KR20110032433A

KR20110032433A - 세포이식술을 위한 혼합세포복합체인 세포스페로이드의 제조방법 및 이의 이용방법

Info

Publication number: KR20110032433A
Application number: KR1020090089912A
Authority: KR
Inventors: 이정익
Original assignee: 이정익
Priority date: 2009-09-23
Filing date: 2009-09-23
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2029-09-23
Also published as: WO2011037416A9; WO2011037416A3; KR101649375B1; WO2011037416A2

Abstract

[과제]

본 발명자는 임상에 효과적이면서 실질적으로 이용 가능한 이식치료용 세포스페로이드를 제공함으로, 정상에서 벗어난 질병상태에 있는, 일부 혹은 전부의 손상 또는 결손된 환부에 이식치료하기 위한 것으로서, 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 본 발명를 이용한 각 질환에 대한 치료법 그리고, 피검물질의 약효 및 독성을 평가하기 위한 시스템으로서 상당히 유용한 것이라는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

[해결수단]

본 발명의 한 관점에 의하면, (1) 혼합세포복합체를 구성하는 각세포재료를 분리준비하는 단계 ; (2) 상기분리 된세포를 계대배양하여 증폭하는 단계 ; (3) 1 종류 혹은 2 종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하고 세포를 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양을 함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조하는 단계 ; 및 (4) 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계를 포함한 이식세포치료용 스페로이드의 제조방법 및 이용방법을 제공한다.

세포스페로이드, 연골세포, 활막유래세포, 간엽계줄기세포, 자가연골세포이식술(autologous chondrocyte implantation), 성체줄기세포, 췌도이식, 췌도세포, 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC), 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC)

Description

세포이식술을 위한 혼합세포복합체인 세포스페로이드의 제조방법 및 이의 이용방법{The method of manufacturing the transplantable spheroids of mixed cellular complexes for cell transplantation and the usage of the same}

본 발명은, 혼합세포복합체가 유전성 질환, 전염성 질환 및 퇴행성질환 등에 의하여 자기조직 재생치료능력의 항상성(Homeostasis)의 균형에 문제가 생김으로 자력으로는 치유에 이르지 못하는 즉, 정상에서 벗어난 질병상태에 있는, 일부 혹은 전부의 손상 또는 결손된 환부에 이식치료하기 위한 것으로서, 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들의 집합인 세포스페로이드의 제조방법에 관한 것으로, 각 동물 신체내의 각각의 조직의 생물학, 의학 등의 분야에 관한 것이다.

혼합세포복합체는 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들(예를 들면 연골조직에 있어서, 연골양조직으로서 형질발현된 세포스페로이드, 췌장조직에 있어서, 인슐린 등을 분비하는 췌도내분비세포로서 형질발현된 세포스페로이드) 로 구성되는 각세포재료를 분리준비하고, 분리준비된 각세포를 계대배양하여 증폭한 후, 1 종류 혹은 2 종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료 혼탁액을 준비하고 진탕배양(Shaking culture)함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조하여 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계를 포함한 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법 및 이의 이용방법에 관한 것이다.

세포치료이식술은 학문 분야에서는 연구의 수단으로, 산업분야에서는 기술개발의 도구로 점점 그 활용의 폭을 확대해 가고 있다. 이러한 세포치료이식술은 여러산업들에 끼치는 파급효과가 커서 국가산업 측면에서 중요성이 부각되고 있다.

세포치료이식술에 사용되는 세포치료제(cell therapy product)는 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 혹은 이종(xenegenic)의 세포를 체외환경(in vitro)에서 배양과정을 통해, 분리, 증식 및 선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용하는 의약품을 칭한다.

세포치료제를 이용한 세포치료이식술에서 사용되는 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들로 구성되는 각세포재료를 분리준비하고, 체외환경(in vitro)에서 배양과정을 통해, 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 일련의 행위를 가하여, 이식물을 수령할 개체에게 주입하거나, 이들 세포로 인체조직을 만듬으로서 치료용으로 쓰이게 된다.

세포치료이식술에 사용되는 세포치료제는 세포 단위이기 때문에 특정 기능( 예, 호르몬의 분비, 특이항원을 인식하는 기능 등)을 새롭게 보유하게 하거나, 본래 갖고 있던 특정 기능이 더욱 증진되도록 유전적으로 변형된 세포일 수도 있으며, 이들 세포치료제는 사용하는 세포의 분화도 정도에 따라서 성체세포치료제와 줄기세포치료제로 구분될 수 있다.

성체세포치료제의 예로는, 연골조직 및 골조직의 손상을 치료하기 위한 자가연골세포이식술에 이용되는 자가연골세포 또는 골세포, 당뇨병 치료를 위한 췌도세포, 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 질환상태를 치료하기 위한 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포, 피부의 재생을 위한 표피세포, 파킨슨씨 병 치료를 위한 태아 신경세포(fetal neural cell)를 포함하는 각종 도파민 분비세포, 암 및 면역질환의 치료를 위한 자연살해세포(natural killer cell), 수지상세포(dendritic cell) 및 세포 독성 T 세포(cytotoxic T cell), 각막손상의 치료를 위한 각막세포 등이 있다. 그 밖에도 신체를 구성하는 각종하는 장기 또는 조직으로부터 유래된 세포들도 성체세포치료제로서 사용될 수 있는데 이들은, 이식하고자 하는 장기 또는 조직을 잘게 절단하여 수득한 마이크로 단위의 다수의 세포들의 집합 혹은 절편일 수도 있다.

한편, 줄기세포치료제는, 미분화도가 높고 다능성(multi-potency) 및 고도의 증식능을 보이는 각종 조직 유래의 줄기세포를 이용하는 면에 있어서, 이들 줄기세포들은 배아줄기세포(ES 세포)와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하여 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 용이한 분화능을 보유하여 손상환부 에 이식하는 것으로 치료효과를 나타내므로써 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 1 종류 혹은 2 종류 이상의 세포를 분리하여 목적으로 한 세포로 분화시킨 후 얻은 세포를 이용하게 된다.

세포치료이식술에 사용되는 세포치료제에 의한 치료는 환자에게 직접 세포를 주입하여 손상된 세포의 기능이나 조직을 재생 수복할 수 있으므로 신체내에서 독성이 없으며 신체 조직의 본래의 기능을 재생 및 유지시킴으로써 수술요법이나 약물요법이 할 수 없는 근원적인 치료방법(radical therapy)가 될 수 있다.

이러한 세포치료제를 이용한 치료대상이 될 수 있는 대표적인 질환과 이 때 사용되는 세포들은, 연골조직 및 골조직의 손상을 치료하기 위한 자가연골세포이식술에 이용되는 자가연골세포 또는 골세포, 당뇨병 치료를 위한 췌도세포, 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 질환상태를 치료하기 위한 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포이며 이들의 배경을 부연하여 설명하자면 아래와 같다.

한국, 일본 및 구미의 국가 등은 이미 고령화사회를 맞고 있으며 평균수명도 세계 최고 수준이 되고 있다. 사람들의 희망은 단순한 생명연장보다는 더욱 건강하게 만족하면서 살 수 있도록 삶의 질(Quality of Life, QOL)에 중점을 두기 시작했다. 이중에서도 주목되는 한가지로 운동기능장해를 들 수 있다.

운동기능장해의 원인이 되는 관절염에는 여러가지의 질환이 포함되지만, 미국의 경우 2002 년에 7,000 만명이상의 환자가 관절염과 관련된 질환이나 만성관절증상을 주증으로 하여 의료시설에 내원하였다. 이 것은 성인 3 명중에 1 명꼴의 빈 도이며 게다가 2020 년까지는 이의 두배에 다라는 환자가 증가할 것으로 예상되고 있다.

일상생활의 불편함이 생기는 환자의 비율은 심혈관계질환을 뒤로 제 2 위로 뒤를 이으로 있으며, 1 년간 863 억달러라는 의료비가 사용되고 있다. 그리고 고령화사회에 가장 많이 발병하는 퇴행성관절염(Osteoarthritis, 변형성관절증)은 주요한 원인의 하나이며, 일본의 동경대학교 22 세기의료센터의 조사에서도 2,400 만명을 우회할것이라고 추정하고 있다. 일본에서도 환자수가 많아, 45 내지 65 세에서 30％, 65 세이상에서는 63％ 내지 85％의 유병율을 나타내며, 매년 90 만명의 새로운환자가 발생한다고 추정하고 있다. 퇴행성관절염으로 대표적인 운동기질환은 실질장기의 질환과 다르게 직접생명을 위협하는 것은 적지만, 인간의 손과 발의 자유를 빼앗아 그 QOL 을 현저하게 저하시킨다. 이러한 운동기질환은 향후 고령화사회에 의하여 점점 더 증가할 것으로 예측되며 이러한 장해에 의한 인적, 사회적손실은 상당한 수준이라고 할 수 있다.

이러한 운동기질환의 대부분은 연골조직, 골조직이 염증 혹은 손상을 당하는 것이 원인이다. 현재 중도의 심한 질환의 경우, 금속과 고분자량의 폴리에틸엔으로 만들어진 인공관절을 이용하여 치료에 적용하고 있지만, 인공관절로 치환 후 10 년이상 경과하면 마찰에 의한 마모분에 의하여 각종 원치않는 생체반응을 야기시키게 되는 것 등의 이유로 적용환자의 제한이 있다. 이러한 문제들을 해결하기 위하여 내마모성을 항상시키는 연구가 행하여지고 있으나 내마모성에 있어는 한계가 있게된다.

1994 년 Brittberg 등이 관절의 비과중부로부터 관절연골을 채취하여 분리한 연골조직세포를 배양하여 과중부의 골연골전층결손부에 이식하는 치료법(자가연골세포이식술, Autologous Chondrocyte Implantation)을 보고(Brittiberg 등, New England Journal of Medicine, 331(14),889(1994))한 이후 1997 년에 FDA 에 허가되었고 이미 비지니스화되어 전세계적으로 2 만건이상의 증례에 대하여 실시된 바 있는 실적이 있다. 2 년 내지 10 년 경과한 219 례의 중장기적인 성적은 양호했으며 89％에서 기능개선이 확인되었다(Peterson L, 6^th Annu. Meet., American Academic Orthopaedic Surgery(1998)). 한편, 2002 년에는 이식후 세균감염에 의한 사망사례의 보고가 있었으며 아직 CDC 의 조사에 의하면 41 례의 시술후 감염례가 확인되었고, 일본에서도 후생노동성건강국으로부터 일본정형외과학회에 이러한 사례에 대한 정보제공이 있었다는 것은 신중하게 재고되야할 문제점이 있다는 것을 재확인 하게 되었다. 또한, 이러한 방법에 있어서도 고령자에게 다발하는 광범위한 연골조직 및 골조직의 변성 또는 부분결손을 동반하는 퇴행성관절염에는 이용할 수 없는 등 아직도 개선되어야 되어야 할 부분이 많이 있다고 할 수 있다.

일본내에서도 비과중부의 관절연골로부터 분리한 연골세포 또는 골수유래의 간엽계줄기세포를 이용하여 조직공학적으로 연골조직을 제조하여 골연골전층결손례에 있어서 임상응용을 시작하고 있다, 그러나, 이러한 임상응용례는 외상성의 골연골손상 또는 이단성골연골염으로서 연골결손범위가 원래부터 적은 증례에 적용하는 데에 그쳤왔다(일본 특허등록문헌: 특원 2001-384446(특개 2003-180819 호 공보), 특원 2002-216561(특개 2003-111831 호 공보), 특원 2003-58118 공보(특개 2004-136096 호 공보)). 현재로서는, 인공관절치환술로 안정적인 치료성적을 얻고 있기 때문에 광범위의 연골조직 및 골조직의 변성 또는 부분결손을 동반하는 퇴행성관절염의 치료에는 적용외로서 이용되지 않고 있었다. 또한, 이들 기술의 대부분이 연골조직, 골조직은 대부분이 단일종류의 세포들로 제조된 것으로(즉, 연골세포 단독, 골세포 단독 혹은 줄기세포 단독), 배양세포로부터 생산되는 단백질 이외에도 추가적인 물질로서, 이식되어지는 단일세포현탁액이 이식환부로부터 이탈하는 것을 방지하기 위한 물질인 단백질, 당류 또는 인공바이오매터리얼로 형성된 지지체인 조직재생용기재를 보조적 혹은 보완적으로 이용하기 때문에, 이들 지지체 자체가 야기시키는 이물반응 및 생체내적합성이 떨어지는 등의 결점 등으로 인한 생체의 직접적인 영향이 해결되야 될 문제점으로 거명되고 있다. 따라서 현실적으로는 실제적으로 임상적용이 용이하지 않은 이러한 문제점들을 고려하면 이러한 지지체를 사용을 최소한으로 하는 기술의 개발이 절실하게 필요한 시점에 있다고 할 수 있다.

한편, 퇴행성관절염의 치료를 기초연구적인 면으로부터 적극적으로 수행하고 있는 Hunziker 등은 퇴행성관절염의 병태는 연골의 변성 및 연골조직의 손상이 연골하골까지 도달하지 않는 부분결손에 있다는 것에 착안하게 되며 관절연골의 부분결손모델을 이용하여 기초연구를 행해오고 있다. 이때 연골의 수복 및 재생의 중심적인 역할은 연골세포가 아니고 활막세포가 한다는 견해를 보고하고 있다(Hunziker 등, The journal of Bone and Joint Surgery, 78-A,721(1996)). 하지만, 이러한 기 술도 치료가능한 범위가 작다는 점이 광범위한 변성에 대한 실직적인 치료법으로써 실현가능성이 떨어지고 광범위한 골연골결손에 대한 초기치료기술의 확립이 절실하게 필요한 시점에 있다고 할 수 있다.

생체내의 각조직에는 성체줄기세포의 존재가 확인되었으며 각종조직유래의 간엽계줄기세포 역시 국소적인 존재가 규명되고 있다. 특히 이들중의 활막유래세포 및 골수유래세포에서는 연골세포로 분화능력을 보유한 간엽계줄기세포를 이용함으로써 연골양조직으로서 형질발현시킨 조직으로 분화시켜 생체밖 및 생체내(in vivo) 환경에서 재건축에 성공하였다는 다수의 연구가 보고되고 있다. 성체줄기세포는 생체를 구성하는 각종조직으로의 분화, 재생이 가능하며 특히 생체밖에서의 배양과정에 의하여 일반조직유래의 체성세포와 비교하여 증식능이 월등히 높다. 이렇게 월등하게 높은 증식율을 보유한 간엽계줄기세포는 발생학적인 면이나 분화라는 관점에서도 유리하다고 사료된다. 한편 Sekiya 등은 활막유래의 세포를 이용하여 생체밖 및 생체내 환경에서 연골조직결손부위에 대한 우수한 재생 및 수복을 확인한 바가 있다(Sekiya 등, Stem cell, 25,689(2007)). Chen 등은, 활막유래세포를 골수세포와 공동배양시킨 결과 연골조직으로의 분화가 되었음을 확인한 바가 있다(Chen 등, Spine, 34-12,1272(2009)). Anderer 등은, 연골조직으로의 분화를 위하여, 배양세포로부터 생산되는 단백질 이외로도 성장인자등의 단백질의 추가로 넣어서 조성시킨 연골분화유도배양액을 사용하지 않고 단지 통상적인 세포배양에 사용되는 배양액만으로 연골재생에 성공한 바가 있다(Anderer 등, Journal of Bone and Mineral Research, 17-8,1420(2002)).

한편, 당뇨병(Diabetes)은 '인슐린 의존형 당뇨병 (insulin dependent diabetes)'과 '인슐린 비-의존형 당뇨병 (insulin independent diabetes)'으로 크게 나뉘어지지만, 상기 2 종류의 당뇨병을 구별하는 정확한 당뇨병 발생 기작은 아직까지는 밝혀지지 않은 실정이다. 상기 2 종류의 당뇨병 중에서 '인슐린 의존형 당뇨병' 환 자는, 인슐린을 생성하는 능력이 크게 떨어져 있기 때문에 외부로부터 인슐린을 계속적으로 공급받아야 한다. 그러나, 생리적인 요구에 알맞게 인슐린을 계속적으로 공급하기는 거의 불가능하며, 더욱이 체내에서는 인슐린이 농도 구배로 존재하여 '간문맥 →간 →간정맥 →대동맥 →근육'의 순서로 인슐린의 농도가 감소하고 있어서, 외부로부터 인슐린을 체내로 주사하게 되면 이러한 농도 구배가 형성되지 못하여 부작용이 발생하게 된다.

또한, 췌장의 베타-세포에서는 인슐린 이외에도 11 종류 이상의 다른 물질이 함께 분비되어 대사를 원활히 유지시키므로, 인슐린만을 투여하여서는 혈당을 강하시킬 수는 있으나 저혈당 방지 및 기타의 합병증 치료는 불가능하다. 게다가, 당뇨병 치료를 위해 사용하는 혈당 강하제는, 혈당 강하 기능은 있으나, 강하제 내성이 나타나 장기간 사용하기가 어렵고 신체 부작용이 심하여 사용하지 않고 있다. 이에 대한 대안으로서, 췌도 이식은 중증의 인슐린 의존성의 1 형 당뇨병에 대한 새로운 치료방법이다. 인슐린의 투여만으로는 해결되지 않는 신부전증 망막증을 비롯한 신경장애 족부괴양 등의 속발증 등을 휴유증 없이 치료할 수 있다는 점에서 근본 치료법으로 주목 받아 최근에는 임상시술 보고가 세계적으로 매년 증가하고 있다.

각종 방식을 통하여 최근에 면역 거부 반응을 없애고 췌도를 이종간에 이식 을 위한 연구들이 (Shapiro 등, Lancet 358 Suppl, S21, (2001), Lee 등, Cell Transplantation 17, 51, (2008)).

한편, 본 발명자도 췌도이식에 있어서, 면역격리를 위하여 이식물을 수령할 개체 유래의 탄성연골을 이용하여, 이식할 췌도를 감싸는 마이크로 입자를 개발하여 제시 한 바 있다(한국 특허등록문헌: 특허제 10-0788800 호 (WO/2008/002059)).

하지만, 현재로서는 이식할 췌도의 공급이 절대적으로 부족한 실정이어서, 정상상태에서 조직학적으로 여러종류의 내분비세포들을 포함하는 혼합세포복합체인 췌도에서 소정의 처리를 하여 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC)를 증식시키는 방법을 포함하는 여러 가지 방법으로 췌도를 대량증식시키고 상기의 대량증식된 세포들을 포함하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조를 통한 세포이식술의 치료법으로 사용될 수 있는 방법들을 고려해 볼 수 있다.

또한, 심혈관계의 형성은 발생단계에 있어서도 초기단계에 일어나는 현상에 한가지이며 성체가 된 후에도 인생에 걸쳐서 신생, 수복, 사멸의 반복된 동적인 구조를 같는다. 최근에는 줄기세포 또는 재생의학의 현저한 발전과 더불어 초기발생단계 뿐만 아니라 성체가 되어서도 그 후에 일어나는 혈관수복에 있어서 각종 조직손상에 대한 능동적인 처치를 행하면서 혈관형성에 중요한 역할을 하는 세포가 주목 받고 있다.

혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC)은 말초혈액중에 존재하는 단핵구성분에 한가지에 속하면서, 혈관형성 혈관신생을 담당하는 골수조직에 서 증식과 분화하고, 혈관형성이 진행중인 장소로 이동하여 신생혈관형성에 있어서 중요한 기능을 보유한 세포라는 것이 알려져 있다(Asahara 등, Science 275, 964, (1997), Asahara 등, EMBO J,18,3964(1999), Takahashi 등, Nature Medicine, 4,434 (1999)). 현재, 임상에 있어서도, 중증의 허혈성질화인 관상동맥 질환, 하지허혈성 질환 등에 대하여 혈관내피전구세포이식치료에 의한 혈관재생요법이 시도되고 있다(일본 특허등록문헌:특원 2005-286607(특개 2007-89537)). 이러한 것을 고려하면, 심혈관계 및 각종조직 및 장기의 재생능력을 혈과내피전구세포가 증강시키는 역할이 기대가 되고 있다. 혈관내피천구세포를 더욱 적극적으로 임상에 응용하기 위해서는 극히 미량의 수로 존재하는 혈과내피전구세포를 양적으로나 기능적으로 개선시켜서 이용할 필요가 있다.

혈관내피전구세포를 혈관재생 치료에 응용하려고 하는 움직임은 여러 배아줄기세포나 다른 조직 특이적 성체 줄기세포 보다 이들 혈관내피전구세포가 갖고 있는 우수한 몇가지 점으로 설명되어 질 수 있다. 즉, 환자 자신의 혈액이나 골수 조직을 이용하여 자신의 조직 재생에 쓰여질 수 있다 는 점 이외에도 EPC 가 가지는 독특한 치료 합목적적인 성질에서 기인한다. 혈관내피전구세포는, 1) 다른 세포로의 변이(특히, 병적인 암세포로의 전이)가 빈번히 일어나지 않고, 2) VEGF(Vascular Endthelial Growth Factor), Angiopoietin-1, HGF 등 혈관 재생인자를 다량 분비를 하면서, 3) 조직내에서 혈관 신생에 적극적으로 작용한다는 점, 4) 이식 되어진 세포들의 Half life 는 비교적 짧다는 점이 혈관재생을 통한 심혈관계 질환에 대한 임상치료 응용에 가장 적합한 세포이다.

상기 정상에서 벗어난 질병상태는, 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 실질조직의 불완전한 질환상태로서, 특히 신체는 혈관계가 거의 모든 조직에 분포함으로 이러한 혈관계의 각종 원인에 건강하지 못한 상태에서 기인한 질환들은 새로운 신생혈관의 재생으로 건강한 심혈관계의 재구축이 필요하게 되는데 이러한 경우에 혈관을 구성하는 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포 등의 동원(recruit) 혹은 이러한 세포들의 세포이식술에 의해 이식 후 심장근육세포를 대신할 조직으로 혹은 혈관신생(Neoangiogenesis)의 유도가 필요한 신체내 각종 조직에 있어서 상기의 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포 등을 포함하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조를 통한 세포이식술의 치료법으로 사용될 수 있는 방법들을 고려해 볼 수 있다.

이러한 상기의 연구결과를 고려하면, 간엽계줄기세포, 췌도에서 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC) 및, 혈관내피전구세포 등을 혼합세포복합체인 이식치료용 세포스페로이드의 제조에 사용하는 재료로 선택하여 발명을 완성하기에 이르렀다.

특히, 통상적인 세포배양조건하에서도 간엽계줄기세포, 췌도에서 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC) 및, 혈관내피전구세포 등는 높은 증식능을 갖으며, 연골조직, 췌도조직 및 혈관조직으로의 용이한 분화능을 보유하는 것은 단기간내에 소정의 목표로 한 양의 이식치료용 세포스페로이드의 제조가 가능하게 된다.

새로운 해결방법으로 최근에 세포를 생체밖(in vitro)에서 배양하여 배양한 세포 혹은 조직을 환자에 적용하려는 기술들이 다수 보고되고 있다. 이런경우, 한종류의 세포 혹은 조직을 생체친화성 재료 또는 생체흡수성 재료인 인공바이오매터리얼로 형성된 지지체(Scaffold)인 조직재생용기재 또는 배양액 혹은 운반용용액과 동시에 구성된 구조물로서 이용하여, 자기치유능력에 의하여 생체내에서 조직을 재생키키는 기술인 조직공학기술(Langer 등, Science 260, 920, (1993)) 및 재생의료(Petit-Zeman, Nature Biotechnology 19, 201, (2001))를 이용한 연골조직 및 골조직의 치료, 당뇨병 치료 및 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 질환상태를 위한 치료 등을 포함한 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직들 세포로 인체조직을 만듬으로서 치료용으로 쓰는 치료가 주목받고 있다.

한편, 지금까지 이러한 조직공학 및 재생의료에 의해 개발되 온 연골조직 및 골조직의 손상을 치료하기 위한 자가연골세포이식술에 이용되는 자가연골세포 또는 골세포, 당뇨병 치료를 위한 췌도세포, 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 질환상태를 치료하기 위한 혈관내피세포, 혈관내피전구세포, 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포 등의 생체밖의 환경에서 준비된 이식이 가능한 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 재생조직과 이 구조물을 구성하는, 관련 이식세포들은 대부분이 단일종류의 세포들로 제조된 것들이 주류였다.

이러한 치료중 연골조직 및 골조직의 치료, 당뇨병 치료 및 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 질환상태를 위한 치료로는 환부에 배양한 자가연골세포이식술에 이용되는 자가연골세포 또는 골세포, 췌도에서 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC), 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포 혹은 이들로 만들어진 각각의 조직을 이식하는 방법을 고려할 수 있다.

[선행기술문헌]

[비특허문헌]

[비특허문헌 1] Langer 등, Science 260, 920, (1993)

[비특허문헌 2] Petit-Zemane, Nature Biotechnology 19, 201, (2001)

[비특허문헌 3] Brittiberg 등, New England Journal of Medicine, 331(14),889(1994)

[비특허문헌 4] Peterson L, 6^th Annu. Meet., American Academic Orthopaedic Surgery(1998)

[비특허문헌 5] Hunziker 등, The journal of Bone and Joint Surgery, 78-A,721(1996)

[비특허문헌 6] Sekiya 등, Stem cell, 25,689(2007)

[비특허문헌 7] Chen 등, Spine, 34-12,1272(2009)

[비특허문헌 8] Anderer 등, Journal of Bone and Mineral Research, 17- 8,1420(2002)

[비특허문헌 9] Shapiro 등, Lancet 358 Suppl, S21, (2001),

[비특허문헌 10] Lee 등, Cell Transplantation 17, 51, (2008)

[비특허문헌 11] Asahara 등, Science 275, 964, (1997),

[비특허문헌 12] Asahara 등, EMBO J,18,3964(1999)

[비특허문헌 13] Takahashi 등, Nature Medicine, 4,434 (1999)

[특허문헌]

[특허문헌 1] 일본 특허등록문헌: 特開 2003-180819

報

[특허문헌 2] 일본 특허등록문헌: 特開 2003-111831

報

[특허문헌 3] 일본 특허등록문헌: 特開 2004-136096

報

[특허문헌 4] 한국 특허등록문헌: 특허제 10-0788800 호

[특허문헌 5] 일본 특허등록문헌: 特開 2007-89537

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본 발명자는 임상에 효과적이면서 실질적으로 이용가능한 혼합세포복합체의 이식치료용 세포스페로이드를 제공하기 위하여, 혼합세포복합체는 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들의 집합인 세포스페로이드 및 혼합세포복합체를 구성하는 각 세포재료를 분리준비하고, 상기분리된 세포를 계대배양하여 증폭한 후, 1 종류 혹은 2 종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁 액을 준비하고 진탕배양(Shaking culture)함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조하여 제조된 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계를 포함한 이식치료용 세포 스페로이드의 제조방법 및 이를 이용한 치료법 그리고, 치료용의 목적과는 별도로 화합물, 약제, 독성물질 등의 피검물질의 약효 및 독성의 생리작용 혹은 독성를 평가하기 위한 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 이식치료용 세포스페로이드를 구성하는 각세포재료는, 연골조직 및 골조직의 손상을 치료하기 위한 자가연골세포이식술에서 응용될 경우, 자가연골세포 또는 골세포 연골세포의 단독 사용 뿐 만 아니라 1 종류 혹은 2 종류이상의 높은 증식능을 갖으며, 연골조직으로의 용이한 분화능을 보유하는 각종 줄기세포 혹은 연골전구세포 등을 이용하는 것으로 연골양조직으로서 형질발현된 이식치료용 세포스페로이드의 대량의 준비가 가능하게 되어, 고령자에게 다발하는 광범위한 연골조직 및 골조직의 변성 또는 연골의 변성 및 연골조직의 손상이 연골하골까지 도달하지 않는 부분결손 등에 대한 치료기술의 확립이라는 면에서도 상당히 유용하게 된다.

또한, 이식치료용 세포스페로이드를 구성하는 각세포재료는 당뇨병 치료를 위한 췌도세포 혹은 췌도에서 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC), 혹은, 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 질환상태를 치료하기 위한 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포들로 대량 증 식과정을 거친 후 이용함으로써 췌도조직 및 혈관조직으로의 형질발현된 이식치료용 세포스페로이드의 대량의 준비가 가능하게 되어, 임상췌도이식에 있어서 고질적인 장기부족에 의한 이식할 췌도의 공급이 절대적으로 부족한 실정에 대한 대안이 될수 있고, 특히, 이식치료용으로 단일세포로 구성된 세포현탁액이 아니고 1 종류 혹은 상호보안의 관계인 2 종류 이상의 3 차원구조를 갖는 다수의 세포들의 집합인 세포스페로이드를 이용하게 됨으로써 본래 갖고 있던 특정 기능을 더욱 증진하게 되고 이식후 세포가 흩어져서 분포하지 않고 세포스페로이드의 구조안에서 각구성세포들과 커뮤니케이션 할 수 있는 긴밀히 접척이 가능한 면에서도 상당히 유용하게 된다. 그밖에 사용하는 세포의 특성에 따라 면역격리능 등의 새로운 기능을 보유 할수 도 있어 유용하게 된다.

본 발명은 상기 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법 그리고 이용방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 한 관점으로서, 혼합세포복합체가, 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들의 집합인 이식치료용 세포스페로이드를 제공한다.

다른 관점으로서, (1) 혼합세포복합체를 구성하는 각 세포재료를 분리준비하는 단계 ; (2) 상기분리된 세포를 계대배양하여 증폭하는 단계 ; (3) 1 종류 혹은 2 종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하고 세포를 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양을 함으로써 세포재료들을 상호접착시 켜 혼합세포복합체를 제조하는 단계 ; 및 (4) 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계를 포함한 이식세포치료용 스페로이드의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 이식치료용 세포스페로이드는 혼합세포복합체를 구성하는 각세포재료가 연골조직 및 골조직의 손상을 치료하기 위한 자가연골세포이식술에서 응용될 경우, 자가연골세포 또는 골세포 연골세포의 단독 사용 뿐 만 아니라 1 종류 혹은 2 종류이상의 높은 증식능을 갖으며, 연골조직으로의 용이한 분화능을 보유하는 각종 줄기세포 혹은 연골전구세포 등을 이용하는 것으로 연골양조직으로서 형질발현된 이식치료용 세포스페로이드의 대량의 준비가 가능하게 되어, 고령자에게 다발하는 광범위한 연골조직 및 골조직의 변성 또는 연골의 변성 및 연골조직의 손상이 연골하골까지 도달하지 않는 부분결손 등에 대한 치료기술의 확립이라는 면에서도 상당히 유용한 수단이다. 게다가 본 발명은 골막패치를 사용하지 않기 때문에 통상적인 자가연골세포이식술과 비교하여 환자측의 부담을 경감시킬 수 있으며 절개부위를 최소한으로 할 수 있어 수술에 의한 침윤 또한 줄일수 있게 된다.

한편, 본 발명자들은 지금까지 조직공학적수법에 의한 연골재생에 적합한 담체제조에 관한 연구, 지적인 세포외환경의 구축에 관한 연구, 조직공학적으로 제조된 연골의 동종이식에 의한 연골재생에 관한 연구, 그리고 인공재료인 지지체를 사용하지 않는 연골세포시트 혹은 재생연골 plate 에 의한연골수복·재생에 관한 연구등에서 성과를 내고 있다. 이들 결과들로 부터 손상을 치료하기 위해서는 손상부 위로 동원되는 간엽계줄기세포 등의 존재가 필수조건이고 조직수복·재생에 필요최소한의 연골유도 initiator 로서 조직공학적인 연골성분의 존재가 중요한 것이라는 의견을 제시하고 있다.

또한, 상기의 본 발명자들의 의견을 고려하면 상기 연골조직표층부터 연골하골까지 도달하지 못한 부분결손은 다능성 및 증식능이 있고 연골조직으로 용이한 분화능을 보유한 간엽계줄기세포의 동원이 적어 결과적으로 조직수복·재생이 충분치 못한 불완전한 치료밖에 기대되지 않는 경우가 다수이다. 본 발명에 의한 활막유래, 골수유래등의 간엽계줄기세포와 연골세포를 혼합세포체로 하여 제조한 이식치료용 세포스페로이드는 상기의 조건을 만족시키기 때문에 양호한 조직수복·재생의 결과를 기대할 수 있다.

또한, 이식치료용 세포스페로이드를 구성하는 각세포재료는 당뇨병 치료를 위한 췌도세포 혹은 췌도에서 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC), 혹은, 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 질환상태를 치료하기 위한 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포들로 대량 증식과정을 거친 후 이용함으로써 췌도조직 및 혈관조직으로의 형질발현된 이식치료용 세포스페로이드의 대량의 준비가 가능하게 되어, 임상췌도이식에 있어서 고질적인 장기부족에 의한 이식할 췌도의 공급이 절대적으로 부족한 실정에 대한 대안이 될수 있고, 특히, 이식치료용으로 단일세포로 구성된 세포현탁액이 아니고 1 종류 혹은 상호보안의 관계인 2 종류 이상의 3 차원구조를 갖는 다수의 세포들의 집합인 세포스페로이드를 이용하게 됨으로써 본래 갖고 있던 특정 기능을 더욱 증진하게 되고 이식후 세포가 흩어져서 분포하지 않고 세포스페로이드의 구조안에서 각구성세포들과 커뮤니케이션 할 수 있는 긴밀히 접척이 가능한 면에서도 상당히 유용하게 된다. 그밖에 사용하는 세포의 특성에 따라 면역격리능 등의 새로운 기능을 보유 할수 도 있어 유용하게 된다.

본 발명은, 혼합세포복합체가, 혼합세포복합체가, 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들의 집합인 이식치료용 세포스페로이드로서 관절염, 관절증, 연골손상, 연골골손상, 반월판손상, 추간판변성 혹은 퇴행성관절염(Osteoarthritis, 변형성관절증), 또는 골조직의 일부를 손상 혹은 결손, 인슐린 의존성 제 1 형 당뇨병 혹은 인슐린 비의존성 당뇨병의 유형을 포함하는 췌도세포이식술이 치료법으로 사용될 수 있는 질환 혹은 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 실질조직의 불완전한 질환 등의 치료를 위한 이식치료용 세포스페로이드에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 "혼합세포복합체"는 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들의 집합인 세포스페로이드를 의미하지만, 각 해당 제공 조직 유래의 고유의 기능을 발휘하는 최종 분화단계의 성체세포, 상기 성체세포의 전구세포 및 아세포 및 미분화도가 높고 다능성(multi-potency) 및 고도의 증식능을 보이는 각종 조직 유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하여 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 용이한 분화능을 보유하여 연골조직, 췌도조직 또는 혈관조직의 등의 손상환부에 이식하는 것으로 치료효과를 나타내므로써 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 1 종류 혹은 2 종류 이상의 세포로 구성된 다수의 세포들의 집합인 것을 특징으로 하는 세포스페로이드일 수도 있다. 이것은 다능성을 보유한세포는 미분화세포이기 때문에 이식후 이식된 부위의 생체조직에 적합한 세포로 분화할 것으로 예상되기 때문이다.

또한, 신체내 정상적 혹은 건강한 상태의 개체로부터 유래한 이식하고자 하는 장기 또는 조직을 잘게 절단하여 수득한 마이크로 단위의 다수의 세포들의 집합 혹은 절편에서 유래한 세포로 구성된 세포스페로이드일 수도 있다.

혼합세포복합체는 면역거부반응이나 윤리적인 문제가 없는 이상적인 세포이식을 위해여 자가조직유래의 세포재료인 경우가 바람직하지만 연골조직은 정상상태에서는 혈관, 신경, 림프관이 없어서 백혈구 등 염증 세포의 침입이 불가능하기 때문에 이식시에 면역거부반응을 유발시키기 어려운 낮은 면역원성을 보이는 면역특권(immune-privilege)을 보유하는 조직으로서 알려져 있는 것으로부터 동종 혹은 이종의 조직으로부터 유래하는 세포 또는 이들중의 2 종류이상의 세포일 수도 있다.

본 발명에서 이용 목적에 따라서 선택할 수 있는 각 해당 제공 조직 유래의 각 세포재료는 특별히 제한적이지 않다. 한 양태로서 고유의 기능을 발휘하는 최종 분화단계의 성체세포로서 연골세포이외에도, 내분비 기능을 담당하는 세포인 경우에 특정 질병을 치료하는데 탁월한 효과를 기대할 수 있어 바람직하다. 일례로 이식물이 췌장 유래인 경우에는 당뇨병을 치료하는데, 이식물이 갑상선 유래인 경우에는 갑상선 기능 저하증을 치료하는데 각각 이용될 수 있다. 다른 예로 이식물이 에리스포이에틴를 분비하는 세포, 성장호르몬을 분비하는 세포 또는 혈액응고 인자를 분비하는 세포인 경우에는 각각 빈혈, 왜소증, 혈우병을 치료하는데 이용될 수 있다. 또 다른 양태로서, 통상적으로 정보가 공개되고 관련기관을 통해 구입이나 양도가 가능한 수립세포주인 경우에도 치료 및 피검물질의 약효 또는 독성을 평가하는 시스템으로서 이용될 수 있다.

본 발명에 있어서 혼합세포체의 이식치료용 세포스페로이드는 크기가 10 ㎛ 내지 1,500 ㎛의 범위인 것을 치료에 사용하는 것이 바람직하다. 이식치료용 세포스페로이드는 크기가 600 ㎛ 정도인것이 바람직한데 이는 일반조직유래의 체성세포로 제조된 스페로이드는 그 중심으로 부터 스페로이드의 표층까지의 거리가 300 ㎛ 정도 까지는 통상적인 배양 조건하에서 가스 및 영양분의 확신이 더 원활하게 되어 세포스페로로이드의 생체밖에서 수명의 연장이 가능하게 되며 증식을 촉진할 수 있어 이식물의 본래의 기능을 발휘하는 데 훨씬 유리하게 작용하기 때문이다. 비교적으로 두께가 얇은 혼합세포복합체는 가스 및 영양분의 확산이 더 원활하게 되어 이식물의 수명의 연장이 가능하게 되며 연골양조직으로서 형질발현을 유지가능하게됨으로써 세포스페로이드의 본래의 기능을 발휘하는데 훨씬 유리하게 작용하기 때문 이다.

한편, 연골조직은 정상상태에서 연골세포로부터 분비되는 세포외기질이 풍부하고 연골세포 자체는 수％에 지나지 않는다. 게다가 대사가 아주 적은 연골세포는 혼합세포복합체의 스페로이드의 형태가 되면 다른 세포와 비교해서 양호한 가스 및 영양분의 확산이 가능한 스페로이드의 중심부터 스페로이드의 표층까지의 거리가 300 ㎛보다 멀 것으로 예상되지만 1,500 ㎛ 보다는 짧은 것이 바람직하다.

본 발명은, (1) 혼합세포복합체를 구성하는 각 세포재료를 분리준비하는 단계 ; (2) 상기분리된 세포를 계대배양하여 증폭하는 단계 ; (3) 1 종류 혹은 2 종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하고 세포를 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양을 함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조하는 단계 ; 및 (4) 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계를 포함한 이식세포치료용 스페로이드의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 이하의 제조방법은 세포스페로이드를 구성하는 각세포재료가 연골조직 및 골조직의 손상을 치료하기 위한 자가연골세포이식술에서 응용될 경우를 예로 들어 구체적으로 설명한다.

본 발명에 의한 제조방법 단계 (1)은, 혼합세포복합체를 구성하는 각세포재료를 분리준비한다. 먼저, 혼합세포복합체를 구성하는 각세포재료의 기원이 되는 해당하는 제공조직을 채취해서 피부조직, 피하조직, 근육조직, 연골하골(subchondral bone), 인대, 반월판, 그밖의그 밖의 결합조직을 제거한 후 호모지나 이저, 막자사발, 블렌더, 외과용 매스, 주사기, 포르셉, 초음파 장치와 같은 물리적 수단으로 쵸핑(chopping)하여 잘게 조각낸다. 이 때, 해당하는 제공조직을 수용하는 무균의 기재로써 배양접시, 원심용용기등을 포함하는 수지소재의 기재, 시계접시(watch glass) 등을 포함하는 초자소재의 기재등과 같은 기재를 이용하지만, 해당하는 제공조직이 연골조직등의 탄력성 있는 조직인 경우에는 쵸핑시 잘게 조각낸 대상조직이 위치된 수용기재로부터 비산되어 이탈하는 경우가 있다. 이런 현상은 해당하는 제공조직이 쵸핑된 후 조직의 회수량이 경감하며 위치된 수용한 게재로부터 비산되어 이탈한 조직을 다시 되돌려서 계속 쵸핑을 한다면 이후의 각세포재료를 분리준비하는 과정에서 세균이나 진균등에 의한 오염 가능성이 높아지는등 목적한 쵸핑을 원활하게 실시하는 것이 어려워진다. 이렇게 상기한 것과 같이 잘게 조각낸 후 해당하는 제공조직으로부터 각세포재료를 분리하여 준비하는 과정을 포함하는 초대배양의 경우, 세균이나 진균등에 의한 오염이 우려되므로 이들에 의한 오염을 방지하기 위해서 무균적인 작업이 요구되기 때문이다.

상기대상조직은, 오목한 모양의 밑바닥이 있으며 쵸핑시 대상조직이 위치된 수용기재로부터 비산되어 이탈하는 것이 방지될 수 있는 정도의 측면부 길이를 갖는 원심용용기속의 바닥에 위치시킨 후 수술용 곡가위 (curved scissors) 를 이용하여 쵸핑하는 것이 바람직하다. 통상 시판되는 50ml 용량의 원심용용기는 쵸핑시 대생조직이 원심용용기로부터 비산되어 이탈하는 것이 방지될 수 있는 정도의 측면부 길이를 갖기 때문에, 예를 들어 연골조직등의 탄력성 있는 조직인 경우에도 원심용용기 내부의 공간으로 부터 비산되어 이탈하지 않는다.

뿐만 아니라, 이 방법을 이용하면 수술용 곡가위는 구부러져 있어 세포배양시 이용하는통상 시판되는 50ml 용량의 원심용용기의 오목한 바닥과의 밀착된 접촉이 용이하다. 대상조직은 통상적인 경우 중력에 영향을 받으므로 항상 오목한 바닥쪽으로 위치하려는 현상이 생긴다. 이러한 현상과 원심용용기의 오목한 바닥의 위치에서 수술용 곡가위에 의한 절단 운동은 대상조직을 바닥으로 모이게 하여서 탄성연골에 강한 수술용 곡가위의 절단 운동이 지속적으로 작용하게 되어 해당제공조직이 연골조직 등과 같은 탄력이 있는 조직이더라도 결과적으로 단시간에 보다 작은 크기로 잘게 조각낼 수 있다. 이러한 쵸핑을 용이하게 달성하기 위해서는 원심기용용기 측면부 장축의 길이보다 긴 수술용 곡가위를 이용하여 쵸핑하는 것이 바람직하다.

쵸핑하여 잘게 분쇄한 후에는 중성 프로테아제, 트립신, 세린 프로테아제, 엘라스타제 및 콜라게나제로부터 선택된 적어도 하나의 단백질 분해효소로 처리하여 개체의 체온과 동일한 온도로 설정한 온수를 제공할수 있는 항온수조 등의 물 속이나 개체의 체온과 동일한 온도로 설정한 공기를 제공할수 있는 세포배양용 인큐베이터 등의 공기중 등의 환경 하에서 해당제공조직과 단백질 분해효소용액으로 구성된 세포현탁액에 액체의 움직임의 유동에 의한 각반을 유발시키면서 소화시킨다.

본 발명에서 단백질 분해효소를 처리하는 온도와 시간은 단백질 분해효소의 종류 및 개체의 종 등에 따라 달라질 수 있지만, 통상적인 세포배양용 인큐베이터 속에서 37℃, 5％ CO₂ 의 조건하에 전자스테러(Magnetic Stirrer)을 이용하여 각반하면서 소화시키는 것이 바람직하다.

그 이유는 다음과 같이 설명될 수 있다. 본 방법은 단백질 분해효소로 소화시키는 과정에서 통상적인 세포배양용 인큐베이터, 무균적인 유리용기, 전자스테러용 무균자석바를 이용하는데 이러한 세포배양용기재는 청결하게 유지되고, 무균적인 유리용기 속에 쵸핑하여 잘게 분쇄된 해당제공조직과 단백질 분해효소용액으로 구성된 세포현탁액에 액체의 움직임의 유동에 의한 각반을 유발하기에 용이하고 유리병의 뚜껑을 조금 개방하는 것으로 그 간격으로부터 인큐베이터 내부의 공간의 온도 습도 등의 기체조성에 직접 연결되어 세포배양에 이상적으로 조정된 인큐베이터 내부의 기체조성은 해당제공조직과 단백질 분해효소용액으로 구성된 세포현탁액 속의 각세포에 대하여도 안정적이고 유리하다.

본 발명에 의한 제조방법 단계 (2)은, 상기 분리된 연골세포 및 활막유래세포를 계대배양하여 증폭한다. 여기서, 배지로는 당업계에 공지된 임의의 세포 증식용 배지 혹은 연골분화유도배지를 이용할 수 있는데, 세포의 생존증식에 필요한 성분(무기염, 탄수화물, 호르몬, 필수아미노산, 비필수아미노산, 비타민)을 함유하는 기본배지(예를 들면, Dulbeco's Modified Eagle Medium(D-MEM), Minimum Essential Medium(MEM), RPMI-1640, Basal Medium Eagle(BME), Dulbeco's Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12(D-MEM/F-12), Glasgow Minimun Essential Medium(Glasgow MEM))와 같은 기본배지를 사용한다.

이러한 배지에는 콜라겐 합성을 위해 요구되는 아스코르브산은 필수적으로 첨가 하고, 그 밖의 증식인자 또는 분화유도인자 FGF(Fibroblast Growth Factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor), IGF(Insulin-like Growth Factor), TGF(Transforming Growth Factor), VEGF(Vascular Endthelial Growth Factor), EGF(Erythrocyte Growth Factor), BMP(Bone Morphogenetic Protein), TNF(Tumor Necrosis Factor), 비타민류, 인터루킨류, 헤파린, 헤파린유도체, 헤파란유산, 콜라겐, 피브로넥틴, 피브린, 다혈소판혈장, 프로제스테론, 세레나이트, B27-써플리멘트, N2-써플리멘트, ITS-써플리멘트(인슐린, 트렌스페린, 아세린산, 소혈청알부민, 리놀레인산 함유), 덱사메타손, 빌루빈산나트륨, 프로린, L-글루타민 등은 필요시에 따라 첨가한다. 또한, 필요에 따라서는, HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 등의 산염기조정을 위한 첨가제, 항생제, 항진균제 등의 항생물질, 통상적인 이용시에 ％인 10％의 FBS(Fetal Bovine Serum) 혹은 더 높은 증식을 원하는 경우에는 10％이상의 FBS, 임상응용에 있어서 용이하도록 환자유래의 자가혈청을 상기의 10％에서 10％이상 함유하고 있어도 좋다.

본 발명에 있어서, 연골세포, 연골전구세포, 활막유래세포, 활막줄기세포, 골아세포, 골수유래세포, 각종조직유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 지방유래세포, 지방유래줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하고 연골세포로 용의한 분화능력을 보유한 세포 등을 손상환부에 이식하는 것으로 치료효과를 볼 수 있는 각세포재료를 약 2 주간 반복적으로 계대배양에 의하여 증폭시킨다.

높은 분화도를 보이는 연골세포는 2∼20 배 이상, ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하고 연골세포로 용의한 분화능력을 보유한 미분화세포는 20∼100 배 이상 증폭가능한 당업계에 공지된 임의의 세포 증식용 배지에 10％FBS, 아스코르브산으로 조정된 배지를 이용하는 것이 바람직하다.

배양하면서 콘플루언시가 약 90％에 도달하면 트립신·EDTA 를 처리하여 증폭된 연골세포를 떼어내어 새로운 배지로 계대배양한다. 본 발명에서 계대배양은 3 회 이하로 제한하는 것이 바람직한데, 이것은 연골세포는 계대회수를 거듭하여, 특히 4 회를 넘어가면 탈분화(de-defferentiation)해서 본래의 성질을 잃어 연골세포로부터 분비하는 세포외기질인 콜라겐의 유형이Ⅱ에서 Ⅰ로 변하는 등 섬유아세포양(fibroblast-like)으로 변하기 때문이다.

본 발명의 상기 연골세포 및 연골전구세포의 계대배양은, 세포를 고밀도로 파종해서 배양한다. 본 발명에서 말하는 상기연골세포 및 연골전구세포의 파종시의 세포밀도는 배양되는 세포에 따라서 달라지지만, 5,000 개/cm² 이상이 바람직하고, 10,000 개/cm² 이상이 더욱 바람직하고, 20,000 개/cm² 이상이 더욱 바람직하다, 연골조직 및 골조직의 배양에 있어서 더욱 효과있게 재생하는 밀도는 (2.0±0.4)×10⁴/cm² 이며, 계대배양시의 파종세포의 세포밀도는 10,000 개/cm² 이하로 하게 되면, 배양세포가 상기의 섬유아세포양으로 변화되괴 쉽고, 즉 연골세포의 경우 형질발현의 정도가 저하되어 본기술의 목적을 달성할 수 없다

본 발명의 이식치료용 세포스페로이드는, 혼합세포복합체가 연골양조직으로서 형질발현된 것을 특징의 하나로 하고 있다. 연골양조직으로서 형질발현되었다라고 한는 것은, SOX9, HAS 등의 유전형질을 발현하고 있는 것, 또는 세포외기질의 형성에 관여하는 콜라겐 유형이Ⅱ인 것 등의 분화형질을 발현하고 있는 것이다. 상기의 조건하에서 연골세포는 약 2 주간(즉, 계대회수 4 회 이전까지 소요되는 시간) 배양하면 최소 2∼20 배 이상으로 증폭될 수 있다.

또한, 상기의 당업계에 공지된 임의의 세포 증식용 배지에 열에 의해 불활화 된 10％의 FBS, 아스코르브산으로 조정된 배지에, 한층 더 빠른 증식속도로 증대시키기 위해서는 다른 증식 혹인 분화인자를 필요에 따라서 첨가하면 상기의 증식정도 이상으로 증폭될 수 있다.

본 발명에 의한 제조방법 단계 (3)은, 1 종류 혹은 2 종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하고 세포를 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양을 함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조한다.

이단계에 있어서, 혼합세포복합체는 충분히 세포재료들을 상호접착시켜서 이식치료용 세포스페로이드를 형성시킬 수 있는 과량의 세포재료를 첨가시킬 필요가 있다. 세포는 본래 세포 스스로 생산해서 세포표면에 발현시키는 각종의 접착인자, 전기적인 인력, 화학결합 등에 의하여 서로 접착하려 하는 성질을 갖고 있고, 이러한 성질은 각세포의 종류에 따라 차이가 있다. 이러한 성질과 더불어 진탕운동을 수반하기 때문에, 인위적으로 세포와 세포 간의 접촉의 기회를 증시시키게 된다. 이러한 인위적인 작업으로 부터 기인하는 지속적이고 반복적인 진탕운동으로부터 생기는 배양액의 유동에 의하여 각세포는 배양용기의 바닥에 정체하지 않으며 배양액중에서 뜨는 현탁상태를 진탕배양기간중에 유지할 수 있다.

따라서, 진탕을 개시한 최초단계에 세포스페로이드가 된 작은 크기의 혼합세포복합체를 중심으로 하여 다수의 다른 세포재료들이 신속하게 접착하게 되어, 이식치료용 세포스페로이드가 성장하게 된다. 특히 연골세포 및 연골양조직으로서 형질발현된 세포는 고밀도로 존재하게 되면 그 크기를 유지하면서 본래의 연골세포에 더욱 유사한 생태로 된다. 즉, 연골조직이 정상연골로서 분화도를 유지하는데 알맞은 환경하에서는 연골세포는 고유의 세포외기질인 콜라겐 유형 Ⅱ을 풍부하게 생산하여 분비하게 되어 결과적으로는 체내에 존재할 때와 같이 세포수는 비교적 적고 세포외기질은 풍부한 정상연골과 비슷한 성질을 나타내게 된다.

상기 단계 (3)에서 본 발명에 의한 제조방법의 단계(2)에 기재된 각배지를 사용하는 것이 가능하다. 진탕배양은 입체 8 자형 , 평면 8 자형, 평면원형, 또는 평면 좌우형으로 이동 가능한 진탕 배양용 셰이커를 이용하여 진탕의 세기를 60 내지 80rpm으로 설정하고, 개체의 체온과 동일한 온도로 설정한 환경에서 진행하는 것이 바람직하다. 특히 진탕배양기간은 1 내지 7 일 동안 진행하게 되는데, 상기계대배양기간 중에 충분히 증폭된 각세포재료는 세포배양기간이 4 주간 이상을 필요로 하는 기존의 자가연골세포이식술 보다 배양기간을 단축시킬수 있어 결국, 단기간에이식치료용 세포스페로이드의 제조가 가능하게 된다. 이러한 기간의 단축은 고령의 환자 및 광범위한 손상을 수반하는 환자 등에게도 임상응용이 가능한 수법으 로 확립될 수 있고, 환자들의 입원기간의 단축으로 인한 의료비경감에 기여할수 있다는 관점에서, 진탕배양기간은 1 일에서 3 일간 걸쳐서 실시하여, 상기 계대배양기간과 진탕배양기간을 포함하는 상기의 이식치료용 세포스페로이드의 총제작시간은 14 일정도로 하는 것이 바람직하다. 배양 용기로는 이의 표면에 세포가 접착되지 않도록 고안된 비 접착성 배양 접시(즉, 부유 배양용 접시) 또는 대량배양의 경우에는 스피너플라스크(spinner Flask)를 사용한다. 예를 들면, 약 37℃에서 친수성을 나타내어 세포가 전혀 접착되지 않는 HydroCell™ 배양 접시(Cellseed. Co.)를 사용할 수 있다. 이를 통하여 약 10 ㎛ 내지 1,500 ㎛의 크기의 이식치료용 세포스페로이드를 제조할 수 있다.

또한, 진탕배양은 세포재료현탁액의 세포밀도가 1.0×10⁴ 개/ml 부터 3,000×10⁴ 개/ml 로 조정해서 적용하지만, 적당한 세포밀도를 선택할 때에는 이용하는 세포재료의 종류, 배양기재의 성질 및 진탕배양시 배양용기의 바닥직경, 공간, 용적, 크기등에 따라서 필요시에 종합적으로 판단하여 적당한 상기의 범위내의 세포재료현탁액의 세포밀도를 설정하면 된다. 또한, 진탕배양시의 진탕의 세기 및 진탕의 양태를 설정할 때에도 세포재료의 종류, 배양기재의 성질 및 진탕배양시 배양용기의 바닥직경, 공간, 용적, 크기등에 따라서 필요시에 종합적으로 판단하여 적당한 상기의 범위내의진탕의 세기를 설정하면 된다. 필요와 의도한 목적에 따라서 진탕의 양태는 그 운동의 형태 및 진탕의 세기도 시간에 경과함에 따라서 변화를 주어도 좋다,

상기 단계 (3)에 있어서, 상기 마이크로케리어(micro-carrier)는, 상기 세포재료현탁액중의 세포들의 상호접착을 촉진시키기 위한 분자로서, 각각의 세포와 상기 마이크로케리어 간에 있어서 상호 양호한 접착성을 부여한다. 이 마이크로케리어를 이용하면, 진탕배야시 세포재료들간의 양호한 상호접착, 세포스페로이드 형성효율의 향상 및 이식에 적합한 연골양조직으로 형질 발현의 강화를 가능하게 한다. 상기 마이크로케리어의 사용은 필요할 시에 1 종류 혹은 2 종류 이상을 병용해도 좋다. 2 종류 이상을 병용하여 사용할 때에는 2 개의 마이크로케리어의 상이한 성질이 반응하여 더욱 유익한 성질을 나타내는 새로운 마이크로케리어로서 작용하여도 좋다. 예를 들어 이하의 물질중에 후라그민(Fragmin, 일반명 : [Dalteparin sodium])과 유산프로타민(Protamine sulfate)의 전기전하적으로 서로 상이한 성질이 마이크로케리어를 형성시키게 되고, 이렇게 형성된 새로운 마이크로케리어는 세포와 상기 마이크로케리어들 간의 양호한 접착성(Nakamura 등, J Biomed Mater Res A. , May-12, Epub ahead of print(2009))을 제공해 주므로 바람직하다.

또한, 상기의 마이크로케리어는, 콜라겐, 콜라겐유도체, 히알루론산, 히알루론산유도체, 루브리신(Lubricin), 뮤신(Mucin), 키토산, 키토산유도체, 폴리로타키산, 폴리로타키산유도체, 키틴, 키틴유도체, 우레탄, 셀룰로스, 아가로스, 젤라틴, 피브리오넥틴, 피브린, 다혈소판혈장, 헤파린, 헤파린유도체, 후라그민(Fragmin, 일반명 : [Dalteparin sodium]), 유산프로타민(Protamine sulfate), Avidin, Streptavidin, Biotin, 라미닌(Laminin), 2-Octyl Cyanoacryleate, 알길산칼슘, 폴리유산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐알콜, 폴리프로필렌, 폴리 글리콜산, 폴리카프로락탐, 폴리유산폴리글리콜산공중합체, 폴리유산폴리카프로탁탐공중합체 및 폴리글리콜산폴리카프로락탐공중합체으로 만들어진 군으로 부터 선택한 1 종류 혹은 2 종류이상의 생체친화성 재료 또는 생체흡수성 재료로 형성된다. 게다가 상기 마이크로케리어는, 임상에 있어서 효율적으로, 실질적으로 이용 가능한 혼합세포이식체로서 세포이실치료용 스페로이드를 제조 및 이용하는 치료법으로서 사용되기 쉽게하기 위한 관점으로써 본다면, 관련기관으로부터 임상적인 이용의 경우 허가 및 인가를 수득한 것이 바람직하다.

상기 단계 (3)에 있어서, 상기 진탕배양에 관하여 도 1, 도 2 및 도 3 을 참조하면서 이하를 설명한다. 1 종류 혹은 2 종류 이상(도 2 의 세포재료 A 와 세포재료 B)의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하여 진탕배양을 함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조과정 1 회만으로 하여 진탕배양, 또는 2 회이상의 반복 실시하는 복수단계의 진탕배양을 함으로써 1 회째의 진탕배양의 결과산물인 1 차세포스페로이드와 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체인 2 차세포스페로이드로 새로운 혼합세포복합체를 제조하는 것이 가능하다. 이러한 1 차세포스페로이드를 중심으로 다시 세포를 배양액내에서 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하여 계속하여 2 회째의 진탕배양을 함으로써 상기 1 회째의 진탕배양의 결과산물인 1 차세포스페로이드와 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체인 2 차세포스페로이드로 새로운 혼합세포복합체를 제조하는 과정에 있어서, 1 차세포스페로이드와 2 회째의 진탕배양의 세포재료를 투입시킨 직후의 모습을 위상차현미경하에서 관찰하여 그 결과를 도 11 에 표시하였다.

2 회 이상 진탕배양함으로써, 결과산물인 1 차세포스페로이드의 구조를 인위적으로 변경시킬수 있다. 예를 들어 더 표층쪽에 가까운 2 차세포스페로이드의 세포재료를 연골세포로 하고 더 심부쪽에 위치하는 1 차스페로이드의 세포재료를 활막유래세포로 적용한다면, 높은 증식율을 보유한 활막유래세포로 세포스페로이드의 대부분을 차지하는 1 차세포스페로이드를 형성시키고 난 뒤, 비교적 고령 환자의 증식율이 저하된 연골세포이더라고 제한된 배양기간내에 적은 수의 세포재료만 가지고서도, 상기 2 차세포스페로이드를 형성하는 데는 충분하게 된다. 각세포재료의 증식능, 생체내의 해부학적 조직학적 발생학적인 면을 종합적으로 판단하여, 상기의 복수단계의 진탕배양의 세포재료의 종류, 세포재료의 종류 및 구성을 고려한 제조방법을 선택하면 된다.

본 발명에 의한 제조방법 단계 (4)은, 세포이식치료를 위하여 제조된 세포스페로이드를 분리하여 손상환부에 이식한다. 상기의 단계(3)에 있어서 진탕배양이 1 내지 7 일간 경과하게 되면 배양접시내에 다양한 크기의 이식치료용 세포스페로이드가 존재하게 된다. 들을 단순히 분리하거나 크기별로 분리하기 위하여, 한 양태로서 멸균 처리된 마이크로 피펫을 이용해서 위상차현미경 하에서 관찰하면서 마이크로 피펫으로 이식치료용 세포스페로이드를 흡입하여 새로운 배양접시(부유배양용 접시)에 옮겨 담는 방식이 이용될 수 있다. 이 때, 배양접시를 원운동시키면서 원심력에 의해 이식치료용 세포스페로이드를 중심으로 모이게 하고 마이크로피펫의 팁(tip)을 이용해서 상기 이식치료용 세포스페로이드의 제작과정에 있어서 사용하는 배양액, 세포현탁액, 마이크로 케리어함유용액, 각종완충액 및 생리식염수 등의 체액과 유사한 조성을 갖는 운반용용액 등을 같이 흡입하면, 크기별 팁의 직경 크기에 적합한 크기의 이식치료용 스페로이드의 흡수가 가능하다. 또한, 이와 비슷한 방식으로 주사용침과 주사기를 이용하여, 손상환부의 세포이식하는 과정에 있어서 내시겨 혹은 관절경 또는 관절경하 수술에 사용가능한 형태의 이식치료용 스페로이드를 준비하면 좋다.

상기 단계 (3)에 있어서, 상기제조한 세포스페로이드를 이식하여 손상환부인 이식부위에 세포스페로이드를 위치시키게 되면, 이것을 세포스페로이드의 표면도 구성하는 세포에 따라 달라 질 수 있으므로, 이러한 세포는, 본래 세포 스스로 생산해서 세포표면에 발현시키는 각종의 접착인자, 전기적인 인력, 화학결합 등에 의하여 서로 접착하려 하는 성질을 갖고 있고, 이러한 세포로 표면이 구성되어 있는 세포스페로이드는, 근접한 세포스페로이드 만으로도 서로 용이하게 합체하지만, 상기 마이크로케리어를 이용하여, 혼합세포복합체를 손상환부에 더욱 양호한 고정 및 단기간내의 이식과 환자와 세포스페로이드 간의 신속한 결합을 원할 때에는 사용해도 좋다. 상기의 마이크로케리아는, 콜라겐, 콜라겐유도체, 히알루론산, 히알루론산유도체, 루브리신(Lubricin), 뮤신(Mucin), 키토산, 키토산유도체, 폴리로타키산, 폴리로타키산유도체, 키틴, 키틴유도체, 우레탄, 셀룰로스, 아가로스, 젤라틴, 피브리오넥틴, 피브린, 다혈소판혈장, 헤파린, 헤파린유도체, 후라그민(Fragmin, 일반명 : [Dalteparin sodium]), 유산프로타민(Protamine sulfate), Avidin, Streptavidin, Biotin, 라미닌(Laminin), 2-Octyl Cyanoacryleate, 알길산칼슘, 폴리유산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐알콜, 폴리프로필렌, 폴리 글리콜산, 폴리카프로락탐, 폴리유산폴리글리콜산공중합체, 폴리유산폴리카프로탁탐공중합체 및 폴리글리콜산폴리카프로락탐공중합체으로 만들어진 군으로 부터 선택한 1 종류 혹은 2 종류이상의 생체친화성 재료 또는 생체흡수성 재료로 형성되어 있고 상기의 마이크로케리어의 성질, 이식치료용 세포스페로이드의 구성, 이식부위의 환경 등을 종합적으로 고려하여 상기의 마이크로케리어의 군에서 선택하면 된다.

한편, 상기 혼합세포복합체를 손상부위에 양호하게 고정하기 위하여 이용하는 마이크로케리어 단독이용 혹은 별도 이용으로서, 손상부위를 포함하는 이식부위는 손상부위와 그 주변부위에 평판한 형상을 고려하면, 상기 해당하는 제공조직유래의 연골세포, 연골전구세포, 활막유래세포, 활막줄기세포, 골아세포, 골수유래세포, 각종조직유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 지방유래세포, 지방유래줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하고 연골세포로 용의한 분화능력을 보유한 세포등을 손상환부에 이식하는 것으로 치료효과를 볼 수 있는 1 종류 혹은 2 종류 이상의 세포를 일정기간 배양하여 시트상(sheet-like) 형태로 상기세포와 세포외기질로 구성된 배양세포시트 단독 혹은 상기 배양세포시트와 같이 콜라겐, 콜라겐유도체, 히알루론산, 히알루론산유도체, 루브리신(Lubricin), 뮤신(Mucin), 키토산, 키토산유도체, 폴리로타키산, 폴리로타키산유도체, 키틴, 키틴유도체, 우레탄, 셀룰로스, 아가로스, 젤라틴, 피브리오넥틴, 피브린, 다혈소판혈장, 헤파린, 헤파린유도체, 후라그민(Fragmin, 일반명 : [Dalteparin sodium]), 유산프로타민(Protamine sulfate), Avidin, Streptavidin, Biotin, 라미닌(Laminin), 2-Octyl Cyanoacryleate, 알길산칼슘, 폴리유산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐알콜, 폴리프로필렌, 폴리글리콜산, 폴리카프로락탐, 폴리유산폴리글리콜산공중합체, 폴리유산폴리카프로탁탐공중합체 및 폴리글리콜산폴리카프로락탐공중합체으로 만들어진 군으로 부터 선택한 1 종류 혹은 2 종류이상의 생체친화성 재료 또는 생체흡수성 재료인 인공바이오매터리얼로 형성된 시트상구조물 및 다양한 모양의 구조물을 보조적으로 연골 혹은 골조직표면에 대하여 피복 혹은 충진하여도 좋다. 여기에서는, 혼합세포복합체를 손상부위에 양호하게 고정하도록 시트상 구조물을 이용하여 보조적으로 이용한 양태를 예로 들어 도 4 에 나타내었다..

본 발명에 있어서, 세포이식은, 먼저 혼합세포복합체의 이식치료용 세포스페로이드의 세포성분이지만, 세포스페로이드를 구성세포로부터 분비된 분자 및 생산된 세포외기질, 상기세포이식용스페로이드의 제조과정에 있어서 사용한 배양액 및 세포현탁액, 마이크로케리어 함유액 또는마이크로케리어 함유액, 각종 완충액, 생리식염수 등의 체액에 유사한 조성인 운반용용액을 단독 혹은 동시에 치료를 위하여 상기손상환부에 이식하는 것으로, 연골양조직으로서 형질발현된 상태로본래의 기능을 발휘할수 있는 세포이식치료가 가능하게 된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 이식치료용 세포스페로이드는 치료의 목적과는 별도로 화합물, 약제, 독성물질 등의 약효, 독성의 생리작용, 및 독성을 평가하기 위한 시스템으로써 이용할 수 있다. 이것은 상기 이식치료용 세포스페로 이드의 용도는 특별히 제한되니 않으며, 각종 질병의 치료용의 목적 이외에도 세포스페로이드를 이용하여 실시할 수 있는 모든 시험, 연구, 세포스페로이드를 이용한 물질 성상의 규명 작업등에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 획득한 각종 성체줄기세포로 제조된 스페로이드를 IGF, TGF, 트렌스페린, 인슐린, FBS, GA-1000, ITS-써플리멘트, 덱사메타손, 아스코르브산, 빌루빈산나트륨, 프로린 등의 인자를 처리함으로써 연골세포로 분화유도 할 수도 있는데, 이러한 작업을 통하여 수득한 분화세포를 환자에게 이식함으로써 줄기세포를 이용한 줄기세포요법을 통한 자가세포이식술이 가능하게 되며, 제작한 세포스페로이드를 대상으로 연골재생에 관여하는 피검물질의 약효 또는 독성을 직접 이렇게 제작된 세포스페로이드를 대상으로 편가하는 데에 사용될 수 있다. 본 발명 이식치료용 세포스페로이드의 용도는 상기 특정 양태에 의해 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기의 2 회 이상의 반복 실시하는 복수단계의 진탕배양을 함으로써 1 회째의 진탕배양의 결과산물인 1 차세포스페로이드를 중심으로 다시 세포를 배양액내에서 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하여 계속하여 2 회째의 진탕배양을 함으로써 상기 1 회째의 진탕배양의 결과산물인 1 차세포스페로이드와 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체인 2 차세포스페로이드로 새로운 혼합세포복합체를 제조하는 것이 가능하다. 이러한 특징을 갖는 복수단계의 진탕배양을 실시하면 세포스페로이드의 구조를 여러겹의 층상형상으로 구축할 수 있다. 예를 들어, 무릎연골조직을 해부학적, 조직학적, 또는 발생학적인 관점에서 관찰하면, 표층부터 골수를 향해서 더 깊은쪽으로 가면서 무릎연골조직을 구성하는 연골 세포의 형상이 변해간다. 이러한 형상이 상이한 연골세포들 사이에는 서로 그 성질 및 기능이 다르다. 이러한 층상구조 내에서 서로 상이한 세포로 세포스페로이드 구조물을 제조하는 함으로써 생체내의 환경과 아주 비슷한 미세환경을 생체외(in vitro)에서 구축하는 것이 가능하다. 이렇게 제조된 세포스페로이드를 이용하여 상기 시스템에 의한 화합물, 약제, 독성물질 등의 생리작용 및 독성을 평가함으로서 보다 정확한 평가 및 예측이 가능하게 된다.

세포이식체의 본래 갖고 있던 특정 기능을 더욱 증진되도록 하는 것은, 다수의 세포들의 집단을 신체외의 조건하에서 보존하게 되면, 일반적인 경우 중력에 의하여 이들 세포들의 집단은 세포들간의 상호접착이 느슨져서 본연의 기능을 읽어가게 되는데, 본 발명에의한 제조방법에서 제공하는 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양으로 세포들의 집단에 있어서 상호접착을 강화시켜서 각구성세포들과 커뮤니케이션 할 수 있는 긴밀히 접척이 가능하게 되고, 세포외기질의 생산을 촉진하기 때문에 결과적으로 본래 갖고 있던 특정기능을 증진시키게 된다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않으며, 하기 실시예의 단순한 변경, 치환 및 변형 등은 본 발명의 권리범위를 벗어날 수 없다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

토끼 무릎관절 연골세포와 활막유래세포를 혼합한 혼합세포복합체에 의한 이 식치료용 세포스페로이드의 제조 및 연골결손모델을 대상으로한 이식

1-A. 연골세포 및 활막유래세포의 분리 및 배양

토끼(Japanese White Rabbit, 1kg±200g, 암컷)로부터 무릎에서 부터 연골조직 및 활막조직을 채취해서 피부조직, 피하조직, 근육조직, 연골하골(subchondral bone), 인대, 반월판, 그 밖의 결합조직을 제거한 후, 통상 시판되는 50ml 용량의 원심용용기의 내부에 위치시킨 다음 수술용 곡가위를 이용하여 쵸핑하하여 잘게 조각내었다. 그리고, 1.25％ 트립신(Invitrogen Co.) 및 0.5％ 콜라게나제Ⅰ(collagenase class Ⅰ: Worthington, Biochemical Co.) 를 D-MEM/F-12 배지(Gibco. Co.)에 1％의 항생제/항진균제 혼합물 (10,000units/ml 의 페니실린 G, 10,000 ㎍/ml 의 스트렙토마이신, 25 ㎍/ml 의 암포테리신, Gibco. Co.)로 조정된 배지에 용해시켜 1 차소화효소 및 2 차소화효소 용액을 준비하였다.

연골조직 및 활막조직은 상기의 각 소화용액에 처리하기 위하여, 무균적인 유리용기에 넣는 동시에 전자스테러용 무균자석바를 넣어준 후, 통상적인 세포배양용 인큐베이터 속에서 37℃, 5％ CO₂ 의 조건하에 전자스테러(모델명 : Magnetic Stirrer RCN-3D, EYELA Co.)을 이용하여 60 rpm으로 각반하면서 소화시킨다.

이때, 1 차소화효소에 의한 1 시간 처리, 및 2 차소화효소에 의한 추가 3 시간 처리하여, 연골세포 및 활막조직이 단일 세포로 분리되도록 하였다. 이러한 과정을 통하여 얻은 세포현탁액은 70 ㎛ 및 40 ㎛의 나일론제의 cell strainer(BD Falcon™:BD Biosciences)로 연속적으로 통과 시킨후 인산완충액에을 이용하여 2 회 세정하였다.

이러한 과정을 통하여 얻은 단일 세포는 연골세포 및 활막유래세포의 개수를 증폭하기 위한 증식용 배지에 접종하여 배양하였다. 처음 배양 파종시 세포밀도는 연골세포의 경우 (2.0±0.4)×10⁴/cm² 로, 활막유래세포는 (1.0±0.4)×10⁴/cm² 로 하며, 이후 계대배양시의 경우 연골세포의 경우 세포 밀도는 (2.0±0.4)×10⁴/cm² 로, 활막유래세포는 (1.0±0.4)×10⁴/cm² 로 하였다. 그리고, D-MEM/F-12 배지(Gibco. Co.)에 열에 의해 불활화 된 10％의 FBS, 1％의 항생제/항진균제 혼합물(10,000units/ml 의 페니실린 G, 10,000 ㎍/ml 의 스트렙토마이신, 25 ㎍/ml 의 암포테리신, Gibco. Co.) 및 50 ㎍/ml 의 아스코르브산으로 조정된 배지를 사용하였으며, 콘플루언시가 90％에 도달하였을 때 트립신-EDTA 로 처리하여 증폭된 연골 세포와 활막유래세포를 배양접시로부터 떼어내었다.

12∼13 일간의 세포증폭을 위한 계대배양기간에 있어서 연골세포는 2 회, 활막유래세포는 최대 4 회까지 계대를 하여 최종적으로는 혼합세포복합체의 이식치료용 세포스페로이드를 제조하기 위한 세포재료로, 제 3 계대째의 연골세포와 제 4∼5 계대째의 활막유래세포를 사용한다.

1-B. 단리 배양 연골세포 및 활막유래세포의 형광시약 테깅 (Tagging)

실시예 1-A 를 통하여 회수한 각각의 단리 배양 연골세포 및 활막유래세포는, D-MEM/F-12 배지(Gibco. Co.)에 1％의 항생제/항진균제 혼합물 (10,000units/ml 의 페니실린 G, 10,000 ㎍/ml 의 스트렙토마이신, 25 ㎍/ml 의 암 포테리신, Gibco. Co.)로 조정된 배지에 재현탁시킨 후 원심(1,800 rpm/5min, 24℃)시킨 후, 연골세포 및 활막유래세포를 대상으로 각세포를 형광현미경 혹은 공초점 레이저 현미경하에서 경시적(

時的)으로 추적하기 위해 PKH 염색키트(Sigma Co.)를 이용하여 형광시약 테깅할 준비를 하였다. 연골세포는 빨간색 형광테그(tag)인 MINI26 을, 활막유래세포는 초록색 형광테그인 MINI67 kit(Fluorescent Cell Linker Mini Kit for General Cell)를 이용하여 본 시약의 프로토콜에 준하여 형광염색을 테깅하여, 연골세포 및 활막유래세포를 서로 비교할수 있도록하였다. 이 작업에 의하여 형광시약의 테깅된 연골세포 및 활막유래세포의 세포현탁액을 준비하였다.

1-C. 진탕배양에 의한 혼합세포복합체의 제조

실시예 1-A 및 실시예 1-B 를 통하여, 적합한 회수의 계대작업 및 형광시약 테깅작업을 걸친 연골세포 및 활막유래세포의 세포현탁액을 D-MEM/F-12 배지(Gibco. Co.)에 열에 의해 불활화 된 10％의 FBS, 1％의 항생제/항진균제 혼합물 (10,000units/ml 의 페니실린 G, 10,000 ㎍/ml 의 스트렙토마이신, 25 ㎍/ml 의 암포테리신, Gibco. Co.) 및 50 ㎍/ml 의 아스코르브산으로 조정된 배지를 이용하여 5ml 에 재현탁하고 연골세포 및 활막유래세포를 단독 혹은 연골세포와 활막유래세포를 동시에 정해진 비율(즉, ①100％활막유래세포·0％연골세포구성의 세포현탁액, ②75％활막유래세포·25％연골세포구성의 세포현탁액, ③50％활막유래세포·50％연골세포구성의 세포현탁액, ④25％활막유래세포·75％연골세포구성의 세포현탁액, ⑤0％활막유래세포·100％연골세포구성의 세포현탁액)로 단독 혹은 혼합세포제 료현탁액으로 준비하였다. 배양 용기로는 60mm 의 HydroCell™ 배양접시(Cellseed. Co.)를 사용하여, 통상적인 세포배양용 인큐베이터 속에서 37℃, 5％ CO₂ 의 조건하에 진탕배양용 세이커(모델명; 더블세이커 NR-3, TAITEK Co.)를 이용하여 평면원형 이동운동을 70rpm 으로 부가하면서 1∼5 일간 배양했다.

계대배양기간과 진탕배양을 포함하는 이식치료용 세포스페로이드의 총 제조에 필요한 시간은 14 일정도로 하였다. 여기에서는, 혼합세포복합체를 손상부위에 양호하게 고정하도록 시트상 구조물(연골세포시트)을 이용하여 보조적으로 이용한 양태를 예로 들어, 그 제조과정 스케쥴을 도 5 에 표시하였다.

배양기간 경과시간 마다 수득한 세포스페로이드를 위상차현비경하에서, 혹은 형광시약을 테깅한 연골세포 및 활막유래세포를 관찰시에 위상차현미경에 적당한 범위의 파장만을 선택적으로 통과시키는 필터를 부가하여 관찰한 후 그 결과를 각각 도 6 및 도 7 에 나타내었다. 도 6 의 A 는 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ②75％활막유래세포·25％연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 진탕배양개시직후, B 는 12 시간 경과 후, C 는 24 시간 경과 후, D 는 36 시간 경과 후의 위상차현미경하에서 관찰한 결과를 각각 나타낸 것이다. 도 7 의 A 는 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ④25％활막유래세포·75％연골세포구성의 세포현탁액를 대상으로 진탕배양직후 B 는 12 시간 경과 후, C 는 24 시간 경과 후, D 는 36 시간 경과 후의 위상차현미경에 적당한 범위의 파장만을 선택적으로 통과시키는 필터를 부가하여 관찰한 결과를 각각 나타낸 것이다.

또한, 진탕배양을 상기 연골세포 및 활막유래세포를 단독 혹은 연골세포와 활막유래세포를 동시에 정해진 비율 ⑤0％활막유래세포·100％연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 평면원형 또는 평면좌우형으로 이동운동을 부가하면서 진탕배양을 4 일간 실시하고 그 결과를 도 8A 및 도 8B 에 나타내었다. 도 9 는, 상기 각 ①～⑤까지의 비율의 조건으로 연골세포 및 활막유래세포의 세포현탁액을 상으로 진탕배양 개시 36 시간 경과 후의 위상차현미경하에 적당한 범위의 파장만을 선택적으로 통과시키는 필터를 부가하여 관찰한 결과를 각각 나타낸 것이다. 공초점 레이저현미경하에서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ③50％활막유래세포·50％연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 진탕배양을 5 일간 실시하고 그결과를 도 10 에 나타내었다.

이식치료용 세포스페로이드를 구성하는 각세포재료는 시간이 경과함에 따라, 인위적인 동작에 기인하는 지속적 반복운동에 의하여 발생된 배양액내의 흐름에 의하여 각각의 세포는 배양용기의 바닥에 정체하지 않으며 배양액중에서 뜨는 현탁상태를 진탕배양기간중에 유지되어 진탕배양 초기단계의 세포스페로이드로 만드어진 작은 크기의 혼합세포복합체를 중심으로 하여 다수의 다른 세포재료들이 신속하게 접착하게 되어, 이식치료용 세포스페로이드가 성장하였다. 이 기간중에, 혼합세포복합체는 진탕배양개시 12 시간 경과 후부터 육안적으로 관찰이 가능하기 시작하여, 진탕배양의 전과정에 있어서 관찰 가능하였다. 이때 수득한 세포스페로이드의 육안적인 관찰소견의 결과를 도 12 에 나타내었다.

혼합세포복합체는 시간이 경과함에 따라, 윤곽이 점차 매끈하게 되는 것을 확인하였다. 배양개시 125 시간 경과 후 위상차현미경하에서 관찰한 결과를 각각 도 6 및 도 7 에 나타내었다.

크기가 작은 세포스페로이드의 경우는 직경이 250±100 ㎛정도, 크기가 큰 세포스페로이드의 경우에는 직경이 700±250 ㎛정도였다.

1-D. 병리조직학적 검사

실시예 1-C 을 통하여 얻은 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ③50％활막유래세포·50％연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 진탕배양을 5 일간 실시하고 세포스페로이드는 4％의 파라포름알데히드 용액으로 고정시키고 15％ 수크로오스 용액, 30％ 수크로오스 용액에 순차적으로 적응시킨 후 동결절편으로 만들고 이 절편을 잘라서 병리조직학적인 검사를 위하여 준비하였다. 상기 절편 상의 세포스페로이드는 3-amino-9-ethylcarbazole(AEC) substrate-chromogen solution(DAKO Japan Co., Ltd.)을 사용하여 avidin-biotin-peroxidase complex technique(LSAB 2 kit/HRP, DAKO JapanCo.,Ltd.)의 프로토콜을 따라서 콜라겐 유형 Ⅱ에 대한 면역조직화학 염색을 실시하였다. 검사결과를 도 13 에에 나타내었다. 그 결과, 진하게 염색된 콜라겐 유형 Ⅱ의 존재를 확인 할 수 있었으며, 이것은 염색된 부위의 세포 및 조직이 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 연골조직으로서 형질발현된 것을 의미한다.

1-E. 토끼 무릎 전층 손상 모델에 세포스페로이드의 이식

실시예 1-C 을 통하여 얻은 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ②75％활막유래세포·25％연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 진탕배양을 실시하여 수득한 세포스페로이드를 마이크로피펫을 이용하여, 토끼(Japanese White Rabbit, 3kg±500g, 암컷)의 슬개골 밑에 위치하는 대퇴골측의 무릎연골에 직경 5mm 의 결손을 연골표층부터 연골하골까지 도달하는 전층 손상 모델을 만든 후 손상부위에 이동시켜 이식시켰다(도 14A). 이식을 실시한 4 주 후에 세포스페로이드를 수령한 토끼를 희생시켜 대퇴골을 회수하고 4％의 파라포름알데히드 용액으로 고정시키고, 탈회처리를 한 후 파라핀 절편으로 만들고 이 절편을 잘라서 병리조직학적인 검사를 위하여 준비하였다. 상기 절편 상의 세포스페로이드는 3-amino-9-ethylcarbazole(AEC) substrate-chromogen solution(DAKO Japan Co., Ltd.)을 사용하여 avidin-biotin-peroxidase complex technique(LSAB 2 kit/HRP, DAKO JapanCo.,Ltd.)의 프로토콜을 따라서 콜라겐 유형 Ⅱ에 대한 면역조직화학 염색을 실시하였다. 토끼의 슬개골 밑에 위치하는 대퇴골측의 무릎연골에 직경 5mm 의 결손을 연골표층부터 연골하골까지 도달하는 전층 손상 모델을 만든 후 손상부위에 이동시켜 이식킨 후 육안적인 관찰소견의 결과를도 14A 에 나타내었다. 또한, 병리조직학적인 검사를 도 14B 에에 나타내었다. 그 결과, 진하게 염색된 콜라겐 유형 Ⅱ의 존재를 확인 할 수 있었으며, 이것은 이식된 세포스페로이드가 신체내의 환경에서 이식 4 주후에 염색된 부위의 세포 및 조직이 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 연골조직으로서 형질발현된 것을 의미한다.

[실시예 2]

래트 췌도세포 유래의 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC)를 대상으로한 1차세포스페로이드의 제조

2-A. PEC 의 분리 및 배양

래트(Brown Norway Rat 또는 Lewis Rat, 350±50g)로부터 췌장을 적출해서 Hanks' Balanced Salt Solutions(HBSS)(Gibco.Co.)에 10％의 FBS 와 HEPES 를 첨가한 용액에 콜라게나제 P(Roche. Co.)를 용해시켜 2 mg/㎖의 콜라게나제 P 를 제조하고 이를 이용해서 소화시키고 Histopaque(Sigma Co.)를 이용하는 농도구배법에 의해 순화시키고 회수하였다.

이렇게 하여 분리된 췌도를 대상으로 5 분정도의 짧은 시간동안 트립신·EDTA 를 처리하여 PEC 로 단리한다. 이렇게 단리 된 PEC 는 상기 실시예 1 의 1-A 에서와 같은 방법으로 분리한 세포를 수적으로 증폭하기 위한 증식용 배지에 접종하여 배양한다. 증폭된 PEC 를 떼어내어 새로운 배지로 계대배양한다. 실시예 1 의 1-A 에서 기술한 배지의 조성, 사용소화효소 및 배양접시의 종류, 처음 배양시 파종시 세포밀도 및 계대배양 파종시 세포밀도는 목표로 하는 용도에 따라 적절하게 변형하여 적용하였다.

2-B. 진탕배양에 의한 혼합세포복합체 (1차세포스페로이드) 의 제조

실시예 2-A 를 통하여 얻은 각각의 단리 배양 PEC 는 계대배양하여 회수하고 이렇게 회수된 PEC 는 D-MEM/F-12 배지(Gibco. Co.)에 열에 의해 불활화 된 10％의 FBS, 1％의 항생제/항진균제 혼합물 (10,000units/ml 의 페니실린 G, 10,000 ㎍/ml 의 스트렙토마이신, 25 ㎍/ml 의 암포테리신, Gibco. Co.) 및 50 ㎍/ml 의 아스코르브산으로 조정된 배지를 이용하여 5ml 에 재현탁하여 세포현탁액으로 준비한다. 배양 용기로는 60mm 의 HydroCell™ 배양 접시(Cellseed. Co.)를 사용하여, 통상적 인 세포배양용 인큐베이터 속에서 37℃, 5％ CO₂ 의 조건하에 진탕배양용 세이커(모델명; 더블세이커 NR-3, TAITEK Co.)를 이용하여 평면원형 이동운동을 70rpm 으로 부가하면서 1∼5 일간 배양했다.

이렇게 1 차세포스페로이드를 구성하는 각세포재료는 시간이 경과함에 따라, 인위적인 동작에 기인하는 지속적 반복운동에 의하여 발생된 배양액내의 흐름에 의하여 각각의 세포는 배양용기의 바닥에 정체하지 않으며 배양액중에서 뜨는 현탁상태를 진탕배양기간중에 유지되어 진탕배양 초기단계의 세포스페로이드로 만드어진 작은 크기의 혼합세포복합체를 중심으로 하여 다수의 다른 세포재료들이 신속하게 접착하게 되어, 이식치료용 세포스페로이드가 성장하였다. 이 기간중에, 혼합세포복합체는 진탕배양개시 12 시간 경과 후부터 육안적으로 관찰이 가능하기 시작하여, 진탕배양의 전과정에 있어서 관찰 가능하였다.

1 차세포스페로이드는 시간이 경과함에 따라, 윤곽이 점차 매끈하게 되는 것을 확인하였다.

2-C. 1 차세포스페로이드의 이용

실시예 2-A 와 2-B 를 통하여 얻은 PEC 로 구성된 1 차세포스페로이드를 중심으로 다시 1 종류 혹은 2 종류이상의 세포를 배양액 내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료현탁액을 준비하여 2 회이상의 진탕배양을 함으로써 상기 1 회째의 진탕배양 의 결과산물인 1 차세포스페로이드와 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체인 2 차세포스페로이드로 새로운 혼합세포복합체를 제조하는 2 회이상의 반복 실시하는 복수단계의 진탕배양 실시는데 이용하였다.

본 발명은 혼합세포복합체인 이식치료용 세포스페로이드는, 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들의 집합인 세포스페로이드 및 혼합세포복합체를 구성하는 각세포재료를 분리준비하고, 분리준비된 각세포를 계대배양하여 증폭한 후, 1 종류 혹은 2 종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하고 진탕배양(Shaking culture)함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조하여 세포이식치료를 위하여 제조된 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 이식세포치료용 스페로이드의 제조방법 및 이를 이용한 치료법과 화합물, 약제, 독성물질 등의 약효 및 독성의 생리작용 혹은 독성를 평가하기 위한 시스템으로, 상기 이식치료용 세포스페로이드를 구성하는 각세포재료는, 연골조직 및 골조직의 손상을 치료하기 위한 자가연골세포이식술에서 응용될 경우, 자가연골세포 또는 골세포 연골세포의 단독 사용 뿐 만 아니라 1 종류 혹은 2 종류이상의 높은 증식능을 갖으며, 연골조직으로의 용이한 분화능을 보유하는 각종 줄기세포 혹은 연골전구세포 등을 이용하는 것으로 연골양조직으로서 형질발현된 이식치료용 세포스페로이드의 대량의 준비가 가능하게 되어, 고령자에게 다발하는 광범위한 연골조직 및 골조직의 변성 또는 연골 의 변성 및 연골조직의 손상이 연골하골까지 도달하지 않는 부분결손 등에 대한 치료기술의 확립이라는 면에서도 상당히 유용하게 된다.

도 1 은 본 발명의 한 양태에 있어서, 1 종류의 세포를 배양액내에서 단독의 세포재료혼탁액을 준비하고 진탕배양함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 나타내는 모식도를 나타낸 것이다.

도 2 는 본 발명의 한 양태에 있어서, 세포재료 A 와 세포재료 B 의 2 종류의 세포를 배양액내에서 혼합세포재료혼탁액을 준비하고 진탕배양함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 나타내는 모식도를 나타낸 것이다.

도 3 은 본 발명의 다른 양태에 있어서, 2 회이상 반복실시하는 복수단계의 진탕배양을 하여 1 회째의 진탕배양의 결과산물인 1 차세포스페로이드를 중심으로 다시 1 종류 혹은 2 종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하여 2 회이상의 진탕배양을 함으로써 상기 1 회째의 진탕배양의 결과산물인 1 차세포스페로이드와 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체인 2 차세포스페로이드로 형성된 혼합세포복합체를 나타내는 모식도를 나타낸 것이다.

도 4 는 본 발명의 한 양태에 있어서, 보조적으로 시트상구조물(연골세포시트)를 이용하여 보조적으로 이용한 치료방법의 혼합세포복합체인 이식치료용 세포스페로이드의 양태를 예로 들어 나타내는 모식도를 나타낸 것이다.

도 5 는 본 발명의 한 양태에 있어서, 혼합세포복합체를 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소에 양호하게 고정하도록 시트상 구조물(연골세포시트)을 이용하여 보조적으로 이용한 양태를 예로 들어, 계대배양기간과 진탕배양기간을 포함하는 이식치료용 세포스페로이드의 총제작시간은 14 일정도로 하는 제조과정 스 케쥴의 일례를 나타낸 것이다.

도 6 는 본 발명의 한 양태에 있어서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ②75％활막유래세포·25％연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 진탕배양함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 위상차현미경하에서 관찰하여 그 결과를 나타낸 것이다.

도 7 은 본 발명의 한 양태에 있어서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ④25％활막유래세포·75％연골세포구성의 세포현탁액를 대상으로 진탕배양함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 위상차현미경하에서 관찰하여 그 결과를 나타낸 것이다.

도 8A 는 발명의 한 양태에 있어서, 1 종류의 세포(즉, ⑤0％활막유래세포·100％연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 평면원형으로 이동운동을 부가하면서 진탕배양함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 위상차현미경하에서 관찰하여 그 결과를 나타낸 것이다.

도 8B 는 본 발명의 한 양태에 있어서, 1 종류의 세포(즉, ⑤0％활막유래세포·100％연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 평면좌우형으로 이동운동을 부가하면서 진탕배양함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 위상차현미경하에서 관찰하여 그 결과를 나타낸 것이다.

도 9 는 본 발명의 한 양태에 있어서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율을 ①100％활막유래세포·0％연골세포구성의 세포현탁액, ②75％활막유래세포·25％연골세포구성의 세포현탁액, ③50％활막유래세포·50％연골세포구성의 세포현탁액, ④25％활막유래세포·75％연골세포구성의 세포현탁액, ⑤0％활막유래세포·100％연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 각각진탕배양함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 위상차현미경하에서 관찰하여 그 결과를 나타낸 것이다.

도 10 은 본 발명의 한 양태에 있어서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ③50％활막유래세포·50％연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 5 일간 진탕배양함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 공초점 레이저현미경하에서 관찰하여 그 결과를 나타낸 것이다.

도 11 은 본 발명의 다른 양태에 있어서, 2 회이상 반복실시하는 복수단계의 진탕배양을 하여 1 회째의 진탕배양의 결과산물인 1 차세포스페로이드를 중심으로 다시 1 종류 혹은 2 종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하여 2 회이상의 진탕배양을 함으로써 상기 1 회째의 진탕배양의 결과산물인 1 차세포스페로이드와 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체인 2 차세포스페로이드로 형성된 혼합세포복합체를 위상차현미경하에서 관찰하여 그 결과를 나타낸 것이다.

도 12 는 본 발명의 다른 양태에 있어서, 혼합세포복합체는 진탕배양개시 12 시간 경과 후부터 육안적으로 관찰이 가능하기 시작하여, 진탕배양의 전과정에 있어서 관찰 가능하였다. 이때 수득한 세포스페로이드의 육안적인 관찰소견의 결과를 나타낸 것이다.

도 13 은 본 발명의 한 양태에 있어서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ③50％활막유래세포·50％연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 5 일간 진탕배양함 으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 대상으로 실시한 면역조직화학 염색의 병리조직학적 검사의 결과를 나타낸 것이다.

도 14A 는 발명의 한 양태에 있어서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율②75％활막유래세포·25％연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 3 일간 진탕배양 함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 토끼의 대퇴골측의 전층 손상 무릎연골의 손상부위에 이동시켜 이식킨 후 육안적인 관찰소견의 결과를 나타낸 것이다.

도 14B 는 본 발명의 한 양태에 있어서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율②75％활막유래세포·25％연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 3 일간 진탕배양 함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 토끼의 대퇴골측의 전층 손상 무릎연골의 손상부위에 이동시켜 이식시킨 세포스페로이드를 이식 4 주후에 이를 대상으로 실시한 면역조직화학 염색의 병리조직학적 검사의 결과를 나타낸 것이다.

Claims

혼합세포복합체가, 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들의 집합인 세포스페로이드.
제 1 항에 있어서,

상기 혼합세포복합체는 이용 목적에 따라서 선택할 수 있는 각 해당 제공 조직 유래의 고유의 기능을 발휘하는 최종 분화단계의 성체세포, 상기 성체세포의 전구세포 및 아세포 및 미분화도가 높고 다능성(multi-potency) 및 고도의 증식능을 보이는 각종 조직 유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하여 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 용이한 분화능을 보유하여 손상환부에 이식하는 것으로 치료효과를 나타내므로써 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 1 종류 혹은 2 종류 이상의 세포로 구성된 다수의 세포들의 집합인 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 혼합세포복합체는, 자가, 동종 혹은 이종의 조직으로부터 유래된 세포 또는 이들 유래의 2 종류이상의 세포들로 구성된 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 혼합세포복합체는 크기가 10 ㎛ 내지 1,500 ㎛인 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 혼합세포복합체는 유전성 질환, 전염성 질환 및 퇴행성질환 등에 의하여 자기조직 재생치료능력의 항상성(Homeostasis)의 균형에 문제가 생김으로 자력으로는 치유에 이르지 못하는 즉, 정상에서 벗어난 질병상태에 있는, 일부 혹은 전부의 손상 또는 결손된 환부에 이식치료하기 위한 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 정상에서 벗어난 질병상태는, 관절연골, 반월판, 추간판, 늑골연골, 비중격, 및 이개연골을 포함하는 연골조직의 일부 혹은 전부를 손상 혹은 결손된 환부로 인한 관절염, 관절증, 연골손상, 연골골손상, 반월판손상, 추간판변성 혹은 퇴행성관절염(Osteoarthritis, 변형성관절증), 또는 골조직의 일부를 손상 혹은 결손된 환부이고 이경우에 각 세포재료는 연골세포, 연골전구세포, 활막유래세포, 활 막줄기세포, 골아세포, 골수유래세포, 각종조직유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 지방유래세포, 지방유래줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하고 연골세포로 용의한 분화능력을 보유한 세포등 으로 구성된 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 정상에서 벗어난 질병상태는, 인슐린 의존성 제 1 형 당뇨병 혹은 인슐린 비의존성 당뇨병의 유형을 포함하는 췌도세포이식술이 치료법으로 사용될 수 있는 상태이고 이경우에 각 세포재료는 췌도세포 및 췌도에서 소정의 처리를 하여 단일세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC), 및 탄성연골(이개연골)세포를 제외한 그밖의 이식물을 수령할 개체 유래의 관절연골, 반월판, 추간판, 늑골연골, 비중격 등의 각종 연골조직으로 부터 분리한 연골세포, 각종조직유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 지방유래세포, 지방유래줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종 분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하고 췌도세포로 용의한 분화능력을 보유한 세포등 으로 구성된 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 정상에서 벗어난 질병상태는, 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부 전에 의한 실질조직의 불완전한 질환상태로서, 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포 등의 동원(recruit) 혹은 이러한 세포들의 세포이식술에 의해 이식 후 심장근육세포를 대신할 조직으로 혹은 혈관신생(Neoangiogenesis)의 유도가 치료법으로 사용될 수 있는 상태이고 이경우에 각 세포재료는혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포, 각종조직유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 지방유래세포, 지방유래줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하고 혈관세포로 용의한 분화능력을 보유한 세포등 으로 구성된 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 혼합세포복합체는, 인간을 제외한 각종의 동물에 대하여 세포이식체로서 사용함으로서 치료용으로 이용하는 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 혼합세포복합체는, 치료용의 목적과는 별도로 화합물, 약제, 독성물질 등의 피검물질의 약효 및 독성의 생리작용 혹은 독성를 평가하기 위한 시스템으로 이용하는 것이 가능한 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
(1) 혼합세포복합체를 구성하는 각 세포재료를 분리준비하는 단계 ; (2) 상기분리된 세포를 계대배양하여 증폭하는 단계 ; (3) 1 종류 혹은 2 종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하고 세포를 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양을 함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조하는 단계 ; 및 (4) 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계를 포함한 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 11 항의 단계 (1)에 있어서,

상기 분리준비되는 세포는, 각 해당 제공 조직 유래의 고유의 기능을 발휘하는 최종 분화단계의 성체세포, 상기 성체세포의 전구세포 및 아세포 및 미분화도가 높고 다능성(multi-potency) 및 고도의 증식능을 보이는 각종 조직 유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 1 종류 혹은 2 종류 이상의 세포인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 11 항 또는 제 12 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 단계 (1)의 대상조직을 쵸핑하여 분쇄한 후 단백질 분해효소를 처리하여 세포를 단리 하는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 13 항에 있어서,

상기 대상조직은, 오목한 모양의 밑바닥이 있으며 쵸핑시 대상조직이 위치된 수용기재로부터 비산되어 이탈하는 것이 방지될 수 있는 정도의 측면부 길이를 갖는 용기속의 바닥에 위치시킨 후 상기용기의 측면부 장축의 길이보다 긴 수술용 곡가위를 이용하여 쵸핑하는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 13 항 또는 제 14 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 대상조직은, 단백분해효소를 처리 시 37℃, 5％ CO₂ 의 조건하에 전자스테러(Magnetic Stirrer)을 이용하여 각반하면서 소화시키는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 11 항의 단계 (2)에 있어서,

세포가 연골세포 및 연골전구세포인경우 계대배양의 회수는 3 회이하로 제한하는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 11 항의 단계 (3)에 있어서,

세포를 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양은, 인위적인 동작에 기인하는 지속적 반복운동에 의하여 발생된 배양액내의 흐름에 의하여 각각의 세포는 배양용기의 바닥에 정체하지 않으며 배양액중에서 뜨는 현탁상태를 진탕배양기간중에 유지할수 있는 진탕배양(Shaking culture)인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 17 항에 있어서,

상기 진탕배양은, 1 일 내지 7 일 동안 진행하는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 17 항 또는 제 18 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 진탕배양은, 세포재료현탁액의 세포밀도가 1 × 10⁴/ml 내지 3,000 × 10⁴/ml 인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 11 항, 제 17 항 또는 제 19 항중 어느 한 항에 있어서

상기 세포재료현탁액은, 상기 진탕배양시 세포재료들간의 상호 양호한 접착, 세포스페로이드형성효율 향상 및 이식에 적합한 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현의 강화 등에 의한 치료효과의 극대화를 위한 1 종류 혹은 2 종류이상의 마이크로케리어(micro-carrier)를 함유한 것을 된 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 20 항에 있어서,

상기 마이크로케리어는, 상기세포재료현탁액중의 세포들의 상호접착을 촉진시키기 위한 분자로서, 각각의 세포와 상기 마이크로케리어 간에 있어서 상호 양호한 접착성을 부여하는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 11 항, 제 17 항 또는 제 19 항중 어느 한 항에 있어서

단계 (3)의 세포를 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양은, 1 회 혹은 2 회이상 반복실시하는 복수단계의 진탕배양을 하여 1 회째의 진탕배양의 결과산물인 1 차세포스페로이드를 중심으로 다시 1 종류 혹은 2 종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료현탁액을 준비하여 2 회이상의 진탕배양을 함으로써 상기 1 회째의 진탕배양의 결과산물인 1 차세포스페로이드와 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체인 2 차세포스페로이드로 새로운 혼합세포복합체를 제조하는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 11 항의 단계 (4)에 있어서,

상기 각각의 목적별 사용방법은,

제 5 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서 기재된, 이식을 통한 치유를 위한 치료, 동물에 대하여 세포이식체로서 사용하는 것 및 피검물질의 약효 및 독성을 평가하기 위한 시스템을 포함하며 이것들과는 별도로 세포이식체의 본래 갖고 있던 특정 기능을 더욱 증진되도록 하는 것, 혹은, 이식시 환자에게 유발되는 면역거부반응을 회피하기 위한 것 임을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법
제 23 항에 있어서,

세포이식체의 본래 갖고 있던 특정 기능을 더욱 증진되도록 하는 것은, 제 11 항 내지 제 24 항중 어느 한 항의 기재되어 있는 제조방법에 의한 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양으로 세포들의 집단에 있어서 상호접착을 강화시키기고 세포외기질의 생산을 촉진시켜 본래 갖고 있던 특정기능을 증진시키게 되는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 9 항 ,제 23 항 또는 제 24 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 세포이식체는, 제 11 항 내지 제 24 항중 어느 한 항에 기재되어 있는 제조방법에 의하여 수득한 세포스페로이드 또는 신체내 정상적 혹은 건강한 상태의 개체로부터 유래한 이식하고자 하는 장기 또는 조직을 잘게 절단하여 수득한 마이크로 단위의 다수의 세포들의 집합 혹은 절편인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 23 항에 있어서,

이식시 환자에게 유발되는 면역거부반응을 회피하기 위한 목적을 달성하기 위해서는, 상기 제 9 항, 제 23 항 내지 제 25 항중 어느 한 항에 기재어 있는 세포이식체를 제 22 항의 1 차세포스페로이드처럼 적용하여, 이들을 중심으로 다시 연골조직 등처럼 면역거부반응을 유발시키기 어려운 낮은 면역원성을 보이는 면역특권(immune-privilege)을 보유하는 조직으로 부터 유래하는 1 종류 혹은 2 종류이상의 세포를 배양액 내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료현탁액을 준비하여 1 회 더 진탕배양을 함으로써 세포스페로이드가 세포이식체를 면역격리시키기 위한 세포재료들을 상호접착시킨 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 26 항에 있어서,

상기 연골조직은, 탄성연골인 이개연골을 제외한 그밖의 관절연골, 반월판, 추간판, 늑골연골, 비중격 등의 이식물을 수령할 개체 유래인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 26 항에 있어서,

상기 연골조직은, 이식물을 수령할 개체 유래의 탄성연골인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 11 항 내지 제 28 항중 어느 한 항에 있어서,

제 11 항의 단계 (4)의 제조된 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계는 혼합세포복합체가 통과 가능한 마 이크로피펫의 팁 혹은 주사용바늘을 이용하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동하는 과정에 있어서 내시경하 혹은 관절경하에 수술이 가능한 형태로 준비된 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 16 항에 있어서,

상기 제조된 세포스페로이드를 이동하는 단계는, 제 20 항 또는 제 21 항중 어느 한 항에 기재되어 있는 마이크로케리어를 추가적으로 이용하는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 20 항 ,제 21 항 또는 제 30 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 마이크로케리어는, 콜라겐, 콜라겐유도체, 히알루론산, 히알루론산유도체, 루브리신(Lubricin), 뮤신(Mucin), 키토산, 키토산유도체, 폴리로타키산, 폴리로타키산유도체, 키틴, 키틴유도체, 우레탄, 셀룰로스, 아가로스, 젤라틴, 피브리오넥틴, 피브린, 다혈소판혈장, 헤파린, 헤파린유도체, 후라그민(Fragmin, 일반명 : [Dalteparin sodium]), 유산프로타민(Protamine sulfate), Avidin, Streptavidin, Biotin, 라미닌(Laminin), 2-Octyl Cyanoacryleate, 알길산칼슘, 폴리유산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐알콜, 폴리프로필렌, 폴리글리콜산, 폴리카프로락탐, 폴리유산폴리글리콜산공중합체, 폴리유산폴리카프로탁탐공중합체 및 폴리글리콜산폴리카프로락탐공중합체으로 만들어진 군으로 부터 선택한 1 종류 혹은 2 종류이상의 생체친화성 재료 또는 생체흡수성 재료로 형성된 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 5 항, 제 7 항, 제 8 항, 제 9 항 또는 제 11 항 내지 제 31 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 이식은, 제 1 항 내지 제 31 항중 어느 한 항에 기재되어 있는 혼합세포복합체인 이식치료용 세포스페로이드의 세포성분, 상기 세포스페로이드의 구성세포로부터 분비된 분자 및 생산된 세포외기질, 상기 이식치료용 세포스페로이드의 제조과정에 있어서 사용한 배양액 및 세포현탁액, 마이크로케리어 함유액 또는 운반용 용액을 단독 혹은 동시에 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 것을 특징으로 하는 이식치료용 스페로이드의 제조방법.
제 32 항에 있어서,

상기 운반용 용액은, 제 1 항 내지 제 32 항중 어느 한 항에 기재되어 있는 이식치료용 세포스페로이드의 제조과정에 있어서 사용한 배양액 및 세포현탁액, 마이크로케리어 함유액 또는 각종 완충 액, 생리식염수 등의 체액에 유사한 조성인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 33 항에 있어서,

상기 운반용용액을 통상적인 동결건조법 및 멸균 처리하여 얻어진 분말상의 물질에는 상기운반용용액 중에 존재하는 치료에 유효하고 유용한 성분이 함유되어 있으며, 활용가능한 용매에 상기 동결건조법 및 멸균 처리하여 얻어진 분말상의 물질을 용해시켜 목적달성을 위한 적절한 농도로 조절한 뒤 이용함으로써, 각종 치료, 재생, 건강증진의 목적으로 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 5 항, 제 7 항, 제 8 항, 제 9 항 또는 제 11 항 내지 제 34 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 이식은, 제 2 항 기재의 이용 목적에 따라서 선택할 수 있는 각 해당 제공 조직 유래의 고유의 기능을 발휘하는 최종 분화단계의 성체세포, 상기 성체세포의 전구세포 및 아세포 및 미분화도가 높고 다능성(multi-potency) 및 고도의 증식능을 보이는 각종 조직 유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하여 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 용이한 분화능을 보유하여 손상환부에 이식하는 것으로 치료효과를 나타내므로써 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 1 종류 혹은 2 종류 이상의 세포를 일정기간 배양하여 시트상(sheet-like) 형태로 상기세포와 세포외기질로 구성된 배양세포시트 단독 혹은 상기 배양세포시트와 같이 콜라겐, 콜라겐유도체, 히알루론산, 히알루론산유도체, 루브리신(Lubricin), 뮤신(Mucin), 키토산, 키토산유도체, 폴리로타키산, 폴리로타키산유도체, 키틴, 키틴유도체, 우레탄, 셀룰로스, 아가로스, 젤라틴, 피브리오넥틴, 피브린, 다혈소판혈장, 헤파린, 헤파린유도체, 후라그민(Fragmin, 일반명 : [Dalteparin sodium]), 유산프로타민(Protamine sulfate), Avidin, Streptavidin, Biotin, 라미닌(Laminin), 2-Octyl Cyanoacryleate, 알길산칼슘, 폴리유산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐알콜, 폴리프로필렌, 폴리글리콜산, 폴리카프로락탐, 폴리유산폴리글리콜산공중합체, 폴리유산폴리카프로탁탐공중합체 및 폴리글리콜산폴리카프로락탐공중합체으로 만들어진 군으로 부터 선택한 1 종류 혹은 2 종류이상의 생체친화성 재료 또는 생체흡수성 재료인 인공바이오매터리얼로 형성된 시트상구조물 및 다양한 모양의 구조물을 보조적으로 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시킬 때 상기 소정의 장소에 대하여 피복 혹은 충진하는 것이 가능한 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 1 항 내지 제 35 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 이식치료용 세포스페로이드의 제조기간은, 14 일이내인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조과정.
제 11 항, 제 17 항, 제 22 항, 제 26 항, 제 32 항 또는제 33 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 배양액은, 연골분화유도배지인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조과정.
제 11 항 내지 제 37 항중 어느 한 항에 있어서,

제 11 항의 단계 (4)의 제조된 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계는 혼합세포복합체가 통과 가능한 마이크로피펫의 팁 혹은 주사용바늘을 이용하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동하는 과정에 있어서 내시경하 혹은 관절경하에 수술이 가능한 형태로 준비된 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
제 5 항의 단계 (1)에 있어서,

상기 각세포재료는, 제 2 항 기재의 이용 목적에 따라서 선택할 수 있는 각 해당 제공 조직 유래의 고유의 기능을 발휘하는 최종 분화단계의 성체세포, 상기 성체세포의 전구세포 및 아세포 및 미분화도가 높고 다능성(multi-potency) 및 고도의 증식능을 보이는 각종 조직 유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하여 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 용이한 분화능을 보유하여 손상환부에 이식하는 것으로 치료효과를 나타내므로써 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 1 종류 혹은 2 종류 이상의 세포를 분리하여 목적으로 한 세포로 분화시킨 후 얻은 세포인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조과정.