JP6240997B2 - ガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法、ハイドロゲル材料の製造方法、ガラス化後のハイドロゲル膜、ガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体および細胞シート - Google Patents
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Description
(2)前記工程Dの前に、ガラス化工程を経ていないハイドロゲルから自由水を除去してガラス化させて、ハイドロゲル乾燥体を得る工程Aを含む前記(1)に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
(3)前記工程Aは半球状凸面を有する鋳型と半球状凹面を有する鋳型との間に完全にはゲル化していない状態のハイドロゲルを配置させて、前記ハイドロゲル乾燥体を得る工程である前記(2)に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
(4)前記工程Aと前記工程Dの間に、前記ハイドロゲル乾燥体を再水和させてガラス化後のハイドロゲルを得る工程Bと、
前記工程Bの後に、前記ガラス化後のハイドロゲルを再びガラス化させてガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得る工程Cと、を含む前記(2)又は(3)に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
(5)前記紫外線の総照射量が100〜6000mJ/cm2である前記(1)〜(4)のいずれか一つに記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
(6)前記半球状凸面及び前記半球状凹面が、哺乳動物の眼球の角膜に対応する曲率半径を有する前記(3)〜(5)のいずれか一つに記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
(7)前記(1)〜(6)のいずれか一つに記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法を用いて得られることを特徴とするガラス化後のハイドロゲル膜。
(8)400nmにおける吸光度が0.05〜0.3である前記(7)に記載のガラス化後のハイドロゲル膜。
(9)細胞外マトリックス成分を1cm2あたり0.1〜10.0mg含有する前記(7)又は(8)に記載のガラス化後のハイドロゲル膜。
(10)膜の厚さが1〜1000μmである前記(7)〜(9)のいずれか一つに記載
のガラス化後のハイドロゲル膜。
(11)ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射する工程D1を含み、前記ハイドロゲルがブタ由来アテロコラーゲンを含有することを特徴とするガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線照射を施したハイドロゲル材料の製造方法。
(12)前記(7)〜(10)のいずれか一つに記載のガラス化後のハイドロゲル膜を乾燥して得られることを特徴とするガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体。
(13)前記(7)〜(10)のいずれか一つに記載のガラス化後のハイドロゲル膜に細胞が付着してなることを特徴とする細胞シート。
また、本発明のガラス化後のハイドロゲル膜は適度な強度と透明度を有しているので、生体移植材料をはじめとする優れた新規材料として利用できる。
尚、本明細書中においては、ハイドロゲル膜の作製工程を詳細に説明するにあたり、当該ガラス化工程の直後であり再水和の工程を経ていないハイドロゲルの乾燥体に対しては、単に「ハイドロゲル乾燥体」とした。そして、当該ガラス化工程の後に再水和の工程を経て得られたゲルを「ガラス化後のハイドロゲル」として区別して表し、そのゲルをガラス化させて得られた乾燥体を「ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体」とした。また、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線照射する工程(後述の工程D1)を施して得られるものを「ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線照射処理を施したハイドロゲル材料」とし、該ハイドロゲル材料に再水和する工程(後述の工程D2)を施して得られるゲルを「ガラス化後のハイドロゲル膜」とし、ガラス化後のハイドロゲル膜を乾燥させて得られた乾燥体を「ガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体」とした。従って、「ガラス化後のハイドロゲル」及び「ガラス化後のハイドロゲル膜」は水和体である。本明細書中における各工程、並びに各工程を経た後のゲル及びゲル乾燥体の呼称を図1に示す。
以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。
[第1実施形態]
本実施形態のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法は、
半球状凸面を有する鋳型と半球状凹面を有する鋳型との間に完全にはゲル化していない状態のハイドロゲルを配置させて、前記ハイドロゲル乾燥体を得る工程A、を含む。
ここで、半球状凸面を有する鋳型および半球状凹面を有する鋳型として、該鋳型を備えた製造装置の一例を図2に示す。図2左に示す製造装置10は、下方に半球状凹面を有する半球状凹面鋳型1aと、半球状凹面鋳型1aの上方に半球状凹面鋳型1aに対向して配置され、該凹面と対応する形状の半球状凸面を有する半球状凸面鋳型2aと、該凹面を囲んで配置される壁面鋳型3とを備える。又は、下方と上方に配置される鋳型の凹面と凸面の組み合わせは逆でもよく、図2右に示すように、下方に半球状凸面鋳型2bと、半球状凸面鋳型2bの上方に配置され該凸面と対応する形状の凹面を有する半球状凹面鋳型1bとの組み合わせであってもよい。
前記ハイドロゲル乾燥体を再水和させてガラス化後のハイドロゲルを得る工程Bと、
前記工程Bの後に、前記ガラス化後のハイドロゲルを再びガラス化させてガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得る工程Cと、
ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射する工程D1と該工程D1を経て作製されたガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線照射を施したハイドロゲル材料を再水和する工程D2と、を含む。なお、以下の本実施形態の説明では、工程D1および工程D2からなる工程を工程Dとして説明する。
本実施形態において、工程Dにおいて紫外線を照射する対象の「ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体」は、工程A、工程B及び工程Cの順で作製された「ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体」、或いはその後、更に、工程D及び工程Cの順を経て作製された「ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体」である。
以下、各工程について説明する。
ハイドロゲル乾燥体をPBSや使用する培養液などで再水和することでガラス化後のハイドロゲルを得ることができる。ここで、再水和する液体には、生理活性物質などの各種の成分が含まれていてもよく、例えば、生理活性物質としては、抗生物質をはじめとする各種医薬品、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、またはゲル化しない細胞外マトリックス成分としてファイブロネクチン、ビトロネクチン、エンタクチン、オステオポエチン等が挙げられる。また、これらを複数含有させることも可能である。
乾燥方法は、工程Aと同様に、風乾、密閉容器内で乾燥(容器内の空気を循環させ、常に乾燥空気を供給する)、シリカゲルを置いた環境下で乾燥する等、種々の方法を用いることができる。ガラス化後のハイドロゲルを再乾燥させることで、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得ることができる。
紫外線の照射には、公知の紫外線照射装置を使用することができる。
ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体への紫外線の照射エネルギーは、単位面積あたりの総照射量が、100〜6000mJ/cm2であることが好ましく、1000〜4000mJ/cm2であることがより好ましく、2200〜3200mJ/cm2であることがさらに好ましい。この範囲の照射量であると、ガラス化後のハイドロゲル膜の透明度および強度を特に好ましいものとすることができる。
単位面積あたりの紫外線総照射量が同一であるとき、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体への紫外線の照射を、複数回に分割して繰り返して行うことで、ガラス化後のハイドロゲル膜の透明度および強度をより高めることができる。また分割の回数は多いほど好ましい。例えば、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体への紫外線の照射の単位面積あたりの総照射量が、1000〜4000mJ/cm2の範囲であるとき、該範囲内での照射回数が2〜10回であることが好ましく、2〜6回であることがより好ましい。
また、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体への紫外線の照射を繰り返す場合、紫外線の照射部位を、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の一方の面と他方の面(上面と下面)とに分けて照射して、その総照射量を、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体への単位面積あたりの紫外線総照射量としてもよい。
本発明のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法によって得られる本発明のガラス化後のハイドロゲル膜は、以下に説明するような物性を有することが好ましい。
本発明の細胞シートは、本発明のガラス化後のハイドロゲル膜に細胞が付着してなるものである。本発明のガラス化後のハイドロゲル膜は、紫外線照射により強度および透明性が増すことに加え、細胞付着性も上昇する。そのため、細胞が付着してなる細胞シートとしても、従来品より優れるものである。当該細胞は、細胞シート上で培養されてもよい。本発明のガラス化後のハイドロゲル膜は生体適合性に優れるので、例えば、ゲル膜に自己由来の細胞が付着した細胞シートは、移植材料として用いることができる。
《ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル膜の製造》
[実施例1]
<支持体の準備>
ナイロンメンブレン (Amersham Pharmacia Cat#RPN1782B)を支持体くり抜き機(森下製版、刃:直径24mm〜33mm)でくり抜き、外径33mm、内径24mmの支持体を製作した。直径35mmペトリディッシュ(BD Falcon、Cat#351008)に、70%エタノールを入れ、ペトリディッシュ中に作製した支持体を10分程度浸し、支持体を滅菌した。70%エタノールをペトリディッシュから取り除き、代わりに3mLのPBS(SIGMA、D8537、Lot#RNBB9236)を入れ、支持体を洗浄した。このPBSによる洗浄は計3回繰り返した。ペトリディッシュからPBSを取り除き、代わりに3mLの無血清培養液(Serum−Free Media、以下SFMと云う)(DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Low glucose(GIBCO Cat.#11885, Lot#1036000), 20mM HEPES(GIBCO Cat#15630−080), 100units/mL Penicilin and 100ug/mL Streptomycin (GIBCO Cat#15104))を入れ使用するまでの数10分間SFMに浸しておいた。
<工程A>
氷上で冷却した50mLコニカルチューブに3mLの前記SFMと、3mLの1.0%ブタ由来アテロコラーゲン溶液(NMP コラーゲンPS 溶液、1.02%,Lot#PSBJC05S, cica lot. I3X05)を加え、均一に混合した混合液を作製した。直径60mmの疎水性ポリスチレン製培養シャーレ(BD FALCON、#353002)の底表面を基板とし、その上面に直径50mmの円形に切断したシート状のポリエチレンビニルを乗せた。その上に内径が34mmの筒状壁面鋳型を設置した。さらに筒状壁面鋳型内のポリエチレンビニル上に、SFMで平衡化した前記支持体を乗せた。すなわち、底面が基板上に乗せたポリエチレンビニル、壁面が前記筒状壁面鋳型である容器とした。その容器の中に前記SFMと1.0%ブタ由来アテロコラーゲンとの等量混合液4mLを流し入れ、クリーンベンチ内に30分間静置させた。
5%CO2/95%空気存在下、37℃の条件で2時間静置した。
壁面鋳型を上下にわずかに動かすことでアテロコラーゲンゲルと壁面鋳型間の接着を解除し、ゲル内の自由水を鋳型の外側に流出させた。ゲルから流出した自由水を回収したのち、再び壁面鋳型を元に戻して、基板上に乗せたポリエチレンビニル上のゲルを鋳型ごとカルチャーパルCO2(コアフロント、CO2 2.5L)で満たした2.5L標準型気密角形ジャーに入れ、4℃で2日間静置し、当該ゲルから自由水と気泡を除去した。なお、当該自由水は基板上に乗せたポリエチレンビニルと壁面鋳型の隙間から流出し、ゲルは鋳型の筒内部に保持されていた。
再度コラーゲンゲルと壁面鋳型間の接着を解除し、ゲルから流出した自由水を回収した。次いで、壁面鋳型を完全に取り外し、ゲルを10℃、湿度40%(40%RH)の条件下で2日間静置し、乾燥させ、平面状のブタ由来アテロコラーゲンゲル乾燥体を得た。
<工程B>
前記基板上に乗せたポリエチレンビニルと、その上面に形成された前記平面状のブタ由来アテロコラーゲンゲル乾燥体とを前記直径60mmペトリディッシュに入れ、さらに37℃に加温した前記PBSを5mL注いで当該アテロコラーゲンゲル乾燥体を浸し、10分間静置し、当該乾燥体を再水和させ、さらに、前記PBSの5mLを新しいPBSに交換して同様に10分間静置する操作を2回繰り返し、PBSで平衡化された、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲルを得た。
<工程C>
得られたブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲルを10℃、40%RHの条件下で1日間静置して乾燥させ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有するガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得た。
<工程D>
UVリンカー(フナコシ、FS−1500)を用いて、ブタ由来アテロコラーゲンを含有するガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に1回目のUV照射(600mJ/cm2)を行った。このUV照射後の当該乾燥体を、前記PBSを5mL入れた前記直径60mmペトリディッシュに移し、10分間静置し、再水和を行った。
1回目のUV照射後に得られたブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル膜を10℃、40%RHの条件下で1日間静置して乾燥させ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有するガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得た(工程C)。その後、1回目と同様にして、工程Dを行った。
(工程C〜D:3回目)
2回目と同様にして工程Cを、1回目と同様にして工程Dを行った。
(工程C〜D:4回目)
2回目と同様にして工程Cを、1回目と同様にして工程Dを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例1の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜を得た。さらに、工程Cを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例1の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体を得た。
実施例2においては、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射する工程(工程D)を1200mJ/cm2ずつ2回に分けて繰り返し行い、それに伴い、工程Cも2回繰り返し、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例2の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜を得た。さらに、工程Cを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例2の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体を得た。なお、実施例1と同様、各工程Cにおいてガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の上面と下面を逆さにし、該ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の両表面に等量のUVが照射されるようにした。
実施例3においては、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射する工程(工程D)を800mJ/cm2ずつ2回に分けて繰り返し行い、それに伴い、工程Cも2回繰り返し、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例3の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜を得た。さらに、工程Cを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例3の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体を得た。なお、実施例1と同様、各工程Cにおいてガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の上面と下面を逆さにし、当該ハイドロゲル再乾燥体の両表面に等量のUVが照射されるようにした。
実施例4においては、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射する工程(工程D)を800mJ/cm2ずつ4回に分けて繰り返し行い、それに伴い、工程Cも4回繰り返し、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例4の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜を得た。さらに、工程Cを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例4平面状のガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体を得た。なお、実施例1と同様、各工程Cにおいてガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の上面と下面を逆さにし、当該ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の両表面に等量のUVが照射されるようにした。
実施例5においては、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射する工程(工程D)を1600mJ/cm2ずつ2回に分けて繰り返し行い、それに伴い、工程Cも2回繰り返し、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例5の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜を得た。さらに、工程Cを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例5の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体を得た。なお、実施例1と同様、各工程Cにおいてガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の上面と下面を逆さにし、当該ハイドロゲル再乾燥体の両表面に等量のUVが照射されるようにした。
実施例1と同様に工程A及び工程Bを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する比較例1のガラス化後のハイドロゲルを得た。さらに、工程Cを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する比較例1の平面状のガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得た。
実施例1〜5で作製したガラス化後のハイドロゲル膜及びそれらの乾燥体、並びに比較例1で作製したガラス化後のハイドロゲル及びガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に対して、分光光度計(日本分光、V−550)を用い、フィルムフォルダ(日本分光、FLH−267)に挿入して、400nmにおける吸光度を測定した。
図5に示された吸光度の値から明らかなように、工程Dの紫外線照射を経て製造された実施例1〜5のガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体は、工程Dの紫外線照射を経ずに製造された比較例1のガラス化後のハイドロゲル再乾燥体と比較し、著しく透明度が上昇していた。また、図5に示された吸光度の値および図6に示された画像から明らかなように、工程Dの紫外線照射を経て製造された実施例1〜5のガラス化後のハイドロゲル膜は、工程Dの紫外線照射を経ずに製造された比較例1のガラス化後のハイドロゲルと比較して、著しく透明度が上昇していた。
[実施例6]紫外線の総照射量2400mJ/cm2(600mJ/cm2×4回)
<鋳型の準備>
図3で示したものと同様の半球状凸面鋳型、半球状凹面鋳型、および壁面鋳型を、70%エタノールを吹き付けて滅菌し、その後クリーンベンチ内で風乾させた。
ナイロンメンブレンを支持体くり抜き機(森下製版、刃:直径11mm〜14mm)でくり抜き、外径14mm、内径11mmの支持体を製作した。直径35mmペトリディッシュに、70%エタノールを入れ、ペトリディッシュ中に作製した支持体を10分程度浸し、支持体を滅菌した。70%エタノールをペトリディッシュから取り除き、代わりに3mLのPBSを入れ、支持体を洗浄した。このPBSによる洗浄は計3回繰り返した。ペトリディッシュからPBSを取り除き、代わりに3mLのSFMを入れ使用するまでの数10分間SFMに浸しておいた。
次いで、氷上で冷却した50mLコニカルチューブに、1mLの前記SFMと、1mLの1.0%ブタ由来アテロコラーゲン溶液を加え、均一に混合した混合液に前記支持体を浸し、支持体をSFMとブタ由来アテロコラーゲンの均一混合液でコーティングした。
前記のとおり作製し、SFMとブタ由来アテロコラーゲンの均一混合液でコーティングされた支持体を半球状凹面鋳型の上面に、半球状凹面鋳型の凹面部分を支持体で囲むようにして乗せた。
前記半球状凹面鋳型に乗せられた支持体の外径(14mm)よりも大きな内径(15mm)を有する筒状の壁面鋳型を前記半球状凹面鋳型の凹面を囲むように設置させた。すなわち、底面が半球状凹面鋳型、壁面が筒状の壁面鋳型であって、底面と壁面が分離可能な容器とした。その容器中に0.7mLの前記SFMとブタ由来アテロコラーゲンの均一混合液を流し入れ、クリーンベンチ内に15分間静置させた。この様子を図7に示す。15分の静置後、完全にはゲル化せずにゲル化進行状態のブタ由来アテロコラーゲンゲルが得られたことを確認した。
次いで、この完全にはゲル化せずにゲル化進行状態のブタ由来アテロコラーゲンゲルが入った筒内部に凸面を有する棒状の自重落下型の半球状凸面鋳型を入れ、底面に配置した前記半球状凹面鋳型と該凹面にかみ合う自重落下型の半球状凸面鋳型とで完全にはゲル化せずにゲル化進行状態のブタ由来アテロコラーゲンゲルを挟み込むようにして当該ゲルを加圧し、5%CO2/95%空気存在下、37℃の条件で2時間静置することで完全にゲル化した。次いで、自重落下型の半球状凸面鋳型を取り外し、ゲルを半球状凹面鋳型および壁面鋳型ごとカルチャーパルCO2(コアフロント、CO2 2.5L)で満たした2.5L標準型気密角形ジャー(コアフロント)に入れ、4℃で一晩(約16時間)静置し、当該ゲルから自由水と気泡を除去した。なお、当該自由水は半球状凹面鋳型と壁面鋳型の隙間から流出し、ゲルは鋳型の筒内部に保持されていた。
壁面鋳型を上下にわずかに動かすことで当該ゲルと壁面鋳型間の接着を解除し、当該ゲルから自由水を鋳型の外側に流出させた。当該ゲルから流出した自由水を回収したのち、壁面鋳型を元に戻して、当該ゲルを鋳型ごと前記カルチャーパルCO2で満たした2.5L標準型気密角形ジャーに入れ、4℃で3日間静置し、当該ゲルから自由水と気泡をさらに除去した。この様子を図7に示す。
再度当該ゲルと壁面鋳型間の接着を解除して壁面鋳型を除去した後、当該ゲルから流出した自由水を回収した。次いで、半球状凹面鋳型上の当該ゲルを10℃、40%RHの条件下で1日間風乾機(エスペック,PDR−3KP)を用いて乾燥させ、ガラス化後の半球面状のブタ由来アテロコラーゲンゲル乾燥体を得た。この様子を図8に示す。
<工程B>
前記半球状凹面鋳型と、半球状凹面鋳型上面に形成された前記ガラス化後の半球面状のブタ由来アテロコラーゲンゲル乾燥体(工程Aで作製)とを前記直径35mmペトリディッシュに入れ、さらに37℃に加温した前記PBSを4mL注いで当該ゲル乾燥体を浸し、10分間静置し、当該ゲル乾燥体を再水和させた。半球状凹面鋳型から剥がれた再水和された半球面状のガラス化後のハイドロゲルを、前記PBSの4mLを新しいPBSに交換して同様に10分間静置する操作を2回繰り返すことで、PBSで平衡化された、半球面状のガラス化後のハイドロゲルを得た。この様子を図9に示す。
<工程C>
得られた半球面状のガラス化後のハイドロゲルを半球状凸面鋳型上に乗せ10℃、40%RHの条件下で1日間静置し当該ゲルを乾燥させ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得た。
<工程D>
UVリンカー(フナコシ、FS−1500)を用いて、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に1回目のUV照射(600mJ/cm2)を行った。なお、当該再乾燥体へのUV照射は、当該再乾燥体を半球状凸面鋳型上に乗せた状態で行った。この様子を図10に示す。このUV照射後の当該再乾燥体を、前記PBSを5mL入れた前記直径60mmペトリディッシュに移し、10分間静置し、再水和を行った。
1回目のUV照射後に得られたブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜を半球状凹面鋳型上に静置し、10℃、40%RHの条件下で1日間静置して乾燥させ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜再乾燥体を得た(工程C)。
その後、今度は半球状凹面鋳型上に当該ゲル膜を載せて行った以外は、1回目と同様にして、工程Dを行った。この様子を図10に示す。
(工程C〜D:3回目)
2回目と同様にして工程Cを、今度は半球状凸面鋳型上にて1回目と同様にして工程Dを行った。この様子を図11に示す。
(工程C〜D:4回目)
2回目と同様にして工程Cを、今度は半球状凹面鋳型上にて1回目と同様にして工程Dを行い、実施例6のブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜を得た。この様子を図11に示す。さらに、工程Cを行い、実施例6のブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体を得た。
実施例1〜6のガラス化後のハイドロゲル膜は、比較例1の従来のガラス化後のハイドロゲルよりも遥かに高い透明度を有していた。したがって、生体移植材料のなかでも、特に高い光透過性と強度が要求される眼球への移植材料として特に好適であると考えられた。
[実施例7]
ウサギ角膜上皮面へ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル膜(実施例1で作製)の移植手術を行った。角膜実質から前方(直径5mmの円状、厚み約200μm)を切除、PBS(−)を用いて37℃で5〜10分放置し再水和し支持体から切り離した直径8mmの当該ゲル膜を移植した。
[実施例8]
ウサギ角膜上皮面へ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜(実施例6で作製)の移植手術を行った。角膜実質から前方(直径5mmの円状、厚み約200μm)を切除、PBS(−)を用いて37℃で5〜10分放置し再水和し支持体から切り離した直径8mmの当該ゲル膜を移植した。
実施例1で作製した平面状のゲル膜は、移植先の眼球面と形状が異なるためにゲル膜に皺が発生してしまっていた。
一方、実施例6で作製した半球面状のゲル膜は、被験者動物の眼球の角膜に対応する曲率半径を有し角膜形状に適合しているため、ゲル膜に皺が発生することが無く、眼球により良好に付着していた。
<ウサギ角膜実質層間へのブタ由来アテロコラーゲンを含有するガラス化後のハイドロゲル膜の移植>
[実施例9]
ウサギ角膜実質層間へ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル膜(実施例1で作製)の移植手術を行った。角膜実質を深さ約200μmで層間剥離し、PBS(−)を用いて37℃で5〜10分放置し再水和し支持体から切り離した直径8mmの当該ゲル膜を層間に移植した。
[実施例10]
ウサギ角膜実質層間へ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜(実施例6で作製)の移植手術を行った。角膜実質を深さ約200μmで層間剥離し、PBS(−)を用いて37℃で5〜10分放置し再水和し支持体から切り離した直径8mmの当該ゲル膜を層間に移植した。
移植から4ヶ月後の、実施例9と実施例10のウサギ角膜の様子を図13に示す。
実施例9と実施例10で移植された両ゲル膜ともに、透明性が維持されており、炎症惹起も見られなかった。したがって、実施例1及び実施例6のガラス化後のハイドロゲル膜は、生体移植材料として大変優れていることがわかる。
[実施例11]
ウサギ角膜内皮面へ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル膜(実施例1で作製)の移植手術を行った。角膜切開層より、支持体から切り離した直径6mm、厚み20μmの当該ゲル膜を挿入し、エアタンポナーデにより角膜後面に付着させた(n=4)。
[実施例12]
ウサギ角膜内皮面へ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜(実施例6で作製)の移植手術を行った。角膜切開層より、支持体から切り離した直径6mm、厚み20μmの当該ゲル膜を挿入し、エアタンポナーデにより角膜後面に付着させた(n=4)。
実施例11および実施例12で移植された両ゲル膜ともに、透明性が維持されており、炎症惹起も見られなかった。したがって、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例1及び実施例6のガラス化後のハイドロゲル膜は、生体移植材料として大変優れていることがわかる。
一方、実施例6で作製した半球面状のゲル膜は、被験動物の眼球の角膜に対応する曲率半径を有し角膜形状に適合しているため、ゲル膜に皺が発生することが無く角膜後面に付着していた。また、実施例6で作製した半球面状のゲル膜は術一ヵ月後においても剥離せず角膜後面に沿って付着していることが確認された。
実施例6で作製したブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜は、被移植者の眼球面に合わせてゲル膜を大量に作製可能であり、さらにブタ由来アテロコラーゲン以外の他個体由来の生体物質を用いなくともよい。したがって、本発明に係るガラス化後のハイドロゲル膜は、従来用いられてきた羊膜にある欠点を持たない優れた移植材料である。
ガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体(実施例1で作製)を再水和させ、チャンバー(トランズウェル12ウェルプレート3460、コーニング)上のメンブレンに付着させ、いったん乾燥させることでメンブレンにガラス化後のハイドロゲル膜を固定させた。チャンバーをセットし、1.5mLの細胞培養液をチャンバー外側に、チャンバー上に0.5mLの細胞懸濁液(2×104 /mL)を播種して、5%CO2 /95%空気存在下の37℃の保湿インキュベーター内で培養した。細胞は、ヒト角膜上皮細胞を用いた。約1カ月間培養の後、ホルマリンで固定し、直接ヘマトキシリン・エオシン(HE)染色した。
ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル膜(実施例1で作製)を用い、上記の方法で、ゲル膜上で角膜上皮細胞の培養を行い、実施例11の細胞シートを得た。
[比較例2]
ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル(比較例1で作製)を用い、ゲル上で角膜上皮細胞の培養を行った。培養方法および培養条件は、実施例13と同様に行い、比較例2の細胞シートを得た。
比較例2のゲル上には、角膜上皮細胞の培養状態は不良であり、良好なシート化ができなかった。一方、図15の画像から明らかなように、工程Dを経て製造された実施例1のゲル膜には、角膜上皮細胞が良好な状態で培養されていた。
[実施例14]
ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜(実施例6で作製)を用い、ゲル膜上で角膜内皮細胞の培養を行った。しかし、半球面状のゲル膜上で単に細胞を培養しても、膜の凹面の中心に細胞が溜まってしまう。そこで、12ウェルプレート(住友ベークライト社製 MS−80120)底面に再水和させた実施例6のゲル膜を張り付けたのち、一旦乾燥させ、当該ゲル膜に130万個/ウェル(4000個/mm2)でヒト正常角膜内皮細胞を播種し、一晩(約16時間)培養した。ヒト正常角膜内皮細胞が播種された当該ゲル膜を、ウェルの底から丁寧にはがし、別のウェルに用意したテフロン(登録商標)製O-リングの上に当該ゲル膜の支持部を浮かせるようにのせ一週間培養を継続し、実施例14の細胞シートを得た。なお、その他の培養条件および操作は実施例13と同様に行った。図16に得られた実施例14の細胞シートを示す。図16の画像からも明らかなように、角膜内皮細胞がブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜上に均一に生着していることがHE染色にて確認された。また、内皮細胞密度は約2800/mm2であった。
Claims (13)
- ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射した後に再水和する工程Dを含み、前記ハイドロゲルがブタ由来アテロコラーゲンを含有することを特徴とするガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
- 前記工程Dの前に、ガラス化工程を経ていないハイドロゲルから自由水を除去してガラス化させて、ハイドロゲル乾燥体を得る工程Aを含む請求項1に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
- 前記工程Aは半球状凸面を有する鋳型と半球状凹面を有する鋳型との間に完全にはゲル化していない状態のハイドロゲルを配置させて、前記ハイドロゲル乾燥体を得る工程である請求項2に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
- 前記工程Aと前記工程Dの間に、前記ハイドロゲル乾燥体を再水和させてガラス化後のハイドロゲルを得る工程Bと、
前記工程Bの後に、前記ガラス化後のハイドロゲルを再びガラス化させてガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得る工程Cと、を含む請求項2又は3に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。 - 前記紫外線の総照射量が100〜6000mJ/cm2である請求項1〜4のいずれか一項に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
- 前記半球状凸面及び前記半球状凹面が、哺乳動物の眼球の角膜に対応する曲率半径を有する請求項3〜5のいずれか一項に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法を用いて得られることを特徴とするガラス化後のハイドロゲル膜。
- 400nmにおける吸光度が0.05〜0.3である請求項7に記載のガラス化後のハイドロゲル膜。
- ブタ由来アテロコラーゲンを1cm2あたり0.1〜10.0mg含有する請求項7又は8に記載のガラス化後のハイドロゲル膜。
- 膜の厚さが1〜1000μmである請求項7〜9のいずれか一項に記載のガラス化後のハイドロゲル膜。
- ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射する工程D1を含み、前記ハイドロゲルがブタ由来アテロコラーゲンを含有することを特徴とするガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線照射を施したハイドロゲル材料の製造方法。
- 請求項7〜10のいずれか一項に記載のガラス化後のハイドロゲル膜を乾燥して得られることを特徴とするガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体。
- 請求項7〜10のいずれか一項に記載のガラス化後のハイドロゲル膜に細胞が付着してなることを特徴とする細胞シート。
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