CN108084461A - 可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可控自交联巯基化透明质酸‑胶原复合水凝胶及其制备方法，该复合水凝胶由交联巯基化透明质酸水凝胶与I型胶原或Ⅱ型胶原组成，I型胶原或Ⅱ型胶原胶原分布在交联巯基化透明质酸的三维交联网络结构中。该复合水凝胶兼备刚性和弹性，力学性能良好，能促进软骨细胞的铺展生长和有利于细胞维持表型，可缓解现有用于软骨修复的凝胶材料存在的容易收缩以及细胞粘附性差的不足，在软骨损伤修复领域有着重要的应用价值。

Description

可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶及其制备方法 与应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，涉及一种可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶及其制备方法，以及该可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶在骨修复领域中的应用。
背景技术
关节软骨缺损是一类常见的骨科疾病，由于关节软骨无血管，无淋巴，无神经，因而较难自我修复。现有的治疗方法主要依赖于自体软骨细胞移植，但是受限于供体细胞的不足以及在培养过程中易分化。组织工程作为一种前沿的技术吸引了人们的眼球。组织工程最基本的原则就是体外分离扩增的软骨细胞协同生长因子种植在支架材料上，将其移植到人体内后可以形成新的软骨组织以达到软骨修复与重建的目的。因此，一个理想的支架对于缺损软骨的重建是至关重要的。水凝胶有利于维持软骨细胞圆形或者椭圆形的形态，这个形态同软骨细胞在天然的软骨基质中的形态一致，水凝胶具有好的渗透性，有利于营养物质的传输和代谢活动的进行，细胞可以被水凝胶三维包裹在水凝胶中，因此，水凝胶已被广泛应用于软骨组织工程并且展现出了巨大的潜力。
透明质酸和胶原是软骨细胞基质最主要的成分。胶原是细胞基质的重要结构蛋白。研究发现，胶原不但具有良好的生物相容性和可降解性，而且包含许多细胞粘附位点和刺激种子细胞合成新胶原的分子信号。然而，单一的胶原支架存在力学强度差、降解速度快和免疫原性等问题，胶原同细胞在体外培养时还会出现严重的收缩，无法满足实际应用的要求。透明质酸也是细胞基质的重要成分，它的结构和生物学性能可调控细胞信号、伤口愈合和基质的形成。透明质酸水凝胶有良好的生物相容性、生物降解性和高保水性和促进软骨形成的特性，但是透明质酸的生物材料会抑制细胞附着，也无法达到应用要求。CN104892962A公开了一种巯基/二硫键可控自交联透明质酸水凝胶，但该水凝胶仍然会抑制细胞附着，其细胞粘附性较差，软骨细胞在其上铺展困难。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶及其制备方法与应用，以有效缓解现有用于软骨修复的凝胶材料存在的容易收缩以及细胞粘附性差的不足。
本发明提供的可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶，由交联巯基化透明质酸水凝胶与胶原组成，胶原分布在交联巯基化透明质酸的三维交联网络结构中，所述胶原为I型胶原或Ⅱ型胶原，所述交联巯基化透明质酸是由结构式如式(Ⅰ)所示的巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成，巯基化透明质酸中半胱氨的接枝率为30％～70％，
上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶中，胶原的含量为4.5～10.5mg/mL，交联巯基化透明质酸的含量为4.5～10.5mg/mL。
上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶中，巯基化透明质酸是以透明质酸为基础通过半胱胺改性得到的，作为改性基础的透明质酸的分子量为0.1MDa～3.0MDa。巯基化透明质酸的制备方法可参见CN 104892962A。
本发明还提供了一种上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的制备方法，步骤如下：
(1)将结构式如式(Ⅰ)所示且半胱氨的接枝率为30％～70％的巯基化透明质酸溶解于α-MEM培养基中形成浓度为1wt.％～10wt.％的巯基化透明质酸溶液，α-MEM培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液以及抗坏血酸得到，
(2)将I型胶原或Ⅱ型胶原用醋酸溶液溶解，调节pH值至7.4～7.8，然后加入PBS缓冲液调节I型胶原或Ⅱ型胶原的浓度为5～20mg/mL得到胶原溶液；
(3)将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液按照的体积比混匀，调节pH值至7.4～7.8，在34～40℃静置使巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成复合水凝胶。
上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的制备方法，所述醋酸溶液的浓度为0.25～1.0mol/L，所述PBS缓冲液的pH值为7.4～7.8、浓度为0.01～0.02mol/L。
上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的制备方法的步骤(2)中，优选在冰浴条件下进行，上述方法的步骤(3)优选将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液冰浴条件下混匀。
上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的制备方法的步骤(3)中，将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液按照的体积比混匀，调节pH值至7.4～7.8，在34～40℃静置不超过1min即可使巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成复合水凝胶。
上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的制备方法的步骤(1)中，α-MEM培养基中青霉素-链霉素混合液的体积浓度优选为0.8％～1.2％，抗坏血酸的浓度优选为45～55μg/mL。
本发明还提供了上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶在骨修复领域中的应用，优选将所述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶用于制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架。
采用可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶用于制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架的步骤如下：
(1)将结构式如式(Ⅰ)所示且半胱氨的接枝率为30％～70％的巯基化透明质酸，溶解于培养基中形成巯基化透明质酸浓度为1wt.％～10wt.％的巯基化透明质酸溶液，
(2)将I型胶原或Ⅱ型胶原用醋酸溶液溶解，调节pH值至7.4～7.8，然后加入PBS缓冲液调节I型胶原或Ⅱ型胶原的浓度为5～20mg/mL得到胶原溶液；
(3)将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液灭菌并按照的体积比混匀，调节pH值至7.4～7.8后立即注射至生物体体内的待修复部位，巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成复合水凝胶，即得软骨组织工程三维支架；
或者，将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液灭菌并按照的体积比混匀，然后加入软骨细胞悬浮液混匀，调节pH值至7.4～7.8后立即注射至生物体体内的待修复部位，巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成包裹软骨细胞的复合水凝胶，即得软骨组织工程三维细胞支架；
或者，将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液灭菌并按照的体积比混匀，然后加入软骨细胞悬浮液并混匀，调节pH值至7.4～7.8，加入模具中，在34～40℃静置，巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成包裹软骨细胞的复合水凝胶，将包裹软骨细胞的复合水凝胶从模具中取出浸没于培养基中，置于培养箱中在34～40℃、3％～5％的CO2的条件下培养至少1天即得软骨组织工程三维细胞支架，培养期间定期更换培养基；
所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液、抗坏血酸以及胎牛血清得到。
采用可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶用于制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架时，步骤(3)中按照5×105～5×106cells/mL的比例向巯基化透明质酸溶液与胶原溶液的混合液中加入软骨细胞悬液，所述软骨细胞可从出生1～5天的幼兔的关节中提取。
采用可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶用于制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架时，所述醋酸溶液的浓度为0.25～1.0mol/L，所述PBS缓冲液的pH值为7.4～7.8、浓度为0.01～0.02mol/L。
采用可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶用于制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架时，步骤(2)优选在冰浴条件下进行，步骤(3)优选将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液冰浴条件下混匀。
采用可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶用于制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架时，步骤(1)中所述培养基中青霉素-链霉素混合液的体积浓度优选为0.8％～1.2％，抗坏血酸的浓度优选为45～55μg/mL，胎牛血清的体积浓度优选为8％～12％。
与现有技术相比，本发明产生了以下有益的技术效果：
1.本发明提供了一种可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶，该复合水凝胶由交联巯基化透明质酸水凝胶与胶原组成，胶原分布在交联巯基化透明质酸的三维交联网络结构中，透明质酸和胶原是软骨细胞基质最主要的成分，该材料具有良好的生物相容性以及生物可降解性能，由于巯基化透明质酸中半胱氨的接枝率适当，并且该复合水凝胶中交联巯基化透明质酸水凝胶与胶原的比例恰当，因而本发明提供的复合水凝胶克服了胶原收缩问题和透明质酸缺乏细胞粘附位点、无法实现细胞铺展生长以及容易出现溶胀的问题，不但力学性能良好，兼备刚性和弹性，而且能促进软骨细胞的铺展生长和有利于细胞维持表型，在软骨损伤修复领域有着重要的潜在应用价值。
2.实验表明，相比于单独的胶原形成的凝胶，本发明提供的复合水凝胶的损耗模量更低，相比于单独的和巯基化透明质酸形成的凝胶相比，本发明提供的复合水凝胶的储能模量更高，具有良好的力学性能，这种力学性能的提升对于将本发明提供的HA-SH-胶原复合水凝胶作为骨修复支架应用是十分有利的。同时，相比于单独的胶原形成的凝胶，本发明提供的复合水凝胶的降解速率明显更慢，这能缓解胶原降解过快的缺点，有利于胶原在体内长期有效地利用。
3.本发明还提供了一种制备可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的方法，通过调整将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液的浓度及体积比等因素，可调整凝胶的形成时间、降解时间以及力学特性，制备出满足不同应用需求的复合水凝胶，具有可控性好和灵活性强的特点。
4.本发明还提供了一种所述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶在骨修复领域的应用，特征是在软骨修复领域的应用，根据具体的应用需求，可将该复合水凝胶直接原位注射至生物体的待修复部位形成软骨组织工程三维支架，或者是将融合了软骨细胞等活性物质的复合水凝胶原位注射至生物体的待修复部位形成软骨组织工程三维细胞支架，或者是将融合了软骨细胞等活性物质的复合水凝胶利用模具在体外形成并培养至软骨细胞达到所需活性之后注入生物体的待修复部位，应用方式多样化，使用方式简单。实验表明，该复合水凝胶能够很好地促进软骨细胞增殖，分泌特异性基质，软骨细胞在以本发明提供的复合凝胶为基础形成的软骨组织工程三维细胞支架中成团生长并且细胞粘附性良好，软骨细胞团的数量和大小随着培养时间延长而增加，有效改善了透明质酸组三维细胞支架软骨细胞铺展困难的问题。
附图说明
图1为实施例1中5个实验组的水凝胶成胶时间图。
图2为实施例1中5个实验组的水凝胶的照片和不同放大倍数的扫描电镜照片，其中，其中，A1～E1图为水凝胶实物的照片，A2～E2图和A3～E3图为水凝胶在不同放大倍数的扫描电镜照片。
图3为实施例1中5个实验组的水凝胶的力学性能图，其中，A图为储能模量曲线，B图为损耗模量曲线。
图4为实施例1中5个实验组的水凝胶的降解曲线。
图5为实施例5中5个实验组中培养不同时间得到的三维细胞支架的照片。
图6为实施例5中5个实验组中培养不同时间得到的三维细胞支架的激光共聚焦扫描显微镜照片，图中，A1～A4、B1～B4、C1～C4、D1～D4、E1～E4图分别为Col、Col7HA-SH3、Col5HA-SH5、Col3HA-SH7和HA-SH组三维细胞支架。
图7为实施例6中5个实验组中培养不同时间得到的三维细胞支架的GAGs定量检测分析图。
图8为实施例6中5个实验组中培养不同时间得到的三维细胞支架的组织学染色照片，其中，A1～E1、A3-E3图为培养14d和28d的番红O染色照片，A2-E2、A4-E4图为培养14d和28d的兔-Ⅱ型胶原免疫组化染色照片。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶及其制备方法与应用作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
实施例1
本实施例中制备巯基化透明质酸，步骤如下：
(1)将分子量为0.3MDa的透明质酸钠溶解于去离子水中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，充分溶解，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，充分溶解，用1mol/L的NaOH溶液和1mol/L的HCl溶液调节混合液的pH值至4.75，在室温反应2h，然后加入半胱氨盐酸盐(CSH·HCl)溶液，在室温反应24h，之后用1mol/L的NaOH溶液调节反应液的pH值至8.5，加入二硫苏糖醇(DTT)溶液，在室温反应12h。
该步骤中，透明质酸钠、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、半胱氨盐酸盐(CSH·HCl)与二硫苏糖醇(DTT)的摩尔比为1:2:4:4:12。
(2)用1mol/L的HCl溶液调节步骤(1)所得反应液的pH值至3.0～3.5，在pH值为3.0～3.5的去离子水中透析72h，冷冻干燥，得到巯基化透明质酸(HA-SH)，采用改进的Ellman法测定HA-SH中的巯基取代度，该HA-SH中半胱氨的接枝率为65.5％。
采用改进的Ellman法测定HA-SH中的巯基取代度发现，通过改变EDCI与CSA·HCl的摩尔比，透明质酸钠的分子量，可以改变HA-SH中巯基的取代度，即改变HA-SH中半胱氨的接枝率，随着EDCI与CSA·HCl的摩尔比增加，巯基取代度逐渐升高，而透明质酸钠的分子量越高，巯基取代度越低，可能的原因是高粘度高分子量的透明质酸钠会导致流动性下降，这可能降低了透明质酸钠与CSA·HCl相互接触的几率，导致较低的反应活性，通过调整EDCI与CSA·HCl的摩尔比以及透明质酸钠的分子量，可以调整HA-SH中半胱氨的接枝率为30％～70％范围内。
实施例2
本实施例中制备可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶，步骤如下：
(1)将实施例1制备的HA-SH灭菌、溶解于α-MEM培养基中形成浓度为10wt.％的HA-SH溶液；所述α-MEM培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液(双抗)以及抗坏血酸得到，α-MEM培养基中双抗的体积浓度为1％，抗坏血酸的浓度为50μg/mL。
(2)在冰浴下将I型胶原用0.5mol/L醋酸溶液溶解，用5mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，然后加入浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液调节I型胶原的浓度为10mg/mL，得到胶原溶液；所述I型胶原是从牛蹄筋中提取得到。
(3)在冰浴条件下用注射器按比例吸取胶原溶液和HA-SH溶液形成以下5个实验组：
①胶原溶液与HA-SH溶液的体积比为7:3，将该实验组编号为Col7HA-SH3，②胶原溶液与HA-SH溶液的体积比为5:5，将该实验组编号为Col5HA-SH5，③胶原溶液与HA-SH溶液的体积比为3:7，将该实验组编号为Col3HA-SH7，④作为对照，只吸取胶原溶液，将该实验组编号为Col，⑤作为对照，只吸取HA-SH溶液，将该实验组编号为HA-SH。这5组溶液的总体积相等，混合均匀后分别用5mol/L的NaOH溶液调节的pH至7.4，在37℃静置一段时间即可形成水凝胶。通过流变仪来测定凝胶成胶时间，拍摄5组凝胶的宏观图片进行对比，此后将水凝胶取出冷冻干燥并采用扫描电镜观察微观结构。
图1为实施例1中5个实验组的水凝胶成胶时间图，由图1可知，单独的胶原成胶需要243s，单独的HA-SH成胶则需要348.09s，Col7HA-SH3组、Col5HA-SH5组以及Col3HA-SH7组中的复合水凝胶成胶只需要10s～27s，按照本发明的方法制备复合水凝胶，将物理交联的胶原和化学交联的HA-SH混合，能有效缩短凝胶成胶时间。
图2为实施例1中5个实验组的水凝胶的照片和不同放大倍数的扫描电镜照片，其中，其中，A1～E1图为水凝胶实物的照片，A2～E2图和A3～E3图为水凝胶在不同放大倍数的扫描电镜照片。扫描电镜照片显示胶原具有纤维状结构，直径约为几百纳米，呈有序排列；HA-SH水凝胶具有相互连接的多孔结构，孔径约为10～35μm；Col7HA-SH3组、Col5HA-SH5组以及Col3HA-SH7组将HA-SH溶液与胶原溶液混合并形成HA-SH复合水凝胶后，部分HA-SH会包裹在胶原纤维的外部，使纤维聚集在一起变得更粗，同时胶原也会填充在HA-SH的多孔结构内部，两种材料的紧密结合使得凝胶时间大大缩短，复合水凝胶结合了两者的优点，兼备刚性和弹性，更有利于细胞生长和维持表型。
将按照前述步骤(1)～(3)的操作新制备的5组水凝胶样品在室温置于动态力学分析仪上，在多频模式(1～20Hz)下测量水凝胶的储能模量(G′)和损耗模量(G″)的变化曲线，5个实验组的水凝胶的力学性能图，其中，A图为储能模量曲线，B图为损耗模量曲线。由图3可知，Col组的储能模量(G′)最高，为11～13KPa，HA-SH组的储能模量(G′)最低，为1.4～2.0KPa，同时Col组的损耗模量(G″)也是最高的，达到了0.3～0.5KPa。Col7HA-SH3组、Col5HA-SH5组以及Col3HA-SH7组将HA-SH溶液与胶原溶液混合并形成HA-SH复合水凝胶后，该复合水凝胶结合了两者的优点，增加了HA-SH的储能模量，同时降低了胶原的损耗模量，这种力学性能的提升对于将本发明提供的HA-SH-胶原复合水凝胶作为骨修复支架应用是十分有利的。
将按照前述步骤(1)～(3)的操作新制备的5组水凝胶样品冷冻干燥并称重，记作Wo，然后浸入含有1mmol/L DTT的PBS缓冲液中，置于恒温摇床在37℃、90rpm的转速下振荡，每隔一段时间将水凝胶取出冷冻干燥并称重，记作Wr。水凝胶的降解行为表示为质量损失百分数，按以下公式计算：
质量损失百分数＝(Wo-Wr)/Wo×100％
图4为实施例1中5个实验组的水凝胶的降解曲线，由图4可知，所有组别的水凝胶均能在DTT的作用下顺利降解，其中纯胶原组的降解速率最快，质量损失最高，在第10h时降解达到91％，而其他组别的水凝胶的质量损失百分数也都在45％以上。随着巯基化透明质酸含量的增加，HA-SH-胶原复合水凝胶的降解速率和质量损失都明显减少，这能有效缓解胶原降解过快的缺点，有利于胶原在体内长期有效地利用。
此外，细胞衍生的谷胱甘肽是一种还原剂，同DTT一样，也具有还原敏感和降解效果，因此当本发明提供的复合水凝胶与细胞共培养时，复合水凝胶可以通过细胞产生的谷胱甘肽逐渐降解，为细胞增殖提供足够的空间。
实施例3
本实施例中制备可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶，步骤如下：
(1)按照实施例1中的方法，调整EDCI与CSA·HCl的摩尔比及透明质酸钠的分子量，制备出半胱氨的接枝率为33.54％的HA-SH，将该HA-SH灭菌、溶解于α-MEM培养基中形成浓度为1wt.％的HA-SH溶液；所述α-MEM培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液(双抗)以及抗坏血酸得到，α-MEM培养基中双抗的体积浓度为1％，抗坏血酸的浓度为50μg/mL。
(2)在冰浴下将I型胶原用0.25mol/L醋酸溶液溶解，用5mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.8，然后加入浓度为0.01mol/L、pH值为7.8的PBS缓冲液调节I型胶原的浓度为5mg/mL，得到胶原溶液；所述I型胶原是从牛蹄筋中提取得到。
(3)在冰浴条件下用注射器按照HA-SH溶液与胶原溶液体积比为6:4的比例吸取HA-SH溶液和胶原溶液，在40℃静置5min，巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成复合水凝胶。
实施例4
本实施例中制备可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶，步骤如下：
(1)将实施例1制备的HA-SH灭菌、溶解于α-MEM培养基中形成浓度为5wt.％的HA-SH溶液；所述α-MEM培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液(双抗)以及抗坏血酸得到，α-MEM培养基中双抗的体积浓度为1％，抗坏血酸的浓度为50μg/mL。
(2)在冰浴下将I型胶原用1mol/L醋酸溶液溶解，用5mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，然后加入浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液调节I型胶原的浓度为20mg/mL，得到胶原溶液；所述I型胶原是从牛蹄筋中提取得到。
(3)在冰浴条件下用注射器按照HA-SH溶液与胶原溶液体积比为7:3的比例吸取HA-SH溶液和胶原溶液，在34℃静置10min，巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成复合水凝胶。
实施例5
本实施中制备软骨组织工程三维细胞支架，步骤如下：
(1)将实施例1制备的HA-SH灭菌、溶解于培养基中形成浓度为10wt.％的HA-SH溶液；所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液(双抗)、抗坏血酸以及胎牛血清得到，该培养基中双抗的体积浓度为1％，抗坏血酸的浓度为50μg/mL，胎牛血清的体积浓度为10％。
(2)在冰浴下将I型胶原用0.5mol/L醋酸溶液溶解，用5mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，然后加入浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液调节I型胶原的浓度为10mg/mL，得到胶原溶液。
(3)用注射器按比例吸取胶原溶液和HA-SH溶液形成以下5个实验组：
①胶原溶液与HA-SH溶液的体积比为7:3，将该实验组编号为Col7HA-SH3，②胶原溶液与HA-SH溶液的体积比为5:5，将该实验组编号为Col5HA-SH5，③胶原溶液与HA-SH溶液的体积比为3:7，将该实验组编号为Col3HA-SH7，④作为对照，只吸取胶原溶液，将该实验组编号为Col，⑤作为对照，只吸取HA-SH溶液，将该实验组编号为HA-SH。这5组溶液的总体积相等，混合均匀后分别加入p2代软骨细胞悬液并充分混合，得到p2代软骨细胞浓度为5×106cells/mL的混合溶液，该软骨细胞从出生1～5天的幼兔的关节中提取，随后分别用5mol/L的NaOH溶液调节pH至7.4，将各实验组调节好pH值的混合液立即注入到环状模具中，在空气环境中于37℃静置30min形成三维包裹软骨细胞的水凝胶。
(4)将各实验组得到的三维包裹软骨细胞的水凝胶从模具中取出，浸没于培养基中，置于培养箱中在37℃、5％的CO2的条件下培养得到软骨组织工程三维细胞支架，培养期间每隔1d更换新鲜的培养基，所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液(双抗)、抗坏血酸以及胎牛血清得到，该培养基中双抗的体积浓度为1％，抗坏血酸的浓度为50μg/mL，胎牛血清的体积浓度为10％。
分别于培养1d、7d、14d、21d和28d后取出各实验组得到的三维细胞支架，使用加入浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液清洗2遍，拍摄照片对比观察三维细胞支架的颜色、形状和大小等变化。将清洗后的三维细胞支架浸没于含有1μg/mL的FDA和1μg/mLPI的PBS缓冲液中染色1min，然后用PBS缓冲液清洗1次，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察三维支架中的软骨细胞的生长状态和分布情况。
图5为实施例5中5个实验组中培养不同时间得到的三维细胞支架的照片，Col组三维细胞支架呈现乳白色，HA-SH组三维细胞支架则呈现出透明状。5个实验组的三维细胞支架培养7天后，Col组三维细胞支架出现了严重的收缩，直径由原来的8mm收缩至3mm，体积收缩过半，此后大小则基本不再变化；而HA-SH组三维细胞支架则出现了溶胀现象，但大小在此后几周基本保持不变；随着培养时间的增加，Col7HA-SH3、Col5HA-SH5和Col3HA-SH7组的三维细胞支架则更好地保持了其原有的形态，有效地缓了胶原收缩问题，尤其是Col5HA-SH5和Col3HA-SH7组的三维细胞支架很好地保持了其原本的形态。
图6为实施例5中5个实验组中培养不同时间得到的三维细胞支架的激光共聚焦扫描显微镜照片，图中，A1～A4、B1～B4、C1～C4、D1～D4、E1～E4图分别为Col、Col7HA-SH3、Col5HA-SH5、Col3HA-SH7和HA-SH组三维细胞支架。由图6可知，5个实验组的三维细胞支架都具有良好的生物相容性，几乎没有死细胞，包裹在三维细胞支架中的软骨细胞都随着培养天数的增加正常增殖。胶原组三维细胞支架具有优良的细胞粘附性，软骨细胞可在其内铺展生长；HA-SH组三维细胞支架则不具备粘附性，软骨细胞铺展困难。软骨细胞在Col7HA-SH3、Col5HA-SH5和Col3HA-SH7组的三维细胞支架中成团生长并且细胞粘附性良好，软骨细胞团的数量和大小随着培养时间延长而增加，大大改善了透明质酸组三维细胞支架软骨细胞铺展困难的问题。
实施例6
本实施中制备软骨组织工程三维细胞支架，步骤如下：
(1)将实施例1制备的HA-SH灭菌、溶解于培养基中形成浓度为10wt.％的HA-SH溶液；所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液(双抗)、抗坏血酸以及胎牛血清得到，该培养基中双抗的体积浓度为1％，抗坏血酸的浓度为50μg/mL，胎牛血清的体积浓度为10％。
(2)在冰浴下将I型胶原用0.5mol/L醋酸溶液溶解，用5mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，然后加入浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液调节I型胶原的浓度为10mg/mL，得到胶原溶液。
(3)在冰浴条件下用注射器按比例吸取胶原溶液和HA-SH溶液形成以下5个实验组：
①胶原溶液与HA-SH溶液的体积比为7:3，将该实验组编号为Col7HA-SH3，②胶原溶液与HA-SH溶液的体积比为5:5，将该实验组编号为Col5HA-SH5，③胶原溶液与HA-SH溶液的体积比为3:7，将该实验组编号为Col3HA-SH7，④作为对照，只吸取胶原溶液，将该实验组编号为Col，⑤作为对照，只吸取HA-SH溶液，将该实验组编号为HA-SH。这5组溶液的总体积相等，然后分别加入p2代软骨细胞悬液并充分混合，得到p2代软骨细胞浓度为5×106cells/mL的混合溶液，该软骨细胞从出生1～5天的幼兔的关节中提取，随后分别用5mol/L的NaOH溶液调节pH至7.4，将各实验组调节好pH值的混合液立即注入到环状模具中，在空气环境中于37℃静置30min形成三维包裹软骨细胞的水凝胶。
(4)将各实验组得到的三维包裹软骨细胞的水凝胶从模具中取出，浸没于培养基中，置于培养箱中在37℃、5％的CO2的条件下培养得到软骨组织工程三维细胞支架，培养期间每隔1d更换新鲜的培养基，所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液(双抗)、抗坏血酸以及胎牛血清得到，该培养基中双抗的体积浓度为1％，抗坏血酸的浓度为50μg/mL，胎牛血清的体积浓度为10％。
分别于培养14d和28d后取出各实验组得到的三维细胞支架，使用浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液清洗2遍，浸泡于4％多聚甲醛溶液中固定48h，然后用OCT包埋，迅速放于冷冻台上冰冻至包埋剂与组织冻结成白色冰体，通常的冰冻时间为1～3min，然后在冰冻切片机上进行切片，厚度为5～10μm，随后分别对切片进行番红O、兔-Ⅱ型胶原免疫组化染色、GAGs定量检测。
图7为实施例6中5个实验组中培养不同时间得到的三维细胞支架的GAGs定量检测分析图。由图7可知，在培养14d后，Col、Col7HA-SH3、Col5HA-SH5、Col3HA-SH7和HA-SH组得到的三维细胞支架的GAGs/干重(μg/mg)的数值分别为98.42±3.75、103.83±4.71、92.96±2.46、80.55±3.73和62.66±1.46，在培养28d后，Col、Col7HA-SH3、Col5HA-SH5、Col3HA-SH7和HA-SH组得到的三维细胞支架的GAGs/干重(μg/mg)的数值分别为131.21±2.19、158.17±4.83、148.81±5.72、113.97±6.77和78.76±3.63。所有实验组28天的GAGs/干重数值都高于14天，Col7HA-SH3组和Col5HA-SH5组的数值都高于Col，尤其是Col7HA-SH3组在14天和28天的数值都是最高的，HA-SH组的数值则是最低的。
图8为实施例6中5个实验组中培养不同时间得到的三维细胞支架的组织学染色照片，其中，A1～E1、A3-E3图为培养14d和28d的番红O染色照片，A2-E2、A4-E4图为培养14d和28d的兔-Ⅱ型胶原免疫组化染色照片。从番红O染色照片可看出，5个实验组的三维细胞支架切片均出现大量阳性异染区域，尤其Col7HA-SH3组，整个基底呈现橙红色，且最为均匀，细胞呈圆形包被于橙红色异染区域中，而Col组中只有切片边缘一周出现异染区域，其它组别中的异染区域则呈现散乱分布的网状结构，相对于Col7HA-SH3组，Col5HA-SH5和Col3HA-SH7的效果稍差，但仍然明显优于Col组和HA-SH组的染色效果。从兔-Ⅱ型胶原免疫组化染色可以看出，5个实验组的三维细胞支架中培养的软骨细胞均能分泌大量特异性基质，且染色结果与番红O染色结果吻合，Col7HA-SH3组最好，二型胶原分布最均匀，相对于Col7HA-SH3组，Col5HA-SH5和Col3HA-SH7的效果稍差，但仍然明显优于Col组和HA-SH组的染色效果，说明合适比例的HA-SH/Col复合水凝胶能够很好地促进软骨细胞增殖，分泌特异性基质。

Claims (10)

1.可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶，其特征在于，该复合水凝胶由交联巯基化透明质酸水凝胶与胶原组成，胶原分布在交联巯基化透明质酸的三维交联网络结构中，所述胶原为I型胶原或Ⅱ型胶原，所述交联巯基化透明质酸是由结构式如式(Ⅰ)所示的巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成，巯基化透明质酸中半胱氨的接枝率为30％～70％，
2.根据权利要求1所述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶，其特征在于该复合水凝胶中胶原的含量为4.5～10.5mg/mL，交联巯基化透明质酸的含量为4.5～10.5mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶，其特征在于巯基化透明质酸是以透明质酸为基础通过半胱胺改性得到的，作为改性基础的透明质酸的分子量为0.1MDa～3.0MDa。
4.权利要求1至3中任一项权利要求所述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)将结构式如式(Ⅰ)所示且半胱氨的接枝率为30％～70％的巯基化透明质酸溶解于α-MEM培养基中形成浓度为1wt.％～10wt.％的巯基化透明质酸溶液，α-MEM培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液以及抗坏血酸得到，
(2)将I型胶原或Ⅱ型胶原用醋酸溶液溶解，调节pH值至7.4～7.8，然后加入PBS缓冲液调节I型胶原或Ⅱ型胶原的浓度为5～20mg/mL得到胶原溶液；
(3)将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液按照的体积比混匀，调节pH值至7.4～7.8，在34～40℃静置使巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成复合水凝胶。
5.根据权利要求4所述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的制备方法，其特征在于所述醋酸溶液的浓度为0.25～1.0mol/L，所述PBS缓冲液的pH值为7.4～7.8、浓度为0.01～0.02mol/L。
6.权利要求1至3中任一项权利要求所述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶在骨修复领域中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶用于制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于采用可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶用于制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架的步骤如下：
(1)将结构式如式(Ⅰ)所示且半胱氨的接枝率为30％～70％的巯基化透明质酸，溶解于培养基中形成巯基化透明质酸浓度为1wt.％～10wt.％的巯基化透明质酸溶液，
(2)将I型胶原或Ⅱ型胶原用醋酸溶液溶解，调节pH值至7.4～7.8，然后加入PBS缓冲液调节I型胶原或Ⅱ型胶原的浓度为5～20mg/mL得到胶原溶液；
(3)将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液灭菌并按照的体积比混匀，调节pH值至7.4～7.8后立即注射至生物体体内的待修复部位，巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成复合水凝胶，即得软骨组织工程三维支架；
或者，将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液灭菌并按照的体积比混匀，然后加入软骨细胞悬浮液混匀，调节pH值至7.4～7.8后立即注射至生物体体内的待修复部位，巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成包裹软骨细胞的复合水凝胶，即得软骨组织工程三维细胞支架；
或者，将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液灭菌并按照的体积比混匀，然后加入软骨细胞悬浮液并混匀，调节pH值至7.4～7.8，加入模具中，在34～40℃静置，巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成包裹软骨细胞的复合水凝胶，将包裹软骨细胞的复合水凝胶从模具中取出浸没于培养基中，置于培养箱中在34～40℃、3％～5％的CO2的条件下培养至少1天即得软骨组织工程三维细胞支架，培养期间定期更换培养基；
所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液、抗坏血酸以及胎牛血清得到。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于步骤(3)中按照5×105～5×106cells/mL的比例向巯基化透明质酸溶液与胶原溶液的混合液中加入软骨细胞悬液。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于所述醋酸溶液的浓度为0.25～1.0mol/L，所述PBS缓冲液的pH值为7.4～7.8、浓度为0.01～0.02mol/L。
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