CN110124104B - 一种用于制备心肌补片的组合物及其应用 - Google Patents

一种用于制备心肌补片的组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于制备心肌补片的组合物及其应用，所述用于制备心肌补片的组合物包括：明胶10‑100份，甘油4‑100份，结冷胶5‑50份，氧化石墨烯3‑10份，多巴胺0.6‑5份，伊桐苷0.5‑20份。添加结冷胶，氧化石墨烯，多巴胺，甲基丙烯酸酐，伊桐苷，不仅提高的组合物的导电性，也提高了机械延展性，同时，还使材料具备的清除自由基的效果。

Description

一种用于制备心肌补片的组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药和医疗器械技术领域，具体而言，涉及一种用于制备心肌补片的组合物及其应用。
背景技术
缺血性心脏病作为我国主要健康问题之一，给我国及世界其他国家带来了沉重的经济负担。心肌细胞是一种终末分化的细胞，坏死后难以再生。尽管目前的药物，介入以及外科手术治疗缺血性心脏病可以有效的改善心肌供血，挽救濒死心肌，可是对于已经造成死亡的无功能心肌并没有修复作用。大面积的心肌死亡可引起的严重的心律失常、心衰以及心肌骤停。对于晚期心脏病的治疗，目前较为有效的方法是心肌移植。但是心肌移植的供体数量少，强烈的免疫排斥反应等因素增加了医疗成本并导致很难在临床上大范围应用。
干细胞或心肌细胞的植入作为一种细胞治疗手段，为治疗心肌梗塞提供了一种极具潜力的解决方案，而干细胞植入作为一种细胞治疗手段，为治疗心肌梗塞提供了一种极具潜力的解决方案。目前已经有很多临床研究充分证实干细胞植入可以改善心梗患者的心肌功能。但是干细胞或心肌细胞的植入治疗最大的瓶颈在于细胞植入后容易大量流失，无法聚集在治疗靶点，而且长期存活率非常低，这些都严重影响临床疗效。为了解决这个问题，科研人员设想将干细胞与某种生物材料复合后，再植入到心肌梗死的部位或者固定到心肌梗死区域，就此，提出了心肌补片的概念。因此，通过组织工程手段制备心肌补片产品引起了国内外专家的重视：使干细胞或心肌细胞按照一定的空间顺序排列形成细胞片层结构，可更准确地作用于心肌梗死区域，提高细胞停留率与存活率，避免过多干细胞的流失，提高治疗效果，降低治疗风险。
理想的心肌补片通常具有以下特点：作为心肌补片的细胞支撑材料具有良好的弹性、可延展性、稳定性、可塑性和有一定的机械强度，不会因必肌细胞的跳动损坏支架。作为心肌补片的细胞支撑材料具有良好的生物相容性，在体内不引起炎症反应、毒性反应和免疫排斥反应，当心肌补片移植到动物模型体内，不会因心脏高速和高强度的跳动而脱离心肌梗死部位。心肌补片的细胞支撑材料具有同步收缩的能力和良好的导电性能进行生物电传导并避免移植体内后发生严重的心律失常。心肌梗死往往伴随着局部缺血、缺氧和炎症微环境等特征，进而梗死部分有大量氧自由基(ROS)的产生，从而引起细胞的损失加重疾病的发生。心肌补片的细胞支撑材料应具有良好清除微环境中的ROS的能力。
目前大多数心肌补片并不能具有上述所有的特性。现有技术中，通常采用天然聚合物作为心肌修补具有良好的生物相容性，例如，明胶，海藻酸钠，I型胶原和纤维蛋白，但是其弹性较弱，压缩后不易回复原有形状。大孔壳聚糖－明胶冷冻凝胶具有良好的弹性特性，但其导电性能微弱。而合成水凝胶包括聚丙烯酸(PAA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)，是在人工条件下通过加成反应、开环聚合等反应制备成的交联聚合物体系。合成水凝胶具有易工业化生产和化学改性，性能可精确调控等优点，而且具有良好机械延展性，但与天然水凝胶相比，缺少细胞粘附位点，其生物相容性和生物降解性较差。
为了获得能在体内发挥良好性能的心肌补片材料，研究人员通常采用多种物质混合的方式，来获得具有多种性能的材料。现有技术中通常会采用静电纺丝纳米纤维，如PHBV、PANi和PVDF作为心肌补片的支架材料，虽然这样的材料可以获得稳定的、孔隙率高的补片，但是上述材料的生物相容性较长，细胞在其上生长的状态并不理想。为了克服这些问题，有现有技术采用基于明胶的水凝胶和聚吡咯组合制备支架，虽然，其有良好的细胞相容性和电导性，但是，其机械性能较差，制备过程中容易破碎，而上述材料本身并不具有清除ROS的能力，这就导致了其难以在体内更好恢复心肌梗死部位的活性。
可见，提供一种有良好的机械延展性，细胞相容性，并且能够在体内发挥清除ROS的能力，更好的恢复心肌梗死部位活性的心肌补片复合材料，是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明为了解决现有技术中存在的上述问题，提供了一种用于制备心肌补片的组合物，其具良好的机械延展性，细胞相容性，并且能够在体内发挥清除ROS的能力，所述组合物的特征在于，包含水凝胶，甘油，氧化石墨烯，多巴胺，去除自由基的物质。
在一个实施方式中，去除自由基的物质优选为伊桐苷，所述伊桐苷又称为伊桐苷O(Itoside O)，其来源于大风子科栀子皮属落叶乔木—伊桐，为伊桐的活性提取物，属于一个新的链状单萜苷类成分，经波谱方法鉴定为3，7-dimethyl-1，6-octadien-3，10-dihydroxyl-10-O-α-L-arabinopyranosyl(1-6)-O-β-D-glucopyranoside(Chai XY，XuZR，Tang LY，et al.Itoside O，a new linear monoterpene glycoside from the barkand twigs of Itoa orientalis.Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2008；17(1)∶79～81)。伊桐苷具有清除自由基，抑制脂质过氧化的作用，可以防止和修复缺氧、缺血或再灌注给细胞带来的损伤。
Figure BDA0002096827570000031
去除自由基的物质还可以是二氮嗪(diazoxide)，二氮嗪是一种选择性的mitoK+ATP通道开放剂，它能够显著改善离体大鼠心肌缺血再灌注后心功能的恢复，减少乳酸脱氢酶(IDH)的释放，具有较好的心肌保护作用。
去除自由基的物质还可以是谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的三肽，其广泛的存在于动植物中，且在生物体内参与多种反应。现代药理学研究表明，巯基基团使得谷胱甘肽具有较强的抗氧化性及清除自由基作用。在清除自由基的反应中，谷胱甘肽参与体内氧化还原反应过程，与过氧化物、亲电子基及自由基结合，保护细胞膜中蛋白质和酶不被氧化还原反应破坏，此外有研究表明谷胱甘肽还参与调节细胞增生、机体免疫应答以及在神经系统中充当神经调质和神经递质的作用。
在一个实施方式中，所述水凝胶可以是天然聚合物，作为心肌修补材料具有良好的生物相容性，例如，明胶，海藻酸钠，I型胶原和纤维蛋白，也可以是合成水凝胶如聚乙二醇(PEG)。优选的，所述水凝胶为明胶，更加优选的是，所述水凝胶为甘油，结冷胶，明胶的共混物，最为优选的，所述甘油，结冷胶，明胶的共混物利用甲基丙烯酸酐进行改性。
在一个实施方式中，所述甘油为丙三醇，能从空气中吸收潮气，也能吸收硫化氢、氰化氢和二氧化硫。难溶于苯、氯仿、四氯化碳、二硫化碳、石油醚和油类。丙三醇是甘油三酯分子的骨架成分。相对密度1.26362。熔点17.8℃。沸点290.0℃，其对明胶有增塑作用，可以提高明胶的热稳定性和机械延展性。
在一个实施方式中，所述结冷胶为一种植物凝胶是Gelzan胶，由微生物发酵制备，其凝固点、熔点和弹性、硬度都可以调节，其与附加物有良好兼容性、热稳定性好等特性，其可以提高明胶的负载能力，优选的，所述结冷胶为G3251(Phytotechlab公司生产的一种植物凝胶，CAS:71010-52-1)。
在一个实施方式中，所述氧化石墨烯为具有良好的导电性和机械性能，其可以提高水凝胶的导电性能和机械性能。
所述多巴胺具有超强粘附、良好的生物相容性及细胞亲和性等特性，可以增加强细胞在心肌补片上的粘附性。
在一个实施方式中，所述用于制备心肌补片的组合物包括明胶，甘油，结冷胶，氧化石墨烯，多巴胺，伊桐苷，优选的，所述用于制备心肌补片的组合物包括：明胶10-100份，甘油4-100份，结冷胶5-50份，氧化石墨烯3-10份，多巴胺0.6-5份，伊桐苷0.5-20份；最优选的，所述用于制备心肌补片的组合物包括：明胶20份，甘油8份，结冷胶10份，氧化石墨烯0.4份，多巴胺1.2份，伊桐苷2.5份。
在一个实施方式中，所述用于制备心肌补片的组合物的制备方法包括：(1)将明胶，甘油，结冷胶制备成透明的MA-Gelzan-Gly共混液；(2)将甲基丙烯酸酐加入到共混液，获得改性的MA-Gelzan-Gly水凝胶；(3)将改性的MA-Gelzan-Gly水凝胶与氧化石墨烯混合，获得负载氧化石墨烯的MA-Gelzan-Gly-Go水凝胶；(4)将MA-Gelzan-Gly-Go水凝胶与多巴胺、伊桐苷混合，以过硫酸铵为引发剂，TEMED为聚合助剂，获得所述用于制备心肌补片的组合物MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA；优选的，所述方法包括
(1)将2g明胶在60℃条件下完全溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，获得10w/v％的明胶溶液，将0.8g的甘油溶于蒸馏水中，获得4w/v％的甘油溶液，将1g的结冷胶在60℃条件下溶于蒸馏水中，获得10w/v％的结冷胶溶液，将上述三种溶液以1.2:1:1.5的比例混合，磁力搅拌1h，得到MA-Gelzan-Gly共混液；
(2)将4ml的甲基丙烯酸酐缓慢滴加到MA-Gelzan-Gly共混液中；在50℃的条件下搅拌1-3小时，使之逐渐反应，然后加入PBS进行稀释后终止反应，反应物加入透析袋内用去离子水透析5-9天，每6-12小时更换一次去离子水，冷冻干燥保存，获得改性的MA-Gelzan-Gly水凝胶；
(3)将40mg的石墨烯制备成4mg/ml溶液，将步骤(2)中改性的MA-Gelzan-Gly水凝胶制备成10％溶液，将10％的MA-Gelzan-Gly水凝胶溶液与石墨烯溶液以4:2的比例进行混合，置于4℃冰箱2-4h，获得负载氧化石墨烯的MA-Gelzan-Gly-Go水凝胶；
(4)在步骤(3)制备的MA-Gelzan-Gly-Go水凝胶，加入0.12g的多巴胺、0.25g的伊桐苷，混合均匀，加入3ml 20％的过硫酸铵和1ml TEMED溶液，置于4℃冰箱过夜，获得所述用于制备心肌补片的组合物MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA。
在一个实施方式中，所述用于制备心肌补片的组合物可以用于制备心肌补片，优选的，将心肌细胞或多能干细胞接种于所述组合物，优选的，所述多能干细胞为脂肪干细胞，间充质干细胞，骨髓干细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：本发明提供一种可以用于制备心肌补片的组合物，采用明胶作为基底物质，通过添加结冷胶，氧化石墨烯，多巴胺，甲基丙烯酸酐，伊桐苷，不仅提高的组合物的导电性，也提高了机械延展性，同时，还使材料具备的清除自由基的效果。通过摸索不同物质的配比和制备工艺，为现有技术提供了一种可以产业上应用的，性能优良的，能更好的恢复心肌梗死部位活性的心肌补片复合材料，具有良好的市场前景和社会公益价值。
附图说明
图1：MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-a、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-b、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-c的弹性模量测试结果图；
图2：MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-c、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-d、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-e、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-f的弹性模量测试结果图；
图3：MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-c、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-e、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-h的心肌细胞增殖情况；
图4：移植组、心梗对照组以及假手术组的HE染色图，其中a为假手术组，b为心梗对照组，c为移植组。
具体实施方式
以下通过本发明的最佳实施方式对本发明进行详细说明，但是，以下内容不应理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1用于制备心肌补片的组合物MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA的制备
1、MA-Gelzan-Gly共混液的制备
称取明胶(Sigma)2g，放入20ml的PBS溶液中，水浴加热60℃，通过磁力搅拌40min，充分溶解，获得10w/v％的明胶溶液；将0.8ml的甘油溶于20ml蒸馏水中，混匀，获得4v/v％的甘油溶液；称取G3251(Phytotechlab公司生产的一种植物凝胶，CAS:71010-52-1)1g，放入10ml的PBS溶液中，水浴加热60℃，通过磁力搅拌30min，充分溶解，获得10w/v％的G3251溶液；将上述10w/v％的明胶溶液、4w/v％的甘油溶液、10w/v％的G3251溶液以体积比1:1:1的比例混合，水浴加热60℃下，磁力搅拌1h，得到MA-Gelzan-Gly共混液。
2、改性的MA-Gelzan-Gly水凝胶的制备
将4ml的甲基丙烯酸酐缓慢滴加到MA-Gelzan-Gly共混液中；在50℃的条件下搅拌1-3小时，使之逐渐反应，然后加入100ml PBS进行稀释后终止反应，反应物加入透析袋内用去离子水透析7天，每8小时更换一次去离子水，冷冻干燥保存，获得改性的MA-Gelzan-Gly水凝胶；
3、负载氧化石墨烯的MA-Gelzan-Gly-Go水凝胶的制备
在冰水浴下，将1g天然鳞片石墨，2g NaNO3在搅拌下缓慢加入到25mL浓硫酸中，搅拌均匀，再缓慢加入3g高锰酸钾，控制反应温度在5℃以下反应3h，再35℃搅拌反应2h。然后滴加46mL的去离子水，高温反应0.5h，控制反应温度不超过85℃，然后加60℃去离子水40mL，搅拌均匀，加30％的双氧水，直至无气体产生，溶液变成亮黄色。抽滤，洗涤，透析至中性，冷冻干燥。取40mg氧化石墨烯配成浓度为4mg/mL的溶液，超声30min(频率40kHz，功率200W)，制得均匀的氧化石墨烯溶。
将改性的MA-Gelzan-Gly水凝胶制备成10％溶液，将10％的MA-Gelzan-Gly水凝胶溶液与石墨烯溶液以4：1的比例进行混合，置于4℃冰箱2-4h，获得负载氧化石墨烯的MA-Gelzan-Gly-Go水凝胶；
4、组合物MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA的制备
在步骤3制备的MA-Gelzan-Gly-Go水凝胶，加入0.12g的多巴胺、0.16g的伊桐苷，混合均匀，加入3ml 20％的过硫酸铵和1ml TEMED溶液，置于4℃冰箱过夜，获得所述用于制备心肌补片的组合物MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA。
5、组合物MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA制备心肌补片
取300μl的MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA滴至PDMS模板表面，将玻片轻扣于水凝胶溶液表面，室温静置一天或置于4℃中成胶。水凝胶成胶风干后，重复上述步骤2-5次，获得2-5层的凝胶层，将其从PDMS模板上剥离，即制MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA心肌补片材料。
实施例2不同明胶、甘油、结冷胶的配比对MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA心肌补片材料机械性能的影响
1、不同型号的心肌补片材料的制备
为了探究明胶、甘油、结冷胶不同的配比对MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA心肌补片材料机械性能的影响，实施例设计了3种不同的明胶、甘油、结冷胶，具体如表1所述：
表1明胶、甘油、结冷胶不同体积比制备心肌补片材料
心肌补片材料型号 体积比
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-a 1:1:1
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-b 1:1.2:1
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-c 1.2:1:1.5
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA心肌补片材料的制备方法如实施例1所述，步骤1中10w/v％的明胶溶液、4w/v％的甘油溶液、10w/v％的G3251溶液以体积比按照表1所述进行调整，分别获得心肌补片材料MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-a、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-b、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-c。
2、不同型号的心肌补片材料的机械性能测试
(1)弹性模量的测试
用英斯特朗万能材料测试机测定MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-a、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-b、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-c的弹性模量。样本大小为高度6mm的和直径12mm。测定模式为压缩模式，压缩速度为化0.02mm/s。分析应力-应变曲线中用于计算水凝胶的弹性模量。每组样品设置5个重复。
3、测试结果
如图1所示，MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-a、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-b、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-c的弹性模量分别为189KPa、167KPa、258KPa，从这样的结果中可以看出，甘油作为一种增塑剂，虽然可以提高水凝胶的机械延展，但是过量的甘油会使明胶的过度稀释，反而使弹性模量下降，而结冷胶由于本身的弹性较好，提高水凝胶中结冷胶的含量有助于提高水凝胶的力学特性。可见，明胶、甘油、结冷胶的配比在1.2:1:1.5时，水凝胶的机械性能最佳。
实施例3不同含量的氧化石墨烯对MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA心肌补片材料机械性能和导电性的影响
1、不同型号的心肌补片材料的制备
为了探究氧化石墨烯对MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA心肌补片材料机械性能和导电性的影响，在明胶、甘油、结冷胶的配比为1.2:1:1.5时，设计了4种不同的氧化石墨烯含量，具体如表2所述：
表2不同含量的氧化石墨烯制备的心肌补片材料
心肌补片材料型号 MA-Gelzan-Gly水凝胶溶液与氧化石墨烯溶液的配比
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-c 4:1
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-d 4:1.5
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-e 4:2
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-f 4:2.5
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA心肌补片材料的制备方法如实施例1所述，步骤1中10w/v％的明胶溶液、4w/v％的甘油溶液、10w/v％的G3251溶液以体积比调整为1.2:1:1.5，步骤3中的MA-Gelzan-Gly水凝胶溶液与石墨烯溶液的配比按照表2的配比进行调整，分别获得心肌补片材料MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-c、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-d、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-e、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-f。
2、不同型号的心肌补片材料的机械性能测试
(1)弹性模量的测试
用英斯特朗万能材料测试机测定上述材料的弹性模量。样本大小为高度6mm的和直径12mm。测定模式为压缩模式，压缩速度为化0.02mm/s。分析应力-应变曲线中用于计算水凝胶的弹性模量。每组样品设置5个重复。
3、不同型号的心肌补片材料的导电性能测试
在不同型号的心肌补片材料上下表面连接铁丝或铜丝，并在表面覆盖薄层的导电胶，制成电极。使用电化学工作站在室温测定五组样品的导电性。每个样品测3次，每组重复5次。
4、测试结果
如图2所示，MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-c、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-d、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-e、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-f的弹性模量分别为258KPa、264KPa、279KPa，212KPa。4种不同配比制备材料的电阻值如表3所述，
表3不同含量的氧化石墨烯制备的心肌补片材料
心肌补片材料型号 电阻值(MΩ)
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-c 0.12±0.09
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-d 0.1±0.07
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-e 0.084±0.09
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-f 0.082±0.06
综合表3与图2的结果可知，增加水凝胶中氧化石墨烯的含量虽然可以提高其导电性，但是，当水凝胶中氧化石墨烯的含量导电一定含量后，其对导电性的增加程度有限，相应的，石墨烯本身具有良好的机械性能，适量添加有助于提高机械性能，但是，过多的石墨烯反而会减低水凝胶的机械延展性，这可能是由于过多的石墨烯阻碍了水凝胶分子间的相互交联。可见，MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA中最佳的MA-Gelzan-Gly水凝胶溶液与氧化石墨烯溶液的配比为2：1。
实施例4不同含量的伊桐苷对MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA心肌补片材料清除自由基能力的影响
1、不同型号的心肌补片材料的制备
为了探究伊桐苷对MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA心肌补片材料清除自由基能力的影响，设计了4种不同的伊桐苷含量，具体如表4所述：
表4不同含量的伊桐苷制备的心肌补片材料
心肌补片材料型号 伊桐苷含量(g)
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-e 0.16
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-g 0.2
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-h 0.25
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-i 0.3
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA心肌补片材料的制备方法如实施例1所述，步骤1中10w/v％的明胶溶液、4w/v％的甘油溶液、10w/v％的G3251溶液以体积比调整为1.2:1:1.5，步骤3中的MA-Gelzan-Gly水凝胶溶液与石墨烯溶液的配比调整为4:2，步骤4中伊桐苷的添加量按照表4进行调整，分别获得心肌补片材料MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-e、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-g、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-h、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-i。
2、对羟自由基的清除能力检测
羟自由基是众多活性氧自由基中具有最强反应活性的自由基，它能够诱导蛋白质、核酸和不饱和脂肪酸等的严重损伤，是心梗中造成细胞损伤的主要因素之一。评估不同型号的心肌补片材料对羟自由基的清除能力，是评估材料是否能够在体内减轻有氧自由基造成的细胞损伤的主要指标之一。利用番红花O染料褪色程度来评估心肌补片材料的羟自由基清除能力，具体步骤如下：
配制2mM FeSO4溶液、6wt％双氧水溶液、360ug/mL番红花溶液，备用，称取10mg不同类型的心肌补片材料，放入EP管中，并向EP管中依次加入1ml水，1.2ml Fe SO4溶液，1ml番红花溶液，混合均匀静置12min后再加入1.6ml双氧水溶液，置于55℃水浴中加热反应35min，反应结束后，在492nm处测定其吸光度值，计算材料对羟自由基的清除能力。以上实验至少重复3次，每个实验组有5个平行样。
3.测试结果
4种不同伊桐苷添加量的心肌补片材料的羟自由基的清除能力，如表5所示
表5不同含量的伊桐苷制备的心肌补片材料的羟自由基的清除能力
心肌补片材料型号 羟自由基的清除能力(％)
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-e 86.14±1.23
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-g 95.46±1.59
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-h 98.23±1.74
MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-i 98.41±1.62
从表5的结果中可以看出，增大心肌补片材料中伊桐苷的添加量会显著提高材料对于羟自由基的清除能力，但是，当材料中伊桐苷的量到达一定程度后，其对于提高羟自由基的清除能力趋于一致，基于此，认为0.25g的伊桐苷添加量最佳。
实施例5心肌补片材料对心肌细胞增殖的影响
为了不同型号的心肌补片材料对心肌细胞增殖的影响，本领域实施例中分别采用MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-c、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-e、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-h接种心肌细胞，观察心肌细胞的增殖情况。
1、心肌细胞的分离与接种
取出生一到两天的新生SD大鼠，脱颈处死，取出心肌，随后用预冷的HBSS清洗2-3边。取部分心室，剪碎，用含EDTA的0.125％胰酶消化过夜。去除胰酶后，加入胶原酶溶液，于37℃、CO2培养箱内10-15分钟。取细胞悬液，用200目铜丝网过滤，在过滤后的细胞悬液中加入a-MEM细胞培养液终止消化，2000rpm，离心3-5min。去掉上清液，加入a-MEM细胞培养液重悬，于37℃、CO2的培养箱内1.5h使成纤维细胞大量贴壁，而心肌细胞留在悬液中。
取MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-c、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-e、MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-h置于灭菌后的培养皿中，利用酒精对心肌补片材料进行消毒灭菌，随后将酒精移去，加入PBS清洗2遍，除去残留的酒精。以4.5×104个接种到上述心肌补片材料中，每种型号的材料设置5个重复。
2、增殖情况检测
在细胞培养1、2、4天后，用细胞计数试剂盒CCK-8进行检测，所述检测方法参照CCK-8试剂盒的说明书进行。
3、检测结果
从图3中可以看出，细胞接种第一天，各支架上的细胞数差异不大，这可能是由于刚开始接种，心肌细胞主要是从悬浮状态逐渐粘附到材料表面，细胞从球形逐渐在支架上铺展，未进行増殖。从第2天到第4天，不同型号的材料中，心肌细胞的增殖情况存在一定的差异，从结果中可以看出，心肌补片材料MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-h最适于心肌细胞的增殖。
实施例6心肌补片材料在体内对心肌梗塞的修复作用
1、大鼠心梗模型的制备
健康雄性SD大鼠，体重200-250g，随机分为心梗组(15只)和假手术组(5只)。
盐酸戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉。经口气管插管行大鼠呼吸机辅助呼吸，持续监视心电图。心肌梗死组左侧胸腔第3-4肋间逐层开胸，开放心包，在左心耳的右下缘1mm处、肺动脉圆锥左缘用无损伤缝针穿过左冠状动脉前降支的心肌表层，用丝线结扎左冠状动脉前降支近端，制成心肌梗死模型。假手术大鼠经历上述手术过程，丝线从冠状动脉下穿过但不结扎。
2、实验分组和心肌补片移植
形成心肌梗死后10天，共存活大鼠12只，将存活12只大鼠随机分为移植组和心梗对照组，每组6只，将心肌补片材料MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-h切成直径8mm，高度1.5mm的正方形，以4.5×104个接种到上述心肌补片材料中。将心肌补片移植到心肌梗死部位，心梗对照组以及假手术组采用相同手术操作，但不进行补片移植。
3、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)的测定
心肌补片移植3周后，将心梗对照组、假手术组、移植组的大鼠眼内眦取血，将血样置于37℃恒温水浴中静置2h，然后以3 500r/min离心10min，吸取上清液至EP管中，用全自动生化分析仪统一测定其中磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)的含量作为评价心肌损伤的指标。
4、HE染色检测心肌组织形态和心梗面积
心肌补片移植3周后、处死大鼠后剪取心肌。用4℃生理盐水反复冲洗心肌，取心肌梗死部位的组织，用4％多聚甲醛溶液固定24h，然后常规脱水、石蜡包埋，制备厚度4μm的组织切片，进行HE染色，观察心梗后心肌组织大体形态变化。利用图像分析软件测定梗死面积并取均值，梗死面积＝(疤痕内弧长+疤痕外弧长)/(外周长+内周长)×100％。
5、心肌细胞原位调亡检测
心肌补片移植3周后、处死大鼠后剪取心肌进行甲醛固定，在病理科进行心肌组织常规石蜡包埋处理后，将蜡块制成厚的切片，将切片轻轻用多聚赖氨酸载玻片搜起，放置于37℃的烤片机烤干后，于检测前再放入60℃的烤箱内烤片2小时左右，采用原位末端标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)法测定心肌细胞凋亡情况，并计算心肌细胞凋亡指数(apoptosis index，AI)。
6、统计学处理
应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，多组间均数比较采用单因素方差。P＜0.05为差异有统计学意义。
7、实验结果
如图4所示、心梗组大鼠心肌细胞包膜不完整，排列紊乱，心肌组织细胞浆着色变深，心肌纤维断裂伴有大量炎性细胞浸润，假手术组大鼠心肌细胞包膜完整，心肌纤维走行整齐，无炎性细胞浸润，心肌组织未见明显病理改变。与假手术相比，移植组大鼠心肌细胞虽然俺存在一定的变性程度，但是与心梗组相比程度均有所减轻，可见，基于MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-h制备的心肌补片对于心梗后，心肌组织的形态修复有积极的作用。
移植组、心梗对照组以及假手术组的心肌细胞凋亡指数、心梗面积以及CK-MB的含量，如表6所示
表6各组心肌细胞凋亡指数、心梗面积以及CK-MB的含量
Figure BDA0002096827570000131
从表6可以看出，虽然移植组相比于假手术组而言，心肌细胞凋亡指数、心梗面积以及CK-MB的含量的指标均较差，但是，明显好于心梗组，说明本申请制备的MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA-h制备的心肌补片在移植体内后，对于心肌梗死起到了积极治疗作用。
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种制备用于心肌补片的组合物的方法，其特征在于，所述方法的步骤包括：
(1)将明胶，甘油，结冷胶制备成透明的MA-Gelzan-Gly共混液；
(2)将甲基丙烯酸酐加入到共混液，获得改性的MA-Gelzan-Gly水凝胶；
(3)将改性的MA-Gelzan-Gly水凝胶与氧化石墨烯混合，获得负载氧化石墨烯的MA-Gelzan-Gly-Go水凝胶；
(4)将MA-Gelzan-Gly-Go水凝胶与多巴胺、伊桐苷混合，以过硫酸铵为引发剂，TEMED为聚合助剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)为：
将2g明胶在60℃条件下完全溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，获得10w/v％的明胶溶液，
将0.8g的甘油溶于蒸馏水中，获得4w/v％的甘油溶液，
将1g的结冷胶在60℃条件下溶于蒸馏水中，获得10w/v％的结冷胶溶液，
将上述三种溶液以1.2:1:1.5的比例混合，磁力搅拌1h，得到MA-Gelzan-Gly共混液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)为：
将4mL的甲基丙烯酸酐缓慢滴加到MA-Gelzan-Gly共混液中，在50℃的条件下搅拌1-3小时，使之逐渐反应，然后加入PBS进行稀释后终止反应；
反应物加入透析袋内用去离子水透析5-9天，每6-12小时更换一次去离子水，冷冻干燥保存，获得改性的MA-Gelzan-Gly水凝胶；
所述步骤(3)为：
将40mg的石墨烯制备成4mg/mL溶液，
将步骤(2)获得的改性的MA-Gelzan-Gly水凝胶制备成10％溶液，
将10％的MA-Gelzan-Gly水凝胶溶液与石墨烯溶液以4:2的比例进行混合，置于4℃冰箱2-4h，获得负载氧化石墨烯的MA-Gelzan-Gly-Go水凝胶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)为：
在步骤(3)制备的MA-Gelzan-Gly-Go水凝胶，加入0.12g的多巴胺、0.25g的伊桐苷，混合均匀，加入3mL 20％的过硫酸铵和1mLTEMED溶液，置于4℃冰箱过夜，获得所述用于制备心肌补片的组合物MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(5)：取300μL步骤(4)获得的组合物，滴至PDMS模板表面，
将玻片轻扣于水凝胶溶液表面，室温静置一天或置于4℃中成胶，
水凝胶成胶风干后，重复上述步骤2-5次，获得2-5层的凝胶层，将其从PDMS模板上剥离，即制得MA-Gelzan-Gly-Go-Ito-DA心肌补片材料。
6.权利要求1-5任一所述的方法制备的心肌补片材料。
7.权利要求6所述的心肌补片材料在制备心肌补片中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述用途为将原代心肌细胞或多能干细胞接种于所述组合物或心肌补片材料中。
9.根据权利要求8任一所述的用途，其特征在于，所述多能干细胞为脂肪干细胞、间充质干细胞、骨髓干细胞。
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