CN108744061B - 一种负载bmp-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种负载BMP‑2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架及其制备方法和应用。本发明利用丝素蛋白和掺锶羟基磷灰石用于骨修复的优势；再将肝素结合到复合支架上，用于缓释生长因子；再吸附BMP‑2，缓释其生长因子能够促进骨髓基质间充质细胞体外增值和诱导其分化为成骨前体细胞，同时，锶元素的掺入可有效提高骨诱导能力以及募集体内骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，该复合支架有望在生物材料领域得到广泛的应用。

Description

一种负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架 及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架及其制备方法和应用。
背景技术
骨形态发生蛋白(BMP)是一种多功能的生长因子，其中，BMP-2在骨形成中是最主要的调控因子，促进骨愈合。已有研究发现：BMP-2能够促进骨髓基质间充质细胞体外增值和诱导其分化为成骨前体细胞。尽管BMP-2具有很多优点，但是也存在一些不足，如：短时间内暴释、易失活、不稳定、半衰期短等。
丝素蛋白(Silk fibroin，SF)是一种从蚕茧中提取的天然生物材料，因其具有无毒、无刺激、良好的生物相容性，通过加工、修饰使降解具有可控性，降解产物易吸收，免疫抗原性低等优点而被作为组织工程的支架材料，成为了研究的热点。
纳米羟基磷灰石(nHAp)具有良好的生物相容性、高的比表面积、有助于细胞的增殖粘附等优点，但其也有质地脆、降解性不好、骨诱导性也不强等缺点，为了满足临床的需求，我们针对这些缺点，对纳米羟基磷灰石的性能进行了改善。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架，解决了支架材料中BMP-2短时间内暴释的问题，并改善了现有羟基磷灰石基支架材料的生物性能。
本发明的另一个目的还在于提供所述负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法，制备工艺简单。
本发明的另一个目的还在于提供所述负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架在骨修复材料中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)在去离子水中加入掺锶羟基磷灰石，经超声分散得到掺锶羟基磷灰石分散液，所述掺锶羟基磷灰石中Sr/(Sr+Ca)的质量比为0～30％；
(2)将掺锶羟基磷灰石分散液与丝素蛋白溶液混合，冷冻干燥后将其浸泡于甲醇溶液中，烘干，得到掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白支架；
(3)配制肝素溶液，将掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白支架置于肝素溶液中进行温育，经清洗和冷冻干燥后，得到掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架；
(4)将BMP-2负载到步骤(3)的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架上，获得所述负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架。
纳米羟基磷灰石的主要成分与天然骨中的无机成分相似，但是天然骨结构中还含有Na、Mg、Sr和Zn等离子。因此，将这些离子掺入纳米羟基磷灰石中，对其进行改性，使其与天然骨结构更相似。在Mg离子和Zn离子掺入纳米羟基磷灰石中，对nHAp的成核以及生长均会造成影响；同时，Zn离子还会造成nHAp晶体尺寸变小和热稳定性也有所降低。在周期表中，锶(Sr)元素与Ca元素是同族元素，在人体中的代谢途径与钙极为相似，具有促进成骨分化以及抑制骨吸收的作用。掺锶羟基磷灰石能够进一步改善羟基磷灰石自身的性能，它不仅具有良好的力学性能及生物性能，而且能够促进成骨细胞活性和抑制破骨细胞分化，还可以促进新骨的形成。
本发明利用丝素蛋白和掺锶羟基磷灰石用于骨修复的优势；再将肝素(Hep)结合到复合支架上，肝素与生长因子发生特异性相互作用，用于缓释生长因子；再吸附BMP-2，缓释其生长因子能够促进骨髓基质间充质细胞体外增值和诱导其分化为成骨前体细胞。
作为本发明所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法的优选实施方式，所述掺锶羟基磷灰石中Sr/(Sr+Ca)的质量比为10％。
作为本发明所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法的优选实施方式，所述丝素蛋白溶液的浓度为2～10wt％。
作为本发明所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法的优选实施方式，所述掺锶羟基磷灰石为纳米掺锶羟基磷灰石，所述纳米掺锶羟基磷灰石采用共沉淀法制备得到。
作为本发明所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法的优选实施方式，其特征在于，所述步骤(1)中，掺锶羟基磷灰石分散液中掺锶羟基磷灰石与去离子水的比例为0.1g:0.5～1.0mL。
作为本发明所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，纳米掺锶羟基磷灰石分散液与丝素蛋白溶液的比为0.5～1.0mL：10mL。
作为本发明所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法的优选实施方式，所述肝素溶液的浓度为1～3mg/mL。
作为本发明所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法的优选实施方式，所述BMP-2的浓度为0.005～0.015mg/mL。
作为本发明所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法的优选实施方式，所述丝素蛋白溶液的制备方法为：
1)将蚕茧剪碎，然后加入温度为95～100℃，浓度为0.5wt％NaHCO3水溶液中进行脱胶处理，其中，NaHCO3水溶液与蚕茧的比例为100mL：2g；脱胶后用去离子水清洗丝素至中性，再重复脱胶和洗涤操作一次，烘干，得到丝素蛋白；
2)取丝素蛋白置于圆底烧瓶中，加入浓度为9.0～9.5mol/L的溴化锂溶液，丝素蛋白与溴化锂溶液的比例为1g:12.5～25mL，在40～60℃水浴加热溶解4～6小时，将丝素蛋白混合液置于透析袋中透析3～5天后，离心，取出上层清液置于浓度为10～25wt％的聚乙二醇溶液中进行反透析8～24小时，即得所述丝素蛋白溶液。
作为本发明所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法的优选实施方式，所述掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的体积为1.5-2.0mm3。
作为本发明所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法的优选实施方式，所述透析袋的截留分子量为8k～14kDa。
作为本发明所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法的优选实施方式，所述步骤2)中，离心条件为25℃，5000r/min，10～15min。
作为本发明所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法的优选实施方式，步骤(3)和(4)中，冷冻干燥的条件为-60℃，48h。
本发明还提供了根据上述方法制备得到的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架。
本发明的复合支架的孔隙率为80～95％，孔径为50～200μm，纳米掺锶羟基磷灰石能够增强骨的传导性以及骨诱导能力，并能够促进成骨细胞的形成以及抑制破骨细胞的产生，同时，肝素结合在复合支架上能够起到缓释BMP-2的效果。
本发明还提供了所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架在骨修复材料中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
发明制备的复合支架具有合适的孔径和孔隙率，其中支架的孔径为50-240μm，孔隙率为80％-95％，有利于骨髓间充质干细胞的粘附和增殖，以及有利于细胞向成骨细胞分化，克服了现有支架材料欠缺的一些问题，多种物质复合，保持了原物质的优点，解决了单一原有材料性能的不足。本发明制备工艺简单，所需的原材料易得，制备的复合支架有望在生物材料领域得到广泛的应用。
附图说明
图1为实施例1～4中制备的羟基磷灰石的TEM图。
图2为实施例1～4制备的羟基磷灰石的EDS图。
图3为实施例1～4的复合支架在扫描电子显微镜下的结构图，由图可知实例1的复合支架的孔径均匀，平均孔径为110-130μm，测出的孔隙率约为92％。
图4为实施例1～4的复合支架的细胞增殖率图。
图5为实施例1和实施例5的复合支架中BMP-2的体外释放曲线。
图6为实施例1的Sr-nHAp/SF复合支架、实施例1的Sr-nHAp/SF-Hep-BMP-2的复合支架、实施例5的Sr-nHAp/SF-BMP-2复合支架的成骨相关基因的表达。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1负载BMP-2的纳米掺锶掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架及其制备方法
本实施例的负载BMP-2的纳米掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架制备方法，包括如下步骤：
(1)取8g去蛹的蚕茧放置于含有2g碳酸氢钠的400mL去离子水中，对其进行加热至沸腾，煮沸时间持续半小时后，取出并用去离子水清洗，重复上述操作至用苦味酸胭脂红法定性判断丝素蛋白中不再含有丝胶为止。然后将得到的丝素蛋白，放置于温度为50℃的烘箱中，加热干燥过夜，去除丝素蛋白中的水分，获得丝素蛋白待用。
(2)取2.5g纯的丝素蛋白并剪成小块，将其置于25mL浓度为9.3mol/L的溴化锂溶液；再在温度为50℃的水浴中加热。加热5h后取出，放置于截留分子量为8kDa的透析袋中进行透析，每隔12小时更换一次去离子水，目的是将丝素蛋白溶液中的溴化锂除去。将透析后的丝素蛋白溶液置于25℃，转速为5000rpm/min的离心机中离心，离心时间为10min，取其上清液再重新离心一次，取出上层清液置于200mL浓度为20wt％的聚乙二醇溶液中进行反透析8～24小时，更换1～2次聚乙二醇溶液，便获得浓度为3.5wt％的丝素蛋白溶液，于4摄氏度的冰箱中保存，备用。
(3)称取0.1g的10％(Sr元素取代纳米羟基磷灰石中的Ca元素的质量比)的掺锶纳米羟基磷灰石(记为10％Sr-nHAp)于试管中，再向其中加入0.5mL去离子水，为了得到均匀的分散液，将其置于超声震荡中；然后，向其中加入10mL步骤(2)的丝素蛋白溶液，边加边震荡，再涡旋5分钟左右，使其混合均匀，然后将溶液注入孔板中，保鲜膜封口，并扎适量小孔，再置于-80℃下冷藏形成冰晶状固体，最后取出置于冻干机中-60℃冻干24小时取出，即得10％Sr-nHAp/SF复合支架。由于复合支架易溶于水，因此需将其浸没于90％(v/v)甲醇溶液中使之改性，再于烘箱中烘干。
其中，掺锶纳米羟基磷灰石的制备方法为：
称取一定量的Ca(NO3)·4H2O和Sr(NO3)2置于烧杯中，加入去离子水溶解，形成含有Ca和Sr的溶液；再称取一定量的(NH4)2HPO4置于烧杯中并加入去离子水溶解，形成P的溶液；将上述两种溶液按照最终溶液中(Ca+Sr)与P的摩尔比为1.67进行配比。溶解适量的Sr(NO3)2和Ca(NO3)·4H2O以获得的Sr/(Sr+Ca)质量比为10％的产物。
(4)将肝素结合到(3)所得的复合支架上，就得到10％Sr-nHAp/SF-Hep的复合支架。
首先，将0.433g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.157g N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于188.3mL去离子水中，并调节溶液的pH至5.4，得到MES缓冲液；然后将一定量的肝素溶于MES缓冲液中，肝素在溶液中最终浓度为2mg/mL；为了得到无菌的支架，将含有肝素的MES溶液通过0.22μm膜滤器过滤；先将已经灭菌的支架于MES缓冲溶液中孵育；再将支架浸入含有肝素溶液的离心管中，并于37℃下进行温育。弃去过量的上清液后，用一系列无菌氯化钠溶液洗涤支架，然后用无菌水洗涤三次。然后将含有肝素的复合支架在经-20℃冷冻后，再通过冷冻干燥法将其冻干，置于无菌条件下备用。
(5)将50μL浓度为0.01mg/mL BMP-2负载于Sr-nHAp/SF-Hep复合支架上，然后，在室温下，使复合支架与BMP-2之间发生特异性相互作用，24小时后，收集支架，就得到了本实施例10％Sr-nHAp/SF-Hep-BMP-2复合支架。
本发明中冷冻干燥的条件为-60℃，冷冻干燥24h；本发明为便于材料的后续分析检测，所述掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的体积为1.5-2.0mm3。
实施例2负载BMP-2的羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架及其制备方法
本实施例的负载BMP-2的羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架的制备方法包括如下步骤：
(1)取8g去蛹的蚕茧放置于含有2g碳酸氢钠的400mL去离子水中，对其进行加热至沸腾，煮沸时间持续半小时后，取出并用去离子水清洗，重复上述操作至用苦味酸胭脂红法定性判断丝素蛋白中不再含有丝胶为止。然后将得到的丝素蛋白，放置于温度为50℃的烘箱中，加热干燥过夜，去除丝素蛋白中的水分，获得丝素蛋白待用。
(2)取1g纯的丝素蛋白并剪成小块，将其置于12.5mL浓度为9.0mol/L的溴化锂溶液；再在温度为50℃的水浴中加热。加热5h后取出，放置于截留分子量为10kDa的透析袋中进行透析，每隔12小时更换一次去离子水，目的是将丝素蛋白溶液中的溴化锂除去。将透析后的丝素蛋白溶液置于25℃，转速为5000rpm/min的离心机中离心，离心时间为10min，取其上清液再重新离心一次，取出上层清液置于200mL浓度为15wt％的聚乙二醇溶液中进行反透析8～24小时，更换1～2次聚乙二醇溶液，便获得浓度为2wt％的丝素蛋白溶液，于4摄氏度的冰箱中保存，备用。
(3)称取0.1g纳米羟基磷灰石于试管中，再向其中加入0.75mL去离子水，为了得到均匀的分散液，将其置于超声震荡中；然后，向其中加入10mL步骤(2)的丝素蛋白溶液，边加边震荡，再涡旋5分钟左右，使其混合均匀，然后将溶液注入孔板中，保鲜膜封口，并扎适量小孔，再置于-80℃冷藏形成冰晶状固体，最后取出置于冻干机中-60℃冻干24小时取出，即得nHAp/SF复合支架。由于复合支架易溶于水，因此需将其浸没于90％(v/v)甲醇溶液中使之改性，再于烘箱中烘干。
(4)将50μL浓度为0.01mg/mLBMP-2负载于nHAp/SF复合支架上，然后，在室温下，使复合支架与BMP-2之间发生特异性相互作用，24小时后，收集支架，就得到了本实施例的nHAp/SF-BMP-2复合支架。
实施例3负载BMP-2的纳米掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架及其制备方法
本实施例的负载BMP-2的纳米掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架及其制备方法包括如下步骤：
(1)取8g去蛹的蚕茧放置于含有2g碳酸氢钠的400mL去离子水中，对其进行加热至沸腾，煮沸时间持续半小时后，取出并用去离子水清洗，重复上述操作至用苦味酸胭脂红法定性判断丝素蛋白中不再含有丝胶为止。然后将得到的丝素蛋白，放置于温度为50℃的烘箱中，加热干燥过夜，去除丝素蛋白中的水分，获得丝素蛋白待用。
(2)取2.5g纯的丝素蛋白并剪成小块，将其置于50mL浓度为9.5mol/L的溴化锂溶液；再在温度为40℃的水浴中加热。加热6h后取出，放置于截留分子量为12kDa的透析袋中进行透析，每隔12小时更换一次去离子水，目的是将丝素蛋白溶液中的溴化锂除去。将透析后的丝素蛋白溶液置于25℃，转速为5000rpm/min的离心机中离心，离心时间为8min，取其上清液再重新离心一次，取出上层清液置于200mL浓度为10wt％的聚乙二醇溶液中进行反透析8～24小时，更换1～2次聚乙二醇溶液，便获得浓度为6wt％的丝素蛋白溶液，于4摄氏度的冰箱中保存，备用。
(3)称取0.1g的20％(Sr元素取代纳米羟基磷灰石中的Ca元素的质量比)的掺锶纳米羟基磷灰石(记为20％Sr-nHAp)于试管中，再向其中加入0.8mL去离子水，为了得到均匀的分散液，将其置于超声震荡中；然后，向其中加入10mL步骤(2)的丝素蛋白溶液，边加边震荡，再涡旋5分钟左右，使其混合均匀，然后将溶液注入孔板中，保鲜膜封口，并扎适量小孔，再置于-80℃下冷藏形成冰晶状固体，最后取出置于冻干机中-60℃冻干24小时取出，即得20％Sr-nHAp/SF复合支架。由于复合支架易溶于水，因此需将其浸没于90％(v/v)甲醇溶液中使之改性，再于烘箱中烘干。
其中，掺锶纳米羟基磷灰石的制备方法为：
称取一定量的Ca(NO3)·4H2O和Sr(NO3)2置于烧杯中，加入去离子水溶解，形成含有Ca和Sr的溶液；再称取一定量的(NH4)2HPO4置于烧杯中并加入去离子水溶解，形成P的溶液；将上述两种溶液按照最终溶液中(Ca+Sr)与P的摩尔比为1.67进行配比。溶解适量的Sr(NO3)2和Ca(NO3)·4H2O以获得的Sr/(Sr+Ca)质量比为20％的产物。
(4)将肝素结合到(3)所得的复合支架上，就得到10％Sr-nHAp/SF-Hep的复合支架。
首先，将0.433g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.157g N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于188.3mL去离子水中，并调节溶液的pH至5.4，得到MES缓冲液；然后将一定量的肝素溶于MES缓冲液中，肝素在溶液中最终浓度为1mg/mL；为了得到无菌的支架，将含有肝素的MES溶液通过0.22μm膜滤器过滤；先将已经灭菌的支架于MES缓冲溶液中孵育；再将支架浸入含有肝素溶液的离心管中，并于37℃下进行温育。弃去过量的上清液后，用一系列无菌氯化钠溶液洗涤支架，然后用无菌水洗涤三次。然后将含有肝素的复合支架在经-20℃冷冻后，再通过冷冻干燥法将其冻干，置于无菌条件下备用。
(5)将50μL浓度为0.005mg/mLBMP-2负载于Sr-nHAp/SF-Hep复合支架上，然后，在室温下，使复合支架与BMP-2之间发生特异性相互作用，24小时后，收集支架，就得到了本实施例20％Sr-nHAp/SF-Hep-BMP-2复合支架。
实施例4负载BMP-2的纳米掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架及其制备方法
本实施例的负载BMP-2的纳米掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架及其制备方法包括如下步骤：
(1)取8g去蛹的蚕茧放置于含有2g碳酸氢钠的400mL去离子水中，对其进行加热至沸腾，煮沸时间持续半小时后，取出并用去离子水清洗，重复上述操作至用苦味酸胭脂红法定性判断丝素蛋白中不再含有丝胶为止。然后将得到的丝素蛋白，放置于温度为50℃的烘箱中，加热干燥过夜，去除丝素蛋白中的水分，获得丝素蛋白待用。
(2)取2.5g纯的丝素蛋白并剪成小块，将其置于25mL浓度为9.5mol/L的溴化锂溶液；再在温度为60℃的水浴中加热。加热4h后取出，放置于截留分子量为14kDa的透析袋中进行透析，每隔12小时更换一次去离子水，目的是将丝素蛋白溶液中的溴化锂除去。将透析后的丝素蛋白溶液置于25℃，转速为5000rpm/min的离心机中离心，离心时间为15min，取其上清液再重新离心一次，取出上层清液置于200mL浓度为25wt％的聚乙二醇溶液中进行反透析8～24小时，更换1～2次聚乙二醇溶液，便获得浓度为10wt％的丝素蛋白溶液，于4摄氏度的冰箱中保存，备用。
(3)称取0.1g的30％(Sr元素取代纳米羟基磷灰石中的Ca元素的质量比)的掺锶纳米羟基磷灰石(记为30％Sr-nHAp)于试管中，再向其中加入1.0mL去离子水，为了得到均匀的分散液，将其置于超声震荡中；然后，向其中加入10mL步骤(2)的丝素蛋白溶液，边加边震荡，再涡旋5分钟左右，使其混合均匀，然后将溶液注入孔板中，保鲜膜封口，并扎适量小孔，再置于-80℃下冷藏形成冰晶状固体，最后取出置于冻干机中-60℃冻干24小时取出，即得30％Sr-nHAp/SF复合支架。由于复合支架易溶于水，因此需将其浸没于90％(v/v)甲醇溶液中使之改性，再于烘箱中烘干。
其中，掺锶纳米羟基磷灰石的制备方法为：
称取一定量的Ca(NO3)·4H2O和Sr(NO3)2置于烧杯中，加入去离子水溶解，形成含有Ca和Sr的溶液；再称取一定量的(NH4)2HPO4置于烧杯中并加入去离子水溶解，形成P的溶液；将上述两种溶液按照最终溶液中(Ca+Sr)与P的摩尔比为1.67进行配比。溶解适量的Sr(NO3)2和Ca(NO3)·4H2O以获得的Sr/(Sr+Ca)质量比为30％的产物。
(4)将肝素结合到(3)所得的复合支架上，就得到10％Sr-nHAp/SF-Hep的复合支架。
首先，将0.433g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.157g N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于188.3mL去离子水中，并调节溶液的pH至5.4，得到MES缓冲液；然后将一定量的肝素溶于MES缓冲液中，肝素在溶液中最终浓度为3mg/mL；为了得到无菌的支架，将含有肝素的MES溶液通过0.22μm膜滤器过滤；先将已经灭菌的支架于MES缓冲溶液中孵育；再将支架浸入含有肝素溶液的离心管中，并于37℃下进行温育。弃去过量的上清液后，用一系列无菌氯化钠溶液洗涤支架，然后用无菌水洗涤三次。然后将含有肝素的复合支架在经-20℃冷冻后，再通过冷冻干燥法将其冻干，置于无菌条件下备用。
(5)将50L浓度为0.015mg/mL BMP-2负载于Sr-nHAp/SF-Hep复合支架上，然后，在室温下，使复合支架与BMP-2之间发生特异性相互作用，24小时后，收集支架，就得到了本实施例30％Sr-nHAp/SF-Hep-BMP-2复合支架。
实施例5负载BMP-2的纳米掺锶掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架及其制备方法
本实施例的负载BMP-2的纳米掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架制备方法，包括如下步骤：
(1)取8g去蛹的蚕茧放置于含有2g碳酸氢钠的400mL去离子水中，对其进行加热至沸腾，煮沸时间持续半小时后，取出并用去离子水清洗，重复上述操作至用苦味酸胭脂红法定性判断丝素蛋白中不再含有丝胶为止。然后将得到的丝素蛋白，放置于温度为50℃的烘箱中，加热干燥过夜，去除丝素蛋白中的水分，获得丝素蛋白待用。
(2)取1g纯的丝素蛋白并剪成小块，将其置于25mL浓度为9.3mol/L的溴化锂溶液；再在温度为50℃的水浴中加热。加热5h后取出，放置于截留分子量为8kDa的透析袋中进行透析，每隔12小时更换一次去离子水，目的是将丝素蛋白溶液中的溴化锂除去。将透析后的丝素蛋白溶液置于25℃，转速为5000rpm/min的离心机中离心，离心时间为10min，取其上清液再重新离心一次，取出上层清液置于200mL浓度为20wt％的聚乙二醇溶液中进行反透析8～24小时，更换1～2次聚乙二醇溶液，便获得浓度为3.5wt％的丝素蛋白溶液，于4摄氏度的冰箱中保存，备用。
(3)称取0.1g的10％(Sr元素取代纳米羟基磷灰石中的Ca元素的质量比)的掺锶纳米羟基磷灰石(记为10％Sr-nHAp)于试管中，再向其中加入0.5mL去离子水，为了得到均匀的分散液，将其置于超声震荡中；然后，向其中加入10mL步骤(2)的丝素蛋白溶液，边加边震荡，再涡旋5分钟左右，使其混合均匀，然后将溶液注入孔板中，保鲜膜封口，并扎适量小孔，再置于-80℃下冷藏形成冰晶状固体，最后取出置于冻干机中-60℃冻干24小时取出，即得10％Sr-nHAp/SF复合支架。由于复合支架易溶于水，因此需将其浸没于90％(v/v)甲醇溶液中使之改性，再于烘箱中烘干，得到10％Sr-nHAp/SF复合支架。
其中，掺锶纳米羟基磷灰石的制备方法为：
称取一定量的Ca(NO3)·4H2O和Sr(NO3)2置于烧杯中，加入去离子水溶解，形成含有Ca和Sr的溶液；再称取一定量的(NH4)2HPO4置于烧杯中并加入去离子水溶解，形成P的溶液；将上述两种溶液按照最终溶液中(Ca+Sr)与P的摩尔比为1.67进行配比。溶解适量的Sr(NO3)2和Ca(NO3)·4H2O以获得的Sr/(Sr+Ca)质量比为10％的产物。
(4)将50μL浓度为0.01mg/mL BMP-2负载于Sr-nHAp/SF复合支架上，然后，在室温下，使复合支架吸附BMP-2，24小时后，收集支架，就得到了本实施例10％Sr-nHAp/SF-BMP-2复合支架。
比较实施例1～5之间的特征做如下分析实验：
(1)图1中A是实施例1的10％Sr-nHAp的TEM图。通过TEM来观察颗粒的微观形貌，由图可知，实施例1中10％Sr-nHAp呈棒状结构，长度范围是80～220nm，宽度大约为22nm；图2中A是实施例1的EDS图表，从图表可知，Sr元素在纳米羟基磷灰石中取代Ca元素的质量为8.7％，图1中B-D分别为实施例2～4中制备的羟基磷灰石的TEM图，从图中可以看出，nHAp颗粒呈棒状结构，长度范围比10％Sr-nHAp稍长，而宽度稍微宽点；实施例3和实施例4的TEM图可知，随着Sr元素替代纳米羟基磷灰石中Ca元素含量的增加，Sr-nHAp颗粒虽然还是呈短棒状结构，但是长度变短，宽度也有所增加。图2中的B-D分别是nHAp、20％Sr-nHAp和30％Sr-nHAp的EDS图表。
颗粒中的Sr元素取代纳米羟基磷灰石中Ca元素的质量比。图3为负载BMP-2的纳米掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架在扫描电子显微镜下的结构图，从图3中可以看出实施例1的复合支架的微孔分布是比较均匀的，微孔与微孔之间的连通性也很好，平均孔径达到125μm，且支架的孔隙率为92％左右，清晰可见有Sr-nHAp颗粒附着于其支架的表明以及内部，并且分布相对均匀，虽然会对复合支架孔径以及微孔与微孔之间的连通性均造成影响，但是相对来说影响却不大。实施例3-4所制备的复合支架无论是微孔的分布，各微孔之间的连通性，还是孔径的大小，都低于实施例1所制备的复合支架。随着锶元素含量的增加，复合支架的微孔分布均匀性较差，各微孔之间的连通性也随之降低，孔径的大小也随之增大，其孔隙率也发生改变。
(2)采用CCK-8法检测上述实施例中负载BMP-2的纳米掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架与细胞共培养的细胞增殖。在培养骨髓间充质干细胞时，所使用的培养液是含有10％的胎牛血清和1％的双抗(青霉素和链霉素的混合液)的α-MEM的培养基，细胞培养在条件为37℃和5％的CO2环境里。在测定材料对细胞的增值效果时，取对数生长期的骨髓间充质干细胞，将骨髓间充质干细胞悬浮液的浓度调整为每毫升含有1×107个。在体积为1.5-2.0mm3的实施例1～4的每个复合支架上加入50μL骨髓间充质干细胞悬浮液，孵育30min，然后将支架置入24孔细胞培养板中，2～3天更换一次培养液；收集1、4、7和10天时间点的细胞加入1cellTiter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂(Promega，Cat.No.G3582)，比例为1/10。即100μL培养液加入10μL检测液。在细胞培养箱中孵育4小时后，利用酶标仪读取孔板在450nm波长的吸光光度值，实验平行做3次。
计算绘图获得细胞增殖图，如图4所示。由图可知，实施例1-4的复合支架上的细胞，随着时间的推移，细胞均表现出增殖的现象。实施例1的复合支架与细胞共同孵育四个时间点后，每个时间点的细胞增殖均高于其他3种支架的。
(3)为了评估从实施例5的10％Sr-nHAp/SF-BMP-2和实施例1的10％Sr-nHAp/SF-Hep-BMP-2复合支架上释放的BMP-2的动力学，根据已报道的文章进行设计时间点。将复合支架浸入含有10mL PBS(pH＝7)的15mL离心管中，并将离心管置于37℃的摇床上。然后，在设定的时间间隔6h、12h、和1、3、5、7、14、21、28天，收集上1mL清液并及时补充等体积的新鲜PBS溶液。按照设置的时间点，及时收集样品并储存于-20℃直至分析。根据制造商的说明书，使用酶标仪在450nm波长处通过ELISA试剂盒测定上清液中BMP-2的量。
(4)通过定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)来分析有关成骨基因的表达，包括骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)。通过RT-qPCR测定以评估孵育21天后种植在复合支架(实施例1制备的Sr-nHAp/SF复合支架、实施例1制备的Sr-nHAp/SF-Hep-BMP-2的复合支架、实施例5制备的Sr-nHAp/SF-BMP-2复合支架)上的细胞的OCN以及OPN的表达水平，结果如图6所示。
上面表征对实施例1～4所制得的复合支架的孔径、孔隙率大小、细胞相容性以及BMP-2缓释对比发现，实施例1制备的支架为最优的复合支架。实施例1所得的缓释BMP-2的肝素结合的复合支架具有合适的孔径以及孔隙率，有利于细胞的粘附以及增殖，并且有利于细胞对营养物质的汲取和新陈代谢的输送；该复合支架用于骨诱导和骨修复等方面，由于锶元素的掺入，可有效提高骨诱导能力以及募集体内骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化；同时，肝素结合在复合支架上有利于BMP-2的缓释。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）在去离子水中加入掺锶羟基磷灰石，经超声分散得到掺锶羟基磷灰石分散液，所述掺锶羟基磷灰石中Sr/（Sr+Ca）的质量比为10%；
（2）将掺锶羟基磷灰石分散液与丝素蛋白溶液混合，冷冻干燥后将其浸泡于甲醇溶液中，烘干，得到掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白支架；
（3）配制肝素溶液，将羟基磷灰石/丝素蛋白支架置于肝素溶液中进行温育，经清洗和冷冻干燥后，得到掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架；
（4）将BMP-2负载到步骤（3）的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架上，获得所述负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架。
2.根据权利要求1所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白溶液的浓度为2~10 wt%。
3.根据权利要求1所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法，其特征在于，所述掺锶羟基磷灰石为纳米掺锶羟基磷灰石，所述纳米掺锶羟基磷灰石采用共沉淀法制备得到。
4.根据权利要求1所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，掺锶羟基磷灰石分散液中掺锶羟基磷灰石与去离子水的比例为0.1 g:0.5~1.0 mL。
5.根据权利要求4所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，纳米掺锶羟基磷灰石分散液与丝素蛋白溶液的比为0.5~1.0 mL：10 mL。
6.根据权利要求1所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法，其特征在于，所述肝素溶液的浓度为1~3 mg/mL。
7.根据权利要求1所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法，其特征在于，所述BMP-2的浓度为0.005~0.015 mg/mL。
8.根据权利要求1所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白溶液的制备方法为：
1）将蚕茧剪碎，然后加入温度为95~100℃，浓度为0.5 wt% NaHCO3水溶液中进行脱胶处理，其中，NaHCO3水溶液与蚕茧的比例为100 mL：2 g；脱胶后用去离子水清洗丝素至中性，再重复脱胶和洗涤操作一次，烘干，得到丝素蛋白；
2）取丝素蛋白置于圆底烧瓶中，加入浓度为9.0~9.5 mol/L的溴化锂溶液，丝素蛋白与溴化锂溶液的比例为1 g:12.5~25 mL，在40~60°C水浴加热溶解4~6小时，将丝素蛋白混合液置于透析袋中透析3~5天后，离心，取出上层清液置于浓度为10~25 wt%的聚乙二醇溶液中进行反透析8~24小时，即得所述丝素蛋白溶液。
9.根据权利要求1~8任一项所述方法制备得到的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架。
10.根据权利要求9所述的负载BMP-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架在制备骨修复材料中的应用。
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