CN106421925B - 基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法 - Google Patents

基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，包括如下步骤：将糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶溶解于酸性缓冲溶液中，配制成质量分数为10％～50％的溶液后，去除溶液中的氧气，然后依次向溶液中加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基丁二酰亚胺，去除氧气后活化15分钟～45分钟；将多臂聚氧乙烯胺和/或多臂聚乙二醇胺溶解于水中并去除氧气，然后加入到上述溶液中，室温下反应30分钟～120分钟；向上述溶液中加入荧光染色试剂，避光反应25分钟～35分钟；将上述溶液冷冻干燥，以得到胰岛培养支架。本发明操作简便易行，反应条件温和，适于工业化或临床应用。

Description

基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制 备方法
技术领域
本发明涉及一种基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法。
背景技术
1型糖尿病是一种自身免疫性疾病。该疾病由机体免疫系统功能障碍，导致胰岛β-细胞坏死，引起糖代谢功能障碍。尽管据International Diabetes Federation(IDF)统计，1型糖尿病患者仅占总糖尿病患者的10％。但1型糖尿病发病较早，多发于儿童及青少年，因此患病时间较长，如血糖控制不当会引发包括心脏、肾脏、肝脏、神经及眼部等多重器官并发症，严重影响患者的生活质量并对社会及家庭造成巨大经济负担。目前，注射胰岛素是主要的治疗1型糖尿病的方法，该方法虽可以有效控制患者血糖，却无法根治1型糖尿病，也无法对患者代谢功能紊乱等做出更为精准的控制。另外，长期服用胰岛素也会造成体重增加，不利于进行血糖检测及对其他心血管并发症的调控。
胰岛移植可被认为是治疗1型糖尿病手段中最具有潜力的治愈性治疗手段。自2000年Edmonton胰岛移植方法成功使7名糖尿病患者实现100％脱离对胰岛素的依赖后，胰岛移植这一手段成为有可能完全治愈1型糖尿病最具潜力的途径。但Edmonton protocol主要通过直接向肝脏门静脉注射胰岛的方法进行胰岛移植，随后的临床结果表明，在接受治疗的糖尿病患者中，胰岛移植术后，超过90％的患者在5年内均病情复发，重新进行胰岛素治疗。导致病情复发的主要原因在于移植后的胰岛在患者体内，因胰岛移植位置、免疫反应等诸多原因无法及时完成血运重建，导致胰岛流失加速，从而加大胰岛移植手术在所需胰岛数量上的要求。而胰岛移植手术的另一个瓶颈恰恰是供体数量有限，因此造成恶性循环，使目前胰岛移植无法前行。因此如何完善胰岛移植手段，使胰岛能够更好的被纳入接受移植患者的循环系统，从而解决胰岛流失问题，是现阶段针对胰岛移植研究的重点方向。
采用生物材料辅助胰岛移植的相关研究也在近年来被广泛关注。目前胰岛移植所采用的生物材料众多且各有优缺，可大体分为包裹型材料和半包裹型材料两大类。半包裹材料中的多孔支架类生物材料，能够为胰岛移植创造除传统移植点之外的新移植部位，但无法从根本解决接受胰岛移植患者免疫排斥等基本问题。包裹型材料包括水凝胶、微胶囊等，因为这类材料可以将胰岛完全包裹，因此能够解决移植手术后患者机体对移植胰岛的免疫排斥反应。但同时，也由于这类材料对胰岛的完全包裹，不利于毛细血管的形成，因此在胰岛移植后血运重建等方面有所欠缺。
发明内容
本发明的一个目的在于提出一种反应条件温和，操作简便易行的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法。
根据本发明的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，包括如下步骤：S101：将糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶溶解于酸性缓冲溶液中，配制成质量分数为30％～50％的溶液后，去除所述溶液中的氧气，然后依次向所述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，去除氧气后活化15分钟～45分钟，以得到活化后的溶液；S102：将多臂聚氧乙烯胺和/或多臂聚乙二醇溶解于水中并去除氧气，然后加入到所述活化后的溶液中，室温下反应30分钟～120分钟；S103：向所述步骤S102处理过的溶液中加入荧光染色试剂，避光反应25分钟～35分钟；S104：将所述步骤S103处理过的溶液冷冻干燥，以得到胰岛培养支架；其中，所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶与所述N-羟基丁二酰亚胺的物质的量之比为(1:1)～(1:10)；所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶与所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的物质的量之比为(1:1)～(1:10)。
根据本发明实施例的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，采用多臂聚乙二醇胺和/或多臂聚氧乙烯胺交联肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素以及透明质酸等糖胺聚糖类的细胞外基质仿生水凝胶，糖胺聚糖类的细胞外基质仿生水凝胶的生物相容性很好，多臂聚乙二醇、多臂聚氧乙烯胺以及糖胺聚糖类的细胞外基质仿生水凝胶均为美国食品药品监督管理局(FDA)已经认证的医用材料，并且能比较全面的模拟胰岛细胞外基质微环境。利用糖胺聚糖静电作用力以及预先设下的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯残基，通过层层自组装的物理方法，成功将胰岛细胞团包裹在凝胶中，通过在凝胶本体连接小分子荧光基团，再次证明凝胶与胰岛的结合。本发明操作简便易行，反应条件温和，易于工业化，且化学/生物性状稳定，也适用于临床应用。
另外，根据本发明上述实施例的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，还可以具有如下附加的技术特征：
优选地，所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶为肝素；所述步骤S102为：将多臂聚乙二醇胺溶解于水中并去除氧气，然后加入到所述活化后的溶液中，室温下反应30分钟～120分钟；其中，所述肝素与所述多臂聚乙二醇胺的质量比为(10:1)～(1:10)。
优选地，所述多臂聚乙二醇胺为四臂聚乙二醇胺和/或八臂聚乙二醇胺。
进一步地，所述肝素的相对分子质量为8000～14000，所述多臂聚乙二醇胺的相对分子质量为2000～20000。
优选地，所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶为硫酸软骨素；所述步骤S102为：将多臂聚乙二醇胺溶解于水中并去除氧气，然后加入到所述活化后的溶液中，室温下反应30分钟～120分钟；其中，所述硫酸软骨素与所述多臂聚乙二醇的质量比为(10:1)～(1:10)。
优选地，所述多臂聚乙二醇为四臂聚乙二醇胺和/或八臂聚乙二醇胺。
进一步地，所述硫酸软骨素的相对分子质量为2000～20000，所述多臂聚乙二醇的相对分子质量为2000～20000。
进一步地，所述酸性缓冲溶液的pH值为6.0～7.0。
进一步地，所述酸性缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液。
进一步地，所述荧光染色试剂为5-FAM-活化酯，且所述5-FAM-活化酯与所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶的物质的量之比为(1:900)～(1:1100)。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1是根据本发明的反应原理图以及反应组分的分子式；
图2是经5-FAM-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯标记的多臂聚乙二醇和/或多臂聚氧乙烯胺交联肝素水凝胶包裹胰岛的组织切片显微图片；
图3是经5-FAM-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯标记的多臂聚乙二醇和/或多臂聚氧乙烯胺交联肝素水凝胶包裹胰岛在体外培养过程中，使用倒置荧光显微镜观察到的图像；
图4为胰岛经不同肝素浓度复合的水凝胶(肝素浓度分别为3mg/mL、7.5mg/mL、15mg/mL)在体外培养过程中的坏死及凋亡情况统计；
图5表明包裹水凝胶的胰岛与胰腺内皮细胞共培养4小时、24小时、48小时后倒置荧光显微镜下的图片(图中亮点为CSFE荧光标记内皮细胞，白色虚线圈指示胰岛位置)；
图6表明包裹水凝胶的胰岛相对于未包裹水凝胶的胰岛，高浓度葡萄糖刺激后胰岛素分泌能力对照图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，包括如下步骤：
S101：将糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶溶解于酸性缓冲溶液中，配制成质量分数为30％～50％的溶液后，去除所述溶液中的氧气，然后依次向所述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，去除氧气后活化15分钟～45分钟，以得到活化后的溶液，其中，所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶与所述N-羟基丁二酰亚胺的物质的量之比为(10:1)～(1:10)；所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶与所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的物质的量之比为(1:1)～(1:10)。糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶可以为肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素以及透明质酸等糖胺聚糖类的细胞外基质仿生水凝胶，其均为美国食品药品监督管理局(FDA)已经认证的医用材料，并且能比较全面的模拟胰岛细胞外基质微环境。优选地，酸性缓冲溶液的pH值为6.0～7.0，优选地，酸性缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液。
S102：将多臂聚氧乙烯胺和/或多臂聚乙二醇胺溶解于水中并去除氧气，然后加入到所述活化后的溶液中，室温下反应30分钟～120分钟。多臂聚乙二醇胺、多臂聚氧乙烯胺均为美国食品药品监督管理局(FDA)已经认证的医用材料。利用糖胺聚糖静电作用力以及预先设下的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯残基，通过层层自组装的物理方法，成功将胰岛细胞团包裹在凝胶中，如图1所示。优选地，采用多臂聚氧乙烯胺与肝素、硫酸软骨素、透明质酸接枝，肝素与多臂聚氧乙烯胺的质量比为(10:1)～(1:10)；进一步地，多臂聚氧乙烯胺为四臂聚氧乙烯胺和/或八臂聚氧乙烯胺；进一步地，肝素的相对分子质量为8000～14000，多臂聚氧乙烯胺的相对分子质量为2000～20000。优选地，采用多臂聚乙二醇与肝素、硫酸软骨素、透明质酸接枝，硫酸软骨素与多臂聚乙二醇的质量比为(10:1)～(1:10)；进一步地，多臂聚乙二醇为四臂聚乙二醇和/或八臂聚乙二醇；进一步地，肝素、硫酸软骨素、透明质酸的相对分子质量为8000～14000，多臂聚乙二醇的相对分子质量为2000～20000。
S103：向所述步骤S102处理过的溶液中加入荧光染色试剂，避光反应25分钟～35分钟。通过在凝胶本体连接小分子荧光基团，再次证明凝胶与胰岛的结合。其中，荧光染色试剂可以为5-FAM-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯或6-FAM-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯等可以与糖类物质通过酰胺键连接的荧光染色试剂。优选地，荧光染色试剂为5-FAM-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯，且5-FAM-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯与糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶的物质的量之比约为(1:900)～(1:1100)。
S104：将所述步骤S103处理过的溶液冷冻干燥，以得到胰岛培养支架。
下面通过具体实施例详细描述本发明。
实施例一
实施例一是采用肝素作为胰岛培养支架的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：将相对分子质量为8000～14000的肝素溶解于pH为6.0～7.0的Tris-HCl缓冲溶液中，配置成质量分数为30％～50％的溶液，低温超声溶解并除去反应器中的氧气，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，按照物质的量比为肝素：N-羟基丁二酰亚胺：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺为1:1:2的比例投放原料，除氧，低温活化15分钟～45分钟。
步骤二：将相对分子质量2000～20000的四臂和/或八臂聚氧乙烯胺溶解于双蒸水中，低温脱气后加入到步骤一的溶液中，控制肝素与多臂聚氧乙烯胺的质量比为(10:1)～(1:10)，室温反应30分钟～120分钟。
步骤三：将5-FAM-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯绿色荧光分子按照与肝素物质的量比以(1:900)～(1:1100)加入步骤二的溶液中，避光反应30分钟，如图2所示，可以看到经包裹得胰岛经冰冻固定及切片处理后，在共聚焦显微镜下可发出FAM荧光，且胰岛形态完好。
步骤四：将上述溶液倒入细胞培养板并冷冻干燥，得到胰岛培养支架。
试验方法：通过胆管灌注胶原酶的方法，经Histopaque分离获取取成年雄性ICR小鼠胰岛，进行材料包裹后在体外培养环境中体外培养14天后，使用死活荧光染色试剂盒对包裹组胰岛及未包裹的对照组胰岛进行染色。同时对包裹组及对照组胰岛固定、包埋后进行冰冻切片染色，以证实材料对胰岛的包裹程度。如图3所示，可以看到经包裹得胰岛可发出FAM荧光，且胰岛形态完好，表明水凝胶包裹胰岛作为体内成像示踪探针的可行性，同时也说明该水凝胶对胰岛无明显毒副作用。从图5中可以明显看出，肝素包裹的胰岛周围内皮细胞显著多于未包裹对照组。而且随着时间的推移，肝素包裹胰岛周围的内皮细胞也逐渐增多，相反，未包裹的胰岛周围内皮细胞相对减少，表明肝素水凝胶在促进胰岛内皮化、血管化方面的积极作用。在对包裹组及对照组胰岛培养过程中的第14天进行胰岛素释放试验，即在两组胰岛中加入20毫摩尔每升的高浓度葡萄糖溶液，观察胰岛在高糖刺激下胰岛素释放的能力，用于评价胰岛功能及活力。如图4所示，水凝胶包裹组的胰岛细胞活力显著优于未包裹对照组胰岛，PI阳性死细胞数量也明显低于对照组。且水凝胶在保存胰岛细胞活力，阻碍胰岛细胞凋亡的作用随着肝素浓度的增加增强。
试验结果：
1)通过死活染色的方法发现胰岛细胞在该仿生合成凝胶中14天后存活率接近100％，大大超过已有商业化的培养支架。
2)与胰腺内皮细胞共培养试验结果显示，培养过程中胰岛细胞呈现周围血管化组织，显著优于对照组，表明包裹并释放肝素的胰岛在培养环境中更易于血管化。
3)如图6所示，包裹水凝胶的胰岛相对于未包裹水凝胶的胰岛，高浓度葡萄糖刺激后胰岛素分泌能力也优于对照组，指示水凝胶包裹的胰岛可最大程度保存胰岛功能。胰岛素释放实验发现胰岛细胞释放胰岛素功能增强，胰岛功能明显优于对照组。
与现有包裹胰岛进行胰岛移植的海藻酸钠相比，本实施例中使用的材料为美国食品药品监督管理局(FDA)认证，并可结合肝素等具有生物活性的因子，促进移植后胰岛在体内的血管化，改善胰岛移植后胰岛的功能及存活性；胰岛移植使用的现有材料海藻酸钠在制备过程中，由于制备条件及原材料差异，批次间有较大差异，对胰岛移植术后胰岛及接受胰岛移植患者体内条件均有不同程度的影响。而该水凝胶具有良好的生物相容性，并可批量化生产，且化学/生物性状稳定，更适用于临床应用。该水凝胶与细胞外基质成分类似，仿生效果大大优于现有胰岛移植材料。
实施例二
实施例二是采用硫酸软骨素作为胰岛培养支架的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：将相对分子质量为8000～14000的硫酸软骨素溶解于pH为6.0～7.0的Tris-HCl缓冲溶液中，配置成质量分数为30％～50％的溶液，低温超声溶解并除去反应器中的氧气，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，按照物质的量比为肝素：N-羟基丁二酰亚胺：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺为1:1:2的比例投放原料，除氧，低温活化15分钟～45分钟。
步骤二：将相对分子质量2000～20000的四臂和/或八臂聚乙二醇胺溶解于双蒸水中，低温脱气后加入到步骤一的溶液中，控制硫酸软骨素与多臂聚乙二醇的质量比为(10:1)～(1:10)，室温反应30分钟～120分钟。
步骤三：将6-FAM-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯绿色荧光分子按照与肝素物质的量比以(1:900)～(1:1100)加入步骤二的溶液中，避光反应35分钟。
步骤四：将上述溶液倒入细胞培养板并冷冻干燥，得到胰岛培养支架。
试验方法：通过胆管灌注胶原酶的方法，经Histopaque分离获取取成年雄性ICR小鼠胰岛，进行材料包裹后在体外培养环境中体外培养14天后，使用死活荧光染色试剂盒对包裹组胰岛及未包裹的对照组胰岛进行染色。同时对包裹组及对照组胰岛固定、包埋后进行冰冻切片染色，以证实材料对胰岛的包裹程度。在对包裹组及对照组胰岛培养过程中的第14天进行胰岛素释放试验，及在两组胰岛中加入20毫摩尔每升的高浓度葡萄糖溶液，观察胰岛在高糖刺激下胰岛素释放的能力，用于评价胰岛功能及活力。
试验结果：
1)通过死活染色的方法发现胰岛细胞在该仿生合成凝胶中14天后存活率接近100％，大大超过已有商业化的培养支架。
2)与胰腺内皮细胞共培养试验结果显示，培养过程中胰岛细胞呈现周围血管化组织，显著优于对照组，表明包裹并释放肝素的胰岛在培养环境中更易于血管化。
3)胰岛素释放实验发现胰岛细胞释放胰岛素功能增强，胰岛功能明显优于对照组。
与现有包裹胰岛进行胰岛移植的海藻酸钠相比，本实施例中使用的材料为美国食品药品监督管理局(FDA)认证，并可结合硫酸软骨素等具有生物活性的因子，促进移植后胰岛在体内的血管化，改善胰岛移植后胰岛的功能及存活性；胰岛移植使用的现有材料海藻酸钠在制备过程中，由于制备条件及原材料差异，批次间有较大差异，对胰岛移植术后胰岛及接受胰岛移植患者体内条件均有不同程度的影响。而该水凝胶具有良好的生物相容性，并可批量化生产，且化学/生物性状稳定，更适用于临床应用。该水凝胶与细胞外基质成分类似，仿生效果大大优于现有胰岛移植材料。
实施例三
实施例三是采用透明质酸作为胰岛培养支架的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：将相对分子质量为8000～14000的透明质酸溶解于pH为6.0～7.0的Tris-HCl缓冲溶液中，配置成质量分数为30％～50％的溶液，低温超声溶解并除去反应器中的氧气，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，按照物质的量比为肝素：N-羟基丁二酰亚胺：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺为1:1:2的比例投放原料，除氧，低温活化15分钟～45分钟。
步骤二：将相对分子质量2000～20000的四臂和/或八臂聚乙二醇胺溶解于双蒸水中，低温脱气后加入到步骤一的溶液中，控制透明质酸与多臂聚乙二醇胺的质量比为(10:1)～(1:10)，室温反应30分钟～120分钟。
步骤三：将AF488-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯绿色荧光分子按照与肝素物质的量比以(1:900)～(1:1100)加入步骤二的溶液中，避光反应30分钟。
步骤四：将上述溶液倒入细胞培养板并冷冻干燥，得到胰岛培养支架。
试验方法：通过胆管灌注胶原酶的方法，经Histopaque分离获取成年雄性ICR小鼠胰岛，进行材料包裹后在体外培养环境中体外培养14天后，使用死活荧光染色试剂盒对包裹组胰岛及未包裹的对照组胰岛进行染色。同时对包裹组及对照组胰岛固定、包埋后进行冰冻切片染色，以证实材料对胰岛的包裹程度。在对包裹组及对照组胰岛培养过程中的第14天进行胰岛素释放试验，即在两组胰岛中加入20毫摩尔每升的高浓度葡萄糖溶液，观察胰岛在高糖刺激下胰岛素释放的能力，用于评价胰岛功能及活力。
试验结果：
1)通过死活染色的方法发现胰岛细胞在该仿生合成凝胶中14天后存活率接近100％，大大超过已有商业化的培养支架。
2)与胰腺内皮细胞共培养试验结果显示，培养过程中胰岛细胞呈现周围血管化组织，显著优于对照组，表明包裹并释放肝素的胰岛在培养环境中更易于血管化。
3)胰岛素释放实验发现胰岛细胞释放胰岛素功能增强，胰岛功能明显优于对照组。
与现有包裹胰岛进行胰岛移植的海藻酸钠相比，本实施例中使用的材料为美国食品药品监督管理局(FDA)认证，并可结合肝素等具有生物活性的因子，促进移植后胰岛在体内的血管化，改善胰岛移植后胰岛的功能及存活性；胰岛移植使用的现有材料海藻酸钠在制备过程中，由于制备条件及原材料差异，批次间有较大差异，对胰岛移植术后胰岛及接受胰岛移植患者体内条件均有不同程度的影响。而该水凝胶具有良好的生物相容性，并可批量化生产，且化学/生物性状稳定，更适用于临床应用。该水凝胶与细胞外基质成分类似，仿生效果大大优于现有胰岛移植材料。
综上，根据本发明实施例的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，采用多臂聚乙二醇和/或多臂聚氧乙烯胺交联肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素以及透明质酸等糖胺聚糖类的细胞外基质仿生水凝胶，糖胺聚糖类的细胞外基质仿生水凝胶的生物相容性很好，多臂聚乙二醇胺、多臂聚氧乙烯胺以及糖胺聚糖类的细胞外基质仿生水凝胶均为美国食品药品监督管理局(FDA)已经认证的医用材料，并且能比较全面的模拟胰岛细胞外基质微环境。利用糖胺聚糖静电作用力以及预先设下的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯残基，通过层层自组装的物理方法，成功将胰岛细胞团包裹在凝胶中，通过在凝胶本体连接小分子荧光基团，再次证明凝胶与胰岛的结合。本发明操作简便易行，反应条件温和，易于工业化，且化学/生物性状稳定，也适用于临床应用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S101：将糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶溶解于酸性缓冲溶液中，配制成质量分数为30％～50％的溶液后，去除所述溶液中的氧气，然后依次向所述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，去除氧气后活化15分钟～45分钟，以得到活化后的溶液；
S102：将多臂聚氧乙烯胺和/或多臂聚乙二醇溶解于水中并去除氧气，然后加入到所述活化后的溶液中，室温下反应30分钟～120分钟；
S103：向所述步骤S102处理过的溶液中加入荧光染色试剂，避光反应25分钟～35分钟；
S104：将所述步骤S103处理过的溶液冷冻干燥，以得到胰岛培养支架；
其中，
所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶与所述N-羟基丁二酰亚胺的物质的量之比为(1:1)～(1:10)；
所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶与所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的物质的量之比为(1:1)～(1:10)。
2.根据权利要求1所述的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，其特征在于，
所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶为肝素；
所述步骤S102为：将多臂聚乙二醇胺溶解于水中并去除氧气，然后加入到所述活化后的溶液中，室温下反应30分钟～120分钟；
其中，所述肝素与所述多臂聚乙二醇胺的质量比为(10:1)～(1:10)。
3.根据权利要求2所述的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，其特征在于，所述多臂聚乙二醇胺为四臂聚乙二醇胺和/或八臂聚乙二醇胺。
4.根据权利要求3所述的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，其特征在于，所述肝素的相对分子质量为8000～14000，所述多臂聚乙二醇胺的相对分子质量为2000～20000。
5.根据权利要求1所述的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，其特征在于，
所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶为硫酸软骨素；
所述步骤S102为：将多臂聚乙二醇胺溶解于水中并去除氧气，然后加入到所述活化后的溶液中，室温下反应30分钟～120分钟；
其中，所述硫酸软骨素与所述多臂聚乙二醇的质量比为(10:1)～(1:10)。
6.根据权利要求5所述的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，其特征在于，所述多臂聚乙二醇为四臂聚乙二醇胺和/或八臂聚乙二醇胺。
7.根据权利要求6所述的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，其特征在于，所述硫酸软骨素的相对分子质量为2000～20000，所述多臂聚乙二醇的相对分子质量为2000～20000。
8.根据权利要求1所述的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，其特征在于，所述酸性缓冲溶液的pH值为6.0～7.0。
9.根据权利要求1或8所述的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，其特征在于，所述酸性缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液。
10.根据权利要求1所述的基于糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶作为胰岛培养支架的制备方法，其特征在于，所述荧光染色试剂为5-FAM-活化酯，且所述5-FAM-活化酯与所述糖胺聚糖仿生细胞外基质水凝胶的物质的量之比为(1:900)～(1:1100)。
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