KR101735560B1

KR101735560B1 - 양이온화 아텔로콜라겐, 헤파린, 췌도세포 및 중간엽 줄기세포를 포함하는 췌도세포 이식용 복합체

Info

Publication number: KR101735560B1
Application number: KR1020150045477A
Authority: KR
Inventors: 김송철; 박시내; 고재형; 심인경
Original assignee: 재단법인 아산사회복지재단; 주식회사 다림티센
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2015-03-31
Publication date: 2017-05-16
Also published as: KR20160117827A

Abstract

본 발명은 양이온화 아텔로콜라겐, 헤파린, 췌도세포 및 중간엽 줄기세포의 복합체를 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물, 상기 복합체를 포함하는 췌도세포 이식용 조성물 및 상기 복합체를 포함하는 인공췌장에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 양이온화 아텔로콜라겐, 헤파린, 췌도세포 및 중간엽 줄기세포의 복합체를 포함하는 조성물은, 그 자체로서 인슐린을 효과적으로 분비생산할 수 있을 뿐만 아니라 췌도세포를 안정화시킬 수 있으므로, 보다 효과적인 당뇨병의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

양이온화 아텔로콜라겐, 헤파린, 췌도세포 및 중간엽 줄기세포를 포함하는 췌도세포 이식용 복합체{Complex for transplanting pancreatic islet cells comprising cationic atelocollagen, heparin, pancreatic islet cells and mesenchymal stem cells}

본 발명은 양이온화 아텔로콜라겐, 헤파린, 췌도세포 및 중간엽 줄기세포를 포함하는 췌도세포 이식용 복합체에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 담체로서 사용된 양이온화 아텔로콜라겐 상에 헤파린이 고정되어 있고, 이에 췌도세포 및 중간엽 줄기세포가 공동배양되어 있는 췌도세포 이식용 복합체, 상기 복합체를 포함하는 인공췌장 및 상기 복합체를 포함하는 인공췌장 이식용 키트에 관한 것이다.

현재 당뇨병으로 고통받고 있는 환자는 전 세계의 4.6%이며, 지속적으로 증가하여 2025년에는 6.0%를 초과할 것으로 예상되고 있다. 당뇨는 크게 1형 당뇨와 2형 당뇨로 나뉘는데 이중 1형 당뇨는 인슐린 의존성 당뇨라 일컬어진다. 췌도세포는 췌장에 존재하는 섬 모양의 특수한 조직에 존재하고 췌도세포의 한 종류인 β세포가 당대사에 필수적인 역할을 하는 인슐린을 분비하는데, 당뇨병은 면역체계가 β세포를 파괴하여 당대사에 필요한 인슐린을 생성하지 못함으로써 발생하는 일종의 자가면역질환으로 알려져 있다. 통상적으로, 상기 당뇨병을 치료하는 방법으로 인슐린을 이용한 방법이 알려져 있으나, 인슐린은 비용이 고가이고 환자가 일정 간격으로 적시에 주사하기에 불편한 문제가 많으며 과다 사용시 쇼크 등 신체 부작용이 심한 문제가 있어, 이에 대한 대안을 개발하려는 연구가 활발히 진행되었다.

최근, 췌장이식 및 췌도세포이식을 통한 당뇨병 치료가 시행되고 있다. 그러나 현재 췌도세포 이식을 위한 세포의 분리 및 배양기술은 2~4명의 공여자로부터 얻은 췌도세포로 한 명의 당뇨병환자에게 이식할 수 있는 정도이며, 이식 후 인슐린 비의존성의 유지는 10% (5년)을 넘지 못하고 있는 실정이다. 그러므로 췌도세포 분리 및 배양 조건을 최적화하고, 이식된 췌도의 손상을 최소화하여 이식 조직의 생존률을 향상시키고자 하는 연구들뿐만 아니라, 다양한 췌도세포의 증식방법, 인간 이외의 동물조직을 이용한 이종이식 등의 방법 등에 대해서도 연구를 진행하고 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제10-2003-0033638호에는 래트의 꼬리 콜라겐(rat tail collagen)과 세포외기질(ECM) 겔을 섞은 용액에 췌도 세포를 혼합하는 방식의 인공췌도세포 제조방법이 개시되어 있다.

한편, 생체에는 피부, 인대, 골, 혈관, 양막, 심막, 심장판막, 태반, 각막 등 콜라겐이 함유되어 있는 조직은 많지만 콜라겐의 종류나 그 비율은 각 조직마다 조금씩 상이하다. 특히 제1형 콜라겐은 피부, 인대, 골 등 거의 모든 조직에 다량 포함되어 있기 때문에 조직공학에서 가장 널리 이용되고 있는 세포외기질 중 하나이다. 상기 콜라겐은 여러 가지 화학적 처리를 통하여 콜라겐 고유의 성질을 변화시키는 것이 가능한데, 예를 들어 일반적으로 콜라겐은 중성의 물에서는 잘 녹지 않는 반면에, 메탄올, 에탄올, 무수숙신산, 무수아세트산 등으로 변형시킨 콜라겐은 양이온화 혹은 음이온화되어 중성의 물에서도 녹게 된다. 이러한 콜라겐은 췌도세포의 세포외 기질로서 작용하여, 췌도세포의 안정성을 향상시키는 역할을 수행할 것으로 예상되어 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국등록특허 제1327630호에는 고순도의 아텔로콜라겐을 이온화시키는 과정을 통하여 양이온화 아텔로콜라겐을 제조한 후 이를 이용하여 췌도세포를 배양하는 방법 및 췌도세포 이식용 담체를 제조하는 방법 및 이를 이용하여 제조된 인공췌장이 개시되어 있다. 그러나, 이같이 콜라겐을 사용하여 배양된 췌도세포는 매우 낮은 수준의 세포생존율 및 인슐린 분비능을 갖고 있기 때문에, 이를 개량하려는 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 보고되지 않고 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 췌도세포의 세포생존율 및 인슐린 분비능을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 양이온화 아텔로콜라겐, 헤파린, 췌도세포 및 중간엽줄기세포를 포함하는 복합체를 사용할 경우, 이에 포함된 췌도세포의 생존율이 증가하고, 인슐린 분비능을 향상시킬 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 양이온화 아텔로콜라겐, 헤파린, 췌도세포 및 중간엽 줄기세포를 포함하는 췌도세포 이식용 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 복합체를 포함하는 인공췌장을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 복합체 및 이를 수용하는 용기수단을 포함하는 인공췌장 이식용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 췌도세포의 세포생존율 및 인슐린 분비능을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 양이온화 아텔로콜라겐을 사용할 경우, 췌도세포의 배양 및 안정성을 도모할 수 있음을 확인하고, 이를 특허출원하였다(한국등록특허 제1327630호). 그러나, 상기 양이온화 아텔로콜라겐을 사용할 경우에는 보다 효과적으로 췌도세포를 배양하고 안정화시킬 수 있을 뿐, 췌도세포의 인슐린 분비능을 향상시킬 수는 없었기 때문에, 이를 개량하여 췌도세포의 세포생존율 및 인슐린 분비능을 향상시키고자 하였다. 이에, 상기 양이온화 아텔로콜라겐에서 배양된 췌도세포에 다양한 물질을 가하여, 목적하는 효과를 나타내는 물질을 검색한 결과, 상기 양이온화 아텔로콜라겐에 헤파린을 첨가하고, 상기 췌도세포와 중간엽 줄기세포를 공배양한 형태의 조성물을 사용할 경우, 췌도세포의 세포생존율 및 인슐린 분비능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 조성물을 당뇨병 모델동물에 이식한 결과, 중간엽 줄기세포의 함량이 증가할 수록 췌도세포의 세포생존율 및 인슐린 분비능이 향상됨을 확인하였다. 이처럼, 췌도세포의 배양시에 헤파린 및 중간엽 줄기세포를 사용하여, 췌도세포의 세포생존율 및 인슐린 분비능을 향상시키는 기술은 지금까지 보고되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.

상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 양이온화 아텔로콜라겐, 헤파린, 췌도세포 및 중간엽 줄기세포를 포함하는 췌도세포 이식용 복합체에 있어서, 담체로서 사용된 양이온화 아텔로콜라겐 상에 헤파린이 고정되어 있고, 이에 췌도세포 및 중간엽 줄기세포가 공동배양되어 있는 췌도세포 이식용 복합체를 제공한다.

본 발명의 용어 "양이온화된 아텔로콜라겐(cationic atelocollagen)" 이란, 양이온으로 대전되고, 제1형 콜라겐 분자의 양쪽 말단에 존재하는 "텔로펩타이드(telopeptide)" 부분이 제거된 콜라겐을 의미한다. 상기 아텔로콜라겐에서 제거된 텔로펩타이드는 나선을 형성하지 않고, 면역반응을 일으키는 주된 원인이 되기 때문에, 의약품이나 화장품 등의 원료로 사용 시에는 이 부분을 제거하여 사용하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 양이온화된 아텔로콜라겐은 췌도세포가 배양되기 위한 기반물질로서 사용되는데, 췌도세포를 이식하고자 하는 생체내 조직에 적합하도록 비드, 튜브, 시트 등의 다양한 형태로 제조될 수 있고, 기계적 강도 및 효소에 의한 분해 저항성을 향상시키기 위하여 가교제에 의해 가교화 될 수 있다. 이때, 상기 가교제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서, EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride) 또는 글루타르 알테이드를 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "헤파린(heparin)"이란, 황산기를 갖고, 약 2만Da의 분자량을 갖는 산성 다당류의 일종을 의미하는데, 구조적으로는 D-글루코사민과 D-글루쿠론산이 α-1,4의 결합으로 교대로 사슬형상을 구성하고, 황산이 글루코사민의 N과 6위치 및 1개 걸러 글루쿠론산의 2위치에 결합하고 있으며, 기능적으로는 혈액응고 저지작용을 나타낸다고 알려져 있다. 상기 헤파린은 고등동물의 간이나 폐 등 모세혈관이 많은 장기 및 혈액 속에 존재한다고 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 헤파린은 상기 양이온화된 아텔로콜라겐 상에 고정되어, 중간엽 줄기세포에서 생성되는 성장인자와 결합, 성장인자의 활성과 반감기를 향상시켜 췌도세포의 기능과 활성을 증가시킬 수 있다. 이때, 상기 양이온화된 아텔로콜라겐 상에 고정되는 헤파린의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서, 양이온화된 아텔로콜라겐의 중량대비 0.01 내지 1.2%(w/w)가 될 수 있고, 다른 예로서, 양이온화된 아텔로콜라겐의 중량대비 1%(w/w)가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "췌도세포(pancreatic islet cell)" 란, "랑게르한스섬(langerhans islets)"이라고도 호칭되며, 췌장에 존재하고, 글루카곤 및 인슐린을 분비하는 내분비세포의 군집을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 췌도세포는 당뇨병을 치료할 수 있는 인슐린을 생산하는 세포인 것으로 해석될 수 있는데, 상기 췌도세포는 중간엽 줄기세포와 함께 상기 양이온화된 아텔로콜라겐 상에 고정된 헤파린에 접종되고, 함께 혼합배양되어 부착된 형태를 나타냄으로써, 췌도세포 이식용 복합체를 형성할 수 있다.

본 발명의 용어 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cells; MSCs)"란, 자가 재생능력이 뛰어나고, 간, 골, 연골, 지방, 혈관, 심장, 신경계 등과 같은 다양한 세포로 분화될 수 있는 미분화된 성체줄기세포를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 췌도세포의 배양시에 필요한 다양한 성장인자를 제공하기 위한 원천으로서 사용되는데, 상기 중간엽 줄기세포는 췌도세포와 함께 상기 양이온화된 아텔로콜라겐 상에 고정된 헤파린에 접종되고, 함께 혼합배양되어 부착된 형태를 나타냄으로써, 췌도세포 이식용 복합체를 형성할 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 지방유래 중간엽 줄기세포, 골수유래 중간엽 줄기세포, 구강유래 중간엽 줄기세포 등의 다양한 성체줄기세포가 사용될 수 있다. 일 례로서, 본 발명에서는 상기 중간엽 줄기세포로서 지방유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stromal cells; ADMSC)를 사용하였다. 상기 지방유래 중간엽 줄기세포는 다른 종류의 중간엽 줄기세포와 비교하여 대량으로 추출할 수 있는 지방조직으로부터 수득할 수 있다는 점에서 취득과정이 용이하고 안전하며, 조직수급상의 제한이 없는 장점과 체외배양이 용이하여 조직 접근성, 안정성, 유효성, 그리고 경제적 측면에서 장점이 있다. 상기 췌도세포에 대한 중간엽 줄기세포의 비율은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서 췌도세포 4,000 IEQ 당 10³ 세포수 이상의 중간엽 줄기세포의 비율이 될 수 있고, 다른 예로서 췌도세포 4,000 IEQ 당 10³ 내지 10⁶ 세포수의 중간엽 줄기세포의 비율이 될 수 있으며, 또 다른 예로서 췌도세포 4,000 IEQ 당 10⁵세포수의 중간엽 줄기세포의 비율이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "췌도세포 이식용 복합체"란, 담체로서 사용된 상기 양이온화 아텔로콜라겐 상에 헤파린이 고정되고, 이에 췌도세포 및 중간엽 줄기세포가 공동배양되어 형성된 형태의 복합체를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 복합체는 양이온화 아텔로콜라겐 상에 헤파린이 고정되고 상기 헤파린에 췌도세포와 중간엽 줄기세포가 동시에 접종되고, 이를 공동배양하여 두 종류의 세포가 혼합된 형태로 구성되거나 또는 상기 췌도세포와 중간엽 줄기세포가 순차적으로 접종되고 이를 각각 배양하여 두 종류의 세포가 층상으로 구별된 상태로 구성될 수도 있다. 이때, 상기 헤파린의 함량은 양이온화 아텔로콜라겐 중량의 1%(w/w)이고, 중간엽 줄기세포의 비율은 췌도세포 1 IEQ 당 25세포수가 될 수 있다.

상기 복합체에 포함된 췌도세포는 이와 공배양된 중간엽 줄기세포에 의하여 인슐린 분비의 측면에서 정상적인 췌도세포와 동일한 기능을 나타낼 수 있으므로, 상기 복합체는 당뇨병을 치료하기 위한 인공췌장의 유효성분으로 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 양이온화 아텔로콜라겐 또는 상기 콜라겐과 헤파린이 처리된 조건에서 췌도세포 또는 췌도세포/ADMSC를 배양한 결과, 췌도세포를 단독으로 배양할 경우보다는 췌도세포/ADMSC를 공배양할 경우에 췌도세포의 생존능이 증가하고, 양이온화 아텔로콜라겐을 단독으로 처리할 경우보다는 양이온화 아텔로콜라겐과 헤파린을 동시에 처리할 경우에 췌도세포의 생존능이 증가함을 확인하였다(도 1). 이에, 글루코스 자극을 통하여 상기 배양된 췌도세포에서 인슐린 분비를 유도한 결과, 췌도세포를 단독으로 배양할 경우보다는 췌도세포/ADMSC를 공배양할 경우에 췌도세포에서 분비된 인슐린의 함량이 증가하고, 양이온화 아텔로콜라겐을 단독으로 처리할 경우보다는 양이온화 아텔로콜라겐과 헤파린을 동시에 처리할 경우에 췌도세포에서 분비된 인슐린의 함량이 증가하고(도 2), 췌도세포의 생존율이 증가함(도 3)을 확인하였다. 이에, 상기 조성물의 당뇨병 치료효과를 동물모델을 이용하여 검증한 결과, 상기 조성물이 이식되지 않은 동물모델은 폐사하였으나, 상기 조성물이 이식된 동물모델은 정상적인 혈당수준을 나타냄을 확인하였다(도 4a 및 4b). 또한, 상기 조성물에 있어서, 중간엽 줄기세포의 함량이 증가할 수록 인슐린 분비량이 증가하고, 이에 따라 당뇨병 치료효율도 증가함을 확인하였다(도 5 및 6).

본 발명은 다른 양태로서 상기 복합체를 포함하는 비드형태의 담체를 포함하는 인공췌장을 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 상기 복합체는 그 자체로서 인슐린을 생산할 수 있기 때문에, 상기 복합체를 시트의 형태로 구성하거나 또는 상기 복합체를 양이온화 아텔로콜라겐 및 알지네이트를 포함하는 비드(양이온화 아텔로콜라겐/알지네이트 비드) 형태로 제작하여 이를 인공췌장으로 사용할 수 있다. 이때, 상기 비드 상에 폴리-L-리신을 도포하여 형성시킨 면역 장벽(immune barrier)을 추가로 포함할 수 있는데, 상기 면역 장벽은 분자량이 큰 면역관련 물질은 통과시키지 않고, 저분자량의 산소, 인슐린, 포도당 등을 통과시켜서 선별적인 통과가 가능하게 한다. 상기 면역 장벽은 그의 효율을 향상시키기 위하여, 알지네이트 코팅을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 양태로서 상기 복합체 및 상기 복합체를 수용하기 위한 용기수단을 포함하는 인공췌장 이식용 키트를 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 복합체에 포함된, 양이온화 아텔로콜라겐은 췌도세포가 생존할 수 있는 기반을 형성하고, 중간엽 줄기세포는 췌도세포가 정상적인 췌도세포와 동일한 형태로 배양되도록 뒷받침하며, 상기 헤파린은 상기 중간엽 줄기세포의 배양을 보조하는 역할을 수행하므로, 상기 4가지 성분을 모두 포함하는 복합체는 췌도세포를 이식하여 정상적인 인슐린을 분비함으로써 당뇨병을 치료할 수 있는 인공췌장 이식용 키트의 유효성분으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 당뇨병 치료용 인공췌장 이식용 키트는 상기 복합체에 포함된 췌도세포의 세포 생존성 및 인슐린 분비능을 유지하는데 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 당뇨병 치료용 인공췌장 이식용 키트의 유효성분인 상기 복합체는 췌도세포가 존재하는 인슐린 부위 뿐만 아니라 체내에서 인슐린을 혈액으로 분비하기에 적합한 다양한 조직에 이식할 수 있고, 상기 조직은 특별히 이에 제한되지 않으나 일 례로서, 간, 비장, 신장, 복강 등이 될 수 있다.

본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 복합체 또는 인공췌장을 당뇨병이 발병된 개체에 이식하는 단계를 포함하는 당뇨병의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "개체"란 당뇨병이 발병된 쥐, 가축, 사람 등을 포함하는 포유동물이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명의 복합체 또는 인공췌장을 당뇨병이 발병된 개체에 이식하여 당뇨병의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 당뇨병을 치료하는 방법에 있어서, 상기 복합체 또는 인공췌장의 이식은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 수행될 수 있다. 본 발명의 복합체 또는 인공췌장은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 혈관내 이식, 근육내 이식, 피하 이식, 피내 이식 등의 경로로 이식될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 양이온화 아텔로콜라겐, 헤파린, 췌도세포 및 중간엽 줄기세포의 복합체는 그 자체로서 인슐린을 효과적으로 분비생산할 수 있을 뿐만 아니라 췌도세포를 안정화시킬 수 있으므로, 보다 효과적인 당뇨병의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 양이온화 아텔로콜라겐 또는 상기 콜라겐과 헤파린이 처리된 조건에서 췌도세포 또는 췌도세포/ADMSC를 배양한 결과를 나타내는 현미경 사진으로서, EC는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리된 조건에서 췌도세포를 배양한 결과를 나타내고, MEC는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리된 조건에서 췌도세포/ADMSC를 공배양한 결과를 나타내며, MHEC는 양이온화 아텔로콜라겐과 헤파린이 처리된 조건에서 췌도세포/ADMSC를 공배양한 결과를 나타내고, C는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리되지 않은 조건에서 췌도세포를 단독으로 배양한 대조군을 나타낸다.
도 2는 양이온화 아텔로콜라겐 또는 상기 콜라겐과 헤파린이 처리된 조건에서 췌도세포 또는 췌도세포/ADMSC를 배양한 후, 글루코스 자극을 통해 배양된 췌도세포에서 분비된 인슐린의 함량을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, EC는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리된 조건에서 췌도세포를 배양한 결과를 나타내고, MEC는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리된 조건에서 췌도세포/ADMSC를 공배양한 결과를 나타내며, MHEC는 양이온화 아텔로콜라겐과 헤파린이 처리된 조건에서 췌도세포/ADMSC를 공배양한 결과를 나타내고, C는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리되지 않은 조건에서 췌도세포를 단독으로 배양한 대조군을 나타낸다.
도 3은 양이온화 아텔로콜라겐 또는 상기 콜라겐과 헤파린이 처리된 조건에서 췌도세포 또는 췌도세포/ADMSC를 배양한 후, 배양된 췌도세포의 IEQ 값을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, EC는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리된 조건에서 췌도세포를 배양한 결과를 나타내고, MEC는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리된 조건에서 췌도세포/ADMSC를 공배양한 결과를 나타내며, MHEC는 양이온화 아텔로콜라겐과 헤파린이 처리된 조건에서 췌도세포/ADMSC를 공배양한 결과를 나타내고, C는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리되지 않은 조건에서 췌도세포를 단독으로 배양한 대조군을 나타낸다.
도 4a는 사육기간의 경과에 따른 당뇨병 동물모델의 혈당수준을 나타내는 그래프이고,
도 4b는 사육기간의 경과에 따른 당뇨병 동물모델의 체중을 나타내는 그래프이다.
도 5a는 당뇨병 치료에 미치는 ADMSC의 효과를 검증한 결과를 나타내는 그래프로서, (○)는 4,000 IEQ의 췌도세포를 포함하는 복합체가 이식된 당뇨병 동물모델의 혈당수준을 나타내고, (●)는 4,000 IEQ의 췌도세포와 1 X 10² 세포수의 ADMSC를 포함하는 복합체가 이식된 당뇨병 동물모델의 혈당수준을 나타내며, (▼)는 4,000 IEQ의 췌도세포와 1 X 10³ 세포수의 ADMSC를 포함하는 복합체가 이식된 당뇨병 동물모델의 혈당수준을 나타내고, (△)는 4,000 IEQ의 췌도세포와 1 X 10⁴ 세포수의 ADMSC를 포함하는 복합체가 이식된 당뇨병 동물모델의 혈당수준을 나타내며, (■)는 4,000 IEQ의 췌도세포와 1 X 10⁵ 세포수의 ADMSC를 포함하는 복합체가 이식된 당뇨병 동물모델의 혈당수준을 나타낸다.
도 5b는 상이한 함량비의 ADMSC를 포함하는 췌도세포 복합체가 이식된 당뇨병 동물모델에서의 30일간의 혈당 수준 변화를 나타내는 상기 도 5a의 혈당 그래프의 곡선하 면적 AUC(area under the curve)를 비교한 그래프이다.
도 6은 서로 다른 함량의 ADMSC를 포함하는 복합체에 의한 당뇨병 치료후, 사육시간의 경과에 따른 정상 동물과 고혈당 동물의 비율변화를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 양이온화 아텔로콜라겐의 제조

실시예 1: 콜라겐 지지체 상에서의 췌도세포와 중간엽 줄기세포( MSC )의 공배양

먼저, 공지된 방법에 따라, 양이온화 아텔로콜라겐을 제조하였다(한국등록특허 제1158338호). 구체적으로, 70 내지 90% 에탄올에 1 내지 5 중량%의 아텔로콜라겐, 0.5 내지 1 M의 초산을 가하여 pH 2 내지 4로 조절한 다음, 4℃에서 10일 동안 교반하여 아텔로콜라겐 분산액을 수득하였다. 상기 수득한 아텔로콜라겐 분산액에 0.5 M NaOH를 가하여 pH 7.4로 적정하고, 이를 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물에 침전물 1 g당 100 ㎖의 물을 가하여 교반하고, 이를 투석용 막에 넣은 후, 물을 사용하여 16 내지 24시간 동안 투석하였다. 투석이 종료된 후, 이를 동결건조하여 양이온화 아텔로콜라겐을 제조하였다.

다음으로, 상기 제조한 양이온화 아텔로콜라겐을 0.1 M 초산에 용해시켜서, 1%(w/v)의 양이온화 아텔로콜라겐 용액을 수득하고, 상기 수득한 양이온화 아텔로콜라겐 용액을 다중웰 배양용기의 각 웰에 도포한 다음, 건조시켜서, 상기 각 웰에 양이온화 아텔로콜라겐을 코팅하였다. 이어, 상기 코팅된 각 웰에 20 mM EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride) 용액을 가하고 4시간 동안 반응시켜서, 상기 양이온화 아텔로콜라겐의 가교화를 유도하였다. 반응이 종료된 후, 각 웰을 증류수로 10분씩 5회 세척하여, 상기 각 웰에 콜라겐 지지체를 형성시켰다.

또한, 20 mM EDC와 7.8 mM NHS(N-hydroxysuccinimide)를 포함하는 50 mM MES(4-Morpholineethanesulfonic acid)완충액에 1% (w/v)의 헤파린을 용해시켜서, 헤파린 용액을 수득하고, 상기 헤파린 용액을 상기 지지체가 형성된 웰에 가하여 2시간 동안 반응시킨 후 정제수로 10분씩 5회 세척하였다. 상기 양이온화 아텔로콜라겐 및 헤파린이 도포된 각 웰에 Sprague Dawley rat 에서 분리한 100 IEQ 의 췌도세포 또는 상기 췌도세포와 지방조직유래 중간엽 줄기세포(ADMSC, 5 X 10⁴ 세포수)의 혼합물을 접종하고, 배양액(10% FBS와 1% 항생제를 포함하는 RPMI-1640 배양액) 1 ㎖을 가한 다음, 2-3일 마다 배양액을 교체하면서 37℃의 CO₂ 배양기에서 1주일간 배양하였다(도 1).

도 1은 양이온화 아텔로콜라겐 또는 상기 콜라겐과 헤파린이 처리된 조건에서 췌도세포 또는 췌도세포/ADMSC를 배양한 결과를 나타내는 현미경 사진으로서, EC는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리된 조건에서 췌도세포를 배양한 결과를 나타내고, MEC는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리된 조건에서 췌도세포/ADMSC를 공배양한 결과를 나타내며, MHEC는 양이온화 아텔로콜라겐과 헤파린이 처리된 조건에서 췌도세포/ADMSC를 공배양한 결과를 나타내고, C는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리되지 않은 조건에서 췌도세포를 단독으로 배양한 대조군을 나타낸다. 도 1에서 보듯이, 췌도세포를 단독으로 배양할 경우보다는 췌도세포/ADMSC를 공배양할 경우에 췌도세포의 생존능이 증가하고, 양이온화 아텔로콜라겐을 단독으로 처리할 경우보다는 양이온화 아텔로콜라겐과 헤파린을 동시에 처리할 경우에 췌도세포의 생존능이 증가함을 확인하였다.

실시예 2: 글루코스 자극을 통한 췌도세포의 인슐린 분비 유도

상기 실시예 1에서 배양된 췌도세포를 KRHB(Kreb's and Ringer's HEPES Bicarbonate, pH 7.4) 완충액으로 세척하고, 다시 KRHB 완충액 1 ㎖를 가하여 37℃에서 30분간 배양한 다음, 3.3 mM 또는 20 mM의 글루코스를 포함하는 KRHB 완충액 1㎖를 가한여 37℃의 에서 1시간 동안 배양하였으며, 이로부터 배양액을 수득하였다. 상기 수득한 배양액을 1/100으로 희석하여 검사시료를 수득하고, 상기 검사시료를 인슐린 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 키트에 가하여 이에 포함된 인슐린의 함량을 측정하였다(도 2).

도 2는 양이온화 아텔로콜라겐 또는 상기 콜라겐과 헤파린이 처리된 조건에서 췌도세포 또는 췌도세포/ADMSC를 배양한 후, 글루코스 자극을 통해 배양된 췌도세포에서 분비된 인슐린의 함량을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, EC는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리된 조건에서 췌도세포를 배양한 결과를 나타내고, MEC는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리된 조건에서 췌도세포/ADMSC를 공배양한 결과를 나타내며, MHEC는 양이온화 아텔로콜라겐과 헤파린이 처리된 조건에서 췌도세포/ADMSC를 공배양한 결과를 나타내고, C는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리되지 않은 조건에서 췌도세포를 단독으로 배양한 대조군을 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 글루코스의 처리농도에 상관없이 췌도세포를 단독으로 배양할 경우보다는 췌도세포/ADMSC를 공배양할 경우에 췌도세포에서 분비된 인슐린의 함량이 증가하고, 양이온화 아텔로콜라겐을 단독으로 처리할 경우보다는 양이온화 아텔로콜라겐과 헤파린을 동시에 처리할 경우에 췌도세포에서 분비된 인슐린의 함량이 증가함을 확인하였다. 특히, 고농도(20 mM)의 글루코스 처리시에는 대조군에 비하여 MHEC 만이 인슐린의 분비량이 유의하게 증가함을 확인하였다.

실시예 3: 췌도세포 생존율 평가

상기 실시예 1에서 배양된 각 췌도세포의 IEQ 값을 산출하고, 이를 비교하였다. IEQ 계수는 췌도세포를 그 크기에 따라 50 내지 100 ㎛, 100 내지 150 ㎛, 150 내지 200 ㎛, 200 내지 250 ㎛, 250 내지 300 ㎛, 300 내지 350 ㎛, 350 내지 400 ㎛ 및 400 ㎛ 이상의 8개 항목으로 구분하고, 각 크기범위의 세포수를 계수한 다음, 각 세포수에 크기에 따라 정해진 상수값(1/6, 1/1.5, 1.7, 3.4, 6.3, 10, 15.8 및 23)을 곱한 값을 합산하여 산출하였다(도 3).

도 3은 양이온화 아텔로콜라겐 또는 상기 콜라겐과 헤파린이 처리된 조건에서 췌도세포 또는 췌도세포/ADMSC를 배양한 후, 배양된 췌도세포의 IEQ 값을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, EC는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리된 조건에서 췌도세포를 배양한 결과를 나타내고, MEC는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리된 조건에서 췌도세포/ADMSC를 공배양한 결과를 나타내며, MHEC는 양이온화 아텔로콜라겐과 헤파린이 처리된 조건에서 췌도세포/ADMSC를 공배양한 결과를 나타내고, C는 양이온화 아텔로콜라겐이 처리되지 않은 조건에서 췌도세포를 단독으로 배양한 대조군을 나타낸다. 도 3에서 보듯이, 췌도세포를 단독으로 배양할 경우보다는 췌도세포/ADMSC를 공배양할 경우에 췌도세포의 IEQ 값이 증가하고, 양이온화 아텔로콜라겐을 단독으로 처리할 경우보다는 양이온화 아텔로콜라겐과 헤파린을 동시에 처리할 경우에 췌도세포의 IEQ 값이 증가함을 확인하였다.

실시예 4: 동물모델을 이용한 당뇨병 치료효과 검증

상기 실시예 1 내지 3의 결과로부터, 양이온화 아텔로콜라겐과 헤파린을 동시에 처리한 조건에서 췌도세포/ADMSC를 공배양할 경우에 췌도세포의 생존율과 이로부터 분비되는 인슐린의 함량이 가장 높은 수준을 나타냄을 확인하였으므로, 이러한 효과를 동물실험을 통해 검증하였다.

실시예 4-1: 양이온화 아텔로콜라겐 , 헤파린 및 췌도세포 / ADMSC 를 포함하는 복합체의 치료효과

먼저, 8~12 주령의 누드마우스(athymic Balb/c mouse)의 복강 내에 스트렙토조톡신(streptozotoxin)을 250 mg/체중 1 kg의 용량으로 주사하여 당뇨를 유도하고 당뇨유도 후 3일 연속 혈당이 300 mg/dl의 이상인 개체를 선택하여 당뇨병 동물모델로 사용하였다.

다음으로, 상기 실시예 1의 방법으로 헤파린이 처리된 양이온화 아텔로콜라겐 지지체를 제작하고, 랫트에서 분리된 4,000 IEQ의 췌도세포와 1 X 10⁴ 또는 1 X 10⁵ 세포수의 ADMSC의 24시간 동안 공배양하여 수득한 배양물을 상기 지지체에 가하여, 헤파린 고정 양이온화 콜라겐/췌도세포/MSC 복합체를 수득하였다.

한편, 상기 당뇨병 동물모델의 복강 내에 졸레틸 30 mg/kg 과 럼푼 10 mg/kg을 주사하여 마취를 유도하고, 이의 등쪽 피부를 소독한 다음 약 2 cm 가량 절개한 후 피부와 근육층 사이에 공간을 형성하였으며, 상기 형성된 공간에 상기 수득한 각각의 헤파린 고정 양이온화 콜라겐/췌도세포/MSC 복합체를 이식한 다음, 피부를 봉합하였다. 이어, 상기 처리된 각 동물모델을 100일 동안 사육하면서, 혈당 및 체중을 측정하였다(도 4a 및 4b). 이때, 대조군으로는 상기 복합체를 이식하지 않은 당뇨병 동물모델을 사용하였다.

도 4a는 사육기간의 경과에 따른 당뇨병 동물모델의 혈당수준을 나타내는 그래프이고, 도 4b는 사육기간의 경과에 따른 당뇨병 동물모델의 체중을 나타내는 그래프로서, (○) 및 (●)는 헤파린 고정 양이온화 콜라겐/췌도세포/MSC 복합체를 이식하지 않은 당뇨병 동물모델을 나타내고, (△)는 헤파린 고정 양이온화 콜라겐/췌도세포/MSC 복합체를 이식하고 사육한 다음, 90일이 경과한 후에 이식된 복합체를 제거한 당뇨병 동물모델을 나타내며, (▼)는 헤파린 고정 양이온화 콜라겐/췌도세포/MSC 복합체를 이식하고 105일 동안 사육한 당뇨병 동물모델을 나타낸다.

도 4a 및 4b에서 보듯이, 상기 복합체가 이식되지 않은 대조군(○ 및 ●)은 당뇨유도 5일 안에 모두 폐사한 반면, 상기 복합체가 이식된 당뇨병 동물모델은 정상적인 혈당(200 mg/dl)을 유지하면서 생존함을 확인하였다. 그러나, 상기 복합체를 제거한 경우, 10일 이내에 당뇨병 동물모델의 혈당수준이 급격하게 증가하고, 체중은 급격히 감소하여 폐사됨을 확인하였다.

실시예 4-2: 양이온화 아텔로콜라겐 , 헤파린 및 췌도세포 / ADMSC 를 포함하는 복합체의 치료효과에 미치는 ADMSC 의 영향

당뇨병 동물모델에 이식된 복합체로서, 상기 실시예 4-1에서 사용된 각각의 복합체 또는 ADMSC를 포함하지 않고 양이온화 아텔로콜라겐, 헤파린 및 췌도세포로 구성된 복합체를 사용한 경우, 혈당수준의 변화를 비교하였다(도 5a 및 5b).

도 5a는 당뇨병 치료에 미치는 ADMSC의 효과를 검증한 결과를 나타내는 그래프로서, (○)는 4,000 IEQ의 췌도세포를 포함하는 복합체가 이식된 당뇨병 동물모델의 혈당수준을 나타내고, (●)는 4,000 IEQ의 췌도세포와 1 X 10² 세포수의 ADMSC를 포함하는 복합체가 이식된 당뇨병 동물모델의 혈당수준을 나타내며, (▼)는 4,000 IEQ의 췌도세포와 1 X 10³ 세포수의 ADMSC를 포함하는 복합체가 이식된 당뇨병 동물모델의 혈당수준을 나타내고, (△)는 4,000 IEQ의 췌도세포와 1 X 10⁴ 세포수의 ADMSC를 포함하는 복합체가 이식된 당뇨병 동물모델의 혈당수준을 나타내며, (■)는 4,000 IEQ의 췌도세포와 1 X 10⁵ 세포수의 ADMSC를 포함하는 복합체가 이식된 당뇨병 동물모델의 혈당수준을 나타낸다. 도 5a에서 보듯이, 췌도세포를 단독으로 포함하는 복합체를 이식하거나 또는 4,000 IEQ의 췌도세포와 1 X 10² 세포수의 ADMSC를 포함하는 복합체를 이식할 경우에는 약 300mg/dl의 고혈당수준이 유지되었으나, 4,000 IEQ의 췌도세포와 1 X 10³ 세포수 이상의 ADMSC를 포함하는 복합체를 이식할 경우에는 이식후 7일까지는 고혈당 상태를 유지하다가 그 후에는 정상혈당으로 회복됨을 확인하였다. 특히, 췌도세포를 단독으로 포함하는 복합체를 이식할 경우에는 약 400mg/dl 이상의 고혈당수준을 유지하다가 대부분 폐사됨을 확인하였다(one-way ANOVA, * p<0.01 (n=4)).

도 5b는 상이한 함량비의 ADMSC를 포함하는 췌도세포 복합체가 이식된 당뇨병 동물모델에서의 30일간의 혈당 수준 변화를 나타내는 상기 도 5a의 혈당 그래프의 곡선하 면적 AUC(area under the curve)를 비교한 그래프이다. 도 5b에서 보듯이, 4,000 IEQ의 췌도세포를 포함하는 복합체, 4,000 IEQ의 췌도세포와 1 X 10² 세포수의 ADMSC를 포함하는 복합체를 이식한 경우의 혈당 AUC에 비해, 4,000 IEQ의 췌도세포와 1 X 10³ 세포수의 ADMSC를 포함하는 복합체를 이식한 경우의 혈당 AUC가 통계적으로 유의하게 감소되었고, 4,000 IEQ의 췌도세포와 1 X 10³ 세포수의 ADMSC를 포함하는 복합체를 이식한 경우와 4,000 IEQ의 췌도세포와 1 X 10⁴ 세포수의 ADMSC를 포함하는 복합체를 이식한 경우의 혈당 AUC는 동일한 수준을 나타내었다(one-way ANOVA, *, §, ¶, † p<0.05 (n=4)).

따라서, 4,000 IEQ의 췌도세포와 공배양되는 ADMSC는 1 X 10³ 세포수 이상일 경우에 임계적인 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 4-3: 양이온화 아텔로콜라겐 , 헤파린 및 췌도세포 / ADMSC 를 포함하는 복합체가 이식된 당뇨병 동물모델의 정상/고혈당의 비율

당뇨병 동물모델에 이식된 복합체로서, 상기 실시예 4-1에서 사용된 각각의 복합체를 이식한 당뇨병 동물모델에서 사육시간의 경과에 따른, 정상 동물과 고혈당 동물의 비율변화를 측정하였다(도 6).

도 6은 서로 다른 함량의 ADMSC를 포함하는 복합체에 의한 당뇨병 치료후, 사육시간의 경과에 따른 정상 동물과 고혈당 동물의 비율변화를 나타내는 그래프이다. 도 6에서 보듯이, 4,000 IEQ의 췌도세포와 공배양되는 ADMSC는 1 X 10³ 세포수 이상일 경우에 거의 대부분의 개체가 이식 직후 정상 혈당으로 회복되었으나, 4,000 IEQ의 췌도세포와 공배양되는 ADMSC가 1 X 10² 세포수 이하일 경우에는 정상혈당으로 회복되지 못함을 확인하였다.

Claims

양이온화 아텔로콜라겐, 헤파린, 췌도세포 및 지방유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 췌도세포 이식용 복합체로서, 상기 췌도세포와 지방유래 중간엽 줄기세포는 헤파린이 고정된 양이온화 아텔로콜라겐 상에 공동배양되어 있는 것인 췌도세포 이식용 복합체.
제1항에 있어서,
상기 양이온화 아텔로콜라겐은 비드, 튜브 또는 시트 형태인 것인 복합체.
제1항에 있어서,
상기 양이온화 아텔로콜라겐은 가교제로 가교된 것인 복합체.
제1항에 있어서,
상기 헤파린은 양이온화 아텔로콜라겐 상에 양이온화 아텔로콜라겐 중량대비 0.01 내지 1.2%(w/w)의 함량으로 고정된 것인 복합체.
제1항에 있어서,
상기 췌도세포 및 지방유래 중간엽 줄기세포는 양이온화 아텔로콜라겐 상에 혼합 배양되어 부착된 것인 복합체.
제1항에 있어서,
상기 췌도세포 및 지방유래 중간엽 줄기세포는 양이온화 아텔로콜라겐 상에 순차적으로 배양되어 층상으로 부착된 것인 복합체.
제1항에 있어서,
상기 췌도세포 및 지방유래 중간엽 줄기세포는 췌도세포 4,000 IEQ 당 10³ 이상의 세포수의 지방유래 중간엽 줄기세포가 양이온화 아텔로콜라겐 상에 공동배양되어 부착된 것인 복합체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 인공췌장.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 복합체 및 이를 수용하는 용기수단을 포함하는 인공췌장 이식용 키트.