CN1912109B - 一种组织工程化脂肪组织的构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及将来自脂肪组织的干细胞在体外分别向脂肪和向内皮细胞定向诱导分化，并将诱导分化的细胞与生物材料相结合，共同构建组织工程脂肪组织的方法，利用此方法可制备用于弥补软组织缺陷、创伤组织修复以及正常组织的填充塑型物。应用本方法构建的脂肪组织，不仅可以用于一些组织的填充、修复还可以用于乳腺的重建、增大、矫正和美容。例如，头面部与颈部肿瘤的切除、各种复合型创伤、先天性畸形的填充修复以及脸颊、嘴唇等部位的美容和皱纹去除。因此，市场价值潜力巨大，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及将来自脂肪组织的干细胞在体外分别向脂肪和向内皮细胞定向诱导分化，并将诱导分化的细胞与生物材料相结合，共同构建组织工程脂肪组织的方法，利用此方法可制备用于弥补软组织缺陷、创伤组织修复以及正常组织的填充塑型物。
背景技术
世界卫生组织最新公布数据表明，过去20年间，世界乳腺癌的发病率几乎翻了一番，目前全球约有100万乳腺癌患者。乳腺癌已经继皮肤癌之后成为女性的头号健康杀手。在中国，女性乳腺癌发病率也在逐渐上升，目前已从1999年的十万分之十七增加到2004年的十万分之五十二，上升超过三倍。其中发病率最高是北京、上海、广州、深圳等经济发达的大城市，而且呈现生活水平越高发病率越高的趋势，发病年龄也由中老年妇女向青年女性扩展。在美国，每3位女性癌症患者中就有一例是乳腺癌患者。乳腺癌的治疗往往需要切除女性的整个乳房，这给女性精神上带来了巨大的负担和痛苦，严重影响了女性患者后期的生活质量，故乳腺根除的同时都伴有乳腺的重建。每年美国女性乳腺根除重建手术约有8万多例，并且逐年递增。此外，每年对胸部进行美容做乳房增大手术(隆胸)的女性也多达24万人。
无论是乳房的重建还是乳房的增大都与软组织的缺损修复有关。软组织的缺损修复主要是组织形态和外表轮廓的维护与修复，目前临床采用的方法主要为异体、自体组织移植以及假体的填充。组织移植是从异体或自体其他部位获取组织块移植到缺损组织，它实际上是一种以创伤修复另一种创伤的方法，具有很大的风险性，往往伴有多种不良反应和并发症。各种假体的填充植入也常常会引起组织红肿、疼痛、胶囊假体填充液渗漏、囊外包膜纤维化挛缩以及免疫功能障碍多种炎症反应和不良现象。
随着20世纪90年代组织工程学概念的提出和不断发展，目前人们把软组织缺损修复的目光投向脂肪组织工程。即将适当的种子细胞与生物支架材料相结合，在一定的微环境下，经过诱导培养，形成一定量的脂肪细胞和组织，再移植到患者体内填充修复缺损的组织。其中种子细胞是工程化首要关键因素。
最初人们利用吸脂术提取出来的脂肪颗粒细胞进行修复移植，但没有取得理想的效果。植入的脂肪细胞多数很快坏死、液化和吸收(Ellenbogen R.1990)。这是由于成熟的脂肪细胞胞浆中80％～90％是由脂滴组成，容易受机械损伤导致细胞活性的丧失。此外，成熟的脂肪细胞是一种终末分化的细胞，不能够在体内有效的增殖发育。
近来研究发现，人体组织内具有一类能够不断自我更新和增殖，具有多向分化潜能的细胞群体——干细胞。它能够在体外培养、增殖并且分化成不同的组织细胞。有证据表明(Zuk P.A，2001)分离自经胶原酶处理后的脂肪组织的基质-血管部分含有大量的前脂肪细胞，或倾向于分化为脂肪细胞的干细胞。这些细胞能以较低的频率自发地分化为脂肪细胞，在脂肪促进剂(如地塞米松，IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)等)的作用下，可提高这些细胞的分化效率。他们很容易从脂肪组织获取，能够在体外大规模培养和扩增，性质稳定，机械抵抗力强。它们在体外适当的培养环境或体内固有的微环境下能够被诱导分化为脂肪和血管内皮等组织。研究表明，在体外脂肪组织来源的间充质干细胞能够种植在适当的生物支架材料上进行生长和增殖，在一定的诱导条件下也能够分化成为脂肪组织(Zuk P.A，2001)和血管内皮细胞(Planat-Benard，2004)。内皮细胞不但能够促进脂肪组织的发育(Hutley L.J，2001；Aokis，2003)，也是形成毛细血管壁的主要细胞，能够促进微血管网络的生成，从而营养脂肪组织(Neels J.G，2004)。
发明内容
本发明提供了使来源于脂肪组织的干细胞分化为具有脂肪细胞和血管内皮性质之细胞的方法和组合物，与适当的生物活性材料结合后，用于移植到患者软组织缺损部位，发挥修复矫正受治疗者软组织的作用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种组织工程化脂肪组织的构建方法，由向脂肪细胞和向血管内皮细胞诱导分化的细胞与生物材料共同构建而成；所述的向脂肪细胞诱导分化的细胞和向血管内皮细胞诱导分化的细胞是从脂肪组织分离的干细胞经体外诱导分化而获得；所述的生物材料是指生物降解型高分子材料，为选自胶原、甲壳素、纤维素、聚氨基酸、PLGA、PGA和PLA中的一种；
脂肪组织来源的干细胞的分离、干细胞的体外诱导分化以及与生物材料的共培养包括以下步骤：
(1)脂肪组织来源的干细胞的分离培养：
1)人类脂肪组织可通过任何适当的方法如手术或脂肪抽吸术而获得。脂肪抽吸术是目前应用最为普遍的方法，因此脂肪抽吸物是本发明细胞的一个特别优选来源。
2)获取的脂肪组织以生理学相容性溶液诸如磷酸缓冲液冲洗，随后在脂肪组织中加入缓冲液，搅拌并放置至澄清，以除去损伤组织、血液和红细胞等。
3)用蛋白水解酶(例如胶原酶、分散酶、胰蛋白酶等)水解方法解离组织，此类酶可减弱或破坏细胞间的结合，从脂肪结缔组织基质中释放出游离的脂肪细胞。由于成熟脂肪细胞的密度较低，通常浮在等渗缓冲溶液的上层，脂肪组织来源的干细胞将沉淀到溶液下层，而中间层则包括结缔组织基质和脂肪细胞聚集体。
4)使用平衡密度离心方法分离得到富含脂肪组织来源的干细胞群体的部分(下层)。
5)用磷酸缓冲液悬浮沉淀的细胞，通过加入高张盐溶液保温及加入红细胞裂解液等方法破坏并除去残留的红细胞。悬浮的细胞可经过一次或连续多次(2～3次)的洗涤，再离心和重悬浮以获得更高的纯度。或者，这些细胞可通过使用流式细胞仪分选或根据细胞的大小和基粒的有无进行分离，干细胞较小并相对无基粒。
6)最终的分离和重悬浮之后，用标准的细胞培养基进行扩大培养，以增加干细胞的数量。常用的标准培养基如添加5％～15％(例如10％)血清(包括胎牛血清，马血清等)的DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium)或者D/F12培养基。培养传代的细胞形态如附图1所示。
(2)脂肪组织来源的干细胞向血管内皮细胞诱导分化：
1)取扩增的第3～8代脂肪组织来源的干细胞以培养基调整成浓度为1～2×105/ml的细胞悬液，轻轻滴加在可降解的、一定体积的生物活性支架材料上；
2)将细胞材料复合体放入负压容器中，负压处理，使细胞贴附在材料的孔洞内和表面；
3)加入含5～15％血清的DMEM培养基继续培养20小时；
4)将细胞材料复合体放入血管内皮细胞诱导的培养基中，共同培养12～21天；
(3)脂肪组织来源的干细胞向脂肪细胞诱导分化：
1)在将脂肪来源的干细胞向血管内皮细胞分化的同时，将第3～8代大规模生产的脂肪来源的干细胞放入培养瓶中，以脂肪细胞诱导分化的培养基进行诱导培养；
2)细胞在显微镜下观察有脂质小泡存在，经判定向成熟脂肪细胞分化的趋势后，将细胞消化处理，以普通培养基重悬制成细胞悬液，备用；
(4)含有诱导的血管内皮细胞和脂肪细胞的工程化脂肪组织的构建：
1)在脂肪组织来源的干细胞向成血管诱导分化12～21天后，将已向脂肪细胞分化的细胞悬液滴加种植在有血管内皮样细胞的支持材料的另一面，然后将细胞材料复合体放入孵箱中，37℃，5％CO2，饱和湿度下孵育1～2小时，使细胞粘附到材料上面；
2)向细胞材料复合体中加入含5～15％血清的DMEM培养液，继续培养20小时；
3)再向细胞材料复合体中加入成脂诱导的培养基，继续诱导3～5天；
4)最后将细胞材料复合体换成含5～10％血清的DMEM培养液继续培养3～5天，即制备成含有诱导的血管内皮细胞和脂肪细胞的工程化脂肪组织，保存备用；
所述用于诱导脂肪组织来源干细胞向血管内皮细胞分化的培养基是含2～8％胎牛血清的低糖DMEM或者D/F12，其中加入2～10ng/ml血管内皮细胞生长因子、2～10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、地塞米松、牛血清白蛋白、鸟氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺以及适量微量元素氯化锌、硫酸锌和氯化锰；
所述用于诱导脂肪组织来源干细胞向脂肪细胞分化的培养基是含有糖皮质激素异丁基-甲基黄嘌呤、地塞米松、氢化可的松和可的松中的一种，胰岛素，一种提高细胞内cAMP水平的化合物二丁缩醛-cAMP、8-溴-cAMP和毛喉素中的一种，和/或一种抑制cAMP降解的化合物磷酸二酯酶抑制剂甲基异丁基黄嘌呤或消炎痛。
以上所述的组织工程化脂肪组织的构建方法中，用于诱导脂肪组织来源干细胞向脂肪细胞分化的培养基是：DMEM，10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰岛素，200μM引哚美辛，1％链霉素/青霉素剂，0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，泛酸盐和生物素。
用于诱导脂肪组织来源干细胞向血管内皮细胞分化的培养基是：DMEM，2％FBS，10ng/ml VEGF，2ng/ml bFGF，1×ITS，0.61g/L尼克酰胺，0.1μM地塞米松，2g/L BSA，0.1g/L鸟氨酸，0.03g/L脯氨酸，0.73g/L谷氨酰胺，1g/L葡萄糖，2g/L半乳糖及适量微量元素氯化锌、硫酸锌和氯化锰。
本发明另一目的在于提供组织工程化脂肪组织的应用，其一是上述方法构建的组织工程化脂肪组织用于制备弥补软组织缺陷的填充塑型物。
其二是上述方法构建的组织工程化脂肪组织用于制备创伤组织修复的填充塑型物。
其三是上述方法构建的组织工程化脂肪组织用于美容，即构建的组织工程化脂肪组织作为塑型物填充于正常组织，达到美容的目的。
应用本发明方法所获得的含有脂肪干细胞、脂肪细胞、内皮细胞等的细胞群体可和任何可植入结构如经过塑型的生物降解型高分子材料如胶原、甲壳素、纤维素、聚氨基酸、PLGA、PGA、PLA等相结合后一起植入。植入结构的性质将根据实际用途而不同。植入结构可以包括成熟组织，也可以包括未成熟组织或不同组织及其支持材料。例如，植入结构可以包括正在经历分化的应用本发明方法获得的细胞群体，单一或以组合方式种植在适当大小和维度的生物降解型高分子材料上。从而应用于制备弥补软组织缺陷和创伤组织修复的填充塑型物以及制备用于美容的正常组织填充塑型物。
本发明是将脂肪来源的干细胞在体外分别向脂肪和向内皮细胞定向诱导分化后再与适当的、可降解的、塑成一定形状的生物活性支架材料结合起来，共同移植到受体部位，重新生成新的脂肪组织。不仅可以用于一些组织的填充、修复还可以用于乳腺的重建、增大、矫正和美容。例如，头面部与颈部肿瘤的切除、各种复合型创伤、先天性畸形的填充修复以及脸颊、嘴唇等部位的美容和皱纹去除。因此，市场价值潜力巨大，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1第二代脂肪组织来源的干细胞形态学观察(×100倍)。
图2脂肪组织来源干细胞的流式分析
(1)FITC阴性对照；(2)CD90表达阳性；(3)CD45表达阴性；(4)CD44表达阴性；(5)CD71表达阳性；(6)CD16表达阴性；(7)CD30表达阴性；(8)PE阴性对照；(9)CD34表达阴性；(10)CD29表达阳性；(11)CD3表达阴性；(12)CD11b表达阴性；(13)CD133表达阴性；(14)CD19表达阴性。
图3脂肪组织来源干细胞的向脂肪细胞分化
a：成脂诱导培养两周，细胞内充满脂质的液泡呈油红O染色阳性；
b：成脂诱导一周的细胞中充满脂质的小滴(×100倍)；
c：成脂诱导二周细胞充满脂质的小滴(×200倍)。
图4脂肪组织来源干细胞的向血管内皮细胞分化及免疫荧光检测。
a：诱导分化7天后，细胞排列成条索状，并形成血管腔样结构；
b：免疫荧光鉴定，诱导分化细胞flt-1阳性表达；
c：免疫荧光鉴定，诱导分化后7天部分细胞CD31阳性表达；
d：免疫荧光鉴定，诱导分化后7天部分细胞CD34阳性表达；
e：免疫荧光鉴定，诱导分化后14天细胞vWF阳性表达；
f：免疫荧光鉴定，诱导分化后14天细胞flk-1阳性表达。
图5工程化脂肪组织NOD/SCID小鼠皮下移植及体内免疫荧光检测。
a：；5周后小鼠腹部皮下形成的隆丘；
b：工程化组织块上白色脂肪层的形成；
c：免疫荧光鉴定，NOD/SCID鼠体内工程化脂肪组织人核蛋白阳性表达；
d：免疫荧光鉴定，NOD/SCID鼠体内工程化脂肪组织人CD34阳性表达；
e：免疫荧光鉴定，NOD/SCID鼠体内工程化脂肪组织人CD31阳性表达；
f：免疫荧光鉴定，NOD/SCID鼠体内工程化脂肪组织人vWF阳性表达。
具体实施方式
实施例1脂肪组织来源干细胞的体外分离和培养扩增：
用磷酸盐缓冲溶液(PBS)反复冲洗吸脂手术得到的吸出物，随后在其中加入PBS，搅拌并放置至澄清，以除去损伤组织、血液和部分红细胞等，然后加入浓度约为0.1％的胶原酶，轻轻搅拌下37℃消化45分钟。1500转离心5分钟，收集细胞沉淀物，并将沉淀悬浮于红细胞裂解液(Tris-NH4Cl)中，室温静置10分钟后，再次离心收集细胞。如此反复处理两次，以尽可能地破碎并除去红细胞。细胞悬液离心收集下层细胞沉淀物，然后使用溴酚兰染料排除法检测细胞的存活率并计数活细胞的比例。
存活细胞在含10％胎牛血清的标准DMEM培养基中37℃、5％CO2培养。当细胞达到约80％汇合时，传代培养，培养基为含10％胎牛血清的标准DMEM培养基，37℃、5％CO2培养。培养至细胞形成单层后用0.25％的胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化解离单层并收集游离的细胞，准备用于分化培养基中进行干细胞定向分化培养。
实施例2脂肪组织来源干细胞表面标志鉴定
取第5代培养扩增的脂肪组织来源的干细胞，0.25％胰酶消化收集细胞，离心。以PBS洗涤细胞2次后，用1mlPBS重悬细胞，计数。用PBS调整细胞浓度为1×106个/ml，按5×105个细胞/管将细胞平均分至多个EP管中，分别将PE或FITC标记的多个抗体(CD90、CD44、CD45、CD71、CD16、CD30、CD34、CD29、CD3、CD11b、CD133和CD19)进行组合，加入各管中，室温下孵育30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重悬细胞后，用流式细胞仪对培养扩增细胞的表面标志进行检测和鉴定。结果显示，脂肪组织来源的干细胞，CD90、CD29和CD71表达阳性，说明其是间质来源的一类具有干细胞性质的细胞(见图2)。
实施例3脂肪组织来源干细胞向脂肪细胞的定向诱导分化及应用
使用含有10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰岛素，200μM引哚美辛，1％青霉素/链霉素，0.5mM IBMX的DMEM培养基在常规条件(37℃，5％CO2)下对脂肪组织来源干细胞继续培养。培养7～15天后，取诱导培养的细胞克隆，甲醇固定2min，50％酒精漂洗，加入油红O染料染色10min，50％酒精漂洗后，用水冲洗，苏木精复染1min，镜下观察染色情况，呈油红O染色阳性，表明细胞内有脂质小泡存在，根据这一特征可判定干细胞已出现向成熟脂肪细胞分化的趋势。将未分化的或部分向脂肪细胞分化的脂肪组织来源的干细胞单独注射或手术方式植入到接受治疗的区域如脸颊、嘴唇等部位以除皱和/或美容。
实施例4组织工程化脂肪细胞体外诱导及应用
将大规模扩增的第3～8代脂肪来源的干细胞制成1～2×105/ml的细胞悬液，轻轻滴加种植在可降解的、1×2cm2大小的长方形状的PLGA生物活性支架材料上，生物活性支架材料表面可预先包被含有5ng/mlbFGF的0.5％的明胶，随着明胶的降解，bFGF将会缓慢释放，促使细胞以后在体内微环境和诱导因子的双重作用下诱导脂肪组织的生成。将细胞材料复合体放入孵箱中，37℃，5％CO2，饱和湿度下静置6～10小时，使细胞贴附在材料的孔洞内和表面。再加含10％FBS的DMEM培养基继续培养24小时。换成成脂诱导的培养基，如DMEM，其中含有10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰岛素，200μM引哚美辛，1％青霉素/链霉素，0.5mM IBMX。细胞与材料共培养7～14天后即可用于体内填充植入。
实施例5脂肪组织来源干细胞向血管内皮细胞的定向诱导分化：
条件培养基为含2％胎牛血清的低糖DMEM中加入10ng/mlVEGF、2ng/mlbFGF、1×ITS、尼克酰胺0.61g/L、地塞米松0.1μmoL/L、牛血清白蛋白(BSA)2g/L、鸟氨酸0.1g/L、脯氨酸0.03g/L、谷氨酰胺0.73g/L、葡萄糖1g/L、半乳糖2g/L及10-6微量元素(氯化锌、硫酸锌和氯化锰)等。将大规模扩增的第3～8代脂肪来源的干细胞以条件培养基重悬，按2×104/cm2接种于预先铺好Matrigel(1∶3比例稀释)的培养板内，每3天换液一次。诱导后7天显微镜下观察，细胞排列成条索状，并形成血管腔样结构。诱导后7天、14天的细胞做成细胞爬片，PBS洗涤，4％的多聚甲醛室温原位固定15分钟，0.1％Triton和3％过氧化氢孵育透膜处理10min，蒸馏水冲洗，20％马血清37℃孵育封闭15分钟，分别加内皮细胞表面标志CD34、CD31、Flk-1、vWF、Flt-1抗体工作液，湿盒中放4℃过夜后，在荧光显微镜下观察，可见CD34、CD31、flt-1、flk-1、vWF均为阳性表达。
实施例6工程化脂肪组织的构建
1)用含10％FBS的标准DMEM培养基大规模培养脂肪来源的干细胞，取第5代细胞制成1～2×105/ml的细胞悬液，轻轻滴加种植在适当的、可降解的、1×2cm2大小的长方形状的PLGA生物活性支架材料上。将细胞材料复合体放入负压容器中，抽真空1分钟后取出，于37℃，5％CO2，饱和湿度下静置2～4小时，使细胞贴附在材料的孔洞内和表面。再加含10％FBS的DMEM培养基继续培养20小时。换成实施例4中所述血管内皮诱导培养基，培养12～21天，显微镜下观察细胞排列成条索状，形成血管腔样结构，管腔样结构周围有呈铺路石样排列的内皮样细胞。
2)同时将脂肪来源的干细胞在培养器皿中向成脂肪组织细胞诱导，在显微镜下观察有脂质小泡存在，判定已出现向成熟脂肪细胞分化趋势后，将细胞消化处理制成1～2×107/ml的细胞悬液，轻轻逐滴滴加种植在有血管内皮样细胞的支持材料的另一面，将细胞材料复合体放入孵箱中，37℃，5％CO2，饱和湿度下孵育1～2小时，使细胞粘附到材料上面，继续孵育1～2小时，加入含10％FBS的DMEM培养基。
3)继续培养20小时后换成成脂诱导的培养基，继续诱导3～5天，随后换成含有10％FBS的DMEM培养基培养3～5天后即得到工程化的脂肪组织块。
实施例7NOD/SCID小鼠皮下填充植入实验
1)2％戊巴比妥钠30～50mg/kg腹腔注射麻醉NOD/SCID小鼠，在其腹部皮肤切开一小口，直径1.0cm，以供工程化组织块移植。
2)取构建好的工程化组织块，填充植入皮下，用线缝合。5周后取标本，冰冻切片，行免疫组织化学染色(抗人核蛋白抗体，CD34，CD31，vWF)。
3)结果显示：取材时，可见小鼠腹部皮肤愈合良好，手术部位形成一隆丘，表面光滑，有一定的弹性(图5a)，手术切开后可见有白色脂肪层形成(图5b)。免疫组化结果显示，5周后工程化组织块内有大量人细胞增殖(图5c)，其中很多细胞CD34、CD31、vWF免疫荧光检测为阳性(图5d、5e、5f)。
Claims (6)
1.一种组织工程化脂肪组织的构建方法，其特征在于：由向脂肪细胞和向血管内皮细胞诱导分化的细胞与生物材料共同构建而成；所述的向脂肪细胞诱导分化的细胞和向血管内皮细胞诱导分化的细胞是从脂肪组织分离的干细胞经体外诱导分化而获得；所述的生物材料是指生物降解型高分子材料，为选自胶原、甲壳素、纤维素、聚氨基酸、PLGA、PGA和PLA中的一种；
脂肪组织来源的干细胞的分离、干细胞的体外诱导分化以及与生物材料的共培养包括以下步骤：
(1)脂肪组织来源的干细胞的分离培养：
1)以磷酸缓冲液冲洗脂肪组织后，加入缓冲液，搅拌并放置至澄清，除去损伤组织、血液和红细胞；
2)蛋白水解酶水解脂肪组织；
3)平衡密度离心，分离脂肪组织来源的干细胞；
4)磷酸缓冲液重悬分离的细胞，加入高张盐溶液保温及加入红细胞裂解液，破坏并除去残留的红细胞；
5)离心去除上清液，加入磷酸缓冲液重悬及离心洗涤，得到的脂肪组织来源的干细胞，用含5％～15％血清的DMEM或者D/F12细胞培养基进行扩大培养，以增加干细胞的数量；
(2)脂肪组织来源的于细胞向血管内皮细胞诱导分化：
1)取扩增的第3～8代脂肪组织来源的干细胞以培养基调整成浓度为1～2×105/ml的细胞悬液，轻轻滴加在可降解的、一定体积的生物活性支架材料上；
2)将细胞材料复合体放入负压容器中，负压处理，使细胞贴附在材料的孔洞内和表面；
3)加入含5～15％血清的DMEM培养基继续培养20小时；
4)将细胞材料复合体放入血管内皮细胞诱导的培养基中，共同培养12～21天；
(3)脂肪组织来源的干细胞向脂肪细胞诱导分化：
1)在将脂肪来源的干细胞向血管内皮细胞分化的同时，将第3～8代大规模生产的脂肪来源的干细胞放入培养瓶中，以脂肪细胞诱导分化的培养基进行诱导培养；
2)细胞在显微镜下观察有脂质小泡存在，经判定向成熟脂肪细胞分化的趋势后，将细胞消化处理，以普通培养基重悬制成细胞悬液，备用；
(4)含有诱导的血管内皮细胞和脂肪细胞的工程化脂肪组织的构建：
1)在脂肪组织来源的干细胞向成血管诱导分化12～21天后，将已向脂肪细胞分化的细胞悬液滴加种植在有血管内皮样细胞的支持材料的另一面，然后将细胞材料复合体放入孵箱中，37℃，5％CO2，饱和湿度下孵育1～2小时，使细胞粘附到材料上面；
2)向细胞材料复合体中加入含5～15％血清的DMEM培养液，继续培养20小时；
3)再向细胞材料复合体中加入成脂诱导的培养基，继续诱导3～5天；
4)最后将细胞材料复合体换成含5～10％血清的DMEM培养液继续培养3～5天，即制备成含有诱导的血管内皮细胞和脂肪细胞的工程化脂肪组织，保存备用；
所述用于诱导脂肪组织来源干细胞向血管内皮细胞分化的培养基是含2～8％胎牛血清的低糖DMEM或者D/F12，其中加入2～10ng/ml血管内皮细胞生长因子、2～10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、地塞米松、牛血清白蛋白、鸟氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺以及适量微量元素氯化锌、硫酸锌和氯化锰；
所述用于诱导脂肪组织来源干细胞向脂肪细胞分化的培养基是含有糖皮质激素异丁基-甲基黄嘌呤、地塞米松、氢化可的松和可的松中的一种，胰岛素，一种提高细胞内cAMP水平的化合物二丁缩醛-cAMP、8-溴-cAMP和毛喉素中的一种，和/或一种抑制cAMP降解的化合物磷酸二酯酶抑制剂甲基异丁基黄嘌呤或消炎痛。
2.根据权利要求1所述的组织工程化脂肪组织的构建方法，其特征在于，用于诱导脂肪组织来源干细胞向脂肪细胞分化的培养基是：DMEM，10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰岛素，200μM引哚美辛，1％链霉素/青霉素剂，0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，泛酸盐和生物素。
3.根据权利要求1所述的组织工程化脂肪组织的构建方法，其特征在于，用于诱导脂肪组织来源干细胞向血管内皮细胞分化的培养基是：DMEM，2％FBS，10ng/ml VEGF，2ng/m1bFGF，1×ITS，0.61g/L尼克酰胺，0.1μM地塞米松，2g/L BSA，0.1g/L鸟氨酸，0.03g/L脯氨酸，0.73g/L谷氨酰胺，1g/L葡萄糖，2g/L半乳糖及适量微量元素氯化锌、硫酸锌和氯化锰。
4.组织工程化脂肪组织的应用，其特征在于，权利要求1所述方法构建的组织工程化脂肪组织用于制备弥补软组织缺陷的填充塑型物。
5.组织工程化脂肪组织的应用，其特征在于，权利要求1所述方法构建的组织工程化脂肪组织用于制备创伤组织修复的填充塑型物。
6.组织工程化脂肪组织的应用，其特征在于，权利要求1所述方法构建的组织工程化脂肪组织用于制备美容用塑型物，所述塑型物填充于正常组织，达到美容的目的。
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