CN113952512B - 一种复合多孔凝胶微球及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合多孔凝胶微球及其制备方法和应用，所述微球是丝素蛋白与脱细胞脱钙骨基质凝胶在海藻酸钠微球表面经乳化交联形成复合多孔薄膜，所述海藻酸钠微球通过海藻酸钠与氯化钠反应形成。通过本发明制备的复合天然骨基质的多孔凝胶微球有高孔隙率、大孔径、高表比面积的特点，利于细胞粘附和生长，具有降解可控性，成球性良好，无粘着现象，粒径大小聚集在50‑200μm，具有良好的溶胀性和血液相容性。适用于不同类型骨缺损修复，具有低免疫性，良好的血液相容性和诱导骨再生性，有利于加快缺损骨的再生进程。本发明制备工艺简单，易于操作和控制，具有广阔的应用前景。

Description

一种复合多孔凝胶微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及组织工程材料技术领域，特别的涉及一种复合多孔凝胶微球及其制备方法和应用。
背景技术
骨骼及其相关疾病占50岁以上人群慢性病的一半，是目前临床上所面临的一个重要的挑战。虽然骨骼具有一定的愈合和再生能力，但对于大的节段性骨缺损，骨不能单独完成修复。老年、交通事故、骨折不愈合、骨肿瘤切除等引起的大骨缺损或损伤，是骨科的严重问题，给健康和生活质量带来极大危害。自体骨移植仍被视为修复骨缺损的“金标准”。然而，自体骨移植的缺点包括继发性损伤、供区发病率高、特殊形状受限、自体骨来源不足等。这些弱点限制了它在临床环境中的广泛使用。异种和同种异体移植均可替代使用，但存在受体免疫系统识别和排斥以及疾病传播等潜在风险。随着骨组织工程技术的发展，支架材料不仅可以为种子细胞提供黏附位点，其理化特性被证明能够有效的调控种子细胞的生物学功能，最终影响骨缺素修复效果。其中，多孔微球作为骨组织工程支架材料的一种，一方面具有可直接注射于组织缺陷部位而免除外科手术过程的优点；另一方面由于其高比表面积和高孔隙率可以提高细胞扩增效率和细胞的新陈代谢等(Park JH,Pérez RA,Jin GZ,Choi SJ,Kim HW,Wall IB.Microcarriers designed for cell culture and tissueengineering of bone.Tissue Eng Part B Rev.2013；19(2):172-190)。
丝素微球有高孔隙率、大孔径、高表比面积、良好的生物相容性以及生物可降解的特点，有利于细胞粘附和生长，且其机械强度高，同时来源广泛，易于获取(Long S,Xiao Y,Zhang X.Progress in preparation of silk fibroin microspheres for biomedicalapplications.Pharm Nanotechnol.2020；8(5):358-371)。因此，丝素微球材料成为近几年组织修复的重要材料之一。但由于其缺乏骨诱导性不能自发诱导骨组织生长，且直接植于宿主体内容易使宿主产生免疫排斥反应，使得单纯的丝素微球在骨修复领域的应用收到制约。
脱细胞脱钙骨基质凝胶是通过物理化学和生物学方法将天然骨基质中的细胞完全去除，再经过酶消化为凝胶状，同时保留天然骨基质的细胞外基质成分和生物活性因子(Sawkins MJ,Bowen W,Dhadda P,Markides H,Sidney LE,Taylor AJ,Rose FR,BadylakSF,Shakesheff KM,White LJ.Hydrogels derived from demineralized anddecellularized bone extracellular matrix.Acta Biomater.2013；9(8):7865-7873)。脱细胞脱钙骨基质凝胶已经被证明能够有效的在体外促进骨祖细胞的黏附、增殖和成骨分化(Alom N,Peto H,Kirkham GR,Shakesheff KM,White LJ.Bone extracellular matrixhydrogel enhances osteogenic differentiation of C2C12 myoblasts and mouseprimary calvarial cells.J Biomed Mater Res B Appl Biomater.2018；106(2):900-908；Zheng Y,Huang K,You X,Huang B,Wu J,Gu Z.Hybrid hydrogels with highstrength and biocompatibility for bone regeneration.Int J Biol Macromol.2017；104:1143-1149)以及体内的骨缺损修复(Li W,Wang F,Barnett C,Wang B.A comparativestudy on fabrication techniques of gelable bone matrix derived from porcinetibia.J Biomed Mater Res B Appl Biomater.2021.doi:10.1002/jbm.b.34860.)。但是单纯的脱细胞脱钙骨基质凝胶由于降解速度过快、力学特性较差以及成型效果差等问题，严重的限制了其用于骨缺损修复的应用。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明的目的在于提供了一种复合多孔凝胶微球及其制备方法和应用，解决骨缺损修复过程自体骨组织来源有限、缺乏骨诱导能力以及降解特性差等问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种复合多孔凝胶微球，所述微球是丝素蛋白与脱细胞脱钙骨基质凝胶在海藻酸钠微球表面经乳化交联形成复合多孔薄膜，所述海藻酸钠微球通过海藻酸钠与氯化钠反应形成。海藻酸钠主要由海藻酸钠盐组成，其作为天然多糖碳水化合物，是一种具有良好增稠性、成膜性、稳定性、絮凝性、螯合性和生物安全相容性的高分子材料，利用氯化钙作为交联剂，可形成具有高度交联网状结构的海藻酸钠微球。
作为优选的，所述脱细胞脱钙骨基质凝胶与丝素蛋白的质量比为0.01～1:10。
本发明的另一个目的还在于，提供了一种上述复合多孔凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：
1)将经过脱细胞脱钙处理后的骨组织粉粹后，加入胃蛋白酶溶液，持续搅拌直至溶解，得到的脱细胞脱钙骨基质凝胶；
2)将司班80和吐温80加入石蜡后搅拌得到均匀乳液，然后向所述乳液中依次加入海藻酸钠溶液、丝素蛋白溶液、步骤1)得到的脱细胞脱钙骨基质凝胶和氯化钙，搅拌均匀，再加入交联剂后，将得到的反应液置于2～8℃充分反应得到凝胶微球溶液；
3)将步骤2)得到的凝胶微球溶液离心，除去上清液，得到的沉淀物经有机溶剂多次洗涤后，真空冷冻干燥，即得到所述复合多孔凝胶微球。
作为优选的，所述脱细胞脱钙骨基质凝胶的pH值为4～10，质量浓度为0.1mg/mL～30mg/mL。
作为优选的，所述脱细胞脱钙骨基质凝胶采用以下步骤制得：取骨组织去掉多余的杂质后切成小块，浸泡于浓度为0.6％～6％的Triton X-100中搅拌处理40～48h后，用离子水清洗多次，再将其用甲醇进行脱脂处理，然后使用DNA酶稀释液温育，再依次用无水乙醇和水清洗、干燥，然后将干燥后的脱细胞骨组织置入12％的EDTA-2Na脱钙液中进行脱钙处理3～4周，即得到脱细胞脱钙骨基质凝胶。
作为优选的，所述海藻酸钠溶液的质量浓度为0.5％～4％；所述丝素蛋白溶液的质量浓度为0.5～8％。
作为优选的，所述丝素蛋白采用以下步骤制得：选取中等级蚕茧，粉碎清洗，然后加入碳酸钠溶液沸煮2～3h后，37℃烘干，再加入氯化钙、无水乙醇和水组成的混合盐液，水浴加热至丝素全部溶解，过滤取上清，再经透析、离心和冷冻干燥，即得到丝素蛋白。
作为优选的，所述蚕茧与碳酸钠溶液的质量体积比为1g:20mL～30mL；所述混合盐液中氯化钙、无水乙醇和水的摩尔比为1:2:6～10。
作为优选的，所述交联剂为戊二醛或京尼平；所述有机溶剂为异丙醇和/或石油醚。
本发明的另一个目的还在于，提供了上述复合多孔凝胶微球或上述方法制备的复合多孔凝胶微球在骨修复中的应用。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明提供的复合多孔凝胶微球，以脱细胞脱钙骨基质凝胶和丝素蛋白为主要原料，其中丝素蛋白是一种天然蛋白分子，具有良好的生物相容性和安全性。脱细胞脱钙骨基质凝胶可以从天然骨中获得，与天然骨基质的经过脱细胞处理后去除了免疫原性，保留了天然骨基质的蛋白质成分以及生物活性因子，利于细胞的黏附，具有良好的骨诱导能力，可以促进骨的快速修复，同时可以有效地降低移植物引起的免疫排斥反应。通过丝素蛋白与脱细胞脱钙骨基质凝胶在海藻酸钠微球表面乳化交联形成复合多孔薄膜，不仅提高了材料的骨诱导性，使得该微球能够诱导和促进骨再生，而且具有良好的生物相容性，生物可降解性和无免疫原性。同时也解决了在骨修复材料中使用生物因子存在的生长因子半衰期短、浓度偏高、容易形成异位骨增生、价格昂贵以及控制释放困难等问题。
2、本发明制备的复合天然骨基质的多孔丝素微球表面具有类似细胞外基质的网络结构和生物活性因子等天然成分，有高孔隙率、大孔径、高表比面积、成球性良好和无粘着现象等的特点，有利于细胞的粘附和生长，可以促进新的骨的形成和加快缺损骨的再生进程。该微球具有良好的溶胀性和血液相容性，以及良好的生物相容性、骨诱导能力和生物可降解性，均符合国家对生物材料的安全性标准。相比于其它三维骨支架材料，能够直接注射到骨缺损位置，可以克服临床上骨缺损部位的不规则性，方便操作。本发明的微球是一种理想的新型骨修复材料，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明脱细胞脱钙骨基质凝胶的制备过程示意图。
图2为本发明制备的新鲜骨和脱细胞脱钙骨的H-E染色对比图。
图3为本发明制备的复合多孔凝胶微球在显微镜下形貌图；图A为实施例1；图B为实施例2；图C为实施例3；图D为对比例。
图4为本发明制备的复合多孔凝胶微球的粒径统计结果。
图5为本发明制备的复合多孔凝胶微球的红外光谱图。
图6为本发明制备的复合多孔凝胶微球的溶胀率曲线图。
图7为本发明制备的复合多孔凝胶微球的溶血率。
图8为本发明制备的复合多孔凝胶微球的血小板消耗率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例中所用试剂未特别说明均市售可得。
一、一种复合多孔凝胶微球的制备方法
实施例1
1)取新鲜猪骨的松质骨部分，去掉多余的杂质后切成大小均一的小骨块，浸泡在去离子水中置于4℃冰箱过夜后再将其置于1％的Triton X-100溶液中震荡48h，大量离子水摇晃清洗3次；再将所述骨组织放置到甲醇中搅拌脱脂，注意每隔4h换一次液；再将所述骨组织浸泡在200U的DNA酶稀释液中在37℃气浴恒温振荡箱振荡2h，震荡速度为175r/min；接着使用PBS清洗后置入无水乙醇中4h，注意每隔2h换一次液；最后使用去离子水清洗后干燥；将干燥后的脱细胞骨组织置入12％的EDTA-2Na脱钙液中进行脱钙处理3周-4周，直至样品完全脱钙，注意每天更换脱钙液一次，即得到脱细胞脱钙骨基质；将脱细胞脱钙骨基质研磨成粉末后，称取0.5g脱细胞脱钙骨基质粉末加到50mL浓度为1mg/mL的胃蛋白酶溶液，置于恒温37℃的磁力搅拌器上搅拌，至脱细胞脱钙骨基质完全溶解，调节溶液pH到7.2～7.4，即得到浓度为10mg/mL的脱细胞脱钙骨基质凝胶，呈白色透明凝胶状(图1)。
2)选取中等级蚕茧，粉碎清洗，按1g:25mL加入碳酸钠溶液(0.4％g/mL)沸煮2.5h，沸煮结束后用沸水洗三次，再将丝素样品用抽滤机抽干，放入烘干箱中37℃烘干。配制氯化钙/无水乙醇/水(摩尔比为1:2:8)混合盐液，80℃水浴加热30min，至丝素全部溶解。过滤取上清，将丝素溶液灌入透析袋(分子量8000-14000)中，用双蒸水透析三天，每12h换一次双蒸水。透析完成后，离心取上清液，即得到2％的丝素蛋白溶液。冷冻干燥，保存在4℃环境下备用。
3)取96mL的液体石蜡于烧杯中，加入3mL司班80和1mL吐温80后进行搅拌均匀(300r/min)30min得到均匀乳液，然后依次加入20mL 2％的海藻酸钠溶液、1mL步骤2)得到的2％丝素蛋白溶液和4mL步骤1)得到的脱细胞骨基质溶液后继续搅拌均匀(300r/min)15min，再将8mL浓度为5％的氯化钙溶液逐滴加入，最后加入1mL戊二醛溶液搅拌均匀后放入4℃冰箱静置12h，得到凝胶微球溶液。
4)将步骤3)获得的凝胶微球溶液离心，倒掉上清液，加入异丙醇搅拌洗涤溶液，然后离心(3000r/min，15min)去掉上清液，然后加入适量石油醚后继续离心(3000r/min，15min)，再次洗涤沉淀后弃掉上清液，收集沉淀。
5)将步骤4)获得的沉淀放入-80℃冰箱进行冷冻12h，再放入冷冻干燥机中冷冻，即可获得所述复合多孔凝胶微球。
实施例2～3和对比例与实施例1的操作步骤相同，仅脱细胞脱钙骨基质凝胶和丝素蛋白溶液的加入量不同，具体见表1所示。
表1
Figure GDA0003379378260000051
二、产品性能检测
1、将实施例1中猪的松质骨在经脱细胞脱钙前后进行H-E染色分析脱细胞的效果。其中，苏木精呈碱性，细胞核中的DNA呈酸性，酸性和碱性物质易于结合；细胞质呈碱性，伊红呈酸性，由此可得两者易于结合，结果如图2所示。
从图中可以看出，新鲜松质骨切片(脱细胞脱钙前)中有大量蓝紫色的细胞核核粉红色的细胞质，而脱细胞脱钙后松质骨的切片中几乎没有看到蓝紫色的细胞核，仅有粉红色的细胞质，说明本发明的脱细胞脱钙骨基质凝胶可以在有效的去除骨组织中细胞的同时保留其天然的细胞外基质。
2、将实施例1～3和对比例制备的复合多孔凝胶微球在显微镜下进行形态观测，结果如图3和4所示。
从图3中可以看出，本发明制备的复合多孔凝胶微球均成球性良好，且微球无粘着现象。且制备的复合多孔凝胶微球的平均粒径相对均一，初始粒径在200μm以下(图4)。
3、将实施例1～3和对比例制备的复合多孔凝胶微球进行红外光谱分析，结果如图5所示。
从图中可以看出，在SA的红外光谱图中，3277cm-1是O-H的吸收峰，2925cm-1为C-H的伸缩振动吸收峰，1608cm-1和1465cm-1是-COO-1基团的反对称与对称伸缩振动吸收峰，1030cm-1为O＝C-O的伸缩振动吸收峰，在SF的红外光谱图中，1627cm-1是酰胺Ⅰ的吸收峰，1415cm-1是酰胺Ⅱ的吸收峰，1023cm-1是酰胺Ⅲ的吸收峰。在四组不同配比的脱细胞骨基质微球的红外光谱图中，SA在3277cm-1处的O-H吸收峰向发生了移动，这是因为SF中的N-H和O-H与SA的O-H之间有氢键在相互作用，四组不同配比的脱细胞骨基质微球在3200cm-1-3400cm-1的范围处的波峰变宽，主要由于SA中O-H的强吸收峰出现在高波数，两者混合后，氢键作用增强，导致此波段的峰形状变宽，相较于SF的红外光谱，在实施例1～3和对比例中的微球红外光谱图中酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ的吸收峰都发生了移动,说明加入SA后，SF中部分无规则卷曲向β-折叠构象转变。图中实施例1～3和对比例中微球的红外光谱图中未见2750cm-1和2850cm-1的醛基吸收峰，说明洗涤充分微球中并无戊二醛残留。综上，四组不同配比的脱细胞骨基质微球的红外光谱中相对于单一成分并没有特殊特征吸收峰的消失，只相应峰位发生变化，说明SF(丝素蛋白)和SA(海藻酸钠)间是以强的氢键结合和静电相互作用。
4、将实施例1～3和对比例制备的复合多孔凝胶微球进行溶胀性能分析，结果如图6所示。
从图中可以看出，本发明制备的复合多孔凝胶微球均具有良好的溶胀性，前期快速溶胀，到一定时间点达到最大溶胀率时，微球达到溶胀平衡后续曲线逐渐平缓。
5、将实施例1～3和对比例制备的复合多孔凝胶微球进行溶血率分析，结果如图7所示。
从图中可以看出，本发明制备的复合多孔凝胶微球的溶血率随着脱细胞脱钙骨基质凝胶浓度的增加而降低，整体溶血率均低于3％，说明本发明制备的微球的溶血程度在标准范围内，符合国家对生物材料的安全性标准。而对比例微球溶血率为4.607±0.621％。
7、将实施例1～3和对比例制备的复合多孔凝胶微球进行血小板消耗率分析，结果如图8所示。
从图中可以看出，本发明制备的复合多孔凝胶微球的血小板消耗率随着脱细胞脱钙骨基质凝胶浓度的增加而降低，整体血小板消耗率均低于30％，说明本发明制备的微球出现血栓的风险低，符合对生物材料的安全性标准。而对比例的血小板消耗率为32.18±1.55。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种复合多孔凝胶微球，其特征在于，所述微球是丝素蛋白与脱细胞脱钙骨基质凝胶在海藻酸钠微球表面经乳化交联形成复合多孔薄膜，所述海藻酸钠微球通过海藻酸钠与氯化钠反应形成；所述脱细胞脱钙骨基质凝胶与丝素蛋白的质量比为0.01～1:10。
2.一种如权利要求1所述复合多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将经过脱细胞脱钙处理后的骨组织粉粹后，加入胃蛋白酶溶液，持续搅拌直至溶解，得到脱细胞脱钙骨基质凝胶；
2）将司班80和吐温80加入石蜡后搅拌得到均匀乳液，然后向所述乳液中依次加入海藻酸钠溶液、丝素蛋白溶液、步骤1）得到的脱细胞脱钙骨基质凝胶和氯化钙，搅拌均匀，再加入交联剂后，将得到的反应液置于2～8 ℃充分反应得到凝胶微球溶液；
3）将步骤2）得到的凝胶微球溶液离心，除去上清液，得到的沉淀物经有机溶剂多次洗涤后，真空冷冻干燥，即得到所述复合多孔凝胶微球。
3.根据权利要求2所述复合多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述脱细胞脱钙骨基质凝胶的pH值为4～10，质量浓度为0.1 mg/mL～30 mg/mL。
4.根据权利要求2所述复合多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述脱细胞脱钙骨基质凝胶采用以下步骤制得：取骨组织去掉多余的杂质后切成小块，浸泡于浓度为0.6～6%的Triton X-100中搅拌处理40～48 h后，用离子水清洗多次，再将其用甲醇进行脱脂处理，然后使用DNA酶稀释液温育，再依次用无水乙醇和水清洗、干燥，然后将干燥后的脱细胞骨组织置入12%的EDTA-2Na脱钙液中进行脱钙处理3～4周，即得到脱细胞脱钙骨基质凝胶。
5.根据权利要求2所述复合多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠溶液的质量浓度为0.5%～4%；所述丝素蛋白溶液的质量浓度为0.5～8%。
6.根据权利要求2所述复合多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白采用以下步骤制得：选取中等级蚕茧，粉碎清洗，然后加入碳酸钠溶液沸煮2～3 h后，37 ℃烘干，再加入氯化钙、无水乙醇和水组成的混合盐液，水浴加热至丝素全部溶解，过滤取上清，再经透析、离心和冷冻干燥，即得到丝素蛋白。
7.根据权利要求6所述复合多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述蚕茧与碳酸钠溶液的质量体积比为1 g:20 mL～30 mL；所述混合盐液中氯化钙、无水乙醇和水的摩尔比为1:2:6～10。
8.根据权利要求2所述复合多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述交联剂为戊二醛或京尼平；所述有机溶剂为异丙醇和/或石油醚。
9.如权利要求1所述复合多孔凝胶微球或3～8任一项所述方法制备的复合多孔凝胶微球在制备骨修复材料中的应用。
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