WO2009048166A1 - 細胞移植療法に用いられる心疾患治療薬 - Google Patents

Abstract

本発明は、心臓組織由来の多能性幹細胞を用いた細胞移植療法において、当該多能性幹細胞の生着性及び心筋細胞の再生効率を顕著に向上させ、心疾患を一層効果的に治療できる、細胞移植法を確立することを目的とする。すなわち、本発明は、心疾患の細胞移植療法において、心臓組織由来の多能性幹細胞と、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）を含むハイドロゲルとを併用することによって、当該多能性幹細胞の生着性を高め、心筋細胞の再生効率を有意に向上させるものである。

Description

明 細. 書

細胞移植療法に用いられる心疾患治療薬

技術分野

[0001 ] 本発明は、 細胞移植療法に用いられる心疾患治療薬に関する。 より詳細に は、 本発明は、 細胞移植療法による心疾患の治療において、 ドナー細胞の生 着性及び心筋細胞の再生が顕著に優れておリ、 一層効果的な心疾患の治療を 可能とする心疾患治療薬に関する。

背景技術

[0002] 近年、 再生医学において、 幹細胞を移植することにより、 目的とする組織 及び臓器を修復し、 再生する医療技術が精力的に研究されている。 これまで に、 各種組織や臓器の成熟細胞に分化する幹細胞が見出され、 細胞移植への 臨床的応用が検討されている。

[0003] 例えば、 骨髄由来細胞又は骨格筋芽細胞が、 心筋細胞への分化が可能であ ることが見出されており、 これらの細胞を用いて心臓組織への細胞移植を行 うと、 短期間での心筋細胞の再生が認められることが報告されている。 しか しながら、 骨髄由来細胞又は骨格筋芽細胞の移植によって認められる心筋細 胞の再生は、 移植された細胞によって実質的に心筋細胞が再生しているので はなく、 パラクライン効果によって心筋を保護するサイトカインの分泌に起 因していることが分かっている。

[0004] また、 本発明者等によって、 心臓組織から、 心筋細胞を初めとする各種成 熟細胞への分化能を有する多能性幹細胞を分離、 精製する技術が開発されて いる （国際公開第 2006/093276号パンフレッ ト） 。 このような心臓組織由来の 多能性幹細胞は、 心筋細胞への分化能が卓越しており、 従来報告されている 心筋幹細胞の中では、 最も、 心疾患の細胞移植による治療に有用であること が分かっている。

[0005] しかしながら、 如何に有用なドナー幹細胞を用いて細胞移植を行っても、 ドナー幹細胞を単独で移植したのでは、 移植 2週間後にはドナ一幹細胞 （移 植細胞） の多くが死滅し、 ドナ一幹細胞の生着が不十分になり、 その結果、 ドナー幹細胞による所望の治療効果が最大限に発現し得ないことが分かつて いる。 そこで、 細胞移植による治療効果を高めるには、 移植後のホスト環境 において、 ドナー幹細胞の生着性を向上させることが重要であると考えられ ている。

[0006] —方、 これまでに、 細胞増殖因子を含有するハイドロゲルが、 細胞移植部 位において細胞増殖因子を徐放させることにより、 細胞移植療法においてド ナー細胞の生着率を向上させ得ることが報告されている （特開 2002— 145797 号公報） 。 しかしながら、 これまでに、 心臓組織由来の多能性幹細胞と、 細 胞増殖因子を含有するハイドロゲルとを併用した細胞移植に関する報告はな い。

発明の開示

[0007] 発明が解決しょうとする課穎

また、 本発明者等が検討したところ、 後記する実験データに示すように、 ' 心臓組織由来の多能性幹細胞とハイドロゲルを単に併用して心臓組織に移植 しても、 ホスト心臓組織における生着性や心筋細胞の再生効率が不十分であ る場合があることが確認された。 即ち、 従来技術からは、 従来報告されてい る心筋幹細胞の中では、 最も臨床上有用である心臓組織由来の多能性幹細胞 を用いても、 ホスト心臓組織における生着性を有効に向上させて、 当該多能 性幹細胞による治療効果を最大限に発現させ得る細胞移植法が確立できない のが現状である。

[0008] そこで、 本発明の目的は、 心臓組織由来の多能性幹細胞を用いた細胞移植 療法において、 当該多能性幹細胞の生着性及び心筋細胞の再生効率を顕著に 向上させ、 心疾患を一層効果的に治療できる、 細胞移植法を確立することで

[0009] 課顥夯 決するための手段

本発明者等は、 上記課題を解決すべく、 様々な細胞移植条件について検討 し、 多くの試行錯誤を繰り返したところ、 心臓組織由来の多能性幹細胞と、 塩基性繊維芽細胞成長因子 （bFGF : bas i c f i brob l ast growth factor) を 含むハイ ドロゲルとを併用することにより、 当該多能性幹細胞の生着性を高 め、 心筋細胞の再生効率を有意に向上させることが可能になることを見出し た。 さらに、 当該多能幹細胞の投与量を、 患者の体重 1 kg当たり 10 x 10⁵個以下 に設定することで、 当該多能性幹細胞の生着性及び心筋細胞の再生をより向 上させうることを見出し、 本発明を完成させた。

即ち、 本発明は、 下記に掲げる細胞移植療法に用いられる心疾患治療薬を 提供する：

[0010] bFGFを含むハイドロゲルと、 心臓組織由来の多能性幹細胞とを含む、 細胞 移植療法に用いられる心疾患治療薬。 ここで、 前記心疾患治療薬は、 前記ハ ィドロゲルと前記多能性幹細胞とを含むキットとして構成されていてもよい

[001 1 ] 本発明の心疾患治療薬で用いられるハイドロゲルとしては、 例えば、 ゼラ チン、 コラーゲン、 デンプン、 ベ チン、 ヒアルロン酸、 キチン、 キトサン またはアルギン酸及びこれらの材^の誘導体^挙^ることができる。 なかで も、 コラーゲンハイドロゲル又はゼラチ ハイドロゲルが好ましい。

[0012] 本発明の心疾患治療薬は、 bFGfを含むハイドロゲルの投与量が、 bFGF量換 算で、 患者の体重 1 kg当たり 〜 100 gとなるように構成されることが好まし い。

[0013] ハイドロゲルの形状はシート状であることが好ましい。

本発明の心疾患治療薬は、 さらに生体内非分解性高分子支持体を含んでい てもよく、 前記シート状のハイド口ゲルは、 この高分子支持体に固定化され て心筋内膜に投与される。 前記生体内非分解性高分子支持体としては、 例え ばポリテトラフルォロエチレン （ゴァテックス （登録商標） ） を挙げること ができる。

[0014] 本発明の心疾患治療薬は、 bFGFが、 前記多能性幹細胞 1 x 10⁶に対して、 少な くとも 1 ~100〃gで投与されるように構成されていることが好ましい。

本発明の心疾患治療薬は、 心臓組織由来の多能性幹細胞が、 患者の体重 1 kg 当たり 1 x 10⁶以下で投与されるように構成されることが好ましく、 患者の体重 1 kg当たり 1 x 10⁵~10 x 10⁵個で投与されるように構成されることがより好まし い。

[0015] 本発明で用いられる心臓組織由来の多能性幹細胞は、 GD90陽性、 GD29陽性 、 GD73陽性、 stro - 1陽性及び GD105陽性であることが好ましい。 このような多 能性幹細胞は、 例えば、 下記工程を経て調製される：

( i )ほ乳動物から採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を 調製する工程、

( i ί )密度勾配法によリ、 上記細胞懸濁液から心臓組織由来細胞群を分離する 工程、 及び

( i i i )得られた心臓組織由来細胞群を、 bFGF及び上皮細胞増殖因子を含有する 培地で浮遊培養した後、 浮遊状のスフ工ァーを形成している細胞を選択し分

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[0016] 本発明で用いられる心臓組織由来の多^性幹細胞は、 患者の心臓組織由来 のものであってもよいし （自家移植） 、 患者以外の心臓組織由来のものであ つてもよいし （他家移植） 、 株化された紬胞であってもよい。

[0017] 発明の効果

本発明の心疾患治療薬によれば、 細胞移植療法による心疾患の治療におい て、 心臓組織由来の多能性幹細胞の生着性の顕著な向上が認められ、 心筋細 胞を再生させることができる。 例えば、 心臓移植を必要とする重症心不全患 者に対して、 本発明の心疾患治療薬を用いて心疾患の細胞移植療法を行うと 、 補助人工心臓移植からの離脱に必要十分な改善度を実現でき、 更には継続 的な薬物療法によって長期的に心臓移植の必要性もなくなる程度の改善度も 期待できる。 このように、 本発明の心疾患治療薬を用いて心疾患の細胞移植 療法を行えば、 従来の細胞移植療法では実現し得ない疾患改善度を達成する ことが可能になる。

[0018] 従って、 本発明の心疾患治療薬は、 日本全国で 7, 000~10，000人いると想定 される心臓移植を必要とする患者、 人工心臓の補助から離脱困難な末期心不 全症患者、 又はこれに準ずる患者に対して、 革新的な救命法として臨床応用 が期待される。

〔0019] また、 心臓組織由来の多能性幹細胞は、 間葉系幹細胞の特徴を呈するため 、 免疫拒絶反応が起きにくいといわれている。 そのため、 本発明の心疾患治 療薬は、 自家細胞移植用としてのみならず、 他家細胞移植療法としても臨床 実用可能である。 それ故、 本発明の心疾患治療薬は、 心臓内の多能性幹細胞 数の存在量が少ないことが予想される高齢者に対しては、 株化したヒト心臓 組織由来の多能性幹細胞を採用して他家細胞移植療法用として用いることに よリ、 心疾患を有効に治療することができる。

[0020] 多分化能を有する細胞であっても、 実際には心筋細胞への分化度は必ずし も高くなく、 骨髄幹細胞や骨格筋芽細胞を用いた心臓での細胞移植療法の臨 床試験は失敗してきた。 本発明は、 心臓組織由来の多能性幹細胞と bFGFを併 用することにより、 初めて i n v i voでの細胞移植治療に成功したといえ、 こ れは従来技術からは予測できない優れた効果といえる。

図面の簡単な説明

[0021 ] [図 1 ]パーコールの密度勾配遠心法により分離したヒ卜由来の心臓組織由来細 胞群を浮遊培養した後に形成された浮遊状のスフエアー （細胞塊） を示す写 真である。 図中、 Aは培養 1日後に観察されたスフエアーを示し、 Bは培養 7日後に観察されたスフエアーを示す。

[図 2] 10 株の異なるヒト由来のスフヱァ一形成細胞 (CSG)の各種マーカー （R ex 1、 Oct 4、 Nanog、 Nkx- 2. 5、 Sox 2、 GATA-4) の発現を PCRにより分析 した結果を示す図である。 cFBは心臓内線維芽細胞、 BMGは骨髄由来間葉系幹 細胞を示す。

[図 3]ヒト由来のスフエアー形成細胞の各種細胞表面抗原 （c-kは (CD1 17) , GD34、 GD90、 GD105、 CD29、 GD73、 Stro— 1、 CD45、 CD3U HLA-MHC c l ass I I ) を FAGS分析した結果である。 図中、 太 (濃)線がスフ： Lァー形成細胞の分析 結果であり、 細 (薄)線がコントロール （標識無しの細胞） の分析結果である [図 4]ヒ ト由来のスフヱァー形成細胞から分化した心筋細胞の写真である。

[図 5]ヒ卜由来スフヱァー形成細胞から分化した心筋細胞の各種マーカ一 （Nk X— 2.5、 GATA4, ANP、 α-ca-actin, TnT、 MLC2v、 MLG2a、 - HG ( - myosin heavy chain), ^ -MHC ( /S -myos i n heavy chain)) の発現を PCRにより分析 した結果を示す図である。 なお、 本分析では、 SaGtinをコントロールとした

[図 6]bFGF含有ゼラチンハイド口ゲルをゴァテックス社 （登録商標） 製の PTFE (ポリテトラフルォロエチレン） 心内膜パッチ （6X6GIH) の中心部に前縫合 した後に、 虚血心筋部位に縫合した際の写真である。

[図 7]ホス卜心筋における多能性幹細胞の生着性を評価した結果を示す図であ る。 上段には、 心臓組織由来の多能性幹細胞を SPI0でラベルし、 鉄染色した 結果を示す。 下段左には、 グループ B及び Dにおいて、 移植治療から 4及び 28 曰後の梗塞心筋部位に生着した多能性幹細胞を MRIにて可視化した画像を示す 。 下段右には、 グループ B及び Dにおいて、 移植治療 28日後に梗塞心筋部位 に生着した多能性幹細胞の割合 （SPIO survival ratio) を示す。

[図 8]催不整脈作用を検証した結果を示す図である。 グループ A ~ Eについて 、 心拍数 （HR) 、 pause. 及び心室期外収縮 (VPG)を測定した結果を示す。 図 中の心電図は、 グループ Eの個体を診断した心電図である。

[図 9]心機能を解析した結果を示す図である。 上段には MRIによリ左室駆出率（ LVEF)を測定した結果、 下段にはエコー法によリ左室駆出率を測定した結果を 示す。 図中、 「p_re Txj とは治療前、 「Post Txj とは治療後を意味する。

[図 10〕梗塞サイズと微小心筋血流の改善度を解析した結果を示す図である。 上段には梗塞サイズ （Infarction volume) を測定した結果、 下段には微小 心筋血流 （perfusion ratio) を測定した結果を示す。 図中、 「Pre Txj と は治療前、 ost Txj とは治療後を意味する。

[図 11]血管新生度を解析した結果を示す図である。 図中、 各グループについ て、 梗塞部位全体 (total)の血管密度、 梗塞端部 （Border area) の血管密度 、 梗塞中心部 （Scar area) の血管密度、 直径 <50/ mの血管密度、 直径 >50 ju mの血管密度を測定した結果をそれぞれ示す。

[図 12]心筋細胞再生の程度について評価した結果を示す図である。 図中、 左 側に示す写真は、 グループ Dのミニブタの心臓の心筋を染色した結果であつ て、 上段には beta- ga l (赤色）、 中段には human Y染色体 （赤色） 、 及び下段 にはブタ特異的遺伝子プローブ （黄） で染色した結果を示す。 また、 右上の グラフは各グループにおける心筋細胞分化率を示し、 右下のグラフには各グ ループにおける細胞融合を介する心筋分化率を示す。

[図 13]虚血心での心筋繊維化の形態とマク口ファージの浸潤度を解析した結 果を示す図である。 図中、 上段には、 各グループのミニブタの心臓の心筋に 対して Masson- tr i chrome染色を行った結果を示す。 下段には、 グループ D及 び Eの心筋中に存在するマクロファージ CD68とマクロファージ GD163を染色し た結果を示す。

[図 14]移植治療 28曰後のグループ D及び Eのミニブタの心臓の心筋において 、 各種炎症性サイトカイン （I L-1 、 I L-6、 I L - 10、 TNF- α ) の発現量を測定 した結果を示す図である。

[図 15]左： ヒ卜心臓内幹細胞 (CDC)と同一検体よリ精製したヒト線維芽細胞（G FB)の培養中での成長曲線 （縦軸は倍体数、 横軸は日数） 、 中： DNA合成能 （B rdU取込み量、 BMG :骨髄幹細胞は比較対照群） 、 右 ： bFGF刺激後 10分の各チ 口シンキナーゼのリン酸化、 を示す図である。

[図 16] A及び B ： bFGF+ヒト GDG同時移植群（bFGF+GDG)と無処置群（contro l ) での左室駆出率（LVEF : A)と梗塞サイズ（i nfarct vo l ume : B)の経時的推移 、 C：両群における移植したドナー細胞 (GDG)の生着性 （矢印は生着したドナ 一細胞を示す） 、 D ： bFGF+GDC移植群のドナー細胞の生着性の経時的評価、 を示す図である。

[0022] 本明細書は、 本願の優先権の基礎である特願 2007- 265008号 （2007年 10月 10 曰出願） の明細書に記載された内容を包含する。

発明を実施するための最良の形態

[0023] 本発明の心疾患治療薬は、 心疾患の細胞移植療法に用いられるものであつ て、 bFGFを含むハイドロゲルと、 心臓組織由来の多能性幹細胞とを組み合わ せてなることを特徴とする。 以下、 本発明の心疾牵治療薬の各構成について 、 詳述する。

[0024] bFGF夯含むハイドロゲル

bFGFを含有させるハイドロゲルは、 生体吸収性高分子のハイドロゲルであ れば特に制限はなく、 例えば、 ゼラチン、 コラーゲン、 デンプン、 ぺクチン 、 ヒアルロン酸、 キチン、 キトサンまたはアルギン酸及びこれらの誘導体の ハイド口ゲル、 あるいはこれらを組み合わせて用いることができる。 bFGFを 含むハイドロゲルは、 上記の生体吸収性高分子を bFGFを含む水溶液に浸して 膨潤させるか、 あるいは緩衝液で膨潤させた生体吸収性高分子に bFGFを含む 溶液を適量滴下して調製することができる。

[0025] 好ましいハイド口ゲルとしては、 コラーゲンハイド口ゲルやゼラチンハイ ドロゲルを挙げることができる。 コラーゲンは、 生体構成タンパク質の 1 3を占める生体の主要タンパク質であり、 それ自身が本来、 種々の生理活性 ペプチドと相互作用している。 例えば、 ある種の細胞増殖因子がコラーゲン と分子間力を介して相互作用していることが報告されている （SGhuppan, D,な ど、 Gastroentero l ogy.， 1 14巻， P139, 1998など） 。 その相互作用には、 静 電的、 疎水性、 水素結合性など種々のものが考えられ、 生理活性ペプチドと コラーゲンとの組み合わせによって、 それらの相互作用の強さ、 割合は異な つている。 これらの相互作用によって、 bFGFと担体としてのコラーゲンとは 物理的に結合し、 安定な bFGF含有コラーゲンハイドロゲルが形成される。

[0026] コラーゲンとしては、 抗原性を除去したァテロコラーゲンを用いることが 好ましい。 コラーゲンは、 市販のコラーゲンスポンジを用いてもよいし、 公 知の方法により調製してもよい。 また、 コラーゲンは水溶性の低いものを用 いることもが好ましい。 コラーゲンも水溶性であるので、 可溶化の方法 （酸 処理、 アルカリ処理、 酵素処理がある） によっては、 bFGF含有コラーゲンハ イド口ゲルが水溶性となり、 生体に投与した際、 一過性に bFGFが当該成形体 から放出されてしまい、 安定した徐放化が困難となるからである。 そのよう な水不溶性のコラーゲンは、 例えば特開 2001- 316282にしたがい、 コラーゲン に架橋処理を施すことにより、 含水率 85.~99%のコラーゲンハイドロゲルと して得ることができる。

[0027] 用いるコラーゲンとしては、 その出発原料となる動物種、 組織部位、 年齢 に関係なく、 いずれのものでもよく、 また、 その抽出方法、 精製法にも依存 しない。 コラーゲンには十数種類のタイプがあるが、 本発明に用いるコラ一 ゲンとしては、 架橋処理によリ水不溶化が可能であればいずれのタイプでも あるいはそれらの混合物でも適用できるが、 好ましくは、 タイプ I、 あるい は、 I Iし IVなどのコラーゲンがよい。

[0028] コラーゲンの架橋は、 従来公知の方法に従って行うことができる。 具体的 には化学架橋剤を使用する方法、 熱処理あるいは紫外線を照射によって架橋 する方法等が挙げられる。 例えば、 コラーゲン水溶液 （0. 3重量％程度が好ま しい） をホモジナイザーを用いて泡立てたのち、 凍結し、 凍結乾燥してコラ 一ゲンスポンジを作製する。 次いで、 この未架橋コラーゲンスポンジを化学 架橋剤処理、 あるいは熱、 紫外線処理を行うことによって架橋する。 化学架 橋の場合、 架橋剤は、 使用するコラーゲンの種類により適宜好適なものが選 択されるが、 通常、 ホルマリン、 ダルタルアルデヒド； 1 -ェチル -3 - (3-ジメ チルァミノプロピル）カルポジイミド塩酸塩、 1-シクロへキシル -3 - (2-モルホ リモェチル）カルポジイミド-メト- p -トルエンスルホナート等〕 、 ェピクロ口 ヒドリン、 ジエポキシ化合物 〔ビスエポキシジエチレングリコール、 1. 4 -ビ ス - (2. 3-エポキシプロポキシ一ブタン）等〕 の架橋剤が用いられる。 架橋剤の 濃度は 10- ³~10重量％、 好ましくは 10- ²~1重量％であり、 4〜40°C、 好ましく は 25〜30°Cで、 3〜48時間、 好ましくは 12~24時間、 該未架橋コラーゲンスポ ンジと該架橋剤溶液と接触させる。

[0029] 熱架橋する場合は、 該未架橋コラーゲンを減圧下 （好ましくは 10mmHg程度 ) 、 110〜160°C、 好ましくは 120~150°Cの雰囲気中に、 通常 1 ~48時間、 好ま しくは 6〜24時間放置することによって行う。 また、 紫外線で架橋する場合は 、 殺菌ランプ下で、 通常、 室温、 好ましくは 0〜40°Cで 6〜48時間放置するこ とによって行なう。

[0030] ゼラチンハイド口ゲルとは、 ゼラチンを架橋させて得られるハイド口ゲル のことである。 本発明において使用されるゼラチンとしては、 牛、 豚、 魚類 等を始めとする各種の動物種の皮膚、 骨、 腱などの身体のあらゆる部位から 採取できるコラーゲン、 或いはコラーゲンとして用いられている物質から、 アルカリ加水分解、 酸加水分解、 および酵素分解等の種々の処理によって変 性させて得ることができる。 また、 遺伝子組換え型コラーゲンの変性体ゼラ チンを用いてもよい。 ゼラチンの性質は、 用いる材料および処理方法によつ て異なるが、 いずれの性質をもつゼラチンも、 本発明においてゼラチンハイ ドロゲルの材料として利用することができる。

[0031] ゼラチンの性質を表す尺度としては、 例えば、 等電点、 分子量、 ジータ電 位などがある。 ジ一タ電位は、 物質 （ゼラチン） の静電的な荷電の程度を表 す尺度である。 本発明において、 好ましいゼラチンとしては、 （ί)コラーゲン からのアルカリ加水分解処理によって得られる、 酸性ゼラチンであり、 （i i) 分子量が、 SDS-PAGEの非還元条件下で約 10万〜約 20万ダルトンであり、 且つ（ i i i)水溶液中のジ一タ電位が、 約一 15〜約一20mVを有するゼラチンが挙げら れる。 また、 好ましくは、 ゥシの骨由来の I型コラーゲンをアルカリ処理し て調製した酸性ゼラチンを用いることができ、 新田ゼラチン社の試料等電点 ( IEP) 5. 0として入手することもできる。 なお、 酸処理して調製した塩基性 ゼラチンは同じく新田ゼラチン社の試料 I EP9. 0として入手することができる が、 ジータ電位は以下のように大きく相違する。

酸性ゼラチン （新田ゼラチン社試料 I EP5. 0) ：約一 15〜約一 20mV

塩基性ゼラチン （新田ゼラチン社試料 IEP9. 0) ：約 +12〜約 +15mV

[0032] ゼラチンの架橋化方法としては、 公知の方法を利用することができる。 例 えば、 ゼラチンの架橋化剤としては、 例えばグルタルアルデヒド； 1 -ェチル- 3 - (3-ジメチルァミノプロピル）カルポジィミド塩酸塩等の水溶性カルポジィ ミド； プロピレンォキサイド、 ジエポキシ化合物、 水酸基、 カルボキシル基 、 アミノ基、 チオール基、 イミダゾ一ル基などの間に化学結合を作る縮合剤 等が挙げられる。 また、 ゼラチンは、 熱処理又は紫外線照射によっても架橋 化することもできる。 また、 これらの架橋化方法を組み合わせて用いること もできる。 更に、 塩架橋、 静電的相互作用、 水素結合、 疎水性相互作用など を利用した物理架橋によリハイドロゲルを作製することも可能である。

[0033] 本発明で使用されるゼラチンハイドロゲルにおけるゼラチンの架橋度は、 ゼラチンハイドロゲルに対して付与すべき生体吸収性のレベルに応じて適宜 設定することができる。 架橋化剤を用いてゼラチンハイドロゲルを架橋させ る場合、 ゼラチンハイドロゲル中のゼラチンと架橋剤の濃度としては、 例え ばゼラチンが 1 ~20重量％、 架橋剤力《0. 01 ~1重量％が挙げられる。 架橋反応 条件は特に制限はないが、 例えば、 0〜40°C、 1〜48時間で行うことができる 。 一般に、 ゼラチンおよび架橋剤の濃度、 架橋時間が増大するとともにハイ ド口ゲルの架橋度は増加し、 生体吸収性は低〈なる。

[0034] 本発明で使角されるゼラチンハイドロゲルの形状は、 細胞移植部位に適用 可能である限り、 特に制限はないが、 例えば、 シート状、 円柱状、 角柱状、 球状、 粒子状等が挙げられる。 これらのゼラチンハイドロゲルの形状の中で も、 シート状が好ましい。 移植された多能性幹細胞を覆うようにシート状の ゼラチンハイドロゲルを細胞移植部位に適用することによって、 当該多能性 幹細胞の生着性を高め、 心筋細胞の再生を一層顕著ならしめることができる

[0035] ゼラチンハイド口ゲルをシート状にする場合、 適用される細胞移植部位に おいて、 位置ずれを防止するために、 当該ゼラチンハイドロゲルが予め心内 膜に適用されるパッチ （心内膜パッチ） に縫合され、 当該心内膜パッチを介 して細胞移植部位に固定できるように構成されていることが望ましい。 この ような心内膜パッチとしては、 公知のものを使用することができるが、 具体 的にはゴァテックス社 （商標） 製の PTFE (ポリテトラフルォロエチレン） パ ツチ I Iが例示される。

[0036] 本発明に使用されるゼラチンハイド口ゲルに含まれる bFGFとしては、 医薬 として使用できる程度に精製されたものであれば、 種々の方法で調製された ものを用いることができ、 また既に市販されている製品を使用してもよい。 b FGFの製造法としては、 例えば、 bFGFを産生する初代培養細胞や株化細胞を培 養し、 培養上清等から分離、 精製して該 bFGFを得ることができる。 また、 遺 伝子工学的手法によリ bFGFをコ一ドする遺伝子を適切なベクターに組み込み 、 これを適当な宿主に挿入して形質転換し、 この形質転換体の培養上清から 目的とする組換え bFGFを得ることもできる。 （例えば、 Nature, 342, 440 ( 1989)、 特開平 5 - 1 1 1382号公報、 Bi ochem. Bi ophys. Res. Commun. 163，

697 (1989)等を参照） 。 上記の宿主細胞は特に限定されず、 従来から遺伝子 工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、 例えば大腸菌、 酵母、 昆虫、 かいこ、 又は動物細胞等を用いることができる。 このようにして得られた bFG Fは、 天然型 bFGFと実質的に同じ作用を有する限り、 そのアミノ酸配列中の 1 若しくは複数のアミノ酸が置換、 欠失及び/又は付加されていてもよく、 ま た同様に糖鎖が置換、 欠失及び 又は付加されていてもよい。

[0037] 本発明に使用されるゼラチンハイド口ゲルは、 一旦ゼラチンを架橋させた ハイド口ゲルを形成させた後、 これに bFGFを含む溶液を適量滴下して、 ゼラ チンハイドロゲルに、 bFGFを含む溶液を浸み込ませることにより得ることが できる。 更に、 本発明に使用されるゼラチンハイドロゲルは、 一旦ゼラチン を架橋させたハイドロゲルを適宜、 適当な大きさ及び形に切断後凍結乾燥し 滅菌し、 得られた凍結乾燥したゼラチンハイドロゲルに対して bFGF水溶液を 滴下して、 ハイドロゲル内に bFGFを含浸させることによつても得ることがで きる。 この含浸操作は、 通常、 4~37°Cで 15分間〜 1時間、 好ましくは 4〜25°C で 15〜30分間で終了し、 その間にハイドロゲルは bFGFで膨潤し、 bFGFがゼラ チン分子と相互作用することによってゼラチン分子と複合体を形成し、 ゼラ チンハイドロゲル内に物理的相互作用によって固定される。 bFGFとゼラチン との間の複合体の形成には、 両者の間の静電的相互作用だけでなく、 疎水結 合、 水素結合等の他の相互作用も大きく寄与していると考えられる。

[0038] 本発明に使用されるハイドロゲルに含まれる bFGF量は、 適用患者の性別や 年齢、 ハイド口ゲルの形状等に応じて適宜設定すればよいが、 通常、 患者の 体重 1 kg当たり bFGFの投与量力 1 ~ 100 w g、 好まし〈は 5~ 50 jW g、 更に好まし くは 5〜10 gに相当する量が例示される。 このような bFGF投与量を充足する ことによって、 移植された多能性幹細胞の生着性を高め、 一層効率的に心筋 細胞を再生させることが可能になる。

[0039] また、 本発明に使用されるハイドロゲルにおいて、 ハイドロゲルに対する b FGFの比率についても、 上記 bFGFの投与量やゼラチンの含有量等に応じて定ま るが、 通常、 ハイドロゲルに対する bFGFの重量比が約 5倍量以下であることが 好ましい。 更に好ましくは、 ハイド口ゲルに対して bFGFは約 5〜約 1 /10⁴倍量の 重量比が挙げられる。

[0040] 本発明で使用されるハイドロゲルの含水率は、 bFGFの徐放性に影響するの で、 bFGFが好ましい徐放性を示すように適宜設定すればよい。 例えば、 ハイ ドロゲルの含水率として、 80〜99重量 <%、 好ましくは 95〜98重量％が挙げら れる。 この架橋度の測定可能な指標に含水率がある。 含水率が大きければ架 橋度は低くなリ、 分解されやすくなる。 つまり、 この含水率の値が bFGFの徐 放 （徐々に放出） を左右する。

[0041 ] 心臟組織由夹の多能性幹細胞 ,：

本発明の心疾患治療薬で使用されるドナ一細胞は、 心臓組織由来の多能性 幹細胞である。 このような多能性幹細胞としては、 心臓組織から分離される ものであり、 自己複製能と共に、 少なくとも心筋細胞への分化能を有してい るものであれば特に制限されないが、 好ましいものとして、 国際公開第 2006/ 093276号パンフレツ卜に記載されている多能性幹細胞が例示される。

[0042] 本発明で使用される心臓組織由来の多能性幹細胞の好適な具体例として、 細胞表面抗原の特性として、 CD90陽性、 GD29陽性、 CD73陽性、 stro- 1陽性及 び GD105陽性を示す多能性幹細胞が例示される。 これらの細胞表面抗原特性は 、 間葉系の幹細胞の代表的特徴であり、 上記細胞表面抗原特性を備えた細胞 は、 間葉系の幹細胞であることが、 細胞表面特性の点から裏付けられている といえる。 また、 心臓組織由来の多能性幹細胞の一例として、 上記細胞表面 特性に加えて、 更に、 c - k i t陰性、 CD45陰性、 GD31陰性、 GD34弱陽性、 及び HL A-MHC class 11陰性を示すものが挙げられる。

[0043] 本発明に使用される心臓組織由来の多能性幹細胞は、 その投与量が患者の 体重 1kg当たり、 10x10⁵個以下、 好ましくは 8x10^s以下、 更に好ましくは 7x1 0⁵個以下に設定される。 投与量の下限値は特に限定されるものではないが、一 般的には多能性幹細胞は1 10⁵〜10 10⁵個、 好まし<は3 10⁵〜8 10⁵個、 更 に好ましくは 5x10⁵~7xl0⁵個の範囲で投与される。 上記ハイドロゲルとの併 用において、 多能性幹細胞の投与量 （特に上限） を上記範囲に設定すること によって、 多能性幹細胞の生着性が向上し、 当該多能性幹細胞が有する有用 機能を最大限に発現させることが可能になる。 一方、 当該多能性幹細胞の投 与量が、 患者の体重 1kg当たり 1x10⁶個を超える場合、 上記ハイド口ゲルと併 用しても、 多能性幹細胞の生着性が低下し、 臨床上有意な心筋細胞への分化 が認められなくなる。

[0044] なお上記の投与量から、 bFGFと多能性幹細胞の割合は、 前記多能性幹細胞 1 x10⁶に対して、 bFGFが少なくとも 1 lOOjUgが好ましいことがわかる。

[0045] 上記細胞表面抗原の特性を有する多能性幹細胞は、 以下に記載する工程（ί) ~(iii)を実施することによって取得することもができる。

[0046] <工程（i) 細胞懸濁液の調製 >

まず、 ほ乳動物から採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸 濁液を調製する （工程（i)) 。

本発明では、 多能性幹細胞の採取源となる心臓組織は、 ほ乳動物由来のも のである限り、 特に制限されない。 本発明において、 ほ乳動物としては、 例 えばマウス、 ラット、 モルモット、 ハムスター、 ゥサギ、 ネコ、 ィヌ、 ヒッ ジ、 ブタ、 ゥシ、 ャギ、 サル、 ヒト等が挙げられる。 本発明の心疾患治療薬 をヒ卜に適用する場合、 採取源となる心臓組織はヒト由来であることが好ま しい。 また、 本工程で使用される心臓組織の部位についても特に制限される ものではない。

[0047] ほ乳動物からの心臓組織片の採取は、 通常の外科的手法によリ心臓組織片 を摘出することにより行われる。 また、 摘出された心臓組織片は、 酵素処理 に先立って、 心臓組織以外の組織 （例えば、 血管、 神経組織等） を極力取り 除いておくことが望ましい。 また、 酵素処理の効率を高めるために、 採取さ れた心臓組織片は、 約 1 mm³以下の断片になるまで細切した後に酵素処理に供 することが望ましい。

[0048] また、 酵素処理は、 生体組織片から細胞懸濁液を調製する際に一般的に使 用される酵素を使用して行われる。 使用される酵素として、 具体的には、 コ ラーゲナーゼ、 トリプシン、 キモトリブシン、 ペプシン等のプロテアーゼが 例示される。 これらの中で、 好ましくはコラーゲナーゼが挙げられる。 かか るコラーゲナーゼとして、 具体的には、 col lagenase type 2 (Worth ington 社製； 205U/mg) が例示される。 なお、 本明細書において、 コラーゲナ一ゼ 1 Uとは、 pH7.5、 37°C、 5時間で、 コラーゲンから 1 /モルの L一口イシン を遊離できる酵素量を表す。

[0049] また、 酵素処理条件についても、 特に制限されないが、 一例として、 下記 酵素処理条件が例示される：

βΐΐ度：例えば、 col lagenase type 2 ( 01"1:1^^1：0门社製； 2051]/ ） を 使用する場合であれば、 マウス由来の心筋組織を処理する場合、 通常 0.1~0. 3重量％、 好まし〈は 0.2重量％程度； ヒト由来の心筋組織を処理する場合、 通常0.2~0.6重量％、 好ましくは 0.4重量％程度となる濃度が挙げられる。 ま た、 例えば、 酵素濃度は、 心筋組織 100mg当たり、 通常 4100〜 1230011、 好ま しくは 8200 U程度となる濃度が例示される。

処理温度：通常 37°C程度となる温度が挙げられる。

処理時間及び回数：通常 20~30分の処理時間で酵素処理を 2回繰り返す条件、 好ましくは 20分程度の処理時間で酵素処理を 2回繰り返す条件が挙げられる。

[0050] 斯くして得られた細胞懸濁液は、 酵素処理後に、 遠心分離して上清を除去 し、 細胞の生育に適した培地を添加しておくことが望ましい。 細胞の生育に 適した培地としては、 例えば 1 0容量％の牛胎児血清 （FBS) 及び 1容量％ のペニシリン一ストレプトマイシン （5000U/ml penici M in及び 5000 g/ml streptomycin sulfateの混合物） を含むダルベッコ改変イーグル培地 （D MEM培地） が例示される。

[0051] <工程（ii) 心臓組織由来細胞群の分離 >

次いで上記細胞懸濁液から、 密度勾配法によリ心臓組織由来細胞群を分離 する （工程（に1)) 。

本工程において、 心臓組織由来細胞群の分離は、 細胞の分離に通常採用さ れている密度勾配法によリ実施することができる。 心臓組織由来細胞群の分 離の好ましい実施態様の一例として、 パーコール （percoll) の密度勾配遠心 法によリ心臓組織由来細胞群を分離する方法が例示される。 パーコールの密 度勾配遠心法は、 シリカゲルの一種であるパーコールを用いて遠心分離する 公知の方法であり、 パーコールを層状に用いているため、 遠心力により細胞 を破壊することなく分離することができる。

[0052] パーコールの密度勾配遠心法によリ、 上記細胞懸濁液から目的の幹細胞を 含む心臓組織由来細胞群を分離するには、 例えば、 上記細胞懸濁液を、 30 容量％パーコール溶液及び 10容量％ノ 一コール溶液からなる不連続密度勾 配にて、 室温にて 1 000 Gで 20分間遠心分画すればよく、 これによつて 30容量％パ一コール溶液と 70容量％パーコール溶液の界面に、 目的の幹 細胞を含む心臓組織由来細胞群が得られる。

[0053] <工程（Hi) 多能性幹細胞の分離 >

次いで、 上記工程（ii)で得られた心臓組織由来細胞群を、 上皮細胞増殖因 子 （EG F； epidermal growth factor) 及び塩基性繊維芽細胞成長因子（b FGF； basic fibroblast growth factor)を含有する培地で浮遊培養した後 に、 浮遊状のスフ Iァー （細胞塊） を形成している細胞を選択し分離する （ 工程（iii)) 。

[0054] 当該浮遊培養に先立って、 上記工程（ii)で得られた心臓組織由来細胞群を 更に酵素処理に供して、 細胞同士の結合や付着を解消しておくことが望まし い。 かかる酵素処理の具体的方法については、 特に制限されず、 プロテア一 ゼ等を使用した公知の方法によリ行うことができる。 該酵素処理の一例とし て、 心臓組織由来細胞群を 0. 05重量％のトリプシン及び 0. 53mMの EDT Aを含有する溶液で、 37 °Cで 1 0分間程度処理する方法が例示され る。 また、 当該酵素処理後にはプロテアーゼ阻害剤を添加し、 プロテア一ゼ 活性を失活させた後に本工程（ί i i)に供されることが望ましい。

[0055] 本工程で使用される培地は、 通常の細胞培養 （浮遊培養） に使用される培 地に、 上皮細胞増殖因子及び bFGFが添加されていればよい。 該培地の好適な ものとして、 例えば、 ヒト血清又は牛血清アルブミンを含む DMEM/F 1 2 H AM培地に、 上記上皮細胞增殖因子及び bFGFが添加されている培地が例 示される。 また、 本工程で使用される培地は、 必要に応じて、 ストレブトマ イシン、 カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質； B27サプリメント （GIBG0 社製） ； HEPES (5mM) 等を含有していてもよい。

[0056] また、 本工程で培地に添加される上皮細胞増殖因子及び bFGFの割合につい ては、 例えば、 上皮細胞増殖因子が 10〜20ng/mし 好ましくは 20ng/ml程度で あり、 bFGFが 10~40ng/mし 好ましくは 40ng/ml程度が例示される。

[0057] 本工程において、 培養開始時の細胞濃度が 1 x10⁴~2x10⁴cells/mし 好まし くは 2 X 10⁴Ge 11 s/m Iとなるように設定して、 培養を行うことが望ましい。

[0058] 本工程における浮遊培養は、 通常 37°Cで、 5%C0₂下で、 通常 14~21間、 好 ましくは 14日間行う。

[0059] 斯くして培養を行うことにより、 多能性幹細胞が細胞分裂を繰リ返してス フェア一 （細胞塊） を形成し、 これが培養液中に浮遊する。 従って、 このス フェア一を回収することにより、 目的とする多能性幹細胞を取得することが できる。

[0060] また、 上記細胞表面抗原の特性を有する多能性幹細胞は、 上記工程（i)〜（i ii)を行う方法以外に、 上記工程（i)及び（ii)を実施した後、 工程（ii)で得ら れた心臓組織由来細胞群から、 前述する細胞表面抗原の特徴を有する細胞を 公知の手法で分取する方法により取得することもできる。 このように細胞を 分取する手法の一例として、 ソーティング機能を備えるフローサイトメータ 一を用いる方法が挙げられる。

[0061] 上記多能性幹細胞は、 上皮細胞増殖因子及び bFGFを含有する培地で培養す ることにより、 該多能性幹細胞を増殖させることができる。 培養に先立って

、 上記工程（ i i i )で得られたスフエアーをプロテアーゼで処理してスフエアー を分解して、 多能性幹細胞を浮遊させておくことが望ましい。 このように多 能性幹細胞を浮遊させる方法としては、 例えば、 0. 05重量％の濃度のトリプ シンで、 37°Cで 20分間程度処理する方法が例示される。 当該プロテア一ゼ処 理後には、 プロテアーゼ阻害剤を添加して、 プロテアーゼの作用を阻害して おくとよい。 本培養に使用される培地には、 上記工程（i i i )で使用される培地 と同様である。 具体的には、 培養開始時の細胞濃度を 20Ge l l s/ jU Iとして、 37 °C、 5%G0₂下で、 通常 14~21日培養を行うことにより、 上記多能性幹細胞を 所望量に増殖させることができる。

[0062] さらに、 本発明の多能性幹細胞は本発明の心疾患治療薬の投与を必要とす る患者自身の心筋組織から調製された細胞であることが望ましいが、 移植可 能な限リにおいて、 患者以外の心筋組織から調製されたものであってよい。 たとえば、 単離した多能性幹細胞を継代して株化して利用可能にすれば、 自 己細胞の取得が困難な高齢者等においても細胞移植療法を実施することがで さる。

[0063] 心疾患治療薬の具体的熊様

本発明の心疾患治療薬は、 上記ハイドロゲルと、 上記多能性幹細胞とを組 み合わせてなるものである限り、 これらの両者が予め混合されてなる混合医 薬組成物であってもよいが、 これらの両者が混合されていないキットである ことが好ましい。 前者 （即ち、 混合医薬組成物） の場合、 上記ハイドロゲル と、 上記多能性幹細胞とを均一に混合するという観点から、 上記ハイドロゲ ルは粒子状のものを使用することが望ましい。 また、 後者 （即ち、 キット） の場合、 上記ハイドロゲルの形状については特に制限されない。

[0064] 本発明の心疾患治療薬が上記混合医薬組成物である場合、 当該心疾患治療 薬を、 カテーテルを利用して、 或いは切開して、 患者の心疾患部位に注入す ることにより投与される。

[0065] また、 本発明の心疾患治療薬が上記キットである場合、 当該心疾患治療薬 の投与は、 上記ハイドロゲルと上記多能性幹細胞の同時投与、 上記多能性幹 細胞の投与後に上記ハイドロゲルを投与、 或いは上記ハイドロゲルの投与後 に上記多能性幹細胞を投与の何れであってもよい。 好ましい態様として、 上 記多能性幹細胞を投与した後に、 シート状のハイドロゲルを上記多能性幹細 胞の投与部位 （細胞移植部位） を覆うように適用する方法が挙げられる。 ま た、 その際、 シート状のハイド口ゲルを生体非分解性の高分子支持体に予め 固定して使用すれば、 当該ハイドロゲルを高分子支持体を介して投与部位に 固定できる。 これにより、 術後に当該ハイド口ゲルの位置ずれを防止すると ともに、 細胞の拡散を防止でき、 上記多能性幹細胞の生着性の向上をよリー 層顕著ならしめることができる。 生体非分解性の高分子支持体としては、 現 在臨床で利用可能なものはポリテ卜ラフルォロエチレン （ゴァテックス （登 録商標） ） 製の心内膜パッチであるが、 これに限定されない。

[0066] 本発明の心疾患治療薬では、 投与簡易性、 多能性細胞の安定性等の観点か ら、 上記ハイドロゲル、 上記多能性幹細胞、 又はこれらの混合物が、 必要に 応じて薬学的に許容される担体で適当に希釈されていてもよい。 薬学的に許 容される担体としては、 例えば、 生理食塩水、 緩衝液等が使用される。

[0067] また、 本発明の心疾患治療薬の心疾患部位への投与方法としては、 上記ハ イド口ゲルの形状等に応じて、 カテーテルを利用する方法、 或いは胸部を切 開する方法等を適宜選択すればよい。

[0068] 本発明の心疾患治療薬において、 対象となる心臓疾患としては、 心筋若し くは冠動脈に障害を来し、 収縮力が低下するような心臓疾患が挙げられ、 具 体的には、 心筋梗塞、 拡張型心筋症、 虚血性心疾患、 うつ血性心不全等が例 示される。

[0069] 相乗的心筋再生効吴と安全性

後述する実施例で示されるよう、 bFGFによる心臓組織由来の多能性幹細胞 増殖効果は、 他の増殖因子に比べて極めて高く、 心臓組織由来の多能性幹細 胞は bFGFとの併用効果が骨髄幹細胞に比較して格段に優れている。 多分化能 を有する細胞であっても、 実際には心筋細胞への分化度は必ずしも高くなく 、 また分化した細胞が血管細胞を再生しないと心臓細胞移植療法での効果は 期待できない。 実際、 骨髄幹細胞や骨格筋芽細胞を用いた心臓細胞移植療法 の臨床試験は失敗している。

[0070] 発明者は、 種々の選択肢の中から心臓組織由来の多能性幹細胞と bFGFの組 み合わせを最良のものとして特定したのであり、 公知事項を単に組合せたも のではない。 本発明の心疾患治療薬の優れた効果は、 心筋細胞への心臓組織 由来多能性幹細胞の高い分化度とハイド口ゲルから徐放される bFGFの持続的 心血管細胞の再生向上効果が相互に作用してもたらされる相乗的な効果であ る。

[0071 ] 通常胚性幹細胞や i PS細胞は奇形腫の問題をはらむが、 組織幹細胞である心 臓組織由来の多能性幹細胞と bFGFの併用では奇形腫の合併が見られない。 ま た、 本発明の多能性幹細胞は間葉系幹細胞の特徴を呈するため、 免疫拒絶反 応が起きにくいと考えられる。 すなわち、 本発明の心疾患治療薬は安全性に おいても優れている。

実施例

[0072] 以下に、 実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれらに よって限定されるものではない。

実施例 1 ： bFGF含有ゼラチンハイドロゲルの調製

10重量％濃度の酸性ゼラチンをグルタルアルデヒドによリ化学架橋した後 、 架橋剤を不活性化した。 次に、 蒸留水にて数回洗浄し、 架橋含水率 75%の 厚さ約 0. 3~0. 4mmのシート状のゼラチンハイドロゲルを得た。 続いて 200 U g の bFGFを含む滅菌蒸留水を滴下し、 bFGF水溶液の適量をゼラチンハイドロゲ ルへ浸み込ませることによってシート状の bFGF含有ゼラチンハイド口ゲルを 得た。

[0073] 得られたシート状の bFGF含有ゼラチンハイドロゲルを 5 x 5cm四方に切断し た。 得られた bFGF含有ゼラチンハイドロゲルは、 1シート当たり、 5〜6 ju g/k gの投与量となるように bFGF含有量が調節されている。 このシート状の bFGF含 有ゼラチンハイドロゲルを、 ゴァテックス社 （登録商標） 製の PTFE (ポリ亍 トラフルォロエチレン） 心内膜パッチ （6X6GITI) の中心部に前縫合した。

[0074] 室 fife例 2 ： ヒト心臓組織由 冬能性幹細胞の取得及び該多能性幹細胞の各心 筋朐への分化能の確認

( 1 ) 細胞懸濁液の調製

ヒトから採取した心臓組織片を氷上の冷 PBS (Phosphate buffered sal in e) 入リシヤーレ内に入れて、 撹拌して心臓組織片血液を除去した。 次いで、 新たな冷 PBS入りシャーレ内で心臓組織片を洗浄した。 更に、 この心臓組織片 の洗浄を二回繰り返し、 最後に PBSを除去した。 その後、 滅菌済みのはさみを 用いて破砕した心臓組織断片を約 1mm³以下になるまで細切した。 細切した心臓 組織片 （約 10mg) を 100ml容三角フラスコに移し、 更に 0.2重量％ collagena se type2 (Worth ington社製）含有溶液 20m Iを添加し、 37°C恒温漕内で 20分 間震盪して酵素処理を行った。 次いで、 更に 10mlの電動ピぺッターを用いて 3 ml/secの速度でピペッティングを行い、 よく撹拌した後、 更に 0.1重量％ DNA se I (Worth ington社製)含有溶液 2.2mlを添加し、 37°C恒温漕内で 3分間震盪 した。 かかる酵素処理後、 20mlの 10容量 %FBS (牛胎仔血清）（Hyc lone社製)及び 1容量％ペニシリンーストレプトマイシンを含有する DMEN GIBGO社製）培地 （以 下、 「培地 1 J と表記する） を加えて酵素を中和し、 細胞含有液を調製した 後、 70 _im cell strainer (FALG0N社製）及び 40 tn cell strainer (FALCON 社製）で濾過した。 濾過後の細胞含有液を 1500rpmで 5分間遠心分離して、 その 上清を除去した後に、 10mlの培地 1を添加して細胞懸濁液 （以下、 細胞懸濁 液 1と表記する） を調製し、 これを氷中保存した。 また、 100ml容三角フラス コに残存した心臓組織片に対しても、 再度同様の処理を行い、 同様に細胞懸 濁液 （以下、 細胞懸濁液 2と表記する） を調製した。 斯くして得られた細胞 懸濁液 1及び 2を混合し、 以下記載する工程に供した。

[0075] C2) パーコールの密度勾配遠心法による心臓組織由来細胞群の分離

パーコール (percoll) 原液 (Amersham Biosciences社製) : 10xPBS (-）（ GIBC0社製） =9:1 (容量比） の溶液をパーコールストックとした。 バーコ一 ルストックを 1 X PBS (-) (61 BG0社製）で希釈し、 バーコ一ルストツクの濃度が' 3 0容量％、 70容量％の溶液を作成した。 30容量 %パーコール溶液にはフ; I：ノール レツド (SIGMA社製）を 0.1容量 %加えて着色した。 容量 15mlの円錐状チューブに 、 まず 30容量％パーコール溶液を 3ml注ぎ、 続いて電動ピぺッターを用いて 30 容量 y。パーコール溶液の下層に 70容量％ パーコール溶液を慎重に加えた。 続 いて、 ヒト心臓組織由来由来の上記細胞縣濁液 3mlを 30容量％パーコール溶液 の上層に慎重に重層した。 室温、 1000G 20分で、 加速減速を極力遅くして遠 心分画した。 遠心後、 目的の細胞集団は、 30容量 %パーコール溶液と 70容量％ パーコール溶液の界面に分布していることが確認された。 また、 一番底には 血球成分が分布しておリ、 30容量％パ一コールの上層には主に細胞破砕物が分 布していることが確認された。 パスツールピぺットにてまず細胞破砕物を除 去した後、 別のピぺッ卜で界面に存在する目的の細胞集団を容量 50mlの円錐 状チューブに回収した。 円錐状チューブに、 DMEM/n2Ham(GIBG0社製)培地を 3 0ml加え、 十分に撹拌した後、 遠心して上清を除去した。 次いで、 トリプシン -EDTA (0.05重量％トリプシン、 0.53m EDTA■ 4Ma含有） （GIBG0社製）溶液 1m Iを添加して、 37°C恒温漕内で 10分間震盪し、 細胞同士の凝集や結合を解消さ せた。 次いで、 トリプシン阻害剤 （Roche社製） 500 1を添加し、 更に DMEM/F 12 111培地(61800社製)8.5|11|を添加し、 十分に懸濁した後、 細胞数を血球計算 盤でカウントした。

[0076] (3) スフエアーの形成

上記 （2) で得られたヒト心臓組織由来細胞群を、 mouse expansion med i urn [DMEM/F12Ham (G I BGO社製)、 2重量％B27サプリメン卜（G I BG0社製）、 1容 量 ¾ penici 11 in-streptomycin 40ng/ml recom inant human basic FGF (Promega社製）、 及び 20ng/ml mouse EGF (SIGMA社製）含有] を用いて、 細 胞培養ディッシュ (noncoat eel I culture dish) (Becton Dickinson社 製） 上で、 37°c、 5% CO ₂下で 14日間、 浮遊培養を行った。 なお、 培養開始 時の細胞濃度は、 2.0x10cells/mlになるように設定した。

[0077] 培養 1日後及び 7曰後に培養液中に浮遊しているスフエアーを撮影した顕 微鏡写真を図 1に示す。 培養後、 スフヱァーを回収することにより、 ヒト心 臓組織由来のスフエアー形成細胞 （多能性幹細胞） を取得した。

[0078] (4) スフエアー形成細胞の増殖

回収したスフエアーを 2m Iの DMEM/Π 2Ham (61 BG0社製）培地に入れ、 よく混合 した後に、 これを遠心分離 （4°C、 1500rpm、 5分間） して、 上清を十分に除 去した。 次いで、 トリプシン- EDTA (0.05重量⁰ /₀トリプシン、 0.53mM EDTA■ 4Na含有） （GIBG0社製)溶液 1mlを添加し、 37°C恒温漕内で 20分間震盪すること により、 スフエアーを分解して、 スフエアーを形成している細胞 （以下、 ス フェアー形成細胞と表記する） を浮遊させた。 次いで、 トリプシン阻害剤 （R OGhe社製） 500 Iを添加し十分に懸濁した後、 細胞数を血球計算盤でカウン 卜した。

[0079] 斯くして浮遊させたスフ：]!ァ一形成細胞を、 mouse expansion medium [D

EM/F12Ham (G I BC0社製）、 2重量％B27サプリメント（G I BG0社製）、 1容量。/。 p enici 11 in-streptomycin, 40ng/ml recombinant human basic FG卜（ rome ga社製）、 及び 20ng/ml mouse EGF (SIGWIA社製)含有] を用いて、 培養開始 時の細胞濃度を 20_Gells/jU I として、 フイブロネクチンコーティング細胞培 養ディッシュ上で、 37°C、 5%G0₂下で 3日間培養を行った。

[0080] 培養後のスフ Iァー形成細胞について、 各種マ一カー （Rex 1、 Nkx-2.5 Oct 4、 Nanog、 GATA - 4、 Sox 2) の発現を、 PCRにより分析した。 得られた 結果を図 2に示す。 この結果から、 ヒト心臓組織由来のスフエアー形成細胞 は、 外胚葉系幹細胞や胚性幹細胞と同様の分化特性を備えていることが確認 された。

[0081] また、 増殖させたスフエア一形成細胞について各種細胞表面抗原 c-kit、 CD 45、 GD3K GD34、 HLA-MHC class Iし GD90、 CD29、 CD73、 stro- 1及び GD105 について分析した。 分析結果を図 3に示す。 この結果から、 ヒト由来のスフ エアー形成細胞は、 G- Idt陰性、 GD45陰性、 GD31陰性、 GD34弱陽性、 HLA- MHG class II陰性、 CD90陽性、 GD29陽性、 GD73陽性、 stro- 1陽性及び GD105陽 性であることが確認された。

[0082] 」5) スフェァー形成細 の心筋細胞への分化の確認 上記 （4) で増殖させたスフ Xァ一形成細胞を遠心分離により回収し、 該 細胞を 1 x10- ⁸モル /1のデキサメサゾン及び 1容量/W)penici 11 in - streptomycin を含有する MEM培地 （GIBG0社製） で、 37°C、 5%C 0₂下で 21日間培養を行 し、、 心筋細胞への分化誘導を行った。 これによつて、 ヒ卜心臓組織由来のス フェアー形成細胞が、 拍動する心筋細胞に分化することが確認された。 なお 、 心筋細胞への分化は、 下記の分析結果からも確認された。

[0083] くヒト心筋特異的トロポニン一 T染色による分析 >

分化誘導後の細胞をヒト心筋特異的トロポニン一 Tで染色して観察したとこ ろ、 心筋細胞の存在が確認された （図 4参照） 。

[0084] <PCRによる分析 >

分化誘導開始 21曰後の細胞について、 各種マーカー （Nkx- 2.5、 GATA4、 A NP、 α-ca-actin. Tn丁、 MLG2v_N Mし G2a、 α-ΜΗ0(α -myosin heavy chamj、 yS-MHCCS -myosin heavy chain), jSactin) の発現を、 PGRにより分析した 。 得られた結果を図 5に示す。 図 5から分かるように、 デキサメサゾンの存 在下で培養することによって、 上記各種マーカーが発現されており、 上記ヒ ト心臓組織由来スフ工ァー形成細胞が心筋細胞に分化したことが確認された

[0085] (6) 結果

以上に示す結果から、 得られたスフエアー形成細胞は、 自己複製能と共に 、 少な〈とも心筋細胞に分化する特性を備えており、 心筋幹細胞として有用 な多能性幹細胞であることが明らかとなった。

[0086] 実施例 3 ：心筋粳案ミニブタの作成及び治療

(1 ) 心筋粳案ミニブタの作成

ミニブタ （約 30kg、 8週齢、 雌） に、 経皮的バルーンカテーテルにて、 左冠 動脈を 90分間閉塞した後に再開通させ、 続いて 28日間飼育することにより、 左室駆出率（left ventricular ejection fraction: LVEF)が約 60%から 3 5~45%まで低下した心筋梗塞ミニブタを作成した。 28曰飼育後の心筋梗塞ミ 二ブタを用いて、 以下の治療を実施した。 ( 2 ) 心筋梗塞ミニブタへの bFGF含有ゼラチンハイドロゲル及び多能性幹 細胞の投与

上記で作成した心筋梗塞ミニブタを以下の 5つのグループに分けて、 梗塞 心筋の治療を行った。

グループ A (n=10) ： ミニブタの胸部を切開して、 ミニブタの体重 1 kg当たり 培地 3m lを梗塞心筋に投与した後、 図 6に示すように、 心内膜パッチが鏠 合されたシート状 bFGF含有ゼラチンハイド口ゲル （投与量： 5~6 j« g/(<g) を 梗塞心筋に被せてパッチ縫合した。

グループ B (n=10) ： ミニブタの胸部を切開して、 上記心臓組織由来の多能 性幹細胞を DMEM培地に懸濁した状態で、 ミニブタの体重 1 kg当たリ 5 X 10⁵〜6 x 10⁵個となるように梗塞心筋に投与した。 シート状 bFGF含有ゼラチンハイドロ ゲルは投与しなかった。

グループ C (n=10) ： ミニブタの胸部を切開して、 骨髄由来間葉系幹細胞 （ 独立行政法人理化学研究所： RI KEN CELL BANK. RCB HMS0008, HMS0043,

HMS0019, HMS0021 , HMS0024, HMS0048, HMS0049) を DMEM培地に懸濁し た状態で、 ミ二ブタの体重 1 kg当たり 5 X 10⁵〜6 X 10⁵個となるように梗塞心筋 に投与した後、 心内膜パッチが縫合されたシート状 bFGF含有ゼラチンハイド 口ゲル （投与量： 5〜6 3/1 ) を梗塞心筋に被せてパッチ縫合した。

グループ D (n=10) ： ミニブタの胸部を切開して、 上記心臓組織由来の多能 性幹細胞を 培地に懸濁した状態で、 ミニブタの体重 1 kg当たリ 5 X 10⁵〜6 x 10⁵個となるように梗塞心筋に投与した後、 心内膜パッチが縫合されたシート 状 bFGF含有ゼラチンハイドロゲル （投与量： 5〜6 jt g/kg) を梗塞心筋に被せ てパッチ縫合した。

ゲル一プ E (n=10) ： ミニブタの胸部を切開して、 上記心臓組織由来の多能 性幹細胞を 培地に懸濁した状態で、 ミ二ブタの体重 1 kg当たリ 5 x 10⁶〜6 x 10⁶個となるように梗塞心筋に投与した後、 心内膜パッチが縫合されたシート 状 bFGF含有ゼラチンハイド口ゲル （投与量： 5〜6 ju g/kg) を梗塞心筋に被せ てパッチ縫合した。 [0088] ( 3 ) 心筋梗塞ミニブタの治療効果の評価

上記 （2) の移植治療から 28日間飼育し、 以下に示す項目について評価し 、 ミニブタの梗塞心筋の治療効果を判定した。

<ホス卜心筋における多能性幹細胞の生着性の評価 >

移植治療から 4及び 28日後に、 ホスト心筋に生着したドナー細胞 （上記心臓 組織由来の多能性幹細胞） を SP 10 (superparamagnetic iron oxide)でラベ ルし、 鉄染色した。 この染色によって、 多能性幹細胞は茶色に染まり、 MRIに てその陰影が黒色に可視化される。 この染色結果から、 ホスト心筋における 多能性幹細胞の生着性を判定した。

[0089] 結果を図 7に示す。 図 7の上段には、 心臓組織由来の多能性幹細胞を SPI0で ラベルし、 鉄染色した結果を示す。 図 7の下段左には、 グループ B及び Dにお いて、 移植治療から 4及び 28日後の梗塞心筋部位に生着した多能性幹細胞を MR Iにて可視化した画像を示す。 また、 図 7の下段右には、 グループ B及びりに おいて、 移植治療 28曰後に梗塞心筋部位に生着した多能性幹細胞の割合 （SPI 0 survival ratio) を示す。 この結果から、 bFGF含有ゼラチンハイドロゲ ルと多能性幹細胞 （投与量： 5x10⁵~6x10⁵個/ kg) を併用投与した場合に、 多能性幹細胞 （投与量： 5x10⁵~6x10⁵個/ kg) 単独の場合に比して、 ホスト 心筋への生着性が有意に向上することが確認された。

[0090] <催不整脈作用の検証 >

移植治療 28曰後に、 各グループのミニブタの心電図解析を行い、 催不整脈 作用を検証した。 グループ A~Eのミニブタ移植治療 28曰後の心拍数 （HR) 、 pause, 及び心室期外収縮 (VPG)を測定した結果を図 8に示す。 図 8から分か るように、 bFGF含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞 （投与量： 5x10⁶〜 6x10⁶個/ kg) を併用投与したグループ Eでは、 心室期外収縮が多く認められ た。 これに対して、 bFGF含有ゼラチンハイド口ゲルと多能性幹細胞 （投与量 : 5x10⁵〜6x10⁵個/ kg) を併用投与したグループ Dでは、 心室期外収縮が顕 著に抑制されていた。

[0091] ぐ心機能の解析 > 移植治療 28日後に、 各グループのミニブタの心機能について、 1及び心ェ コ一法により解析した。 結果を図 9に示す。 図 9の上段には駅 Iにより左室駆出 率 (LVEF)を測定した結果、 下段にはエコー法によリ左室駆出率を測定した結 果を示す。 この結果から、 bFGF含有ゼラチンハイド口ゲルと多能性幹細胞 （ 投与量： 5x10⁵~6x10⁵個/ kg) を併用投与したグループ Dにおいてのみ、 心 機能の顕著な改善が認められた。 一方、 bFGF含有ゼラチンハイド口ゲルと多 能性幹細胞 （投与量： 5x10⁶~6x10⁶個/ kg) を併用投与したグループ Eでは 、 心機能の有意な改善効果は認められなかつた。

[0092] <梗塞サイズと微小心筋血流の改善度の解析 >

移植治療 28日後に、 各グループのミニブタの梗塞サイズと微小心筋血流の 改善度について、 コントラスト駅 Iとコントラスト心エコー法により解析した 。 結果を図 10に示す。 図 10の上段には梗塞サイズ （Infarction volume) を 測定した結果、 下段には微小心筋血流 （perfusion ratio) を測定した結果 を示す。 図 9から明らかなように、 bFGF含有ゼラチンハイド口ゲルと多能性 幹細胞 （投与量： 5x10⁵〜6x10⁵個/ kg) を併用投与したグループ Dにおいて のみ、 梗塞サイズと微小心筋血流において有意な改善度が認められた。 一方 、 bFGF含有ゼラチンハイド口ゲルと多能性幹細胞 （投与量： 5x10⁶〜6x10⁶個 /kg) を併用投与したグループ Eでは、 グループ A及び Bと同程度の改善度し か認められなかった。

[0093] ぐ血管新生度の解析 >

移植治療 28曰後に、 各グループのミニブタの血管密度を測定することによ リ、 血管新生度を解析した。 図 11に、 各グループについて、 梗塞部位全体 (to tal) の血管密度、 梗塞周辺部 （Border area) の血管密度、 梗塞中心部 （S car area) の血管密度、 直径 <50jumの血管密度、 直径 >50j«mの血管密度を それぞれ示す。

[0094] この結果からも、 bFGF含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞 （投与量 ： 5x10⁵〜6x10⁵個/ kg) を併用投与したグループ Dにおいて、 最も有効な血 流改善効果が認められた。 [0095] <心筋細胞再生の評価 >

移植治療 28日後の各グループのミニブタの心臓の心筋において再生された 心筋細胞の評価を行った。 各グループのミニブタの心臓の心筋において、 新 たに再生されたヒト心筋細胞を、 ヒ卜のトロポニン- 1プロモーターで制御さ れている beta- ga l (赤色）と human Y染色体 （赤色） にて検出した。 また、 ホ ストのブタ心筋細胞はブタ特異的遺伝子プローブ （黄） にて区別した。 なお 、 全心筋細胞は act i n (緑）、 核は DAP I (青）で検出した。 結果を図 12に示す。 図 12に示す写真は、 グループ Dのミニブタの心臓の心筋を染色した結果である 。 上段には beta- ga l (赤色）、 中段には human Y染色体 (赤色） 、 及び下段に はブタ特異的遺伝子プローブ （黄） で染色した結果を示す。 また、 図 12中、 右上のグラフは、 生着している多能性幹細胞の内、 心筋細胞に分化した割合 (心筋細胞分化率） を示し、 右下のグラフには、 多能性幹細胞から心筋細胞 に分化した細胞の内、 細胞融合を介した心筋細胞分化を示す細胞の割合 （細 胞融合を介する心筋分化率） を示す。

[0096] この結果からも、 bFGF含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞 （投与量 ： 5 x 10⁵~6 x 10⁵個/ kg) を併用投与したグループ Dが、 グループ C及び Eに 比して、 心筋細胞の再生が格段に優れていることが確認された。

[0097] <虚血心での心筋繊維化の形態とマク口ファージの浸潤度の解析 >

移植治療 28日後の各グループのミニブタの心臓の心筋において、 心筋繊維 化の形態とマク口ファージの浸潤度を解析した。 各グループのミニブタの心 臓の心筋に、 Masson- tri chrome染色を行って、 線維化している細胞を可視化 した。 また、 グループ D及び Eの心筋中に存在するマクロファージ CD68とマ クロファージ CD163を染色した。 結果を図 13に示す。 図 13の上段に、 各グルー プのミニブタの心臓の心筋に対して Masson-tr i chrome染色を行った結果を示 す。 また、 図 13の下段には、 グループ D及び Eの心筋中に存在するマクロフ ァージ GD68とマクロファージ GD163を染色した結果を示す。 この結果から、 bF GF含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞 （投与量： 5 x 10⁶~6 x 10⁶個 /kg ) を併用投与したグループ Eは、 心筋繊維化が最も強く認められた。 また、 グループ Dでは、 グループ Eに比べて、 抗炎症マクロファージ CD163が減少し ており、 炎症惹起マクロファ一ジ GD68が増加していることが確認された。 即 ち、 本試験結果からも、 bFGF含有ゼラチンハイド口ゲルと多能性幹細胞 （投 与量： 5 x 10⁵~6 x 10⁵個/ kg) を併用したグループ Dでは十分な梗塞心筋の治 療効果が認められるものの、 bFGF含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞 (投与量： 5 x 10⁶~6 x 10⁶個/ kg) を併用したグループ Eでは、 十分な梗塞心 筋の治療効果が得られていないことが示された。

[0098] <炎症性サイトカインの発現量の解析 >

移植治療 28日後のグループ D及び Eのミニブタの心臓の心筋において、 各 種炎症性サイトカイン （I L - 1 、 I L - 6、 " 10、 TNF- ） の発現量を測定した 。 結果を図 14に示す。 グループ Eは、 グループ Dに比べて、 炎症性サイ卜力 インである I L-6と TNF - a I phaの発現上昇が有意に認められた。

[0099] <まとめ >

以上の結果から、 bFGF含有ゼラチンハイド口ゲルと多能性幹細胞 （投与量 ： 5 x 10⁵~6 x 10⁵個/ kg) を併用投与したグループ Dでは、 他のグループに比 して、 顕著に優れた梗塞心筋の治療効果が認められた。 'グループ Dで認めら れた梗塞心筋の治療効果は、 従来の治療方法では実現し得ないレベルにあり 、 臨床上の実用が強く要望される。

[0100] また、 bFGF含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞 （投与量： 5 x 10⁶~6 x 10⁶個/ kg) を併用投与したグループ Eでは、 有効な梗塞心筋の治療効果が認 められなかったことから、 bFGF含有ゼラチンハイドロゲルとの併用する際に 、 当該多能性幹細胞の生着性の向上及び心筋細胞の再生を臨床上有効ならし めるには、 多能性幹細胞の投与量を 10 X 10⁵個/ kg以下に設定することに臨界的 意義があることが明らかとなつた。

[0101 ] なお、 ミニブタはヒトモデルとして最適な実験動物であり、 ミニブタをモ デルとした動物試験から明らかにされた薬物の有効投与量は、 ヒ卜への薬物 投与量にも適用できることは、 当該技術分野で周知である。 従って、 上記の 試験結果は、 ヒトに対して bFGF含有ゼラチンハイド口ゲルと多能性幹細胞 （ 投与量： 1 x 10⁵~ 10 x 10⁵個/ kg、 好ましくは3 10⁵〜8 10⁵個、 更に好ましく は 5 x 10⁵~7 x 10⁵個） を併用投与する際に認められる治療有効性を十分に裏付 けるものである。

[0102] 実施例 4 ： bFGFの各種増殖因子の効果

実施例 2にしたがい、 ヒト心臓組織由来多能性幹細胞を調製した。 bFGFに よる増殖効奥 - この心臓組織由夹多能性幹細胞 (CDC)と同一検体より精製し た線維芽細胞 (cFB)において比較した。 図 1 5 (左） に示されるよう、 bFGFに よる増殖効果は、 心 組織由来多能性幹細胞に対してのみ顕著でぁリ、 同一 検体より精製した線維芽細胞 (GFB)はあまり増殖させなかった。

[0103] また、 bFGnこよる t曾 交力 夯、 ±ΪΡ.の ,Γ 糸 S織 性. 細 (GDG)と固 一検体よリ精製した骨髄幹細胞 (BMG)において、 DNAの合成能として比較した 。 DNAの合成能は BrdUの取り込みで評価し、 bFGFの刺激前後の値と各群間での 取り込み能の変化率における絶対値を統計学的に検定した。 図 1 5 (中） に 示されるよう、 bFGFによる増殖効果は、 心臓組織由来多能性幹細胞に対して のみ顕著であり、 同一検体よリ精製した骨髄幹細胞 (BMG)はあまリ増殖させな かった。

[0104] さらに、 上記のヒト心臓組織由夹多能忡幹細胞における bFGF制激後 1 0分の 各チロシンキナーゼのリン酸化を Western b l ot法により検討した。 図 1 5 ( 右） に示されるよう、 bFGF刺激を加えた細胞では、 Akt， ERK1 /2, p38の著明 なリン酸化が認められ、 これらが媒介するシグナル伝達系を通じて細胞を増 殖させることが確認された。

[0105] 次いで、 他の増殖因子 （HGF、 I 6F-1 ) について、 ヒト心臓組織由来多能性 幹細胞に対する増殖効果を検討したところ、 HGFや I GF-1の添加では目視で細 胞の増殖は確認できなかつた（data not shown)。

[0106] 実施例 5 ：安全性 （奇形腫合併の有無） の確認

実施例 3にしたがって心筋梗塞ミニブタを作成し、 慢性心筋梗塞 1ヶ月後に bFGF含有ゼラチンハイドロゲルとヒト心矓翊織由来多能性幹細胞 (CDC) »同時 移植し、 この処置群（bFGF+GDG)を無処置群（contro l )と比較した。 図 1 6 Aは 左室駆出率 (LVEF)を、 図 1 6 Bは梗塞サイズ（i nfarct vo l ume)の経時的推移 (移植前、 移植後 4週間、 移植後 16週間） を示す。 さらに、 両群における移 植したドナー細胞 (CDG)の生着性を細胞移植後 MR Iで評価した。 図 1 6 Cは、 1 6週目での典型的 MR I像を示す （黄色の矢印は生着したドナー細胞を示す） を 、 図 1 6 Dは、 bFGF+GDG移植群のドナー細胞の生着性を、 移植直後に当たる 4 日目の生着率を 100%として経時的に評価したものである。

[0107] 図 1 6に示されるよう、 本発明の bFGF含有ゼラチンハイドロゲルとヒト 臓糸織由来多能性幹細胞 (GDG)の同時移植の効粟は長期的に保持され、 奇形腫 の合併は全くみられなかった。

[0108] 本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考と して本明細書中にとリ入れるものとする。

産業上の利用可能性

[0109] 本発明の心疾患治療薬によれば、 細胞移植療法による心疾患の治療におい て、 心臓組織由来の多能性幹細胞の生着性の顕著な向上が認められ、 心筋細 胞を再生させることができる。 本発明の心疾患治療薬を用いて心疾患の細胞 移植療法を行えば、 従来の細胞移植療法では実現し得ない疾患改善度を達成 することが可能になる。 従って、 本発明は、 心臓移植を必要とする患者、 人 ェ心臓の補助から離脱困難な末期心不全症患者、 又はこれに準ずる患者の心 疾患治療薬として有用である。

Claims

請求の範囲

[I] 塩基性繊維芽細胞成長因子を含むハイドロゲルと、 心臓組織由来の多能性 幹細胞とを含む、 細胞移植療法に用いられる心疾患治療薬。

[2] 前記ハイドロゲルと、 前記多能性幹細胞とを含むキッ卜として構成されて いる、 請求項 1に記載の心疾患治療薬。

[3] 前記ハイド口ゲルが、 ゼラチン、 コラーゲン、 デンプン、 ぺクチン、 ヒア ルロン酸、 キチン、 キトサンまたはアルギン酸及びこれらの材料の誘導体か らなる群よリ選ばれる少なくとも 1種類のハイドロゲルである、 請求項 1又 は 2に記載の心疾患治療薬。

[4] 前記ハイド口ゲルが、 コラーゲンハイド口ゲル又はゼラチンハイド口ゲル である、 請求項 3に記載の心疾患治療薬。

[5] 塩基性繊維芽細胞成長因子を含むハイドロゲルの投与量が、 塩基性繊維芽 細胞成長因子量換算で、 患者の体重 1 kg当たり 1〜 100 gとなるように構成さ れている、 請求項 1〜 4のいずれかに記載の心疾患治療薬。

[6] 前記ハイドロゲルがシート状である、 請求項 1〜 5のいずれかに記載の心 疾患治療薬。

[7] さらに生体内非分解性高分子支持体を含む、 請求項 6に記載の心疾患治療 薬。

[8] 前記ハイドロゲルが前記生体内非分解性高分子支持体に固定化して投与さ れるものである、 請求項フに記載の心疾患治療薬。

[9] 前記生体内非分解性高分子支持体がポリ亍トラフルォロエチレンである、 請求項 8に記載の心疾患治療薬。

[10] 前記塩基性繊維芽細胞成長因子が、 前記多能性幹細胞 1 x 10⁶に対して、 少な くとも〗〜 100ju gで投与されるように構成されている、 請求項 1〜 9のいずれ かに記載の心疾患治療薬。

[I I ] 前記多能性幹細胞が、 患者の体重 1 kg当たり 1 x 10⁶以下で投与されるように 構成されている、 請求項 1 〜 1 0のいずれかに記載の心疾患治療薬。

[12] 前記多能性幹細胞が、 患者の体重 1 kg当たリ 1 X 10⁵~10 x 10⁵個で投与される ように構成されている、 請求項 1 1に記載の心疾患治療薬。

[13] 前記多能性幹細胞が、 CD90陽性、 GD29陽性、 GD73陽性、 stro-1陽性及び CD1

05陽性である、 請求項 1 〜 1 2のいずれかに記載の心疾患治療薬。

[14] 前記多能性幹細胞が、 下記工程を経て調製されるものである、 請求項 1 〜

1 3のいずれかに記載の心疾患治療薬：

( ί )ほ乳動物から採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を 調製する工程、

( i i )密度勾配法によリ、 上記細胞懸濁液から心臓組織由来細胞群を分離する 工程、 及び

( i i i )得られた心臓組織由来細胞群を、 塩基性繊維芽細胞成長因子及び上皮細 胞増殖因子を含有する培地で浮遊培養した後、 浮遊状のスフ Xァーを形成し ている細胞を選択し分離する工程。

[15] 前記多能性幹細胞が、 患者の心臓組織由来のものである、 請求項 1 ~ 1 4 のいずれかに記載の心疾患治療薬。

[1 6] 前記多能性幹細胞が、 患者以外の心臓組織由来のものである、 請求項 1 ~

1 4のいずれかに記載の心疾患治療薬。

[17] 前記多能性幹細胞が株化された細胞である、 請求項 1 〜 1 4のいずれかに 記載の心疾患治療薬。