CN114848897B - 一种多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种多孔羟基磷灰石‑水滑石复合材料及其制备方法和应用，涉及骨修复材料技术领域。本发明提供的多孔羟基磷灰石‑水滑石复合材料，包括多孔羟基磷灰石支架以及附着在所述多孔羟基磷灰石支架表面的水滑石；所述水滑石为掺铕的镁铝水滑石。在本发明中，所述水滑石赋予多孔羟基磷灰石支架粗糙的表面，可在骨再生过程中持续释放生物活性金属离子，并能促进细胞在支架表面的粘附。本发明提供的多孔羟基磷灰石‑水滑石复合材料原料易得，具备良好的细胞黏附、成骨及成血管性能。

Description

一种多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及骨修复材料技术领域，具体涉及一种多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
随着人口的老龄化，因骨质疏松、细菌感染、骨肿瘤等疾病造成的骨缺损、骨破坏越来越多。尽管骨组织具有内源性自愈和再生能力，但超过临界标准的大面积骨缺损的重建对骨科医生来说还是一个巨大的挑战。目前，适用于骨缺损修复的材料主要包括自体骨移植物、异体骨移植物和人工骨修复支架。尽管自体骨移植物是临床实践中的金标准，但是自体骨或异体骨移植在临床治疗中可能存在巨大的隐患，如严重的免疫排斥反应、未知疾病传播、成骨诱导不良、神经损伤并发症等，这些不利因素将极大地限制骨缺损的有效修复。同时骨发育和修复的机制是一系列复杂而同步的事件，包括成骨细胞、炎症细胞、雪旺细胞和内皮细胞等相互协同作用，以使骨组织恢复到其稳态功能状态。在这些细胞中，内皮细胞在骨缺损修复过程中对血管生成至关重要，因为形成的血管可以为深埋在骨组织内部的细胞提供所需的营养和氧气，同时将废物从组织中输送出去。因此，开发一种具有成骨和血管化特性的理想人工骨移植物有着重要的临床实用价值和潜在的发展前景。
目前，羟基磷灰石(HAp)作为一种含有钙、磷元素的无机材料，与骨组织的无机成分相似，是优秀的骨缺损植入材料。对于骨组织工程，骨修复材料在植入后应该为细胞附着、增殖和分化提供一定的化学和物理线索，以促进新骨和血管的生成。同样，理想的支架应该具有层次化的孔隙结构，能够让血管深入到材料内部，从而实现内部骨组织的重建。尽管HAp陶瓷具有优异的生物相容性，但其力学性能、细胞爬行和粘附性能差等缺点导致其修复速度较慢，限制了其临床应用。
到目前为止，为了提高羟基磷灰石支架的生物安全性和成骨性能，已经添加了如胶原蛋白、壳聚糖和透明质酸等制备有机/无机复合材料。然而上述材料的添加并没有带来更有效的成骨性能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料及其制备方法和应用，本发明提供的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料在具有良好生物相容性的同时也能极大地促进骨缺损部位成骨再生。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料，包括多孔羟基磷灰石支架以及附着在所述多孔羟基磷灰石支架表面的水滑石；所述水滑石为掺铕的镁铝水滑石。
优选地，所述多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料中镁元素的质量分数为2.22～7.29％，铝元素的质量分数为1.05～3.48％，铕元素的质量分数为0.36～1.20％。
优选地，所述水滑石的化学式为Mg2+ 1-xM3+ x(OH)2·An- x/n·zH2O，其中M3+代表Al3+和Eu3+，A代表水滑石层板间的阴离子；Al3+和Eu3+的摩尔比为0.9～0.7:0.1～0.3；x的范围为0.17～0.33；n的范围为2～1；z的范围为0.63～0.47。
优选地，所述多孔羟基磷灰石支架的孔径为200～600μm。
本发明提供了上述技术方案所述多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料的制备方法，包括以下步骤：
将镁无机盐、铝无机盐、铕无机盐、六亚甲基四胺和水混合，得到镁铝铕盐溶液；
将多孔羟基磷灰石支架置于所述镁铝铕无机盐溶液中，进行水热反应，得到多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料。
优选地，所述镁铝铕盐溶液中镁离子、铝离子和铕离子的摩尔比为2：0.9～0.7：0.1～0.3。
优选地，所述镁无机盐中的镁离子、六亚甲基四胺和水的摩尔比为1：2～4：0.8～1。
优选地，所述水热反应的温度为80～140℃；所述水热反应的时间为8～48h。
优选地，所述多孔羟基磷灰石支架的制备方法包括以下步骤：
将羟基磷灰石粉末和壳聚糖浆液混合，得到羟基磷灰石/壳聚糖复合浆料；所述壳聚糖浆液为壳聚糖的乙酸水溶液；
将三聚氰胺海绵浸入所述羟基磷灰石/壳聚糖复合浆料中，得到填充复合浆料的三聚氰胺海绵；
将所述填充复合浆料的三聚氰胺海绵进行干燥，得到多孔磷灰石/壳聚糖/海绵支架；
将所述多孔磷灰石/壳聚糖/海绵支架进行煅烧，得到多孔羟基磷灰石支架。
本发明提供了上述技术方案所述多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料或上述技术方案所述制备方法制备得到的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料在制备骨修复支架材料中的应用。
本发明提供了一种多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料，包括多孔羟基磷灰石支架以及附着在所述多孔羟基磷灰石支架表面的水滑石；所述水滑石为掺铕的镁铝水滑石。在本发明中，所述水滑石赋予多孔羟基磷灰石支架粗糙的表面，可在骨再生过程中持续释放生物活性金属离子，并能促进细胞在支架表面的粘附。本发明提供的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料原料易得，具备良好的细胞黏附、成骨及成血管性能。
本发明提供了所述多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料的制备方法，本发明通过一步水热法合成多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料，制备方法简单，易于操作。
附图说明
图1为实施例3制备多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料的实验过程的实物图；
图2为对比例1的多孔羟基磷灰石支架和实施例3制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料的扫描电镜(SEM)对比图；
图3为制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料不同水热时间(8h、16h、24h)的SEM图；
图4为制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料更长水热时间(36h、48h)的SEM图，以及不同水热时间和不同金属盐投料比的元素含量测试图；
图5为制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料的离子浓度释放图；
图6为制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料的细胞粘附图；
图7为用碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S(ARS)染色和定量分析来验证不同水热时间的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料的成骨性能图；
图8为制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料的血管形成分析和新形成的连接点的数量、总长度图；
图9为兔颅骨的外科钻孔手术和多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料植入的过程图；
图10为多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料在植入0周、4周和8周颅骨的Micro-CT及骨体积分数、骨矿化密度定量分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料，包括多孔羟基磷灰石支架以及附着在所述多孔羟基磷灰石支架表面的水滑石；所述水滑石为掺铕的镁铝水滑石。
本发明提供的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料包括多孔羟基磷灰石支架。在本发明中，所述多孔羟基磷灰石支架的孔径优选为200～600μm。在本发明中，所述多孔羟基磷灰石支架的孔隙为通孔。
本发明提供的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料包括附着在所述多孔羟基磷灰石支架表面的水滑石。在本发明中，所述水滑石为掺铕的镁铝水滑石，化学式优选为Mg2+ 1-xM3+ x(OH)2·An- x/n·zH2O，其中M3+代表Al3+和Eu3+，A代表水滑石层板间的阴离子；Al3+和Eu3+的摩尔比为0.9～0.7:0.1～0.3；x的范围为0.17～0.33；n的范围为2～1；z的范围为0.63～0.47。在本发明中，所述A包括NO3 2-和CO3 2-。
在本发明中，所述水滑石的粒径优选为0.5～2μm。
在本发明中，所述多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料中镁元素的质量分数优选为2.22～7.29％，更优选为6.97％；铝元素的质量分数优选为1.05～3.48％，更优选为3.07％；铕元素的质量分数优选为0.36～1.20％，更优选为1.02％。
在本发明中，所述水滑石原位生长在所述多孔羟基磷灰石支架表面。在本发明中，所述多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料优选为白色。
本发明还提供了上述技术方案所述多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料的制备方法，包括以下步骤：
将镁无机盐、铝无机盐、铕无机盐、六亚甲基四胺和水混合，得到镁铝铕盐溶液；
将多孔羟基磷灰石支架置于所述镁铝铕无机盐溶液中，进行水热反应，得到多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料。
本发明将镁无机盐、铝无机盐、铕无机盐、六亚甲基四胺和水混合，得到镁铝铕盐溶液。在本发明中，所述镁无机盐优选包括硝酸镁、硫酸镁或氯化镁，具体优选为Mg(NO3)2·6H2O；所述铝无机盐优选包括硝酸铝、氯化铝或硫酸铝，具体优选为Al(NO3)3·9H2O；所述铕无机盐优选包括硝酸铕、三氯化铕或硫酸铕，具体优选为Eu(NO3)3。
在本发明中，所述镁铝铕盐溶液中镁离子、铝离子和铕离子的摩尔比优选为2:0.9～0.7:0.1～0.3。
在本发明中，所述镁无机盐中的镁离子、六亚甲基四胺和水的摩尔比优选为1：2～4：0.8～1，更优选为1：3：0.9。在本发明中，所述水优选为去离子水。
得到镁铝铕盐溶液后，本发明将多孔羟基磷灰石支架置于所述镁铝铕无机盐溶液中，进行水热反应，得到多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料。下面先对所述多孔羟基磷灰石支架的制备方法进行详细说明：在本发明中，所述多孔羟基磷灰石支架的制备方法优选包括以下步骤：
将羟基磷灰石粉末和壳聚糖浆液混合，得到羟基磷灰石/壳聚糖复合浆料；所述壳聚糖浆液为壳聚糖的乙酸水溶液；
将三聚氰胺海绵浸入所述羟基磷灰石/壳聚糖复合浆料中，得到填充复合浆料的三聚氰胺海绵；
将所述填充复合浆料的三聚氰胺海绵进行干燥，得到多孔磷灰石/壳聚糖/海绵支架；
将所述多孔磷灰石/壳聚糖/海绵支架进行煅烧，得到多孔羟基磷灰石支架。
本发明优选将羟基磷灰石粉末和壳聚糖浆液混合，得到羟基磷灰石/壳聚糖复合浆料。在本发明中，所述羟基磷灰石粉末优选为纳米羟基磷灰石粉末。在本发明中，所述壳聚糖浆液优选为壳聚糖的乙酸水溶液；所述壳聚糖浆液的制备方法优选为：将0.3g壳聚糖粉末加入到10mL浓度为0.35mol/L的乙酸水溶液中，待壳聚糖粉末完全溶解，得到壳聚糖浆液。
在本发明中，所述羟基磷灰石粉末和壳聚糖浆液中的壳聚糖的质量比优选为20:1。
得到羟基磷灰石/壳聚糖复合浆料后，本发明优选将三聚氰胺海绵浸入所述羟基磷灰石/壳聚糖复合浆料中，得到填充复合浆料的三聚氰胺海绵。本发明对所述浸入的时间没有特殊要求，三聚氰胺海绵中充满所述羟基磷灰石/壳聚糖复合浆料为宜。在本发明中，所述三聚氰胺海绵优选为圆柱形、正方体或三棱柱，所述圆柱形三聚氰胺海绵的直径优选为10mm，高度优选为2mm。
得到填充复合浆料的三聚氰胺海绵后，本发明优选将所述填充复合浆料的三聚氰胺海绵进行干燥，得到多孔磷灰石/壳聚糖/海绵支架。在本发明中，所述干燥优选为真空干燥；所述真空干燥的真空度优选为80千帕；所述干燥的温度优选为60℃；所述干燥的时间优选为24h。本发明在干燥过程中，随着溶剂的蒸发，得到干燥的多孔磷灰石/壳聚糖/海绵支架。
得到多孔磷灰石/壳聚糖/海绵支架后，本发明优选将所述多孔磷灰石/壳聚糖/海绵支架进行煅烧，得到多孔羟基磷灰石支架。在本发明中，所述煅烧的温度优选为1350℃，保温时间优选为2h。在本发明中，由室温升温至所述煅烧的温度的升温速率优选为5℃/min。在本发明中，所述煅烧的气氛优选为空气。
得到多孔羟基磷灰石支架后，本发明将所述多孔羟基磷灰石支架置于所述镁铝铕无机盐溶液中，进行水热反应，得到多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料。在本发明中，所述多孔羟基磷灰石支架在置于镁铝铕无机盐溶液中前，优选先在超声波浴中用去离子水和无水乙醇分别清洗5分钟。本发明通过清洗去除多孔羟基磷灰石支架上残留的杂质。
在本发明中，所述水热反应的温度优选为80～140℃，更优选为120℃；所述水热反应的时间优选为8～48h，更优选为24～36h。在本发明中，所述水热反应优选在高温反应釜中进行，更优选为特氟龙内衬的不锈钢高压釜。
本发明优选在所述水热反应后，将所得反应体系冷却至室温，然后将所得支架依次进行清洗、透析处理和干燥，得到多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料。在本发明中，所述清洗优选为分别用去离子水和无水乙醇多次冲洗。在本发明中，所述透析处理采用的透析袋的截留分子量优选为3.5kDa。本发明通过透析处理去除残留的六亚甲基四胺。在本发明中，所述干燥优选为真空干燥；所述干燥的温度优选为60℃；所述干燥的时间优选为12～24h。
本发明提供了上述技术方案所述多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料或上述技术方案所述制备方法制备得到的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料在制备骨修复支架材料中的应用。本发明通过一步水热法在多孔羟基磷灰石支架上原位生长掺铕的镁铝水滑石，得到的复合材料具有良好的生物相容性，可以促进多孔羟基磷灰石支架成骨和成血管性能，而不需要额外的细胞或生长因子。该复合材料制备方法简单，可以在多孔羟基磷灰石支架光滑的表面形成微纳米结构，以此赋予羟基磷灰石支架材料优异的生物活性和亲水性能，与纯羟基磷灰石支架相比成骨和成血管性能更加优异，在骨组织工程领域具有潜在的应用前景。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
对比例1
多孔羟基磷灰石支架(HAp)的合成：
将0.3g壳聚糖粉末加入到10mL浓度为0.35mol/L的乙酸水溶液中并保持磁力搅拌直到壳聚糖粉末完全溶解，得到壳聚糖浆液；然后将6g纳米羟基磷灰石粉末缓慢加入壳聚糖浆液中，再继续机械搅拌得到均匀的羟基磷灰石/壳聚糖复合浆料；
将三聚氰胺海绵浸入所述羟基磷灰石/壳聚糖复合浆料中，直至海绵充满浆料；将其转移到真空烘箱中，在真空度为80千帕和温度为60℃的条件下保持干燥24h，得到干燥的多孔纳米基磷灰石/壳聚糖/海绵支架；
将所述多孔纳米基磷灰石/壳聚糖/海绵支架置于马弗炉中，以5℃/min的升温速率升温至1350℃，煅烧2h，得到多孔羟基磷灰石支架(HAp)。
实施例1
按照对比例1的方法制备得到多孔羟基磷灰石支架(HAp)；在超声波浴中用去离子水和无水乙醇分别清洗HAp 5min；
将2mmol Mg(NO3)2·6H2O、0.9mmolAl(NO3)3·9H2O、0.1mmol Eu(NO3)3和6mmol六亚甲基四胺溶于20mL去离子水中，得到镁铝铕盐溶液；
将2g清洗后的HAp与所述镁铝铕盐溶液放入高温反应釜中，在120℃进行水热反应8h，之后冷却至室温，分别用去离子水和无水乙醇多次冲洗取出的复合材料，随后将所得的复合材料进行透析(3.5kDa)处理，然后在真空烘箱中干燥18h，得到多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料(记为HL8)。
实施例2
按照对比例1的方法制备得到多孔羟基磷灰石支架(HAp)；在超声波浴中用去离子水和无水乙醇分别清洗HAp 5min；
将2mmol Mg(NO3)2·6H2O、0.9mmolAl(NO3)3·9H2O、0.1mmol Eu(NO3)3和6mmol六亚甲基四胺溶于20mL去离子水中，得到镁铝铕盐溶液；
将2g清洗后的HAp与所述镁铝铕盐溶液放入高温反应釜中，在120℃进行水热反应16h，之后冷却至室温，分别用去离子水和无水乙醇多次冲洗取出的复合材料，随后将所得的复合材料进行透析(3.5kDa)处理，然后在真空烘箱中干燥18h，得到多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料(记为HL16)。
实施例3
按照对比例1的方法制备得到多孔羟基磷灰石支架(HAp)；在超声波浴中用去离子水和无水乙醇分别清洗HAp 5min；
将2mmol Mg(NO3)2·6H2O、0.9mmolAl(NO3)3·9H2O、0.1mmol Eu(NO3)3和6mmol六亚甲基四胺溶于20mL去离子水中，得到镁铝铕盐溶液；
将2g清洗后的HAp与所述镁铝铕盐溶液放入高温反应釜中，在120℃进行水热反应24h，之后冷却至室温，分别用去离子水和无水乙醇多次冲洗取出的复合材料，随后将所得的复合材料进行透析(3.5kDa)处理，然后在真空烘箱中干燥18h，得到多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料(记为HL24或HL24-Eu/10％)。
实施例4
按照对比例1的方法制备得到多孔羟基磷灰石支架(HAp)；在超声波浴中用去离子水和无水乙醇分别清洗HAp 5min；
将2mmol Mg(NO3)2·6H2O、0.9mmolAl(NO3)3·9H2O、0.1mmol Eu(NO3)3和6mmol六亚甲基四胺溶于20mL去离子水中，得到镁铝铕盐溶液；
将2g清洗后的HAp与所述镁铝铕盐溶液放入高温反应釜中，在120℃进行水热反应36h，之后冷却至室温，分别用去离子水和无水乙醇多次冲洗取出的复合材料，随后将所得的复合材料进行透析(3.5kDa)处理，然后在真空烘箱中干燥18h，得到多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料(记为HAp/LDH-36h)。
实施例5
按照对比例1的方法制备得到多孔羟基磷灰石支架(HAp)；在超声波浴中用去离子水和无水乙醇分别清洗HAp 5min；
将2mmol Mg(NO3)2·6H2O、0.9mmolAl(NO3)3·9H2O、0.1mmol Eu(NO3)3和6mmol六亚甲基四胺溶于20mL去离子水中，得到镁铝铕盐溶液；
将2g清洗后的HAp与所述镁铝铕盐溶液放入高温反应釜中，在120℃进行水热反应48h，之后冷却至室温，分别用去离子水和无水乙醇多次冲洗取出的复合材料，随后将所得的复合材料进行透析(3.5kDa)处理，然后在真空烘箱中干燥18h，得到多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料(记为HAp/LDH-48h)。
实施例6
按照对比例1的方法制备得到多孔羟基磷灰石支架(HAp)；在超声波浴中用去离子水和无水乙醇分别清洗HAp 5min；
将2mmol Mg(NO3)2·6H2O、0.8mmolAl(NO3)3·9H2O、0.2mmol Eu(NO3)3和6mmol六亚甲基四胺溶于20mL去离子水中，得到镁铝铕盐溶液；
将2g清洗后的HAp与所述镁铝铕盐溶液放入高温反应釜中，在120℃进行水热反应24h，之后冷却至室温，分别用去离子水和无水乙醇多次冲洗取出的复合材料，随后将所得的复合材料进行透析(3.5kDa)处理，然后在真空烘箱中干燥18h，得到多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料(记为HL24-Eu/20％)。
实施例7
按照对比例1的方法制备得到多孔羟基磷灰石支架(HAp)；在超声波浴中用去离子水和无水乙醇分别清洗HAp 5min；
将2mmol Mg(NO3)2·6H2O、0.7mmolAl(NO3)3·9H2O、0.3mmol Eu(NO3)3和6mmol六亚甲基四胺溶于20mL去离子水中，得到镁铝铕盐溶液；
将2g清洗后的HAp与所述镁铝铕盐溶液放入高温反应釜中，在120℃进行水热反应24h，之后冷却至室温，分别用去离子水和无水乙醇多次冲洗取出的复合材料，随后将所得的复合材料进行透析(3.5kDa)处理，然后在真空烘箱中干燥18h，得到多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料(记为HL24-Eu/30％)。
测试例
1)实施例3制备多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料的实验过程进行实物拍照，结果见图1；图1的I为不同形状的三聚氰胺海绵，Ⅱ为多孔纳米基磷灰石/壳聚糖/海绵支架，Ⅲ为多孔羟基磷灰石支架，Ⅳ为多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料。由图1可知，采用直径10mm的三聚氰胺海绵制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料的直径为6毫米。图2为对比例1的多孔羟基磷灰石支架和实施例3制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料的扫描电镜(SEM)对比图。由图2可以看出，实施例3制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料表面成功生长片状水滑石。
2)对制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料进行微观形貌的表征测试，研究了HAp、HL8、HL16、HL24四种支架材料的扫描电镜，结果见图3，图3的第二行是第一行黑框的放大图。由图3可知，在纯HAp支架表面观察到致密光滑表面，通过不同的水热反应时间，生长不同密度的水滑石，随着水热时间的增加，在羟基磷灰石支架表面生长的水滑石也逐渐增多，其中HL24水滑石生长的密度最大，HL16次之，HL8最小。
3)对制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料进行更长水热时间和元素含量进行测试，来研究不同水热时间和不同金属盐投料比对复合支架材料的影响，如图4的a所示，随着水热反应时间的增加，HAp/LDH-36h和HAp/LDH-48h的SEM微观形貌展现与HL24相同的表面形态。此外，图4的b和c通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-MS)测试了不同水热时间和不同金属盐投料的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料(HAp/LDHs支架)的元素含量，在HAp/LDHs支架中检测到Eu离子，表明金属Eu元素成功掺杂到水滑石中。HAp/LDHs中Mg、Al和Eu元素的浓度随着水热反应时间的增加而逐渐增加，表明水滑石随着水热反应时间的增加而逐渐在羟基磷灰石表面进行生长。同时，HL36(HAp/LDH-36h)和HL48(HAp/LDH-48h)的金属离子浓度与HL24相同，即使增加铕盐的比例，HL24-Eu/20％和HL24-Eu/30％仍保持与HL24相似的结果。显然，这些结果表明，经过24小时的水热反应，水滑石已在HAp支架表面完全生长。
4)对制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料在Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中进行35天内的离子释放实验，如图5所示，图5的a为镁离子累积释放量，b为铝离子累积释放量，c为铕离子累积释放量。由图5可以看出，HL8、HL16和HL24支架在Tris-HCl缓冲溶液中第35天内表现出持续的离子释放动力学行为。
5)对制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料进行细胞黏附实验，小鼠胚胎成骨前体细胞(MC3T3-E1)在HAp/LDHs支架上黏附和附着的形态在共培养3天后通过SEM进行观察，如图6所示。与HAp支架上的MC3T3-E1细胞相比，HAp/LDHs支架上的MC3T3-E1细胞表现出更充分的铺展和延伸的丝状伪足，这表明生长的水滑石可以促进HAp/LDHs支架上的细胞黏附。然而，与HL24支架相比，HL8和HL16支架上的MC3T3-E1细胞没有完全伸展，表明随着表面粗糙度的增加，能够更好地促进细胞的黏附。另外，HAp/LDHs支架在与MC3T3-E1细胞一起培养后显示出一些光滑的表面，这可能是由于细胞培养基中HAp/LDHs支架表面的水滑石进一步降解和吸收所致。
6)对制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料进行碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S(ARS)染色实验，用ALP和ARS染色结果和定量分析来验证不同水热时间的复合材料的诱导成骨性能，所得结果如图7所示。通过茜素红S染色试验验证材料对MC3T3-E1细胞的体外矿化能力，同时ALP在成骨的早期阶段起关键作用。图7的b和d的ARS染色结果显示在HL24组中可以观察到大量矿化结节的形成，同时HL24组的OD值明显高于其他组。此外，与纯HAp支架相比，HL24组显示出更明显的ALP染色效果(图7的a)，表明HL24促进了MC3T3-E1在支架上的成骨分化，这与茜素红S染色的结果一致。碱性磷酸酶活性也呈现出相似的趋势(图7的c)。上述两个结果都证明了在多孔羟基磷灰石支架表面原位生长掺铕的镁铝水滑石复合支架材料具有显著的成骨能力，特别是随着水热时间增加成骨性能更好，这可能与粗糙表面促进细胞黏附和生物活性离子释放有关。
7)对制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料进行血管生成实验，来评估复合支架材料对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的管形成能力，所得结果如图8所示。在管形成分析试验中，血管形成能力基于水滑石原位生长时间的依赖性方式发生，在分析结构的参数时，即新形成连接点的数量和长度时(图8的b和c)，随着水滑石生长时间增加，新形成连接点的数量和长度数量更多，代表着新形成的血管更多，并且与HAp相比，另外三组之间存在显著统计学差异。
8)对制备的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料进行植入兔子颅骨的手术，手术及复合材料植入过程如图9所示。在颅骨部位，用环钻工具制造4个直径为6mm的颅骨缺损。将纯HAp支架和三种不同水热时间的水滑石表面改性HAp支架(HL8、HL16、HL24)放置在相应的位置。
通过Micro-CT检测0周、4周和8周的复合材料植入颅骨后骨缺损部位的再生状态，所得结果如图10所示。纯HAp支架组8周时的Micro-CT图像显示，其骨量通过自修复略有增加，并且在缺损内部发现较大的残余空隙空间。然而，在第4周和第8周时，HAp/LDHs支架组中所有兔子的临界缺损周围都出现了新的骨组织。4周和8周后，植入支架和HAp/LDHs支架的兔的骨体积值明显大于纯HAp支架(图10的b)，表明在多孔羟基磷灰石支架表面原位生长的水滑石会通过释放生物活性离子促进骨再生。同样，骨矿化密度分析结果也显示出同样的趋势(图10的c)。
对比例和实施例结果表明，本发明提供的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料有效的赋予羟基磷灰石支架优异的细胞粘附性和诱导成骨与成血管的活性。本发明合成的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料具有良好的生物相容性，它能有效促进细胞黏附，诱导体外钙沉积和成血管细胞迁移来实现优异的成骨和成血管性能。因此，这种具备生物活性的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料有望成为临床骨科手术的一种很有前途的生物活性植入材料。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料，包括多孔羟基磷灰石支架以及附着在所述多孔羟基磷灰石支架表面的水滑石；所述水滑石为掺铕的镁铝水滑石；
所述多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料中镁元素的质量分数为2.22～7.29％，铝元素的质量分数为1.05～3.48％，铕元素的质量分数为0.36～1.20％。
2.根据权利要求1所述的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料，其特征在于，所述水滑石的化学式为Mg2+ 1-xM3+ x(OH)2·An- x/n·zH2O，其中M3+代表Al3+和Eu3+，A代表水滑石层板间的阴离子；Al3+和Eu3+的摩尔比为0.9～0.7:0.1～0.3；x的范围为0.17～0.33；n的范围为2～1；z的范围为0.63～0.47。
3.根据权利要求1所述的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料，其特征在于，所述多孔羟基磷灰石支架的孔径为200～600μm。
4.权利要求1～3任一项所述多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料的制备方法，包括以下步骤：
将镁无机盐、铝无机盐、铕无机盐、六亚甲基四胺和水混合，得到镁铝铕盐溶液；
将多孔羟基磷灰石支架置于所述镁铝铕无机盐溶液中，进行水热反应，得到多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述镁铝铕盐溶液中镁离子、铝离子和铕离子的摩尔比为2:0.9～0.7:0.1～0.3。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述镁无机盐中的镁离子、六亚甲基四胺和水的摩尔比为1：2～4：0.8～1。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述水热反应的温度为80～140℃；所述水热反应的时间为8～48h。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述多孔羟基磷灰石支架的制备方法包括以下步骤：
将羟基磷灰石粉末和壳聚糖浆液混合，得到羟基磷灰石/壳聚糖复合浆料；所述壳聚糖浆液为壳聚糖的乙酸水溶液；
将三聚氰胺海绵浸入所述羟基磷灰石/壳聚糖复合浆料中，得到填充复合浆料的三聚氰胺海绵；
将所述填充复合浆料的三聚氰胺海绵进行干燥，得到多孔磷灰石/壳聚糖/海绵支架；
将所述多孔磷灰石/壳聚糖/海绵支架进行煅烧，得到多孔羟基磷灰石支架。
9.权利要求1～3任一项所述多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料或权利要求4～8任一项所述制备方法制备得到的多孔羟基磷灰石-水滑石复合材料在制备骨修复支架材料中的应用。
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