сфероиды распределяются по поверхности коллагеновой мембраны титановой полоской, длина которой соответствует размерам рамы. По поверхности мембраны проводится полное заполнение слоя сфероидов в 1 сфероид по высоте по всей площади верхней поверхности мембраны, ограниченной внутренними краями рамы, для выравнивания слоя сфероидов полоска перемещается по верхней поверхности ребер рамы несколько раз до равномерного распределения сфероидов. Для закрепления сфероидов и их частичного проникновения внутрь коллагеновой мембраны проводится 3D культивирование сфероидов на поверхности коллагеновой мембраны. При этом происходит тканевое слияние сфероидов с объединением коллагенового остова сфероидов между собой в единый пласт, этот этап 3D культивирования проводиться в течение 5 суток в питательной среде состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Р12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, 50 мл тромболизата (в качестве тромболизата у 3 животных использовался тромболизат кроликов, а у 3 кроликов - тромболизат тромбоцитов человека (PLTGold® Human Platelet Lysate Merck), пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл (при 100 % влажности над слоем питательной среды внутри культурального флакона и 5 % СО2 в воздушной газовой смеси), замена питательной среды во флаконе проводиться не менее 1 раз в 3 сут. Смена среды осуществляется путем аккуратной аспирации питательной среды с помощью пипеток для сохранения положения сфероидов на поверхности мембраны. Края коллагеновой мембраны, свободные от слоя сфероидов, которые были под титановой рамкой, прошиваются хирургическими рассасывающимися нитями для возможности последующего крепления тканеинженерной конструкции к свободным краям надкостницы реципиентного ложа вокруг костного дефекта при трансплантации этой тканеинженерной конструкции в живой организм. Слой сфероидов располагается снаружи, вне зависимости, в трубчатую конструкцию сворачивается коллагеновая мембрана, либо если она используется в виде заплатки. Коллагеновая мембрана всегда обращена к центру костного дефекта, внутреннее пространство ограниченное коллагеновой мембраной и поверхностями костного дефекта заполняется с помощью шприца гелем, который получен путем смешивания 2 % (масса/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl2 в 10 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с помощью стерильного Y-образного смесителя, гель отвердевает в течение 1 мин и имеет модуль Юнга 0,17 МПа, в составе геля присутствуют факторы роста TGF-β1 и FGF-2 в количестве 10 нг/мл каждый. Этот гель необходим для заполнения свободного пространства костного дефекта и поддержания тканеинженерной конструкции в расправленном состоянии в живом организме. Фактически гель необходим для реализации остеогенных потенций тканеинженерной конструкции, пространство под ТИК заполненная альгинатным гелем является по сути ин виво биореактором, внутри которого протекает репаративный остеогенез. После созревания ТИК полученная заявленным способом представляет собой трансплантат - биоискусственную надкостницу в виде эластичной тонкой пластины из коллагеновой мембраны и клеточных сфероидов из аутологичных культивированных клеток надкостницы, прилипших к мембране, слившихся между собой и частично распластанных, клетки проникают в межволоконные пространства коллагеновой мембраны и продуцируют собственные коллагеновые волокна с образованием связанного и объединяющего тканеинженерную конструкцию коллагенового остова.
Для исследований остеогенных свойств тканеинженерной надкостницы, надкостница сворачивалась в трубочку, заполнялась альгинатным гелем и помещалась в диффузную камеру 2 мм толщиной с порами 0,45 мм. Камеры позволяют пассивно диффундировать нутриентам и сигнальным молекулам из реципиента, но не вызывают иммунного ответа. Фильтры также предотвращают прямое взаимодействие между клетками донора и реципиента. Камеры были изготовлены по известной технологии (Friedenstein A.J., Chailakhyan R.K., Gerasimov U.V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet. 1987 May; 20(3):263-72. doi: 10.1111/j.1365-2184.1987.tb01309.x. PMID: 3690622).
Камеры трансплантировались в организм кроликов, причем ТИК содержал для каждого кролика аутологичный клеточный материал. Камеры пересаживались кроликам в бедро в межмышечные фасции. По 1 камере одному животному. Через 75 суток при гистологическом исследовании тканей внутри диффузной камеры обнаружен косно-хрящевой регенерат.
Claims (5)
1. Способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов субъекта, характеризующийся тем, что коллагеновую мембрану размещают на дне культурального сосуда с боковой крышкой и пропитывают коллагеновую мембрану культуральной питательной средой, далее размещают на коллагеновой мембране сверху прямоугольную выполненную из титана раму с размером сечения 4×4 мм при высоте рамы 0,5 мм, рамой прижимают края коллагеновой мембраны к дну флакона, сверху на коллагеновую мембрану, ограниченную внутренними стенками рамы, укладывают горизонтальный слой клеточных сфероидов, состоящих из агрегированных культивированных аутологичных клеток надкостницы, в один ряд, культивируют сфероиды на поверхности коллагеновой мембраны в процессе созревания тканеинженерной конструкции в питательной среде: DMEM или DMEM-F12 450 мл, L-глутамина 292 мг, тромболизата 50 мл, пенициллина 100 ед./мл, стрептомицина 100 мкг/мл при 100 % влажности и с 5 % содержанием СО2 в воздушной смеси над слоем питательной среды внутри культурального флакона, в течение 6-7 сут. с заменой культуральной питательной среды не менее 2 раз.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что используют гомосфероиды из культивированных адгезивных культивированных клеток камбиального слоя надкостницы в количестве 6000 клеток на сфероид или клеточные гетеросфероиды из адгезивных культивированных клеток надкостницы и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в соотношении 2:1 в количестве 6000-8000 клеток на сфероид.
3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что используют в качестве культуральной питательной среды среду на основе ксеногенных фетальных сывороток животных, среду на основе аутологичной и аллогенных сывороток человека, среду на основе тромболизатов крови человека, бессывороточную синтетическую среду, бессывороточную синтетическую среду с добавлением индукторов остеогенной дифференцировки.
4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что коллагеновая мембрана представляет собой стерильную децеллюляризованную надкостницу - быка, овцы, кролика или человека.
5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что используют сфероиды с размером от 250 до 500 мкм.
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2023119297A Division RU2818176C1 (ru) | 2023-07-21 | Способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов пациентов |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2022117576A RU2022117576A (ru) | 2023-12-29 |
RU2819284C2 true RU2819284C2 (ru) | 2024-05-16 |
Family
ID=
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2301677C1 (ru) * | 2005-12-09 | 2007-06-27 | ЗАО "РеМеТэкс" | Биотрансплантат для лечения дегенеративных и травматических заболеваний хрящевой ткани и способ его получения |
RU2675930C1 (ru) * | 2017-07-21 | 2018-12-25 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") | Клеточная культура и биотрансплантат для регенерации костной ткани на ее основе |
RU2721532C1 (ru) * | 2018-12-12 | 2020-05-19 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") | Клеточная культура и биотрансплантат для регенерации костной ткани на ее основе |
RU2731314C1 (ru) * | 2019-10-30 | 2020-09-01 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Способ производства клеточных сфероидов для восстановления хрящей |
RU2744664C1 (ru) * | 2020-03-02 | 2021-03-12 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Способ производства сфероидов из культивируемых клеток надкостницы для обеспечения репаративного остеогенеза |
RU2744756C1 (ru) * | 2020-06-01 | 2021-03-15 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Способ трансплантации биокомпозитных сфероидов для обеспечения возможности восстановления целостности кости при дефектах, размеры которых превышают критические |
RU2747087C1 (ru) * | 2020-08-31 | 2021-04-26 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Способ производства биокомпозитных сфероидов для восстановления костной ткани |
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2301677C1 (ru) * | 2005-12-09 | 2007-06-27 | ЗАО "РеМеТэкс" | Биотрансплантат для лечения дегенеративных и травматических заболеваний хрящевой ткани и способ его получения |
RU2675930C1 (ru) * | 2017-07-21 | 2018-12-25 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") | Клеточная культура и биотрансплантат для регенерации костной ткани на ее основе |
RU2721532C1 (ru) * | 2018-12-12 | 2020-05-19 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") | Клеточная культура и биотрансплантат для регенерации костной ткани на ее основе |
RU2731314C1 (ru) * | 2019-10-30 | 2020-09-01 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Способ производства клеточных сфероидов для восстановления хрящей |
RU2744664C1 (ru) * | 2020-03-02 | 2021-03-12 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Способ производства сфероидов из культивируемых клеток надкостницы для обеспечения репаративного остеогенеза |
RU2744756C1 (ru) * | 2020-06-01 | 2021-03-15 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Способ трансплантации биокомпозитных сфероидов для обеспечения возможности восстановления целостности кости при дефектах, размеры которых превышают критические |
RU2747087C1 (ru) * | 2020-08-31 | 2021-04-26 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Способ производства биокомпозитных сфероидов для восстановления костной ткани |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220105245A1 (en) | Bone-like prosthetic implants | |
Ringe et al. | Stem cells for regenerative medicine: advances in the engineering of tissues and organs | |
CA2441994C (en) | Composition and methods for the production of biological tissues and tissue constructs | |
EP2010193A2 (en) | Methods for bone regeneration using endothelial progenitor cell preparations | |
US11285177B2 (en) | Allografts containing viable cells and methods thereof | |
RU2425645C1 (ru) | Способ и трансплантат для лечения печеночной недостаточности | |
KR20200052302A (ko) | 지방 유래 줄기세포를 포함하는 생체재료 및 이를 생산하는 방법 | |
Endres et al. | Angiogenesis and healing with non-shrinking, fast degradeable PLGA/CaP scaffolds in critical-sized defects in the rabbit femur with or without osteogenically induced mesenchymal stem cells | |
Kim et al. | Effects of polycaprolactone-tricalcium phosphate, recombinant human bone morphogenetic protein-2 and dog mesenchymal stem cells on bone formation: pilot study in dogs | |
Martin et al. | Producing prefabricated tissues and organs via tissue engineering | |
RU2819284C2 (ru) | Способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов субъекта | |
KR20060107897A (ko) | 이식용 연골 조성물 | |
Tan et al. | The promotion of the vascularization of decalcified bone matrix in vivo by rabbit bone marrow mononuclear cell-derived endothelial cells | |
KR20110032433A (ko) | 세포이식술을 위한 혼합세포복합체인 세포스페로이드의 제조방법 및 이의 이용방법 | |
US8367059B2 (en) | Materials and methods for cryopreserved bone constructs | |
RU2645963C2 (ru) | Способ наращивания объема костной ткани гребня альвеолярного отростка челюсти | |
RU2818176C1 (ru) | Способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов пациентов | |
Feng et al. | Bone regeneration combining platelet rich plasma with engineered bone tissue | |
CN210932936U (zh) | 一种组织工程骨 | |
RU2744732C1 (ru) | Биокомпозитный сфероид для восстановления костей и способ его получения | |
CN111214707A (zh) | 一种破骨细胞前体和间充质干细胞作为种子细胞的基质依赖型组织工程骨及其构建方法 | |
RU2240135C1 (ru) | Культура клеток, содержащая клетки-предшественники остеогенеза, имплантат на ее основе и его использование для восстановления целостности кости | |
KR20180087870A (ko) | 골재생용 세포 치료제 및 이것의 제조 방법 | |
RU2744756C1 (ru) | Способ трансплантации биокомпозитных сфероидов для обеспечения возможности восстановления целостности кости при дефектах, размеры которых превышают критические | |
RU2807692C2 (ru) | Способ получения трансплантата - тканеинженерной надхрящницы на основе клеточных сфероидов |