CN111849013A - 一种纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架及其制备方法和用途 - Google Patents
一种纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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Abstract
本发明提供了一种纳米羟基磷灰石‑丝素蛋白矿化支架及其制备方法和用途,属于生物医用材料领域。该矿化支架的制备方法包括如下步骤:将丝素蛋白支架浸没于矿化液中反应,即得;所述矿化液是乙二胺四乙酸钙钠和磷酸二氢钠混合水溶液。本发明矿化支架不仅亲水性显著提高、生物相容性良好、可促进细胞迁移和生长,还具有良好的力学性能和良好的成骨分化、诱导能力,可促进牙槽窝内新骨生成、减少牙槽嵴吸收。与现有技术中的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合材料相比力学性能和成骨分化、诱导能力有显著提高,可用于拔牙位点的保存。同时,本发明矿化支架能被人体降解吸收,降解产物无毒性,是一种性能优良的生物医用材料,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域,具体涉及一种纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架及其制备方法和用途。
背景技术
牙拔除后,剩余牙槽骨出现不可逆性吸收,原有牙槽骨高度、宽度降低。骨量的不足严重影响口腔种植修复治疗。因此,拔牙位点保存技术应用而生。目前,可靠而有效的位点保存方法为采用骨替代材料填充拔牙窝,促进牙槽窝内新骨生成。常用的骨替代材料包括自体骨、同种异体骨、异种骨等,但存在需要开辟第二术区取骨、免疫原性反应、疾病传播等风险。开发新型便捷、无毒、可吸收的人工骨替代材料来满足临床应用仍是当下的研究热点。
丝素蛋白是一种天然的蛋白聚合物,具有良好的生物相容性、可控降解性、优异的机械性能、极低的免疫原性和易于加工等有点,被认为是一种很有潜力的生物应用材料。同时,丝素蛋白具有与胶原蛋白相似的纤维状结构,其氨基酸侧链中的羟基、羧基官能团可作为羟基磷灰石矿化的模板。近年来,丝素蛋白在牙科材料领域的研究和应用较多,如:静电纺丝屏障膜、生长因子缓释载体、种植体表面涂层、牙髓干细胞培养支架等。
羟基磷灰石是一种生物活性陶瓷,其化学组成和结晶结构类似于天然骨组织的磷灰石。将丝素蛋白和羟基磷灰石结合,制备成丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料可以很好的模拟骨的有机/无机结构。传统的丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料的制备过程包括①共混法,即将已合成好的羟基磷灰石与丝素蛋白溶液物理性混合,通过冷冻干燥法制备具有三维多孔结构的支架材料。但合成的复合材料难以形成无机物与有机物在分子水平上的紧密键合,只能在成分上而不能从结构上进行仿生,并且易出现力学性能下降,材料与矿化物结合不紧密等问题。②模拟体液(SBF)矿化法,即将丝素蛋白材料长时间地浸泡在模拟体液中,使羟基磷灰石在基质材料上自组装形成晶体。但模拟体液离子饱和度高,易析出晶体,溶液稳定性差。③交替浸渍矿化法,即直接将丝素蛋白支架交替浸渍于过饱和的钙磷矿化液中,诱导其矿化。但其缺点是难以形成稳定结晶的羟基磷灰石,骨诱导性和骨引导性较差,从而应用受到较大的限制。因此,寻找到一种新的制备方法,制备结构稳定、力学性能优良、生物相容性、骨诱导性和骨引导性良好的丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明提供了一种纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架及其制备方法和用途。
本发明提供了一种纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的制备方法,它包括如下步骤:将丝素蛋白支架浸没于矿化液中反应,即得;
所述矿化液是乙二胺四乙酸钙钠和磷酸二氢钠混合水溶液。
进一步地,所述矿化液中乙二胺四乙酸钙钠的浓度为0.2~0.3mol/L,所述磷酸二氢钠的浓度为0.1~0.2mol/L;
优选地,所述矿化液中乙二胺四乙酸钙钠的浓度为0.25mol/L,所述磷酸二氢钠的浓度为0.15mol/L;
更优选地,所述矿化液的pH为6.0。
进一步地,所述矿化液的制备方法如下:将乙二胺四乙酸钙钠和磷酸二氢钠溶于去离子水中后,用NaOH水溶液调节pH,即可;
优选地,所述NaOH水溶液的浓度为1mol/L。
进一步地,所述将丝素蛋白支架浸没于矿化液中反应的反应条件为120~130℃、1~3atm条件下反应12~24h;
优选地,所述反应条件为121℃、2atm条件下反应24h。
进一步地,所述反应后得到的纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架还要经过如下步骤的处理:清洗,然后干燥;
优选地,所述清洗为去离子水清洗;
和/或,所述干燥为冷冻干燥。
进一步地,所述丝素蛋白支架为将丝素蛋白溶液冷冻干燥后而得;
优选地,所述丝素蛋白溶液的浓度为5wt%~10wt%;
和/或,所述冷冻干燥为先在-80℃冷冻12h,再-50℃冷冻干燥;
更优选地,所述丝素蛋白溶液的浓度为6wt%。
进一步地,所述丝素蛋白溶液的制备方法包括如下步骤:
(1)将桑蚕茧放入Na2CO3溶液中脱胶,清洗、干燥,得纤维状丝素蛋白;
(2)将纤维状丝素蛋白溶于LiBr溶液中,透析、离心,得丝素蛋白溶液。
进一步地,
步骤(1)中,所述桑蚕茧为桑蚕茧片;
和/或,步骤(1)中,所述桑蚕茧和Na2CO3溶液的质量比为1:(10~100);
和/或,步骤(1)中,所述Na2CO3溶液的浓度为0.01~0.05mol/L;
和/或,步骤(1)中,所述脱胶时间为1~5h;
和/或,步骤(1)中,所述清洗为用去离子水清洗;
和/或,步骤(1)中,所述干燥为37℃恒温干燥;
和/或,步骤(2)中,所述LiBr溶液的浓度为9~10mol/L;
和/或,步骤(2)中,所述纤维状丝素蛋白和LiBr溶液的质量比为1:(1~10);
和/或,步骤(2)中,所述纤维状蚕茧溶于LiBr溶液中的溶解条件为30~60℃溶解1~5h;
和/或,步骤(2)中,所述透析为去离子水透析;
和/或,步骤(2)中,所述离心的离心率为5000~10000r/min;
优选地,
步骤(1)中,所述桑蚕茧和Na2CO3溶液的质量比为1:30;
和/或,步骤(1)中,所述Na2CO3溶液的浓度为0.02mol/L;
和/或,步骤(1)中,所述Na2CO3溶液为沸水溶液;
和/或,步骤(1)中,所述脱胶时间为1h;
和/或,步骤(1)中,所述脱胶时加热匀速搅拌;
和/或,步骤(1)中,所述清洗为用去离子水清洗3次,每次20min;
和/或,步骤(2)中,所述LiBr溶液的浓度为9.3mol/L;
和/或,步骤(2)中,所述纤维状丝素蛋白和LiBr溶液的质量比为1:6;
和/或,步骤(2)中,所述纤维状蚕茧溶于LiBr溶液中的溶解条件为60℃溶解4h;
和/或,步骤(2)中,所述透析为去离子水透析3天;
和/或,步骤(2)中,所述透析时,透析袋的截留分子量为3500Da;
和/或,步骤(2)中,所述离心的离心率为9000r/min;
更优选地,所述丝素蛋白溶液使用去离子水稀释或聚乙二醇浓缩调节浓度。
本发明还提供了一种纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架,它是由前述的制备方法制备而成。
本发明还提供了前述的纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架在制备骨替代材料中的应用;优选地,所述骨替代材料用于填充拔牙窝。
本发明的有益效果在于:
(1)将丝素蛋白与羟基磷灰石通过水热矿化法制成骨组织工程用复合支架材料,一方面丝素蛋白可作为羟基磷灰石粒子的粘接剂,抑制羟基磷灰石粒子的脱离和迁移;另一方面可以使有机聚合物的韧性与无机粒子的强度中和,提高材料的机械性能。本发明的纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架综合两者的性能,优势互补,具有优异的力学性能。
(2)本发明采用的丝素蛋白基底材料具有良好的生物相容性、低免疫原性、可被体内降解吸收,且降解产物为氨基酸,无毒性。
(3)本发明矿化过程获得的羟基磷灰石为纳米级,具有骨诱导性,有助于牙槽窝内新骨生成。
(4)本发明制备的纳米羟基磷灰石矿化的丝素蛋白多孔支架材料制备工艺简单,需时短,制备条件容易满足,原料成本低廉。
综上,本发明方法制备的纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架不仅亲水性能显著提高、生物相容性良好、可促进细胞迁移和生长,还具有良好的力学性能和良好的成骨分化、诱导能力,可促进牙槽窝内新骨生成、减少牙槽嵴吸收。与现有技术中的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合材料相比力学性能和成骨分化、诱导能力有显著提高,可用于拔牙位点的保存。同时,本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架被人体降解吸收,且降解产物对机体无毒性,是一种性能优良的生物医用材料,具有良好的应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的扫描电镜图:a为丝素蛋白多孔支架的低倍(300X)扫描电镜图;b为纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的低倍(300X)扫描电镜图;c为丝素蛋白多孔支架的高倍(2000X)扫描电镜图;d为纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的高倍(2000X)扫描电镜图。
图2为本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的傅里叶红外光谱图。
图3为本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的X射线衍射谱图。
图4为本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的接触角检测数据。
图5为本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的细胞毒性检测结果,绿色表示活细胞,红色表示死细胞:a为MC3T3-E1接种在丝素蛋白多孔支架后1天的生长情况;b为MC3T3-E1接种在纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架后1天的生长情况;c为MC3T3-E1接种在丝素蛋白多孔支架后3天的生长情况;d为MC3T3-E1接种在纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架后3天的生长情况。
图6为本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的细胞分布结果,其中,左图红色框内放大后为右图,红色箭头为紧贴孔壁生长的MC3T3-E1细胞。
图7为本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的成骨分化结果。
图8为本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的大鼠拔牙窝内新骨生成实验结果。
图9为本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架、传统共混矿化丝素蛋白支架和模拟体液矿化丝素蛋白支架的细胞毒性检测结果。
图10为本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架、传统共混矿化丝素蛋白支架和模拟体液矿化丝素蛋白支架的力学性能检测结果。
图11为本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架、传统共混矿化丝素蛋白支架和模拟体液矿化丝素蛋白支架的骨诱导性能检测结果。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品,通过购买市售产品获得。
实施例1、本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的制备
将去除蚕蛹后的桑蚕茧减成1cm2的蚕茧片,将蚕茧片放入浓度为0.02mol/L的Na2CO3溶液中进行脱胶处理1h,Na2CO3溶液为沸水,蚕茧片与Na2CO3溶液的质量比为1:30,脱胶过程中使用加热磁力搅拌器加热并匀速搅拌。脱胶处理后将已成纤维状的蚕茧彻底清洗(去离子水清洗3次,每次20min)后拧干,放入37℃恒温干燥烘箱中干燥,得纤维状丝素蛋白。
将纤维状丝素蛋白溶于9.3mol/L的LiBr溶液中,纤维状丝素蛋白和LiBr溶液的质量比为1:6,溶解条件为60℃溶解4h,然后经去离子水透析3天,透析袋的质量为3500Da,透析后离心,离心速率为9000r/min,获得丝素蛋白溶液,丝素蛋白溶液通过滴加去离子水稀释或PEG(聚乙二醇)浓缩调节,得到浓度为6wt%的丝素蛋白溶液。
将丝素蛋白溶液移入细胞培养孔板中,放入-80℃冰箱冷冻12h,然后-50℃冷冻干燥即得丝素蛋白多孔支架。丝素蛋白多孔支架尺寸根据细胞培养孔板而得,直径为5mm或10mm,高度为3mm。
将丝素蛋白多孔支架浸没于新鲜配制的矿化液中,121℃、2atm条件下反应24h,经去离子水彻底清洗(去离子水清洗3次,每次20min)后,冷冻干燥获得纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架材料。矿化液的配制方法为将EDTA-Ca-Na2(乙二胺四乙酸钙钠)和NaH2PO4·H2O(一水磷酸二氢钠)一起溶于去离子水中,用浓度为1mol/L的NaOH调节溶液pH为6.0,所述矿化液中EDTA-Ca-Na2的浓度为0.25mol/L,NaH2PO4的浓度为0.15mol/L。
本发明矿化支架材料的扫描电镜图如图1所示,图1中a和c为丝素蛋白多孔支架的低倍(300X)和高倍(2000X)扫描电镜图,所制备的丝素蛋白多孔支架呈高度连通的多孔结构,孔隙均匀分布,孔隙周围呈现出小梁状或刃状边缘;图1中b和d为纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的低倍(300X)和高倍(2000X)扫描电镜图,所制备的纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架呈多孔状,孔壁有纳米级羟基磷灰石均匀沉积。
以下通过具体的试验例证明本发明的有益效果。
试验例1、本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的表征
1、傅里叶红外检测
将实施例1所得纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架剪碎成粉末状,对其进行傅里叶红外光谱检测,研究其有机官能团变化情况。傅里叶红外检测的结果如图2所示:1635cm-1、1520cm-1和1232cm-1处的吸收峰分别归属于蚕丝蛋白分子(Silk)的酰胺I、酰胺II和酰胺III的特征吸收峰,表明其二级结构为无规卷曲;此外,在矿化支架材料的红外光谱中607cm-1和561cm-1的特征吸收对应磷酸根O-P-O弯曲振动,证明矿化支架中存在羟基磷灰石。图2中MSF为纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架,SF为丝素蛋白多孔支架。
2、X射线衍射检测
将实施例1所得纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架剪碎成粉末状,对其进行X射线衍射检测,研究丝素蛋白材料中引入纳米级羟基磷灰石对材料微观结晶形态的改变。X射线衍射检测的结果如图3所示:结果表明纯丝素蛋白支架材料存在一定结晶(β-折叠)。而通过矿化法引入纳米羟基磷灰石的复合材料表现出高结晶度,是由于纳米羟基磷灰石的存在诱导看丝素蛋白分子链结构上的变化。图3中MSF为纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架,SF为丝素蛋白多孔支架。
试验例2、本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的亲水性
将实施例1所得纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架放在接触角测量仪的载物台上,每次测量使用5μl去离子水滴,记录水滴接触到样品表面后的铺展变化,并通过量角法测量接触角大小,每组样品重复测量3次,取最终平均值,结果如图4所示。图4结果显示:纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的平均水接触角(45.67°)明显低于丝素蛋白多孔支架(85.37°)(p<0.01),表明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的亲水性能显著提高。图4中MSF为纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架,SF为丝素蛋白多孔支架。
试验例3、本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的细胞毒性
将小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1)接种在实施例1所得纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架材料上,37℃、5%CO2孵箱中进行培养1和3天后进行活-死细胞染色,通过共聚焦显微镜观察细胞在支架材料上的生存情况。本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的细胞毒性结果如图5所示:图中a和c为MC3T3-E1接种在丝素蛋白多孔支架后1天和3天的生存状态,图b和d为MC3T3-E1接种在纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架后1天和3天的生存状态,绿色表示活细胞,红色表示死细胞,可以看出MC3T3-E1在纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架上增殖更快,表明矿化支架无生物毒性,且利于细胞生长。
试验例4、本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的细胞分布
将MC3T3-E1接种在实施例1所得纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架材料上,37℃、5%CO2孵箱中进行培养7天后经过石蜡包埋,制成切片,并进行苏木精和伊红染色,通过光学显微镜观察细胞在支架材料上的生存分布情况,结果如图6所示。图6显示纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架表现出多孔结构,孔隙之间互相贯通。MC3T3-E1细胞呈梭形紧贴孔壁生长,与材料间连接稳固,证明了纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架可提供一个诱导细胞附着和迁移的良好微环境。图6中MSF为纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架,SF为丝素蛋白多孔支架。
试验例5、本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的骨诱导性
将MC3T3-E1接种在实施例1所得纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架材料上,并连续在成骨诱导培养基中培养21天后进行茜素红染色,通过光学显微镜观察细胞在支架材料上的成骨分化情况,并通过氯化十六烷基吡啶与茜素红反应的定量分析进一步精确分析钙含量。本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的成骨分化结果如图7所示:对MC3T3-E1成骨诱导21天后,与SF(丝素蛋白多孔支架)组相比,在MSF(纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架)材料上,钙含量沉积明显增多,表现出明显增多的矿化小结,并通过定量分析,MSF组的OD值高于SF组(p<0.05),说明MSF具有更大的成骨诱导潜力。
试验例6、本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的动物试验
将实施例1所得本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架植入大鼠上颌第一磨牙拔牙窝,通过组织学切片HE染色观察术后一周和六周牙槽窝内新骨生产情况。图8所示,图中空白对照组为拔牙窝自然愈合过程,图中丝素蛋白组为拔牙窝内植入丝素蛋白多孔支架的愈合过程,图中矿化丝素蛋白组为拔牙窝内植入纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的愈合过程。可看出纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架具有良好的骨诱导性,可促进牙槽窝内新骨生成。
试验例7、本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架与共混矿化丝素蛋白支架、模拟体液矿化丝素蛋白支架的细胞毒性检测
传统共混矿化丝素蛋白支架(GSF)的制备方法:
将去除蚕蛹的蚕茧剪成碎片后,放置于浓度为0.02mol/L的Na2CO3水溶液中煮沸60分钟,蚕茧片与Na2CO3溶液的质量比为1:30,脱去丝胶蛋白,然后用去离子水充分洗净,拧干,于37℃恒温箱中过夜烘干。称量干燥的纤维状丝素蛋白,随后放入浓度为9.3mol/L的LiBr溶液中进行搅拌,纤维状丝素蛋白和LiBr溶液的质量比为1:6,避光条件下保持温度60℃,4h。随后,将彻底溶解的纤维状丝素蛋白溶液注入截留分子量为3500Da的透析袋中,室温下于去离子水中透析3天,间隔12h更换一次去离子水。将透析得到的纤维状丝素蛋白溶液在4℃,4000r/min转速下离心30min后取上清液,测量浓度,并调整最终浓度为6wt%。即得到丝素蛋白溶液。
将羟基磷灰石粉末以20%浓度加入上述所得的丝素蛋白溶液中,混合均匀后转移至孔板中,并放入-80℃超低温冰箱中过夜进行预冻,随后,将样品在温度为-60℃的条件下冷冻干燥48h,即可获得GSF支架。将GSF支架浸泡在90%(v/v)甲醇溶液中,30min后取出,去离子水清洗干净,置于37℃恒温箱中烘干处理,备用。
模拟体液矿化丝素蛋白支架(SSF)的制备方法:
将去除蚕蛹的蚕茧剪成碎片后,放置于浓度为0.02mol/L的Na2CO3水溶液中煮沸60分钟,蚕茧片与Na2CO3溶液的质量比为1:30,脱去丝胶蛋白,然后用去离子水充分洗净,拧干,于37℃恒温箱中过夜烘干。称量干燥的纤维状丝素蛋白,随后放入浓度为9.3mol/L的LiBr溶液中进行搅拌,纤维状丝素蛋白和LiBr溶液的质量比为1:6,避光条件下保持温度60℃,4h。随后,将彻底溶解的纤维状丝素蛋白溶液注入截留分子量为3500Da的透析袋中,室温下于去离子水中透析3天,间隔12h更换一次去离子水。将透析得到的纤维状丝素蛋白溶液在4℃,4000r/min转速下离心30min后取上清液,测量浓度,并调整最终浓度为6wt%。即得到丝素蛋白溶液。
将上述所得的丝素蛋白溶液转移至规格不同的孔板中,并放入-80℃超低温冰箱中过夜进行预冻,随后,将样品在温度为-60℃的条件下冷冻干燥48h,即可获得丝素蛋白支架。将状丝素蛋白支架浸泡在90%(v/v)甲醇溶液中,30min后取出,去离子水清洗干净,置于37℃恒温箱中烘干处理,备用。
配制1×模拟体液:取700ml去离子水于1000ml塑料烧杯中,依次加入8.035gNaCl、0.355g NaHCO3、0.225gKCl、0.231g K2HPO4·3H2O、0.311g MgCl2·6H2O、39ml 1.0M·HCl、0.292g CaCl2、0.072g Na2SO4、6.118g Tris、0-5ml 1.0M·HCl,溶解完全,PH为7.20-7.40,保持温度为36.5±1.5℃。
将上述所得的丝素蛋白支架浸泡于新鲜配制的模拟体液中,于37℃条件下矿化7天后取出,洗净,备用,即得SSF支架。
分别将实施例1所得的纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架(MSF)、传统共混矿化丝素蛋白支架(GSF)和模拟体液矿化丝素蛋白支架(SSF)的浸提液培养MC3T3-E1,1、3、7天后通过CCK-8测定细胞活力,进行细胞毒性评价,结果如图9所示。图9显示:3组材料的相对增值率均接近100%,毒性测试的等级为0级,证明3组支架基本无毒副作用。
试验例8、本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架与共混矿化丝素蛋白支架、模拟体液矿化丝素蛋白支架的力学性能检测
传统共混矿化丝素蛋白支架(GSF)的制备方法:同试验例7;
模拟体液矿化丝素蛋白支架(SSF)的制备方法:同试验例7。
通过万能力学实验机对3组材料进行压缩强度检测。将各组支架均修整为4mm高,直径5mm的圆柱体,横梁速度设置为1mm/min,测量范围在0-50%形变量的范围之中,并在弹性形变范围内计算材料的弹性模量,结果如图10所示。根据图10所示,在弹性形变区域,本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架(MSF)的弹性模量(E1=1007.61±221.15kPa)明显高于模拟体液矿化丝素蛋白支架、共混矿化丝素蛋白支架组(E2=450.23±48.91kPa、E3=708.46±80.35kPa)(P<0.05)。说明与其他方法制备的羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架,本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架力学性能有显著提高。
试验例9、本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架与共混矿化丝素蛋白支架、模拟体液矿化丝素蛋白支架的骨诱导性能检测
传统共混矿化丝素蛋白支架(GSF)的制备方法:同试验例7;
模拟体液矿化丝素蛋白支架(SSF)的制备方法:同试验例7。
qRT-PCR是检测细胞基因表达的方法,灵敏度高,易于操作。因此在本实验中,将MC3T3-E1在各组支架表面成骨诱导培养7天后,通过该手段来检测细胞成骨分化情况。为了评估各组支架对于细胞成骨分化的促进作用,检测了四种成骨标记基因ALP,Runx2,Col-1,Osx的表达(图11)。结果显示:在细胞接种后7天,纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架组较其他两组而言,成骨相关基因表达有显著上升,即在该时间点下,纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架组(MSF)的成骨基因表达水平最高。其中,纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的ALP和Runx2表达相比共混矿化丝素蛋白组(GSF)有显著提高,差异具有统计学意义(P<0.05);纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的Osx表达相比模拟体液矿化丝素蛋白组(SSF)有显著提高,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架与其他方法制备的羟基磷灰石/丝素蛋白复合材料相比,具有更好的成骨分化能力。
综上,本发明方法制备的纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架不仅亲水性能显著提高、生物相容性良好、可促进细胞迁移和生长,还具有良好的力学性能和良好的成骨分化、诱导能力,可促进牙槽窝内新骨生成、减少牙槽嵴吸收。与现有技术中的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合材料相比力学性能和成骨分化、诱导能力有显著提高,可用于拔牙位点的保存。同时,本发明纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架被人体降解吸收,且降解产物对机体无毒性,是一种性能优良的生物医用材料,具有良好的应用前景。
Claims (10)
1.一种纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架的制备方法,其特征在于:它包括如下步骤:将丝素蛋白支架浸没于矿化液中反应,即得;
所述矿化液是乙二胺四乙酸钙钠和磷酸二氢钠混合水溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述矿化液中乙二胺四乙酸钙钠的浓度为0.2~0.3mol/L,所述磷酸二氢钠的浓度为0.1~0.2mol/L;
优选地,所述矿化液中乙二胺四乙酸钙钠的浓度为0.25mol/L,所述磷酸二氢钠的浓度为0.15mol/L;
更优选地,所述矿化液的pH为6.0。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述矿化液的制备方法如下:将乙二胺四乙酸钙钠和磷酸二氢钠溶于去离子水中后,用NaOH水溶液调节pH,即可;
优选地,所述NaOH水溶液的浓度为1mol/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述将丝素蛋白支架浸没于矿化液中反应的反应条件为120~130℃、1~3atm条件下反应12~24h;
优选地,所述反应条件为121℃、2atm条件下反应24h。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述反应后得到的纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架还要经过如下步骤的处理:清洗,然后干燥;
优选地,所述清洗为去离子水清洗;
和/或,所述干燥为冷冻干燥。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述丝素蛋白支架为将丝素蛋白溶液冷冻干燥后而得;
优选地,所述丝素蛋白溶液的浓度为5wt%~10wt%;
和/或,所述冷冻干燥为先在-80℃冷冻12h,再-50℃冷冻干燥;
更优选地,所述丝素蛋白溶液的浓度为6wt%。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于:所述丝素蛋白溶液的制备方法包括如下步骤:
(1)将桑蚕茧放入Na2CO3溶液中脱胶,清洗、干燥,得纤维状丝素蛋白;
(2)将纤维状丝素蛋白溶于LiBr溶液中,透析、离心,得丝素蛋白溶液。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中,所述桑蚕茧为桑蚕茧片;
和/或,步骤(1)中,所述桑蚕茧和Na2CO3溶液的质量比为1:(10~100);
和/或,步骤(1)中,所述Na2CO3溶液的浓度为0.01~0.05mol/L;
和/或,步骤(1)中,所述脱胶时间为1~5h;
和/或,步骤(1)中,所述清洗为用去离子水清洗;
和/或,步骤(1)中,所述干燥为37℃恒温干燥;
和/或,步骤(2)中,所述LiBr溶液的浓度为9~10mol/L;
和/或,步骤(2)中,所述纤维状丝素蛋白和LiBr溶液的质量比为1:(1~10);
和/或,步骤(2)中,所述纤维状蚕茧溶于LiBr溶液中的溶解条件为30~60℃溶解1~5h;
和/或,步骤(2)中,所述透析为去离子水透析;
和/或,步骤(2)中,所述离心的离心率为5000~10000r/min;
优选地,
步骤(1)中,所述桑蚕茧和Na2CO3溶液的质量比为1:30;
和/或,步骤(1)中,所述Na2CO3溶液的浓度为0.02mol/L;
和/或,步骤(1)中,所述Na2CO3溶液为沸水溶液;
和/或,步骤(1)中,所述脱胶时间为1h;
和/或,步骤(1)中,所述脱胶时加热匀速搅拌;
和/或,步骤(1)中,所述清洗为用去离子水清洗3次,每次20min;
和/或,步骤(2)中,所述LiBr溶液的浓度为9.3mol/L;
和/或,步骤(2)中,所述纤维状丝素蛋白和LiBr溶液的质量比为1:6;
和/或,步骤(2)中,所述纤维状蚕茧溶于LiBr溶液中的溶解条件为60℃溶解4h;
和/或,步骤(2)中,所述透析为去离子水透析3天;
和/或,步骤(2)中,所述透析时,透析袋的截留分子量为3500Da;
和/或,步骤(2)中,所述离心的离心率为9000r/min;
更优选地,所述丝素蛋白溶液使用去离子水稀释或聚乙二醇浓缩调节浓度。
9.一种纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架,其特征在于:它是由权利要求1~8任一项所述的制备方法制备而成。
10.权利要求9所述的纳米羟基磷灰石-丝素蛋白矿化支架在制备骨替代材料中的应用;优选地,所述骨替代材料用于填充拔牙窝。
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