CN112138216B

CN112138216B - 一种高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜及其制备方法

Info

Publication number: CN112138216B
Application number: CN202010981492.2A
Authority: CN
Inventors: 孙勇; 樊渝江; 卢恭恭; 徐杨
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2020-09-17
Filing date: 2020-09-17
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2040-09-17
Also published as: CN112138216A

Abstract

本发明提供了一种高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜，由双交联高分子三维网络以及均匀分布在双交联高分子三维网络中的微米级球形羟基磷灰石组成的，具有互穿网络结构的多孔膜；双交联高分子三维网络是具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联、具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料与具有氨基及羧基的高分子材料通过迈克加成反应，以及具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料上的酚羟基与从微米级球形羟基磷灰石中游离出的钙离子螯合形成的。本发明可改善羟基磷灰石在材料中的分散性，增加羟基磷灰石与有机相整合度，在无外源细胞或生长因子的情况下实现颅骨缺损重塑再生。

Description

一种高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜及其制备方法

技术领域

本发明属于骨修复材料领域，涉及一种高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜及其制备方法。

背景技术

由创伤、肿瘤切除或感染引起的颅骨缺损在世界范围内构成了巨大的临床挑战。颅脑外伤的发病率逐年上升，据不完全统计，我国每年因颅脑外伤造成的颅骨缺损人数高达100～200/10万人，其死亡率和致残率在所有类型的创伤中排名第一，颅脑外伤也已成为人类健康的重要威胁。从患者的临床治疗效果和经济效益考虑，选择合适的颅骨修补材料是颅骨缺损修复中所面临的最严峻的挑战。

目前，自体和同种异体骨移植占每年进行的移植物的90％以上。然而，这些移植方法也存在一些缺点，例如，供体部位的并发症、血肿、炎症以及高成本的骨收集程序等。尽管钛网和聚醚醚酮(PEEK)提供了机械支撑与保护作用，但它们经常导致潜在的风险，例如，不可降解、无法促进骨与血管再生、杨氏模量过高、患者会感到强烈的异物感、伤口愈合不良概率高以及导致头皮缺血坏死而需要把植入物取出待感染控制后再进行二次开颅手术等。骨组织工程学的进步为颅骨缺损的再生提供了希望。基于外源性干细胞的疗法可提供必要的环境线索，为细胞增殖和分化创造合适的环境，已成为颅骨成形术中最有据可查的方法之一。然而，外源性干细胞的离体扩增及其体内递送受到了干细胞来源有限，商业化成本过高以及临床转化和监管批准的预期困难的限制。

为了解决这些问题，开发出理想的无细胞和生长因子的功能性生物支架具有特别的挑战性和意义。源自天然产物的水凝胶是非常有吸引力的用于组织工程的三维生物材料。但在没有外加成骨因子、生物活性分子或负载细胞情况下，由于水凝胶孔隙率较低和缺乏有效的孔结构，因而水凝胶本身的骨形成能力有限。据报道，孔隙结构对于新组织的形成是必需的，因为它可以使细胞在3D环境中迁移、浸润和增殖。因此，开发具有多孔结构、可募集内源干细胞并促进骨形成的水凝胶系统是令人感兴趣的。另外，通过掺入羟基磷灰石(HAp)颗粒可诱导成骨分化，形成骨传导性水凝胶。生物活性水凝胶/HAp复合材料在颅骨修复中已显示出良好的应用前景。但是，现有的生物活性水凝胶/HAp复合材料存在着HAp在复合材料中团聚、分散不均匀，无机相与有机相的相容性较为有限的问题。而成熟的骨骼是由连续的有机相和无机相组成，良好的相结合与相容性才赋予了自然骨骼优异的力学性能。因此，如何改善HAp在有机相中的分散性、增加无机相与有机相之间的相容性与整合度，如何形成具有高度仿生骨基质成分与结构的HAp复合材料，在无外源细胞或生长因子的情况下实现颅骨缺损重塑再生，仍然是本领域面临的难题之一。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜及其制备方法，以改善羟基磷灰石在材料中的分散性，增加羟基磷灰石与有机相整合度，并在无外源细胞或生长因子的情况下实现颅骨缺损重塑再生。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜，由双交联高分子三维网络以及均匀分布在双交联高分子三维网络中的微米级球形羟基磷灰石组成的，具有互穿网络结构的多孔膜，该颅骨修复多孔膜的平均孔径为250～350μm、孔隙率为85％～95％；双交联高分子三维网络是具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联、具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料与具有氨基及羧基的高分子材料通过迈克加成反应，以及具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料上的酚羟基与从微米级球形羟基磷灰石中游离出的钙离子螯合形成的。

上述颅骨修复多孔膜的技术方案中，微米级球形羟基磷灰石的粒径为10～50μm。

上述颅骨修复多孔膜的技术方案中，所述具有氨基及羧基的高分子材料是I型胶原，所述具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料是结构式如式(Ⅰ)所示的多巴胺改性的透明质酸，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为5％～50％，优选地，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为5％～10％；

上述颅骨修复多孔膜的技术方案中，该颅骨修复多孔膜中，微米级球形羟基磷灰石的含量优选为15wt.％～50wt.％，余量为双交联高分子三维网络。进一步优选地，双交联高分子三维网络中，具有氨基及羧基的高分子材料的含量为50wt.％～70wt.％。

上述颅骨修复多孔膜的技术方案中，该颅骨修复多孔膜的拉伸断裂应力为至少为30KPa，优选为30～40KPa，例如在一个实施例中制备的颅骨修复多孔膜的拉伸断裂应力为34.8KPa，对应的拉伸断裂应变为52％。

本发明提供的颅骨修复多孔膜在PBS缓冲液中的溶胀3、7、14天后的溶胀率稳定在96±7％，压缩模量稳定在26.5±3KPa，具有良好的结构稳定性。

上述颅骨修复多孔膜的技术方案中，I型胶原是以动物皮、肌腱、尾腱为原料制备的I型胶原。

上述颅骨修复多孔膜的技术方案中，结构式如式(Ⅰ)所示多巴胺改性的透明质酸是以透明质酸钠为基础通过多巴胺改性得到的，为5％～10％，作为改性基础的透明质酸钠的分子量为30w～400w，优选为200w～400w，进一步优选为250w～350w。

本发明提供的颅骨修复多孔膜由天然聚合物和微米级球形羟基磷灰石构成，具有良好的生物相容性，体内降解产物可吸收，原料来源广泛；并且，该颅骨修复多孔膜具有优越的柔性和延展性，植入颅骨缺损后能够适应颅内压变化，发挥应力松弛作用；同时，该颅骨修复多孔膜具有与松质骨相似的互穿多孔结构及孔隙率，该结构能促进营养物质的传输及细胞迁移，为内源干细胞募集和分化提供了特异性的微环境，在不使用外源细胞和生长因子的情况下，该颅骨修复多孔膜在体内利用宿主干细胞归巢，成功诱导了兔子颅骨缺损处血管和骨的快速再生。

本发明提供的颅骨修复多孔膜采用微米级球形羟基磷灰石浆料为原料，相比于微米级棒状羟基磷灰石，微米级球形羟基磷灰石浆料中的羟基磷灰石具有更大的比表面积及更好的液相分散性，可改善羟基磷灰石在多孔膜中的分散均匀性，同时，相比于采用微米级棒状羟基磷灰石的情况，微米级球形羟基磷灰石浆料提升了多孔膜交联度，形成高度杂化交联多孔膜结构，这有利于提升多孔膜的湿热稳定性，改善有机相与无机相的整合度。以上两方面的改进，有利于增加细胞粘附位点，并实现更均匀的细胞粘附，促进细胞在多孔膜上更均匀地铺展生长。

本发明还提供了上述高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜的制备方法，包括以下步骤：

将具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料溶解，在冰浴条件下加入微米级球形羟基磷灰石浆料并充分超声分散，然后滴加具有氨基及羧基的高分子材料的溶液，充分超声分散，在超声条件下调节所得混合液的pH值至6.8～8.5，再立即转移至模具中静置至各组分充分交联和络合，得到杂化交联水凝，冷冻干燥，即得杂化交联颅骨修复多孔膜；

所述微米级球形羟基磷灰石浆料的固含量为5wt.％～45wt.％，该固含量优选为20wt.％～45wt.％。

上述颅骨修复多孔膜的制备方法的技术方案的步骤(1)中，所述具有氨基及羧基的高分子材料是I型胶原，所述具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料是结构式如式(Ⅰ)所示的多巴胺改性的透明质酸，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为5％～50％，优选地，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为5％～10％；

上述颅骨修复多孔膜的制备方法的技术方案中，微米级球形羟基磷灰石浆料的加入量应使微米级球形羟基磷灰石的质量占具有氨基及羧基的高分子材料、具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料以及微米级球形羟基磷灰石总质量的15％～50％。优选地，具有氨基及羧基的高分子材料的溶液的加入量应使具有氨基及羧基的高分子材料的质量占具有氨基及羧基的高分子材料和具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的总质量的50％～70％。

上述颅骨修复多孔膜的制备方法的技术方案中，将具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料用水溶解形成浓度为5～50mg/mL、优选浓度为5～40mg/mL的具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的溶液，将具有氨基及羧基的高分子材料用醋酸溶液溶解形成浓度为3～50mg/mL、优选浓度为3～35mg/mL的具有氨基及羧基的高分子材料溶的液。

上述颅骨修复多孔膜的制备方法的技术方案中，优选采用浓度为0.01～1mol/L的醋酸溶液溶解具有氨基及羧基的高分子材料。

上述颅骨修复多孔膜的制备方法的技术方案中，一种可行的多巴胺改性的透明质酸的制备方法如下：

将透明质酸钠溶解在事先脱气完全的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，随后将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在水中，将N-羟基琥珀酰亚胺溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液滴加至透明质酸钠溶液中，搅拌反应4～6h，向所得混合液中加入盐酸多巴胺(DA)水溶液，搅拌反应24～48h、优选24～36h，在两次搅拌反应过程中，控制pH值在5.5～6.5范围内，优选在5.8～6.5范围内，该步骤的所有操作均在氮气保护下进行。将所得反应液通过透析纯化3天，冷冻干燥，得到多巴胺改性的透明质酸粉末。

作为可选方案，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、盐酸多巴胺与透明质酸钠上的羧基的摩尔比为(6～8):(4～6):(3～5):1，优选为(6.5～7.5):(4.5～5.5):(3.5～4.5):1，盐酸多巴胺水溶液的浓度为3～6mmol/L，优选为3～5mmol/L，透明质酸钠水溶液的浓度为15～35mg/mL，优选为15～25mg/mL。作为改性基础的透明质酸钠的分子量为30w～400w，优选为200w～400w，进一步优选为250w～350w。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案产生了以下有益的技术效果：

1.本发明提供了高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜，该颅骨修复多孔膜由双交联高分子三维网络以及均匀分布在双交联高分子三维网络中的微米级球形羟基磷灰石(HAp)组成的，具有互穿网络结构的多孔膜，该颅骨修复多孔膜的平均孔径为250～350μm、孔隙率为85％～95％。双交联高分子三维网络结构中丰富的儿茶酚官能团不仅可以与胶原分子发生迈克加成反应，而且可以螯合羟基磷灰石上的钙离子，提升多孔膜交联度，实现了有机-无机相的高度整合。

2.本发明提供的颅骨修复多孔膜具有高度仿生骨基质成分与多孔结构，具有与松质骨相似的互穿多孔结构及孔隙率，高度仿生的基质成分与结构可促进营养物质的传输及细胞迁移，为内源干细胞募集和分化提供特异性的微环境，体外细胞二维共培养实验表明，该多孔膜可保留干细胞，促进其粘附、增殖及成骨分化，在不使用外源细胞和生长因子的情况下，该颅骨修复多孔膜在体内利用宿主干细胞归巢，成功诱导了兔子颅骨缺损处血管和骨的快速再生。降低了外源性干细胞和生长因子潜在的不可控临床风险，操作简单，有望实现临床应用转化。克服了现有颅骨修复材料因没有适于细胞生长的多孔结构及孔隙率而无法募集干细胞在3D环境中迁移、浸润和增殖，并促进干细胞成骨分化的不足。

3.本发明提供的颅骨修复多孔膜具有优越的柔性，其拉伸断裂应力可达34.8KPa，拉伸应变可达52％，不仅可以通过变形来保持多孔膜的完整性，而且植入颅骨缺损后能够适应颅内压的变化，发挥应力松弛作用，因此可将颅骨切除术和颅骨成形术结合起来而直接植入，该多孔膜可在颅脑创伤患者进行去骨瓣减压后随即植入缺损部位，促进颅骨缺损完美修复，而无需让患者等待3～6个月后再进行颅骨成形术，可有效减轻患者的痛苦。同时，植入具有高柔韧性的该多孔膜可避免由于与脑组织的摩擦而引起的炎症从而进行二次手术。

4.本发明提供的颅骨修复多孔膜中的酚羟基可与骨组织表面胺基发生Michael加成反应，从而与骨组织表面产生共价结合，因此该多孔膜具有自粘性，有利于植入材料在缺损位置的粘附和即刻固定，而无需其他固定器械的辅助，可简化手术操作流程，降低手术风险。

5.本发明提供的颅骨修复多孔膜，在制备时采用了具有高分散相的微米级球形HAp浆料，有效缓解了HAp在材料中团聚，改善了其分散性，同时，相对于采用微米级棒状HAp的情况，该多孔膜的热变性湿热温度得到了一定的提升，说明采用微米级球形HAp制备多孔膜，因微米级球形HAp具有更好的流动性和液相分散性，有利于钙离子的溶出，促进了Ca²⁺参与的络合反应，进而使得杂化交联的程度增加，使有机-无机相更有效地整合。HAp在多孔膜中更均匀的分散以及与有机相更有效地整合，同时微米级球形HAp的高比表面积可提供更多的细胞粘附位点，使得细胞可在该多孔膜中更好、更均匀地铺展生长。

6.本发明提供的颅骨修复多孔膜由天然聚合物和微米级球形羟基磷灰石构成，具有良好的生物相容性，体内降解产物可吸收，原料来源广泛，并且酶促降解性能可控；同时，该多孔膜在PBS缓冲液中保持3、7和14天后，溶胀率稳定在96±7％，压缩模量稳定在26.5±3KPa，具有良好的结构稳定性。以上两点有利于其在植入体内后稳定地发挥修复作用。

7.实验表明，本发明提供的颅骨修复多孔膜在植入兔子临界颅骨缺损模型12周后，取得了良好的修复效果，有大量新生骨组织且几乎长满整个缺损区域，新生骨组织逐渐扩展到了缺损的中心区域，颅骨缺损充分愈合，同时新生骨组织具有接近自然骨的结构特征且大量的新生血管分布在缺损处，并且缺损处新生骨组织的主要成分为成熟的胶原，骨发育较为成熟。该多孔膜可诱导再生高密度血管的新生骨，及时供应血液和营养，维持骨骼完整性。同时，该多孔膜的降解速率与组织再生速度相匹配，植入兔子颅骨12周后，实现颅骨缺损部位完美重塑，同时大部分材料被降解吸收。

附图说明

图1是本发明所述颅骨修复多孔膜的制备过程示意图(以多巴胺改性的透明质酸及I型胶原为例)。

图2是实施例2制备的杂化交联水凝及HCLM的大体观，HCLM的SEM照片。

图3是实施例2制备的HCLM的激光共聚焦三维重建图像。

图4是ColI、HA、HAD和HCLM的红外谱图。

图5是HA、ColI、HA-ColI和HCLM的TG曲线。

图6是HA、HAD、ColI、HA-ColI、HA-ColI-HAp以及HCLM的DSC曲线。

图7是冷冻干燥后的微米级球形HAp浆料的SEM照片(A图)、EDS分析(B图)、激光粒径散射测试(C图)以及XRD测试(D图)结果。

图8是冷冻干燥后的微米级棒状HAp分散液的SEM照片。

图9是对比例1制备的HAD/CoI/棒状HAp多孔膜的SEM照片。

图10是实施例2制备的HCLM((A)图)和对比例1制备的HAD/CoI/棒状HAp多孔膜((B)图)的Micro-CT图。

图11是HCLM和对比例1制备的HAD/CoI/棒状HAp多孔膜的DSC曲线。

图12是HCLM柔性折叠及即刻固定示意图。

图13是HCLM的拉伸测试结果。

图14是HCLM水凝胶在PBS缓冲液中的溶胀3、7、14天后的储能模量。

图15是HCLM水凝胶的降解率随时间变化的曲线。

图16是HCLM及HAD/CoI/棒状HAp多孔膜与干细胞体外共培养3、7、14天后的CCK-8细胞增殖测试结果。

图17是HCLM及HAD/CoI/棒状HAp多孔膜与干细胞体外共培养14天的细胞活死染色结果对比图。

图18是HCLM与干细胞体外共培养14天后的细胞骨架染色的激光共聚焦图像((A)图)、SEM照片((B)图)和茜素红染色结果((C)图)。

图19是HCLM植入兔子临界颅骨缺损模型1周的SEM照片((A)图)、细胞骨架染色((B)～(D)图)和CD44免疫荧光染色((E)～(F))结果。

图20是HCLM促进兔子临界颅骨缺损再生修复手术过程的照片。

图21是HCLM促进兔子临界颅骨缺损再生修复12周后的Micro-CT三维重建图像((A)(B)图)和代表性X光射线图像((C)图)。

图22是HCLM促进兔子临界颅骨缺损再生修复12周后的新生骨参数定量分析结果。

图23将HCLM植入兔子临界颅骨缺损模型12周后的图是HE染色和MT染色结果。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明提供的高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜及其制备方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于本发明的保护范围。

下述各实施例中，微米级球形羟基磷灰石(HAp)浆料由四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心生产，通过超声破碎处理，微米级球形HAp在浆料中具有良好的分散性。

下述各实施例中，动物实验操作均在无菌环境下进行且已经通过四川大学伦理委员会批准，兔子临界颅骨缺损模型构建及手术植入方法如下：用戊巴比妥钠通过耳静脉注射方法对兔子进行麻醉。用手持牙科电钻在颅骨两侧钻取直径约9mm的孔洞，钻取过程不断用生理盐水冲洗以去除渣滓和渗出血液同时降温，切忌钻孔过程伤及硬脑膜。用医用纱布初步止血，滴加生理盐水使其处于湿润状态。用一次性无菌弯镊将仿生矿化水凝胶植入颅骨缺损处，手术线缝合，伤口擦拭碘伏，注射硫酸庆大霉素，放回笼内观察。

实施例1

本实施例中，制备多巴胺改性透明质酸(HAD)，步骤如下：

(1)向浓度为21mg/mL的透明质酸钠(Mw＝2000kDa)水溶液中滴加浓度为84mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，然后滴加浓度为200mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)溶液，搅拌反应4h，滴加浓度为3mmol/L的盐酸多巴胺水溶液，搅拌反应24h，两次搅拌反应过程中均控制pH值在6.0，该步骤的操作均在氮气保护下进行，EDCI、NHS、盐酸多巴胺与透明质酸钠上的羧基的摩尔比为7:5:4:1；

(2)将步骤(1)所得反应液用透析膜(MW＝3.5-8kDa)在pH值为4的超纯水中透析72h，真空冷冻干燥，即得多巴胺接枝率为10％的HAD粉体，将样品保存在干燥器中。

通过调整EDCI、NHS、盐酸多巴胺与透明质酸钠上的羧基的摩尔比，透明质酸钠的分子量，可以改变HAD中多巴胺的接枝率，在本发明限定的比例关系范围内，可以调整HAD中多巴胺的接枝率在5％～10％范围内。

实施例2

本实施例中，制备高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜(HCLM)，制备过程示意图见图1，步骤如下：

将实施例1制备的多巴胺的接枝率为10％的HAD溶解在水去离子中，涡旋振荡至透明澄清，得到浓度为25mg/mL的HAD溶液，将I型胶原(ColI)溶解在0.5mol/L的酸溶液中得到浓度为25mg/mL的ColI溶液。

在冰浴条件下将固含量为35wt.％的微米级球形HAp浆料加入HAD溶液中，并用细胞破碎仪探头超声分散15min，然后滴加ColI溶液，用细胞破碎仪探头充分超声分散，微米级球形HAp浆料、HAD溶液及ColI溶液的加入量应使微米级球形HAp、HAD及ColI的质量比为2:5:5；然后在超声条件下用1mol/L的NaOH溶液将所得混合溶液的pH值调节至7.5，再立即转移至硅胶模具(直径8mm，高度2mm)中静置24h使各组分充分交联和络合，得到杂化交联水凝，冷冻干燥，脱模，即得HCLM。

本实施例制备的杂化交联水凝及HCLM的大体观图2(A)的左、右两图所示。由图可知，HCLM呈多孔海绵状薄膜。

将本实施例制备的HCLM置于2.5％戊二醛中固定24h，随后冷冻干燥，将冷冻干燥后得到的样品放置入液氮中迅速冷冻10min后脆断，粘附在导电胶上，进行表面喷金处理拍SEM，结果如图2(B)所示，其中下图是上图的局部放大图，由SEM照片可知，HCLM呈现相互贯穿的多孔结构，微米级球形HAp与ColI纤维紧密缠绕，呈现仿生骨基质结构。HCLM具有与松质骨相似的孔结构分布、孔隙率及微孔尺寸，根据图2统计发现，HCLM的孔隙率为85±8％，平均孔径为300±28μm，该结构有利于营养物质的输送和细胞迁移。

对本实施例制备的HCLM进行荧光染色并进行激光共聚焦分析，激光共聚焦三维重建得到的图像如图3所示，该图反应了HCLM中微米级球形HAp的分布情况，由图6可知，微米级球形HAp在HCLM中的分布是比较均匀的。

采用红外光谱仪(Nicolet 6700，Germany)在500cm^-1～2000cm^-1波长范围内，对ColI、透明质酸钠(HA)、HAD和HCLM的化学结构进行表征。如图4所示，1627cm^-1(酰胺I谱带)处峰归属于ColI的特征酰胺峰，在1550cm^-1(酰胺II带)和1235cm^-1(酰胺III带)的峰表明多巴胺的氨基与HA的羧基之间发生酰胺化反应，形成HAD。1747cm^-1处的峰出现减弱，这是由于一方面是由于HAD侧链的酚羟基被氧化成醌或半醌结构，随后发生歧化反应并自交联造成的，另一方面，是由于酚羟基与ColI的氨基发生迈克加成反应，并与钙离子鳌合，形成多重交联网络结构造成的。

对HA、ColI、透明质酸钠-I型胶原的物理混合物(HA-ColI，HA与ColI的质量比为1:1)、HCLM进行热重分析(温度范围：25～800℃，升温速率：10℃/min，氮气保护)，以对HCLM的热分解性能进行表征，结果如图5所示。从图5可知，HAD与ColI分子之间产生了化学交联，而不仅是简单的物理作用，因为TG曲线中并未产生额外的失重阶段。

对HA、HAD、ColI、透明质酸钠-I型胶原的物理混合物(HA-ColI，HA与ColI的质量比为1:1)、透明质酸钠-I型胶原-微米级球形HAp的物理混合物(HA-ColI-HAp，三者的质量比同实施例3)以及HCLM进行差热(DSC)分析，结果如图6所示，DSC曲线中的吸热峰温度代表胶原分子内氢键被破坏，导致三股螺旋结构解散为无规卷曲结构的温度，即热变性温度。相比于HA-ColI及HA-ColI-HAp，HCLM的变性温度大幅提升，从纯ColI膜的84.6℃提高到113.5℃。DSC测试结果表明HAD与ColI之间发生了迈克加成反应。DSC测试结果进一步表明，相比于物理共混，杂化交联使HCLM湿热稳定性得到明显提高，有助于改善材料的降解速率。

对比例1

本对比例中，以微米级棒状HAp制备HAD/CoI/棒状HAp多孔膜，步骤如下：

将实施例1制备的多巴胺的接枝率为10％的HAD溶解在水去离子中，涡旋振荡至透明澄清，得到浓度为25mg/mL的HAD溶液，将I型胶原(ColI)溶解在0.5mol/L的酸溶液中得到浓度为25mg/mL的ColI溶液，将微米级棒状HAp加入去离子水中，在涡旋振荡器上充分振荡使棒状HAp充分分散在水中，得到固含量为35wt.％的微米级棒状HAp分散液。

在冰浴条件下将固含量为35wt.％的微米级棒状HAp分散液加入HAD溶液中，并用细胞破碎仪探头超声分散15min，然后滴加ColI溶液，用细胞破碎仪探头充分超声分散，然后在超声条件下用1mol/L的NaOH溶液将所得混合溶液的pH值调节至7.5，再立即转移至硅胶模具(直径8mm，高度2mm)中静置24h使各组分充分交联和络合，冷冻干燥，脱模，即得HAD/CoI/棒状HAp多孔膜。

以下通过相关测试来比较实施例2中微米级球形HAp浆料与微米级棒状HAp分散液中HAp的分散性，以及HAp在HCLM和HAD/CoI/棒状HAp多孔膜中的分散性，并对HCLM和HAD/CoI/棒状HAp多孔膜进行DSC分析。

1.微米级球形HAp浆料与微米级棒状HAp分散液中HAp的分散性比较

分别量取1mL微米级球形HAp浆料和1mL微米级棒状HAp分散液，冷冻干燥，粘贴在导电胶上进行真空喷金处理及SEM拍照，同时对微米级球形HAp浆料进行激光粒径散射测试、EDS分析以及XRD测试。

图7是冷冻干燥后的微米级球形HAp浆料的SEM照片(A图)、EDS分析(B图)、激光粒径散射测试(C图)以及XRD测试(D图)结果，图8是冷冻干燥后的微米级棒状HAp分散液的SEM照片。由SEM照片可知，微米级棒状HAp出现了明显的团聚现象，而微米级球形HAp则具有更好的分散性和更大的比表面积。激光粒径散射测试表明微米级球形HAp的粒径分布范围为10～50μm，XRD和EDS测试结果表明微米级球形HAp的钙磷比为1.67，完全吻合羟基磷灰石PDF卡片。

2.HAp在HCLM和HAD/CoI/棒状HAp多孔膜中的分散性

对比例1制备的HAD/CoI/棒状HAp多孔膜的SEM照片分别如图9所示，相对于图2(B)，在HAD/CoI/棒状HAp多孔膜中，棒状HAp出现了较为明显的团聚，而在HCLM中，微米级球形HAp的分散性相对更好。实施例1制备的HCLM和对比例1制备的HAD/CoI/棒状HAp多孔膜的Micro-CT图分别如图10的(A)(B)两图所示，由图10可以看到，在HAD/CoI/棒状HAp多孔膜中，棒状HAp在材料的某些部位出现了较为明显的团聚，而在材料的某些部位又几乎没有棒状HAp的分布，在HCLM中，微米级球形HAp的分布明显更均匀。说明本发明采用微米级球形HAp浆料制备HCLM能有效避免HAp在材料中团聚，改善其分散性。

3.HCLM和HAD/CoI/棒状HAp多孔膜的DSC分析

实施例1制备的HCLM和对比例1制备的HAD/CoI/棒状HAp多孔膜的DSC曲线如图11所述，由图11可知，相比于HAD/CoI/棒状HAp多孔膜，HCLM的热变性温度提高了8℃，这说明采用微米级球形HAp浆料制备HCLM，相比于采用微米级棒状HAp分散液，可提升多孔膜的交联度，交联度的增加使得HCLM的热变性温度升高，这是因为微米级球形HAp具有更好的流动性和液相分散性，有利于钙离子的溶出，促进了Ca²⁺参与的络合反应，进而使得杂化交联的程度增加。杂化交联度的增加，可提升HCLM的湿热稳定性，湿热稳定性增加，表明材料结构稳定性得到提升，有利于改善材料降解性能，延长材料在缺损部位发挥修复功效的时间。同时，酚羟基与HAp表面游离钙离子的鳌合，提升了杂化交联的程度，这种相互作用能赋予材料良好的有机-无机相相容性，增强了有机-无机相之间的结合。

实施例3

本实施例中，制备HCLM并测试进行拉伸应力和即刻固定性能测试。

在冰浴条件下将固含量为35wt.％的微米级球形HAp浆料加入HAD溶液中，并用细胞破碎仪探头超声分散15min，然后滴加I型胶原溶液，用细胞破碎仪探头充分超声分散，微米级球形HAp浆料、HAD溶液及ColI溶液的加入量应使微米级球形HAp、HAD及ColI的质量比为2:5:5；然后在超声条件下用1mol/L的NaOH溶液将所得混合溶液的pH值调节至7.5，再立即转移至硅胶模具(直径35mm，高度3mm)中静置24h使各组分充分交联和络合，得到杂化交联水凝，冷冻干燥，脱模，即得HCLM。

对HCLM进行拉伸应力和即刻固定性能测试，结果如图12～13所示。由图12可知，HCLM具有出色的柔韧性，经过随意折叠弯曲变形后依然可以恢复到原来的形状，HCLM可一步植入颅骨缺损，经血液渗透后即刻固定在缺损位置。由图13可知，HCLM的拉伸断裂应力为34.8KPa，对应的最大拉伸应变为52％。以上实验结果表明HCLM植入颅骨缺损后能通过自身变形适应颅内压变化，可避免临床上通过额外的器械进行辅助固定，进而降低因摩擦或炎症引起的二次开颅手术。

实施例4

本实施例中，测试实施例2制备的杂化交联水凝的溶胀行为及降解行为。

将实施例3制备的杂化交联水凝(HCLM水凝胶)表面的水分干燥去除，然后称重，记作Wd。然后将HCLM水凝胶浸入没在磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液(0.01mol/L，pH＝7.4)中，并在转速为90rpm，温度为37℃的恒温振荡器中摇动。每间隔一定时间再次称重HCLM水凝胶，记作Ws。每个样品均设置三组平行试验。按照下式计算HCLM水凝胶的溶胀率，HCLM水凝胶在PBS缓冲液中的溶胀3、7、14天后的溶胀率保持在96±7％。

溶胀率＝(Ws-Wd)/Wd×100％

在对应时间点将溶胀后的HCLM水凝胶样品取出，用PBS缓冲液清洗，随后利用动态力学分析仪(DMA，TA-Q800，USA)测试HCLM水凝胶的压缩力学性能。测试温度为室温，预加应力为5mN，振幅为20μm，频率为5Hz，测试样品的储能模量。每个样品测试三次，HCLM水凝胶在PBS缓冲液中的溶胀3、7、14天后的储能模量如图10所示。

使用透明质酸酶和I型胶原酶对HCLM的酶促降解行为进行测试。采用含有透明质酸酶(100U/mL)和I型胶原酶(100U/mL)的PBS缓冲液配制作为降解液。称量实施例2制备的HCLM水凝胶的初始重量，记作W_O，然后将HCLM水凝胶浸没在5mL降解液中，并在转速为90rpm，温度为37℃的恒温振荡器中摇动。之后，每间隔一定时间再次称重HCLM水凝胶，记作Wk，直到完全降解为止。每个样品均设置三组平行试验。按照下式计算HCLM水凝胶的降解率，结果如图15所示。

降解率＝(W_O-Wk)/W_O×100％

根据溶胀及降解行为测试结果可知，HCLM在3、7和14天的溶胀率相对稳定，对应的压缩模量也相对稳定，为27±2KPa，表明HCLM在湿环境中具有出色的结构和力学稳定性，这对于其在植入体内后发挥其功能性修复作用至关重要。同时，HCLM具有可控的降解速率，完全降解时间＞32h，可持续提供支架微环境促进组织再生。

实施例5

本实施例中，按以下步骤构建细胞-HCLM的二维共培养模型：

将实施例2制备的HCLM置于超低粘附24孔板中，吸取20μL 2.5×10⁵/mL兔子骨髓间充质干细胞(MSCs)悬浮液(调节pH至7.4)滴加到HCLM表面，在细胞培养箱中孵育30min后，向HCLM的另外一面滴加20μL 2.5×10⁵/mL MSCs细胞悬浮液(调节pH至7.4)，随后转移至细胞培养箱中孵育3h后，将1.5mL的培养基滴加到每个孔中，然后置于细胞培养箱中进行培养，每2天更换一次新的培养基，培养一定时间后，将细胞-HCLM复合物取出，用PBS清洗去表面未粘附的细胞，再进行相关测试。此处使用的培养基为补充有10％血清和1％双抗的α-MEM或高糖DMEM培养基。同时，用对比例1制备的HAD/CoI/棒状HAp多孔膜进行相同的操作作为对比实验进行比较。

图16是HCLM及HAD/CoI/棒状HAp多孔膜与干细胞体外共培养3、7、14天后的CCK-8细胞增殖测试结果，图16表明HCLM和HAD/CoI/棒状HAp多孔膜不具细胞毒性并促进了细胞增殖，且HCLM能更好地促进细胞增殖。

将HCLM及HAD/CoI/棒状HAp多孔膜与干细胞体外共培养14天后取出进行细胞活死染色。图17是HCLM及HAD/CoI/棒状HAp多孔膜与干细胞体外共培养14天的细胞活死染色结果对比图。细胞活死染色结果表明HCLM及HAD/CoI/棒状HAp多孔膜与细胞体外共培养14天时，未观察到死细胞的存在，表现出良好的生物相容性。相对于HAD/CoI/棒状HAp多孔膜，细胞在HCLM中的生长更均匀、更密集，说明HCLM因的微米级球形HAp具有更大的比表面积，同时微米级球形HAp在HCLM中分布更均匀，有利于增加细胞粘附位点，促进细胞的粘附生长。

将HCLM与干细胞体外共培养14天后取出进行细胞骨架染色的激光共聚焦测试、茜素红染色及SEM测试。图18的(A)～(C)图是HCLM与干细胞体外共培养14天后的细胞骨架染色的激光共聚焦图像、SEM照片和茜素红染色结果。细胞骨架染色及SEM照片表明HCLM与细胞在体外共培养14天后，细胞呈现出明显的梭形铺展形态，表现出明显的黏附材料生长的形貌特征。茜素红染色表明粘附到HCLM上的细胞在体外共培养14天时向成骨分化，形成钙结节细胞外基质。

本实施例的体外二维培养模型证实，HCLM能促进干细胞增殖、粘附并向成骨分化。相对于HAD/CoI/棒状HAp多孔膜，HCLM更有利于细胞的增殖和更均匀地粘附生长。

实施例6

本实施例中，将实施例2制备的HCLM植入兔子临界颅骨缺损模型(Diameter＝9mm)。植入1周后，取出HCLM，用PBS缓冲液清洗掉HCLM表面未粘附的细胞，分别用2.5％的戊二醛和4％的多聚甲醛固定48h，随后分别将进行临界点干燥、SEM测试、细胞骨架染色和CD44免疫荧光染色，结果如图19所示。图19中，(A)图是SEM照片，(B)～(D)图是细胞骨架染色的激光共聚焦图像，(E)～(F)图是CD44免疫荧光染色的激光共聚焦图像。SEM照片中可见大量细胞呈铺展状态，并粘附在HCLM表面。细胞骨架染色可见细胞核周围大面积的肌动蛋白染色，表明细胞粘附生长行为。CD44免疫荧光染色结果显示粘附在HCLM上的大多数细胞具有CD44阳性表达，表明HCLM能够募集内源干细胞，且内源干细胞在HCLM中有明显的粘附生长。

实施例7

将实施例2制备的HCLM植入兔子临界颅骨缺损模型(Diameter＝9mm)。分别在植入4周和12周后取出HCLM，进行相应的表征。

图20是HCLM促进兔子临界颅骨缺损再生修复手术过程的照片，由图20可知，HCLM在植入后与周围组织紧密贴合，且术中出血量较少。对HCLM促进兔子临界颅骨缺损再生修复4周和12周后进行X光射线测试和Micro-CT测试，图21是HCLM促进兔子临界颅骨缺损再生修复12周后的Micro-CT三维重建图像((A)(B)图)和代表性X光射线图像((C)图)，图22是HCLM促进兔子临界颅骨缺损再生修复12周后的新生骨参数定量分析结果，其中(A)图是骨密度，(B)图是新生骨占总体积百分比(AV/TV)。X光射线图像证实在植入后第4周，可以看到缺损处存在大量的材料且材料与缺损组织边缘结合紧密，在植入后第12周，缺损则被白色组织部分填充。进一步通过Micro-CT三维重建图像可知，在植入后第12周，新生骨组织具有更高的厚度和骨量，且形成了具有类似自然骨结构的新生骨组织。Micro-CT定量分析结果表明新生骨体积、骨密度值均随植入时间增加而提升，证明HCLM能促进颅骨缺损再生重塑。

实施例8

将实施例7中植入兔子临界颅骨缺损模型12周后的HCLM取出，依次进行脱钙、石蜡包埋和切片。随后进行H&E和Masson’s trichrome组织化学染色，结果如图23所示，图23的(A)图是HE染色结果，(B)图是MT染色结果。

由图23可知，在植入12周后，有大量新生骨组织且几乎长满整个缺损区域，新生骨组织逐渐扩展到了缺损的中心区域，颅骨缺损充分愈合。局部放大可以看到新生骨组织具有接近自然骨的结构特征且大量的新生血管分布在缺损处。Masson染色通过不同分子量的染料在不同致密度的胶原纤维的渗透性能差异来判断骨的成熟度，致密的胶原、肌肉纤维和红细胞会被染为红色，而疏松的胶原和纤维素则会被染为蓝色。通过Masson染色进一步证实缺损处新生骨组织的主要成分为成熟的胶原，说明骨发育较为成熟。以上实验结果综合表明HCLM植入体内12周后促进了兔子颅骨缺损的完美再生重塑。

Claims

1.一种高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜，其特征在于，该颅骨修复多孔膜由双交联高分子三维网络以及均匀分布在双交联高分子三维网络中的微米级球形羟基磷灰石组成的，具有互穿网络结构的多孔膜，该颅骨修复多孔膜的平均孔径为250～350μm、孔隙率为85％～95％；双交联高分子三维网络是具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联、具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料与具有氨基及羧基的高分子材料通过迈克加成反应，以及具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料上的酚羟基与从微米级球形羟基磷灰石中游离出的钙离子螯合形成的；

该颅骨修复多孔膜中，微米级球形羟基磷灰石的含量为15wt.％～50wt.％，余量为双交联高分子三维网络；双交联高分子三维网络中，具有氨基及羧基的高分子材料的含量为50wt.％～70wt.％，该颅骨修复多孔膜的拉伸断裂应力为30～40KPa；

该颅骨修复多孔膜的制备方法如下：

所述微米级球形羟基磷灰石浆料的固含量为5wt.％～45wt.％。

2.根据权利要求1所述高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜，其特征在于，微米级球形羟基磷灰石的粒径为10～50μm。

3.根据权利要求1所述高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜，其特征在于，该颅骨修复多孔膜中，所述具有氨基及羧基的高分子材料是I型胶原，所述具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料是结构式如式(Ⅰ)所示的多巴胺改性的透明质酸，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为5％～50％，

4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜，其特征在于，多巴胺改性的透明质酸是以透明质酸钠为基础通过多巴胺改性得到的，作为改性基础的透明质酸钠的分子量为30w～400w。

5.根据权利要求1所述高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜，其特征在于，在制备该颅骨修复多孔膜时，微米级球形羟基磷灰石浆料的加入量应使微米级球形羟基磷灰石的质量占具有氨基及羧基的高分子材料、具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料以及微米级球形羟基磷灰石总质量的15％～50％。

6.根据权利要求5所述高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜，其特征在于，在制备该颅骨修复多孔膜时，具有氨基及羧基的高分子材料的溶液的加入量应使具有氨基及羧基的高分子材料的质量占具有氨基及羧基的高分子材料和具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的总质量的50％～70％。

7.根据权利要求1所述高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜，其特征在于，在制备该颅骨修复多孔膜时，将具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料用水溶解形成浓度为5～50mg/mL的具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的溶液，将具有氨基及羧基的高分子材料用醋酸溶液溶解形成浓度为3～50mg/mL的具有氨基及羧基的高分子材料的溶液。