CN107158465B - 一种骨支架复合材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种骨支架复合材料的制备方法，包括以下步骤：1）制备β‑TCP煅烧骨块；2）制备β‑TCP/Zn²⁺煅烧骨骨块；3）制备β‑TCP/CS复合支架材料；4）制备β‑TCP/Zn²⁺/CS多孔复合支架材料。本发明的有益效果为：本发明提供的一种骨支架复合材料的制备方法，其利用磷酸二氢铵法对胎牛牛松质骨进行二次煅烧制备、再经+锌+壳聚糖双重表面修饰的胎牛骨（β‑磷酸三钙）是一种生物相容性好，综合骨修复能力强的骨支架材料；同时，随着血清治疗的大面积普及，我国胎牛血清厂家开始大规模发展，胎牛血清的用量在逐步提高，而天然胎牛骨这一生产胎牛血清的剩余材料却被浪费，将其充分利用则能降低两种医疗产业的成本。

Description

一种骨支架复合材料的制备方法

技术领域

本发明涉及医用材料制备技术领域，具体涉及一种骨支架复合材料的制备方法。

背景技术

颌骨缺损可导致口颌系统功能的丧失，给人们的生活及工作带来巨大影响，通过植入骨支架材料以实现骨缺损的修复是其有效的治疗途径。近年来，随着外伤、肿瘤等疾病的增多，加之老龄化社会的临近，颌骨缺损在人群中的发病率呈现出逐步上升的态势，骨支架材料的需求量也随之增大。目前在我国颌骨支架材料市场上占有绝对统治地位的是粉末型进口材料，该材料价格昂贵，不能用于较大创面的骨缺损修复（8mm以上），且因未进行表面修饰而缺少成骨促进作用。因此，开发具有自主知识产权和成骨促进作用，且能用于较大创面骨缺损修复的新型骨支架材料已成为迫在眉睫的重要需求。已有骨支架材料生物力学研究显示，良好的骨支架材料生物力学性质与内部微结构对骨缺损的修复具有积极影响，如可促进新生骨、新生血管生成以及促进成骨因子表达等。但是，由于骨缺损修复过程的复杂性，以往研究未能充分指出理想骨支架材料所需的微结构与生物力学特征，相关研究仍处在基于试错法的摸索过程中。另一方面，骨支架材料的感染是一个重要的科学问题，但相关研究非常薄弱，亟待加强。

天然来源的骨支架材料由于具有和人体骨组织多孔结构相似及经煅烧后与人骨矿物质成分相近（羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA））的两大特点，受到了学者们的青睐。煅烧天然牛松质骨（煅烧天然成年牛松质骨，下称：成年牛骨，煅烧天然胎牛松质骨，下称：胎牛骨）是天然来源骨支架材料的一种，其已在细胞学实验及动物成骨实验等各方面均取得了很好的效果，且是唯一已通过相关临床认证批准的骨支架材料，并已在临床中得到应用，如瑞士小牛松质骨来源的“Bio-oss”骨粉，已经在全世界口腔临床中得到了大量的普及和使用。近年来，国内也出现了陕西瑞盛生物科技有限公司的“骼瑞”牌天然煅烧牛骨粉，也在国内医疗市场中可以见到。煅烧天然牛松质骨已在多例临床种植手术中得到验证。因此，煅烧天然牛松质骨是目前除了自体骨移植外的最佳骨支架材料之一，从而为实验研究骨支架材料生物力学表征与骨修复能力之间的关系提供了良好的材料选择。

然而，虽然煅烧天然牛松质骨的有效性及安全性已得到了公认，但在其应用及研发中仍存在着一些问题。以瑞士Bio-Oss骨粉为例，其虽然在市场上具有绝对的统治地位，却具有以下缺点：（1）、价格昂贵，这不仅阻碍了种植骨手术的普及，而且给患者带来了经济损失；（2）、粉末状成骨材料在成骨性能方面能力较差，且容易导致组织坏死；（3）、仅有煅烧去免疫工艺，未进行表面修饰，缺乏骨生长促进作用。陕西“骼瑞”一种品牌的销售不仅很难撼动进口材料的统治地位，而且与“Bio-oss”一样，也没有经过表面修饰处理，依然缺乏骨生长促进作用。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种骨支架复合材料的制备方法，是利用磷酸二氢铵煅烧法对天然胎牛骨的煅烧工艺进行了创新改良，并对胎牛骨进行了锌及壳聚糖复合表面修饰，其生物相容性好，成骨能力强；同时，随着血清治疗的大面积普及，我国胎牛血清厂家开始大规模发展，胎牛血清的用量在逐步提高，而天然胎牛骨这一生产胎牛血清的剩余材料却被浪费，将其充分利用则能降低两种医疗产业的成本。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种骨支架复合材料的制备方法，包括以下步骤：

1）制备β-TCP煅烧骨块：

新鲜胎牛骨的松质骨部分锯成5mm×5mm×1cm和5mm×5mm×4cm大小的长方体骨块，将骨块经去离子水煮沸脱4h蛋白脱脂、0.25mol/L的NaOH溶液90℃水浴20～30min脱糖、10%H₂O₂溶液浸泡10～15min漂白后，脱去松质骨中的部分有机物质；

将上述处理后的骨块用滤纸吸去水分，50℃烘干12h，放入电阻炉中煅烧，以5℃/min的升温速度缓慢升至800℃，维持6h后，自然冷却至室温；

将800℃煅烧后的长方体骨块超声清洗并烘干，超声功率为480W，清洗时间为30min，烘干温度为50℃，烘干时间为24h，然后浸入0.5mol/L的NH₄H₂PO₄溶液中室温浸泡24h，50℃烘干1d，放入电阻炉中二次高温煅烧，以10℃/min的升温速度缓慢升温至1000℃，保温时间4h，得到β-TCP煅烧骨骨块；

2）制备β-TCP/Zn²⁺煅烧骨骨块：

将步骤1）制备得到的β-TCP煅烧骨骨块100g浸于500ml 0.25 mol/L的ZnCl₂溶液中，60℃水浴1h，干燥后再经1200℃高温煅烧1h，制成含锌0.4%wt的β-TCP/Zn²⁺煅烧骨骨块；

3）制备β-TCP/CS复合支架材料：

称取2g壳聚糖，紫外线灭菌6h，在无菌条件下加入10g/L的乙酸200ml并在磁力搅拌下充分溶解，4℃保存备用；在无菌条件下，将已消毒的步骤1）得到100gβ-TCP煅烧骨块置于带胶皮塞的250mL玻璃试剂瓶中，加入已准备好的壳聚糖溶液，负压抽吸使壳聚糖液进入材料多孔腔隙，4℃放置24 h，然后吸除溶液，晾干，得到复合材料；再将复合材料用无菌稀氨水溶液浸泡12 h后，以pH值为7.4的0.01 mol/L PBS洗至中性，晾干，制备得到含CS 0.7%wt的β-TCP/CS复合材料；

4）制备β-TCP/Zn²⁺/CS多孔复合支架材料：

将已消毒的步骤2）得到的β-TCP/Zn²⁺煅烧骨骨块按步骤3）所述的方法，浸入CS溶液中负压抽吸并洗至中性，晾干后便制成含锌0.4%wt、含CS 0.7%wt的β-TCP/Zn²⁺/CS多孔复合支架材料。

本发明的有益效果为：本发明提供的一种骨支架复合材料的制备方法，其利用磷酸二氢铵法对胎牛牛松质骨进行二次煅烧制备、再经+锌+壳聚糖双重表面修饰的胎牛骨（β-磷酸三钙）是一种生物相容性好，综合骨修复能力强的骨支架材料；同时，随着血清治疗的大面积普及，我国胎牛血清厂家开始大规模发展，胎牛血清的用量在逐步提高，而天然胎牛骨这一生产胎牛血清的剩余材料却被浪费，将其充分利用则能降低两种医疗产业的成本。

附图说明

图1显示为煅烧骨的X衍射分析。

其中，横、纵坐标分别为：衍射角2θ、衍射强度；a：成年牛骨在煅烧800℃后的X衍射图，红色线条为成年牛骨的衍射折线，黑线为Ca₅(PO₄)(OH)的标准品衍射峰图；b：胎牛牛骨在煅烧800℃后的X衍射图，红色线条为胎牛牛骨的衍射折线，黑线为Ca₅(PO₄)(OH)的标准品衍射峰图；c：成年牛骨分别利用焦磷酸钠法（黑色）和磷酸二氢铵法（红色）二次煅烧后的衍射峰图；紫红色为Ca₃(PO₄)₂标准品衍射峰图，绿色为Ca₅(PO₄)(OH)的标准品衍射峰图；d：胎牛骨分别利用焦磷酸钠法（黑色）和磷酸二氢铵法（红色）煅烧后的衍射峰图；紫红色为Ca₃(PO₄)₂标准品衍射峰图，绿色为Ca₅(PO₄)(OH)的标准品衍射峰图。

图2显示为煅烧后的骨块肉眼观察图。

其中：2a：成牛骨骨块； 2b：胎牛骨骨块；肉眼下视成牛骨与胎牛骨骨块均呈均一白色，白色，可见骨小梁结构，质硬，胎牛骨不易破碎。

图3显示为两种骨块扫描电镜图。

其中：a：成年质骨，放大倍数为105X；b：胎牛骨，放大倍数为105X。

图4显示为骨孔径大小的测量实验过程图（图中所使用电压等参数及放大倍数均标于图下方）。

图5显示为部分骨块测杨氏模量时过程图。

其中，a、b、c、d四个图代表四个不同的骨块。

图6显示为MC3T3-E1细胞与两种煅烧骨骨块的复合电镜图。

其中，细索状，悬挂在中间的为生长的细胞，胎牛骨及成年牛骨以及生长时间均标注在图的左侧及上侧，1000X。

图7显示为免疫组化法检测碱性磷酸酶活性分析及三种基因的实时定量PCR检测。

其中，a：碱性磷酸酶的活性分析，##表示与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.01)，*表示与成年牛骨组相比有显著性差异(P＜0.01)；b：三种基因的实时定量PCR检测，#P＜0.05，## P＜0.01（与空白组对比）；* P＜0.05，**P＜0.01（与成年牛骨组对比）。

图8显示为兔下颌骨缺损修复体内实验三种结果折线图。

其中，a：新生图体积；b：新生血管体积；c：剩余支架材料体积；横坐标为时间，4W是第4周；8W是第8周，12W是第12周；纵坐标为体积（%）；图中不同颜色线代表不同组，标于左上方，图中短线为标准差。

图9显示为各组在三个时间点的新生骨Masson三色染色（100X）。

其中，箭头标示深蓝色部分为新生骨。

图10显示为三组材料相应新生血管免疫组化染色切片（100X）。

其中，箭头标示圆形孔状结构是新生血管。

图11显示为支架材料骨综合修复能力对比。

其中：a：碱性磷酸酶活性对比；b：三种细胞因子表达；c：剩余骨支架材料检测；d：新生骨量检测；e：新生血管量；4W：第四周，8W：第八周；12W：第十二周；图中黑色折线为胎牛骨，红色折线为胎牛骨+锌+壳聚糖。

图12显示为新生骨Masson三色染色。

其中，a：胎牛骨；b：胎牛骨+锌+壳聚糖，图中灰色部分为骨支架材料，箭头标示蓝色部分为新生骨。

图13显示为新生血管免疫组化染色图。

其中，a：胎牛骨；b：胎牛骨+锌+壳聚糖；箭头标示红色管状组织为新生血管。

具体实施方式

实施例1：

磷酸二氢铵法煅烧天然牛松质骨：

1.2成年牛松质骨及胎牛松质骨骨块的煅烧：

1.2.1 骨块准备及有机物去除

用小型锯子将成牛骨新鲜胎牛股骨干骺端从股骨锯下，常压下用0.5M/L 氢氧化钠溶液进行数次换液煮沸去除油脂，后锯成10×5×5（mm³）大小骨块；0.3M 氢氧化钠溶液浸泡48小时，10% 双氧水溶液浸泡12小时。

1.2.2 焦磷酸钠法及磷酸二氢铵法煅烧

第一步：滤纸吸取大部分水分后，80℃烘干12h；将干燥后的骨块放入马弗炉中进行煅烧，缓慢(5℃/min)升温，在800℃维持6h，后随炉冷却；第二步：焦磷酸钠法：将800℃煅烧后的骨块浸入0.09M 焦磷酸钠溶液中浸泡24h；磷酸二氢铵法：将800℃煅烧后的骨块浸入0.5M 磷酸二氢铵溶液中浸泡24h；第三步：两种方法及骨块均在烘干后进入马弗炉进行1000℃煅烧，缓慢(5℃/min)温并维持4h。

1.3 两种方法制备后骨块的理化性质测定

使用X衍射仪检测成份。主要要点：捻碎骨块、扫描模式：40kV/150mA、扫描范围：10℃-80℃，2θ=0.02°、扫描速度：10°/min。参照标准：羟基磷灰石[Ca₅(PO₄)₃(OH)] JCPDF No：09-0432；β-磷酸三钙[Ca₃(PO₄)₂] JCPDF No：09-0160。同时进行EDAX能谱分析；利用扫描电子显微镜观察其微观结构：真空干燥骨块、喷金60s、放大105倍、55Hz电子束、拍照并使用测量软件测量骨块孔径大小。

2.1两种方法煅烧后骨块的理化性质测定

2.1.1 X线衍射物象分析结果及EDAX能谱分析

图1表示：成年牛骨与胎牛牛骨在800℃煅烧后的X衍射峰形和羟基磷灰石接近，提示两者的主要成份为羟基磷灰石；采用焦磷酸钠法处理的成年牛及胎牛骨骨块，经1000℃二次煅烧后，其主要成分为β-磷酸三钙和羟基磷灰石混合物；采用磷酸二氢铵法处理的成年牛及胎牛骨骨块，经1000℃煅烧后，其主要成分为β-磷酸三钙。由此可见，焦磷酸钠法和磷酸二氢铵法二次煅烧的两种方法相比，后者的β-磷酸三钙纯度较高。这可能首先是由于焦磷酸钠的熔沸点较高的原因（熔点880℃，沸点938℃），煅烧骨在1000-1200℃煅烧时，其热量不能均匀达到预设温度，导致部分羟基磷灰石无法和焦磷酸钠中的磷酸根结合为β-磷酸三钙。此外，焦磷酸钠法所制备材料残存Na⁺，其可以在加热状态下与磷酸根重新反应形成磷酸钠。磷酸钠混入制备后骨支架材料后，其抗压强度会随之变低，并出现降解速度过快的现象。天然牛松质骨经第一次无氧煅烧后，其主要成分变成了羟基磷灰石，而磷酸铵盐中的NH³⁺易于和羟基磷灰石中的H⁺反应结合形成NH₄。NH₄极易在高温时挥发，因此在高温二次煅烧时，磷酸铵盐仅仅遗留其PO₄ ²⁺-与羟基磷灰石进行反应，从而能形成纯度较高的β-磷酸三钙。以往报道用的磷酸铵及磷酸氢铵都存在常温下不稳定的现象，而磷酸二氢铵的化学性质在空气中较稳定，配置的溶液浓度易控制，因此，本实验首次使用的磷酸二氢铵法制备煅烧天然牛松质骨支架材料，β-磷酸三钙纯度高，效果良好。

表1显示为两种骨块经不同方法处理后的EDAX能谱分析，其表示：800℃煅烧后，A1组与B1组Ca/P原子数量比均接近1.58，两组之间的差异无统计学意义(p=0.42>0.05)；1000℃二次煅烧后，B1组与B2组Ca/P原子比均接近1.38，两组之间的差异无统计学意义(p=0.81>0.05)，C1组与C2组Ca/P原子比均接近1.47，两组之间的差异无统计学意义(p=0.66>0.05)； A，B，C组三组间的Ca/P原子数量比在同种骨块内的差异均有统计学意义(p<0.05)。

由此可见，磷酸二氢铵法制备的成年牛及胎牛骨Ca/P比值均接近于1.47，与纯相磷酸钙分子式中的钙磷原子数比值(Ca/P=3/2=1.5)接近，而焦磷酸钠法制备的成年牛及胎牛骨Ca/P比值均约为1.38，不仅与纯相磷酸钙有差异，且与磷酸二氢铵法的制备结果差异有显著性(P=1.16E-11<0.001)。因此，磷酸二氢铵法制备要优于焦磷酸钠法。

表1

注：组内钙磷原子数量比的差异：800℃煅烧后，A1组与B1组Ca/P原子数量比均接近1.58，两组之间的差异无统计学意义(p=0.42>0.05)；1000℃二次煅烧后，B1组与B2组Ca/P原子比均接近1.38，两组之间的差异无统计学意义(p=0.81>0.05)，C1组与C2组Ca/P原子比均接近1.47，两组之间的差异无统计学意义(p=0.66>0.05)； ^*,^#：A，B，C组三组间的Ca/P原子数量比在同种骨块内的差异均有统计学意义(p<0.05)。

2.1.2 磷酸二氢铵法煅烧后两种骨块形态学观察

经煅烧后，牛松质骨形成了白色、孔径清晰的骨块（图2）。扫描电镜下观察（图3），两种煅烧骨骨块孔隙联通，孔壁上分布有微孔结构，且胎牛骨骨块孔壁上的微孔结构多于成年牛骨。

实施例2：

骨支架材料微观结构及生物力学特性与骨缺损修复之间的关系：

骨支架材料植入体内后会与组织、细胞等充分接触，为它们提供生长空间，并为生长过程中的代谢产物、炎性因子、细胞因子等提供良好输送体。因此，除了骨支架材料本身的化学性质外，骨支架材料的微观结构及力学性能也是影响其成骨作用的重要因素之一。孔径、孔隙率和微孔分布等微观结构及材料的杨氏模量不仅为细胞的粘附、分化和增殖提供必要的环境，且能显著影响骨修复过程中细胞的反应及材料的降解。

多孔支架材料的孔径大小对与成骨过程中的细胞粘附、生长及血管生成等有重要意义。在以往研究中，学者们对其进行了大量的研究：Hulbert S等将铝酸钙小球状材料植入狗的骨缺损后，认为其孔径大小最低要求为100μm左右（孔隙率为46%），100μm以上的孔径有利于矿化后的新骨形成，而75-100μm的孔径则有利于未矿化软骨的长入，10-44、44-75μm大小的孔径只有纤维等组织长入；Itälä A等利用激光技术，制作了50、75、100 及125μm四种孔径大小的材料。作者将该四种材料植入兔子动物实验中后，发现四组之间的骨生长没有明显差异，且100μm对于兔动物实验来说，并不是一个很严格的值；Karageorgiou V和Kaplan D认为骨支架材料的孔径大小应该为300μm左右，因为较小的孔径容易因局部缺氧而导致软骨形成的减少，较大孔径则有利于新生血管的长入；Lane J和Bostrom M认为有利于骨生长的孔径大小应处于100～500μm之间；Teixeira S等用80%的羟基磷灰石及20%的β-磷酸三钙制备了孔隙率为70%的混合骨支架材料，该材料中的孔径有68%为400μm，3%为0.7μm的小孔。该材料在植入雄性免疫缺陷小鼠6周后呈现了一定的成骨作用；Woodard J等利用羟基磷灰石制作了经重组人骨形态发生蛋白-2表面修饰后的羟基磷灰石骨支架材料，其孔径设置为大孔径（250-350μm）及小孔径（2-8μm）的混合（孔隙率未见描述）。将其植入猪身上后，该材料在第8周时体现出一定的成骨能力。由此可见，不同化学属性的骨支架材料、不同的实验方法可反应出不同的成骨能力最优孔径大小。

孔隙率是指某固体物体中的孔洞占有百分比，其对于骨修复主要有两方面的意义：（1）、适当存在的孔洞为细胞、组织等生长提供了空间；（2）、多孔性结构与长入其内的新生骨及血管等软组织形成了“机械连锁效应”。其与孔径大小是一对不可分割的几何结构参数，并形成了反比关系：孔隙率高的材料具有较大的面积，有利于成骨过程中各种细胞及神经纤维的生理活动，而孔径增大可以提高营养成份的输入，但却降低了材料的孔隙率。因此，孔径大小及孔隙率大小应与材料本身相适应，也应处于一个合理的组合或范围中。以上两种参数虽然已得到了众多的研究结果，但因所采用材料及研究方法的不同，目前尚无一个理想的参数能指导人工骨支架材料的研发，因此，Hannink G和Arts J提出，研究孔径大小对骨缺损修复的影响是“very interesting”的，进一步对特定化学属性骨支架材料相应的微观结构参数进行挖掘研究，将有利于形成理想的新型骨支架材料。

骨支架材料降解能力是植入材料骨修复能力中的另一项重要指标，是新生骨生长的空间保证。以往研究显示，骨支架材料降解受到众多因素的影响，如局部pH值、Ca/P比、材料结晶度、颗粒大小、接触面积大小、孔隙率、细胞种类、和水分含量等。其中，材料的化学属性因素与材料降解相关研究较明确，材料化学属性的不同会造成其降解速率的不同，有学者利用不同化学方法合成不同的材料，以挖掘新的高吸收率降解材料。从理想情况看，骨支架材料吸收的速度应该与新生骨形成的速度相近，但多孔支架材料的吸收总是要较慢于新生骨的形成速度。造成这一现象的主要原因，可能是异种材料本身的降解与其生物相容性是相互矛盾的：一方面，材料必须要完全满足宿主的生物相容性，不能引起任何的免疫组织反应，另一方面，材料降解的过程部分需要依靠免疫系统中的巨噬细胞产生破骨细胞而进行，而高的生物相容性则降低了巨噬细胞将其识别其的几率，例如磷酸钙材料则不易被巨噬细胞所捕获。

根据Wolf定理，力学因素对骨的退化、吸收和破坏有明显的影响，不同大小的应力不仅会造成骨不同的生物学行为，也会影响骨形成不同的结构。骨支架材料的生物力学性质与材料降解之间可能具有密切的联系，但以往学者们对其研究主要集中于以下两点：（1）、骨支架材料的抗压强度及杨氏模量等必须足以支撑骨缺损区的外界压力，不能在细胞及组织生长期间塌陷，且须全程支撑外界压力，直到新骨形成；（2）、骨支架材料抗压强度及杨氏模量的升高有利于张力纤维的排布及细胞的分化扩展。由于更换材料的化学属性并不能很好地解决其降解问题，因此，加强骨支架材料生物力学性质与材料降解之间的关系研究，或能为我们提高其降解率带来新的启示。

如本文前言所述，煅烧天然牛骨为我们研究骨支架材料微观结构参数及生物力学特点提供了良好的材料基础，但以往文献中少见成年牛骨与胎牛骨在成骨过程中的比较研究。而关于成骨过程的研究方法，以往的相关研究众多，但是，由于受到诸多不确定因素的影响，体外细胞研究与体内成骨研究的结果往往不尽相同，因此，全面利用体外细胞实验、分子表达实验及体内动物实验验证新生骨形成、血管生成、材料降解等骨修复综合能力是最直接、最有效的方式，有利于全面、综合评估天然骨材料的成骨能力。

综上所述，本实验拟选用成年牛骨与胎牛骨作为研究对象，系统性地检测成骨细胞在两者上的早后期粘附及早后期成骨因子表达（体外实验），同时通过兔下颌骨骨缺损修复实验检测二者在成骨前期、中期及后期的新生骨、新生血管、材料降解能力（体内实验）；再利用扫描电子显微镜、Micro-CT、力学试验机等仪器检测两种材料的微观结构及生物力学性质，并利用三维有限元建模力学分析的方法，以期研究：（1）、骨综合修复能力最优天然煅烧牛骨的微观结构特点及煅烧天然牛骨von Mises应力分布及受载向位移分布特点；（2）、煅烧天然牛骨生物力学特征与成骨之间的关系；（3）煅烧天然牛骨材料降解与其生物力学性质之间的关系。以上实验将为胎牛骨在临床中的应用提供实验依据，并为以β-磷酸三钙为化学属性的人工骨材料提供骨支架材料“仿生”几何结构参数，并能从生物力学角度解释骨支架材料的降解，从而能更好地服务于医学临床。

1体外实验（细胞及分子水平检测）

1.1小鼠成骨细胞系MC3T3-E1与支架材料复合及扫描电镜观察

小鼠MC3T3-E1 成骨细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12 完全培养液（配制方法见附件1.3）中，置于5%二氧化碳、37℃孵箱中培养。每3天更换1次培养液，用 0.25%的胰酶消化进行传代培养。细胞初期粘附率观察：实验组为胎牛骨组及成牛骨组，两组互为对照组。每组选取4块，放入24孔板中，每孔1块。将传代成骨细胞制成 10⁴/ml 成骨细胞悬液，在各材料的表面分别接种1ml细胞悬液，37℃、5%CO₂培养。在4h及24h时取出材料进行电镜扫描，观察细胞贴附情况，并进行粘附率统计。同时观察细胞在4、7 d时的粘附情况。

1.2 分子水平检测两种煅烧骨块的成骨诱导能力

1.2.1 实时定量PCR检测骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原纤维引物及扩增体系

将成年牛骨和胎牛骨预湿后无菌滤纸吸干，分别放入24孔板内以5×10⁴个/ml细胞浓度（兔骨髓间充质干细胞成骨分化细胞），每个材料表面接种1ml细胞悬浮液，分别形成成年牛骨组及胎牛骨组，加入1ml细胞悬液的设为空白对照组。

24h后各组加入1ml完全培养基，每2d换液，14d后分别利用离心法（3000r，3mins）收集各组的细胞，按照试剂盒使用方法提取总RNA，按照试剂盒进行cDNA反转录。使用引物序列（表2.1）扩增基因骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、骨钙素(osteocalcin，OCN)、Ⅰ型胶原纤维(collagenous fiber，COLⅠ)及内参基因；PCR反应体系：2×SybrGreen qPCR Mix 10μl，上下游引物（表2）各0.4μl，模板（cDNA）7.2μl，加ddH₂O至20μl。PCR循环条件：95℃：3min、95℃：7s、57℃：10s、72℃：15s、45个循环。扩增过程中的主要注意步骤点：（1）、将cDNA样品稀释8倍后进行上机检测，各个基因的扩增曲线，标准曲线，扩增效率及相关系数均在要求范围之内；（2）、各基因扩增曲线呈典型“S”型曲线，熔解曲线呈单一峰值。

1.2.2 碱性磷酸酶的检测

取1.2.1中的细胞10μl，4℃冰浴震荡30min，4℃、12000r/min离心1h，取上清液。操作步骤（表3）：

表2

统计学方法：组间两两比较采用独立样本均数t检验，P值<0.05为有统计学意义。

表3

绘制标准蛋白曲线，测定各组蛋白总量。根据碱性磷酸酶定量试剂盒使用方法测定碱性磷酸酶活力，碱性磷酸酶活力=（测定OD值-空白OD值）/(标准OD值-空白OD值) ×标准品浓度（0.1mg/ml）/待测样本蛋白浓度（gprot/ml）。

1.3 体内实验（兔颌骨骨缺损修复实验）

1.3.1 兔子选择及分组

选取新西兰大耳兔50只（雌雄各半，体重位于1.8-2.8kg）随机分为以下各组：使用成年牛骨块为成年牛骨组，使用胎牛骨块为胎牛骨组，使用羟基磷灰石粉为对照组，每组5只（组内雌雄基本一致），各组分别设4、8、12 周为3 个时间观察点，使用动物45只，预留5只备用。动物实验过程小心谨慎，严格按照医学伦理学要求进行，同时获得兰州大学医学伦理委员会同意。

1.3.2 兔颌骨缺损模型的建立及材料植入

所有实验动物采用2%利多卡因皮下局部浸润麻醉，麻醉时注射至兔子皮肤与皮下组织分离并形成明显肿胀即可。注射利多卡因3分钟后与手术区备皮、消毒，随后于兔下颌骨角前切迹处剪开皮肤，沿下颌体部下缘1cm处向前作一长约 2-3cm 平行切口，钝性分离肌肉及筋膜，前止点为颏孔处，后止点在下颌角前切迹处，暴露两者之间的下颌骨体部，使用高速小球钻在颊侧距离下颌骨下缘约1cm左右制备一个10mm×5mm×5mm 大小的箱型人工骨缺损，边冲钻边利用生理盐水降温并注意保护下牙槽血管及神经。清创、止血后植入上述三种材料使得材料充分与骨断面精密结合。对照组用羟基磷灰石粉填满骨缺损区，关闭伤口，分层缝合。在4、8、12周各时间点使用过量麻药对动物进行安乐死。

1.3.3检测新骨形成体积及材料的降解率

1.3.3.1micro-CT检测

将各组、各时间观测点的兔子过量麻醉药物安乐死后，分离其下颌骨。用线锯在植骨部位周围外约2mm处取得标本，将获取的标本立即放入4%多聚甲醛固定液中。将获取的样本使用Micro-CT进行扫描，扫描阈值为65-255，扫描厚度为18μm，然后再进行组织学观察。骨缺损区域新骨体积及剩余材料体积的重建和分析使用CT-analyzer软件进行。结果使用t检验进行分析。

1.3.3.2组织学观察

样本经13%EDTA脱钙，常规脱水、浸蜡及包埋，切片在长方体形骨缺损的中央由近中向远中纵切。每个样本8张切片，其中4张进行Masson 三色染色，以对骨缺损区域新生骨的成熟度加以评价，实验步骤参照试剂盒进行；另外4张切片进行免疫组化染色，一抗为Anti-Endothelium 抗体(PLA-E)，二抗为山羊抗小鼠IgG，对骨缺损区域新生血管密度加以统计，实验步骤参照试剂盒进行，最后利用显微镜拍照，结果用ImageJ软件识别并统计。

1.4两种煅烧骨块生物力学表征检测

1.4.1 生物力学表征实验室检测

以下检测分别均按照成年牛骨及胎牛骨分组，每组8例（块）。利用检测后数据进行统计。将骨块利用真空干燥机真空干燥，真空状态下表面喷金60s，利用扫描电子显微镜观察其微观结构（放大105倍，55Hz电子束）。观察其表面超微结构并拍照。骨块孔径大小的测量：利用SEM自带测量软件，随机取多个视野并测量、记录，后利用SPSS17.0进行统计。其孔径形状利用肉眼观察电镜照片，如图4所示。

孔隙率的测定：利用Micro-CT 以 7μm 的空间分辨率进行360°扫描，整合时间2s，X-线线源设置为70 kVp，114 mA。孔隙率由CT系统自带软件计算。

两种骨块抗压强度和杨氏模量的测定：取将经磷酸二氢铵法制备的两种骨块（成年牛骨块及胎牛骨块，各5块，大小为5mm×5mm×10mm），使用压缩法模型检测。其过程为将块状的骨，一端放在平置的载物台上，上方用传感器压缩骨块，垂直向下加力，以2×10²N/S的速率匀速加载，三次测量取平均值。利用曲线图判断测试结果，如果曲线图结果杂乱，则替换骨块重新测量（部分的曲线图见图5）。同时测得抗压强度。

2.1 两种煅烧骨块骨缺损修复能力实验检测：

2.1.1 体内实验实验结果：

2.1.1.1 小鼠成骨细胞与两种煅烧骨骨块的复合：

细胞初期粘附率：成年牛骨：4h：28.3±12%、24h：40.6±9.6%；胎牛骨：4h：35.0±7.4%、24h：48.5±12%。差异有统计学意义（P<0.05）；图6扫描电镜观察图显示了1d、4d及7d时两种骨块上细胞粘附及增殖的情况：接种1d 时，可见少量细胞黏附于两种煅烧骨骨块上，接种4d及7d时，细胞粘附无异常。（注：接种4h时，细胞粘附很难被电镜观察到，因此未有电镜照片；接种4d及7d 时两种骨块均形成明显增植，因此未进行粘附率统计，仅用电镜观察其粘附无异常现象。）

2.1.1.2免疫组化法检测碱性磷酸酶活性及三种基因的实时定量PCR检测：

图7为四种成骨因子表达结果，其中a表明：胎牛骨组和成年牛骨组碱性磷酸酶的相对活性均增高，但胎牛骨组碱性磷酸酶活性增幅较成年牛骨组高：空白组：17.28±1.18，成年牛骨组：26.29±2.52，胎牛骨组：30.11±2.72，组间差异均呈现出明显差异（P＜0.01）。

b为三种成骨因子基因的实时定量PCR结果：I型胶原纤维：空白组1.00±0.09，成年牛骨组1.13±0.07，胎牛骨组1.23±0.07；骨钙素：空白组1.00±0.07，成年牛骨组：1.18±0.06，胎牛骨组：1.31±0.09；骨桥蛋白：空白组1.00±0.03，成年牛骨组：1.10±0.03，胎牛骨组：1.32±0.08；其中，胎牛骨组较成年牛骨组表达较高，差异有统计学意义（P<0.05），而较空白组均呈现出显著的差异（P＜0.01）。

2.1.2 兔下颌骨缺损修复体内实验结果：

图8为兔下颌骨缺损修复体内实验结果，分别有新生骨体积、新生血管体积、剩余支架材料体积三部分。

图8a表明：羟基磷灰石粉组新生骨体积呈现下降趋势，在第8周及第12周时，成年牛骨组及胎牛骨组相应的新生骨体积明显比羟基磷灰石组增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；同时，胎牛骨组相应的新生骨体积较成年牛骨组高，差异有统计学意义（P＜0.05）；另外， 图9中的Masson三色染色结果表示：与CT检测一致（羟基磷灰石粉组：4W： 13.88%±0.64%、8W：5.83%±0.76%、12W：1.75±0.59%；胎牛骨组：4W： 8.41%±0.33%、8W：15.48%±0.18%、12W：17.62±0.28%；成年牛骨组： 4W： 6.60%±0.18%、8W：11.02%±0.28%、12W：15.33±0.36%。），胎牛骨组中新生骨在各期中均较成年骨组高，并呈现出增多趋势，而羟基磷灰石粉组初期新生骨较多，但呈现出下降趋势。

图8b表明：羟基磷灰石粉组的新生血管在8周时开始减少，到第12周时变为0，而成年牛骨组及胎牛骨组新生血管均逐渐增多，而胎牛骨组的新生血管要较成年牛骨组增长明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；图10中的免疫组织切片图表明：羟基磷灰石粉组新生血管在12周出现了坏死，而其他两组的新生血管逐渐增多，与统计结果（羟基磷灰石粉组：4W：0.46%±0.01%、8W：0.35%±0.01%、12W：0；胎牛骨组：4W： 0.56%±0.01%、8W：0.93%±0.01%、12W：1.41±0.01%；成年牛骨组： 4W： 0.52%±0.01%、8W：0.70%±0.01%、12W：0.93±0.01%。）一致，胎牛骨组的新生血管要较成年牛骨组增多。

图8c表明，胎牛骨组的剩余材料相对较少，差异有统计学意义（P＜0.05）。其统计结果为：胎牛骨组：4W：38.58%±0.53% 、8W：22.58%±0.38%、12W：19.23%±0.34%；成年牛骨组 ：4W：41.56%±0.43%、8W：29.61%±0.51%、12W：23.44%±0.27%。（注：羟基磷灰石粉组由于发生坏死，其剩余材料未进行统计。）

2.2骨支架材料生物力学表征分析：

表4显示为两种煅烧骨骨块孔隙几何结构参数及生物力学性质的测定(n=10，±S)，其表明，成年牛骨的孔径大小大于胎牛骨，但其孔隙率低于胎牛骨骨块，差异有显著的统计学意义(P<0.001)；胎牛骨的抗压强度、抗弯曲强度及杨氏模量均高于成年牛骨，差异有显著性(P<0.001)。

表4

其中，P值为两样本均数比较的t检验值。

总结：

选用了煅烧成年与胎牛松质骨作为研究对象，利用体外实验检测了二者在细胞粘附及早后期成骨因子表达中的刺激能力，同时利用兔下颌骨骨缺损修复动物体内实验检测了它们在成骨前期、中期及后期的成骨、新生血管、材料降解能力；最后利用扫描电子显微镜、Micro-CT、力学试验机等检测了两种材料的微观结构及生物力学参数，并结合三维有限元建模分析方法分析了它们的von Mises平均应力分析。得出以下结论：

（1）、关于孔径大小，本实验首次提出理想的骨支架材料可具备如下特点：孔径大小处于50-400μm范围内、以约193μm为中位数，193μm以下及以上大小的孔径数量基本相等、服从正态分布，符合公式；

（2）、在孔径形状及孔隙率方面，本实验结果支持多孔支架材料的形状为椭圆形、相互贯通并孔隙率处于70%以上；

（3）、本实验首次提出理想的骨支架材料其应力应“仿真”分布，在骨小梁及骨板连接处形成应力集中，而在骨板等较厚处形成应力较弱区域。

（4）、骨支架材料的吸收过程中主体几何结构的破坏主要发生在8周以后；本实验首次提出骨支架材料降解与人体骨退化吸收一致的特点：应力应力集中点及受载向位移较小处首先吸收、而其他部位退化吸收较小。

实施例3：

锌+壳聚糖表面修饰骨支架材料的制备及其生物相容性、成骨能力检测：

1.1 胎牛骨+锌+壳聚糖复合材料的准备：

胎牛骨的制备方法与实施例1中1.2.1及1.2.2相同。配制好500ml的0.25M的ZnCl溶液。利用负压抽吸使ZnCl溶液充分与煅烧骨结合，60℃水浴1h，再经低温煅烧制备；配制好20ml壳聚糖乙酸溶液（10g/L）后用负压抽吸使壳聚糖乙酸溶液充分进入含Zn²⁺胎牛骨煅烧骨块，4℃保持24h；其Zn²⁺含量及钙磷比、孔径大小、表面微结构观察、孔隙率检测、抗压强度及杨氏模量的具体检测方法与第一部分及第二部分中相应方法相同。

1.2 胎牛骨+锌+壳聚糖复合材料生物安全性检测及成骨能力检测：

该两部分实验实验组为胎牛骨+锌+壳聚糖，设实施例2中胎牛骨为对照组。各实验组均设5个平行。具体实验步骤及方法与实施例2中相应实验方法相同。

2.1生物安全性检测结果：

急性毒性试验显示小鼠一般状况良好，正常活动，无死亡；实验前对照组及实验组的体重分别为20.89±0.51g、21.62±0.36，实验后体重分别各增重1 g；心、肝、肾病理检查均正常；MTT体外细胞毒性实验表明实验组及对照组的细胞毒性均为0级，符合GB/T16886.5-2003中的要求；实验组细胞增值速度明显比对照组快；溶血实验结果显示两组的平均溶血率为2.35±0.18%、1.65±0.33%，均<5%；皮肤刺激实验显示，经24、48及72h不同时间点观察，两组材料的浸提液覆盖部位均无水肿、红斑出现。以上实验表明了与预期的结果一致，胎牛骨+锌+壳聚糖与第一部分中的胎牛骨一样具有良好的生物相容性。Zn²⁺及壳聚糖均已在各实验中证明了良好的生物相容性，同时，两种材料已在多种临床使用产品中使用。另外，Zn²⁺的安全范围约是0.5wt%，而本实验材料的Zn²⁺含量为0.32wt%，处于安全范围中，避免了因Zn²⁺含量过高而引起的综合问题。这为其在临床中普及使用提供了前提保证。

2.2 化学成分检测结果：

EDX结果显示胎牛骨+锌+壳聚糖的钙磷比为1.57，与胎牛骨检测基本一致；Zn²⁺的含量为0.32wt%；孔径大小（195±36.62μm）及孔隙率（70.57±0.7%）与胎牛骨（193±42.82；70.61±0.34）无差异（P＞0.05）；抗压强度、杨氏模量为9.16±0.04 MPa、105±0.45 MPa明显强于胎牛骨（4.84±0.015 MPa；75.86±4.65 MPa），差异有显著统计学意义（P＜0.01）。

2.3骨修复能力检测结果：

细胞粘附率情况：胎牛骨+锌+壳聚糖材料的粘附率在4h初期及24h稳定粘附率分别为64.6%±0.113、66.3%±0.107，胎牛骨材料粘附率为：35.0%±7.4%、48.5±12%；图11-图13为胎牛骨+锌+壳聚糖材料与胎牛骨在四种成骨因子的表达、新生血管、新生骨及材料降解等各项中的检测结果。图11a及图11b中的免疫组化及实时定量PCR结果表明，碱性磷酸酶及骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原纤维三组基因的表达量明显在胎牛骨+锌+壳聚糖材料组中增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；图11c中的材料降解率检测表明，4w、8w、12w时胎牛骨+锌+壳聚糖材料组的降解率较对照组（胎牛骨）低；图11d及图12联合表明，在4w、8w及12w时胎牛骨+锌+壳聚糖材料组的新生骨体积均明显高于胎牛骨组；图11e及图13联合表明，在4w、8w及12w时胎牛骨+锌+壳聚糖材料组的新生血管量也同样明显高于胎牛骨组，以上差异均有有统计学意义（P＜0.05）。与预期结果一致，以上综合成骨能力结果提示：+锌+壳聚糖的双修饰可以在前期、中期及后期中均对胎牛骨的综合骨修复能力有明显的促进作用。与以往研究相比，本实验实验组的骨综合修复能力无论从成骨细胞粘附、碱性磷酸酶及骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原纤维等三种基因表达，还是从新生骨量、新生血管量方面，均要优于或接近与其它材料，是成骨效果较为理想的新型骨支架材料。

以往多个研究表明壳聚糖是已知修饰材料中效果肯定的一种材料，被称为仿生人工细胞外基质且具有成膜性。其在煅烧骨表面可形成一层壳聚糖薄膜，可以有效地改善材料细胞粘附率低的缺点，还可以促进成骨；游离的壳聚糖也可以促进成骨细胞增殖和成骨间质干细胞，增加骨桥蛋白和I型胶原表达，并减少破骨细胞形成；在壳聚糖处理的小鼠实验中发现骨结构能更好愈合和更好地形成骨结构。

同样地，锌离子在骨形成过程中也起着重要的作用。骨的Ca/P维持在1.37-1.87之间，表明了其中还有其他一些元素参与到骨的构成中，而锌就是其中一种（其余为：Sr，Mg，Si，Co等.），对于骨的机械强度形成有重要意义；胎牛骨+锌+壳聚糖的抗压强度及杨氏模量较单纯胎牛骨有明显改善，这可能是由于锌与壳聚糖共同增强了支架材料的两种生物力学性能，而较强的抗压强度及杨氏模量则有利于细胞粘附及增长，从而能促进新生骨的形成；同时，锌还可以促进成骨细胞合成骨钙素、胰岛素样生长因子-1和转化生长因子-β等在骨组织形成中具有重要正向作用的因子。因此，+锌+壳聚糖是一种有效的β-磷酸三钙支架材料表面修饰方法。

胎牛骨+锌+壳聚糖材料的材料降解率要较单纯胎牛骨差，这可能是锌及壳聚糖虽然未造成胎牛骨的整体结构改变，但二者均影响了材料降解，这表明，与以往报道一致，化学因素在材料降解中起着重要的作用。但该材料的降解率（33%）要低于以往报道的结果（55%），与之相比属于性能较优的骨支架材料，可在临床种植手术中进行使用。

首次设计并制备了+锌+壳聚糖复合胎牛骨（β-磷酸三钙）支架材料，通过对其进行生物相容性检验及系统性综合骨修复能力实验，得出以下结论：经磷酸二氢铵法煅烧制备、再经+锌+壳聚糖双重表面修饰的胎牛骨（β-磷酸三钙）是一种生物相容性好，综合骨修复能力强的骨支架材料，有望能在临床中普及使用。

随着人口老龄化社会的到来以及肿瘤、外伤及感染等因素的增多，加之口腔种植技术的普及，人体颌骨缺损的发病率在逐步升高。通过植入骨支架材料以实现骨缺损的修复是有效的治疗途径，然而，骨支架材料在应用与研究两方面均存在着各种问题：（1）、颌骨支架材料被国外进口品牌统治且缺乏骨生成促进作用及不能用于较大创面的骨缺损修复；（2）、理想骨支架材料的微结构及生物力学性质与骨缺损修复之间的关系尚未揭示清楚；（3）、以微生物态的角度去认识骨支架材料感染的有关研究还不多见。这些问题的存在制约了相关研究的深入展开及相应产业的进一步发展。

针对以上问题，申请人首先进行了“磷酸二氢铵法胎牛骨+锌+壳聚糖”这一新型骨支架材料的设计及制备，检测了其生物相容性，并系统性地联合体外体内实验，从分子、细胞及动物实验方面全面验证了其成骨作用；其次，对煅烧天然成年及煅烧胎牛松质骨支架材料的微观结构及生物力学性质进行了实验室检测及三维有限元建模分析，全面分析了煅烧天然牛骨微观结构及生物力学各项参数与骨缺损修复过程中的细胞粘附、成骨因子表达、新生骨形成、新生血管生成及骨支架材料自身降解之间的关系；最后，通过利用高通量基因测序方法，对口腔微生物在煅烧天然牛骨中的初期定植群落结构进行了检测，并分析了孔隙率及孔径大小对群落结构的影响。

本实验依照实验进行的顺序分为了四部分：在第一部分中，进行了天然牛骨磷酸二氢铵法煅烧的创新实验，并与传统的焦磷酸钠法进行了对比；在第二部分中，对煅烧天然牛骨的微观结构及生物力学性质，以及它们与系统性的骨缺损修复能力之间的关系进行了分析；在第三部分中，对口腔微生物在煅烧天然牛骨支架材料中初期定植的群落结构进行了检测，并分析了微结构参数对它们的影响；在第四部分中，对经磷酸二氢铵法煅烧制备后的胎牛骨进行了+锌+壳聚糖复合表面修饰，在评价了其生物相容性后，系统性地对其骨缺损修复能力进行了检测。具体创新性结论为：

1、提出了利用磷酸二氢铵法煅烧天然牛骨的制备方法，该方法可制备出纯度较高的β-磷酸三钙骨支架材料；设计并制备了一种“胎牛骨+磷酸二氢铵（煅烧）+锌+壳聚糖”的新型骨支架材料，其生物相容性好，成骨能力强，有望能在临床中普及使用的新型骨支架材料；

2、揭示出通过煅烧天然牛松质骨所得到的骨支架材料具备以下两个生物力学特点：(1)、孔径大小服从正态分布；(2)、通过模拟支架结构在人体中受载情形，发现平均应力在结构内部随机分布、应力集中区位于骨小梁及骨板连接处；同时，发现了煅烧天然牛松质骨骨支架材料的降解过程与特点可能与人体松质骨的应力性退化吸收过程及特点相似。以上特点可为人工合成较为理想的新型骨支架材料提供指导及参考。

3、提出骨支架材料的孔径大小及孔隙率对口腔微生物在其上的初期定植群落结构有明显影响；较大孔径可能有利于兼性厌氧菌的初期定植，而较小孔径可能与厌氧菌属的初期定植有关；多孔性块状骨支架材料可能比粉剂型骨支架材料更易受到感染。以上特点可为进一步研究骨支架材料的感染提供实验支持，并为在临床中使用抗生素治疗或预防骨支架材料感染提供用药指导。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种骨支架复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）制备β-TCP煅烧骨块：

新鲜胎牛骨的松质骨部分锯成5mm×5mm×1cm和5mm×5mm×4cm大小的长方体骨块，将骨块经去离子水煮沸脱4h蛋白脱脂、0.25mol/L的NaOH溶液90℃水浴20～30min脱糖、10%H₂O₂溶液浸泡10～15min漂白后，脱去松质骨中的部分有机物质；

将上述处理后的骨块用滤纸吸去水分，50℃烘干12h，放入电阻炉中煅烧，以5℃/min的升温速度缓慢升至800℃，维持6h后，自然冷却至室温；

将800℃煅烧后的长方体骨块超声清洗并烘干，超声功率为480W，清洗时间为30min，烘干温度为50℃，烘干时间为24h，然后浸入0.5mol/L的NH₄H₂PO₄溶液中室温浸泡24h，50℃烘干1d，放入电阻炉中二次高温煅烧，以10℃/min的升温速度缓慢升温至1000℃，保温时间4h，得到β-TCP煅烧骨骨块；

2）制备β-TCP/Zn²⁺煅烧骨骨块：

将步骤1）制备得到的β-TCP煅烧骨骨块100g浸于500ml 0.25 mol/L的ZnCl₂溶液中，60℃水浴1h，干燥后再经1200℃高温煅烧1h，制成含锌0.4%wt的β-TCP/Zn²⁺煅烧骨骨块；

3）制备β-TCP/CS复合支架材料：

称取2g壳聚糖，紫外线灭菌6h，在无菌条件下加入10g/L的乙酸200ml并在磁力搅拌下充分溶解，4℃保存备用；在无菌条件下，将已消毒的步骤1）得到100gβ-TCP煅烧骨块置于带胶皮塞的250mL玻璃试剂瓶中，加入已准备好的壳聚糖溶液，负压抽吸使壳聚糖液进入材料多孔腔隙，4℃放置24 h，然后吸除溶液，晾干，得到复合材料；再将复合材料用无菌稀氨水溶液浸泡12 h后，以pH值为7.4的0.01 mol/L PBS洗至中性，晾干，制备得到含CS 0.7%wt的β-TCP/CS复合材料；

4）制备β-TCP/Zn²⁺/CS多孔复合支架材料：

将已消毒的步骤2）得到的β-TCP/Zn²⁺煅烧骨骨块按步骤3）所述的方法，浸入CS溶液中负压抽吸并洗至中性，晾干后便制成含锌0.4%wt、含CS 0.7%wt的β-TCP/Zn²⁺/CS多孔复合支架材料。