WO2011037416A2 - 세포이식술을 위한 혼합세포복합체인 세포스페로이드의 제조방법 및 이의 이용방법 - Google Patents

세포이식술을 위한 혼합세포복합체인 세포스페로이드의 제조방법 및 이의 이용방법 Download PDF

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells

Definitions

  • the mixed cell complex has a problem in balancing homeostasis of self-renewal regeneration ability due to hereditary disease, infectious disease, and degenerative disease, so that the self-healing cannot be cured by magnetic force.
  • a collection of cells that can replace the various tissues that make up the body that are expressed as normal or healthy conditions in the body.
  • TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing a cell spheroid, and relates to the field of biology, medicine, and the like of each tissue in each animal body.
  • the mixed cell complex is a tissue similar to a normal or healthy state in the body, and a number of cells that can replace various tissues constituting the body (for example, in cartilage tissue, are expressed as chondrocyte tissue).
  • each cell material composed of cell spheroids expressed as pancreatic endocrine cells that secrete insulin and the like is isolated and prepared, and then subcultured and amplified to prepare each cell.
  • the cell materials are adhered to each other to prepare a mixed cell complex to separate cell spheroids for each purpose.
  • Method for producing a cell spheroid for transplantation treatment comprising the step of moving to a predetermined place according to the method and its use It relates to the law.
  • Cell therapy transplantation is increasingly being used as a means of research in academic fields and as a tool for technological development in industrial fields. Such cell therapy transplants have a significant ripple effect on various industries, and thus are important in terms of national industries.
  • Cell therapy for use in cell therapy transplantation is incubated in a living self (autologous), allogeneic (allogenic), or two kinds (xenegenic) in vitro environment (in vitro) the cell in order to restore the function of cells and tissues Throughout the process, it refers to a medicinal product that is used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions that isolate, proliferate, select, or otherwise alter the biological properties of the cell.
  • each cell material consisting of a number of cells that can replace various tissues that make up the expressed body as tissues similar to normal or healthy state in the body used in cell therapy transplantation using cell therapy.
  • a series of acts that change the biological properties of cells through incubation in vitro can be used for treatment by injecting an implant into a recipient or by making human tissue from these cells.
  • Cell therapy used in cell transplantation is a cell unit, so cells that are genetically modified to have a new function (e.g. hormone secretion, to recognize specific antigens, etc.) or to further enhance the specific function that they originally had
  • the cell therapy may be classified into adult cell therapy and stem cell therapy, depending on the degree of differentiation of the cells used.
  • adult cell therapeutic agents include autologous chondrocytes or bone cells used for autologous chondrocyte transplantation to treat cartilage tissue and bone tissue damage, pancreatic islet cells for the treatment of diabetes mellitus, various cardiovascular diseases, and diseases caused by peripheral vascular insufficiency.
  • EPC endothelial progenitor cells
  • fetal neurons Treatment of various dopamine secretory cells, including fetal neural cells, natural killer cells, dendritic cells and cytotoxic T cells, and corneal damage for the treatment of cancer and
  • stem cell therapeutics are similar to embryonic stem cells (ES cells) in terms of using stem cells derived from various tissues with high degree of undifferentiation and multi-potency and high proliferative capacity. It is a kind of tissue that has functional and proliferative ability and is similar to a normal or healthy state in the body, and has an easy differentiation ability and is transplanted to an injured lesion to have a therapeutic effect, so that it can replace various tissues constituting the body. Two or more kinds of cells are separated, differentiated into cells of interest, and the obtained cells are used.
  • ES cells embryonic stem cells
  • Cell therapy used in cell therapy transplants can inject cells directly into the patient to restore and restore the function or tissue of the damaged cells, so there is no toxicity in the body and surgical treatment by regenerating and maintaining the original function of body tissues. It can also be a radical therapy that drug therapy cannot.
  • Representative diseases that can be treated with the cell therapy and cells used at this time are autologous chondrocytes or bone cells used for autologous chondrocyte transplantation to treat cartilage and bone tissue damage, and islets for the treatment of diabetes mellitus.
  • Vascular endothelial cells, endothelial progenitor cells (EPC), endothelial stem cells, cardiomyocytes and muscle cells for the treatment of diseases caused by cells, various cardiovascular diseases and peripheral vascular dysfunction.
  • EPC endothelial progenitor cells
  • Arthritis which causes motor dysfunction, includes a variety of diseases, but in the United States, more than 70 million patients visited medical facilities in 2002 based on arthritis-related diseases or chronic joint symptoms. This is the frequency of one in three adults and is expected to double the number by 2020.
  • cartilage tissues are prepared using chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells isolated from articular cartilage in the nasal conjunctiva.
  • a case has been applied to a case of traumatic osteochondral damage or biphasic chondritis that has a small range of cartilage defects from the original (Japanese Patent Registration: Japanese Patent Application No. 2001-384446 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-180819), Japanese Patent Application No. 2002-216561). (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-111831), Japanese Patent Application No. 2003-58118 (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-136096).
  • cartilaginous tissue and bone tissue are mostly made of a single type of cells (that is, chondrocytes alone, bone cells alone or stem cells alone), as an additional substance in addition to the protein produced from the cultured cells, Since the single cell suspension to be transplanted supplementally or complementarily uses a tissue regeneration substrate, which is a support formed of a protein, sugar or artificial biomaterial, which is a substance for preventing the escape from the transplanted lesion, Direct effects of living organisms due to defects such as foreign body reactions and poor in vivo compatibility have been addressed as problems to be solved. Therefore, considering these problems, which are not practically easy to apply in reality, it can be said that the development of a technology that minimizes the use of such a support is urgently needed.
  • Hunziker et al. who are actively carrying out the treatment of degenerative arthritis from the basic research point, pointed out that the pathology of degenerative arthritis is the partial defect in which cartilage degeneration and cartilage tissue damage does not reach the subchondral bone.
  • Basic research has been conducted using the partial defect model of. At this time, it is reported that the central role of cartilage repair and regeneration is not chondrocytes but synovial cells (Hunziker et al., The journal of Bone and Joint Surgery, 78-A, 721 (1996)).
  • the fact that such a technique is also small in the range of treatment is less feasible as a practical treatment for a wide range of degeneration, and the establishment of an initial treatment technique for a wide range of osteochondral defects is urgently needed.
  • adult stem cells The existence of adult stem cells has been confirmed in each tissue in vivo, and mesenchymal stem cells derived from various tissues have also been identified locally.
  • synovial-derived cells and bone marrow-derived cells were used to differentiate into tissues expressed as chondrocytes by using mesenchymal stem cells having differentiation capacity into chondrocytes, and then reconstructed in vitro and in vivo .
  • Many studies have been reported to be successful.
  • Adult stem cells are capable of differentiation and regeneration into various tissues constituting the living body, and their proliferative ability is much higher than that of somatic cells derived from general tissues, in particular by culturing in vitro.
  • the mesenchymal stem cells with such a high proliferation rate are considered to be advantageous in terms of developmental aspects and differentiation.
  • diabetes is divided into 'insulin dependent diabetes' and 'insulin independent diabetes', but the precise mechanism of diabetes that distinguishes the two types of diabetes is still It is unknown.
  • Patients of 'insulin dependent diabetes mellitus' among the two types of diabetes have to be continuously supplied with insulin from the outside because their ability to produce insulin is greatly separated. However, it is almost impossible to continuously supply insulin to meet physiological demands.
  • insulin exists in a concentration gradient in the body, the concentration of insulin decreases in the order of the portal vein ⁇ liver ⁇ hepatic vein ⁇ aorta ⁇ muscle. When insulin is injected into the body from the outside, such a concentration gradient is not formed and side effects occur.
  • pancreatic beta-cells secrete more than 11 different substances in addition to insulin to maintain metabolism smoothly, administration of insulin alone can lower blood sugar but prevent hypoglycemia and treat other complications.
  • the hypoglycemic agent used for the treatment of diabetes mellitus has a hypoglycemic function, but it is difficult to use for a long time due to the hypoglycemic resistance and severe side effects are not used.
  • pancreatic islet transplantation is a novel treatment for severe insulin dependent type 1 diabetes.
  • clinical procedure reports have been increasing every year in the world, receiving attention as a fundamental treatment in that renal failure, which is not resolved only by the administration of insulin, and secondary diseases such as neuropathic foot and foot ulcers can be treated without resting symptoms.
  • the present inventors have also developed and presented microparticles surrounding the transplanted pancreatic islet using elastic cartilage derived from an individual who will receive an implant for isothermal isolation in Korean islets. 10-0788800 (WO / 2008/002059).
  • pancreatic islets the supply of pancreatic islets is absolutely insufficient, and endocrine cells (pancreatic cells) separated into single cells by predetermined treatment in the pancreatic islets, which are mixed cell complexes containing various types of endocrine cells, are histologically normal.
  • Methods that can be used as a method for the treatment of cell transplantation through the production of cell spheroid for transplantation treatment including the mass propagation of pancreatic islets in various ways including the method of propagating endocrine cells (PEC) You can consider.
  • the formation of the cardiovascular system is one of the phenomena occurring in the early stage even in the developmental stage, and even after the adulthood, it has the same dynamic structure of new life, restoration, and death throughout life.
  • stem cells or regenerative medicine attention has been paid to cells that play an important role in angiogenesis, as well as active treatment for various tissue damages not only in the early stages of development but also in the subsequent vascular repair after adulthood. .
  • Endothelial progenitor cells belong to one of the monocyte components present in peripheral blood, proliferate and differentiate in bone marrow tissues responsible for angiogenesis, and move to the place where angiogenesis is progressing, forming angiogenesis. It is known that the cells possess important functions in (Asahara et al., Science 275, 964, (1997), Asahara et al., EMBO J, 18,3964 (1999), Takahashi et al., Nature Medicine, 4,434 (1999)).
  • vascular regeneration therapy by vascular endothelial progenitor cell transplantation therapy has been attempted in the clinical trials for coronary artery disease, lower limb ischemic disease and the like which are severe ischemic nitrification (Japanese Patent Registration: Japanese Patent Application No. 2005-286607 (Patent No. 2007-89537) )).
  • Japanese Patent Registration Japanese Patent Application No. 2005-286607 (Patent No. 2007-89537)
  • the role of blood and endothelial progenitor cells to enhance the regenerative capacity of the cardiovascular system and various tissues and organs is expected.
  • it is necessary to improve the amount of blood and endothelial progenitor cells present in extremely small numbers and to improve their function.
  • vascular endothelial progenitor cells The movement to apply vascular endothelial progenitor cells to vascular regeneration treatment can be explained by some of the superior characteristics of these vascular endothelial progenitor cells over several embryonic stem cells or other tissue-specific adult stem cells. This is due to the unique therapeutic purpose of EPC, in addition to being able to use his own blood or bone marrow tissue to regenerate his tissue.
  • Vascular endothelial progenitor cells 1) mutations to other cells (especially pathological to cancer cells) do not occur frequently, 2) VEGF (Vascular Endthelial Growth Factor), Angiopoietin-1, HGF secrete a large amount of vascular regeneration factors 3) is active in angiogenesis within the tissue, and 4) the half life of the transplanted cells is relatively short is the most suitable cell for clinical treatment applications for cardiovascular diseases through revascularization.
  • VEGF Vascular Endthelial Growth Factor
  • Angiopoietin-1 Angiopoietin-1
  • HGF secrete a large amount of vascular regeneration factors
  • the abnormal state of the disease is an incomplete disease state of the parenchyma caused by various cardiovascular diseases and peripheral vascular insufficiency.
  • the body is unhealthy due to various causes of the vascular system because the vascular system is distributed in almost all tissues.
  • One disease requires reconstruction of a healthy cardiovascular system with new neovascularization, in which case vascular endothelial cells, endothelial progenitor cells (EPCs), endothelial stem cells and cardiomyocytes, Endothelial progenitor cells (endothelial) in tissues that are required to induce neoangiogenesis or tissues to replace cardiomyocytes after transplantation of cells such as muscle cells or cell transplantation.
  • progenitor cells (EPC) endothelial stem cells and cardiomyocytes and muscle cells
  • mesenchymal stem cells mesenchymal stem cells, pancreatic endocrine cells (PEC) isolated from single cells in the pancreatic islets, and vascular endothelial progenitor cells, such as vascular endothelial progenitor cells for the preparation of transplant therapy cell spheroid
  • PEC pancreatic endocrine cells
  • mesenchymal stem cells in particular, pancreatic endocrine cells (PECs), and vascular endothelial progenitor cells, which are isolated from single cells in the pancreatic islets, have high proliferative capacity even under normal cell culture conditions. Having an easy differentiation ability into a tissue enables the production of a cell spheroid for transplantation treatment at a predetermined target in a short time.
  • PECs pancreatic endocrine cells
  • vascular endothelial progenitor cells which are isolated from single cells in the pancreatic islets, have high proliferative capacity even under normal cell culture conditions. Having an easy differentiation ability into a tissue enables the production of a cell spheroid for transplantation treatment at a predetermined target in a short time.
  • one type of cell or tissue is used as a structure composed of a tissue regeneration material or a culture solution or a transport solution, which is a scaffold formed of a biocompatible material or an artificial biomaterial that is a bioabsorbable material, and has a self-healing ability.
  • Cartilage tissue using tissue engineering technology (Langer et al., Science 260, 920, (1993)) and regenerative medicine (Petit-Zeman, Nature Biotechnology 19, 201, (2001))
  • Various tissues that make up the body expressed as a normal or healthy state in the body including the treatment of bone tissue, the treatment of diabetes mellitus, and the treatment of diseases caused by various cardiovascular diseases and peripheral vascular dysfunction.
  • Therapies used for therapeutic treatment by creating human tissues have attracted attention.
  • autologous chondrocytes or bone cells used in autologous chondrocyte transplantation to treat cartilage and bone tissue damage that has been developed by such tissue engineering and regenerative medicine so far pancreatic islet cells for treating diabetes, various cardiovascular diseases, and Tissues similar to normal or healthy conditions in the body capable of transplantation prepared in an ex vivo environment such as vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, endothelial stem cells, and cardiomyocytes and muscle cells to treat disease states caused by peripheral vascular dysfunction.
  • the regenerated tissues expressed as transgenic cells and the related transplanted cells that make up the structure were mostly made of a single kind of cells.
  • treatment of cartilage and bone tissue treatments of cartilage and bone tissue, treatment of diabetes mellitus, and various cardiovascular diseases and peripheral vascular dysfunction include autologous chondrocytes, bone cells, and islets used in autologous chondrocyte transplantation in the affected area.
  • Endocrine cells PEC
  • vascular endothelial cells EPC
  • endothelial progenitor cells EPC
  • endothelial stem cells cardiomyocytes and muscle cells or their tissues isolated from Consider how to transplant.
  • Non-Patent Document 1 Langer et al., Science 260, 920, (1993)
  • Non-Patent Document 2 Petit-Zemane, Nature Biotechnology 19, 201, (2001)
  • Non-Patent Document 3 Brittiberg et al., New England Journal of Medicine, 331 (14), 889 (1994)
  • Non-Patent Document 5 Hunziker et al., The journal of Bone and Joint Surgery, 78-A, 721 (1996)
  • Non-Patent Document 6 Sekiya et al., Stem cell, 25, 689 (2007)
  • Non-Patent Document 8 Heat Transfer et al., Journal of Bone and Mineral Research, 17-8,1420 (2002)
  • Non-Patent Document 9 Shapiro et al., Lancet 358 Suppl, S21, (2001),
  • Non-Patent Document 10 Lee et al., Cell Transplantation 17, 51, (2008)
  • Non-Patent Document 11 Asahara et al., Science 275, 964, (1997),
  • Non-Patent Document 12 Asahara et al., EMBO J, 18,3964 (1999)
  • Non-Patent Document 13 Takahashi et al., Nature Medicine, 4,434 (1999)
  • Patent Document 1 Japanese Patent Registration Document: ⁇ ⁇ 2003-180819 ⁇ ⁇
  • Patent Document 2 Japanese Patent Registration Document: ⁇ ⁇ 2003-111831 ⁇ ⁇
  • Patent Document 3 Japanese Patent Registration Document: ⁇ ⁇ 2004-136096 ⁇ ⁇
  • Patent Document 4 Korean Patent Registration Document: Patent No. 10-0788800
  • Patent Document 5 Japanese Patent Registration Document: ⁇ ⁇ 2007-89537 ⁇ ⁇
  • the mixed cell complexes may be formed in various forms of the body that are expressed as tissues similar to normal or healthy conditions in the body.
  • Each cell material constituting the cell spheroid and the mixed cell complex which is a collection of a plurality of cells that can replace the tissue, is prepared and separated and passaged and amplified, and then one or more types of cells are removed.
  • Prepare a mixed cell complex by preparing cell mixtures by adhering the cell materials by preparing a single or mixed cell material suspension in a culture medium and shaking culture, and shaking the cells to separate the prepared cell spheroids.
  • Method for producing a cell spheroid for transplantation treatment comprising the step of moving to a place and It is an object of the present invention to provide a system for evaluating the physiological effects or toxicities of the medicinal effects and toxicities of a test substance such as a compound, a drug, a toxic substance, and the like separately from the therapeutic purpose.
  • Each cell material constituting the cell spheroid for transplantation treatment when applied in autologous chondrocyte transplantation for treating damage to cartilage tissue and bone tissue, as well as the use of autologous chondrocytes or osteoblastic chondrocytes alone as well as one type
  • the use of various stem cells or cartilage progenitor cells which have two or more kinds of high proliferative capacity and easy differentiation into cartilage tissues, enables the preparation of a large amount of cell spheroids for transplantation therapy expressed as chondrogenic tissues.
  • each cell material constituting the cell spheroid for transplantation treatment is a pancreatic endocrine cell (PEC) isolated from a single cell in the pancreatic islet or the pancreatic islet for diabetic treatment, or various cardiovascular diseases and peripheral vascular insufficiency.
  • PEC pancreatic endocrine cell
  • Vascular endothelial cells, endothelial progenitor cells (EPC), endothelial stem cells, cardiomyocytes, and muscle cells to treat diseases caused by It is possible to prepare a large amount of cell spheroids for the transgenic expression of transplanted grafts, which may be an alternative to the situation in which the supply of the pancreatic islets to be transplanted due to the chronic organ deficiency in clinical pancreatic transplantation is absolutely insufficient.
  • cell suspension consisting of single cells for treatment, but has two or more three-dimensional structures of one type or mutual security relationship.
  • cell spheroid a collection of a number of cells, further enhances the specific functions originally possessed, and enables the close integration of cells in the structure of the cell spheroid to communicate closely with each constituent cell within the structure of the cell spheroid after transplantation. It is also quite useful. In addition, depending on the characteristics of the cells used, it may be useful because it can hold new functions such as immuno-isolation.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing and using the cell spheroid for the transplantation treatment.
  • the present invention provides a cell spheroid for transplantation therapy in which a mixed cell complex is a collection of a plurality of cells that can replace various tissues constituting the body expressed as a tissue similar to a normal or healthy state in the body. To provide.
  • the cell spheroid for transplantation treatment is used for autologous chondrocytes or osteoblastic chondrocytes when each cell material constituting the mixed cell complex is applied in autologous chondrocyte transplantation to treat cartilage tissue and bone tissue damage.
  • Transplant treatment cell sp. Expresses as chondrogenic tissues by using various stem cells or chondrocyte precursor cells that have high proliferative ability as well as one or two or more types, as well as use alone, and have easy differentiation into cartilage tissues. It is possible to prepare a large amount of Lloyd, which is very useful in establishing treatment techniques for extensive degeneration of cartilage and bone tissues, or degeneration of cartilage and partial defects in which cartilage tissue damage does not reach the subchondral bone.
  • the present invention does not use a periosteal patch, the burden on the patient side can be reduced compared to the conventional autologous chondrocyte transplantation, and the incision site can be minimized, thereby reducing the invasion by surgery.
  • the inventors of the present invention to the carrier production suitable for cartilage regeneration by tissue engineering method, the study of the construction of an intelligent extracellular environment, the study of cartilage regeneration by allograft of tissue-engineered cartilage, and The researches on cartilage repair and regeneration by chondrocyte sheets or regenerated cartilage plates that do not use artificial scaffolds have been successful.
  • These results suggest that the presence of mesenchymal stem cells mobilized to the damaged area is a prerequisite for treating the damage, and that the presence of tissue-engineered cartilage components is important as the minimum cartilage inducing initiator required for tissue repair and regeneration. Suggesting.
  • each cell material constituting the cell spheroid for transplantation treatment is a pancreatic endocrine cell (PEC) isolated from a single cell in the pancreatic islet or the pancreatic islet for diabetic treatment, or various cardiovascular diseases and peripheral vascular insufficiency.
  • PEC pancreatic endocrine cell
  • Vascular endothelial cells, endothelial progenitor cells (EPC), endothelial stem cells, cardiomyocytes, and muscle cells to treat diseases caused by It is possible to prepare a large amount of cell spheroids for the transgenic expression of transplanted grafts, which may be an alternative to the situation in which the supply of the pancreatic islets to be transplanted due to the chronic organ deficiency in clinical pancreatic transplantation is absolutely insufficient.
  • cell suspension consisting of single cells for treatment but has one or two or more three-dimensional structures of mutual security.
  • cell spheroid a collection of a number of cells, further enhances the specific functions originally possessed, and enables the close integration of cells in the structure of the cell spheroid to communicate closely with each constituent cell within the structure of the cell spheroid after transplantation. It is also quite useful. In addition, depending on the characteristics of the cells used, it may be useful because it can hold new functions such as immuno-isolation.
  • Fig. 1 shows a schematic diagram showing a mixed cell complex in which cell materials are bonded to each other by preparing and shaking culture of a single cell material suspension in a culture medium of one cell in a culture medium.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a mixed cell complex in which two kinds of cells, cell material A and cell material B, are bonded to each other by preparing a mixed cell material suspension in a culture medium and shaking with each other. It is shown.
  • Figure 3 is another embodiment of the present invention, the culture medium of one or two or more kinds of cells again with a focus on the primary cell spheroid as a result of the first shaking culture by performing a plurality of shaking cultures repeated two or more times
  • Secondary cell spores which are mixed cell complexes in which the primary cell spheroid, which is the result of the first shaking culture, and the cell materials are mutually bonded by preparing single or mixed cell material suspensions and culturing at least two times.
  • the schematic diagram showing the mixed cell complex formed by Lloyd is shown.
  • Figure 4 shows a schematic diagram showing an embodiment of a cell spheroid for transplantation treatment, which is a mixed cell complex of a therapeutic method that is used as an auxiliary method by using an auxiliary sheet-like structure (cartilage cell sheet) in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 illustrates an embodiment in which the mixed cell complexes are assisted by using a sheet-like structure (cartilage cell sheet) so as to securely fix the mixed cell complexes to a predetermined place according to each purpose-use method.
  • the total production time of the cell spheroid for transplantation treatment, including passage period and shaking culture period, is an example of a manufacturing process schedule of about 14 days.
  • Fig. 6 is a phase difference of a mixed cell complex in which cell materials are mutually bonded by shaking culture of a cell suspension of 75% synovial-derived cells and 25% chondrocytes. It observed under the microscope and the result is shown.
  • Fig. 7 is a phase contrast microscope of a mixed cell complex in which cell materials are mutually bonded by shaking culture of a cell suspension of 4 25% synovial-derived cells. 75% chondrocytes. The observation is shown below.
  • Fig. 8A is an aspect of the invention, in which one cell (i.e., 5% synovial-derived cell. 100% chondrocyte-derived cell suspension is subjected to a planar circular movement while adding a movement in a planar circular manner to mutually adhere the cell materials. The mixed cell complexes were observed under a phase contrast microscope to show the results.
  • one cell i.e., 5% synovial-derived cell. 100% chondrocyte-derived cell suspension is subjected to a planar circular movement while adding a movement in a planar circular manner to mutually adhere the cell materials.
  • the mixed cell complexes were observed under a phase contrast microscope to show the results.
  • Fig. 8B shows an embodiment of the present invention in which cell materials are cultured by adding shaking motion to a cell suspension of one type of cell (i.e., 5% synovial-derived cells.
  • the intercellular bonded mixed cell complexes were observed under a phase contrast microscope to show the results.
  • Fig. 9 shows the ratio of chondrocytes and synovial-derived cells according to one embodiment of the present invention, i.e. 100% synovial-derived cells. 0% chondrogenic cell suspensions, 75% synovial-derived cells. 25% chondrogenic cell suspensions. 3 50% synovial cell-derived cell suspension, 50% chondrogenic cell suspension, 4 25% synovial cell-derived cell suspension, 75% chondrogenic cell suspension, 5 0% synovial cell-derived cell suspension, 100% chondrogenic cell suspension.
  • the mixed cell complexes in which cell materials were bonded to each other were observed under a phase contrast microscope, and the results are shown.
  • Fig. 10 shows a mixed cell complex in which the cell materials are adhered to each other by shaking culture for 5 days with a ratio of chondrocytes and synovial-derived cells to 50% synovial-derived cells. Is observed under a confocal laser microscope to show the results.
  • Figure 11 is a culture solution of one or two or more kinds of cells in the form of the first cell spheroid which is the result of the first shaking culture by performing a plurality of shaking cultures repeated two or more times in another embodiment of the present invention.
  • Secondary cell spores which are mixed cell complexes in which the primary cell spheroid, which is the result of the first shaking culture, and the cell material are bonded to each other by preparing a cell material turbidity solution alone or in a mixture and performing two or more shaking cultures. Lloyd's mixed cell complexes were observed under a phase contrast microscope to show the results.
  • Figure 12 in another embodiment of the present invention the mixed cell complex began to be observed visually from 12 hours after the start of shaking culture, it was possible to observe the whole process of shaking culture. The results of visual observation of the obtained cell spheroids are shown.
  • FIG. 13 shows a mixed cell complex in which the ratio of chondrocytes and synovial-derived cells is 50% synovial-derived cells. The results of histopathological examination of immunohistochemical staining were performed.
  • Fig. 14A shows a mixed cell complex in which cell materials are adhered to each other by shaking culture for 3 days with a cell suspension of chondrocytes and synovial-derived cells; The results of gross observation findings after transplantation were transferred to the injured area of the knee cartilage of the total thickness of the rabbit's femur.
  • Fig. 14B shows a mixed cell complex in which the cell materials are mutually adhered by shaking culture for 3 days with a cell suspension of chondrocytes and synovial-derived cells; The results of histopathological examination of immunohistochemical staining in which the cell spheroids were transplanted to the injured area of the knee cartilage on the entire surface of the rabbit's femur at 4 weeks after transplantation were shown.
  • a mixed cell complex is a cell for transplantation therapy, wherein the mixed cell complex is a collection of a plurality of cells that can replace various tissues constituting the body expressed as a tissue similar to a normal or healthy state in the body.
  • the mixed cell complex is a collection of a plurality of cells that can replace various tissues constituting the body expressed as a tissue similar to a normal or healthy state in the body.
  • spheroids arthritis, arthrosis, cartilage damage, cartilage damage, meniscus damage, intervertebral disc degeneration or osteoarthritis, or damage or defects in parts of bone tissue
  • insulin-dependent type 1 diabetes or insulin-independent diabetes The present invention relates to a cell spheroid for transplantation therapy for the treatment of a disease in which pancreatic islet cell transplantation including the disease may be used as a treatment or incomplete disease of the parenchymal tissue due to various cardiovascular diseases and peripheral vascular insufficiency.
  • the "mixed cell complex” refers to a cell spheroid, which is a collection of a plurality of cells that can replace various tissues constituting the expressed body as a tissue similar to a normal or healthy state in the body.
  • ES cells normal or healthy condition in the body with similar versatility and proliferative capacity as ES cells such as cells or mesenchymal stem cells, embryonic stem cells (ES cells), and induced multifunctional stem cells (iPS cells) that initiate various differentiated cells It is a tissue similar to that of graft, and has an easy differentiation ability and is transplanted to the damaged part of the back of cartilage tissue, islet tissue or vascular tissue.
  • Cell spheroid may be a collection of a plurality of cells consisting of one or two or more types of cells that can replace various tissues constituting the body by exhibiting a therapeutic effect. This is because, since the cells having pluripotency are undifferentiated cells, they are expected to differentiate into cells suitable for living tissue at the transplanted site after transplantation.
  • it may be a cell spheroid consisting of cells derived from a collection or section of a plurality of micro-units obtained by finely cutting the organ or tissue to be transplanted from a normal or healthy subject in the body.
  • the mixed cell complex is preferably a cell material derived from autologous tissues for ideal cell transplantation without immune rejection reaction or ethical problem, but the cartilage tissues do not have blood vessels, nerves or lymphatic vessels in normal condition, and thus invade inflammatory cells such as white blood cells.
  • the cell material derived from each of the donor tissues that can be selected according to the purpose of use in the present invention is not particularly limited.
  • the adult cells in the final stage of differentiation which have inherent functions, are preferred in addition to chondrocytes, which can be expected to have excellent effects in treating certain diseases.
  • the implant may be used to treat diabetes when the pancreas is derived, and when the implant is derived from the thyroid gland, respectively, to treat hypothyroidism.
  • the implant may be used to treat anemia, dwarfism, and hemophilia when the erythropoietin-secreting cells, growth hormone-secreting cells, or blood-clotting factors secrete cells.
  • it can be used as a system for evaluating the efficacy or toxicity of the therapeutic and test substance.
  • the cell spheroid for transplantation treatment of the mixed cell body has a size in the range of 10 ⁇ m to 1,500 ⁇ m for the treatment.
  • Cellular spheroids for transplantation therapy are preferably 600 ⁇ m in size, which means that spheroids made from somatic cells derived from general tissues have a distance from the center to the surface layer of spheroids up to 300 ⁇ m under normal culture conditions. This is because gas and nutrients are more convincing, allowing for longer lifespan of cell spheroids and promoting their proliferation, which is much more advantageous for the original function of the implant.
  • the relatively thin mixed cell complex allows for better diffusion of gas and nutrients to extend the life of the graft and to maintain the expression of cartilage tissue, thus providing a much more inherent function of cell spheroids. Because it works advantageously.
  • cartilage tissue is rich in extracellular matrix secreted from chondrocytes in the normal state, and the cartilage cells themselves are only a few percent.
  • the distance from the center of spheroids to the surface of the spheroids, which can diffuse gas and nutrients better than other cells is expected to be greater than 300 ⁇ m. But shorter than 1,500 ⁇ m is preferred.
  • the present invention comprises the steps of: (1) isolating and preparing each cell material constituting the mixed cell complex; (2) passaging and amplifying the separated cells; (3) one or two or more types of cells in the culture medium Preparing a mixed cell complex by adhering the cell materials to each other by preparing a single or mixed cell material suspension and culturing the cells in a dense suspended state; and (4) separating the cell spheroids, respectively. It relates to a method for producing a spheroid for transplantation cell treatment comprising the step of moving to a predetermined place according to the purpose of use.
  • each cell material constituting the cell spheroid is applied in autologous chondrocyte transplantation for treating damage to cartilage tissue and bone tissue.
  • each cell material constituting the mixed cell complex is prepared.
  • the donor tissue which is the origin of each cell material constituting the mixed cell complex, is removed to remove skin tissue, subcutaneous tissue, muscle tissue, subchondral bone, ligaments, meniscus, and other connective tissue. It is then chopped into pieces by physical means such as homogenizers, mortars, blenders, surgical masses, syringes, forceps, ultrasonic devices.
  • a substrate such as a substrate of a resin material including a culture plate, a centrifugal container, a supermaterial containing a watch glass, etc. may be used as a sterile substrate containing a corresponding donor tissue.
  • the chopped target tissue may be scattered from the receiving base where it is located when chopping. This phenomenon reduces the recovery of tissue after chopping of the donor tissue, and if it continues to choke away the tissue that was scattered from the accepted placement placed there, the bacteria or The possibility of contamination by fungi increases, making it difficult to carry out the desired chopping smoothly.
  • the microorganisms may be contaminated by bacteria or fungi. Because work is required.
  • the target tissue has a concave bottom and is placed on the bottom of a centrifugal vessel having a side length that can be prevented from escaping from being scattered from the receiving base where the target tissue is located when chopping. It is preferable to choke using a curved scissors.
  • Commercially available 50ml centrifugal vessels have a side length that prevents the escape of diversified tissues from the centrifugal vessel during chopping, and thus, for example, centrifugal vessels may be used for elastic tissues such as cartilage tissues. It does not escape from the space inside the container.
  • the surgical scissors are easily bent and in close contact with the concave bottom of a commercially available 50 ml centrifuge container used for cell culture. Since the target tissue is normally affected by gravity, there is always a tendency to position toward the concave bottom. These phenomena and the cutting motion by the surgical scissors at the concave bottom position of the centrifugal container bring the target tissues to the floor so that the cutting motion of the surgical scissors is strong against the elastic cartilage. Even elastic tissues, such as tissues, can eventually be shredded to smaller sizes in a short time. In order to easily achieve such chopping, chopping is preferably performed using surgical scissors which are longer than the length of the long axis of the side surface of the centrifuge container.
  • a constant temperature bath that can provide hot water set to the same temperature as the body temperature by treating with at least one protease selected from neutral protease, trypsin, serine protease, elastase and collagenase
  • protease selected from neutral protease, trypsin, serine protease, elastase and collagenase
  • the movement of liquid in a cell suspension consisting of the donor tissue and the protease solution in the air such as in a cell culture incubator that can provide air set at the same temperature as the body temperature of the individual. Digestive while causing leggings.
  • the temperature and time for treating the protease may vary depending on the type of protease and the species of the individual. However, in a typical cell culture incubator, 37 ° C. under 5% CO 2 , Magnetic stirr) is preferably digested while leggings.
  • the reason can be explained as follows.
  • the method utilizes a conventional cell culture incubator, a sterile glass container, and a sterile magnet bar for electronic sterilization during digestion with proteolytic enzymes.
  • the cell culture substrate is kept clean and chopped finely by chopping into a sterile glass container. It is easy to induce gaiters due to the flow of liquid in the cell suspension consisting of the corresponding donor tissue and the protease solution, and by opening the lid of the glass bottle slightly, the gas such as temperature, humidity, and the like of the space inside the incubator
  • the gas composition inside the incubator which is directly linked to the composition and ideally adapted for cell culture, is also stable and advantageous for each cell in the cell suspension consisting of the donor tissue and the protease solution.
  • Step (2) of the production method according to the present invention passages and amplify the isolated chondrocytes and synovial-derived cells.
  • any medium for cell proliferation or cartilage differentiation medium known in the art may be used as a medium, and components (inorganic salts, carbohydrates, hormones, essential amino acids, non-essential amino acids, vitamins) necessary for cell proliferation.
  • Basic medium containing eg Dulbeco's Modified Eagle Medium (D-MEM), Minimum Essential Medium (MEM), RPMI-1640, Basic Medium Eagle (BME), Dulbeco's® Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (D) MEM / F-12) and Glasgow Minimun Essential Medium (Glasgow MEM) are used.
  • Ascorbic acid which is required for collagen synthesis, is essentially added to these media, and other growth factors or differentiation-inducing factors, such as FGF (Fibroblast Growth Factor), HGF (Hepatocyte Growth Factor), IGF (Insulin-like Growth Factor), and TGF (Transforming) Growth Factor (VGF), Vascular Endthelial Growth Factor (VEGF), Erythrocyte Growth Factor (EGF), Bone Morphogenetic Protein (BMP), Tumor Necrosis Factor (TNF), Vitamins, Interleukins, Heparin, Heparin Derivatives, Heparan Lactic Acid, Collagen, Fibronectin, fibrin, multiplatelet plasma, progesterone, serenite, B27-supplement, N2-supplement, ITS-supplement (containing insulin, transferrin, acerinic acid, bovine serum albumin, linoleic acid), Dexamethasone, sodium bilitate, proline, L-glutamine and the like are added as necessary.
  • additives for acid base adjustment such as HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid), antibiotics such as antibiotics and antifungal agents, and 10% FBS (%) in normal use Fetal Bovine Serum) or higher proliferation, may contain 10% or more of FBS, 10% to 10% or more of the patient-derived autologous serum to facilitate clinical applications.
  • ES cells stem cells
  • iPS cells induced multifunctional stem cells
  • Cartilage cells showing a high degree of differentiation are 2-20 times or more, undifferentiated cells possessing similar versatility and proliferative capacity as ES cells and possessing differentiation capacity that are readily available as chondrocytes are known in the art. It is preferable to use a medium adjusted with 10% FBS, ascorbic acid in any cell growth medium.
  • the amplified chondrocytes are removed by treatment with trypsin-EDTA and passaged with fresh medium.
  • the cells are seeded at high density and cultured.
  • the cell density at the time of seeding of the chondrocytes and chondrocytes in the present invention varies depending on the cultured cells, but is preferably 5,000 / cm 2 or more, more preferably 10,000 / cm 2 or more, and 20,000 / More preferably cm 2 or more, the density of regenerating more effectively in the culture of cartilage tissue and bone tissue is (2.0 ⁇ 0.4) ⁇ 10 4 / cm 2 , the cell density of the sowing cells during subculture is 10,000 cells / cm When it is less than or equal to 2 , it is easy to change the cultured cells into the fibroblast cells, that is, in the case of chondrocytes, the degree of expression is lowered and the purpose of the present technology cannot be achieved.
  • the cell spheroid for transplantation treatment of the present invention is characterized in that the mixed cell complex is expressed as chondrocyte tissue.
  • To be expressed as chondrogenic tissues is to express differentiating traits such as those expressing genotypes such as SOX9 and HAS, or the type II collagen involved in the formation of extracellular matrix.
  • chondrocytes can be amplified by at least 2 to 20 times when cultured for about 2 weeks (that is, the time required before 4 passages).
  • the cell materials are mutually prepared by preparing a cell material suspension containing one or two or more kinds of cells in a culture medium alone or in a mixture, and culturing the cells in a dense suspended state. By adhering to prepare a mixed cell complex.
  • the mixed cell complex needs to add an excess of cell material sufficient to bond the cell materials together to form a cell spheroid for transplantation treatment.
  • Cells inherently have a property of being produced by the cells themselves and trying to adhere to each other by various adhesion factors, electrical attraction, chemical bonds, etc., which are expressed on the cell surface, and these properties vary depending on the type of each cell. In addition to this property, it is accompanied by agitation, which artificially presents an opportunity for cell-to-cell contact.
  • step (3) it is possible to use each medium described in step (2) of the production method according to the present invention.
  • Shake culture is set to 60-80 rpm using shaking culture shakers that can move in three-dimensional, eight-dimensional, flat circular, or planar left and right, and at the same temperature as the subject's body temperature. It is preferable to proceed.
  • the shaking culture period is 1 to 7 days, each cell material sufficiently amplified during the passage culture can shorten the culture period than the conventional autologous chondrocyte transplantation that requires more than 4 weeks of cell culture period. As a result, it is possible to manufacture a cell spheroid for transplantation treatment in a short time.
  • the shaking culture period is 1 It is preferable that the total production time of the transplanted cell spheroid for the transplantation treatment including the passage period and the shaking culture period is 14 days.
  • a culture vessel a non-adhesive culture dish (i.e., a floating culture dish) designed to prevent cells from adhering to its surface or a spinner flask in the case of mass culture is used.
  • a HydroCellTM culture dish (Cellseed. Co.) may be used that exhibits hydrophilicity at about 37 ° C. to which cells are not adhered at all.
  • a cell spheroid for transplantation treatment having a size of about 10 ⁇ m to 1,500 ⁇ m can be prepared.
  • the shaking culture is applied by adjusting the cell density of the cell material suspension from 1.0 ⁇ 10 4 cells / ml to 3,000 ⁇ 10 4 cells / ml.
  • the cell density of the cell material suspension within the above-mentioned range may be set by comprehensively determining as necessary according to the bottom diameter, space, volume, size, etc. of the culture vessel.
  • the intensity of shaking and the mode of shaking in shaking culture it is necessary to make a comprehensive judgment as necessary according to the type of cell material, the nature of the culture material and the bottom diameter, space, volume, and size of the culture vessel in shaking culture. What is necessary is just to set the intensity of shaking within the above range.
  • the mode of shaking may change the form of motion and the intensity of shaking as time passes.
  • the micro-carrier is a molecule for promoting mutual adhesion of cells in the cell material suspension, and gives good adhesion between each cell and the microcarrier. do.
  • this microcarrier it is possible to enhance good expression between the cell material in shaking embryos, to improve the efficiency of cell spheroid formation and to enhance the expression of chondrocytes suitable for transplantation.
  • the electric charges of fragmin (Dalteparin sodium) and protamine sulfate are different from each other, and the microcarriers are formed.
  • Preferred adhesion between cells and the microcarriers (Nakamura et al., J Biomed Mater Res A., May-12, Epub ahead of print (2009)).
  • the microcarrier is collagen, collagen derivatives, hyaluronic acid, hyaluronic acid derivatives, lubricin (Lubricin), mucin (Mucin), chitosan, chitosan derivatives, polyrotaki acid, polyrotaki acid derivatives, chitin, Chitin derivatives, urethanes, cellulose, agarose, gelatin, fibronectin, fibrin, multiplatelet plasma, heparin, heparin derivatives, fragmin (Fragmin, common name: [Dalteparin sodium], Protamine sulfate, Avidin , Streptavidin, Biotin, Laminin, 2-Octyl Cyanoacryleate, Calcium Alginate, Polylactic Acid, Polyethylene Glycol, Polyvinylpyrrolidone, Polyvinyl Alcohol, Polypropylene, Polyglycolic Acid, Polycaprolactam, Polylactic Acid Polyglycolic Acid One or more biocompatible materials or bioab
  • the microcarrier is licensed for clinical use from a relevant institution, from the point of view of making it easy to be used as a therapeutic method for producing and using a cell heterogeneous spheroid as a practically available mixed cell transplant in clinical practice. And preferably obtained application.
  • Cell mixed materials were prepared by adhering cell materials to each other by preparing cell material suspensions containing one or two or more types of cells (cell material A and cell material B of FIG. 2) alone or mixed in a culture medium and shaking them.
  • Secondary cell a mixed cell complex in which the primary cell spheroid, which is the result of the first shaking culture, and the cell material are mutually bonded by shaking culture or multiple stage shaking cultures performed two or more times. It is possible to prepare new mixed cell complexes with spheroids.
  • the primary cell spheroid and the cells which are the result of the first shaking culture, were prepared by preparing a cell material suspension in which the cells were mixed in the culture medium, followed by the second shaking culture.
  • the phase immediately after the first cell spheroid and the second cell culture material in the shaking culture is added under a phase contrast microscope. Observation and the results are shown in FIG.
  • the structure of the resultant primary cell spheroid can be artificially altered.
  • the cell material of the secondary cell spheroid closer to the superficial layer is used as chondrocytes and the cell material of the primary spheroid located at the deeper side is used as synovial-derived cells
  • the cell spores are synovial-derived cells with high proliferation rate.
  • the primary cell spheroid which accounts for the majority of the Lloyds
  • the secondary cell spheroid is formed even with a small number of cell materials within a limited culture period, even though the cartilage cells have a relatively low proliferation rate in elderly patients. That's enough.
  • the proliferation ability of each cell material and the anatomical histological development in vivo may be comprehensively determined, and a manufacturing method may be selected in consideration of the cell material, cell type, and composition of the above-described multi-step shaking culture.
  • Step (4) of the production method according to the present invention the cell spheroid prepared for cell transplantation treatment is isolated and implanted into the damaged lesion.
  • the shaking culture in the step (3) is 1 to 7 days, there are cell spheroids for transplantation treatment of various sizes in the culture dish.
  • a micropipette is aspirated by inhalation of a cell spheroid for transplantation treatment and then transferred to a new culture dish (floating plate) while observing under a phase contrast microscope using a sterile micropipette. Manner may be used.
  • the culture plate and the cells used in the manufacturing process of the cell spheroid for transplantation treatment using the tip of the micropipette are collected around the cell spheroid for transplantation treatment by centrifugal force while circularly culturing the culture plate.
  • Inhalation of a carrier solution having a composition similar to that of a body fluid, such as a suspension, a microcarrier-containing solution, various buffers, and a saline solution enables the absorption of a implantable spheroid having a size appropriate for the diameter of the tip.
  • a spheroid for transplantation treatment may be prepared in the form of endoscopic or arthroscopic or arthroscopic surgery in the process of cell transplantation of damaged lesions.
  • the cell spheroid is placed in the transplanted site of the damaged lesion by transplanting the prepared cell spheroid, this may vary depending on the cells constituting the surface of the cell spheroid, such cells Originally, cells have a property of being produced by the cells themselves and expressed on the surface of the cells, and are intended to adhere to each other by various adhesion factors, electrical attraction, chemical bonds, and the like. Although Lloyd alone integrates easily with each other, the microcarrier may be used when the mixed cell complex is desired for better fixation and short-term transplantation to the damaged lesion and quick coupling between the patient and the cell spheroid.
  • the microkerias include collagen, collagen derivatives, hyaluronic acid, hyaluronic acid derivatives, lubricin (Lubricin), mucin (Mucin), chitosan, chitosan derivatives, polyrotachiic acid, polyrotaki acid derivatives, chitin, chitin derivatives.
  • the transplanted site including the damaged site is considered to have a flat shape on the damaged site and its surroundings.
  • iPS cells induced multifunctional stem cells
  • One or two or more types of cells that can be treated by transplanting them into the cells are cultured for a certain period of time and then sheet-like and Cultured cell sheet consisting of extracellular matrix alone or collagen, collagen derivative, hyaluronic acid, hyaluronic acid derivative, lubricin, mucin, chitosan, chitosan derivative, polyrotamic acid, Polyrotachi acid derivatives, chitin, chitin derivatives, urethanes, cellulose, agarose, gelatin, fibronectin, fibrin, multiplatelet plasma, heparin, heparin derivatives, flagmin (Fragmin, generic name: Dalteparin sodium), Protamine Sulfate, Avidin, Streptavidin, Biotin, Laminin, 2-Octyl Cyanoacryleate, Calcium Alginate, Polylactic Acid, Polyethylene Glycol, Polyvinylpyrrolidone, Polyvinyl Alcohol, Polypropylene, Polyglycolic Acid,
  • cell transplantation is a cell component of a cell spheroid for transplantation treatment of a mixed cell complex, but a molecule secreted from the constituent cell and the produced extracellular matrix, a process for producing the cell transplant spheroid
  • the cartilage tissue is implanted into the damaged lesion for treatment alone or simultaneously with a carrier solution having a composition similar to that of the culture solution and the cell suspension, microcarrier-containing or microcarrier-containing solution, various buffers, and physiological saline.
  • the cell spheroid for transplantation treatment can be used as a system for evaluating the medicinal effects of the compounds, drugs, toxic substances, physiological effects, and toxicity separately from the purpose of treatment.
  • the use of the cell spheroid for transplantation treatment is not particularly limited, and in addition to the purpose of the treatment of various diseases, all the tests, research, and identification of material properties using the cell spheroid can be performed using the cell spheroid.
  • spheroids prepared by various adult stem cells obtained by the method of the present invention may be used for IGF, TGF, transferrin, insulin, FBS, GA-1000, ITS-supplement, dexamethasone, ascorbic acid, and bilirubin.
  • Differentiation into chondrocytes can also be induced by treating factors such as sodium phosphate and proline, and autologous cell transplantation through stem cell therapy using stem cells is possible by transplanting differentiated cells obtained through this work to patients.
  • the drug efficacy or toxicity of a test substance involved in cartilage regeneration in one cell spheroid can be directly used to shift the cell spheroid thus produced.
  • the use of the cell spheroid for transplantation treatment of the present invention is not limited by the above specific embodiment.
  • a cell material in which cells are mixed again in a culture medium based on a primary cell spheroid, which is a result of the first shaking culture by carrying out a plurality of shaking cultures repeatedly performed two or more times.
  • a new mixed cell complex with a secondary cell spheroid which is a mixed cell complex in which the first cell spheroid, which is the result of the first shaking culture, and the cell materials are bonded to each other. It is possible to prepare.
  • the structure of the cell spheroid can be constructed in multiple layers.
  • the shape of the chondrocytes constituting the knee cartilage tissue changes as it goes deeper from the surface toward the bone marrow. Chondrocytes of different shapes differ in their properties and functions.
  • the preservation of a large population of cells under extracorporeal conditions would normally cause the population of these cells to loosen the inter-adhesions between the cells by gravity. It will be read, by culturing to maintain a dense suspended state provided by the production method according to the present invention by strengthening the mutual adhesion in the population of cells, it is possible to closely close communication with each constituent cells, Because it promotes the production of extracellular matrix, it eventually enhances specific functions that it originally had.
  • Chondrocytes and synovial tissues were taken from the knees of a Japanese white rabbit (1 kg ⁇ 200 g, female) to remove skin tissue, subcutaneous tissue, muscle tissue, subchondral bone, ligaments, meniscus and other connective tissue. Afterwards, it was placed inside a commercially available 50ml centrifugal container, and then chopped by using chopping scissors. Then, 1.25% trypsin (Invitrogen Co.) and 0.5% collagenase I (collagenase class I: Worthington, Biochemical Co.) were added to D-MEM / F-12 medium (Gibco. Co.) for 1% antibiotic / antifungal agent.
  • trypsin Invitrogen Co.
  • collagenase I collagenase class I: Worthington, Biochemical Co.
  • chondrocytes and synovial tissue were separated into single cells.
  • the cell suspension obtained through this process was passed through a cell strainer (BD FalconTM: BD Biosciences) made of nylon of 70 ⁇ m and 40 ⁇ m and washed twice with phosphate buffer.
  • Single cells obtained through this process were inoculated and cultured in a proliferation medium for amplifying the number of chondrocytes and synovial derived cells.
  • the cell density at initial culture sowing was (2.0 ⁇ 0.4) ⁇ 10 4 / cm 2 for chondrocytes, and for synovial-derived cells (1.0 ⁇ 0.4) ⁇ 10 4 / cm 2 .
  • Cell density was (2.0 ⁇ 0.4) ⁇ 10 4 / cm 2 and synovial derived cells were (1.0 ⁇ 0.4) ⁇ 10 4 / cm 2 .
  • FBS 1% antibiotic / antifungal mixture (10,000 units / ml penicillin G, 10,000 ⁇ g / ml streptomycin) inactivated by heat in D-MEM / F-12 medium (Gibco. Co.). , 25 ⁇ g / ml of amphotericin, Gibco. Co.) and 50 ⁇ g / ml of ascorbic acid were used, and amplified by trypsin-EDTA when confluency reached 90%. Chondrocytes and synovial-derived cells were removed from the culture dish.
  • Cells for the preparation of cell spheroids for transplantation treatment of mixed cell complexes by substituting up to 2 times of chondrocytes and up to 4 times of synovial cells in subcultures for 12-13 days of cell amplification.
  • chondrocytes of the third passage and synovial derived cells of the fourth to fifth passages are used.
  • Example 1-A Each isolated cultured chondrocyte and synovial-derived cells recovered through Example 1-A were treated with a 1% antibiotic / antifungal mixture (10,000 units / ml penicillin) in D-MEM / F-12 medium (Gibco. Co.). G, 10,000 ⁇ g / ml streptomycin, 25 ⁇ g / ml amphotericin, Gibco.Co.), Resuspended in media adjusted and centrifuged (1,800 rpm / 5 min, 24 ° C.), followed by chondrocytes and synovial membranes.
  • antibiotic / antifungal mixture 10,000 units / ml penicillin
  • D-MEM / F-12 medium Gibco. Co.
  • a fluorescent reagent tagging was prepared using PKH staining kit (Sigma Co.). Chondrocytes were tagged with red fluorescent tag (MINI26) and synovial derived cells with green fluorescent tag (MINI67 kit, Fluorescent Cell Linker Mini Kit for General Cell). And synovial derived cells can be compared with each other. By this operation, cell suspensions of tagged chondrocytes and synovial-derived cells of fluorescent reagents were prepared.
  • Example 1-A and Example 1-B cell suspensions of chondrocytes and synovial-derived cells were subjected to D-MEM / F-12 medium (Gibco. Co.) through a suitable number of passages and fluorescent reagent tagging. 10% FBS inactivated by heat, 1% antibiotic / antifungal mixture (10,000 units / ml penicillin G, 10,000 ⁇ g / ml streptomycin, 25 ⁇ g / ml amphotericin, Gibco.
  • FIGS. 6 and 7 show the results observed under a phase contrast microscope after 36 hours.
  • Fig. 7A shows the ratio of chondrocytes and synovial-derived cells 4 25% synovial-derived cells. 75% of chondrocyte-derived cell suspensions, B after 12 hours, C for 24 hours, and D for 36 hours. The observed results are shown by adding a filter for selectively passing only a wavelength within a suitable range to the phase difference microscope after elapse.
  • the shaking culture is carried out in the flat circular or planar left and right of the chondrocytes and synovial-derived cells alone or at the same time 50% synovial-derived cells. Shaking culture was performed for 4 days with the exercise added, and the results are shown in FIGS. 8A and 8B.
  • Fig. 9 shows the addition of a filter for selectively passing only a suitable range of wavelengths under a phase contrast microscope 36 hours after the start of shaking culture onto the cell suspensions of chondrocytes and synovial-derived cells under conditions of the ratios 1 to 5 above. Each observation is shown.
  • each cell material constituting the cell spheroid for transplantation treatment over time, each cell does not stagnate at the bottom of the culture vessel due to the flow in the culture medium caused by continuous repetitive movement due to artificial movement.
  • the floating suspension is maintained during the shaking culture, and a large number of different cell materials are rapidly adhered to the small-scale mixed cell complex made of the cell spheroid at the early stage of the shaking culture. Grew.
  • the mixed cell complex began to be visually observed after 12 hours from the start of shaking culture, and was observed throughout the entire shaking culture. The results of visual observation of the obtained cell spheroids are shown in FIG. 12.
  • Small cell spheroids had a diameter of about 250 ⁇ 100 ⁇ m and large cell spheroids had a diameter of about 700 ⁇ 250 ⁇ m.
  • the ratio of chondrocytes and synovial-derived cells obtained through Example 1-C 50% synovial-derived cells. 50% chondrocyte-sustained cells were subjected to shaking cultures for 5 days, and cell spheroids of 4% paraformaldehyde. The solution was fixed in solution, sequentially adapted to a 15% sucrose solution and a 30% sucrose solution, then made into frozen sections, and the sections were cut and prepared for histopathological examination.
  • the cell spheroids on the fragments were prepared using the 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) substrate-chromogen solution (DAKO Japan Co., Ltd.) using the avidin-biotin-peroxidase complex technique (LSAB 2 kit / HRP, DAKO Japan Co. , Ltd.) was subjected to immunohistochemical staining for collagen type II.
  • AEC 3-amino-9-ethylcarbazole
  • LSAB 2 kit / HRP avidin-biotin-peroxidase complex technique
  • the rabbits receiving the cell spheroids were sacrificed to recover the femur, fixed with 4% paraformaldehyde solution, demineralized, paraffin sections were cut, and the sections were cut for pathological examination. Ready.
  • FIG. 14A shows the results of gross observation findings after a full-thickness injury model was developed in which the 5 mm diameter defect reached the cartilage surface to the subchondral bone in the knee cartilage on the femur side of the rabbit. It was. Also, histopathological examination is shown in Fig. 14B.
  • the heavily stained collagen type II which is the cartilage tissue in which the cells and tissues of the stained area were similar to the normal or healthy state in the body after the transplanted cell spheroid in the body. As expressed by means.
  • pancreas was extracted from rats (Brown Norway Rat or Lewis Rat, 350 ⁇ 50g) and collagenase P (Roche) was added to Hanks' Balanced Salt Solutions (HBSS) (Gibco.Co.) With 10% FBS and HEPES. Co.) was dissolved to prepare 2 mg / ml collagenase P, digested using it, and purified and recovered by concentration gradient method using Histopaque (Sigma Co.).
  • HBSS Hanks' Balanced Salt Solutions
  • isolated islets were treated with trypsin / EDTA for a short period of 5 minutes on isolated islets.
  • the isolated PEC is inoculated and cultured in a growth medium for amplifying the cells separated by the same method as in 1-A of Example 1 to amplify numerically.
  • the amplified PEC is removed and passaged to fresh medium.
  • the composition of the medium described in Example 1-A, the type of digestive enzyme and culture plate used, the cell density at the time of initial seeding, and the cell density at the time of subculture were applied as appropriately modified according to the intended use. .
  • Example 2-A Each isolated cultured PEC obtained in Example 2-A was recovered by subculture and thus recovered PEC was 10% of FBS, 1 inactivated by heat in D-MEM / F-12 medium (Gibco. Co.). Media adjusted with% antibiotic / antifungal mixture (10,000 units / ml penicillin G, 10,000 ⁇ g / ml streptomycin, 25 ⁇ g / ml amphotericin, Gibco. Co.) and 50 ⁇ g / ml ascorbic acid Resuspend in 5ml to prepare the cell suspension. As a culture vessel, using a 60 mm HydroCellTM culture dish (Cellseed.
  • shaking shaker model name; double shaker NR-
  • TAITEK Co. was incubated for 1 to 5 days while adding a planar circular movement at 70rpm.
  • each cell material constituting the primary cell spheroid does not stagnate at the bottom of the culture vessel due to the flow in the culture medium caused by continuous repetitive movements caused by artificial movement.
  • the floating suspension is maintained during the shaking culture, and a large number of different cell materials are rapidly adhered to the small-scale mixed cell complex made of the cell spheroid at the early stage of the shaking culture. Grew. During this period, the mixed cell complex began to be visually observed after 12 hours from the start of shaking culture, and was observed throughout the entire shaking culture.
  • the primary cell spheroid was confirmed that the contour gradually became smooth over time.
  • Small cell spheroids had a diameter of about 250 ⁇ 100 ⁇ m and large cell spheroids had a diameter of about 700 ⁇ 250 ⁇ m.
  • Example 2-A and 2-B prepared a cell material suspension containing only one or two or more kinds of cells in a culture medium with primary cell spheroid consisting of PECs and cultured two or more times with shaking By a plurality of steps of repeating two or more times to prepare a new mixed cell complex from the secondary cell spheroid, which is a mixed cell complex obtained by adhering the first cell spheroid and the cell material as a result of the first shaking culture. It was used to perform shaking culture.
  • a cell spheroid for transplantation treatment which is a mixed cell complex
  • a cell spheroid which is a collection of a plurality of cells that can replace various tissues constituting the body expressed as a tissue similar to a normal or healthy state in the body.
  • preparing each cell material constituting the mixed cell complex subcultured and amplified each cell prepared, and preparing a cell material suspension in which one or two or more kinds of cells are mixed alone or in a culture medium and shaken.
  • Cell culture spores for grafting cell materials by adhering the cell materials to each other by culturing (Shaking culture) to separate the cell spheroids prepared for cell transplantation treatment and transfer them to a predetermined place according to each purpose of use.
  • each cell material constituting the cell spheroid for transplantation treatment is a pancreatic endocrine cell (PEC) isolated from a single cell in the pancreatic islet or the pancreatic islet for diabetic treatment, or various cardiovascular diseases and peripheral vascular insufficiency.
  • PEC pancreatic endocrine cell
  • Vascular endothelial cells, endothelial progenitor cells (EPC), endothelial stem cells, cardiomyocytes, and muscle cells to treat diseases caused by It is possible to prepare a large amount of cell spheroids for the transgenic expression of transplanted grafts, which may be an alternative to the situation in which the supply of the pancreatic islets to be transplanted due to the chronic organ deficiency in clinical pancreatic transplantation is absolutely insufficient.
  • cell suspension consisting of single cells for treatment, but has one or more three-dimensional structures of mutual security.
  • cell spheroid a collection of a number of cells, further enhances the specific functions originally possessed, and enables the close integration of cells in the structure of the cell spheroid to communicate closely with each constituent cell within the structure of the cell spheroid after transplantation. It is also quite useful. In addition, depending on the characteristics of the cells used, it may be useful because it can hold new functions such as immuno-isolation.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing and using the cell spheroid for the transplantation treatment.

Abstract

본 발명자는 임상에 효과적이면서 실질적으로 이용 가능한 이식치료용 세포스페로이드를 제공함으로, 정상에서 벗어난 질병상태에 있는, 일부 혹은 전부의 손상 또는 결손된 환부에 이식치료하기 위한 것으로서, 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 본 발명를 이용한 각 질환에 대한 치료법 그리고, 피검물질의 약효 및 독성을 평가하기 위한 시스템으로서 상당히 유용한 것이라는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명의 한 관점에 의하면, (1) 혼합세포복합체를 구성하는 각세포재료를 분리준비하는 단계；(2) 상기분리 된세포를 계대배양하여 증폭하는 단계；(3) 1종류 혹은 2종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하고 세포를 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양을 함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조하는 단계；및 (4) 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계를 포함한 이식세포치료용 스페로이드의 제조방법 및 이용방법을 제공한다.

Description

세포이식술을 위한 혼합세포복합체인 세포스페로이드의 제조방법 및 이의 이용방법{THE METHOD OF MANUFACTURING THE TRANSPLANTABLE SPHEROIDS OF MIXED CELLULAR COMPLEXES FOR CELL TRANSPLANTATION AND THE USAGE OF THE SAME}
본 발명은, 혼합세포복합체가 유전성 질환, 전염성 질환 및 퇴행성질환 등에 의하여 자기조직 재생치료능력의 항상성(Homeostasis)의 균형에 문제가 생김으로 자력으로는 치유에 이르지 못하는 즉, 정상에서 벗어난 질병상태에 있는, 일부 혹은 전부의 손상 또는 결손된 환부에 이식치료하기 위한 것으로서, 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들의 집합인 세포스페로이드의 제조방법에 관한 것으로, 각 동물 신체내의 각각의 조직의 생물학, 의학 등의 분야에 관한 것이다.
혼합세포복합체는 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들(예를 들면 연골조직에 있어서, 연골양조직으로서 형질발현된 세포스페로이드, 췌장조직에 있어서, 인슐린 등을 분비하는 췌도내분비세포로서 형질발현된 세포스페로이드) 로 구성되는 각세포재료를 분리준비하고, 분리준비된 각세포를 계대배양하여 증폭한 후, 1종류 혹은 2종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하고 진탕배양(Shaking culture)함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조하여 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계를 포함한 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법 및 이의 이용방법에 관한 것이다.
세포치료이식술은 학문 분야에서는 연구의 수단으로, 산업분야에서는 기술개발의 도구로 점점 그 활용의 폭을 확대해 가고 있다. 이러한 세포치료이식술은 여러산업들에 끼치는 파급효과가 커서 국가산업 측면에서 중요성이 부각되고 있다.
세포치료이식술에 사용되는 세포치료제(cell therapy product)는 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 혹은 이종(xenegenic)의 세포를 체외환경(in vitro)에서 배양과정을 통해, 분리, 증식 및 선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용하는 의약품을 칭한다.
세포치료제를 이용한 세포치료이식술에서 사용되는 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들로 구성되는 각세포재료를 분리준비하고, 체외환경(in vitro)에서 배양과정을 통해, 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 일련의 행위를 가하여, 이식물을 수령할 개체에게 주입하거나, 이들 세포로 인체조직을 만듬으로서 치료용으로 쓰이게 된다.
세포치료이식술에 사용되는 세포치료제는 세포 단위이기 때문에 특정 기능(예, 호르몬의 분비, 특이항원을 인식하는 기능 등)을 새롭게 보유하게 하거나, 본래 갖고 있던 특정 기능이 더욱 증진되도록 유전적으로 변형된 세포일 수도 있으며, 이들 세포치료제는 사용하는 세포의 분화도 정도에 따라서 성체세포치료제와 줄기세포치료제로 구분될 수 있다.
성체세포치료제의 예로는, 연골조직 및 골조직의 손상을 치료하기 위한 자가연골세포이식술에 이용되는 자가연골세포 또는 골세포, 당뇨병 치료를 위한 췌도세포, 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 질환상태를 치료하기 위한 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포, 피부의 재생을 위한 표피세포, 파킨슨씨 병 치료를 위한 태아 신경세포(fetal neural cell)를 포함하는 각종 도파민 분비세포, 암 및 면역질환의 치료를 위한 자연살해세포(natural killer cell), 수지상세포(dendritic cell) 및 세포 독성 T 세포(cytotoxic T cell), 각막손상의 치료를 위한 각막세포 등이 있다. 그 밖에도 신체를 구성하는 각종하는 장기 또는 조직으로부터 유래된 세포들도 성체세포치료제로서 사용될 수 있는데 이들은, 이식하고자 하는 장기 또는 조직을 잘게 절단하여 수득한 마이크로 단위의 다수의 세포들의 집합 혹은 절편일 수도 있다.
한편, 줄기세포치료제는, 미분화도가 높고 다능성(multi-potency) 및 고도의 증식능을 보이는 각종 조직 유래의 줄기세포를 이용하는 면에 있어서, 이들 줄기세포들은 배아줄기세포(ES 세포)와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하여 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 용이한 분화능을 보유하여 손상환부에 이식하는 것으로 치료효과를 나타내므로써 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 1종류 혹은 2종류 이상의 세포를 분리하여 목적으로 한 세포로 분화시킨 후 얻은 세포를 이용하게 된다.
세포치료이식술에 사용되는 세포치료제에 의한 치료는 환자에게 직접 세포를 주입하여 손상된 세포의 기능이나 조직을 재생 수복할 수 있으므로 신체내에서 독성이 없으며 신체 조직의 본래의 기능을 재생 및 유지시킴으로써 수술요법이나 약물요법이 할 수 없는 근원적인 치료방법(radical therapy)가 될 수 있다.
이러한 세포치료제를 이용한 치료대상이 될 수 있는 대표적인 질환과 이 때 사용되는 세포들은, 연골조직 및 골조직의 손상을 치료하기 위한 자가연골세포이식술에 이용되는 자가연골세포 또는 골세포, 당뇨병 치료를 위한 췌도세포, 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 질환상태를 치료하기 위한 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC), 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포이며 이들의 배경을 부연하여 설명하자면 아래와 같다.
한국, 일본 및 구미의 국가 등은 이미 고령화사회를 맞고 있으며 평균수명도 세계 최고 수준이 되고 있다. 사람들의 희망은 단순한 생명연장보다는 더욱 건강하게 만족하면서 살 수 있도록 삶의 질(Quality of Life, QOL)에 중점을 두기 시작했다. 이중에서도 주목되는 한가지로 운동기능장해를 들 수 있다.
운동기능장해의 원인이 되는 관절염에는 여러가지의 질환이 포함되지만, 미국의 경우 2002년에 7,000만명이상의 환자가 관절염과 관련된 질환이나 만성관절증상을 주증으로 하여 의료시설에 내원하였다. 이 것은 성인 3명중에 1명꼴의 빈도이며 게다가 2020년까지는 이의 두배에 다라는 환자가 증가할 것으로 예상되고 있다.
일상생활의 불편함이 생기는 환자의 비율은 심혈관계질환을 뒤로 제2위로 뒤를 이으로 있으며, 1년간 863억달러라는 의료비가 사용되고 있다. 그리고 고령화사회에 가장 많이 발병하는 퇴행성관절염(Osteoarthritis, 변형성관절증)은 주요한 원인의 하나이며, 일본의 동경대학교 22 세기의료센터의 조사에서도 2,400만명을 우회할것이라고 추정하고 있다. 일본에서도 환자수가 많아, 45 내지 65세에서 30%, 65세이상에서는 63% 내지 85%의 유병율을 나타내며, 매년 90만명의 새로운환자가 발생한다고 추정하고 있다. 퇴행성관절염으로 대표적인 운동기질환은 실질장기의 질환과 다르게 직접생명을 위협하는 것은 적지만, 인간의 손과 발의 자유를 빼앗아 그 QOL을 현저하게 저하시킨다. 이러한 운동기질환은 향후 고령화사회에 의하여 점점 더 증가할 것으로 예측되며 이러한 장해에 의한 인적, 사회적손실은 상당한 수준이라고 할 수 있다.
이러한 운동기질환의 대부분은 연골조직, 골조직이 염증 혹은 손상을 당하는 것이 원인이다. 현재 중도의 심한 질환의 경우, 금속과 고분자량의 폴리에틸엔으로 만들어진 인공관절을 이용하여 치료에 적용하고 있지만, 인공관절로 치환 후 10년이상 경과하면 마찰에 의한 마모분에 의하여 각종 원치않는 생체반응을 야기시키게 되는 것 등의 이유로 적용환자의 제한이 있다. 이러한 문제들을 해결하기 위하여 내마모성을 향상시키는 연구가 행하여지고 있으나 내마모성에 있어는 한계가 있게된다.
1994년 Brittberg 등이 관절의 비과중부로부터 관절연골을 채취하여 분리한 연골조직세포를 배양하여 과중부의 골연골전층결손부에 이식하는 치료법(자가연골세포이식술, Autologous Chondrocyte Implantation)을 보고(Brittiberg 등, New England Journal of Medicine, 331(14),889(1994))한 이후 1997년에 FDA 에 허가되었고 이미 비지니스화되어 전세계적으로 2만건이상의 증례에 대하여 실시된 바 있는 실적이 있다. 2년 내지 10년 경과한 219례의 중장기적인 성적은 양호했으며 89%에서 기능개선이 확인되었다(Peterson L, 6th Annu. Meet., American Academic Orthopaedic Surgery(1998)). 한편, 2002년에는 이식후 세균감염에 의한 사망사례의 보고가 있었으며 아직 CDC의 조사에 의하면 41례의 시술후 감염례가 확인되었고, 일본에서도 후생노동성건강국으로부터 일본정형외과학회에 이러한 사례에 대한 정보제공이 있었다는 것은 신중하게 재고되야할 문제점이 있다는 것을 재확인 하게 되었다. 또한, 이러한 방법에 있어서도 고령자에게 다발하는 광범위한 연골조직 및 골조직의 변성 또는 부분결손을 동반하는 퇴행성관절염에는 이용할 수 없는 등 아직도 개선되어야 되어야 할 부분이 많이 있다고 할 수 있다.
일본내에서도 비과중부의 관절연골로부터 분리한 연골세포 또는 골수유래의 간엽계줄기세포를 이용하여 조직공학적으로 연골조직을 제조하여 골연골전층결손례에 있어서 임상응용을 시작하고 있다, 그러나, 이러한 임상응용례는 외상성의 골연골손상 또는 이단성골연골염으로서 연골결손범위가 원래부터 적은 증례에 적용하는 데에 그쳤왔다(일본 특허등록문헌: 특원2001-384446(특개 2003-180819호 공보), 특원2002-216561(특개 2003-111831호 공보), 특원 2003-58118 공보(특개 2004-136096호 공보)). 현재로서는, 인공관절치환술로 안정적인 치료성적을 얻고 있기 때문에 광범위의 연골조직 및 골조직의 변성 또는 부분결손을 동반하는 퇴행성관절염의 치료에는 적용외로서 이용되지 않고 있었다. 또한, 이들 기술의 대분분이 연골조직, 골조직은 대부분이 단일종류의 세포들로 제조된 것으로(즉, 연골세포 단독, 골세포 단독 혹은 줄기세포 단독), 배양세포로부터 생산되는 단백질 이외에도 추가적인 물질로서, 이식되어지는 단일세포현탁액이 이식환부로부터 이탈하는 것을 방지하기 위한 물질인 단백질, 당류 또는 인공바이오매터리얼로 형성된 지지체인 조직재생용기재를 보조적 혹은 보완적으로 이용하기 때문에, 이들 지지체 자체가 야기시키는 이물반응 및 생체내적합성이 떨어지는 등의 결점 등으로 인한 생체의 직접적인 영향이 해결되야 될 문제점으로 거명되고 있다. 따라서 현실적으로는 실제적으로 임상적용이 용이하지 않은 이러한 문제점들을 고려하면 이러한 지지체를 사용을 최소한으로 하는 기술의 개발이 절실하게 필요한 시점에 있다고 할 수 있다.
한편, 퇴행성관절염의 치료를 기초연구적인 면으로부터 적극적으로 수행하고 있는 Hunziker 등은 퇴행성관절염의 병태는 연골의 변성 및 연골조직의 손상이 연골하골까지 도달하지 않는 부분결손에 있다는 것에 착안하게 되며 관절연골의 부분결손모델을 이용하여 기초연구를 행해오고 있다. 이때 연골의 수복 및 재생의 중심적인 역할은 연골세포가 아니고 활막세포가 한다는 견해를 보고하고 있다(Hunziker 등, The journal of Bone and Joint Surgery, 78-A,721(1996)). 하지만, 이러한 기술도 치료가능한 범위가 작다는 점이 광범위한 변성에 대한 실직적인 치료법으로써 실현가능성이 떨어지고 광범위한 골연골결손에 대한 초기치료기술의 확립이 절실하게 필요한 시점에 있다고 할 수 있다.
생체내의 각조직에는 성체줄기세포의 존재가 확인되었으며 각종조직유래의 간엽계줄기세포 역시 국소적인 존재가 규명되고 있다. 특히 이들중의 활막유래세포 및 골수유래세포에서는 연골세포로 분화능력을 보유한 간엽계줄기세포를 이용함으로써 연골양조직으로서 형질발현시킨 조직으로 분화시켜 생체밖 및 생체내(in vivo) 환경에서 재건축에 성공하였다는 다수의 연구가 보고되고 있다. 성체줄기세포는 생체를 구성하는 각종조직으로의 분화, 재생이 가능하며 특히 생체밖에서의 배양과정에 의하여 일반조직유래의 체성세포와 비교하여 증식능이 월등히 높다. 이렇게 월등하게 높은 증식율을 보유한 간엽계줄기세포는 발생학적인 면이나 분화라는 관점에서도 유리하다고 사료된다. 한편 Sekiya 등은 활막유래의 세포를 이용하여 생체밖 및 생체내 환경에서 연골조직결손부위에 대한 우수한 재생 및 수복을 확인한 바가 있다(Sekiya 등, Stem cell, 25,689(2007)). Chen 등은, 활막유래세포를 골수세포와 공동배양시킨 결과 연골조직으로의 분화가 되었음을 확인한 바가 있다(Chen 등, Spine, 34-12,1272(2009)). Anderer 등은, 연골조직으로의 분화를 위하여, 배양세포로부터 생산되는 단백질 이외로도 성장인자등의 단백질의 추가로 넣어서 조성시킨 연골분화유도배양액을 사용하지 않고 단지 통상적인 세포배양에 사용되는 배양액만으로 연골재생에 성공한 바가 있다(Anderer 등, Journal of Bone and Mineral Research, 17-8,1420(2002)).
한편, 당뇨병(Diabetes)은 '인슐린 의존형 당뇨병 (insulin dependent diabetes)'과 '인슐린 비-의존형 당뇨병 (insulin independent diabetes)'으로 크게 나뉘어지지만, 상기 2 종류의 당뇨병을 구별하는 정확한 당뇨병 발생 기작은 아직까지는 밝혀지지 않은 실정이다. 상기 2 종류의 당뇨병 중에서 '인슐린 의존형 당뇨병' 환 자는, 인슐린을 생성하는 능력이 크게 떨어져 있기 때문에 외부로부터 인슐린을 계속적으로 공급받아야 한다. 그러나, 생리적인 요구에 알맞게 인슐린을 계속적으로 공급하기는 거의 불가능하며, 더욱이 체내에서는 인슐린이 농도 구배로 존재하여 '간문맥 →간 →간정맥 →대동맥 →근육'의 순서로 인슐린의 농도가 감소하고 있어서, 외부로부터 인슐린을 체내로 주사하게 되면 이러한 농도 구배가 형성되지 못하여 부작용이 발생하게 된다.
또한, 췌장의 베타-세포에서는 인슐린 이외에도 11종류 이상의 다른 물질이 함께 분비되어 대사를 원활히 유지시키므로, 인슐린만을 투여하여서는 혈당을 강하시킬 수는 있으나 저혈당 방지 및 기타의 합병증 치료는 불가능하다. 게다가, 당뇨병 치료를 위해 사용하는 혈당 강하제는, 혈당 강하 기능은 있으나, 강하제 내성이 나타나 장기간 사용하기가 어렵고 신체 부작용이 심하여 사용하지 않고 있다. 이에 대한 대안으로서, 췌도 이식은 중증의 인슐린 의존성의 1형 당뇨병에 대한 새로운 치료방법이다. 인슐린의 투여만으로는 해결되지 않는 신부전증 망막증을 비롯한 신경장애 족부괴양 등의 속발증 등을 휴유증 없이 치료할 수 있다는 점에서 근본 치료법으로 주목 받아 최근에는 임상시술 보고가 세계적으로 매년 증가하고 있다.
각종 방식을 통하여 최근에 면역 거부 반응을 없애고 췌도를 이종간에 이식을 위한 연구들이 (Shapiro등, Lancet 358 Suppl, S21, (2001), Lee등, Cell Transplantation 17, 51, (2008)).
한편, 본 발명자도 췌도이식에 있어서, 면역격리를 위하여 이식물을 수령할 개체 유래의 탄성연골을 이용하여, 이식할 췌도를 감싸는 마이크로 입자를 개발하여 제시 한 바 있다(한국 특허등록문헌: 특허제 10-0788800 호 (WO/2008/002059)).
하지만, 현재로서는 이식할 췌도의 공급이 절대적으로 부족한 실정이어서, 정상상태에서 조직학적으로 여러종류의 내분비세포들을 포함하는 혼합세포복합체인 췌도에서 소정의 처리를 하여 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC)를 증식시키는 방법을 포함하는 여러 가지 방법으로 췌도를 대량 증식시키고 상기의 대량증식된 세포들을 포함하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조를 통한 세포이식술의 치료법으로 사용될 수 있는 방법들을 고려해 볼 수 있다.
또한, 심혈관계의 형성은 발생단계에 있어서도 초기단계에 일어나는 현상에 한가지이며 성체가 된 후에도 인생에 걸쳐서 신생, 수복, 사멸의 반복된 동적인 구조를 같는다. 최근에는 줄기세포 또는 재생의학의 현저한 발전과 더불어 초기 발생단계 뿐만 아니라 성체가 되어서도 그 후에 일어나는 혈관수복에 있어서 각종 조직손상에 대한 능동적인 처치를 행하면서 혈관형성에 중요한 역할을 하는 세포가 주목 받고 있다.
혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC)은 말초혈액중에 존재하는 단핵구성분에 한가지에 속하면서, 혈관형성 혈관신생을 담당하는 골수조직에서 증식과 분화하고, 혈관형성이 진행중인 장소로 이동하여 신생혈관형성에 있어서 중요한 기능을 보유한 세포라는 것이 알려져 있다(Asahara등, Science 275, 964, (1997), Asahara등, EMBO J,18,3964(1999), Takahashi등, Nature Medicine, 4,434 (1999)). 현재, 임상에 있어서도, 중증의 허혈성질화인 관상동맥 질환, 하지허혈성 질환 등에 대하여 혈관내피전구세포이식치료에 의한 혈관재생요법이 시도되고 있다(일본 특허등록문헌:특원2005-286607(특개2007-89537)). 이러한 것을 고려하면, 심혈관계 및 각종조직 및 장기의 재생능력을 혈과내피전구세포가 증강시키는 역할이 기대가 되고 있다. 혈관내피천구세포를 더욱 적극적으로 임상에 응용하기 위해서는 극히 미량의 수로 존재하는 혈과내피전구세포를 양적으로나 기능적으로 개선시켜서 이용할 필요가 있다.
혈관내피전구세포를 혈관재생 치료에 응용하려고 하는 움직임은 여러 배아줄기세포나 다른 조직 특이적 성체 줄기세포 보다 이들 혈관내피전구세포가 갖고 있는 우수한 몇가지 점으로 설명되어 질 수 있다. 즉, 환자 자신의 혈액이나 골수 조직을 이용하여 자신의 조직 재생에 쓰여질 수 있다 는 점 이외에도 EPC가 가지는 독특한 치료 합목적적인 성질에서 기인한다. 혈관내피전구세포는, 1) 다른 세포로의 변이(특히, 병적인 암세포로의 전이)가 빈번히 일어나지 않고, 2) VEGF(Vascular Endthelial Growth Factor), Angiopoietin-1, HGF등 혈관 재생 인자를 다량 분비를 하면서, 3) 조직내에서 혈관 신생에 적극적으로 작용한다는 점, 4) 이식 되어진 세포들의 Half life는 비교적 짧다는 점이 혈관재생을 통한 심혈관계 질환에 대한 임상치료 응용에 가장 적합한 세포이다.
상기 정상에서 벗어난 질병상태는, 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 실질조직의 불완전한 질환상태로서, 특히 신체는 혈관계가 거의 모든 조직에 분포함으로 이러한 혈관계의 각종 원인에 건강하지 못한 상태에서 기인한 질환들은 새로운 신생혈관의 재생으로 건강한 심혈관계의 재구축이 필요하게 되는데 이러한 경우에 혈관을 구성하는 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포 등의 동원(recruit) 혹은 이러한 세포들의 세포이식술에 의해 이식 후 심장근육세포를 대신할 조직으로 혹은 혈관신생(Neoangiogenesis)의 유도가 필요한 신체내 각종 조직에 있어서 상기의 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC), 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포 등을 포함하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조를 통한 세포이식술의 치료법으로 사용될 수 있는 방법들을 고려해 볼 수 있다.
이러한 상기의 연구결과를 고려하면, 간엽계줄기세포, 췌도에서 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC) 및, 혈관내피전구세포 등을 혼합세포복합체인 이식치료용 세포스페로이드의 제조에 사용하는 재료로 선택하여 발명을 완성하기에 이르렀다.
특히, 통상적인 세포배양조건하에서도 간엽계줄기세포, 췌도에서 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC) 및, 혈관내피전구세포 등는 높은 증식능을 갖으며, 연골조직, 췌도조직 및 혈관조직으로의 용이한 분화능을 보유하는 것은 단기간내에 소정의 목표로 한 양의 이식치료용 세포스페로이드의 제조가 가능하게 된다.
새로운 해결방법으로 최근에 세포를 생체밖(in vitro)에서 배양하여 배양한 세포 혹은 조직을 환자에 적용하려는 기술들이 다수 보고되고 있다. 이런경우, 한종류의 세포 혹은 조직을 생체친화성 재료 또는 생체흡수성 재료인 인공바이오매터리얼로 형성된 지지체(Scaffold)인 조직재생용기재 또는 배양액 혹은 운반용용액과 동시에 구성된 구조물로서 이용하여, 자기치유능력에 의하여 생체내에서 조직을 재생키키는 기술인 조직공학기술(Langer 등, Science 260, 920, (1993)) 및 재생의료(Petit-Zeman, Nature Biotechnology 19, 201, (2001))를 이용한 연골조직 및 골조직의 치료, 당뇨병 치료 및 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 질환상태를 위한 치료 등을 포함한 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직들 세포로 인체조직을 만듬으로서 치료용으로 쓰는 치료가 주목받고 있다.
한편, 지금까지 이러한 조직공학 및 재생의료에 의해 개발되 온 연골조직 및 골조직의 손상을 치료하기 위한 자가연골세포이식술에 이용되는 자가연골세포 또는 골세포, 당뇨병 치료를 위한 췌도세포, 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 질환상태를 치료하기 위한 혈관내피세포, 혈관내피전구세포, 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포 등의 생체밖의 환경에서 준비된 이식이 가능한 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 재생조직과 이 구조물을 구성하는, 관련 이식세포들은 대부분이 단일종류의 세포들로 제조된 것들이 주류였다.
이러한 치료중　연골조직 및 골조직의 치료, 당뇨병 치료 및 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 질환상태를 위한 치료로는 환부에 배양한 자가연골세포이식술에 이용되는 자가연골세포 또는 골세포, 췌도에서 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC), 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC), 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포 혹은 이들로 만들어진 각각의 조직을 이식하는 방법을 고려할 수 있다.
선행기술문헌
비특허문헌
비특허문헌 1 Langer 등, Science 260, 920, (1993)
비특허문헌 2 Petit-Zemane, Nature Biotechnology 19, 201, (2001)
비특허문헌 3 Brittiberg 등, New England Journal of Medicine, 331(14),889(1994)
비특허문헌 4 Peterson L, 6th Annu. Meet., American Academic Orthopaedic Surgery(1998)
비특허문헌 5 Hunziker 등, The journal of Bone and Joint Surgery, 78-A,721(1996)
비특허문헌 6 Sekiya 등, Stem cell, 25,689(2007)
비특허문헌 7 Chen 등, Spine, 34-12,1272(2009)
비특허문헌 8 Anderer 등, Journal of Bone and Mineral Research, 17-8,1420(2002)
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비특허문헌 13 Takahashi등, Nature Medicine, 4,434 (1999)
특허문헌
특허문헌 1 일본 특허등록문헌: 特開 2003-180819號 公報
특허문헌 2 일본 특허등록문헌: 特開 2003-111831號 公報
특허문헌 3 일본 특허등록문헌: 特開 2004-136096號 公報
특허문헌 4 한국 특허등록문헌: 특허 제10-0788800 호
특허문헌 5 일본 특허등록문헌: 特開 2007-89537號 公報
본 발명자는 임상에 효과적이면서 실질적으로 이용가능한 혼합세포복합체의 이식치료용 세포스페로이드를 제공하기 위하여, 혼합세포복합체는 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들의 집합인 세포스페로이드 및 혼합세포복합체를 구성하는 각 세포재료를 분리준비하고, 상기분리된 세포를 계대배양하여 증폭한 후, 1종류 혹은 2종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하고 진탕배양(Shaking culture)함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조하여 제조된 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계를 포함한 이식치료용 세포 스페로이드의 제조방법 및 이를 이용한 치료법 그리고, 치료용의 목적과는 별도로 화합물, 약제, 독성물질 등의 피검물질의 약효 및 독성의 생리작용 혹은 독성를 평가하기 위한 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 이식치료용 세포스페로이드를 구성하는 각세포재료는, 연골조직 및 골조직의 손상을 치료하기 위한 자가연골세포이식술에서 응용될 경우, 자가연골세포 또는 골세포 연골세포의 단독 사용 뿐 만 아니라 1종류 혹은 2종류이상의 높은 증식능을 갖으며, 연골조직으로의 용이한 분화능을 보유하는 각종 줄기세포 혹은 연골전구세포 등을 이용하는 것으로 연골양조직으로서 형질발현된 이식치료용 세포스페로이드의 대량의 준비가 가능하게 되어, 고령자에게 다발하는 광범위한 연골조직 및 골조직의 변성 또는 연골의 변성 및 연골조직의 손상이 연골하골까지 도달하지 않는 부분결손 등에 대한 치료기술의 확립이라는 면에서도 상당히 유용하게 된다.
또한, 이식치료용 세포스페로이드를 구성하는 각세포재료는 당뇨병 치료를 위한 췌도세포 혹은 췌도에서 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC), 혹은, 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 질환상태를 치료하기 위한 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포들로 대량 증식과정을 거친 후 이용함으로써 췌도조직 및 혈관조직으로의 형질발현된 이식치료용 세포스페로이드의 대량의 준비가 가능하게 되어, 임상췌도이식에 있어서 고질적인 장기부족에 의한 이식할 췌도의 공급이 절대적으로 부족한 실정에 대한 대안이 될수 있고, 특히, 이식치료용으로 단일세포로 구성된 세포현탁액이 아니고 1종류 혹은 상호보안의 관계인 2종류 이상의 3차원구조를 갖는 다수의 세포들의 집합인 세포스페로이드를 이용하게 됨으로써 본래 갖고 있던 특정 기능을 더욱 증진하게 되고 이식후 세포가 흩어져서 분포하지 않고 세포스페로이드의 구조안에서 각구성세포들과 커뮤니케이션 할 수 있는 긴밀히 접척이 가능한 면에서도 상당히 유용하게 된다. 그밖에 사용하는 세포의 특성에 따라 면역격리능 등의 새로운 기능을 보유 할수 도 있어 유용하게 된다.
본 발명은 상기 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법 그리고 이용방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 한 관점으로서, 혼합세포복합체가, 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들의 집합인 이식치료용 세포스페로이드를 제공한다.
다른 관점으로서, (1) 혼합세포복합체를 구성하는 각 세포재료를 분리준비하는 단계；(2) 상기분리된 세포를 계대배양하여 증폭하는 단계；(3) 1종류 혹은 2종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하고 세포를 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양을 함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조하는 단계；및 (4) 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계를 포함한 이식세포치료용 스페로이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 이식치료용 세포스페로이드는 혼합세포복합체를 구성하는 각세포재료가 연골조직 및 골조직의 손상을 치료하기 위한 자가연골세포이식술에서 응용될 경우, 자가연골세포 또는 골세포 연골세포의 단독 사용 뿐 만 아니라 1종류 혹은 2종류이상의 높은 증식능을 갖으며, 연골조직으로의 용이한 분화능을 보유하는 각종 줄기세포 혹은 연골전구세포 등을 이용하는 것으로 연골양조직으로서 형질발현된 이식치료용 세포스페로이드의 대량의 준비가 가능하게 되어, 고령자에게 다발하는 광범위한 연골조직 및 골조직의 변성 또는 연골의 변성 및 연골조직의 손상이 연골하골까지 도달하지 않는 부분결손 등에 대한 치료기술의 확립이라는 면에서도 상당히 유용한 수단이다. 게다가 본 발명은 골막패치를 사용하지 않기 때문에 통상적인 자가연골세포이식술과 비교하여 환자측의 부담을 경감시킬 수 있으며 절개부위를 최소한으로 할 수 있어 수술에 의한 침윤 또한 줄일수 있게 된다.
한편, 본 발명자들은 지금까지 조직공학적수법에 의한 연골재생에 적합한 담체제조에 관한 연구, 지적인 세포외환경의 구축에 관한 연구, 조직공학적으로 제조된 연골의 동종이식에 의한 연골재생에 관한 연구, 그리고 인공재료인 지지체를 사용하지 않는 연골세포시트 혹은 재생연골plate에 의한연골수복?재생에 관한 연구등에서 성과를 내고 있다. 이들 결과들로 부터 손상을 치료하기 위해서는 손상부위로 동원되는 간엽계줄기세포 등의 존재가 필수조건이고 조직수복?재생에 필요최소한의 연골유도 initiator로서 조직공학적인 연골성분의 존재가 중요한 것이라는 의견을 제시하고 있다.
또한, 상기의 본 발명자들의 의견을 고려하면 상기 연골조직표층부터 연골하골까지 도달하지 못한 부분결손은 다능성 및 증식능이 있고 연골조직으로 용이한 분화능을 보유한 간엽계줄기세포의 동원이 적어 결과적으로 조직수복?재생이 충분치 못한 불완전한 치료밖에 기대되지 않는 경우가 다수이다. 본 발명에 의한 활막유래, 골수유래등의 간엽계줄기세포와 연골세포를 혼합세포체로 하여 제조한 이식치료용 세포스페로이드는 상기의 조건을 만족시키기 때문에 양호한 조직수복?재생의 결과를 기대할 수 있다.
또한, 이식치료용 세포스페로이드를 구성하는 각세포재료는 당뇨병 치료를 위한 췌도세포 혹은 췌도에서 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC), 혹은, 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 질환상태를 치료하기 위한 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포들로 대량 증식과정을 거친 후 이용함으로써 췌도조직 및 혈관조직으로의 형질발현된 이식치료용 세포스페로이드의 대량의 준비가 가능하게 되어, 임상췌도이식에 있어서 고질적인 장기부족에 의한 이식할 췌도의 공급이 절대적으로 부족한 실정에 대한 대안이 될수 있고, 특히, 이식치료용으로 단일세포로 구성된 세포현탁액이 아니고1종류 혹은 상호보안의 관계인 2종류 이상의 3차원구조를 갖는 다수의 세포들의 집합인 세포스페로이드를 이용하게 됨으로써 본래 갖고 있던 특정 기능을 더욱 증진하게 되고 이식후 세포가 흩어져서 분포하지 않고 세포스페로이드의 구조안에서 각구성세포들과 커뮤니케이션 할 수 있는 긴밀히 접척이 가능한 면에서도 상당히 유용하게 된다. 그밖에 사용하는 세포의 특성에 따라 면역격리능 등의 새로운 기능을 보유 할수 도 있어 유용하게 된다.
도1은 본 발명의 한 양태에 있어서, 1종류의 세포를 배양액내에서 단독의 세포재료혼탁액을 준비하고 진탕배양함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 나타내는 모식도를 나타낸 것이다.
도2는 본 발명의 한 양태에 있어서, 세포재료 A와 세포재료 B의 2종류의 세포를 배양액내에서 혼합세포재료혼탁액을 준비하고 진탕배양함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 나타내는 모식도를 나타낸 것이다.
도3은 본 발명의 다른 양태에 있어서, 2회이상 반복실시하는 복수단계의 진탕배양을 하여 1회째의 진탕배양의 결과산물인 1차세포스페로이드를 중심으로 다시 1종류 혹은 2종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하여 2회이상의 진탕배양을 함으로써 상기 1회째의 진탕배양의 결과산물인 1차세포스페로이드와 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체인 2차세포스페로이드로 형성된 혼합세포복합체를 나타내는 모식도를 나타낸 것이다.
도4는 본 발명의 한 양태에 있어서, 보조적으로 시트상구조물(연골세포시트)를 이용하여 보조적으로 이용한 치료방법의 혼합세포복합체인 이식치료용 세포스페로이드의 양태를 예로 들어 나타내는 모식도를 나타낸 것이다.
도5는 본 발명의 한 양태에 있어서, 혼합세포복합체를 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소에 양호하게 고정하도록 시트상 구조물(연골세포시트)을 이용하여 보조적으로 이용한 양태를 예로 들어, 계대배양기간과 진탕배양기간을 포함하는 이식치료용 세포스페로이드의 총제작시간은 14일정도로 하는 제조과정 스케쥴의 일례를 나타낸 것이다.
도6는 본 발명의 한 양태에 있어서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ②75％활막유래세포.25%연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 진탕배양함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 위상차현미경하에서 관찰하여 그 결과를 나타낸 것이다.
도7은 본 발명의 한 양태에 있어서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ④25％활막유래세포.75%연골세포구성의 세포현탁액를 대상으로 진탕배양함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 위상차현미경하에서 관찰하여 그 결과를 나타낸 것이다.
도8A는 발명의 한 양태에 있어서, 1종류의 세포(즉, ⑤0％활막유래세포.100%연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 평면원형으로 이동운동을 부가하면서 진탕배양함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 위상차현미경하에서 관찰하여 그 결과를 나타낸 것이다.
도8B는 본 발명의 한 양태에 있어서, 1종류의 세포(즉, ⑤0％활막유래세포.100%연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 평면좌우형으로 이동운동을 부가하면서 진탕배양함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 위상차현미경하에서 관찰하여 그 결과를 나타낸 것이다.
도9는 본 발명의 한 양태에 있어서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율을 ①100％활막유래세포.0%연골세포구성의 세포현탁액, ②75％활막유래세포.25%연골세포구성의 세포현탁액, ③50％활막유래세포.50%연골세포구성의 세포현탁액, ④25％활막유래세포.75%연골세포구성의 세포현탁액, ⑤0％활막유래세포.100%연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 각각진탕배양함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 위상차현미경하에서 관찰하여 그 결과를 나타낸 것이다.
도10은 본 발명의 한 양태에 있어서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ③50％활막유래세포.50%연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 5일간 진탕배양 함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 공초점 레이저현미경하에서 관찰하여 그 결과를 나타낸 것이다.
도11은 본 발명의 다른 양태에 있어서, 2회이상 반복실시하는 복수단계의 진탕배양을 하여 1회째의 진탕배양의 결과산물인 1차세포스페로이드를 중심으로 다시 1종류 혹은 2종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하여 2회이상의 진탕배양을 함으로써 상기1회째의 진탕배양의 결과산물인 1차세포스페로이드와 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체인 2차세포스페로이드로 형성된 혼합세포복합체를 위상차현미경하에서 관찰하여 그 결과를 나타낸 것이다.
도12는 본 발명의 다른 양태에 있어서, 혼합세포복합체는 진탕배양개시 12시간 경과 후부터 육안적으로 관찰이 가능하기 시작하여, 진탕배양의 전과정에 있어서 관찰 가능하였다. 이때 수득한 세포스페로이드의 육안적인 관찰소견의 결과를 나타낸 것이다.
도13은 본 발명의 한 양태에 있어서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ③50％활막유래세포.50%연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 5일간 진탕배양 함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 대상으로 실시한 면역조직화학 염색의 병리조직학적 검사의 결과를 나타낸 것이다.
도14A는 발명의 한 양태에 있어서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율②75％활막유래세포.25%연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 3일간 진탕배양 함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 토끼의 대퇴골측의 전층 손상 무릎연골의 손상부위에 이동시켜 이식킨 후 육안적인 관찰소견의 결과를 나타낸 것이다.
도14B는 본 발명의 한 양태에 있어서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율②75％활막유래세포.25%연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 3일간 진탕배양 함으로써 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체를 토끼의 대퇴골측의 전층 손상 무릎연골의 손상부위에 이동시켜 이식시킨 세포스페로이드를 이식4주후에 이를 대상으로 실시한 면역조직화학 염색의 병리조직학적 검사의 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은, 혼합세포복합체가, 혼합세포복합체가, 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들의 집합인 이식치료용 세포스페로이드로서 관절염, 관절증, 연골손상, 연골골손상, 반월판손상, 추간판변성 혹은 퇴행성관절염(Osteoarthritis, 변형성관절증), 또는 골조직의 일부를 손상 혹은 결손, 인슐린 의존성 제1형 당뇨병 혹은 인슐린 비의존성 당뇨병의 유형을 포함하는 췌도세포이식술이 치료법으로 사용될 수 있는 질환 혹은 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 실질조직의 불완전한 질환 등의 치료를 위한 이식치료용 세포스페로이드에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 “혼합세포복합체”는 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들의 집합인 세포스페로이드를 의미하지만, 각 해당 제공 조직 유래의 고유의 기능을 발휘하는 최종 분화단계의 성체세포, 상기 성체세포의 전구세포 및 아세포 및 미분화도가 높고 다능성(multi-potency) 및 고도의 증식능을 보이는 각종 조직 유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하여 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 용이한 분화능을 보유하여 연골조직, 췌도조직 또는 혈관조직의 등의 손상환부에 이식하는 것으로 치료효과를 나타내므로써 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 1종류 혹은 2종류 이상의 세포로 구성된 다수의 세포들의 집합인 것을 특징으로 하는 세포스페로이드일 수도 있다. 이것은 다능성을 보유한세포는 미분화세포이기 때문에 이식후 이식된 부위의 생체조직에 적합한 세포로 분화할 것으로 예상되기 때문이다.
또한, 신체내 정상적 혹은 건강한 상태의 개체로부터 유래한 이식하고자 하는 장기 또는 조직을 잘게 절단하여 수득한 마이크로 단위의 다수의 세포들의 집합 혹은 절편에서 유래한 세포로 구성된 세포스페로이드일 수도 있다.
혼합세포복합체는 면역거부반응이나 윤리적인 문제가 없는 이상적인 세포이식을 위해여 자가조직유래의 세포재료인 경우가 바람직하지만 연골조직은 정상상태에서는 혈관, 신경, 림프관이 없어서 백혈구 등 염증 세포의 침입이 불가능하기 때문에 이식시에 면역거부반응을 유발시키기 어려운 낮은 면역원성을 보이는 면역특권(immune-privilege)을 보유하는 조직으로서 알려져 있는 것으로 부터 동종 혹은 이종의 조직으로부터 유래하는 세포 또는 이들중의 2종류이상의 세포일 수도 있다.
본 발명에서 이용 목적에 따라서 선택할 수 있는 각 해당 제공 조직 유래의 각 세포재료는 특별히 제한적이지 않다. 한 양태로서 고유의 기능을 발휘하는 최종 분화단계의 성체세포로서 연골세포이외에도, 내분비 기능을 담당하는 세포인 경우에 특정 질병을 치료하는데 탁월한 효과를 기대할 수 있어 바람직하다. 일례로 이식물이 췌장 유래인 경우에는 당뇨병을 치료하는데, 이식물이 갑상선 유래인 경우에는 갑상선 기능 저하증을 치료하는데 각각 이용될 수 있다. 다른 예로 이식물이 에리스포이에틴를 분비하는 세포, 성장호르몬을 분비하는 세포 또는 혈액응고 인자를 분비하는 세포인 경우에는 각각 빈혈, 왜소증, 혈우병을 치료하는데 이용될 수 있다. 또 다른 양태로서, 통상적으로 정보가 공개되고 관련기관을 통해 구입이나 양도가 가능한 수립세포주인 경우에도 치료 및 피검물질의 약효 또는 독성을 평가하는 시스템으로서 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서 혼합세포체의 이식치료용 세포스페로이드는 크기가 10㎛ 내지 1,500㎛의 범위인 것을 치료에 사용하는 것이 바람직하다. 이식치료용 세포스페로이드는 크기가 600㎛ 정도인것이 바람직한데 이는 일반조직유래의 체성세포로 제조된 스페로이드는 그 중심으로 부터 스페로이드의 표층까지의 거리가 300㎛ 정도 까지는 통상적인 배양 조건하에서 가스 및 영양분의 확신이 더 원활하게 되어 세포스페로로이드의 생체밖에서 수명의 연장이 가능하게 되며 증식을 촉진할 수 있어 이식물의 본래의 기능을 발휘하는 데 훨씬 유리하게 작용하기 때문이다. 비교적으로 두께가 얇은 혼합세포복합체는 가스 및 영양분의 확산이 더 원활하게 되어 이식물의 수명의 연장이 가능하게 되며 연골양조직으로서 형질발현을 유지가능하게됨으로써 세포스페로이드의 본래의 기능을 발휘하는데 훨씬 유리하게 작용하기 때문이다.
한편, 연골조직은 정상상태에서 연골세포로부터 분비되는 세포외기질이 풍부하고 연골세포 자체는 수%에 지나지 않는다. 게다가 대사가 아주 적은 연골세포는 혼합세포복합체의 스페로이드의 형태가 되면 다른 세포와 비교해서 양호한 가스 및 영양분의 확산이 가능한 스페로이드의 중심부터 스페로이드의 표층까지의 거리가 300㎛보다 멀 것으로 예상되지만 1,500㎛ 보다는 짧은 것이 바람직하다.
본 발명은, (1) 혼합세포복합체를 구성하는 각 세포재료를 분리준비하는 단계；(2) 상기분리된 세포를 계대배양하여 증폭하는 단계；(3) 1종류 혹은 2종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하고 세포를 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양을 함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조하는 단계；및 (4) 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계를 포함한 이식세포치료용 스페로이드의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 이하의 제조방법은 세포스페로이드를 구성하는 각세포재료가 연골조직 및 골조직의 손상을 치료하기 위한 자가연골세포이식술에서 응용될 경우를 예로 들어 구체적으로 설명한다.
본 발명에 의한 제조방법 단계 (1)은, 혼합세포복합체를 구성하는 각세포재료를 분리준비한다. 먼저, 혼합세포복합체를 구성하는 각세포재료의 기원이 되는 해당하는 제공조직을 채취해서 피부조직, 피하조직, 근육조직, 연골하골(subchondral bone), 인대, 반월판, 그밖의그 밖의 결합조직을 제거한 후 호모지나이저, 막자사발, 블렌더, 외과용 매스, 주사기, 포르셉, 초음파 장치와 같은 물리적 수단으로 쵸핑(chopping)하여 잘게 조각낸다. 이 때, 해당하는 제공조직을 수용하는 무균의 기재로써 배양접시, 원심용용기등을 포함하는 수지소재의 기재, 시계접시(watch glass) 등을 포함하는 초자소재의 기재등과 같은 기재를 이용하지만, 해당하는 제공조직이 연골조직등의 탄력성 있는 조직인 경우에는 쵸핑시 잘게 조각낸 대상조직이 위치된 수용기재로부터 비산되어 이탈하는 경우가 있다. 이런 현상은 해당하는 제공조직이 쵸핑된 후 조직의 회수량이 경감하며 위치된 수용한 게재로부터 비산되어 이탈한 조직을 다시 되돌려서 계속 쵸핑을 한다면 이후의 각세포재료를 분리준비하는 과정에서 세균이나 진균등에 의한 오염 가능성이 높아지는등 목적한 쵸핑을 원활하게 실시하는 것이 어려워진다. 이렇게 상기한 것과 같이 잘게 조각낸 후 해당하는 제공조직으로부터 각세포재료를 분리하여 준비하는 과정을 포함하는 초대배양의 경우, 세균이나 진균등에 의한 오염이 우려되므로 이들 에 의한 오염을 방지하기 위해서 무균적인 작업이 요구되기 때문이다.
상기대상조직은, 오목한 모양의 밑바닥이 있으며 쵸핑시 대상조직이 위치된 수용기재로부터 비산되어 이탈하는 것이 방지될 수 있는 정도의 측면부 길이를 갖는 원심용용기속의 바닥에 위치시킨 후 수술용 곡가위（curved scissors）를 이용하여 쵸핑하는 것이 바람직하다. 통상 시판되는 50ml 용량의 원심용용기는 쵸핑시 대생조직이 원심용용기로부터 비산되어 이탈하는 것이 방지될 수 있는 정도의 측면부 길이를 갖기 때문에, 예를 들어 연골조직등의 탄력성 있는 조직인 경우에도 원심용용기 내부의 공간으로 부터 비산되어 이탈하지 않는다.
뿐만 아니라, 이 방법을 이용하면 수술용 곡가위는 구부러져 있어 세포배양시 이용하는통상 시판되는 50ml 용량의 원심용용기의 오목한 바닥과의 밀착된 접촉이 용이하다. 대상조직은 통상적인 경우 중력에 영향을 받으므로 항상 오목한 바닥쪽으로 위치하려는 현상이 생긴다. 이러한 현상과 원심용용기의 오목한 바닥의 위치에서 수술용 곡가위에 의한 절단 운동은 대상조직을 바닥으로 모이게 하여서 탄성연골에 강한 수술용 곡가위의 절단 운동이 지속적으로 작용하게 되어 해당제공조직이 연골조직 등과 같은 탄력이 있는 조직이더라도 결과적으로 단시간에 보다 작은 크기로 잘게 조각낼 수 있다. 이러한 쵸핑을 용이하게 달성하기 위해서는 원심기용용기 측면부 장축의 길이보다 긴 수술용 곡가위를 이용하여 쵸핑하는 것이 바람직하다.
쵸핑하여 잘게 분쇄한 후에는 중성 프로테아제, 트립신, 세린 프로테아제, 엘라스타제 및 콜라게나제로부터 선택된 적어도 하나의 단백질 분해효소로 처리하여 개체의 체온과 동일한 온도로 설정한 온수를 제공할수 있는 항온수조 등의 물 속이나 개체의 체온과 동일한 온도로 설정한 공기를 제공할수 있는 세포배양용 인큐베이터 등의 공기중 등의 환경 하에서 해당제공조직과 단백질 분해효소용액으로 구성된 세포현탁액에 액체의 움직임의 유동에 의한 각반을 유발시키면서 소화시킨다.
본 발명에서 단백질 분해효소를 처리하는 온도와 시간은 단백질 분해효소의 종류 및 개체의 종 등에 따라 달라질 수 있지만, 통상적인 세포배양용 인큐베이터 속에서 37℃, 5% CO2의 조건하에 전자스테러(Magnetic Stirrer)을 이용하여 각반하면서 소화시키는 것이 바람직하다.
그 이유는 다음과 같이 설명될 수 있다. 본 방법은 단백질 분해효소로 소화시키는 과정에서 통상적인 세포배양용 인큐베이터, 무균적인 유리용기, 전자스테러용 무균자석바를 이용하는데 이러한 세포배양용기재는 청결하게 유지되고, 무균적인 유리용기 속에 쵸핑하여 잘게 분쇄된 해당제공조직과 단백질 분해효소용액으로 구성된 세포현탁액에 액체의 움직임의 유동에 의한 각반을 유발하기에 용이하고 유리병의 뚜껑을 조금 개방하는 것으로 그 간격으로부터 인큐베이터 내부의 공간의 온도 습도 등의 기체조성에 직접 연결되어 세포배양에 이상적으로 조정된 인큐베이터 내부의 기체조성은 해당제공조직과 단백질 분해효소용액으로 구성된 세포현탁액 속의 각세포에 대하여도 안정적이고 유리하다.
본 발명에 의한 제조방법 단계 (2)은, 상기 분리된 연골세포 및 활막유래세포를 계대배양하여 증폭한다. 여기서, 배지로는 당업계에 공지된 임의의 세포 증식용 배지 혹은 연골분화유도배지를 이용할 수 있는데, 세포의 생존증식에 필요한 성분(무기염, 탄수화물, 호르몬, 필수아미노산, 비필수아미노산, 비타민)을 함유하는 기본배지(예를 들면, Dulbeco's Modified Eagle Medium(D-MEM), Minimum Essential Medium(MEM), RPMI-1640、Basal Medium Eagle(BME), Dulbeco's　Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12(D-MEM/F-12), Glasgow Minimun Essential Medium(Glasgow MEM))와 같은 기본배지를 사용한다.
이러한 배지에는 콜라겐 합성을 위해 요구되는 아스코르브산은 필수적으로 첨가 하고, 그 밖의 증식인자 또는 분화유도인자FGF(Fibroblast Growth Factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor), IGF(Insulin-like Growth Factor), TGF(Transforming Growth Factor), VEGF(Vascular Endthelial Growth Factor), EGF(Erythrocyte Growth Factor), BMP(Bone Morphogenetic Protein), TNF(Tumor Necrosis Factor), 비타민류, 인터루킨류, 헤파린, 헤파린유도체, 헤파란유산, 콜라겐, 피브로넥틴, 피브린, 다혈소판혈장, 프로제스테론, 세레나이트, B27-써플리멘트, N2-써플리멘트, ITS-써플리멘트(인슐린, 트렌스페린, 아세린산, 소혈청알부민, 리놀레인산 함유), 덱사메타손, 빌루빈산나트륨, 프로린, L-글루타민 등은 필요시에 따라 첨가한다. 또한, 필요에 따라서는, HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 등의 산 염기조정을 위한 첨가제, 항생제, 항진균제 등의 항생물질, 통상적인 이용시에 %인 10%의 FBS(Fetal Bovine Serum) 혹은 더 높은 증식을 원하는 경우에는 10%이상의 FBS, 임상응용에 있어서 용이하도록 환자유래의 자가혈청을 상기의 10%에서 10%이상 함유하고 있어도 좋다.
본 발명에 있어서, 연골세포, 연골전구세포, 활막유래세포, 활막줄기세포, 골아세포, 골수유래세포, 각종조직유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 지방유래세포, 지방유래줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하고 연골세포로 용의한 분화능력을 보유한 세포 등을 손상환부에 이식하는 것으로 치료효과를 볼 수 있는 각세포재료를 약 2주간 반복적으로 계대배양에 의하여 증폭시킨다.
높은 분화도를 보이는 연골세포는 2~20배 이상, ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하고 연골세포로 용의한 분화능력을 보유한 미분화세포는 20~100배 이상 증폭가능한 당업계에 공지된 임의의 세포 증식용 배지에 10% FBS, 아스코르브산으로 조정된 배지를 이용하는 것이 바람직하다.
배양하면서 콘플루언시가 약 90%에 도달하면 트립신?EDTA를 처리하여 증폭된 연골세포를 떼어내어 새로운 배지로 계대배양한다. 본 발명에서 계대배양은 3회 이하로 제한하는 것이 바람직한데, 이것은 연골세포는 계대회수를 거듭하여, 특히 4회를 넘어가면 탈분화(de-defferentiation)해서 본래의 성질을 잃어 연골세포로부터 분비하는 세포외기질인 콜라겐의 유형이Ⅱ에서 Ⅰ로 변하는 등 섬유아세포양(fibroblast-like)으로 변하기 때문이다.
본 발명의 상기 연골세포 및 연골전구세포의 계대배양은, 세포를 고밀도로 파종해서 배양한다. 본 발명에서 말하는 상기연골세포 및 연골전구세포의 파종시의 세포밀도는 배양되는 세포에 따라서 달라지지만, 5,000개/cm2이상이 바람직하고, 10,000개/cm2이상이 더욱 바람직하고, 20,000개/cm2이상이 더욱 바람직하다, 연골조직 및 골조직의 배양에 있어서 더욱 효과있게 재생하는 밀도는 (2.0±0.4)×104/cm2 이며, 계대배양시의 파종세포의 세포밀도는 10,000개/cm2이하로 하게 되면, 배양세포가 상기의 섬유아세포양으로 변화되괴 쉽고, 즉 연골세포의 경우 형질발현의 정도가 저하되어 본기술의 목적을 달성할 수 없다
본 발명의 이식치료용 세포스페로이드는, 혼합세포복합체가 연골양조직으로서 형질발현된 것을 특징의 하나로 하고 있다. 연골양조직으로서 형질발현되었다라고 한는 것은, SOX9, HAS 등의 유전형질을 발현하고 있는 것, 또는 세포외기질의 형성에 관여하는 콜라겐 유형이Ⅱ인 것 등의 분화형질을 발현하고 있는 것이다.
상기의 조건하에서 연골세포는 약 2주간(즉, 계대회수 4회 이전까지 소요되는 시간) 배양하면 최소 2~20배 이상으로 증폭될 수 있다.
또한, 상기의 당업계에 공지된 임의의 세포 증식용 배지에 열에 의해 불활화 된 10%의 FBS, 아스코르브산으로 조정된 배지에, 한층 더 빠른 증식속도로 증대시키기 위해서는 다른 증식 혹인 분화인자를 필요에 따라서 첨가하면 상기의 증식정도 이상으로 증폭될 수 있다.
본 발명에 의한 제조방법 단계 (3)은, 1종류 혹은 2종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하고 세포를 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양을 함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조한다.
이단계에 있어서, 혼합세포복합체는 충분히 세포재료들을 상호접착시켜서 이식치료용 세포스페로이드를 형성시킬 수 있는 과량의 세포재료를 첨가시킬 필요가 있다. 세포는 본래 세포 스스로 생산해서 세포표면에 발현시키는 각종의 접착인자, 전기적인 인력, 화학결합 등에 의하여 서로 접착하려 하는 성질을 갖고 있고, 이러한 성질은 각세포의 종류에 따라 차이가 있다. 이러한 성질과 더불어 진탕운동을 수반하기 때문에, 인위적으로 세포와 세포 간의 접촉의 기회를 증시시키게 된다. 이러한 인위적인 작업으로 부터 기인하는 지속적이고 반복적인 진탕운동으로부터 생기는 배양액의 유동에 의하여 각세포는 배양용기의 바닥에 정체하지 않으며 배양액중에서 뜨는 현탁상태를 진탕배양기간중에 유지할 수 있다.
따라서, 진탕을 개시한 최초단계에 세포스페로이드가 된 작은 크기의 혼합세포복합체를 중심으로 하여 다수의 다른 세포재료들이 신속하게 접착하게 되어, 이식치료용 세포스페로이드가 성장하게 된다. 특히 연골세포 및 연골양조직으로서 형질발현된 세포는 고밀도로 존재하게 되면 그 크기를 유지하면서 본래의 연골세포에 더욱 유사한 생태로 된다. 즉, 연골조직이 정상연골로서 분화도를 유지하는데 알맞은 환경하에서는 연골세포는 고유의 세포외기질인 콜라겐 유형 Ⅱ을 풍부하게 생산하여 분비하게 되어 결과적으로는 체내에 존재할 때와 같이 세포수는 비교적 적고 세포외기질은 풍부한 정상연골과 비슷한 성질을 나타내게 된다.
상기 단계 (3)에서 본 발명에 의한 제조방법의 단계(2)에 기재된 각배지를 사용하는 것이 가능하다. 진탕배양은 입체 8자형, 평면 8자형, 평면원형, 또는 평면 좌우형으로 이동 가능한 진탕 배양용 셰이커를 이용하여 진탕의 세기를 60 내지 80rpm으로 설정하고, 개체의 체온과 동일한 온도로 설정한 환경에서 진행하는 것이 바람직하다. 특히 진탕배양기간은 1 내지 7일 동안 진행하게 되는데, 상기계대배양기간 중에 충분히 증폭된 각세포재료는 세포배양기간이 4주간 이상을 필요로 하는 기존의 자가연골세포이식술 보다 배양기간을 단축시킬수 있어 결국, 단기간에이식치료용 세포스페로이드의 제조가 가능하게 된다. 이러한 기간의 단축은 고령의 환자 및 광범위한 손상을 수반하는 환자 등에게도 임상응용이 가능한 수법으로 확립될 수 있고, 환자들의 입원기간의 단축으로 인한 의료비경감에 기여할수 있다는 관점에서, 진탕배양기간은 1일에서 3일간 걸쳐서 실시하여, 상기 계대배양기간과 진탕배양기간을 포함하는 상기의 이식치료용 세포스페로이드의 총제작시간은 14일정도로 하는 것이 바람직하다. 배양 용기로는 이의 표면에 세포가 접착되지 않도록 고안된 비 접착성 배양 접시(즉, 부유 배양용 접시) 또는 대량배양의 경우에는 스피너플라스크(spinner Flask)를 사용한다. 예를 들면, 약 37℃에서 친수성을 나타내어 세포가 전혀 접착되지 않는 HydroCellTM 배양 접시(Cellseed. Co.)를 사용할 수 있다. 이를 통하여 약 10㎛ 내지 1,500㎛의 크기의 이식치료용 세포스페로이드를 제조할 수 있다.
또한, 진탕배양은 세포재료현탁액의 세포밀도가 1.0×104개/ml 부터 3,000×104개/ml로 조정해서 적용하지만, 적당한 세포밀도를 선택할 때에는 이용하는 세포재료의 종류, 배양기재의 성질 및 진탕배양시 배양용기의 바닥직경, 공간, 용적, 크기등에 따라서 필요시에 종합적으로 판단하여 적당한 상기의 범위내의 세포재료현탁액의 세포밀도를 설정하면 된다. 또한, 진탕배양시의 진탕의 세기 및 진탕의 양태를 설정할 때에도 세포재료의 종류, 배양기재의 성질 및 진탕배양시 배양용기의 바닥직경, 공간, 용적, 크기등에 따라서 필요시에 종합적으로 판단하여 적당한 상기의 범위내의진탕의 세기를 설정하면 된다. 필요와 의도한 목적에 따라서 진탕의 양태는 그 운동의 형태 및 진탕의 세기도 시간에 경과함에 따라서 변화를 주어도 좋다.
상기 단계 (3)에 있어서, 상기 마이크로케리어(micro-carrier)는, 상기 세포재료현탁액중의 세포들의 상호접착을 촉진시키기 위한 분자로서, 각각의 세포와 상기 마이크로케리어 간에 있어서 상호 양호한 접착성을 부여한다. 이 마이크로케리어를 이용하면, 진탕배야시 세포재료들간의 양호한 상호접착, 세포스페로이드 형성효율의 향상 및 이식에 적합한 연골양조직으로 형질 발현의 강화를 가능하게 한다. 상기 마이크로케리어의 사용은 필요할 시에 1종류 혹은 2종류 이상을 병용해도 좋다. 2종류 이상을 병용하여 사용할 때에는 2개의 마이크로케리어의 상이한 성질이 반응하여 더욱 유익한 성질을 나타내는 새로운 마이크로케리어로서 작용하여도 좋다. 예를 들어 이하의 물질중에 후라그민(Fragmin, 일반명：[Dalteparin sodium])과 유산프로타민(Protamine sulfate)의 전기전하적으로 서로 상이한 성질이 마이크로케리어를 형성시키게 되고, 이렇게 형성된 새로운 마이크로케리어는 세포와 상기 마이크로케리어들 간의 양호한 접착성(Nakamura 등, J Biomed Mater Res A. , May-12, Epub ahead of print (2009))을 제공해 주므로 바람직하다.
또한, 상기의 마이크로케리어는, 콜라겐, 콜라겐유도체, 히알루론산, 히알루론산유도체, 루브리신(Lubricin), 뮤신(Mucin), 키토산, 키토산유도체, 폴리로타키산, 폴리로타키산유도체, 키틴, 키틴유도체, 우레탄, 셀룰로스, 아가로스, 젤라틴, 피브리오넥틴, 피브린, 다혈소판혈장, 헤파린, 헤파린유도체, 후라그민(Fragmin, 일반명：[Dalteparin sodium]), 유산프로타민(Protamine sulfate), Avidin, Streptavidin, Biotin, 라미닌(Laminin), 2-Octyl Cyanoacryleate、알길산칼슘, 폴리유산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐알콜, 폴리프로필렌, 폴리글리콜산, 폴리카프로락탐, 폴리유산폴리글리콜산공중합체, 폴리유산폴리카프로탁탐공중합체 및 폴리글리콜산폴리카프로락탐공중합체으로 만들어진 군으로 부터 선택한 1종류 혹은 2종류이상의 생체친화성 재료 또는 생체흡수성 재료로 형성된다. 게다가 상기 마이크로케리어는, 임상에 있어서 효율적으로, 실질적으로 이용 가능한 혼합세포이식체로서 세포이실치료용 스페로이드를 제조 및 이용하는 치료법으로서 사용되기 쉽게하기 위한 관점으로써 본다면, 관련기관으로부터 임상적인 이용의 경우 허가 및 인가를 수득한 것이 바람직하다.
상기 단계 (3)에 있어서, 상기 진탕배양에 관하여 도1, 도2 및 도3을 참조하면서 이하를 설명한다. 1종류 혹은 2종류 이상(도2의 세포재료A와 세포재료B)의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하여 진탕배양을 함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조과정 1회 만으로 하여 진탕배양, 또는 2회이상의 반복 실시하는 복수단계의 진탕배양을 함으로써 1회째의 진탕배양의 결과산물인 1차세포스페로이드와 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체인 2차세포스페로이드로 새로운 혼합세포복합체를 제조하는 것이 가능하다. 이러한 1차세포스페로이드를 중심으로 다시 세포를 배양액내에서 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하여 계속하여 2회째의 진탕배양을 함으로써 상기 1회째의 진탕배양의 결과산물인 1차세포스페로이드와 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체인 2차세포스페로이드로 새로운 혼합세포복합체를 제조하는 과정에 있어서, 1차세포스페로이드와 2회째의 진탕배양의 세포재료를 투입시킨 직후의 모습을 위상차현미경하에서 관찰하여 그 결과를 도11에 표시하였다.
2회 이상 진탕배양함으로써, 결과산물인 1차세포스페로이드의 구조를 인위적으로 변경시킬수 있다. 예를 들어 더 표층쪽에 가까운 2차세포스페로이드의 세포재료를 연골세포로 하고 더 심부쪽에 위치하는 1차스페로이드의 세포재료를 활막유래세포로 적용한다면, 높은 증식율을 보유한 활막유래세포로 세포스페로이드의 대부분을 차지하는 1차세포스페로이드를 형성시키고 난 뒤, 비교적 고령 환자의 증식율이 저하된 연골세포이더라고 제한된 배양기간내에 적은 수의 세포재료만 가지고서도, 상기 2차세포스페로이드를 형성하는 데는 충분하게 된다. 각세포재료의 증식능, 생체내의 해부학적 조직학적 발생학적인 면을 종합적으로 판단하여, 상기의 복수단계의 진탕배양의 세포재료의 종류, 세포재료의 종류 및 구성을 고려한 제조방법을 선택하면 된다.
본 발명에 의한 제조방법 단계 (4)은, 세포이식치료를 위하여 제조된 세포스페로이드를 분리하여 손상환부에 이식한다. 상기의 단계(3)에 있어서 진탕배양이 1 내지 7일간 경과하게 되면 배양접시내에 다양한 크기의 이식치료용 세포스페로이드가 존재하게 된다. 들을 단순히 분리하거나 크기별로 분리하기 위하여, 한 양태로서 멸균 처리된 마이크로 피펫을 이용해서 위상차현미경 하에서 관찰하면서 마이크로 피펫으로 이식치료용 세포스페로이드를 흡입하여 새로운 배양접시(부유배양용 접시)에 옮겨 담는 방식이 이용될 수 있다. 이 때, 배양접시를 원운동시키면서 원심력에 의해 이식치료용 세포스페로이드를 중심으로 모이게 하고 마이크로피펫의 팁(tip)을 이용해서 상기 이식치료용 세포스페로이드의 제작과정에 있어서 사용하는 배양액, 세포현탁액, 마이크로 케리어함유용액, 각종완충액 및 생리식염수 등의 체액과 유사한 조성을 갖는 운반용용액 등을 같이 흡입하면, 크기별 팁의 직경 크기에 적합한 크기의 이식치료용 스페로이드의 흡수가 가능하다. 또한, 이와 비슷한 방식으로 주사용침과 주사기를 이용하여, 손상환부의 세포이식하는 과정에 있어서 내시겨 혹은 관절경 또는 관절경하 수술에 사용가능한 형태의 이식치료용 스페로이드를 준비하면 좋다.
상기 단계 (3)에 있어서, 상기제조한 세포스페로이드를 이식하여 손상환부인 이식부위에 세포스페로이드를 위치시키게 되면, 이것을 세포스페로이드의 표면도 구성하는 세포에 따라 달라 질 수 있으므로, 이러한 세포는, 본래 세포 스스로 생산해서 세포표면에 발현시키는 각종의 접착인자, 전기적인 인력, 화학결합 등에 의하여 서로 접착하려 하는 성질을 갖고 있고, 이러한 세포로 표면이 구성되어 있는 세포스페로이드는, 근접한 세포스페로이드 만으로도 서로 용이하게 합체하지만, 상기 마이크로케리어를 이용하여, 혼합세포복합체를 손상환부에 더욱 양호한 고정 및 단기간내의 이식과 환자와 세포스페로이드 간의 신속한 결합을 원할 때에는 사용해도 좋다. 상기의 마이크로케리아는, 콜라겐, 콜라겐유도체, 히알루론산, 히알루론산유도체, 루브리신(Lubricin), 뮤신(Mucin), 키토산, 키토산유도체, 폴리로타키산, 폴리로타키산유도체, 키틴, 키틴유도체, 우레탄, 셀룰로스, 아가로스, 젤라틴, 피브리오넥틴, 피브린, 다혈소판혈장, 헤파린, 헤파린유도체, 후라그민(Fragmin, 일반명：[Dalteparin sodium]), 유산프로타민(Protamine sulfate), Avidin, Streptavidin, Biotin, 라미닌(Laminin), 2-Octyl Cyanoacryleate、알길산칼슘, 폴리유산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐알콜, 폴리프로필렌, 폴리글리콜산, 폴리카프로락탐, 폴리유산폴리글리콜산공중합체, 폴리유산폴리카프로탁탐공중합체 및 폴리글리콜산폴리카프로락탐공중합체으로 만들어진 군으로 부터 선택한 1종류 혹은 2종류이상의 생체친화성 재료 또는 생체흡수성 재료로 형성되어 있고 상기의 마이크로케리어의 성질, 이식치료용 세포스페로이드의 구성, 이식부위의 환경 등을 종합적으로 고려하여 상기의 마이크로케리어의 군에서 선택하면 된다.
한편, 상기 혼합세포복합체를 손상부위에 양호하게 고정하기 위하여 이용하는 마이크로케리어 단독이용 혹은 별도 이용으로서, 손상부위를 포함하는 이식부위는 손상부위와 그 주변부위에 평판한 형상을 고려하면, 상기 해당하는 제공조직유래의 연골세포, 연골전구세포, 활막유래세포, 활막줄기세포, 골아세포, 골수유래세포, 각종조직유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 지방유래세포, 지방유래줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하고 연골세포로 용의한 분화능력을 보유한 세포등을 손상환부에 이식하는 것으로 치료효과를 볼 수 있는 1종류 혹은 2종류 이상의 세포를 일정기간 배양하여 시트상(sheet-like) 형태로 상기세포와 세포외기질로 구성된 배양세포시트 단독 혹은 상기 배양세포시트와 같이 콜라겐, 콜라겐유도체, 히알루론산, 히알루론산유도체, 루브리신(Lubricin), 뮤신(Mucin), 키토산, 키토산유도체, 폴리로타키산, 폴리로타키산유도체, 키틴, 키틴유도체, 우레탄, 셀룰로스, 아가로스, 젤라틴, 피브리오넥틴, 피브린, 다혈소판혈장, 헤파린, 헤파린유도체, 후라그민(Fragmin, 일반명：[Dalteparin sodium]), 유산프로타민(Protamine sulfate), Avidin, Streptavidin, Biotin, 라미닌(Laminin), 2-Octyl Cyanoacryleate、알길산칼슘, 폴리유산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐알콜, 폴리프로필렌, 폴리글리콜산, 폴리카프로락탐, 폴리유산폴리글리콜산공중합체, 폴리유산폴리카프로탁탐공중합체 및 폴리글리콜산폴리카프로락탐공중합체으로 만들어진 군으로 부터 선택한 1종류 혹은 2종류이상의 생체친화성 재료 또는 생체흡수성 재료인 인공바이오매터리얼로 형성된 시트상구조물 및 다양한 모양의 구조물을 보조적으로 연골 혹은 골조직표면에 대하여 피복 혹은 충진하여도 좋다. 여기에서는, 혼합세포복합체를 손상부위에 양호하게 고정하도록 시트상 구조물을 이용하여 보조적으로 이용한 양태를 예로 들어 도4에 나타내었다.
본 발명에 있어서, 세포이식은, 먼저 혼합세포복합체의 이식치료용 세포스페로이드의 세포성분이지만, 세포스페로이드를 구성세포로부터 분비된 분자 및 생산된 세포외기질, 상기세포이식용스페로이드의 제조과정에 있어서 사용한 배양액 및 세포현탁액, 마이크로케리어 함유액 또는마이크로케리어 함유액, 각종 완충액, 생리식염수 등의 체액에 유사한 조성인 운반용용액을 단독 혹은 동시에 치료를 위하여 상기손상환부에 이식하는 것으로, 연골양조직으로서 형질발현된 상태로본래의 기능을 발휘할수 있는 세포이식치료가 가능하게 된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 이식치료용 세포스페로이드는 치료의 목적과는 별도로 화합물, 약제, 독성물질 등의 약효, 독성의 생리작용, 및 독성을 평가하기 위한 시스템으로써 이용할 수 있다. 이것은 상기 이식치료용 세포스페로이드의 용도는 특별히 제한되니 않으며, 각종 질병의 치료용의 목적 이외에도 세포스페로이드를 이용하여 실시할 수 있는 모든 시험, 연구, 세포스페로이드를 이용한 물질 성상의 규명 작업등에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 획득한 각종 성체줄기세포로 제조된 스페로이드를 IGF, TGF, 트렌스페린, 인슐린, FBS, GA-1000, ITS-써플리멘트, 덱사메타손, 아스코르브산, 빌루빈산나트륨, 프로린 등의 인자를 처리함으로써 연골세포로 분화유도 할 수도 있는데, 이러한 작업을 통하여 수득한 분화세포를 환자에게 이식함으로써 줄기세포를 이용한 줄기세포요법을 통한 자가세포이식술이 가능하게 되며, 제작한 세포스페로이드를 대상으로 연골재생에 관여하는 피검물질의 약효 또는 독성을 직접 이렇게 제작된 세포스페로이드를 대상으로 편가하는 데에 사용될 수 있다. 본 발명 이식치료용 세포스페로이드의 용도는 상기 특정 양태에 의해 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기의 2회 이상의 반복 실시하는 복수단계의 진탕배양을 함으로써 1회째의 진탕배양의 결과산물인 1차세포스페로이드를 중심으로 다시 세포를 배양액내에서 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하여 계속하여 2회째의 진탕배양을 함으로써 상기 1회째의 진탕배양의 결과산물인 1차세포스페로이드와 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체인 2차세포스페로이드로 새로운 혼합세포복합체를 제조하는 것이 가능하다. 이러한 특징을 갖는 복수단계의 진탕배양을 실시하면 세포스페로이드의 구조를 여러겹의 층상형상으로 구축할 수 있다. 예를 들어, 무릎연골조직을 해부학적, 조직학적, 또는 발생학적인 관점에서 관찰하면, 표층부터 골수를 향해서 더 깊은쪽으로 가면서 무릎연골조직을 구성하는 연골세포의 형상이 변해간다. 이러한 형상이 상이한 연골세포들 사이에는 서로 그 성질 및 기능이 다르다. 이러한 층상구조 내에서 서로 상이한 세포로 세포스페로이드 구조물을 제조하는 함으로써 생체내의 환경과 아주 비슷한 미세환경을 생체외(in vitro)에서 구축하는 것이 가능하다. 이렇게 제조된 세포스페로이드를 이용하여 상기 시스템에 의한 화합물, 약제, 독성물질 등의 생리작용 및 독성을 평가함으로서 보다 정확한 평가 및 예측이 가능하게 된다.
세포이식체의 본래 갖고 있던 특정 기능을 더욱 증진되도록 하는 것은, 다수의 세포들의 집단을 신체외의 조건하에서 보존하게 되면, 일반적인 경우 중력에 의하여 이들 세포들의 집단은 세포들간의 상호접착이 느슨져서 본연의 기능을 읽어가게 되는데, 본 발명에의한 제조방법에서 제공하는 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양으로 세포들의 집단에 있어서 상호접착을 강화시켜서 각구성세포들과 커뮤니케이션 할 수 있는 긴밀히 접척이 가능하게 되고, 세포외기질의 생산을 촉진하기 때문에 결과적으로 본래 갖고 있던 특정기능을 증진시키게 된다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않으며, 하기 실시예의 단순한 변경, 치환 및 변형 등은 본 발명의 권리범위를 벗어날 수 없다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1
토끼 무릎관절 연골세포와 활막유래세포를 혼합한 혼합세포복합체에 의한 이식치료용 세포스페로이드의 제조 및 연골결손모델을 대상으로한 이식
1-A. 연골세포 및 활막유래세포의 분리 및 배양
토끼(Japanese White Rabbit, 1kg±200g, 암컷)로부터 무릎에서 부터 연골조직 및 활막조직을 채취해서 피부조직, 피하조직, 근육조직, 연골하골(subchondral bone), 인대, 반월판, 그 밖의 결합조직을 제거한 후, 통상 시판되는 50ml 용량의 원심용용기의 내부에 위치시킨 다음 수술용 곡가위를 이용하여 쵸핑하하여 잘게 조각내었다. 그리고, 1.25% 트립신(Invitrogen Co.) 및 0.5% 콜라게나제Ⅰ(collagenase class Ⅰ: Worthington, Biochemical Co.) 를 D-MEM/F-12배지(Gibco. Co.)에 1%의 항생제/항진균제 혼합물 (10,000units/ml의 페니실린G, 10,000㎍/ml의 스트렙토마이신, 25㎍/ml의 암포테리신, Gibco. Co.)로 조정된 배지에 용해시켜 1차소화효소 및 2차소화효소 용액을 준비하였다.
연골조직 및 활막조직은 상기의 각 소화용액에 처리하기 위하여, 무균적인 유리용기에 넣는 동시에 전자스테러용 무균자석바를 넣어준 후, 통상적인 세포배양용 인큐베이터 속에서 37℃, 5% CO2의 조건하에 전자스테러(모델명：Magnetic Stirrer RCN-3D、EYELA Co.)을 이용하여 60 rpm 으로 각반하면서 소화시킨다.
이때, 1차소화효소에 의한 1시간 처리, 및 2차소화효소에 의한 추가 3시간 처리하여, 연골세포 및 활막조직이 단일 세포로 분리되도록 하였다. 이러한 과정을 통하여 얻은 세포현탁액은 70㎛ 및 40㎛의 나일론제의 cell strainer(BD FalconTM:BD Biosciences)로 연속적으로 통과 시킨후 인산완충액에을 이용하여 2회 세정하였다.
이러한 과정을 통하여 얻은 단일 세포는 연골세포 및 활막유래세포의 개수를 증폭하기 위한 증식용 배지에 접종하여 배양하였다. 처음 배양 파종시 세포밀도는 연골세포의 경우 (2.0±0.4)×104/cm2로, 활막유래세포는 (1.0±0.4)×104/cm2로 하며, 이후 계대배양시의 경우 연골세포의 경우 세포 밀도는 (2.0±0.4)×104/cm2 로, 활막유래세포는 (1.0±0.4)×104/cm2 로 하였다. 그리고, D-MEM/F-12배지(Gibco. Co.)에 열에 의해 불활화 된 10%의 FBS, 1%의 항생제/항진균제 혼합물 (10,000units/ml의 페니실린G, 10,000㎍/ml의 스트렙토마이신, 25㎍/ml의 암포테리신, Gibco. Co.) 및 50㎍/ml의 아스코르브산으로 조정된 배지를 사용하였으며, 콘플루언시가 90%에 도달하였을 때 트립신-EDTA로 처리하여 증폭된 연골 세포와 활막유래세포를 배양접시로부터 떼어내었다.
12~13일간의 세포증폭을 위한 계대배양기간에 있어서 연골세포는 2회, 활막유래세포는 최대 4회까지 계대를 하여 최종적으로는 혼합세포복합체의 이식치료용 세포스페로이드를 제조하기 위한 세포재료로, 제3계대째의 연골세포와 제4~5계대째의 활막유래세포를 사용한다.
1-B. 단리 배양 연골세포 및 활막유래세포의 형광시약 테깅 (Tagging)
실시예 1-A를 통하여 회수한 각각의 단리 배양 연골세포 및 활막유래세포는, D-MEM/F-12배지(Gibco. Co.)에 1%의 항생제/항진균제 혼합물 (10,000units/ml의 페니실린G, 10,000㎍/ml의 스트렙토마이신, 25㎍/ml의 암포테리신, Gibco. Co.)로 조정된 배지에 재현탁시킨 후 원심(1,800 rpm/5min, 24℃)시킨 후, 연골세포 및 활막유래세포를 대상으로 각세포를 형광현미경 혹은 공초점 레이저 현미경하에서 경시적(經時的)으로 추적하기 위해 PKH염색키트(Sigma Co.)를 이용하여 형광시약 테깅할 준비를 하였다. 연골세포는 빨간색 형광테그(tag)인 MINI26을, 활막유래세포는 초록색 형광테그인 MINI67 kit(Fluorescent Cell Linker Mini Kit for General Cell)를 이용하여 본 시약의 프로토콜에 준하여 형광염색을 테깅하여, 연골세포 및 활막유래세포를 서로 비교할수 있도록하였다. 이 작업에 의하여 형광시약의 테깅된 연골세포 및 활막유래세포의 세포현탁액을 준비하였다.
1-C. 진탕배양에 의한 혼합세포복합체의 제조
실시예 1-A 및 실시예 1-B를 통하여, 적합한 회수의 계대작업 및 형광시약 테깅작업을 걸친 연골세포 및 활막유래세포의 세포현탁액을 D-MEM/F-12배지(Gibco. Co.)에 열에 의해 불활화 된 10%의 FBS, 1%의 항생제/항진균제 혼합물 (10,000units/ml의 페니실린G, 10,000㎍/ml의 스트렙토마이신, 25㎍/ml의 암포테리신, Gibco. Co.) 및 50㎍/ml의 아스코르브산으로 조정된 배지를 이용하여 5ml에 재현탁하고 연골세포 및 활막유래세포를 단독 혹은 연골세포와 활막유래세포를 동시에 정해진 비율(즉, ①100％활막유래세포.0%연골세포구성의 세포현탁액, ②75％활막유래세포.25%연골세포구성의 세포현탁액, ③50％활막유래세포.50%연골세포구성의 세포현탁액, ④25％활막유래세포.75%연골세포구성의 세포현탁액, ⑤0％활막유래세포.100%연골세포구성의 세포현탁액)로 단독 혹은 혼합세포제료현탁액으로 준비하였다. 배양 용기로는 60mm의 HydroCellTM 배양 접시(Cellseed. Co.)를 사용하여, 통상적인 세포배양용 인큐베이터 속에서 37℃, 5% CO2의 조건하에 진탕배양용 세이커(모델명; 더블세이커NR-3, TAITEK Co.)를 이용하여 평면원형 이동운동을 70rpm으로 부가하면서 1~5일간 배양했다. 계대배양기간과 진탕배양을 포함하는 이식치료용 세포스페로이드의 총 제조에 필요한 시간은 14일정도로 하였다. 여기에서는, 혼합세포복합체를 손상부위에 양호하게 고정하도록 시트상 구조물(연골세포시트)을 이용하여 보조적으로 이용한 양태를 예로 들어, 그 제조과정 스케쥴을 도5에 표시하였다.
배양기간 경과시간 마다 수득한 세포스페로이드를 위상차현비경하에서, 혹은 형광시약을 테깅한 연골세포 및 활막유래세포를 관찰시에 위상차현미경에 적당한 범위의 파장만을 선택적으로 통과시키는 필터를 부가하여 관찰한 후 그 결과를 각각 도6 및 도7에 나타내었다. 도6의 A는 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ②75％활막유래세포.25%연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 진탕배양개시 직후, B는 12시간 경과 후, C는 24시간 경과 후, D는 36시간 경과 후의 위상차현미경하에서 관찰한 결과를 각각 나타낸 것이다. 도7의 A는 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ④25％활막유래세포.75%연골세포구성의 세포현탁액를 대상으로 진탕배양직후 B는 12시간 경과 후, C는 24시간 경과 후, D는 36시간 경과 후의 위상차현미경에 적당한 범위의 파장만을 선택적으로 통과시키는 필터를 부가하여 관찰한 결과를 각각 나타낸 것이다.
또한, 진탕배양을 상기 연골세포 및 활막유래세포를 단독 혹은 연골세포와 활막유래세포를 동시에 정해진 비율 ⑤0％활막유래세포.100%연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 평면원형 또는 평면좌우형으로 이동운동을 부가하면서 진탕배양을 4일간 실시하고 그 결과를 도8A 및 도8B에 나타내었다. 도9는, 상기 각 ①～⑤까지의 비율의 조건으로 연골세포 및 활막유래세포의 세포현탁액을 상으로 진탕배양 개시 36시간 경과 후의 위상차현미경하에 적당한 범위의 파장만을 선택적으로 통과시키는 필터를 부가하여 관찰한 결과를 각각 나타낸 것이다.
공초점 레이저현미경하에서, 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ③50％활막유래세포.50%연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 진탕배양을 5일간 실시하고 그결과를 도10에 나타내었다.
이식치료용 세포스페로이드를 구성하는 각세포재료는 시간이 경과함에 따라, 인위적인 동작에 기인하는 지속적 반복운동에 의하여 발생된 배양액내의 흐름에 의하여 각각의 세포는 배양용기의 바닥에 정체하지 않으며 배양액중에서 뜨는 현탁상태를 진탕배양기간중에 유지되어 진탕배양 초기단계의 세포스페로이드로 만드어진 작은 크기의 혼합세포복합체를 중심으로 하여 다수의 다른 세포재료들이 신속하게 접착하게 되어, 이식치료용 세포스페로이드가 성장하였다. 이 기간중에, 혼합세포복합체는 진탕배양개시 12시간 경과 후부터 육안적으로 관찰이 가능하기 시작하여, 진탕배양의 전과정에 있어서 관찰 가능하였다. 이때 수득한 세포스페로이드의 육안적인 관찰소견의 결과를 도12에 나타내었다.
혼합세포복합체는 시간이 경과함에 따라, 윤곽이 점차 매끈하게 되는 것을 확인하였다. 배양개시 125시간 경과 후 위상차현미경하에서 관찰한 결과를 각각 도6 및 도7에 나타내었다.
크기가 작은 세포스페로이드의 경우는 직경이 250±100㎛정도, 크기가 큰 세포스페로이드의 경우에는 직경이 700±250㎛정도였다.
1-D. 병리조직학적 검사
실시예1-C 을 통하여 얻은 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ③50％활막유래세포.50%연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 진탕배양을 5일간 실시하고 세포스페로이드는 4%의 파라포름알데히드 용액으로 고정시키고 15% 수크로오스 용액, 30% 수크로오스 용액에 순차적으로 적응시킨 후 동결절편으로 만들고 이 절편을 잘라서 병리조직학적인 검사를 위하여 준비하였다. 상기 절편 상의 세포스페로이드는 3-amino-9-ethylcarbazole(AEC) substrate-chromogen solution(DAKO Japan Co., Ltd.)을 사용하여 avidin-biotin-peroxidase complex technique(LSAB 2 kit/HRP, DAKO JapanCo.,Ltd.)의 프로토콜을 따라서 콜라겐 유형 Ⅱ에 대한 면역조직화학 염색을 실시하였다. 검사결과를 도13에에 나타내었다. 그 결과, 진하게 염색된 콜라겐 유형 Ⅱ의 존재를 확인 할 수 있었으며, 이것은 염색된 부위의 세포 및 조직이 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 연골조직으로서 형질발현된 것을 의미한다.
1-E. 토끼 무릎 전층 손상 모델에 세포스페로이드의 이식
실시예1-C 을 통하여 얻은 연골세포 및 활막유래세포의 비율 ②75％활막유래세포.25%연골세포구성의 세포현탁액을 대상으로 진탕배양을 실시하여 수득한 세포스페로이드를 마이크로피펫을 이용하여, 토끼(Japanese White Rabbit, 3kg±500g, 암컷)의 슬개골 밑에 위치하는 대퇴골측의 무릎연골에 직경 5mm의 결손을 연골표층부터 연골하골까지 도달하는 전층 손상 모델을 만든 후 손상부위에 이동시켜 이식시켰다(도14A). 이식을 실시한 4주 후에 세포스페로이드를 수령한 토끼를 희생시켜 대퇴골을 회수하고 4%의 파라포름알데히드 용액으로 고정시키고, 탈회처리를 한 후 파라핀 절편으로 만들고 이 절편을 잘라서 병리조직학적인 검사를 위하여 준비하였다. 상기 절편 상의 세포스페로이드는 3-amino-9-ethylcarbazole(AEC) substrate-chromogen solution(DAKO Japan Co., Ltd.)을 사용하여 avidin-biotin-peroxidase complex technique(LSAB 2 kit/HRP, DAKO JapanCo.,Ltd.)의 프로토콜을 따라서 콜라겐 유형 Ⅱ에 대한 면역조직화학 염색을 실시하였다. 토끼의 슬개골 밑에 위치하는 대퇴골측의 무릎연골에 직경 5mm의 결손을 연골표층부터 연골하골까지 도달하는 전층 손상 모델을 만든 후 손상부위에 이동시켜 이식킨 후 육안적인 관찰소견의 결과를 도14A에 나타내었다. 또한, 병리조직학적인 검사를 도14B에에 나타내었다. 그 결과, 진하게 염색된 콜라겐 유형 Ⅱ의 존재를 확인 할 수 있었으며, 이것은 이식된 세포스페로이드가 신체내의 환경에서 이식4주후에 염색된 부위의 세포 및 조직이 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 연골조직으로서 형질발현된 것을 의미한다.
실시예 2
래트 췌도세포 유래의 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC)를 대상으로한 1차세포스페로이드의 제조
2-A. PEC의 분리 및 배양
래트(Brown Norway Rat 또는 Lewis Rat, 350±50g)로부터 췌장을 적출해서 Hanks' Balanced Salt Solutions(HBSS)(Gibco.Co.)에 10%의 FBS와 HEPES를 첨가한 용액에 콜라게나제 P(Roche. Co.)를 용해시켜 2㎎/㎖의 콜라게나제 P를 제조하고 이를 이용해서 소화시키고 Histopaque(Sigma Co.)를 이용하는 농도구배법에 의해 순화시키고 회수하였다.
이렇게 하여 분리된 췌도를 대상으로 5분정도의 짧은 시간동안 트립신/EDTA를 처리하여PEC로 단리한다. 이렇게 단리 된 PEC는 상기 실시예1의 1-A에서와 같은 방법으로 분리한 세포를 수적으로 증폭하기 위한 증식용 배지에 접종하여 배양한다. 증폭된PEC를 떼어내어 새로운 배지로 계대배양한다. 실시예1의 1-A에서 기술한 배지의 조성, 사용소화효소 및 배양접시의 종류, 처음 배양시 파종시 세포밀도 및 계대배양 파종시 세포밀도는 목표로 하는 용도에 따라 적절하게 변형하여 적용하였다.
2-B. 진탕배양에 의한 혼합세포복합체 (1차세포스페로이드) 의 제조
실시예 2-A를 통하여 얻은 각각의 단리 배양 PEC는 계대배양하여 회수하고 이렇게 회수된 PEC는 D-MEM/F-12배지(Gibco. Co.)에 열에 의해 불활화 된 10%의 FBS, 1%의 항생제/항진균제 혼합물 (10,000units/ml의 페니실린G, 10,000㎍/ml의 스트렙토마이신, 25㎍/ml의 암포테리신, Gibco. Co.) 및 50㎍/ml의 아스코르브산으로 조정된 배지를 이용하여 5ml에 재현탁하여 세포현탁액으로 준비한다. 배양 용기로는 60mm의 HydroCellTM 배양 접시(Cellseed. Co.)를 사용하여, 통상적인 세포배양용 인큐베이터 속에서 37℃, 5% CO2의 조건하에 진탕배양용 세이커(모델명; 더블세이커NR-3, TAITEK Co.)를 이용하여 평면원형 이동운동을 70rpm으로 부가하면서 1~5일간 배양했다.
이렇게 1차세포스페로이드를 구성하는 각세포재료는 시간이 경과함에 따라, 인위적인 동작에 기인하는 지속적 반복운동에 의하여 발생된 배양액내의 흐름에 의하여 각각의 세포는 배양용기의 바닥에 정체하지 않으며 배양액중에서 뜨는 현탁상태를 진탕배양기간중에 유지되어 진탕배양 초기단계의 세포스페로이드로 만드어진 작은 크기의 혼합세포복합체를 중심으로 하여 다수의 다른 세포재료들이 신속하게 접착하게 되어, 이식치료용 세포스페로이드가 성장하였다. 이 기간중에, 혼합세포복합체는 진탕배양개시 12시간 경과 후부터 육안적으로 관찰이 가능하기 시작하여, 진탕배양의 전과정에 있어서 관찰 가능하였다.
1차세포스페로이드는 시간이 경과함에 따라, 윤곽이 점차 매끈하게 되는 것을 확인하였다.
크기가 작은 세포스페로이드의 경우는 직경이 250±100㎛정도, 크기가 큰 세포스페로이드의 경우에는 직경이 700±250㎛정도였다.
2-C. 1차세포스페로이드의 이용
실시예 2-A와 2-B를 통하여 얻은PEC로 구성된1차세포스페로이드를 중심으로 다시 1종류 혹은 2종류이상의 세포를 배양액 내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료현탁액을 준비하여 2회이상의 진탕배양을 함으로써 상기1회째의 진탕배양의 결과산물인 1차세포스페로이드와 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체인 2차세포스페로이드로 새로운 혼합세포복합체를 제조하는2회 이상의 반복 실시하는 복수단계의 진탕배양 실시는데 이용하였다.
본 발명은 혼합세포복합체인 이식치료용 세포스페로이드는, 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들의 집합인 세포스페로이드 및 혼합세포복합체를 구성하는 각세포재료를 분리준비하고, 분리준비된 각세포를 계대배양하여 증폭한 후, 1종류 혹은 2종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하고 진탕배양(Shaking culture)함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조하여 세포이식치료를 위하여 제조된 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 이식세포치료용 스페로이드의 제조방법 및 이를 이용한 치료법과 화합물, 약제, 독성물질 등의 약효 및 독성의 생리작용 혹은 독성를 평가하기 위한 시스템으로, 상기 이식치료용 세포스페로이드를 구성하는 각세포재료는, 연골조직 및 골조직의 손상을 치료하기 위한 자가연골세포이식술에서 응용될 경우, 자가연골세포 또는 골세포 연골세포의 단독 사용 뿐 만 아니라 1종류 혹은 2종류이상의 높은 증식능을 갖으며, 연골조직으로의 용이한 분화능을 보유하는 각종 줄기세포 혹은 연골전구세포 등을 이용하는 것으로 연골양조직으로서 형질발현된 이식치료용 세포스페로이드의 대량의 준비가 가능하게 되어, 고령자에게 다발하는 광범위한 연골조직 및 골조직의 변성 또는 연골의 변성 및 연골조직의 손상이 연골하골까지 도달하지 않는 부분결손 등에 대한 치료기술의 확립이라는 면에서도 상당히 유용하게 된다.
또한, 이식치료용 세포스페로이드를 구성하는 각세포재료는 당뇨병 치료를 위한 췌도세포 혹은 췌도에서 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC), 혹은, 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 질환상태를 치료하기 위한 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포들로 대량 증식과정을 거친 후 이용함으로써 췌도조직 및 혈관조직으로의 형질발현된 이식치료용 세포스페로이드의 대량의 준비가 가능하게 되어, 임상췌도이식에 있어서 고질적인 장기부족에 의한 이식할 췌도의 공급이 절대적으로 부족한 실정에 대한 대안이 될수 있고, 특히, 이식치료용으로 단일세포로 구성된 세포현탁액이 아니고1종류 혹은 상호보안의 관계인2종류 이상의 3차원구조를 갖는 다수의 세포들의 집합인 세포스페로이드를 이용하게 됨으로써 본래 갖고 있던 특정 기능을 더욱 증진하게 되고 이식후 세포가 흩어져서 분포하지 않고 세포스페로이드의 구조안에서 각구성세포들과 커뮤니케이션 할 수 있는 긴밀히 접척이 가능한 면에서도 상당히 유용하게 된다. 그밖에 사용하는 세포의 특성에 따라 면역격리능 등의 새로운 기능을 보유 할수 도 있어 유용하게 된다.
본 발명은 상기 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법 그리고 이용방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
해당사항 없음

Claims (39)

  1. 혼합세포복합체가, 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현된 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들의 집합인 세포스페로이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혼합세포복합체는 이용 목적에 따라서 선택할 수 있는 각 해당 제공 조직 유래의 고유의 기능을 발휘하는 최종 분화단계의 성체세포, 상기 성체세포의 전구세포 및 아세포 및 미분화도가 높고 다능성(multi-potency) 및 고도의 증식능을 보이는 각종 조직 유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하여 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 용이한 분화능을 보유하여 손상환부에 이식하는 것으로 치료효과를 나타내므로써 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 1종류 혹은 2종류 이상의 세포로 구성된 다수의 세포들의 집합인 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 혼합세포복합체는, 자가, 동종 혹은 이종의 조직으로부터 유래된 세포 또는 이들 유래의 2종류이상의 세포들로 구성된 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
  4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합세포복합체는 크기가 10㎛ 내지 1,500㎛인 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
  5. 제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합세포복합체는 유전성 질환, 전염성 질환 및 퇴행성질환 등에 의하여 자기조직 재생치료능력의 항상성(Homeostasis)의 균형에 문제가 생김으로 자력으로는 치유에 이르지 못하는 즉, 정상에서 벗어난 질병상태에 있는, 일부 혹은 전부의 손상 또는 결손된 환부에 이식치료하기 위한 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
  6. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 정상에서 벗어난 질병상태는, 관절연골, 반월판, 추간판, 늑골연골, 비중격, 및 이개연골을 포함하는 연골조직의 일부 혹은 전부를 손상 혹은 결손된 환부로 인한 관절염, 관절증, 연골손상, 연골골손상, 반월판손상, 추간판변성 혹은 퇴행성관절염(Osteoarthritis, 변형성관절증), 또는 골조직의 일부를 손상 혹은 결손된 환부이고 이경우에 각 세포재료는 연골세포, 연골전구세포, 활막유래세포, 활막줄기세포, 골아세포, 골수유래세포, 각종조직유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 지방유래세포, 지방유래줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하고 연골세포로 용의한 분화능력을 보유한 세포등 으로 구성된 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
  7. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 정상에서 벗어난 질병상태는, 인슐린 의존성 제1형 당뇨병 혹은 인슐린 비의존성 당뇨병의 유형을 포함하는 췌도세포이식술이 치료법으로 사용될 수 있는 상태이고 이경우에 각 세포재료는 췌도세포 및 췌도에서 소정의 처리를 하여 단일 세포로 분리한 내분비세포(pancreatic endocrine cell; PEC), 및 탄성연골(이개연골) 세포를 제외한 그밖의 이식물을 수령할 개체 유래의 관절연골, 반월판, 추간판, 늑골연골, 비중격 등의 각종 연골조직으로 부터 분리한 연골세포, 각종조직유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 지방유래세포, 지방유래줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종 분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하고 췌도세포로 용의한 분화능력을 보유한 세포등 으로 구성된 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
  8. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 정상에서 벗어난 질병상태는, 각종 심혈관계 질환 및 말초 혈관계의 부전에 의한 실질조직의 불완전한 질환상태로서, 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포 등의 동원(recruit) 혹은 이러한 세포들의 세포이식술에 의해 이식 후 심장근육세포를 대신할 조직으로 혹은 혈관신생(Neoangiogenesis)의 유도가 치료법으로 사용될 수 있는 상태이고 이경우에 각 세포재료는 혈관내피세포, 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC) , 내피줄기세포 및 심장근육세포 및 근육세포, 각종조직유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 지방유래세포, 지방유래줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하고 혈관세포로 용의한 분화능력을 보유한 세포등 으로 구성된 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
  9. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합세포복합체는, 인간을 제외한 각종의 동물에 대하여 세포이식체로서 사용함으로서 치료용으로 이용하는 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
  10. 제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합세포복합체는, 치료용의 목적과는 별도로 화합물, 약제, 독성물질 등의 피검물질의 약효 및 독성의 생리작용 혹은 독성를 평가하기 위한 시스템으로 이용하는 것이 가능한 것을 특징으로 하는 세포스페로이드.
  11. (1) 혼합세포복합체를 구성하는 각 세포재료를 분리준비하는 단계；(2) 상기분리된 세포를 계대배양하여 증폭하는 단계；(3) 1종류 혹은 2종류이상의 세포를 배양액내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료혼탁액을 준비하고 세포를 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양을 함으로써 세포재료들을 상호접착시켜 혼합세포복합체를 제조하는 단계；및 (4) 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계를 포함한 이식치료용 세포 스페로이드의 제조방법.
  12. 제11항의 단계 (1)에 있어서,
    상기 분리준비되는 세포는, 각 해당 제공 조직 유래의 고유의 기능을 발휘하는 최종 분화단계의 성체세포, 상기 성체세포의 전구세포 및 아세포 및 미분화도가 높고 다능성(multi-potency) 및 고도의 증식능을 보이는 각종 조직 유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 1종류 혹은 2종류 이상의 세포인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  13. 제11항 또는 제12항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (1)의 대상조직을 쵸핑하여 분쇄한 후 단백질 분해효소를 처리하여 세포를 단리 하는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 대상조직은, 오목한 모양의 밑바닥이 있으며 쵸핑시 대상조직이 위치된 수용기재로부터 비산되어 이탈하는 것이 방지될 수 있는 정도의 측면부 길이를 갖는 용기속의 바닥에 위치시킨 후 상기용기의 측면부 장축의 길이보다 긴 수술용 곡가위를 이용하여 쵸핑하는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  15. 제13항 또는 제14항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상조직은, 단백분해효소를 처리 시 37℃, 5% CO2의 조건하에 전자스테러(Magnetic Stirrer)을 이용하여 각반하면서 소화시키는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  16. 제11항의 단계 (2)에 있어서,
    세포가 연골세포 및 연골전구세포인경우 계대배양의 회수는 3회이하로 제한하는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  17. 제11항의 단계 (3)에 있어서,
    세포를 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양은, 인위적인 동작에 기인하는 지속적 반복운동에 의하여 발생된 배양액내의 흐름에 의하여 각각의 세포는 배양용기의 바닥에 정체하지 않으며 배양액중에서 뜨는 현탁상태를 진탕배양 기간중에 유지할수 있는 진탕배양(Shaking culture)인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 진탕배양은, 1일 내지 7일 동안 진행하는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  19. 제17항 또는 제18항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 진탕배양은, 세포재료현탁액의 세포밀도가 1 × 104/ml 내지 3,000 × 104/ml인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  20. 제11항, 제17항 또는 제19항중 어느 한 항에 있어서
    상기 세포재료현탁액은, 상기 진탕배양시 세포재료들간의 상호 양호한 접착, 세포스페로이드형성효율 향상 및 이식에 적합한 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질발현의 강화 등에 의한 치료효과의 극대화를 위한 1종류 혹은 2종류이상의 마이크로케리어(micro-carrier)를 함유한 것을 된 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 마이크로케리어는, 상기세포재료현탁액중의 세포들의 상호접착을 촉진시키기 위한 분자로서, 각각의 세포와 상기 마이크로케리어 간에 있어서 상호 양호한 접착성을 부여하는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  22. 제11항, 제17항 또는 제19항중 어느 한 항에 있어서
    단계 (3)의 세포를 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양은, 1회 혹은 2회이상 반복실시하는 복수단계의 진탕배양을 하여 1회째의 진탕배양의 결과산물인 1차세포스페로이드를 중심으로 다시 1종류 혹은 2종류이상의 세포를 배양액 내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료현탁액을 준비하여 2회이상의 진탕배양을 함으로써 상기1회째의 진탕배양의 결과산물인 1차세포스페로이드와 세포재료들을 상호접착시킨 혼합세포복합체인 2차세포스페로이드로 새로운 혼합세포복합체를 제조하는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  23. 제11항의 단계 (4)에 있어서,
    상기 각각의 목적별 사용방법은,
    제 5항 내지 제 10항중 어느 한 항에 있어서 기재된, 이식을 통한 치유를 위한 치료, 동물에 대하여 세포이식체로서 사용하는 것 및 피검물질의 약효 및 독성을 평가하기 위한 시스템을 포함하며 이것들과는 별도로 세포이식체의 본래 갖고 있던 특정 기능을 더욱 증진되도록 하는 것, 혹은, 이식시 환자에게 유발되는 면역거부반응을 회피하기 위한 것 임을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  24. 제23항에 있어서,
    세포이식체의 본래 갖고 있던 특정 기능을 더욱 증진되도록 하는 것은, 제 11항 내지 제24항중 어느 한 항의 기재되어 있는 제조방법에 의한 고밀도의 부유상태로 유지시키는 배양으로 세포들의 집단에 있어서 상호접착을 강화시키기고 세포외기질의 생산을 촉진시켜 본래 갖고 있던 특정기능을 증진시키게 되는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  25. 제9항 ,제23항 또는 제 24항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포이식체는, 제11항 내지 제24항중 어느 한 항에 기재되어 있는 제조방법에 의하여 수득한 세포스페로이드 또는 신체내 정상적 혹은 건강한 상태의 개체로부터 유래한 이식하고자 하는 장기 또는 조직을 잘게 절단하여 수득한 마이크로 단위의 다수의 세포들의 집합 혹은 절편인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  26. 제23항에 있어서,
    이식시 환자에게 유발되는 면역거부반응을 회피하기 위한 목적을 달성하기 위해서는, 상기 제 9항, 제 23항 내지 제25항중 어느 한 항에 기재어 있는 세포이식체를 제22항의1차세포스페로이드처럼 적용하여, 이들을 중심으로 다시 연골조직 등처럼 면역거부반응을 유발시키기 어려운 낮은 면역원성을 보이는 면역특권(immune-privilege)을 보유하는 조직으로 부터 유래하는 1종류 혹은 2종류이상의 세포를 배양액 내에서 단독 혹은 혼합한 세포재료현탁액을 준비하여 1회 더 진탕배양을 함으로써 세포스페로이드가 세포이식체를 면역격리시키기 위한 세포재료들을 상호접착시킨 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 연골조직은, 탄성연골인 이개연골을 제외한 그밖의 관절연골, 반월판, 추간판, 늑골연골, 비중격 등의 이식물을 수령할 개체 유래인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 연골조직은, 이식물을 수령할 개체 유래의 탄성연골인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  29. 제11항 내지 제28항중 어느 한 항에 있어서,
    제11항의 단계 (4)의 제조된 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계는 혼합세포복합체가 통과 가능한 마이크로피펫의 팁 혹은 주사용바늘을 이용하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동하는 과정에 있어서 내시경하 혹은 관절경하에 수술이 가능한 형태로 준비된 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  30. 제16항에 있어서,、
    상기 제조된 세포스페로이드를 이동하는 단계는, 제20항 또는 제21항중 어느 한 항에 기재되어 있는 마이크로케리어를 추가적으로 이용하는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  31. 제20항 ,제21항 또는 제30항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마이크로케리어는, 콜라겐, 콜라겐유도체, 히알루론산, 히알루론산유도체, 루브리신(Lubricin), 뮤신(Mucin), 키토산, 키토산유도체, 폴리로타키산, 폴리로타키산유도체, 키틴, 키틴유도체, 우레탄, 셀룰로스, 아가로스, 젤라틴, 피브리오넥틴, 피브린, 다혈소판혈장, 헤파린, 헤파린유도체, 후라그민(Fragmin, 일반명：[Dalteparin sodium]), 유산프로타민(Protamine sulfate), Avidin, Streptavidin, Biotin, 라미닌(Laminin), 2-Octyl Cyanoacryleate、알길산칼슘, 폴리유산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐알콜, 폴리프로필렌, 폴리글리콜산, 폴리카프로락탐, 폴리유산폴리글리콜산공중합체, 폴리유산폴리카프로탁탐공중합체 및 폴리글리콜산폴리카프로락탐공중합체으로 만들어진 군으로 부터 선택한 1종류 혹은 2종류이상의 생체친화성 재료 또는 생체흡수성 재료로 형성된 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  32. 제5항, 제7항, 제8항, 제9항 또는 제11항 내지 제31항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이식은, 제1항 내지 제31항중 어느 한 항에 기재되어 있는 혼합세포복합체인 이식치료용 세포스페로이드의 세포성분, 상기 세포스페로이드의 구성세포로부터 분비된 분자 및 생산된 세포외기질, 상기 이식치료용 세포스페로이드의 제조과정에 있어서 사용한 배양액 및 세포현탁액, 마이크로케리어 함유액 또는 운반용 용액을 단독 혹은 동시에 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 것을 특징으로 하는 이식치료용 스페로이드의 제조방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 운반용 용액은, 제1항 내지 제32항중 어느 한 항에 기재되어 있는 이식치료용 세포스페로이드의 제조과정에 있어서 사용한 배양액 및 세포현탁액, 마이크로케리어 함유액 또는 각종 완충 액, 생리식염수 등의 체액에 유사한 조성인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 운반용용액을 통상적인 동결건조법 및 멸균 처리하여 얻어진 분말상의 물질에는 상기운반용용액 중에 존재하는 치료에 유효하고 유용한 성분이 함유되어 있으며, 활용가능한 용매에 상기 동결건조법 및 멸균 처리하여 얻어진 분말상의 물질을 용해시켜 목적달성을 위한 적절한 농도로 조절한 뒤 이용함으로써, 각종 치료, 재생, 건강증진의 목적으로 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  35. 제5항, 제7항, 제8항, 제9항 또는 제11항 내지 제34항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이식은, 제2항 기재의 이용 목적에 따라서 선택할 수 있는 각 해당 제공 조직 유래의 고유의 기능을 발휘하는 최종 분화단계의 성체세포, 상기 성체세포의 전구세포 및 아세포 및 미분화도가 높고 다능성(multi-potency) 및 고도의 증식능을 보이는 각종 조직 유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하여 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 용이한 분화능을 보유하여 손상환부에 이식하는 것으로 치료효과를 나타내므로써 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는1종류 혹은 2종류 이상의 세포를 일정기간 배양하여 시트상(sheet-like) 형태로 상기세포와 세포외기질로 구성된 배양세포시트 단독 혹은 상기 배양세포시트와 같이 콜라겐, 콜라겐유도체, 히알루론산, 히알루론산유도체, 루브리신(Lubricin), 뮤신(Mucin), 키토산, 키토산유도체, 폴리로타키산, 폴리로타키산유도체, 키틴, 키틴유도체, 우레탄, 셀룰로스, 아가로스, 젤라틴, 피브리오넥틴, 피브린, 다혈소판혈장, 헤파린, 헤파린유도체, 후라그민(Fragmin, 일반명：[Dalteparin sodium]), 유산프로타민(Protamine sulfate), Avidin, Streptavidin, Biotin, 라미닌(Laminin), 2-Octyl Cyanoacryleate、알길산칼슘, 폴리유산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐알콜, 폴리프로필렌, 폴리글리콜산, 폴리카프로락탐, 폴리유산폴리글리콜산공중합체, 폴리유산폴리카프로탁탐공중합체 및 폴리글리콜산폴리카프로락탐공중합체으로 만들어진 군으로 부터 선택한 1종류 혹은 2종류이상의 생체친화성 재료 또는 생체흡수성 재료인 인공바이오매터리얼로 형성된 시트상구조물 및 다양한 모양의 구조물을 보조적으로 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시킬 때 상기 소정의 장소에 대하여 피복 혹은 충진하는 것이 가능한 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  36. 제1항 내지 제35항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이식치료용 세포스페로이드의 제조기간은, 14일이내인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조과정.
  37. 제11항, 제17항, 제22항, 제26항, 제32항 또는제 33항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양액은, 연골분화유도배지인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조과정.
  38. 제11항 내지 제37항중 어느 한 항에 있어서,
    제11항의 단계 (4)의 제조된 세포스페로이드를 분리하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동시키는 단계는 혼합세포복합체가 통과 가능한 마이크로피펫의 팁 혹은 주사용바늘을 이용하여 각각의 목적별 사용방법에 따른 소정의 장소로 이동하는 과정에 있어서 내시경하 혹은 관절경하에 수술이 가능한 형태로 준비된 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조방법.
  39. 제5항의 단계 (1)에 있어서,
    상기 각세포재료는, 제2항 기재의 이용 목적에 따라서 선택할 수 있는 각 해당 제공 조직 유래의 고유의 기능을 발휘하는 최종 분화단계의 성체세포, 상기 성체세포의 전구세포 및 아세포 및 미분화도가 높고 다능성(multi-potency) 및 고도의 증식능을 보이는 각종 조직 유래의 성체줄기세포 혹은 간엽계줄기세포, 배아줄기세포(ES 세포), 각종분화세포를 초기화시킨 유도다기능성줄기세포(iPS 세포) 등과 같이 ES 세포와 유사한 다기능성 및 증식능력을 보유하여 신체내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 용이한 분화능을 보유하여 손상환부에 이식하는 것으로 치료효과를 나타내므로써 신체내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는1종류 혹은 2종류 이상의 세포를 분리하여 목적으로 한 세포로 분화시킨 후 얻은 세포인 것을 특징으로 하는 이식치료용 세포스페로이드의 제조과정.
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