CN106318998B

CN106318998B - 用于提高重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物

Info

Publication number: CN106318998B
Application number: CN201510401874.2A
Authority: CN
Inventors: 邓献存; 王海彬; 范里; 邓全宇; 万宇翔; 潘洪辉; 徐胜; 缪仕伟; 白骅
Original assignee: Zhejiang Haizheng Borui Biopharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Haizheng biopharmaceutical Co., Ltd; Zhejiang Borui biopharmaceutical Co., Ltd
Priority date: 2015-07-08
Filing date: 2015-07-08
Publication date: 2019-08-20
Anticipated expiration: 2035-07-08
Also published as: CN106318998A

Abstract

本发明涉及一种用于提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体‑抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物，其包括半乳糖(10‑100mmol/L)、氨基葡萄糖(1‑50mmol/L)、N‑乙酰甘露糖(1‑50mmol/L)、N‑乙酰葡萄糖胺(1‑50mmol/L)、尿嘧啶(1‑50mmol/L)、四水氯化锰(0.01‑1mmol/L)、地塞米松(0.01‑1mmol/L)和氢化可的松(0.01‑1mmol/L)。将本发明的组合物添加到培养基后，能显著提高基于动物细胞大规模培养技术生产的重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体‑抗体融合蛋白的唾液酸化水平，从而提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体‑抗体融合蛋白的稳定性。

Description

用于提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物。

技术背景

进入21世纪以来，生命科学和生物技术已经成为众多国家研究开发热点，现代生物技术产业的发展水平是国际竞争力的重要标志之一。动物细胞表达系统及其大规模培养技术是现阶段乃至今后较长一段时期内生物技术药物和生物制品产业最为重要的生产系统和核心技术，其产品包括各类抗体、重组蛋白、人畜禽病毒疫苗等。其中，重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白是生物技术药物最重要的产品之一，在治疗风湿性、类风湿性关节炎、银屑病等自身免疫性疾病方面具有明显的疗效，对提高自身免疫性疾病患者的生活质量，保障人类健康具有重大的现实意义。

蛋白质的糖基化修饰是蛋白质的一种重要的翻译后修饰，对蛋白类药物的功能(如：药物动力学、生物学活性、蛋白分泌、体内清除、溶解性以及受体识别)起着决定性作用。唾液酸化是蛋白糖基化修饰的重要形式，是衡量药物质量的关键指标。唾液酸广泛存在于糖蛋白N-糖链或O-糖链的末端，其连接主要分为三个步骤：(1)糖基末端的半乳糖化：UDP-半乳糖在半乳糖苷转移酶(Mn²⁺为辅因子)的催化下转移至N-乙酰葡萄糖胺；(2)氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺经过多步酶促反应合成CMP-唾液酸；(3)CMP-唾液酸在唾液酸转移酶(Mn²⁺为辅因子)的催化下，转移至已完成半乳糖化的糖基末端。其中前两个步骤为糖基唾液酸化提供位点及前体，步骤(3)完成最终的糖基末端唾液酸修饰。

大量研究表明唾液酸对于蛋白类药物在体内的半衰期有着重要的作用。蛋白类药物的糖基化末端未连上唾液酸，则该蛋白会在人体肝脏中易被非唾液酸化受体结合，从而被快速降解。Walsh G等将促红细胞生成素(EPO)N-糖链末端的唾液酸切除，并将其注射到体内发现，去唾液酸化的EPO迅速被肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体摄取并分解。Liu等通过动物实验发现，肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平越高，其在实验兔体内的循环半衰期越久。表1所示为不同种类的糖蛋白在唾液酸化和去唾液酸状态下的体内循环半衰期。唾液酸化和去唾液酸化状态下蛋白类药物的半衰期相差数十甚至千百倍。综上所述，蛋白类药物唾液酸化水平对其在体内的稳定性起决定作用。

表1唾液酸化对糖蛋白体内循环半衰期的影响

目前，提高蛋白质药物唾液酸化的研究主要集中在促红细胞生成素，很少涉及抗体融合蛋白。提高其唾液酸化水平的过程方法主要有以下三种：(1)优化基础培养基组分。Baker等发现在培养基中加入葡萄糖胺、尿苷和N-乙酰甘露糖胺能显著提高胞内磷酸胞苷唾液酸含量，有利于重组蛋白的唾液酸含量。(2)控制代谢副产物氨的生成。Yang M等发现培养环境中过高的氨浓度(>10mmol/L)会抑制N-乙酰葡萄糖胺的合成，降低促红细胞生成素的唾液酸含量，导致蛋白糖基结构的不均一。(3)优化培养过程参数。Muthing J等发现较低的pH有利于抗体IgG3的唾液酸修饰，而Trummer E等实验结果显示较低的培养温度却使促红细胞生成素的唾液酸含量较常温培养(37℃)下降20％。

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白包含了重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体蛋白以及抗体保守区的部分片段(CH₂、CH₃及键间部位)。重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白共包含有6个N端糖基化位点及20多个O端糖基化位点，较抗体蛋白和促红细胞生成素糖基化位点更多，糖型更为复杂。如何简单有效提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的唾液酸化水平，延长其在病人体内的半衰期，保证长久药效，降低给药频率和剂量是目前亟须解决的问题。然而，现阶段尚未有调节重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的有效措施。

发明内容

本发明所要解决的技术问题，就是提供一种用于提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物，以满足有效、快速改善抗体融合蛋白唾液酸化修饰，进而延长其体内半衰期的需要。

本发明的思路为：开发一种用于提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物，强化和丰富动物细胞培养中的唾液酸化前体供应，优化胞内酶促反应环境以提高糖苷转移和连接效率，最终提高抗体融合蛋白的唾液酸化水平。

本发明所述的组合物含有合成糖基前体物质、辅因子和糖皮质激素。

其中，所述合成糖基前体物质包含半乳糖、氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺和尿嘧啶。

其中，所述辅因子选自四水氯化锰。

其中，所述糖皮质激素包括地塞米松和氢化可的松。

在一个实施方案中，所述组合物包含：

半乳糖

氨基葡萄糖

N-乙酰甘露糖

N-乙酰葡萄糖胺

尿嘧啶

四水氯化锰

地塞米松和

氢化可的松。

在一个优选的实施方案中，所述组合物包含：

半乳糖：10-100mmol/L

氨基葡萄糖：1-50mmol/L

N-乙酰甘露糖：1-50mmol/L

N-乙酰葡萄糖胺：1-50mmol/L

尿嘧啶：1-50mmol/L

四水氯化锰：0.01-1mmol/L

地塞米松：0.01-1mmol/L和

氢化可的松：0.01-1mmol/L。

在一个更优选的实施方案中，所述组合物包含：

半乳糖：30mmol/L

氨基葡萄糖：20mmol/L

N-乙酰甘露糖：20mmol/L

N-乙酰葡萄糖胺：20mmol/L

尿嘧啶：20mmol/L

四水氯化锰：0.1mmol/L

地塞米松：0.1mmol/L和

氢化可的松：0.1mmol/L。

本发明进一步提供了前述组合物的制备方法，所述方法包括：将处方量的合成糖基前体物质和辅因子充分溶解于无热源超纯水中，将处方量的糖皮质激素溶于95-99％的乙醇溶液中后添加到已溶解了合成糖基前体物质和辅因子的溶液中，配制成所述的组合物。

在一个优选的技术方案中，所述组合物的制备方法包括：将处方量的四水氯化锰、半乳糖、氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺和尿嘧啶充分溶解于无热源超纯水中，将处方量的地塞米松、氢化可的松溶于95-99％的乙醇溶液中后添加到已溶解了四水氯化锰、半乳糖、氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺和尿嘧啶的溶液中，配制成所述的组合物。

本发明还提供了前述组合物在提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平中的用途。

本发明的组合物通过加入半乳糖和尿嘧啶，可以强化糖基结构末端的半乳糖化，提供唾液酸化的位点；通过加入氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖和N-乙酰葡萄糖胺，可以提高胞内CMP-唾液酸含量，增加底物供给；通过加入四水氯化锰，可以增加酶促辅因子的供应，提高酶反应速度；通过加入地塞米松和氢化可的松，可以优化高尔基体内pH等生化环境，提高糖基转移酶的酶活。

本发明还提供了一种含有如前所述组合物的培养基。在一个优选的实施方案中，每升培养基中含有10ml如前所述的组合物。

本发明的积极效果是：

(1)添加到培养基中后能有效、快速地提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平；

(2)组分明确，不含动物来源成分，安全性高；

(3)添加到培养基中后不影响细胞生长和产物表达；

(4)本发明的组合物配制及使用方便，适于重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的大规模生产。

附图说明

图1为表达重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的CHO细胞在未添加和添加本发明组合物的美国Life techonology公司开发的CD optimal商业化基础培养基中进行流加培养时活细胞密度变化的趋势图，图中，▲、■分别表示未添加和添加后的活细胞密度。

图2为表达重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的CHO细胞在未添加和添加本发明组合物的美国Life techonology公司开发的CD optimal商业化基础培养基中进行流加培养时重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白合成的趋势图，图中，▲、■分别表示未添加和添加后的重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白在培养上清中的浓度。

图3为表达重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的CHO细胞在未添加和添加本发明组合物的美国Life techonology公司开发的CD optimal商业化基础培养基中进行流加培养时最终收获的重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的唾液酸化的含量图，**表示显著差异(p<0.01)。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行进一步说明。应当理解，这些实施例只是为了说明本发明，并不是用来限制本发明。

实施例1在批式培养过程中，应用于美国SAFC Biosciences公司生产的商业化无血清培养基EX-CELL ^TM 302CHO的用于提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物。

本实施例中共提供十八种用于提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物(表2)，含有四水氯化锰、半乳糖、氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺、尿嘧啶、地塞米松和氢化可的松。

本实施例中组合物的制备方法为：将处方量的四水氯化锰、半乳糖、氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺和尿嘧啶充分溶解于无热源超纯水中，将处方量的地塞米松、氢化可的松溶于99％的乙醇溶液中后添加到已溶解了四水氯化锰、半乳糖、氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺和尿嘧啶的溶液中，配制成所述的组合物。

将所述用于提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物按每升培养基添加10ml的方式添加至美国SAFC Biosciences公司生产的商业化无血清培养基EX-CELL ^TM 302CHO中。

表2应用于美国SAFC Biosciences公司生产的商业化无血清培养基EX-CELL TM302CHO的用于提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物配方表(单位：mmol/L)

使用添加了上述组合物的培养基，将表达重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的CHO细胞以5.00×10⁵cells/ml的密度，大于95％的活性接种于瑞士TPP公司生产的50ml细胞培养管中，放置于瑞士阿道夫科耐公司生产的摇床上进行批式培养。同时，使用不添加上述组合物的EX-CELL ^TM 302CHO培养基，采用上述相同方法对表达重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的CHO细胞进行批式培养，作为对照组。结果见表3。

表3批式培养过程中细胞生长，产物表达及重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸含量

在不含本实施例组合物配方的EX-CELL ^TM 302CHO培养基中，最大活细胞密度为3.26×10⁶cells/ml，产物浓度为265.23mg/L，重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸含量为35.8μg/mg。在添加本实施例组合物配方的培养基中，细胞生长和产物表达并未受影响(p>0.05)，最大活细胞密度为3.22±0.13×10⁶cells/ml，产物浓度为262±12mg/L；重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化有显著提升(p<0.05)，其唾液酸含量为49.2±3.2μg/mg，比未添加时提高了37％。

实施例2在流加培养过程中，应用于美国Life techonology公司开发的CDoptimal商业化基础培养基的用于提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物。

本实施例用于提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物含有：

半乳糖：30mmol/L

氨基葡萄糖：20mmol/L

N-乙酰甘露糖：20mmol/L

N-乙酰葡萄糖胺：20mmol/L

尿嘧啶：20mmol/L

四水氯化锰：0.1mmol/L

地塞米松：0.1mmol/L和

氢化可的松：0.1mmol/L。

本实施例中组合物的制备方法为：将处方量的四水氯化锰、半乳糖、氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺和尿嘧啶充分溶解于无热源超纯水中，将处方量的地塞米松和氢化可的松溶于95％的乙醇溶液中后添加到已溶解了四水氯化锰、半乳糖、氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺和尿嘧啶的溶液中，配制成所述的组合物。

将所述用于提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物按每升培养基添加10ml的方式添加至美国Life techonology公司开发的CD optimal商业化基础培养基中。

使用添加了上述组合物的无血清培养基，将表达重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的CHO细胞以5.00×10⁵cells/ml的密度，大于95％的活性接种于德国赛多利斯公司生产的2L反应器中，进行流加培养。流加策略为在流加培养过程的第3，6，9天分别流加10％(v/v)美国Life techonology公司开发的CD optimal商业化基础培养基。同时，使用不添加上述组合物的美国Life techonology公司开发的CD optimal商业化基础培养基，采用上述相同方法对表达重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的CHO细胞进行流加培养，作为对照组。结果见图1，图2和图3。

在未添加本实施例组合物的无血清培养基中，最大活细胞密度为9.54±0.07×10⁶cells/ml，培养过程中细胞活性始终维持在90％以上(图1)，流加培养过程产物最终浓度为827±16mg/L(图2)，重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸含量为36.2±1.3μg/mg(图3)。在已添加本实施例组合物的培养基中，细胞生长和产物表达并未受影响(p>0.05)，最大活细胞密度为9.48±1.32×10⁶cells/ml(图1)，产物浓度为828±45mg/L(图2)，重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化有显著提升(p<0.05)，其唾液酸含量为54.8±4.4μg/mg(图3)，比未添加时提高了51％。

Claims

1.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含合成糖基前体物质、辅因子和糖皮质激素，所述合成糖基前体物质包含半乳糖、氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺和尿嘧啶，所述辅因子选自四水氯化锰，所述糖皮质激素包括地塞米松和氢化可的松。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含：

半乳糖：10-100mmol/L

氨基葡萄糖：1-50mmol/L

N-乙酰甘露糖：1-50mmol/L

N-乙酰葡萄糖胺：1-50mmol/L

尿嘧啶：1-50mmol/L

四水氯化锰：0.01-1mmol/L

地塞米松：0.01-1mmol/L

和

氢化可的松：0.01-1mmol/L。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含：

半乳糖：30mmol/L

氨基葡萄糖：20mmol/L

N-乙酰甘露糖：20mmol/L

N-乙酰葡萄糖胺：20mmol/L

尿嘧啶：20mmol/L

四水氯化锰：0.1mmol/L

地塞米松：0.1mmol/L和

氢化可的松：0.1mmol/L。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含：

半乳糖：100mmol/L

氨基葡萄糖：50mmol/L

N-乙酰甘露糖：1mmol/L

N-乙酰葡萄糖胺：1mmol/L

尿嘧啶：1mmol/L

四水氯化锰：1mmol/L

地塞米松：1mmol/L和

氢化可的松：1mmol/L。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含：

半乳糖：100mmol/L

氨基葡萄糖：1mmol/L

N-乙酰甘露糖：50mmol/L

N-乙酰葡萄糖胺：1mmol/L

尿嘧啶：50mmol/L

四水氯化锰：1mmol/L

地塞米松：1mmol/L和

氢化可的松：0.01mmol/L。

6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含：

半乳糖：10mmol/L

氨基葡萄糖：1mmol/L

N-乙酰甘露糖：1mmol/L

N-乙酰葡萄糖胺：1mmol/L

尿嘧啶：50mmol/L

四水氯化锰：1mmol/L

地塞米松：1mmol/L和

氢化可的松：0.01mmol/L。

7.一种制备权利要求1所述组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：将合成糖基前体物质和辅因子充分溶解于无热源超纯水中，将糖皮质激素溶于95-99％的乙醇溶液中后添加到已溶解了合成糖基前体物质和辅因子的溶液中，配制成所述的组合物。

8.一种制备权利要求2-6任一项所述组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：将处方量的四水氯化锰、半乳糖、氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺和尿嘧啶充分溶解于无热源超纯水中，将处方量的地塞米松、氢化可的松溶于95-99％的乙醇溶液中后添加到已溶解了四水氯化锰、半乳糖、氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺和尿嘧啶的溶液中，配制成所述的组合物。

9.权利要求1-6任一项所述的组合物在提高重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平中的用途。

10.一种含有权利要求1-6任一项所述组合物的培养基。

11.根据权利要求10所述的培养基，其特征在于，每升培养基中含有10ml权利要求1-6任一项所述的组合物。