CN109777765A - 干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供改进的干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法，包括基础细胞培养基和添加物组成；所述基础培养基中包括注射用水或者采用同级别的超纯水，碳水化合物、氨基酸、维生素、甲壳素、壳聚糖、无机盐及微量元素；还包括脂类及前体，核苷、生长因子及转运蛋白，还原剂、保护剂和诱导剂；所述添加物为乙醇胺和丁酸钠；所述乙醇胺的终浓度为9.88‑10.12mg/L，所述丁酸钠的终浓度为9.73‑10.27mg/L，所述转铁蛋白的终浓度为1.86‑2.14mg/L。该干细胞培养基能更快速扩增不同来源的干细胞，让细胞的扩增速度提高3‑5倍，但又不影响其分化的潜能，同时延长了传代次数，而且又能很好的保持干细胞的潜能性。

Description

干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法。

背景技术

体外培养动物细胞时，通常需要在培养基中加入血清，用于提供细胞生长所需的营养物质及生长环境，但血清存在价格昂贵、极易感染病毒或支原体、成分复杂不利于进行细胞产品的分离纯化等诸多缺点。随着现代生物技术的发展，科学家们开始寻求一种新的替代培养基——无血清培养基。

无血清培养基(Serum Free Medium，SFM)，是指在基础细胞培养基基础上，添加成分完全确定或部分确定的血清替代成分形成的培养基，适合大规模生产，被广泛应用于细胞生物学、药理学、肿瘤学领域。

动物细胞培养技术近年来发展迅速，已经成为生物工程领域中的前沿研究课题之一。其在生物制品的生产、肿瘤细胞的体外建模、病毒的分离鉴定和机体发育功能研究等方面均有重要应用。通常，为了提供细胞生长所需的激素、生长因子等物质，动物细胞是在含血清的培养基中进行培养的。但血清成分复杂且不完全明确，批次间容易产生较大差异，培养中易发生外源物污染，并且血清本身价格也比较昂贵等；这些均使得血清在生产和研究中的应用存在诸多不利。目前，已有大量实验数据证实无血清培养基不仅能避免或改善含血清培养基所带来的上述缺陷，也能获得良好的培养效果并维持原有生物学功能。干细胞尽量含量甚微，但广泛分布于哺乳动物的各个组织器官，这些组织或器官包括但不局限于骨髓、脐带、脂肪组织、脑组织、视网膜、心脏、肝脏、肺以及皮肤等。大量研究表明，这些低含量的干细胞可在体外通过适当的方法进行进一步扩增，最常规的一种培养干细胞的培养基就是添加有胎牛血清的培养基。

发明内容

本发明提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法，该干细胞培养基能更快速扩增不同来源的干细胞，让细胞的扩增速度提高3-5倍，但又不影响其分化的潜能，同时延长了传代次数，而且又能很好的保持干细胞的潜能性。

根据本发明实施例的第一个方面，提供一种干细胞培养基，包括基础细胞培养基和添加物组成；

所述基础培养基中包括注射用水或者同级别的超纯水，碳水化合物、氨基酸、维生素、甲壳素、壳聚糖、无机盐及微量元素；还包括脂类及前体，核苷、细胞生长因子及转铁蛋白，还原剂、保护剂和诱导剂；所述细胞生长因子包括人表皮生长因子hEGF、甲状腺素、肾上腺素、胰岛素中的一种或者多种；

所述添加物为乙醇胺、丁酸钠、食品添加剂和亚硒酸钠；所述乙醇胺的终浓度为9.88-10.12mg/L，所述丁酸钠的终浓度为9.73-10.27mg/L，所述转铁蛋白的终浓度为1.86-2.14mg/L。

作为优选的于，所述碳水化合物为葡萄糖、半乳糖、果糖、谷氨酰胺或丙酸铜。

作为优选的于，所述维生素是终浓度为0.2mg/L的生物素、2.46-2.71mg/L的叶酸、0.25-0.35mg/L的核黄素、2.18-2.36mg/L的泛酸钙、8.77-9.14mg/L的氯化胆碱、12.39-12.81mg/L的肌醇、1.92-2.12mg/L的烟酰胺、0.88-1.12mg/L的维生素B6以及0.56-0.80mg/L的维生素B12。

作为优选的于，所述无机盐包括Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^–、HPO₄ ^2–、H₂PO₄ ^–和HCO₃ ^–；微量元素包括铁、铜、锌、硒和锰。

作为优选的于，所述生长因子包括胰岛素和胰岛素样生长因子。

作为优选的于，所述还原剂为还原型谷胱甘肽或巯基乙醇；所述保护剂为Pluronic F68、甲基纤维素或聚乙烯醇；所述诱导剂为丁酸钠。

根据本发明实施例的第二个方面，提供一种干细胞培养基的干细胞培养方法，包括：

在基础培养基中加入500ml的注射用水或者同级别的超纯水，并加入碳水化合物、氨基酸、维生素、甲壳素、壳聚糖、无机盐及微量元素；还包括脂类及前体，核苷、细胞生长因子及转铁蛋白，还原剂、保护剂和诱导剂；得到基础培养基；

在基础培养基中依次加入终浓度为9.88-10.12mg/L的乙醇胺、终浓度为9.73-10.27mg/L的丁酸钠、终浓度为1.86-2.14mg/L食品添加剂和亚硒酸钠；将配置好的培养基避光保存在4℃的冰箱中。

根据本发明实施例的第三个方面，提供一种干细胞培养基的应用，所述培养基在诱导人间充质干细胞分化为角膜上皮细胞中的应用。

本发明提出一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法，所述基础培养基中包括注射用水或者同级别的超纯水，碳水化合物、氨基酸、维生素、甲壳素、壳聚糖、无机盐及微量元素；还包括脂类及前体，核苷、细胞生长因子及转铁蛋白，还原剂、保护剂和诱导剂；所述细胞生长因子包括人表皮生长因子hEGF、甲状腺素、肾上腺素、胰岛素中的一种或者多种；所述添加物为乙醇胺、丁酸钠、食品添加剂和亚硒酸钠；所述乙醇胺的终浓度为9.88-10.12mg/L，所述丁酸钠的终浓度为9.73-10.27mg/L，所述转铁蛋白的终浓度为1.86-2.14mg/L。该干细胞培养基能更快速扩增不同来源的干细胞，让细胞的扩增速度提高3-5倍，但又不影响其分化的潜能，同时延长了传代次数，而且又能很好的保持干细胞的潜能性。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

根据本发明实施例的第一个方面，提供干细胞培养基，包括基础细胞培养基和添加物组成；

所述基础培养基中包括注射用水或者同级别的超纯水，碳水化合物、氨基酸、维生素、甲壳素、壳聚糖、无机盐及微量元素；还包括脂类及前体，核苷、细胞生长因子及转铁蛋白，还原剂、保护剂和诱导剂；所述细胞生长因子包括人表皮生长因子hEGF、甲状腺素、肾上腺素、胰岛素中的一种或者多种；

所述添加物为乙醇胺、丁酸钠、食品添加剂和亚硒酸钠；所述乙醇胺的终浓度为9.88-10.12mg/L，所述丁酸钠的终浓度为9.73-10.27mg/L，所述转铁蛋白的终浓度为1.86-2.14mg/L。

在本实施例中，水是培养基的重要组分之一，却往往被研究人员所忽视，培养基用水品质的好坏将直接影响到细胞的生长状态。水中的污染物主要包括无机物、有机物、细菌产物(内毒素)、颗粒等。无机物包括重金属、铁、钙、氯等。有机物主要是植物腐败的副产物和洗涤剂。因此培养基用水必须经过高度纯化获得。本实施例中，培养基采用注射用水或者采用同级别的超纯水进行配制。

甲壳素(Chitin)是自然界中唯一带正电荷的碱性多糖，其含量仅次于纤维素，主要原料源于虾蟹壳。壳聚糖(Chitosan)则是甲壳素在特殊条件下脱去部分或全部乙酰基的产物。甲壳素和壳聚糖分子链上富含羟基，且后者还含有游离氨基，这些基团化学性质活泼，可发生酚化、羟、羧基化与交联等反应生成其它结构和性能都不相同的衍生物。并且两者及其一些衍生物具有良好的生物相容性、可降解性和无抗原性等特性，易与细胞结合和被人体吸收，是一种理想的细胞基质材料。壳聚糖的衍生物之一羧甲基壳聚糖具有促细胞增殖作用。

作为优选的于，所述碳水化合物为葡萄糖、半乳糖、果糖、谷氨酰胺或丙酸铜。

在本实施例中，葡萄糖是培养基中最常使用的碳水化合物，用于提供能源。然而，葡萄糖代谢会产生对细胞生长和抗体合成重要影响的副产物——乳酸。通过控制葡萄糖浓度或者采用其他能源物质(如半乳糖、果糖等)可以降低培养过程中的乳酸产量，但可能会对抗体的糖基化类型产生影响，进而影响抗体在体内的生物活性。此外，还可通过在培养基中添加丙酮酸代替谷氨酰胺作为能源物质，可以降低乳酸和氨的产量。

作为优选的于，所述维生素是终浓度为0.2mg/L的生物素、2.46-2.71mg/L的叶酸、0.25-0.35mg/L的核黄素、2.18-2.36mg/L的泛酸钙、8.77-9.14mg/L的氯化胆碱、12.39-12.81mg/L的肌醇、1.92-2.12mg/L的烟酰胺、0.88-1.12mg/L的维生素B6以及0.56-0.80mg/L的维生素B12。

作为优选的于，所述无机盐包括Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^–、HPO₄ ^2–、H₂PO₄ ^–和HCO₃ ^–；微量元素包括铁、铜、锌、硒和锰。

在本实施例中，培养基中的无机盐包括Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^–、HPO₄ ^2–、H₂PO₄ ^–和HCO₃ ^–等。其中，Na⁺、K⁺和Cl^–负责调节许多营养物质和大分子的跨膜运输；Mg²⁺是细胞间质的重要组分，同时还是酶反应的辅因子；Ca²⁺参与细胞生理活动，并调节细胞膜功能；HCO₃ ^-主要起到pH缓冲作用。通过流加NaH₂PO₄可以显著提高GS-NS0细胞密度，可能是由于磷元素是细胞磷脂、DNA和RNA的重要组成部分。

因为铁涉及众多参与DNA复制和细胞代谢的酶，铁缺陷会引起细胞周期停滞在G0或者G1期，甚至使快速分裂的细胞发生凋亡。铜离子作为培养基中重要的氧化剂，对抗体质量(二硫键形成、C末端降解、唾液酸含量等)、细胞代谢(细胞密度、乳酸含量等)都会产生重要影响。锌作为胰岛素的替代物，在无蛋白培养基开发中得到广泛应用。硒元素则是谷胱甘肽过氧化物酶的辅因子，能够保护细胞不受活性氧的伤害。锰元素作为一系列糖基转移酶重要辅因子，在抗体糖基化过程中起到关键作用，改变培养基中Mn²⁺浓度可以显著影响抗体的糖基化特征。

作为优选的于，所述生长因子包括胰岛素和胰岛素样生长因子。

作为优选的于，所述还原剂为还原型谷胱甘肽或巯基乙醇；所述保护剂为Pluronic F68、甲基纤维素或聚乙烯醇；所述诱导剂为丁酸钠。

根据本发明实施例的第二个方面，提供一种干细胞培养基的干细胞培养方法，包括：

在基础培养基中加入500ml的注射用水或者同级别的超纯水，并加入碳水化合物、氨基酸、维生素、甲壳素、壳聚糖、无机盐及微量元素；还包括脂类及前体，核苷、细胞生长因子及转铁蛋白，还原剂、保护剂和诱导剂；得到基础培养基；

在基础培养基中依次加入终浓度为9.88-10.12mg/L的乙醇胺、终浓度为9.73-10.27mg/L的丁酸钠、终浓度为1.86-2.14mg/L食品添加剂和亚硒酸钠；将配置好的培养基避光保存在4℃的冰箱中。

根据本发明实施例的第三个方面，提供一种干细胞培养基的应用，所述培养基在诱导人间充质干细胞分化为角膜上皮细胞中的应用。

本发明提出一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法，所述基础培养基中包括注射用水或者同级别的超纯水，碳水化合物、氨基酸、维生素、甲壳素、壳聚糖、无机盐及微量元素；还包括脂类及前体，核苷、细胞生长因子及转铁蛋白，还原剂、保护剂和诱导剂；所述细胞生长因子包括人表皮生长因子hEGF、甲状腺素、肾上腺素、胰岛素中的一种或者多种；所述添加物为乙醇胺、丁酸钠、食品添加剂和亚硒酸钠；所述乙醇胺的终浓度为9.88-10.12mg/L，所述丁酸钠的终浓度为9.73-10.27mg/L，所述转铁蛋白的终浓度为1.86-2.14mg/L。该干细胞培养基能更快速扩增不同来源的干细胞，让细胞的扩增速度提高3-5倍，但又不影响其分化的潜能，同时延长了传代次数，而且又能很好的保持干细胞的潜能性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的实施例的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明的实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明的实施例各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种干细胞培养基，其特征在于，包括基础细胞培养基和添加物组成；

所述基础培养基中包括注射用水或者同级别的超纯水，碳水化合物、氨基酸、维生素、甲壳素、壳聚糖、无机盐及微量元素；还包括脂类及前体，核苷、细胞生长因子及转铁蛋白，还原剂、保护剂和诱导剂；所述细胞生长因子包括人表皮生长因子hEGF、甲状腺素、肾上腺素、胰岛素中的一种或者多种；

所述添加物为乙醇胺、丁酸钠、食品添加剂和亚硒酸钠；所述乙醇胺的终浓度为9.88-10.12mg/L，所述丁酸钠的终浓度为9.73-10.27mg/L，所述转铁蛋白的终浓度为1.86-2.14mg/L。

2.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述碳水化合物为葡萄糖、半乳糖、果糖、谷氨酰胺或丙酸铜。

3.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述维生素是终浓度为0.2mg/L的生物素、2.46-2.71mg/L的叶酸、0.25-0.35mg/L的核黄素、2.18-2.36mg/L的泛酸钙、8.77-9.14mg/L的氯化胆碱、12.39-12.81mg/L的肌醇、1.92-2.12mg/L的烟酰胺、0.88-1.12mg/L的维生素B6以及0.56-0.80mg/L的维生素B12。

4.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述无机盐包括Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg^{2 +}、Cl^–、HPO₄ ^2–、H₂PO₄ ^–和HCO₃ ^–；微量元素包括铁、铜、锌、硒和锰。

5.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述还原剂为还原型谷胱甘肽或巯基乙醇；所述保护剂为Pluronic F68、甲基纤维素或聚乙烯醇；所述诱导剂为丁酸钠。

6.一种干细胞培养基的干细胞培养方法，其特征在于，包括：

在基础培养基中加入500ml的注射用水或者同级别的超纯水，并加入碳水化合物、氨基酸、维生素、甲壳素、壳聚糖、无机盐及微量元素；还包括脂类及前体，核苷、细胞生长因子及转铁蛋白，还原剂、保护剂和诱导剂；得到基础培养基；

在基础培养基中依次加入终浓度为9.88-10.12mg/L的乙醇胺、终浓度为9.73-10.27mg/L的丁酸钠、终浓度为1.86-2.14mg/L食品添加剂和亚硒酸钠；将配置好的培养基避光保存在4℃的冰箱中。

7.一种干细胞培养基的应用，其特征在于，所述培养基在诱导人间充质干细胞分化为角膜上皮细胞中的应用。