JP2002537849A - 脂肪由来の幹細胞および格子 - Google Patents

脂肪由来の幹細胞および格子

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(57)【要約】 本発明は脂肪由来の幹細胞および格子を提供する。一態様では、本発明は脂肪細胞および赤血球を実質上含まない脂肪由来幹細胞ならびに結合組織幹細胞のクローン集団を提供する。該細胞は単独でもしくは生物学的に適合した組成物内で、分化した組織および構造をつくり出すために、インビボおよびインビトロの両方で用いることができる。さらに、ホルモンを産生させるために、そして他の細胞の集団の増殖および拡大をサポートするための条件培養培地を提供するために、該細胞を拡大し、そして培養することができる。別の態様では、本発明は、細胞を実質上含まない、脂肪組織由来の細胞外マトリックス材料を含む脂肪由来の格子を提供する。該格子は、インビボであろうとインビトロであろうと、原基またはいっそう成熟した組織もしくは構造への細胞の増殖および分化を容易にするための基質として使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） 近年、主として骨髄から得られる間葉性幹細胞の同定は組織再生および分化に
おける進歩を導いてきた。そのような細胞は骨髄および骨膜で発見された多分化
能性細胞であり、そしてそれらは種々の間葉性組織または結合組織に分化するこ
とができる。例えば、そのような骨髄由来幹細胞は５−アザシチジンのような薬
剤に曝露することで筋細胞へ発達を誘導することができる(Wakitaniら, Muscle
Nerve, 18(12), 1417-26 (1995))。そのような細胞は軟骨、脂肪、および骨のよ
うな組織の修復に有用であること(例えば、米国特許 5,908,784号、5,906,934号
、5,827,740号、5,827,735号参照)、およびそれらはまた遺伝子の修飾による適
用を有することが示唆されてきた(例えば5,591,625号参照)。そのような細胞の
同定が組織再生および分化における進歩を導いてきたが、そのような細胞の使用
はいくつかの技術的障害によって妨げられている。そのような細胞の使用に対す
る一つの障害は、それらが非常にまれで（1/2,000,000細胞くらいの少なさに相
当する）、それらを得るためのおよび単離するためのいかなる方法も困難でかつ
多大な費用を要するということである。勿論、骨髄採取は一般的にドナーに痛み
を伴う。さらに、特に選別されたロットの血清を使用して、そのような幹細胞の
使用にさらにコストと労力を加えなければ、そのような細胞は分化を誘導するこ
となく培養することが困難である。従って、より容易に入手可能な、多分化能性
幹細胞、特に培養材料を費用をかけて前もって選別する必要なく培養することが
できる細胞の供給源が必要である。
【０００２】 組織工学における他の進歩は、細胞が、三次元構造を生み出すために特別に定
義づけられた(defined)培養中で増殖されうることを示した。空間的広がりのあ
る定義づけは典型的には、細胞の増殖および分化をサポートしかつ誘導するため
の種々の無細胞の格子またはマトリックスを使用することで達成される。この技
術はいまだその初期段階であるが、動物モデルにおける実験では、組織全体を再
生するために種々の無細胞の格子材料を用いることができるということが実証さ
れている(例えばProbstら, BJU Int., 85(3), 362-7 (2000) 参照)。適当な格子
材料は、腫瘍細胞系から単離される分泌型の細胞外マトリックス材料(例えば En
gelbreth-Holm-Swarm腫瘍分泌マトリックス−「マトリゲル(matrigel)」)である
。この材料はIV型コラーゲンおよび増殖因子を含み、かつ細胞増殖のための優れ
た基質を提供する(例えばVukicevicら, Exp. Cell Res, 202(1), 1-8 (1992)参
照)。しかし、この材料はまたある種の細胞の悪性変異を促進するので (例えばF
ridmanら, Int. J. Cancer, 51(5), 740-44 (1992)参照)、それは臨床応用に適当でない。
他の人工の格子が開発されてきたが、インビボで使用した場合これらが細胞に対
してかあるいは患者に対して毒性であるということが判明しうる。従って、細胞
の集団を培養しおよび増殖させる際に基質として使用するのに適当な格子材料が
依然として必要である。
【０００３】 （本発明の要旨） 本発明は脂肪由来幹細胞および格子を提供する。一態様では、本発明は脂肪細
胞および赤血球を実質上含まない脂肪由来幹細胞ならびに結合組織幹細胞のクロ
ーン集団を提供する。該細胞は単独でもしくは生物学的に適合した組成物内で、
分化した組織および構造をつくり出すために、インビボおよびインビトロの両方
で用いることができる。さらに、ホルモンを産生させるために、そして他の細胞
の集団の増殖および拡大をサポートするための条件培養培地を提供するために、
該細胞を拡大し、そして培養することができる。別の態様では、本発明は、細胞
を実質上含まない、脂肪組織由来の細胞外マトリックス材料を含む脂肪由来の格
子を提供する。該格子は、インビボであろうとインビトロであろうと、原基また
はいっそう成熟した組織もしくは構造への細胞の増殖および分化を容易にするた
めの基質として使用することができる。
【０００４】 どれくらい多くの脂肪組織が存在するのか考えてみると、本発明の細胞および
格子は多分化能性幹細胞の容易な供給源となる。さらに、該細胞は血清のロット
を前もって選別する必要のない培養条件下、未分化の状態で培養中継代すること
ができるので、本発明の細胞は、他の型の幹細胞より相当少ない費用で維持する
ことができる。これらのおよび他の本発明の利点およびさらなる本発明の特徴は
、添付図面からおよび以下の詳細な説明中で明らかになるだろう。
【０００５】 （発明の詳細な説明） 本発明のある一態様は脂肪由来幹細胞に関する。好ましくは、該幹細胞は、他
の細胞型（例えば、脂肪細胞、赤血球、他のストロマ細胞等）、および細胞外マ
トリックス材料を実質上含まず、そして更に好ましくは、該幹細胞はそのような
他の細胞型およびマトリックス材料を全く含まない。好ましくは、本発明の細胞
は、霊長類、さらに好ましくはより高度な霊長類（例えばヒヒまたは猿）の脂肪
組織から得られる。典型的には、本発明の細胞は、本明細書に記載されるような
方法を使用して、ヒト脂肪組織から得られるだろう。
【０００６】 本発明の細胞は組織工学における使用のためのいかなる型の幹細胞であっても
よいが、望ましくは該細胞は中胚葉由来である。典型的には、そのような細胞は
単離すると、２以上の中胚葉のまたは間葉性の発生上の表現型を有する(すなわ
ち、それらは多分化能性である)。特に、そのような細胞は概して中胚葉組織(例
えば、成熟脂肪組織、骨、心臓の種々の組織（例えば、心膜、心外膜、心筋外膜
、心筋、心膜、弁組織等）、皮膚結合組織、血管組織(hemangial tissue)(例え
ば、血球、心内膜、血管上皮組織等)、筋組織(骨格筋、心筋、平滑筋等が挙げら
れる)、泌尿性器組織(例えば、腎、前腎、後腎の導管および中腎の導管、後腎の
憩室、尿管、腎臓の腎盂、集合管、女性の生殖構造の上皮(特に卵管、子宮、お
よび膣))、胸膜組織および腹膜組織、内臓、中胚葉腺組織(例えば、副腎皮質組
織)、ならびにストロマ組織(例えば、骨髄))を発生する能力を有する。勿論、該
細胞は成熟細胞に進化する能力を有しうるので、適切な前駆細胞 (例えば、前脂
肪細胞、前筋細胞、前骨細胞等)に分化することによって、それはまたそれの発
生上の表現型能を実現することができる。また、培養条件次第では、該細胞はま
た発生上の表現型(例えば、胚性の、胎児性の(fetal)、造血性(hematopoetic)の
、神経原性の、または神経痛原性(neuralgiagenic)の発生上の表現型)を表しう
る。この点で、本発明の細胞は２以上の発生上の表現型(例えば、脂肪形成性、
軟骨原性、心臓原性、皮膚原性、造血性、血管原性、筋原性、腎原性、神経原性
、神経痛原性、尿生殖器原性、骨原性、心膜原性、腹膜原性、胸膜原性、内臓原
性(splanchogenic)、およびストロマ性の発生上の表現型)を有しうる。そのよう
な細胞はこれらの発生上の表現型のうち２以上を有しうるが、好ましくは、その
ような細胞はそのような発生上の表現型を３以上(例えば、４以上の中胚葉性の
または間葉性の発生上の表現型)を有し、本発明の幹細胞のうちいくつかのタイ
プは、分化の過程を通じて任意の中胚葉の表現型を獲得する能力を有する。
【０００７】 本発明の幹細胞は任意の適当な方法によって脂肪組織から得ることができる。
そのような方法のいずれにおいても最初の工程は、供給源動物からの脂肪組織の
単離を必要とする。該動物内の脂肪ストロマ細胞が生存できる限り、その動物は
生きていても死んでいてもよい。典型的には、ヒト脂肪ストロマ細胞は、外科の
または吸引の脂肪組織切除術のようなよく知られているプロトコルを用いて、生
きているドナーから得られる。事実、脂肪吸引方法は非常によく知られているの
で、脂肪吸引の溶出液は本発明の細胞が得られうる特に好ましい供給源である。
【０００８】 どのようにして得られるとしても、該脂肪組織は材料の残留物から幹細胞を単
離するために処理される。あるプロトコルでは、該脂肪組織を生理学的に適合し
た食塩溶液(例えば、リン酸緩衝食塩水(PBS))で洗浄し、かつその後強く撹拌し
、そして置いて沈殿させる、脂肪組織から遊離した成分(例えば、損傷を受けた
組織、血液、赤血球等)を除く工程。従って、一般に洗浄および沈殿の工程は上
澄み液が比較的デブリスの無い状態になるまで繰り返される。
【０００９】 残留している細胞は概して種々の大きさの塊で存在するだろうし、そして該プ
ロトコルは細胞自身への損傷を最小化すると同時にその大きな構造を分解するた
めに測定される工程を使用して進行する。この目的を達成する方法の一つは、洗
浄した細胞塊を、細胞間の結合を弱めるかまたは破壊する酵素(例えば、コラゲ
ナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン等)で処理することである。そのような酵素
処理の量および期間は、用いられる条件に応じて変化するだろうが、そのような
酵素の使用は一般的に技術上公知である。そのような酵素処理のかわりになるも
のとしてまたはそのような酵素処理と共同して、該細胞塊を他の処理（例えば、
機械撹拌、音波エネルギー、熱エネルギー等）を使用して分解することができる
。もし分解が酵素による方法で達成されるならば、細胞に対する有害な影響を最
小限におさえるために、適当な期間後酵素を中和することが望ましい。
【００１０】 該分解工程は、典型的には凝集した細胞（一般的にリポソーム）のスラリーま
たは懸濁液、および一般的に遊離のストロマ細胞(例えば、赤血球、平滑筋細胞
、内皮細胞、線維芽細胞、および幹細胞)を含む液体分画を生産する。該分離工
程の次段階は、凝集した細胞をストロマ細胞から分離することである。これは、
ストロマ細胞を上澄み液でカバーされたペレットにする遠心分離によって達成さ
れうる。上澄み液はその後捨てることができ、かつペレットは生理学的に適合し
た液体中に懸濁する。さらに、懸濁した細胞には典型的には赤血球が含まれ、ほ
とんどのプロトコルにおいてはこれらを溶解することが望ましい。選択的に赤血
球を溶解させるための方法は技術上公知であり、任意の適当なプロトコルを用い
ることができる(例えば、高張のまたは低張の培地中でのインキュベーション)。
勿論、もし赤血球を溶解するのであれば、残りの細胞はその後溶解産物から、例
えば濾過または遠心分離によって、単離されるべきである。勿論、赤血球を溶解
するかどうかに関わらず、懸濁した細胞を、１以上の連続した回数洗浄し、再遠
心分離し、そして再懸濁してより高い純度を達成することができる。かわりに、
該細胞をセルソーターを用いて、あるいは細胞の大きさや粒度を基にして分離す
ることができる、幹細胞は比較的小さく無顆粒である。テロメラーゼの発現はま
た幹細胞特異的なマーカーとして働きうる。それらはまた、例えばパンニングま
たは磁気ビーズを使用することによって、免疫組織学的に分離することができる
。本発明の細胞を単離するためのいかなる工程および方法も、所望すれば、手動
で実施することができる。あるいは、そのような細胞を単離する工程は、その多
くが技術上公知である(例えば、米国特許5,786,207号参照)適当な装置によって
容易となりうる。
【００１１】 最終の単離および再懸濁に続いて、該細胞を培養し、所望すれば、収率を決定
するために数および生存度を分析してもよい。望ましくは、細胞を、標準的な細
胞培養培地(例えば、典型的には5-15%(例えば、10%)血清(例えば、ウシ胎仔血清
、ウマ血清等)を補ったDMEM)を使用して、分化させることなく培養されうる。好
ましくは、細胞は、それらの発生上の表現型を依然として保有しながら、そのよ
うな培地中で分化することなく少なくとも５回継代することができ、更に好まし
くは、細胞は発生上の表現型を失うことなく少なくとも10回(例えば、少なくと
も15回またはさらには少なくとも20回)継代されうる。従って、通常間葉性幹細
胞(例えば、骨髄由来)の場合、分化を誘導することなく本発明の細胞を培養する
ということは、特に選別されたロットの血清を用いることなく達成することがで
きる。生存度および 収率を測定する方法は、技術上公知である(例えば、トリパ
ンブルー排除能)。
【００１２】 単離に続いて、該幹細胞は、２以上の前述の発生上の表現型を有するそれらの
細胞を同定するために、表現型の同定によって更に単離される。典型的には、該
ストロマ細胞は、望ましい密度(例えば、約100細胞/cm2〜約100,000細胞/cm2の
間(例えば、約500細胞/cm2〜約50,000細胞/cm2の間、または、より具体的には約
1,000細胞/cm2 〜約20,000細胞/cm2の間))でプレーティングされる。もしそれよ
り低い密度(例えば、約300細胞/cm2)でプレーティングされた場合、細胞は、い
っそう容易にクローン単離することができる。例えば、数日後、そのような密度
でプレーティングされた細胞は、集団へと増殖するだろう。
【００１３】 所望すれば、細胞集団をクローニングするのに適当な方法を使用して、そのよ
うな細胞および集団をクローン性増殖させることができる。例えば、増殖した細
胞の集団を物理的にひろい別個のプレート(もしくはマルチウェルプレートのウ
ェル)に播種してもよい。あるいは、該細胞は、各々のウェルに一つの細胞を置
く(例えば、約0.1〜約1細胞/ウェルまたはさらには約0.25〜約0.5細胞/ウェル、
例えば0.5細胞/ウェル)ことを容易にするために統計に基づく比でマルチウェル
プレート上でサブクローニングしてもよい。勿論、該細胞は低い密度で(例えば
、ペトリ皿または他の適当な基質の中で)それらをプレーティングすることによ
って、またクローニングリングなどの装置を使用して他の細胞からそれらを単離
することによってクローニングすることができる。あるいは、放射線源が入手可
能な場所では、細胞を単層に増殖させることおよび、その後に単層内の一つを遮
へいし残りの細胞に放射線を照射することによってクローンを得ることができる
。生き残っている細胞がその後クローン集団へと増殖するだろう。クローン集団
の生成は任意の適当な培養培地中で拡大されうるが、幹細胞(例えば、本発明の
幹細胞または他の幹細胞)をクローニングするための好ましい培養条件は、F12培
地＋20%血清(好ましくはウシ胎仔血清)を約２／３と約１／３の、ストロマ細胞(
例えば、脂肪吸引液の間質性血管分画から得られる細胞)で条件付けられた(cond
itioned)標準培地である（相対的な割合は容積測定で決定される）。
【００１４】 いずれにしても、クローンであろうとなかろうと、単離された細胞は、それら
の発生上の表現型が決定されうる適当な時点まで培養されうる。前述のように、
本発明の細胞は、前述の発生上の表現型のうち少なくとも２つを有する。従って
、得られたクローンから取り出された１以上の細胞を、それがそのような発生の
能力を有するかどうかを確認するために処理してもよい。処理の一つの型は、分
化するための個々のタイプの成熟細胞(またはそれらの前駆細胞)に曝露されるこ
とによって条件付けられた培養培地中で本発明の細胞を培養することである(例
えば、筋細胞に曝露されることによって条件付けられた培地は筋原性分化を誘導
することができる、心臓弁細胞に曝露されることによって条件付けられた培地は
心臓弁組織への分化を誘導することができる等)。勿論、分化を引き起こすため
定義づけられた培地もまた使用することができる。例えば、脂肪原性の発生上の
表現型は、例えば、糖質コルチコイド(例えば、イソブチル−メチルキサンチン
、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン等)、インスリン、細胞内のc
AMPレベルを上昇させる化合物(例えば、ジブチリル−cAMP、8−CPT−cAMP(8-(4)
クロロフェニルチオ)−アデノシン3',5'サイクリック１リン酸;8−ブロモ−cAMP
;ジオクタノイル−cAMP、フォルスコリン等)、および／またはcAMPの分解を阻害
する化合物(例えばメチルイソブチルキサンチン、テオフィリン、カフェイン、
インドメタシン、などのようなホスホジエステラーゼ阻害剤)を含む、脂肪生成
を促進する培地に該細胞を曝露することによって評価することができる。従って
、約10-9M〜約10-6M(例えば、約1μM)のデキサメタゾンと組み合わせて約1μMと
約10μMの間のインスリンに幹細胞を曝露することは脂肪細胞分化を誘導するこ
とができる。そのような培地はまた、所望すれば、インドメタシン(例えば、約1
00μM〜約200μM)のような他の薬剤を含むことができ、かつ好ましくは該培地は
血清を含まない。骨原性の発生上の表現型は、約10μM〜約50μMのアスコルビン
酸−2−リン酸および約10nMと約50nMの間のβ−グリセロリン酸と組み合わせて
約10-7Mと約10-9Mの間のデキサメタゾン(例えば、約1μM)に該細胞を曝露するこ
とで評価することができ、かつ該培地はまた血清(例えば、ウシ血清、ウマ血清
等)を含有することができる。筋原性分化は、好ましくは血清の豊富な培地(例え
ば、約10%と約20%の間の血清(ウシ、ウマ、かそれらの混合物か)を含む)中で、
約10μMと約 100μMの間のヒドロコルチゾンに該細胞を曝露することによって誘
導されうる。軟骨原性分化は、約1μM〜約10μMの間のインスリンおよび約1μM
〜約10μMの間のトランスフェリン、約1ng/mlと10ng/mlの間のトランスフォーミ
ング増殖因子(TGF)β1、ならびに約10nMと約50nMの間のアスコルビン酸−2−リ
ン酸(50nM)に該細胞を曝露することによって誘導されうる。軟骨原性分化のため
には、好ましくは該細胞は高密度(例えば、約数百万細胞/mlでまたは微小集積培
養(micromass culture)技術を使用して)で、かつまた少量の血清(例えば約1%〜
約5%)の存在下培養される。該細胞はまた、発生上より未発達の表現型(例えば、
胎児性のまたは胚性の表現型)を呈するように誘導されうる。そのような誘導は
胎児および胚の中の条件によく似た条件に本発明の細胞を曝露することによって
達成される。例えば、本発明の細胞または集団は胎児もしくは胚から単離された
細胞と、または胎児血清の存在下、共培養してもよい。このような方針に沿って
、該細胞は、個々のタイプの成熟細胞あるいはそれらの前駆細胞と共培養するこ
とで前述の任意の中胚葉系列への分化を誘導されうる。従って、例えば、筋原性
分化は、本発明の細胞を筋細胞または前駆細胞と共培養することで誘導すること
ができ、かつ同様の結果は本明細書に記載される他の組織型についても達成され
うる。分化を誘導する他の方法は技術上公知であり、それらの多くは適切に用い
られうる。
【００１５】 分化誘導培地中で適当な期間(例えば、数日から１週間以上)細胞を培養した後
、実際それらが分化して所定の細胞タイプの物理的特質を得たかどうかを決定す
るために該細胞を分析することができる。分化そのものの測定の一つにテロメア
長がある−未分化の幹細胞は分化した細胞より長いテロメアを有する。従って該
細胞はテロメラーゼ活性のレベルで評価することができる。あるいは、細胞から
RNAまたは蛋白を抽出し、所望の表現型を表示するマーカーの存在について分析
することができる(ノーザンハイブリダイゼーション、rtPCR、ウェスタンブロッ
ト分析等を用いて)。勿論、組織特異的な染料を用いて該細胞を免疫組織化学的
に分析する、または染色することができる。従って、例えば、脂肪原性の分化を
評価するために、脂肪特異的な染料(例えば、オイルレッドＯ、サファリンレッ
ド、スダンブラック等)で該細胞を染色することができ、あるいは脂肪関連因子(
例えば、IV型コラーゲン、PPAR−γ、アジプシン、リポプロテインリパーゼ等)
の存在を評価するために該細胞について精査することができる。同様に、骨生成
は骨特異的な染料(例えば、アルカリホスファターゼ、フォン・コッサ(von Koss
a)等)で細胞を染色することによって評価することができ、または骨特異的なマ
ーカー(例えば、オステオカルシン、オステオネクチン、オステオポンチン、I型
コラーゲン、骨誘導蛋白質、cbfa等)の存在について精査することができる。筋
発生は、古典的な形態学的変化(例えば、多核細胞、シンシチウム形成等)を同定
することで評価することができ、または筋特異的な因子(例えば、myo D、ミオシ
ン重鎖、NCAM等)の存在で生化学的に評価することができる。軟骨原性は、軟骨(
cartallge)特異的な染料(例えば、アルシアンブルー(alcian blue))を用いて細
胞を染色することによって、または軟骨特異的な分子(例えば、培地中の硫酸グ
リコサミノグリカン類およびプロテオグリカン類(例えば、ケラチン、コンドロ
イチン等)、II型コラーゲン等)の発現／生成について精査することによって測定
することができる。発生上の表現型を評価する他の方法は技術上公知であり、そ
れらのうちいかなるものも適切である。例えば、大きさおよび粒度によって該細
胞を選別することができる。また、該細胞はモノクローナル抗体を生み出すため
に使用することができ、ついでそれらが選択的に所定の細胞タイプに結合するか
どうかを評価するのに使用することができる。抗原性の相関は、所定の発生上の
経路に従って幹細胞が分化したことを確認することができる。
【００１６】 該細胞は単独でかつ他の細胞から単離されていてもよいが、好ましくはそれは
細胞の集団内にあり、そして本発明は本発明の細胞を包含する定義づけられた集
団を提供する。いくつかの具体例においては、該集団は異種(heterogeneous)で
ある。すなわち、例えば、該集団は本発明の細胞に因子を供給するための支持細
胞(support cell)を含むことができる。勿論、本発明の幹細胞はそれ自身他の型
の細胞(例えば、他の型の幹細胞、例えば、神経幹細胞(NSC)、造血幹細胞(HPC、
特にCD34+幹細胞)、胚幹細胞(ESC)およびそれらの混合物)を培養するための支持
細胞として働くことができ、かつ該集団はそのような細胞を含むことができる。
他の具体例においては、集団は実質上同種(homogeneous)であり、本発明の脂肪
由来幹細胞から本質的になる。
【００１７】 本発明の細胞はクローン化されうるので、それらを含む実質上同種な集団はク
ローンでありうる。事実、本発明はまた、中胚葉幹細胞、結合組織幹細胞、また
はそれらの混合物から本質的になる任意の定義づけられたクローンの細胞集団に
関する。この具体例においては、細胞は脂肪由来であってもよく、あるいは他の
中胚葉もしくは結合細胞組織(例えば、骨髄、筋等)から技術上公知の方法を使用
して得ることができる。単離後、本明細書に記載されるように細胞をクローン性
に増殖させることができる。
【００１８】 本発明の細胞(および細胞集団)は、種々の目的のために使用されうる。前述さ
れたように、該細胞は他のタイプの細胞の増殖および拡大をサポートすることが
でき、かつ本発明はこれを達成する方法に関する。一態様では、本発明は本発明
の幹細胞を用いて培養培地を条件付ける方法ならびにそのような方法で生産され
た条件培地(conditioned medium)に関する。細胞がそれを条件付けるのに十分な
条件下で細胞に所望の培養培地を曝露することによって培地は条件付けられる。
典型的には、培地は、ホルモン、細胞マトリックス材料、および他の因子を培地
中へ分泌する本発明の細胞の増殖をサポートするために使用される。適当な期間
(例えば、１日または数日)の後に、分泌された因子を含む培養培地は、細胞から
単離され、将来の使用のために保存することができる。勿論、本発明の細胞およ
び集団は、所望すれば培地を条件付けるために連続して再使用されうる。他の応
用(例えば、本発明の細胞を他のタイプの細胞と共培養するため)において、細胞
は条件培地の中に維持することができる。従って、所望すれば、本発明はこの方
法を用いて得られる本発明の細胞を含むかあるいは本発明の細胞を実質上含まな
い、条件培地を提供する。
【００１９】 該条件培地は、所望の細胞タイプの増殖および拡大をサポートするために使用
することができ、そして本発明は条件培地を使用して細胞(特に幹細胞)を培養す
る方法を提供する。該方法は、細胞がかわらず生存できるままである条件下、条
件培地中で所望の細胞を維持することを含む。細胞は、技術上公知であるような
、それらを培養するための任意の適当な条件下で維持されうる。望ましくは、該
方法は細胞有糸分裂の連続ラウンドが拡大した集団を形成することを可能にする
。正確な条件(例えば、温度、CO2レベル、撹拌、抗生物質の存在等)は培地の他
の成分および細胞タイプによるであろう。しかし、これらのパラメータを最適化
することは当業者の範囲内である。いくつかの具体例においては、培地は、本明
細書に記載されたように培地を条件付けるために使用される脂肪由来の細胞を実
質上含まないことが望ましい。しかし、他の具体例においては、脂肪由来の細胞
を条件培地中に保持することおよび目的の細胞と共培養することが望ましい。事
実、本発明の脂肪由来の細胞は細胞内伝達の細胞表面メディエーター(mediator)
を発現することができるので、本発明の細胞および所望の他の細胞を２つのタイ
プの細胞が接触する条件下で共培養することがしばしば望ましい。これは、例え
ば、細胞の異種集団として該細胞を適当な培養基質上に播種することによって達
成されうる。あるいは、本発明の脂肪由来細胞は最初コンフルエンスにまで増殖
し、第２の所望の細胞が条件培地中で培養されるための基質として働くであろう
。
【００２０】 他の具体例においては、本発明の脂肪由来の細胞は、例えば、外因性の遺伝子
を発現するかあるいは内因性の遺伝子の発現を抑制するために遺伝子学的に変更
されていてもよく、そして本発明はそのような細胞および集団を遺伝子学的に変
更する方法を提供する。この方法に従って、細胞を導入遺伝子を包含する核酸を
含む遺伝子導入ベクターに曝露し、そうして導入遺伝子が細胞内で発現されるの
に適切な条件下で核酸が細胞内に導入される。導入遺伝子は通常適当なプロモー
ターに機能的に連結したコードポリヌクレオチドを包含する発現カセットである
。該コードポリヌクレオチドは蛋白をコードすることができ、またはそれは生物
学的に活性なRNA(例えば、アンチセンスRNAまたはリボザイム)をコードすること
ができる。従って、例えば、コードポリヌクレオチドは毒素に対する抵抗性を与
える遺伝子、ホルモン(例えば、ペプチド増殖ホルモン、ホルモン放出因子、性
ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、サイトカイン(例えば、インターフェロン(in
terferin)、インターロイキン、リンフォカイン)等)、細胞表面結合性の細胞内
のシグナル伝達部分(例えば、細胞接着分子、ホルモン受容体等)、所定の分化系
列を促進する因子等をコードすることができる。勿論、所定の導入遺伝子を送達
するための遺伝子導入技術を用いることが望まれる場合、それの配列は公知であ
ろう。
【００２１】 発現カセット内で、該コードポリヌクレオチドは適当なプロモーターに機能的
に連結されている。適当なプロモーターの例として原核生物のプロモーターおよ
びウイルスのプロモーター(例えば、レトロウイルスのITRs、LTRs、例えばヘル
ペスウイルスIEp(例えば、ICP4-IEpおよびICP0-IEp)、サイトメガロウイルス(CM
V)IEpなどの前初期ウイルスのプロモーター(IEp)、および例えばラウス肉腫ウイ
ルス(RSV)プロモーター、およびマウス白血病ウイルス(MLV)プロモーターなどの
他のウイルスのプロモーター)が挙げられる。他の適当なプロモーターは、例え
ばエンハンサー(例えば、ウサギβ−グロビン調節領域)、構成的に活性なプロモ
ーター(例えば、β−アクチンプロモーター等)、シグナル特異的プロモーター(
例えば、RU486応答性プロモーター等の誘導プロモーター)、および組織特異的な
プロモーターなどの真核細胞のプロモーターである。あらかじめ規定された細胞
のコンテクスト中で遺伝子発現を駆動させるために適当なプロモーターを選択す
ることは十分に熟練の範囲内である。該発現カセットは１以上のコードポリヌク
レオチドを含めることができ、かつそれは、望まれるように、他の領域(例えば
、ポリアデニル化配列、膜挿入シグナルまたは分泌リーダーをコードしている配
列、リボソームエントリー配列、転写調節領域(例えば、エンハンサー、サイレ
ンサー等)等) を含んでいてもよい。
【００２２】 導入遺伝子を含む該発現カセットは導入遺伝子を細胞に送達するのに適当な遺
伝子ベクターに組み込まれるべきである。所望の目的とする応用によって、任意
のそのようなベクターを、細胞を遺伝子学的に変更するためにそんなふうに使用
することができる(例えば、プラスミド、裸のDNA、アデノウイルス、アデノ随伴
ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、パピローマウイルス、レトロウ
イルス等のウイルス)。そのようなベクター内の望ましい発現カセットを構成す
る方法のいずれもが使用することができ、その多くは技術上公知である(例えば
、直接クローニング、相同的組換え等)。勿論、ベクターの選択は主として細胞
にベクターを導入するために使用される方法(例えば、プロトプラスト融合、カ
ルシウム−リン酸沈降、遺伝子銃、電気穿孔、ウィルスベクターによる感染等に
よって)を決定するだろうし、それは通常技術上公知である。
【００２３】 遺伝子学的に変更された細胞を導入遺伝子の生成物を生産するためのバイオリ
アクターとして用いることができる。他の具体例においては、遺伝子学的に変更
された細胞を導入遺伝子およびその産物を動物に送達するために用いることがで
きる。例えば、該細胞は、いったん遺伝子学的に変更されていると、導入遺伝子
がインビボで発現されるのに十分な条件下で動物に導入されうる。
【００２４】 遺伝子変更のための有用な標的として働くことに加えて、本発明の多くの細胞
および集団は、ホルモン(例えば、サイトカイン、ペプチドまたは他の増殖因子(
例えばモノブチリン(monobutyrin))等)を分泌する。最初の単離でそのようなホ
ルモンを自然に分泌する細胞もあれば、本明細書に記載されているように、ホル
モンを分泌するために遺伝子学的に変更されうる細胞もある。ホルモンを分泌す
る本発明の細胞はインビボおよびインビトロで種々のコンテクスト中で使用され
うる。例えば、そのような細胞を所定のホルモンの容易な供給源を提供するバイ
オリアクターとして用いることができ、かつ本発明はそのような細胞からホルモ
ンを得る方法に関する。該方法に従って、細胞はそれらがホルモンを培養培地中
に分泌するのに適当な条件下で培養される。適当な時間の後に、かつ好ましくは
定期的に、培地を採取し、培地からホルモンを単離するために処理される。いか
なる標準的方法(例えば、ゲルクロマトグラフィーまたはアフィニティークロマ
トグラフィー、透析、凍結乾燥等)も培地からホルモンを精製するために使用さ
れることができ、その多くは技術上公知である。
【００２５】 他の具体例においては、ホルモンを分泌する本発明の細胞(および集団)は治療
薬として用いることができる。概して、そのような方法は所望の組織に該細胞を
インビトロ(例えば、体内移植または組織移植に優先する移植片として)かあるい
はインビボ（動物組織に直接）のどちらかで導入することを含む。細胞は所望の
組織に任意の方法により適切に導入されうるが、その方法は通常組織の型に従っ
て変わるであろう。例えば、細胞を含む培養培地に移植片をつけること(または
それを注入すること)によって、細胞は移植片に導入されうる。あるいは、該細
胞は集団を樹立するために組織内の所望の部位上に播種してもよい。細胞は、例
えば、カテーテル、トロカール、カニューレ、ステント(細胞と一緒に播種され
うる)等の装置を用いてインビボで部位に導入されうる。これらの応用のために
、好ましくは、細胞はサイトカインまたは成長ホルモン(例えば、ヒト成長因子
、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、インスリン様増殖因子、造血幹細胞増殖
因子、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子ファミリ
ーのメンバー、血管および 内皮の細胞成長因子、TGFbファミリーのメンバー(骨
誘導因子を包含する)、または先天性疾患に特異的な酵素(例えば、ジストロフィ
ン))を分泌する細胞である。
【００２６】 一つの応用において、本発明はそのような細胞を使用して患者の傷のふさがり
を促進する方法を提供する。該方法に従って、細胞がホルモンを産生するのに十
分な条件下、ホルモンを分泌する本発明の細胞を傷の近傍に移す。傷の近傍での
該ホルモンの存在は傷のふさがりを促進する。該方法は外側の(例えば表面)傷と
内部の傷の両方のふさがりを促進する。本発明の方法がふさがりを促進するのに
有用である傷は、擦り傷、剥離、吹き傷(blowing wound)、火傷、挫傷、銃創、
切り傷、開放創、貫通創、穿孔創、刺切創、串線創、刺創、手術創、皮下創傷、
または擦過創が挙げられるが、これらに限定されない。該方法は傷の完全な治癒
およびふさがりを達成する必要はなく、該方法が傷のふさがりをある程度促進す
れば十分である。この点で、該方法は、単独でまたは傷ついた組織を治すための
他の方法に添える方法として用いられうる。
【００２７】 本発明の細胞が血管新生ホルモン(例えば、血管増殖因子、血管および内皮細
胞増殖因子等)を分泌する場合、それら(およびそれらを含む集団)を組織内の血
管新生を誘導するために用いることができる。つまり、本発明はそのような細胞
を用いて組織内の血管新生を促進する方法を提供する。この方法に従って、該細
胞は細胞が血管新生ホルモンを生み出すのに十分な条件下、所望の組織に導入さ
れる。組織内部のホルモンの存在は組織内部での血管新生を促進する。
【００２８】 本発明の幹細胞は発生上の表現型を有するので、それらは組織工学で用いられ
うる。この点で、本発明は、本発明の細胞が増殖し、そして分化して所望する素
材を形成するのに十分な条件下で細胞を維持することを含む動物素材を生産する
方法を提供する。該素材は、成熟組織、あるいは器官全体さえも包含することが
できる（本発明の細胞が本明細書に記載されているように分化しうるタイプの組
織を含む）。典型的には、そのような素材は、脂肪、軟骨、心臓、皮膚結合組織
、血液組織、筋、腎、骨、胸膜組織、内臓組織、血管組織等を含むだろう。さら
に典型的には、該素材はこれらの組織型の組み合わせ(すなわち１以上の組織型)
を含むだろう。例えば、素材は動物器官(例えば、心臓、腎)または四肢(例えば
、脚、翼、腕、手、足等)の全てまたは一部を含むことができる。勿論、細胞は
分裂および分化してそのような構造を生み出すことができるかぎり、それらはま
たそのような構造の原基を形成することもできる。初期段階において、そのよう
な原基は所望の成熟構造または器官の将来の発生のために冷凍保存されうる。
【００２９】 そのような構造を生み出すために、本発明の細胞および集団はそれらが増殖し
、分裂して所望の構造を形成するのに適当な条件下で維持される。いくつかの応
用においては、このことは動物に該細胞を移す(すなわちインビボ)、典型的には
新しい素材を所望の部位に移すことで達成される。従って、例えば、本発明は該
細胞が組織(例えば、骨、筋、軟骨、腱、脂肪等)に移植された動物においてその
ような組織の再生を促進することができる。他の具体例、および特に原基をつく
り出すための具体例においては、該細胞はインビトロで組織への分化および拡大
を誘導されうる。そのような応用において、細胞は組織発生を促す三次元構造の
形成を容易にする基質上で培養される。従って、例えば、細胞は生体適合性格子
(例えば、細胞外マトリックス材料、合成ポリマー、サイトカイン、増殖因子を
含む格子等)上で培養することができ、または播種することができる。そのよう
な格子は組織型への発生を容易にするために所望される形状に成型されうる。ま
た、少なくともそのような培養の間の初期の段階では、培地および／または基質
は、適切な組織型および構造の発生を容易にする因子(例えば、増殖因子、サイ
トカイン、細胞外マトリックス材料等)で満たされている。事実、いくつかの具
体例においては、本明細書に記載されているように、細胞をそれぞれの組織型の
成熟細胞またはそれらの前駆細胞と共培養すること、あるいは細胞を各々の条件
培地に曝露することが望ましい。
【００３０】 そのような動物素材および組織を生産するための本発明の脂肪由来細胞および
集団の使用を容易にするために、本発明は本発明の細胞(および集団)ならびに生
物学的に適合した格子を含む組成物を提供する。典型的には、該格子は典型的に
は約100μmと約300μmの間のオーダーで空間を有するメッシュまたはスポンジの
状態で繊維を有するポリマー材料から形成される。そのような構造は細胞が成長
し増殖するのに十分な領域を提供する。望ましくは、該格子は時のたつのにつれ
生物分解性で、その結果発生するにつれてその動物素材に吸収されるであろう。
従って、適当なポリマーの格子はモノマー(例えば、グリコール酸、乳酸、フマ
ル酸プロピル、カプロラクトン、ヒアルロナン(hyaluronan)、ヒアルロン酸等)
から形成されうる。他の格子は蛋白質、多糖類、ポリヒドロキシ酸、ポリオルト
エステル、ポリ無水物(polyanhydride)、ポリホスファゼン(polyphosphazene)、
または合成ポリマー(特に生物分解性のポリマー)を含むことができる。勿論、そ
のような格子を形成するのに適当なポリマーは１以上のモノマー(例えば、既述
のモノマーの組み合わせ)を含むことができる。また、該格子はまた、所望であ
れば、ホルモン(例えば増殖因子、サイトカイン、およびモルフォゲン(例えば、
レチノイン酸、アラキドン酸(aracadonic acid)等)、所望の細胞外マトリックス
分子(例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン等)、または他の材料(
例えば、DNA、ウイルス、他の細胞型等)を含むことができる。
【００３１】 該組成物を形成するために、細胞はそれらが格子内部の空間に入り込むように
格子の中へ導入される。例えば、マトリックスは細胞を含む溶液または懸濁液中
に浸してもよく、またはそれらをマトリックス中に染みこませもしくは注入して
もよい。特に好ましい組成物はポリマーを含む懸濁液を架橋することによって形
成され、かつまたその中に分散された本発明の細胞を有するヒドロゲルである。
この形成方法は細胞が格子の至る所に拡散することを許容し、細胞で格子を更に
いっそう満たすことを容易にする。勿論、該組成物はまた、所望の表現型の成熟
細胞またはそれらの前駆細胞を含むことができ、特に格子内部で、本発明の幹細
胞が適切に分化することを誘導することを促進する(例えば、格子内部でそのよ
うな細胞を共培養する効果として)。
【００３２】 該組成物は望ましい組織型、構造、または原基の増殖および発生を促進する任
意の適当な方法で用いられうる。例えば、該組成物は三次元的または定位的(ste
rotactic)モデリング技術を用いて構築されうる。従って、例えば、組成物内部
の層またはドメインは骨原性分化の用意ができている細胞によって占められてい
てもよく、そして組成物内部の他の層またはドメインは筋原性および／または軟
骨原性の発生の用意ができている細胞に占められていてもよい。そのようなドメ
インを互いに並ばせることは複合組織型(例えば、四肢で見られるような筋に囲
まれた骨)を含む複雑な構造の成形および分化を容易にする。所望の構造の増殖
および分化に導くために、適切であれば該組成物はバイオリアクターまたはイン
キュベーター内で、エクスビボ(ex vivo)で培養してもよい。他の具体例におい
ては、その構造は宿主動物内組織または構造を増殖させることが望ましい部位に
いつでも直接移植される。さらに別の具体例では、該組成物は、使用できるよう
になるまで増殖しおよび成熟するであろう宿主(典型的には動物 (例えば、ブタ
、ヒヒ等))に移植されうる。その後、該成熟構造(または原基)は宿主から切除さ
れそして適切であれば、宿主に移植される。
【００３３】 該組成物への含有が適当な格子は、任意の適当な供給源(例えば、マトリゲル)
から得ることができ、および適当な格子の商業的供給源が存在する(例えば、適
当なポリグリコール酸はEthicon N.J.などの供給源から得ることができる)。他
の適当な格子は脂肪組織の無細胞部分−すなわち細胞を実質上含まない脂肪組織
細胞外のマトリックス素材から得ることができ、そして本発明はそのような脂肪
由来の格子を提供する。典型的には、そのような脂肪由来の格子は、細胞増殖の
ための優れた基質として働く蛋白(例えばプロテオグリカン、糖蛋白、ヒアルロ
ニン(hyaluronin)、フィブロネクチン、コラーゲン(I型、II型、III型、IV型、V
型、VI型等)等)を含む。そのうえ、そのような脂肪由来の格子はマトリックス中
に播種された細胞の増殖を促進するホルモン、好ましくはサイトカインおよび増
殖因子を含むことができる。
【００３４】 脂肪由来のマトリックスは、無細胞分画に存在するであろうものを除き、上記
と同様にして脂肪組織から単離することができる。例えば、脂肪組織またはそれ
らの誘導体(例えば、上記のように遠心分離の結果生じる細胞分画)を、音波また
は熱エネルギーに曝露しうる、および／またはマトリックス材料を回収するため
に酵素処理することができる。また、望ましくは脂肪組織の細胞分画は、例えば
リパーゼ、界面活性剤、プロテアーゼでそれを処理することによって、および／
または機械のもしくは音波の破砕(例えば、ホモジナイザーもしくはソニケータ
ーの使用)によって単離される。どのように単離されたとしても、該材料は初期
に粘性のある材料として確認されるが、所望すれば、所望の目的とする使用次第
で続けて処理してもよい。例えば、未加工のマトリックス材料を、所望の格子材
料を生産するために処理してもよい(例えば、透析されてもよいしあるいはプロ
テアーゼもしくは酸で処理されてもよい等)。従って格子は水和された形で調製
されてもよく、または実質上無水の形もしくは粉体に乾燥されもしくは凍結乾燥
されていてもよい。その後、該粉体は、例えばそれを適当な細胞培養培地中に懸
濁することによって、細胞培養基質として使用するために再水和してもよい。こ
の点で、脂肪由来の格子は上記されたような他の適当な格子材料と混合されうる
。勿論、本発明は脂肪由来の格子および細胞または細胞の集団(例えば、本発明
の脂肪由来の細胞および他の細胞等(特に他の型の幹細胞))を含む組成物に関す
る。
【００３５】 上述されたように、本発明の細胞、集団、格子、および組成物は組織工学およ
び組織再生に使用されうる。従って、本発明はこれらの本発明の特徴のいずれを
も包括する移植可能な構造(すなわち移植片)に関する。移植片の正確な性質はそ
れが置かれた使用方法に従って変化するであろう。該移植片は、上記されたよう
に、成熟組織であるか、もしくはそれを含むことができ、またはそれは未成熟な
組織または格子を含むことができる。従って、例えば、移植片の一つの型は骨原
性分化を受けている(または用意のできている)本発明の細胞の集団を含む骨移植
片であってもよく、上述のように、適当な大きさおよび体積の格子内部に任意に
播種される。そのような移植片は患者内の成熟した骨組織の発生または再生を促
すために宿主内に注入されうるかあるいは移植されうる。同様の移植片が患者内
部の筋、脂肪、軟骨、腱等の成長または再生を促すために使用されうる。他の型
の移植片は、いったん患者に移植されると、適切な構造へ発達するであろう肢芽
、指芽、発生中の腎等の原基(本明細書に記載されているような)である。
【００３６】 脂肪由来の格子は、細胞培養キットの一部として都合よく使用することができ
る。従って、本発明は、本発明の脂肪由来の格子および１以上の他の構成要素(
例えば、水和剤(例えば、水、生理学的に適合した食塩水、調製された細胞培養
培地、血清またはそれらの誘導体等)、細胞培養基質(例えば、培養ディッシュ、
プレート、バイアル等)、細胞培養培地(液状であろうと粉体状であろうと)、抗
生物質、ホルモン等)を含むキットを提供する。該キットは任意のそのような成
分を含むことができるが、適切な組み合わせの際には所望の細胞型の培養および
増殖をサポートするのに必要な全ての成分を含めることが好ましい。勿論、所望
であれば、該キットはまた、本明細書に記載されているように格子の中へ播種さ
れることができる細胞(典型的には冷凍された)を含むことができる。
【００３７】 本発明の態様の多くは組織増殖および分化に関するが、本発明は同様に他の応
用も有する。例えば、脂肪由来の格子は、例えば組織増殖および分化のために改
良された格子および基質を開発中に実験試薬として使用されうる。脂肪由来の格
子はまた、例えばしわ、傷痕、皮膚の陥没等を隠すためまたは組織増加のため、
美容的に用いられうる。そのような応用のためには、好ましくは該格子は単位投
与形態にフォルム化されまたパッケージ化される。所望であれば、担体(例えば
、グリセリンまたはアルコールのような溶媒)、香料、抗生物質、着色剤、およ
び化粧品中で通例用いられる他の成分と混合されうる。該基質をまた、自家移植
的にあるいは同種移植として用いることができ、そしてそれは傷の治癒を促進す
るための軟膏または包帯剤として使用することができ、また内部に含めることが
できる。該脂肪由来の細胞はまた実験試薬として使用されうる。例えば、それら
は分化における初期の事象を招く薬剤の発見を容易にするために用いることがで
きる。例えば、本発明の細胞を、特定の系統の分化誘導用の培地に曝露すること
ができ、ついで遺伝子の弁別的な発現が分析される(例えば、ランダムプライム
ド(random-primed)PCRまたは電気泳動または蛋白またはRNA等によって)。
【００３８】 本発明の幹細胞または脂肪由来の格子を単離するための任意の工程について、
本発明は脂肪組織からそのような試薬を単離するためのキットを提供する。該キ
ットは患者から脂肪組織を単離するための手段(例えば、カニューレ、針、吸引
器等)およびストロマ細胞を単離するための手段(例えば、本明細書に記載されて
いる方法によって)を含むことができる。該キットは、例えばその後に適切であ
れば同一個体から再導入されることができる幹細胞の臨床供給源として用いるこ
とができる。つまり、該キットは、同じ方法であっても、所望の組織型の再生長
を要する患者に移植するための脂肪由来幹細胞の単離を容易にすることができる
。この点で、該キットはまた、本明細書に記載されているような細胞に分化する
ための培地を含んでいてもよい。適切には、該細胞は、必要とされるような患者
内部でそれらが分化するようにする培地に曝露することができる。勿論、該キッ
トはインビトロでの操作(例えば、本明細書に記載されているようにクローニン
グすることまたは分化させること)のための幹細胞の都合のよい供給源として用
いることができる(can me used)。他の具体例においては、該キットは、本明細
書に記載されているように脂肪由来の格子を単離するために用いることができる
。
【００３９】
【実施例】
当業者は前述の詳細な説明を読めば本発明を十分に実施可能であるが、以下の
実施例は本発明の特徴のいくつかを明らかにするのに役立つであろう。特に、そ
れらは、成熟細胞を実質上含まないヒト脂肪由来幹細胞の単離、そのような細胞
のクローン集団の単離、そのような細胞がインビボおよびインビトロで分化しう
ること、およびそのような細胞が他のタイプの幹細胞の増殖をサポートしうるこ
とを実証する。本実施例はまた、細胞培養のための適当な基質として働くことが
できる細胞を実質上含まない脂肪由来の格子の単離を実証する。勿論、これらの
実施例は単に例示的な目的で示されているので、それらは本発明の範囲を限定的
に解釈するために使用されるべきではなく、むしろ全体として前述の本発明の説
明をさらに詳述するものとして理解されるべきである。
【００４０】 これらの実施例中で用いられる方法、例えば、手術法、細胞培養、酵素的消化
、組織学、ならびに蛋白およびポリヌクレオチドの分子的解析は当業者に周知で
ある。そのような理由から、および簡潔を期すために、実験の詳細は詳しく述べ
ない。
【００４１】 （実施例１） 本実施例は成熟脂肪細胞を実質上含まないヒト脂肪由来幹細胞の単離を実証す
る。
【００４２】 未精製の脂肪吸引液は待機手術を受ける患者から取得した。脂肪吸引処置の前
に、血液による吸引液の汚染を最小化するために該患者にエピネフリンを投与し
た。該吸引液を濾して結合した脂肪組織片を結合した液体不要物から単離した。
単離した組織を中性のリン酸緩衝食塩水で徹底的にすすいだ後、0.075%(w/v)コ
ラゲナーゼで３７℃、約２０分間断続的に撹拌しながら酵素的に解離した。消化
に続いて、コラゲナーゼを中和して、スラリーを約260gで約10分間遠心分離する
と、多層の上澄み液と細胞のペレットとを生じた。上澄み液を除いてさらなる使
用のために保管し、ペレットは赤血球溶解溶液中に再懸濁して約２５℃で約１０
分間撹拌せずにインキュベートした。インキュベーションの後、培地を中和し、
細胞を約250gで約10分間再び遠心分離した。２度目の遠心分離に続いて、細胞を
懸濁し、生存度(トリパンブルー排除能を用いて)および細胞数を調べた。その後
、細胞を約1x106細胞/100mmディッシュの密度でプレーティングした。それらをD
MEM＋ウシ胎仔血清(約10%)中３７℃、約5%CO2中で培養した。
【００４３】 細胞の大部分は付着性で、小さく、単核で、比較的無顆粒の線維芽細胞様の細
胞であり、目に見える脂肪滴を含まなかった。大部分の細胞はオイルレッドＯお
よびフォン・コッサで陰性に染色された。細胞はまた、HeLa細胞およびHN-12細
胞を陽性のコントロールとして用いて、テロメラーゼ(市販のTRAP分析キットを
使用)の発現についても調べられた。ヒト陰茎包皮線維芽細胞およびHN-12の加熱
細胞抽出液を陰性のコントロールとして使用した。テロメリック(telomeric)生
成物を12.5%ポリアクリルアミドゲル(cells)上で分離し、シグナルをホスホイメ
ージングによって決定した。テロメラーゼ活性を表しているテロメリックラダー
は、脂肪由来幹細胞において陽性のコントロールと同程度に観察された。陰性の
コントロールではラダーは観察されなかった。
【００４４】 従って、これらの細胞は筋細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、または血液細
胞と同定できなかった。これらの結果は、以前にヒト幹細胞で報告されたのと同
様に脂肪由来の細胞がテロメラーゼ活性を発現することを実証する。
【００４５】 次いで、これらの細胞の部分集団を以下の培地に曝露しそれらの発生上の表現
型を評価した:
【００４６】
【表１】
【００４７】 集団を軟骨発生培地中で数週間高密度培養した。組織培養およびパラフィン切
片の組織学的分析は２、７、１４日目にH&E、アルシアンブルー、トルデンブル
ー(toludene blue)、およびゴルドナーのトリクローム染色にて実施した。免疫
組織化学をコンドロイチン-4-硫酸およびケラチン硫酸およびII型コラーゲンに
対する抗体を使用して実施した。染色しているマトリックスの定性的評価もまた
実施された。その結果、軟骨膜細胞の明確な境界を有する軟骨球状結節は、初期
処理後４８時間程度の早さで形成されることが示された。未処理のコントロール
細胞は軟骨原性分化の徴候を示さなかった。これらの結果は幹細胞が軟骨原性の
発生上の表現型を有することを裏付けている。
【００４８】 集団はコンフルエントに近い状態まで培養した後、脂肪生成培地に数週間曝露
した。プレーティングから２週間後、および４週間後に、オイルレッドＯ染色後
の相対不透明度の比色測定により集団を試験した。脂肪生成は２週間目に進行中
であり、４週間目ではかなり進行していることが確認された(相対不透明度はそ
れぞれ1および5.3)。骨髄由来の幹細胞を陽性のコントロールとして用いたとこ
ろ、これらの細胞はわずかに小さな脂肪分化能を示した(相対密度はそれぞれ0.7
および2.8)。
【００４９】 集団をコンフルエントに近い状態まで培養した後、骨発生培地に数週間曝露し
た。プレーティングから２週間後および４週間後に、フォン・コッサ染色後の相
対不透明度の比色測定により集団を試験した。骨発生は２週間目に進行中であり
、４週間目ではかなり進行していることが確認された(相対不透明度はそれぞれ1
.1および7.3)。骨髄由来の幹細胞を陽性のコントロールとして用いたところ、こ
れらの細胞はわずかに小さな骨生成能を示した(相対密度はそれぞれ0.2および6.
6)。
【００５０】 集団をコンフルエントに近い状態まで培養した後、筋発生培地に数週間曝露し
た。プレーティングから１、３、および６週間後に、多核細胞の評価と筋特異的
な蛋白(MyoDおよびミオシン重鎖)の発現とによって集団を試験した。ヒト陰茎包
皮線維芽細胞および骨格筋芽細胞をコントロールとして使用した。MyoDおよびミ
オシンを発現している細胞は、幹細胞集団では筋発生培地に曝露した後の全時点
で見られ、そのような細胞の割合は３週間、６週間で増加した。多核細胞は６週
間で観察された。対照的に、線維芽細胞はいかなる時点においてもこれらの特徴
を全く示さなかった。
【００５１】 これらの結果は成熟脂肪細胞を実質上含まないヒト脂肪由来の多分化能性幹細
胞が単離されたことを実証するものである。
【００５２】 （実施例２） 本実施例は脂肪由来幹細胞が５−アザシチジンに応答して分化しないことを実
証する。
【００５３】 実施例１によって得られた脂肪由来幹細胞を５−アザシチジンの存在中で培養
した。骨髄由来の幹細胞とは対照的に、この薬剤に曝露しても筋原性分化は誘導
されなかった。(Wakitaniら, supra参照).
【００５４】 （実施例３） 本実施例はヒト脂肪由来幹細胞のクローン集団の産生を実証する。
【００５５】 実施例１に記載された方法に従って単離した細胞を約5,000細胞/100mmディッ
シュでプレーティングし、実施例１で示されたようにして数日間培養した。数回
細胞分裂の後、いくつかのクローンをクローニングリングでピックアップし、４
８ウェルプレート中のウェルに移した。これらの細胞を、週に二度培地を変えな
がら、それらが約80%〜約90%コンフルエントになるまで(２／３Ｆ12培地＋20%ウ
シ胎仔血清および１／３標準培地−実施例１で単離された細胞によって最初に条
件付けられた−「クローニング培地」中37℃、約5%CO2中で)数週間培養した。そ
の後、各々の培養物を35mmディッシュに移して増殖させた後、100mmディッシュ
に再び移してコンフルエントに近い状態まで増殖させた。これに続いて、細胞集
団の一つを凍結し、残りの集団を12ウェルプレート上に、1000細胞/ウェルでプ
レーティングした。
【００５６】 細胞をクローニング培地中で１５継代以上培養し、実施例１で示されたように
して分化についてモニタリングした。各々のクローンは、何回か連続して分化し
た後はずっと未分化状態のままであった。
【００５７】 次いでクローン集団を樹立し、実施例１に記載されるようにして脂肪生成、軟
骨発生、筋発生、および骨発生培地に曝露した。各々の培地に曝露すると、少な
くとも一つのクローンが骨、脂肪、軟骨、および筋に分化することができ、ほと
んどのクローンは少なくとも３つのタイプの組織に分化出来ることが観察された
。細胞が筋および軟骨に発達しうることは、これら脂肪由来幹細胞の多分化能を
さらに実証するものである。
【００５８】 これらの結果は、脂肪由来幹細胞が、多くの継代の間、特別に前もって選別さ
れた血清のロットを必要とせずに未分化の状態のまま維持されうるということを
実証する。結果はまた、該細胞がそのような長期の継代後に多分化能を保持する
ことを実証しており、該細胞が実際に幹細胞であって単なる拘束された前駆細胞
ではないことを証明している。
【００５９】 （実施例４） 本実施例は脂肪由来幹細胞が他のタイプの幹細胞の培養物をサポートすること
を実証する。
【００６０】 ヒト脂肪由来幹細胞を96ウェルプレート上に、約30,000個/ウェルの密度で継
代し、一週間培養した後に放射線照射した。次いで臍帯血から単離されたヒトの
CD34+造血幹細胞をウェルに播種した。共培養物をMyeloCult H5100培地中で維持
し、細胞生存度および増殖を顕微鏡観察によって主観的にモニタリングした。共
培養２週間後に、該造血幹細胞のCD34発現をフローサイトメトリーによって評価
した。
【００６１】 ストロマ細胞と共培養すると２週間にわたって、造血幹細胞はこんもりとした
細胞の大きなコロニーを形成した。フロー分析により、該細胞の62%がCD34+のま
まであることが明らかとなった。顕微鏡観察によると、ヒト脂肪由来ストロマ細
胞は依然として生存しておりかつ臍帯血由来のヒト造血幹細胞の増殖をサポート
した。
【００６２】 これらの結果は、ヒトの皮下脂肪組織由来のストロマ細胞が他の幹細胞のエク
スビボでの維持、増殖および分化をサポートしうることを実証する。
【００６３】 （実施例５） 本実施例は脂肪由来幹細胞がインビボで分化しうることを実証する。
【００６４】 ４つのグループ(A-D) の無胸腺マウス（各１２匹）に、以下のものを含んでい
るヒドロキシアパタイト／トリカルシウムリン酸立方体を皮下移植した：グルー
プＡは実施例１に記載されているようにして骨発生培地で前処理された脂肪由来
幹細胞を含んでいた。グループＢは未処理の脂肪由来幹細胞を含んでいた。グル
ープＣは骨発生培地を含むが細胞を含まなかった。グループＤは非骨発生培地を
含み、かつ細胞を含まなかった。各々のグループ内で、６匹のマウスを移植後３
週間で犠牲にし、残りのマウスは移植から８週間で犠牲にした。立方体を摘出し
、固定、脱灰、および切片化した。それぞれの切片はH&E染色、マロリー骨染色(
Mallory bone stain)およびオステオカルシンの免疫染色によって分析した。
【００６５】 オステオカルシンについて染色し、かつマロリー骨染色する、類骨様組織のは
っきり識別される領域が、グループＡおよびＢ由来の切片で観察された。他のグ
ループよりも実質的により多くの類骨組織がグループＡおよびＢにおいて観察さ
れたが(p<0.05 ANOVA)、グループＡとＢの間には骨発生における有意差は観察さ
れなかった。さらに、骨増殖における質的な増加がグループＡとＢの両方におい
て３週間と８週間の間で認められた。これらの結果は脂肪由来幹細胞がインビボ
で分化しうることを実証するものである。
【００６６】 （実施例６） 本実施例は実質上細胞を含まない脂肪由来の格子の単離を実証する。
【００６７】 １つのプロトコルにおいては、保存していた実施例１からの上澄み液を0.05%
トリプシンEDTA/ 100U/ml デオキシリボヌクレアーゼ中で３日間酵素消化に付し
て細胞を破壊した。毎日デブリスを生理食塩水ですすぎ、かつ新しい酵素が添加
された。その後材料は食塩水で洗い落とされ、そして0.05%コラゲナーゼ(collag
ease)および約0.1%リパーゼ中に再懸濁して存在している蛋白および脂肪を部分
消化した。このインキュベーションを２週間継続した。
【００６８】 別のプロトコルにおいては、保存していた実施例１からの上澄み液をEDTA中で
インキュベートして全ての上皮細胞を除去した。残存する細胞を、1% NP40、0.5
%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、5mM EDTA、0.4M NaCl、50mM Tris-HC
L(pH 8)およびプロテアーゼ阻害剤を含み、かつロイペプチン、キモスタチン、
アンチパインおよびペプスタチンＡ を各々10μg/ml 含むバッファーを使用して
溶解した。最後に、該組織を二価のカチオンを含まないPBS中で徹底的に洗浄し
た。
【００６９】 両方の準備プロトコルの後、残存している物質を洗浄すると、ゲル状の塊とし
て同定された。この物質の顕微鏡分析により、それは細胞を含まず、かつ大量の
コラーゲン(おそらくIV型)および種々の増殖因子からなることが明らかになった
。この物質の調製物は細胞の増殖をサポートし、それが組織培養のための優れた
基質であることを実証した。
【００７０】 （言及による包含） 本書類もしくは任意の図面、配列表、または本書類とともに提出される陳述書
の中で言及されまたは引用された任意の情報源(例えば、発明者証、特許出願、
特許、出版された刊行物、所蔵図書または記録、実用新案、世界中のウエブペー
ジ等)は、そのことにそのように言及することによって、結果として本明細書に
包含され、本明細書の一部とされる。
【００７１】 （解釈の指針） 前述の事項は本発明全体の統合された説明であり、単なるその一面の特定の要
素の説明ではない。本説明は、本発明の実施のために本発明者らが知る最良の形
態を含めて本発明の「好ましい具体例」を記載する。それを実行する発明者に公
知の最良の形態を含むことをいう。勿論、前述の説明を読むと、それらの好まし
い具体例の変形は当業者には明らかとなるであろう。本発明者らは、当業者が適
切であればそのような変形を用いることを予測し、そして本発明者らは本発明が
特に本明細書に記載されるのとは別のやり方で実施されることを意図する。従っ
て、本発明は、適用可能な法によって許容されるように、これに添付された特許
請求の範囲に記載された主題のあらゆる変更物および均等物を含む。
【００７２】 前述の説明および以下の特許請求の範囲において使用されるように、単数の表
示(例えば、「ある(a)」または「一つの(one)」)は、別段の指示がない限り、複
数を含む。不連続の数値の範囲の記述は、当該範囲内にあるそれぞれ別個の値に
個々に言及する略記方法として働くことを意図しており、各々の別個の値は、ま
るでそれが個々に列挙されたかのように本明細書に含まれる。さらに、以下の用
語は次のように定義される：「原基」は特異的な成熟した構造に発達する能力を
有する原始構造である。「発生上の表現型」は、分化の過程を通じて細胞が特定
の物理的な表現型を獲得する能力である。「ホルモン」は細胞によって分泌され
、かつ接触により同一または他の細胞に表現型の変化を引き起こす任意の物質で
ある。「幹細胞」は少なくとも二つのはっきりと区別される発生経路に従って分
化する能力を有する多分化能性細胞である。
【００７３】 特に特許請求の範囲に関することとして、用語「から本質的になる」は、本発
明の基本的かつ新規な特徴に本質的に影響を及ぼさない、列挙されていない成分
または工程が特に列挙された成分または工程に加えて用いられうることを示す。 対照的に、「含む(comprising)」、「有する(having)」、および「包含する(in
cluding)」のような用語は、任意の成分または工程が列挙されたものに加えて存
在できることを示す。用語「からなる」は列挙された成分または工程だけが存在
することを示すが、該成分または工程の均等物が特に列挙されたものの代替とな
りうる可能性を除外しない。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年５月１８日（２００１．５．１８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１３８】 上記脂肪組織が脂肪吸引溶出液である、請求項１３２に
記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年６月１２日（２００２．６．１２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｆ 2/54 Ａ６１Ｆ 2/60 ４Ｃ０８４ 2/60 Ａ６１Ｋ 35/12 ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｋ 35/12 Ａ６１Ｌ 27/00 Ｚ ４Ｃ０９７ 38/22 Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｌ 27/00 17/02 Ａ６１Ｍ 1/10 43/00 １０７ Ａ６１Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ 17/02 21/02 Ａ 43/00 １０７ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 21/02 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/24 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｆ 2/22 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カッツ、アダム ジェイ． アメリカ合衆国、ペンシルヴァニア州 15218、ピッツバーグ、トレヴァニオン ストリート 1207 (72)発明者 リュール、ラモン スペイン国、バルセロナ エー−08034、 18−４−２アー、エンリック ギメネス （番地なし) (72)発明者 ファートレル、ジェイ．ウィリアム アメリカ合衆国、ペンシルヴァニア州 15238、ピッツバーグ、スウィートウォー ター レイン １ (72)発明者 ヘドリック、マーク エイチ． アメリカ合衆国、カリフォルニア州 91346、エンチノ、ヴァルジーン アヴェ ニュー 5147 (72)発明者 ベンイム、プロスパー アメリカ合衆国、カリフォルニア州 90095−1665、ロス アンジェルス、ルコ ント アヴェニュー 10833 (72)発明者 ローレンツ、ハーマン ピーター アメリカ合衆国、カリフォルニア州 90077、ロス アンジェルス、コーフ レ イン 10434 (72)発明者 ズー、ミン アメリカ合衆国、カリフォルニア州 90095−1665、ロス アンジェルス、ルコ ント アヴェニュー 10833 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 DA03 GA11 HA20 4B063 QA01 QQ08 QR33 QR59 QR77 QR80 QS05 QX01 QX02 4B064 AG02 AG15 CA10 CC24 DA01 4B065 AA93X AB01 BA02 BB19 BD39 BD42 CA44 4C081 AB03 AB13 AB18 AB19 AB31 AB34 AB35 CD29 CD34 EA01 EA11 4C084 AA02 BA44 CA18 CA25 CA56 DA01 DB52 DB57 DB59 MA67 NA14 ZA89 ZB22 ZC03 4C087 AA01 AA02 BB64 CA05 MA67 NA14 ZA89 ZB22 ZC03 4C097 AA01 AA15 AA20 AA21 AA23 AA26 BB01

Claims (79)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 成熟脂肪細胞を実質上含まない哺乳類の脂肪由来の幹細胞。
  2. 【請求項２】 ＤＭＥＭ＋約１０％ウシ胎仔血清中で、分化させることなく
    少なくとも１５回継代して培養することができる、請求項１に記載の細胞。
  3. 【請求項３】 脂肪原性、軟骨原性、心臓原性、皮膚原性、造血性、血管原
    性、筋原性、腎原性、神経原性、神経痛原性、尿生殖器原性、骨原性、心膜原性
    、腹膜原性、胸膜原性、内臓原性、およびストロマ性の発生上の表現型からなる
    発生上の表現型の群から選択される２以上の発生上の表現型を有する、請求項２
    に記載の細胞。
  4. 【請求項４】 ヒトである、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
  5. 【請求項５】 遺伝子学的に変更されている、請求項１〜４のいずれかに記
    載の細胞。
  6. 【請求項６】 細胞表面結合細胞内シグナル伝達部分を有する、請求項１〜
    ５のいずれかに記載の細胞。
  7. 【請求項７】 ホルモンを分泌する、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞
    。
  8. 【請求項８】 上記ホルモンがサイトカインおよび増殖因子からなるホルモ
    ンの群から選択される、請求項７に記載の細胞。
  9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれかに記載の細胞を含む定義づけられた
    細胞集団。
  10. 【請求項１０】 異種である、請求項９に記載の定義づけられた細胞集団。
  11. 【請求項１１】 神経幹細胞(NSC)、造血幹細胞(HPC)、胚幹細胞(ESC)およ
    びそれらの混合物からなる細胞の群から選択される幹細胞をさらに含む(compres
    sing)、請求項９または１０に記載の定義づけられた細胞集団。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜８のいずれかの細胞から本質的になる、請求項
    ９に記載の定義づけられた細胞集団。
  13. 【請求項１３】 実質上同種である、請求項９または１２に記載の定義づけ
    られた細胞集団。
  14. 【請求項１４】 クローンである、請求項１３に記載の定義づけられた細胞
    集団。
  15. 【請求項１５】 集団がクローンであって、中胚葉幹細胞(MHC)、結合組織
    幹細胞(CTSC)、またはそれらの混合物から本質的になる定義づけられた細胞集団
    。
  16. 【請求項１６】 上記幹細胞が、脂肪原性、軟骨原性、心臓原性、皮膚原性
    、造血性、血管原性、筋原性、腎原性、神経原性、神経痛原性、尿生殖器原性、
    骨原性、心膜原性、腹膜原性、胸膜原性、内臓原性、およびストロマ性の発生上
    の表現型からなる発生上の表現型の群から選択される２以上の発生上の表現型を
    有する、請求項１５に記載の集団。
  17. 【請求項１７】 細胞を実質上含まない脂肪組織細胞外マトリックス材料を
    含む脂肪由来の格子。
  18. 【請求項１８】 ヒト蛋白、プロテオグリカン、糖蛋白、ヒアルロニン、ま
    たはフィブロネクチン分子を含む、請求項１７に記載の脂肪由来の格子。
  19. 【請求項１９】 I型、II型、III型、IV型、V型、VI型コラーゲンからなる
    コラーゲンの群から選択されるコラーゲンを含む、請求項１７または１８に記載
    の脂肪由来の格子。
  20. 【請求項２０】 ホルモンを含む請求項１７〜１９のいずれかに記載の脂肪
    由来の格子。
  21. 【請求項２１】 上記ホルモンがサイトカインおよび増殖因子からなるホル
    モンの群から選択される、請求項２０に記載の脂肪由来の格子。
  22. 【請求項２２】 実質上無水である、請求項１７〜２１のいずれかに記載の
    脂肪由来の格子。
  23. 【請求項２３】 凍結乾燥されてなる、請求項１７〜２２のいずれかに記載
    の脂肪由来の格子。
  24. 【請求項２４】 水和されてなる、請求項１７〜２１のいずれかに記載の脂
    肪由来の格子。
  25. 【請求項２５】 請求項１７〜２４のいずれかに記載の脂肪由来の格子と水
    和剤、細胞培養基質、細胞培養培地、抗生物質化合物、およびホルモンからなる
    構成要素の群から選択される１以上の構成要素とを含むキット。
  26. 【請求項２６】 細胞および請求項１７〜２４のいずれかに記載の脂肪由来
    の格子を含む組成物。
  27. 【請求項２７】 請求項１〜８のいずれかに記載の細胞および生物学的に適
    合した格子を含む組成物。
  28. 【請求項２８】 請求項９〜１６のいずれかに記載の集団および生物学的に
    適合した格子を含む組成物。
  29. 【請求項２９】 上記格子がポリマー材料を含む、請求項２７または２８に
    記載の組成物。
  30. 【請求項３０】 上記ポリマー材料がメッシュまたはスポンジとしてポリマ
    ー繊維から形成されるものである、請求項２９に記載の組成物。
  31. 【請求項３１】 上記ポリマー材料が、グリコール酸、乳酸、フマル酸プロ
    ピル、カプロラクトン、ヒアルロナン、ヒアルロン酸およびそれらの組み合わせ
    からなるモノマーの群から選択されるモノマーを含む、請求項２９または３０に
    記載の組成物。
  32. 【請求項３２】 上記ポリマー材料が、蛋白、多糖、ポリヒドロキシ酸、ポ
    リオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、合成ポリマーまたはそれら
    の組み合わせを含む、請求項２９〜３１のいずれかに記載の組成物。
  33. 【請求項３３】 上記ポリマー材料が、細胞を内部に拡散させているポリマ
    ー懸濁液の架橋によって形成されるヒドロゲルである、請求項２９〜３２のいず
    れかに記載の組成物。
  34. 【請求項３４】 上記格子が、サイトカインおよび増殖因子からなるホルモ
    ンの群から選択されるホルモンをさらに含む、請求項２９〜３３のいずれかに記
    載の組成物。
  35. 【請求項３５】 上記格子が請求項１７〜２４のいずれかに記載の脂肪由来
    の格子である、請求項２９〜３４のいずれかに記載の組成物。
  36. 【請求項３６】 請求項１〜８のいずれかに記載の細胞を、導入遺伝子を包
    含する核酸を含む遺伝子導入ベクターに曝露することを含み、それによって該導
    入遺伝子が細胞内で発現されるような条件下で、該核酸が細胞内に導入される、
    遺伝子学的に変更された細胞を得る方法。
  37. 【請求項３７】 上記導入遺伝子が毒素に対する抵抗性を与える蛋白をコー
    ドする、請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 (a)遺伝子学的に変更された細胞を請求項３６または３７
    に従って得ること、および(b)動物に該細胞を導入し、そうして導入遺伝子をイ
    ンビボで発現することを含む、動物に対する導入遺伝子の送達方法。
  39. 【請求項３９】 細胞が分化するのに十分な条件下で、形態発生培地中で細
    胞を培養することを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の細胞を分化させる方
    法。
  40. 【請求項４０】 上記培地が、脂肪生成、軟骨発生、心臓発生、皮膚発生、
    胚性、胎児性、造血性、血管発生、筋発生、腎性、神経発生、神経痛発生、尿生
    殖器発生、骨発生、心膜発生、腹膜発生、胸膜発生、および内臓発生、またはス
    トロマ発生培地である、請求項３９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 上記形態発生培地が脂肪生成培地であり、かつ脂肪原性の
    分化を同定するために細胞をモニタリングする、請求項３９または４０に記載の
    方法。
  42. 【請求項４２】 上記形態発生培地が軟骨発生培地であり、かつ軟骨原性分
    化を同定するために細胞をモニタリングする、請求項３９または４０に記載の方
    法。
  43. 【請求項４３】 上記形態発生培地が胚性または胎児性培地であり、かつ胚
    性または胎児性の表現型を同定するために細胞をモニタリングする、請求項３９
    または４０に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 上記形態発生培地が筋発生培地であり、かつ筋原性分化を
    同定するために細胞をモニタリングする、請求項３９または４０に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 上記形態発生培地が骨発生培地であり、かつ骨原性分化を
    同定するために細胞をモニタリングする、請求項３９または４０に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 上記形態発生培地がストロマ発生培地であり、かつストロ
    マ性または造血性分化を同定するために細胞をモニタリングする、請求項３９ま
    たは４０に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 上記細胞がインビトロで分化する、請求項３９〜４６のい
    ずれかに記載の方法。
  48. 【請求項４８】 上記細胞がインビボで分化する、請求項３９〜４６のいず
    れかに記載の方法。
  49. 【請求項４９】 (a) 請求項７または８に記載の細胞を、細胞がホルモンを
    培地中に分泌するのに十分な条件下、培地内で培養すること、および(b)該培地
    から該ホルモンを単離することを含む、ホルモンを生産する方法。
  50. 【請求項５０】 請求項７または８に記載の細胞を、該細胞がホルモンを生
    み出すのに十分な条件下、傷の近傍に導入し、それによって該ホルモンの存在が
    傷のふさがりを促進することを含む、患者内の傷のふさがりを促進する方法。
  51. 【請求項５１】 請求項７または８に記載の細胞を、該細胞がホルモンを生
    み出すのに十分な条件下、組織に導入し、それによって該ホルモンの存在が組織
    内の血管新生を促進することを含む、組織内の血管新生を促進する方法。
  52. 【請求項５２】 上記組織が動物内にある、請求項５１に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 上記組織が移植片である、請求項５１または５２に記載の
    方法。
  54. 【請求項５４】 上記ホルモンが、ヒト成長因子、神経成長因子、血管およ
    び内皮細胞増殖因子ならびにTGFβスーパーファミリーのメンバーからなる増殖
    因子の群から選択される増殖因子である、請求項４９〜５３のいずれかに記載の
    方法。
  55. 【請求項５５】 細胞が培地を条件付けるのに十分な条件下、請求項１〜７
    のいずれかに記載の細胞に培養培地を曝露することを含む、培養培地を条件付け
    る方法。
  56. 【請求項５６】 上記培地が、条件付けられた後に細胞から単離される、請
    求項５５に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 上記細胞が請求項９〜１６のいずれかに記載の集団の内部
    にある、請求項３６〜５６のいずれかに記載の方法。
  58. 【請求項５８】 請求項５５または５６に記載の方法に従って生産される条
    件培養培地。
  59. 【請求項５９】 請求項１〜７のいずれかに記載の細胞を実質上含まない、
    請求項５８に記載の条件培養培地。
  60. 【請求項６０】 幹細胞が生存を維持するための条件下、請求項５８または
    ５９に記載の条件培地中で幹細胞を維持することを含む幹細胞を培養する方法。
  61. 【請求項６１】 幹細胞の拡大した集団を形成するための幹細胞の有糸分裂
    の連続ラウンドを許容することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 【請求項６２】 上記培地が請求項１〜７のいずれかに記載の脂肪由来の細
    胞を実質上含まない、請求項６０または６１に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 上記培地が請求項１〜７のいずれかに記載の脂肪由来の細
    胞を含む、請求項６０〜６２のいずれかに記載の方法。
  64. 【請求項６４】 幹細胞および脂肪由来の細胞が接触している、請求項６３
    に記載の方法。
  65. 【請求項６５】 上記幹細胞が造血幹細胞である、請求項６０〜６４のいず
    れかに記載の方法。
  66. 【請求項６６】 請求項１８〜２６のいずれかに記載の組成物を、該組成物
    内で細胞が増殖しかつ分化して動物素材を形成するのに十分な条件下で維持する
    ことを含む動物素材の製造方法。
  67. 【請求項６７】 上記素材が、脂肪、軟骨、心臓、皮膚結合組織、血液組織
    、筋、腎、骨、胸膜の、および内臓の組織、およびそれらの組み合わせからなる
    組織の群から選択される組織型を含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 上記素材が１以上の組織型を含む、請求項６６または６７
    に記載の方法。
  69. 【請求項６９】 上記素材が少なくとも動物器官の一部分を含む、請求項６
    ６〜６８のいずれかに記載の方法。
  70. 【請求項７０】 上記素材が少なくとも動物四肢の一部分を含む、請求項６
    ６〜６８のいずれかに記載の方法。
  71. 【請求項７１】 上記組成物がインビトロで維持される、請求項６６〜７０
    のいずれかに記載の方法。
  72. 【請求項７２】 上記組成物が動物内に導入されかつインビボで維持される
    、請求項６６〜７０のいずれかに記載の方法。
  73. 【請求項７３】 請求項１〜７のいずれかに記載の細胞を含む移植片。
  74. 【請求項７４】 請求項８〜１３のいずれかに記載の集団を含む移植片。
  75. 【請求項７５】 請求項１４〜１６のいずれかに記載の脂肪由来の格子を含
    む移植片。
  76. 【請求項７６】 請求項１７〜２６のいずれかに記載の組成物を含む移植片
    。
  77. 【請求項７７】 脂肪組織を患者から単離する手段および幹細胞を脂肪組織
    の残留物から単離する手段を含む、脂肪組織から幹細胞を単離するためのキット
    。
  78. 【請求項７８】 幹細胞を分化させるための培地をさらに含む、請求項７７
    に記載のキット。
  79. 【請求項７９】 上記培地が、脂肪生成、軟骨発生、心臓発生、皮膚発生、
    胚性、胎児性、造血性、血管発生、筋発生、腎性、神経発生、神経痛発生、尿生
    殖器発生、骨発生、心膜発生、腹膜発生、胸膜発生、および内臓発生、またはス
    トロマ発生の培地からなる培地の群から選択される、請求項７８に記載のキット
    。
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