WO2020004646A1 - 細胞培養用ハイドロゲル、ゲルキット、細胞培養物の製造方法、及び細胞培養用ハイドロゲルの製造方法 - Google Patents

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WO2020004646A1
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hydrogel
cell culture
cell
cells
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田口　光正
智子 大山
木村　敦
廣太郎 大山
弘 石原
卓志 下川
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国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture hydrogel, a gel kit, a method for producing a cell culture, and a method for producing a cell culture hydrogel.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and in cell culture using a hydrogel as a scaffold, gene expression is reduced while reducing growth activity caused by unknown growth factors mixed into the raw material of the scaffold.
  • the aim is to provide technology that can be controlled.
  • the present inventors have conducted intensive studies on the phenomenon that the reproducibility of the cell culture results is reduced due to the lot difference of the cell culture scaffold (commercially available coating agent). In some cases, it was confirmed that the type and activity of such growth factors greatly affected the cell culture results. Then, a method of forming a scaffold while reducing the activity of a growth factor in the scaffold by irradiation, and a method of producing a cell culture were established.
  • growth factor in the present invention is synonymous with “cell growth factor” which is a factor affecting cell culture results, and specifically, fibroblast growth factor-1 and the like are exemplified. .
  • the cell growth activity is 100 pg / mL or less in terms of fibroblast growth factor-1 activity,
  • the elastic modulus is 0.1 to 500 kPa,
  • the cell proliferation activity is less than 105% as the proliferation activity of NIH-3T3 cells in a 28-hour incubation using Cell Counting Kit-8 as compared to bovine dermis-derived type I collagen gel extracted by acid treatment.
  • a gel kit comprising the hydrogel according to any one of (1) to (5) and a physiologically active factor separate from the hydrogel.
  • a method for producing a hydrogel for cell culture For an aqueous solution containing 0.1 to 70% by mass of a hydrophilic polymer, An irradiation step of irradiating radiation of a dose of 1 to 1000 kGy, The hydrogel after irradiation has a cell growth activity of 100 pg / mL or less in terms of fibroblast growth factor-1 activity, The elastic modulus of the hydrogel after the irradiation is 0.1 to 500 kPa, The method for producing a cell culture hydrogel, wherein the irradiated hydrogel has a radiation cross-linked structure of a hydrophilic polymer.
  • the hydrogel after the irradiation contains at least 1 mass% and not more than 30 mass% with respect to the hydrogel, of at least one selected from the group consisting of collagen, collagen peptide and gelatin.
  • a production technique for stably controlling gene expression in cell culture to produce a cell culture there is provided a production technique for stably controlling gene expression in cell culture to produce a cell culture.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a relationship between a gamma ray dose and an elastic modulus.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the amount of FGF1 added and the proliferation activity.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the amount of FGF1 added and the proliferation activity.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the amount of FGF1 added and the proliferation activity. It is a figure which shows the differentiation control in the phagocyte culture derived from a mouse peritoneal cavity. It is a figure which shows the morphology control in B16F10 cell culture derived from mouse malignant melanoma. It is a figure which shows the morphological control in HeLa cell culture derived from human-derived cervical cancer.
  • hydrogel for cell culture of the present invention (hydrogel for cell culture scaffold) has a cell growth activity of 100 pg / mL or less in terms of fibroblast growth factor-1 activity and an elasticity.
  • the hydrogel for cell culture of the present invention is also simply referred to as “hydrogel of the present invention”.
  • the hydrogel is a gel that hardens into a gel by enclosing water, and is formed by, for example, cross-linking such that constituent molecules of a hydrophilic polymer such as a protein bridge each other.
  • the crosslinking by radiation utilizes the inherent high energy of radiation, and is a so-called crosslinking agent (for example, also called a thermal crosslinking agent (polymerization initiator) or an ultraviolet crosslinking agent (photopolymerization initiator)). Is not required, so that a radiation crosslinking structure containing no crosslinking agent is constituted. By having such a radiation cross-linking structure, a hydrogel state can be maintained even when left under cell culture conditions.
  • a hydrogel having a water content of 10% by mass or more can be suitably used as the hydrogel.
  • the upper limit of the water content is not particularly limited, and may be appropriately set to, for example, 99% by mass or less.
  • hydrogel those having a hydrophilic polymer content of, for example, 1% by mass or more, preferably 3% by mass or more with respect to the hydrogel can be suitably used.
  • the upper limit of the content of the hydrophilic polymer with respect to the hydrogel is not particularly limited, and for example, those having a content of 50% by mass or less, preferably 40% by mass or less can be suitably used.
  • Radiation cross-linking is not particularly limited. However, irradiation generates an active site on a polymer chain, and the polymer chain originating from the active site is bonded to an X-type or T-type to form a three-dimensional structure.
  • a simple network structure (network structure). It is a feature of radiation crosslinking that it proceeds even at room temperature or below without using additives such as crosslinking agents, and is applied to gelation of materials, improvement of heat resistance, imparting shape memory, etc. You.
  • the hydrophilic polymer is the same as a known hydrophilic polymer. Specifically, it refers to a polymer having a hydrophilic group in the molecule.
  • hydrophilic group examples include a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, an ether group, an acyl group, and a sulfo group. That is, the hydrophilic polymer is a polymer having at least one, preferably two or more such hydrophilic groups in the molecule.
  • the molecular weight of the hydrophilic polymer is not particularly limited, and for example, a polymer in the range of 150 to 2,000,000 may be appropriately selected and used. Typically, a polymer in the range of 1,000 to 1,000,000 can be appropriately selected and used. In addition, if the polymers have the same composition, the elastic modulus of the hydrogel tends to increase as the molecular weight increases.
  • “molecular weight” means a weight average molecular weight unless otherwise specified. The weight average molecular weight may be measured by a conventionally known size exclusion chromatogram.
  • hydrophilic polymer examples include hydrophilic polymers derived from natural products such as proteins, peptides, polysaccharides, and nucleic acids, and derivatives thereof.
  • the term “derived from a natural product” means that it can be obtained by extracting or purifying from a natural product (earth resources, typically organisms such as animals, plants, and fungi), and is itself a natural product. It is not limited to this.
  • a synthetic protein artificially synthesized using an extract or purified product from a natural product as a raw material is included in the above-described hydrophilic polymer derived from a natural product (hereinafter, also referred to as a natural polymer).
  • the synthetic protein includes both proteins synthesized in a cell-based protein synthesis system and proteins synthesized in a cell-free protein synthesis system.
  • hydrophilic polymer derived from the natural product include, for example, dextrin, dextran, chitin, chitosan, agar, agarose, gellan gum, xanthan gum, karaya gum, carrageenan, cellulose, polysaccharides such as starch, collagen, gelatin, fibrin, Examples include proteins such as albumin, laminin, keratin, ovalbumin, myosin, globulin, and peptide, and nucleic acids such as DNA and RNA.
  • the hydrophilic polymer derived from the natural product only a single subtype may be used as a raw material of the hydrogel, or a plurality of different subtypes may be used as a raw material of the hydrogel.
  • subtypes of collagen such as type I collagen, type II collagen, type III collagen, type IV collagen, and type V collagen are known. Therefore, one or more of these subtypes of collagen can be used in combination.
  • Type I collagen is preferred in that it can be obtained relatively inexpensively because it is present in the largest amount in a living body.
  • type IV collagen is a collagen present in the basement membrane of skin, and is preferable because it can be obtained relatively easily.
  • the protein means a macromolecule in which a plurality of amino acids are bound by peptide bonds, and is not limited by the number of amino acids constituting the protein.
  • a peptide consisting of two or more amino acids is included.
  • a "peptide" when used, it means the macromolecule which consists of 2 or more and 2,000 or less amino acids.
  • the derivative of the hydrophilic polymer (natural polymer) derived from the natural product is not particularly limited.
  • the polymer derived from the natural product may be a lower alkyl group, a lower alkoxyalkyl group, or a hydroxy lower alkyl group. Substituted derivatives are mentioned.
  • a lower alkyl group-substituted cellulose derivative a lower alkoxyalkyl group-substituted cellulose derivative, a hydroxy lower alkyl group-substituted cellulose derivative, a lower alkoxyalkyl group-substituted chitosan derivative, a lower alkoxyalkyl group-substituted chitin derivative, a lower alkoxyalkyl group-substituted starch
  • Examples include natural polymer derivatives selected from the group consisting of derivatives and lower alkoxyalkyl group-substituted carrageenan derivatives.
  • the hydrophilic polymer may be an artificially synthesized synthetic polymer (synthetic resin).
  • synthetic resin synthetic polymers selected from the group consisting of polyethylene oxide, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyacrylamide, polymethacrylamide and polyethylene glycol.
  • a macromolecule having an artificially designed sequence may be included in the synthetic molecule.
  • artificial proteins including peptides
  • nucleic acids including peptides
  • polysaccharides having artificially designed sequences can be mentioned.
  • the hydrogel may be one in which only one of the hydrophilic polymers is cross-linked (bonded) to each other, or two or three or more hydrophilic polymers are cross-linked (bonded) to each other. It may be something.
  • an animal-derived hydrophilic polymer or It is preferable to select a derivative thereof, and more preferable is a hydrophilic polymer (hereinafter, also referred to as a biological polymer) or a derivative thereof obtained by extraction or purification from a living body (animal living body).
  • a hydrophilic polymer hereinafter, also referred to as a biological polymer
  • a derivative thereof obtained by extraction or purification from a living body animal living body.
  • a protein material with a low degree of purification extracted from a living body can be used as the hydrophilic polymer.
  • a mixture of a plurality of subtypes of collagen, or a mixture of a plurality of proteins such as collagen and laminin, or a mixture of different polymers such as proteins and polysaccharides and proteins and nucleic acids is used as a hydrogel for a cell culture scaffold. It can be used as a starting polymer.
  • a biocompatible hydrophilic polymer is used. It is preferable to select Such a biocompatible hydrophilic polymer includes, for example, the above-mentioned bio-derived polymer.
  • macromolecules mainly composed of proteins exemplified by gelatin and collagen can be decomposed and absorbed by enzymes such as collagenase and protease at the transplant destination (donor), they are used as raw materials for scaffold hydrogels for culturing transplant cells. Is preferred.
  • the elastic modulus (hereinafter sometimes referred to as “hardness” for convenience) is defined by a known method of measuring a stress-strain curve according to JIS K 6272 and the like. Is measured by That is, the hydrogel of the present invention contains a hydrogel having a compression modulus of 0.1 to 500 kPa. In the case of a hydrogel for a cell culture scaffold for mammalian cells, a hydrogel having a compression modulus of preferably 1 kPa to 200 kPa, more preferably 3 kPa to 60 kPa can be suitably used.
  • Cultured cells are cells separated from various tissues in a living body.
  • the elastic moduli of the tissues are different from each other, and it is known that the elasticity of the bone is GPa or more, the cartilage is MPa or more (for example, about 1 to 100 MPa), and the soft tissue is 0.1 to 500 kPa (for example, about 50 kPa).
  • the elasticity of the bone is GPa or more
  • the cartilage is MPa or more (for example, about 1 to 100 MPa)
  • the soft tissue is 0.1 to 500 kPa (for example, about 50 kPa).
  • the elasticity of the hydrogel serving as a scaffold can be selected according to the elasticity of the tissue from which the desired cell is separated.
  • the hydrogel of the present invention having a compression modulus of 0.1 to 500 kPa is suitable for culturing cells derived from soft tissues such as nerves and muscles.
  • the hydrogel for a cell culture scaffold of the present invention is a hydrogel in which the influence of a growth factor contained in a natural polymer substrate (hereinafter, may be exemplified by a protein) is reduced so that a stable cell culture result can be obtained. It is.
  • the effect of the growth factor can be quantitatively defined by using fibroblast growth factor-1 (FGF1) as a growth factor for evaluation.
  • FGF1 fibroblast growth factor-1
  • the hydrogel of the present invention has a cell growth activity of 100 pg / mL or less, preferably 50 pg / mL or less, more preferably 10 pg / mL or less in terms of FGF1 activity.
  • the effects of growth factors can be quantitatively defined by measuring the proliferation of the cells for evaluation.
  • the cell proliferation activity evaluated in a system using NIH-3T3 cells can be used as an index.
  • the proliferation activity does not have the growth factor activity (typically It can be less than 105% as compared to a hydrogel prepared using a hydrophilic polymer which has been confirmed in advance to contain no growth factor.
  • the absence of growth factor activity in the hydrophilic polymer can be confirmed by performing a purity test using, for example, a high performance liquid chromatograph mass spectrometer (LC-MS). In addition, it can be confirmed by a technique such as confirming the activity of a growth factor that may be contained by a reporter assay.
  • a polymer in which the activity of a growth factor that may be contaminated is deactivated by subjecting the hydrophilic polymer to an acidic (or alkaline) environment and performing a deactivation treatment such as heating under a high temperature condition. You can also.
  • type I collagen derived from bovine dermis extracted by acid treatment (Tri-D manufactured by Nippi Co., Ltd.) is known to have inactivated the growth factor activity by the acid treatment.
  • Collagen can be employed as a reference scaffold.
  • the proliferation activity may be measured using a cell proliferation measurement reagent (eg, Cell Counting Kit-8, manufactured by Dojindo Laboratories Inc.), or the number of cells before and after culture is measured and compared using a commercially available cell counter. Alternatively, the number of cells before and after culturing may be measured and compared under a microscope using a hemocytometer.
  • the cell culture time for evaluating the proliferation activity is not particularly limited, but may be, for example, a 28-hour culture (a 24-hour incubation followed by a 4-hour color reaction).
  • the number of cells can be estimated from an absorbance-cell number correlation graph (calibration curve) obtained in advance by measuring the absorbance at a predetermined wavelength by the absorption spectrophotometry.
  • a water-soluble tetrazolium salt for example, C 20 H 13 N 6 O 11 S 2 Na
  • the increase in cell number can be evaluated with good reproducibility.
  • This measurement may be performed using a commercially available measurement kit, Cell Counting Kit-8 (manufactured by Dojindo Laboratories Inc.).
  • Cell Counting Kit-8 manufactured by Dojindo Laboratories Inc.
  • any of a microplate reader, an absorbance meter, and a spectrophotometer can be used.
  • 3T3 cells are used as cells for evaluation, and 90 ⁇ L is seeded in a plurality of wells at a concentration of 5,000 cells / well, and pre-cultured for 24 hours (culture conditions). : 5% carbon dioxide atmosphere, 37 ° C).
  • Cell Counting Kit-8 composed of a water-soluble tetrazolium salt solution is added in an amount of 10 ⁇ L / well.
  • main culture is performed in an incubator for 4 hours to perform a color reaction (cultivation conditions: 5% carbon dioxide atmosphere, 37 ° C.).
  • the absorbance at 450 nm is measured with a microplate reader (incubation for a total of 28 hours).
  • a gel for example, a bovine dermis-derived type I collagen gel extracted by an acid treatment
  • a high-purity natural polymer containing no growth factor by a similar method was used as a reference sample.
  • the proliferation activity can be defined by dividing the absorbance of the sample incubated for a total of 28 hours by the absorbance of the reference sample and expressing the result as a percentage (%).
  • the hydrogel for a cell culture scaffold of the present invention is defined by such an evaluation method, and has a proliferation activity of less than 105% when incubated for 28 hours.
  • the proliferation activity of NIH-3T3 cells in a 28-hour incubation with Cell Counting Kit-8 was determined to be derived from bovine dermis derived by acid treatment. It is less than 105% as compared with type collagen gel.
  • the effect of the growth factor can be quantitatively defined by using fibroblast growth factor-1 (FGF1) as a growth factor for evaluation.
  • FGF1 fibroblast growth factor-1
  • a reference hydrogel in which a predetermined amount of FGF1 is added to a desired cell culture scaffold hydrogel is prepared, and compared with a calibration curve of a cell proliferation rate when cells are cultured in the reference hydrogel for a predetermined time.
  • the activity of the growth factor mixed into the target hydrogel for cell culture scaffold can be evaluated in terms of the amount of FGF1.
  • the activity of the growth factor contaminated in the hydrogel for the intended cell culture scaffold is converted to the amount of FGF1 by comparing the cell growth rate when the culture is performed with FGF1 added to the culture medium as a calibration curve. May be evaluated.
  • the hydrogel for a cell culture scaffold of the present invention has reduced effects of growth factors contained in a natural polymer as a substrate. Specifically, the cell growth activity is suppressed to a low activity of 100 pg / mL or less in terms of FGF1, and therefore, gene expression and differentiation state can be stably controlled. Preferably, if the proliferative activity value as defined above is kept as low as less than 105%, gene expression and differentiation state can be more stably controlled.
  • the hydrogel of the present invention has an elastic modulus suitable for desired cell culture and reduces the influence of a physiologically active factor (growth factor) contained in a hydrophilic polymer substrate.
  • a physiologically active factor growth factor
  • a hydrophilic polymer substrate When used as a culture scaffold, gene expression and differentiation status can be stably controlled.
  • the biologically active factor (growth factor) contained in the protein affects the culture result.
  • the hydrogel of the present invention has a reduced effect of a biologically-derived bioactive factor (growth factor) even when the above protein is used as a hydrophilic polymer.
  • irregularities having a desired shape may be formed on the cell culture surface of the hydrogel.
  • it may have a parallel groove, a concave portion (such as a substantially circular concave portion), and a combination thereof.
  • the groove that forms the parallel groove may be a straight line or a dotted line.
  • the interval between the parallel grooves is arbitrary, it is preferably 0.5 to 1000 ⁇ m.
  • the spacing between the parallel grooves may be constant or variable.
  • the depth of the parallel groove recess is arbitrary, a depth of 0.5 to 500 ⁇ m can be suitably used.
  • the concave portion may have any shape, for example, a dot shape.
  • it may have a substantially circular shape (typically a circle) having a diameter of 10 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • a plurality of cells for example, a cell population, a colony, and a fertilized egg
  • a concave portion having a diameter of 10 to 100 ⁇ m may be formed.
  • the diameter of the recess in this range, the number of cells that can be captured by the recess can be limited.
  • a concave portion having a diameter of 20 to 30 ⁇ m may be formed.
  • the culture scaffold having such a concave portion is used for the purpose of isolating, holding and culturing about 1 to 10 cells (typically, 1 to 3 cells, preferably 1 cell) on average per one concave section. On the other hand, it can be suitably used.
  • the hydrogel of the present invention is suitable for cell mass (spheroid, sphere) culture.
  • the hydrogel of the present invention can be provided with a concave portion having a size corresponding to the diameter of the cell mass, for example, 50 to 1000 ⁇ m, 100 to 800 ⁇ m, 10 to 200 ⁇ m, A recess of 20 to 100 ⁇ m may be provided.
  • the depth of the concave portion the deepest distance from the hydrogel surface may be 10 to 1000 ⁇ m.
  • the hydrogel may be provided with one recess or a plurality (for example, 2 to 10000). When a plurality of recesses are provided, the longest distance between adjacent recesses may be 10 to 10000 ⁇ m.
  • the elastic modulus of the hydrogel may be non-uniform.
  • it can be set to be non-uniform in the thickness direction.
  • it may be set to be constituted by a plurality of hydrogel layers having different elastic moduli, or set so that the elastic force of the cell culture surface is set low and the elastic force is increased in the depth direction (thickness direction).
  • a gradient gel may be used.
  • the elastic modulus may be set so as to be non-uniform in the horizontal direction.
  • a portion having a different elastic modulus from the surroundings may be provided, or a gradient gel set so that the elastic modulus gradually decreases in a specific direction.
  • a gradient gel set so that the elastic modulus gradually decreases in a specific direction.
  • the hydrogel of the present invention may be a gel containing a higher concentration of a polymer than before.
  • the polymer may contain 1% by mass or more and 30% by mass or less based on the hydrogel.
  • the hydrogel of the present invention may contain one or more selected from the group consisting of collagen, gelatin, and collagen peptide in an amount of 1% by mass to 30% by mass.
  • the concentration is higher than the concentration contained in general neutralized collagen or a hydrogel (such as Matrigel) derived from a commercially available biological extract.
  • a hydrogel containing such a high concentration of a polymer can be obtained by irradiation.
  • the hydrogel containing a polymer having the above concentration can be obtained by irradiating a solution of each polymer, whose concentration is appropriately adjusted, with air if necessary.
  • the conditions of the method for producing a hydrogel those described in the following [(4) Method for producing hydrogel for cell culture] can be adopted.
  • the present invention also includes a hydrogel for post-adding a physiologically active factor separate from the hydrogel.
  • the bioactive factor added to the hydrogel later include a cell growth factor, a differentiation inducing factor, an adhesion factor, a chemotactic factor, an extracellular matrix, and the like, and one or more selected from these may be added.
  • the cell growth factor added later to the hydrogel of the present invention is not particularly limited, and includes any components used for cell culture and the like. Such components include hepatocyte growth factor, platelet-derived growth factor, granulocyte colony stimulating factor, epidermal growth factor, vascular endothelial cell growth factor, basic fibroblast growth factor, insulin growth factor, transforming growth factor, Nerve growth factor, bone morphogenetic factor, and the like.
  • the differentiation-inducing factor added later to the hydrogel of the present invention is not particularly limited, and includes any components used for cell culture and the like. Such components include Activin, TGF ⁇ 2, HGF (Hepatocyte growth factor), Dex (Dexamethasone), Rac1 (RAS-related C3 botulinus toxin substrate 1), Zfpfin (, Zfp52152in, and the like.
  • the adhesion factor added later to the hydrogel of the present invention is not particularly limited, and includes any components used for cell culture and the like. Such components include integrins, nephronectin, laminin, fibronectin, tenascin, fibulin, EMILIN, QBRICK, osteopontin, polydom, MAEG, fibronogen and the like.
  • the chemotactic factor added later to the hydrogel of the present invention is not particularly limited, and includes any components used for cell culture and the like. Such components include CCL21, fMLP, leukotriene B4, IL-8, C5a, leukotriene B4 (LTB4), platelet activating factor (PAF), and the like.
  • the extracellular matrix to be added later is not particularly limited, and includes any components used for cell culture and the like. Such components include collagen, laminin, fibronectin, elastin, polysaccharides, and the like.
  • the amount of the physiologically active factor (cell growth factor, differentiation inducing factor, adhesion factor, chemotactic factor, extracellular matrix, etc.) to be added to the hydrogel of the present invention is not particularly limited. It is appropriately selected according to the conditions.
  • the present invention also includes a hydrogel in which one or more factors selected from the group consisting of a differentiation-inducing factor, an adhesion factor, a chemotactic factor, and an extracellular matrix are added to the hydrogel of the present invention.
  • a differentiation-inducing factor selected from the group consisting of a differentiation-inducing factor, an adhesion factor, a chemotactic factor, and an extracellular matrix.
  • These differentiation inducing factors, adhesion factors, chemotactic factors, and extracellular matrix may be appropriately selected and blended from those exemplified as bioactive factors to be added later.
  • the present invention also includes a gel kit containing the hydrogel of the present invention and a physiologically active factor separate from the hydrogel (for example, a cell growth factor and / or an extracellular matrix).
  • a physiologically active factor for example, cell growth factor and / or an extracellular matrix.
  • the bioactive factors contained in these gel kits include cell growth factors, differentiation inducing factors, adhesion factors, chemotactic factors, extracellular matrices, and the like, and may be one or more selected from these.
  • ⁇ Cell growth factors that can be included in the gel kit of the present invention are not particularly limited, and include any components used for cell culture and the like. Such components include hepatocyte growth factor, platelet-derived growth factor, granulocyte colony stimulating factor, epidermal growth factor, vascular endothelial cell growth factor, basic fibroblast growth factor, insulin growth factor, transforming growth factor, Nerve growth factor, bone morphogenetic factor, and the like.
  • the differentiation inducing factors that can be included in the gel kit of the present invention are not particularly limited, and include any components used for cell culture and the like. Such components include Activin, TGF ⁇ 2, HGF (Hepatocyte growth factor), Dex (Dexamethasone), Rac1 (RAS-related C3 botulinus toxin substrate 1), Zfpfin (, Zfp52152in, and the like.
  • Adhesion factors that can be included in the gel kit of the present invention are not particularly limited, and include any components used for cell culture and the like. Such components include integrins, nephronectin, laminin, fibronectin, tenascin, fibulin, EMILIN, QBRICK, osteopontin, polydom, MAEG, fibronogen and the like.
  • the chemotactic factors that can be included in the gel kit of the present invention are not particularly limited, and include any components used for cell culture and the like. Such components include CCL21, fMLP, leukotriene B4, IL-8, C5a, leukotriene B4 (LTB4), platelet activating factor (PAF), and the like.
  • the extracellular matrix that can be included in the gel kit of the present invention is not particularly limited, and includes any components used for cell culture and the like. Such components include collagen, laminin, fibronectin, elastin, polysaccharides, and the like.
  • the mass ratio of the hydrogel of the present invention to a physiologically active factor (for example, cell growth factor and / or extracellular matrix) separate from the hydrogel is not particularly limited, and the use of the gel kit is not limited. It is appropriately selected according to the conditions.
  • the method of using the gel kit of the present invention is not particularly limited, but a physiologically active factor (for example, a cell growth factor and / or extracellular matrix) separate from the hydrogel is added to the hydrogel of the present invention at a desired timing. Thereafter, it can be used for production of a cell culture described below, and the like.
  • a physiologically active factor for example, a cell growth factor and / or extracellular matrix
  • the method of addition is appropriately selected according to the use of the gel kit, the type of the physiologically active factor (for example, cell growth factor and extracellular matrix), and the like.
  • the method for producing a cell culture of the present invention is a method for culturing cells by bringing the cells to be cultured into contact with the hydrogel of the present invention as a scaffold.
  • the hydrogel of the present invention it is preferable to select and use a hydrogel having an elastic modulus and / or surface shape corresponding to a desired gene expression or differentiation state as the hydrogel.
  • the gene expression may be expression of a gene involved in cell differentiation, or gene expression involved in cell growth.
  • the “elastic modulus and / or surface shape corresponding to the desired gene expression or differentiation state” is appropriately selected according to the type of gene to be expressed.
  • the gene to be expressed is the melamine gene
  • preferable elastic modulus and surface shape of the gel according to the cells used for gene expression are as follows.
  • the elastic modulus of the hydrogel is preferably 5 to 48 kPa, and the surface shape is preferably flat.
  • the elastic modulus of the hydrogel is preferably 1 kPa to 30 kPa (more preferably, about 5 kPa), and the surface shape is flat. Is preferred.
  • the elastic modulus of the hydrogel is preferably about 30 kPa to 500 kPa (more preferably about 48 kPa), The surface shape is preferably flat.
  • the elastic modulus of the hydrogel is preferably about 5 kPa to 500 kPa or more (more preferably 5 kPa to 48 kPa), and the surface shape is a parallel groove (preferably, a line-shaped unevenness having a groove width of 1 ⁇ m to 10 ⁇ m, more preferably). Preferably have a line-shaped unevenness with a groove width of 5 ⁇ m).
  • Cells to be cultured on the scaffold hydrogel are not particularly limited, and desired cells can be selected.
  • desired cells can be selected.
  • cells derived from humans, cells derived from mammals other than human, cells derived from animals other than mammals, cells derived from plants, and the like are exemplified.
  • Such cells may be cell lines (cell lines) or primary cultured cells, or may be transfected cells into which a predetermined gene has been introduced.
  • the hydrogel for a cell culture scaffold of the present invention can be suitably applied to the production or differentiation induction of pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells.
  • cells are not limited to a state in which single cells exist independently of each other, but include a cell population (eg, cell cluster, tissue) in which a plurality of cells are aggregated. That is, the hydrogel of the present invention can be used as a culture scaffold for various cultures such as colony culture, cell mass (spheroid, sphere) culture, and tissue culture.
  • a cell population eg, cell cluster, tissue
  • the hydrogel of the present invention can be used as a culture scaffold for various cultures such as colony culture, cell mass (spheroid, sphere) culture, and tissue culture.
  • cells of various animals and plants for example, melanin-producing cells, phagocytes derived from peritoneal cavity, cardiomyocytes, nerve cells, liver cells, kidney cells, pancreatic cells, stem cells, antibody-producing cells, osteoclasts Culturing epithelial cells, fibroblasts, breast cancer cells, mammary gland cancer cells, brain tumor cells, uterine cancer cells, cervical cancer cells, pancreatic cancer cells, myoblast cells, various stem cells (such as ES cells) Can be.
  • the cells to be cultured may include tissue fragments and the like.
  • differentiation is not promoted by using a hydrogel having an elastic modulus of about 16 kPa (typically about 13 to 19 kPa) as a scaffold, While undifferentiated, the cells proliferate and can be produced as undifferentiated cells.
  • a hydrogel having an elastic modulus of about 1 to 16 kPa as a scaffold the cells proliferate three-dimensionally and a cell mass (spheroid, Sphere) can be manufactured.
  • the environment for culturing the cells may be a known environmental condition, for example, culturing in an atmosphere of 5% CO 2 and 37 ° C.
  • a known CO 2 incubator can be used as a culture device (environmental device).
  • the cultured cell culture can be separated from the scaffold by a known method.
  • the present invention is a hydrogel for cell culture scaffold for culturing melanin-producing cells, a hydrogel for culturing undifferentiated phagocytes derived from the abdominal cavity, a hydrogel for culturing cardiomyocytes, and a hydrogel for culturing osteoclasts.
  • Hydrogel hydrogel, hydrogel for epithelial cell culture, hydrogel for fibroblast cell culture, hydrogel for breast cancer cell culture, hydrogel for breast cancer cell culture, hydrogel for brain tumor cell culture, uterine cancer culture Hydrogel for pancreatic cancer cell culture, Hydrogel for iPS cell culture, Hydrogel for ES cell culture, Hydrogel for MUSE cell culture, Hydrogel for stem cell culture, Nerve cell culture , A hydrogel for culturing blood cells, and a hydrogel for culturing myoblasts.
  • the precursor of the hydrogel for cell culture scaffold of the present invention is an aqueous solution containing 0.1 to 70% by mass of a hydrophilic polymer, for example, a protein.
  • concentration of the hydrophilic polymer in the precursor is not particularly limited, but irradiation of a high-concentration precursor with radiation increases the ratio of radiation cross-linking generated per unit volume, and therefore, a high elasticity hydro- Gels tend to have low moisture content. Therefore, the concentration of the hydrophilic polymer in the precursor can be determined from the required elastic modulus and water content.
  • the precursor of the hydrogel may include a bioactive factor such as a growth factor. That is, even if a physiologically active factor is contained in an aqueous solution as a precursor of the hydrogel, a hydrogel with reduced activity of the factor can be provided by the action of radiation.
  • a bioactive factor such as a growth factor
  • hydrophilic polymer a polymer derived from a natural product (a natural polymer, typically a biopolymer) may be used.
  • the natural polymer is as defined above. Examples include collagen, which is often contained in the extracellular matrix of multicellular animals, and gelatin and collagen peptides obtained by thermally denaturing collagen.
  • the natural product-derived polymer may include a bioactive factor (growth factor) derived from a living body.
  • a hydrophilic polymer derived from a living body particularly a protein separated from a living body, may contain a physiologically active factor (growth factor).
  • growth factor remains in a certain amount even after the precursor is crosslinked to form a hydrogel, and in cell culture using the hydrogel as a scaffold, the cell culture results including the gene expression and the state of differentiation of the cultured cells are not affected. It is an element that stabilizes or inhibits. Therefore, it is preferable that the substrate be a polymer (eg, protein) having a small growth factor, in other words, a high purity.
  • a polymer eg, protein
  • the growth factors include basic fibroblast growth factor (bFGF or FGF2), epidermal growth factor (Epidermal growth factor), and insulin-like growth factor (basic fibroblast growth factor: bFGF or FGF2), which promote cell proliferation and differentiation.
  • IGF insulin-like growth factor
  • TGF transforming growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • GFFactor platelet-derived growth factor
  • GFFact platelet-derived growth factor
  • BMP bone morphogenic protein
  • HGF hepatocyte growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • the natural polymer contains a certain amount of growth factor by appropriately performing the irradiation step described below and the activity reduction process (typically, the pH adjustment process) of the physiologically active factor on the hydrogel precursor.
  • the activity reduction process typically, the pH adjustment process
  • the precursor in cell culture using a hydrogel as a scaffold, gene expression of the cultured cells is stably performed.
  • the precursor has a proliferation equivalent to that of fibroblast growth factor of 0 to 1000 ng / mL when converted to fibroblast growth factor.
  • Active growth factors can be included.
  • 0-500 ng / mL of a growth factor having a proliferative activity comparable to that of fibroblast growth factor may be included.
  • a growth factor having a proliferative activity equivalent to that of fibroblast growth factor of 0 to 100 ng / mL can be contained.
  • 0 to 10 ng / mL of a growth factor having a growth activity comparable to that of fibroblast growth factor may be contained.
  • increasing the radiation dose can increase the amount of acceptable growth factors. Therefore, when presumed to be irradiated with a dose of more than 5 kGy, the precursor has the same proliferative activity as fibroblast growth factor of more than 1000 ng / mL when converted to fibroblast growth factor. Growth factors can be included.
  • the method for producing a hydrogel for cell culture (hydrogel for cell culture scaffold) of the present invention comprises a step of irradiating the above-mentioned precursor with radiation at a dose of 1 to 1000 kGy.
  • a method for producing a hydrogel for a cell culture scaffold comprising: According to the production method, the hydrogel of the present invention can be preferably produced.
  • radiation is a concept including an electromagnetic wave having a shorter wavelength than ultraviolet light, an electron beam, and an ion beam, and the electromagnetic wave includes X-rays and gamma rays.
  • Known radiation generators can be used as the radiation irradiator.
  • the precursor is continuously or intermittently irradiated with radiation at a dose of 1 to 1000 kGy using a radiation irradiation apparatus.
  • the lower limit of the dose may be 2 kGy or more, 5 kGy or more, 10 kGy or more, 100 kGy or more, 500 kGy or more, and the upper limit of the dose may be 500 kGy or less, 300 kGy or less, 200 kGy or less, 100 kGy or less.
  • irradiation with a dose of 5-200 kGy can be preferably used.
  • the dose is obtained by time-integrating the dose of radiation per unit time, and can be measured by a dosimeter sold for each radiation.
  • the irradiation energy is desirably set to about 100 keV to about 10 MeV.
  • Irradiation of the precursor partially cleaves the hydrophilic macromolecule (eg, protein) to generate radicals, and a cross-linking reaction generates a gel containing water (hydrogel). Generation).
  • the crosslinking reaction is immediately stopped.
  • the crosslink density during the reaction depends on the radiation dose to be irradiated, and as a result, the elastic modulus of the gel also depends on the radiation dose.
  • FIG. 1 shows an example in which gamma ray dose and elastic modulus of a crosslinked hydrogel were examined for gelatin derived from cattle and gelatin derived from pig. Although the tendency is slightly different depending on the type of gelatin, it can be seen that the dose and the elastic modulus are in a substantially linear relationship between the gamma ray doses of 0 to 100 kGy. In other words, the radiation dose can be determined according to the required elastic modulus of the hydrogel.
  • the ambient temperature is 4 to 50 ° C. and the concentration of dissolved oxygen in the precursor is 0 to 40 mg / L.
  • the ambient temperature at the time of the radiation irradiation may be appropriately set according to the properties of the hydrophilic polymer. For example, when collagen is used, radiation can be efficiently cross-linked by irradiating radiation at a low temperature of about 4 to 25 ° C. When gelatin is used, radiation is irradiated at a temperature of 10 to 30 ° C. By doing so, radiation crosslinking can be performed efficiently. Further, the dissolved oxygen of the precursor in irradiation has an effect of capturing radicals.
  • the crosslink density is reduced, and as a result, the elastic modulus of the hydrogel can be reduced.
  • a specific method for example, irradiating radiation in an environment where the oxygen concentration is high, leaving the precursor under a high oxygen concentration, bubbling oxygen to the precursor, and the like, by a method such as The dissolved oxygen concentration can be increased.
  • the crosslink density is increased, and as a result, the elastic modulus of the hydrogel can be increased.
  • the concentration of dissolved oxygen in the precursor can be reduced by irradiating radiation in a nitrogen environment or bubbling nitrogen into the precursor.
  • the dissolved oxygen concentration can be changed between the surface in contact with oxygen (typically, the cell culture surface) and other parts. it can.
  • oxygen typically, the cell culture surface
  • the base portion can have a high elastic modulus and only the surface to be used for cell culture can have a low elastic modulus.
  • the method for producing a hydrogel for a cell culture scaffold includes a step of irradiating radiation (dose of 1 to 1000 kGy).
  • the hydrophilic polymer is cross-linked by irradiation with a predetermined radiation to impart a predetermined elastic modulus.
  • the high energy of the radiation also acts on the growth factor in the hydrogel precursor, so that the activity of the growth factor can be reduced. That is, the irradiation of the radiation exhibits both the effect of crosslinking the hydrophilic polymer and the effect of reducing the activity of the physiologically active factor. Therefore, the scaffold hydrogel can be provided by a simple method.
  • the production method of producing a scaffold hydrogel by irradiation is particularly suitable when the activity of the bioactive factor contained in the precursor is relatively low. Furthermore, the above-mentioned irradiation is excellent from the viewpoint that the hydrogel for a cell culture scaffold can be sterilized (sterilized).
  • the method for producing a hydrogel for a cell culture scaffold may further include a treatment for reducing the activity of a physiologically active factor (for example, a growth factor).
  • a physiologically active factor for example, a growth factor
  • the activity of a physiologically active factor (for example, a growth factor) in the hydrogel can be reduced by performing a pH adjusting process (pH adjusting step) on the hydrogel crosslinked by irradiation with radiation. After the irradiation, by adjusting the pH to 6 to 8 using a basic solution or a buffer solution, it can be used as a scaffold for cell culture in which the activity of the bioactive factor is reduced.
  • a medium As a basic solution or a buffer solution that can be used in the pH adjustment step after irradiation, various commercially available buffer solutions (for example, PBS), a medium, or water can be selected.
  • the medium may contain phenolsulfonephthalein (phenol red).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • ⁇ -MEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • GMEM Glasgow Minimum Essential Medium
  • I Iskov's Modified Dulbecco's Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (Fam-12), RPMI-1640 and the like can be used.
  • the temperature condition of the pH adjustment step after irradiation is not particularly limited, but may be preferably 4 to 60 ° C, more preferably 32 to 38 ° C.
  • Heat treatment may be performed as the treatment for reducing the activity of the physiologically active factor. Exposure of a bioactive factor to a high temperature environment can irreversibly inactivate its activity. This heat treatment may be performed at any timing before performing the radiation irradiation step or after the radiation irradiation step. For example, by performing a heat treatment on the precursor before irradiation, the activity of the physiologically active factor in the precursor can be reduced. Although not particularly limited, heating may be performed at 50 ° C. or more for 1 minute or more. The upper limit of the heating temperature is not particularly limited, but may be, for example, 60 ° C. or less, and the upper limit of the heating time may be 5 minutes or less.
  • an acid treatment for adjusting the pH of the precursor to pH 5 or lower (preferably pH 4 or lower) or an alkali treatment for adjusting the pH to 8 or higher (preferably pH 9 or higher) is performed prior to the irradiation. May be applied.
  • the bioactive factor can be irreversibly inactivated when exposed to an acid environment or an alkali environment. That is, by performing such an acid treatment or an alkali treatment, the activity of the physiologically active factor in the precursor can be reduced.
  • the method for reducing the activity of these physiologically active factors may be appropriately selected according to the properties of the hydrophilic polymer.
  • a method of heat-treating the precursor can be suitably employed.
  • a process of dissolving gelatin in an aqueous solution and a process of reducing the activity of a physiologically active factor can be simultaneously realized, and a hydrogel for a cell culture scaffold can be easily produced.
  • collagen is selected as the hydrophilic polymer, it is preferable to subject the hydrogel obtained by irradiation to pH adjustment.
  • a growth factor activity reduction treatment for example, a pH adjustment treatment or a heat treatment
  • a heat treatment of the precursor before the irradiation rather than a heat treatment of the precursor before the irradiation.
  • a preferred embodiment of the method for producing a hydrogel for a cell culture scaffold comprises a step of irradiating radiation and a step of reducing the activity of a bioactive factor.
  • the hydrogel production method of the present invention having both a radiation irradiation step and a step of reducing the activity of a physiologically active factor exhibits an effect more than the sum of the growth factor reduction actions of the two steps. That is, when the activity of the growth factor is to be reduced to a predetermined level or less only by irradiation, the elasticity required for the hydrogel may be exceeded by irradiation. In other words, since the decrease in the activity of the growth factor acts in the direction of increasing the radiation dose, it becomes an obstacle when trying to obtain a gel having a small elastic modulus of about several kPa, for example, for culturing nerve cells. .
  • the pH adjustment is preferable in that the pH of the cell culture scaffold can be adjusted to the optimum pH for cell culture.
  • only one kind of the activity reducing treatment of the physiologically active factor may be adopted, or two or more kinds of treatments may be performed in combination.
  • the precursor can include a growth factor at 0-1000 ng / mL. This eliminates the need to use a highly purified raw material as the hydrophilic polymer, and allows the use of a generally available hydrophilic polymer (eg, protein), which allows a wider range of materials to be selected and Cost can also be reduced.
  • a surface processing step of processing the shape of the hydrogel surface may be added.
  • a method of pressing a mold having a predetermined shape against the hydrogel precursor is exemplified. Since the hydrogel precursor of the present invention has a relatively low modulus of elasticity, the shape of the mold can be transferred to the hydrogel by irradiating the mold while pressing the mold.
  • the surface shape of the mold may be a shape corresponding to the shape of the desired cell culture surface of the hydrogel. For example, a mold having parallel grooves at predetermined intervals and a mold having convex portions at predetermined sizes and intervals are exemplified.
  • concave portion in which the convex portion of the mold is transferred to the hydrogel can exert an effect of serving as a microwell for isolating and holding predetermined cells in cell culture.
  • the material of the mold is not particularly limited as long as it is a water-insoluble material, and silicon, glass, synthetic resin, or the like can be used. Since the mold is peeled off after being pressed, a flexible mold is preferable, and a synthetic resin is desirable.
  • the groove that forms the parallel groove may be a straight line or a dotted line. Although the interval between the parallel grooves is arbitrary, it is preferably 0.5 to 1000 ⁇ m. The spacing between the parallel grooves may be constant or variable. Although the depth of the parallel groove is arbitrary, a depth of 0.5 to 500 ⁇ m can be suitably used.
  • the convex portion may have any shape, for example, a dot shape. For example, it may have a substantially circular shape (typically a circle) having a diameter of 10 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • a concave portion having a diameter of 10 ⁇ m to 1000 ⁇ m can be formed.
  • a plurality of cells for example, a cell population, a colony, and a fertilized egg
  • a convex portion having a diameter of 10 ⁇ m to 100 ⁇ m may be transferred to form a concave portion having a diameter of 10 to 100 ⁇ m.
  • the number of cells that can be captured by the recess can be limited.
  • a projection having a diameter of 20 to 30 ⁇ m may be transferred to form a depression having a diameter of 20 to 30 ⁇ m.
  • the culture scaffold having such a concave portion is used for the purpose of isolating, holding and culturing about 1 to 10 cells (typically, 1 to 3 cells, preferably 1 cell) on average per one concave section. On the other hand, it can be suitably used.
  • the sample under the following conditions is irradiated with gamma rays. Then, the pH is adjusted.
  • hydrophilic polymer (collagen): 600,000 or less (eg, 200,000 to 600,000, preferably 400,000 to 500,000) Concentration of hydrophilic polymer (collagen) solution: 0.1 to 5.0% by mass Dissolved oxygen concentration: 0 to 8 mg / L
  • Gamma ray dose 1 to 100 kGy (preferably 2 to 50 kGy)
  • Solution temperature at the time of gamma ray irradiation is 4 to 37 ° C (preferably 4 to 25 ° C)
  • pH adjustment treatment DMEM medium at 37 ° C. for 10 to 180 minutes.
  • melanin-producing cells phagocytes derived from the peritoneal cavity, cardiomyocytes, osteoclasts, epithelial cells, fibroblasts, cardiomyocytes, breast cancer cells, breast cancer cells, brain tumor cells, uterine cancer cells
  • a hydrogel gelatin gel having an elastic modulus of 1 to 200 kPa for culturing cervical cancer cells, pancreatic cancer cells, and myoblasts
  • a sample under the following conditions is prepared. Gamma irradiation is selected.
  • hydrophilic polymer 200,000 or less (eg, 100,000-170,000)
  • Concentration of hydrophilic polymer (gelatin) solution 0.1 to 70% by mass
  • Dissolved oxygen concentration 0 to 8 mg / L
  • Gamma ray dose 1 to 300 kGy (preferably 2 to 200 kGy)
  • the solution temperature during gamma ray irradiation is 4 to 37 ° C (preferably 10 to 30 ° C).
  • pH adjustment treatment DMEM medium, 50 ° C. for 10 to 180 minutes.
  • a physiologically active factor As described above in [Gel kit containing hydrogel of the present invention], by adding a physiologically active factor to the hydrogel of the present invention, a desired action according to the added component can be imparted to the hydrogel. Therefore, a step of adding a bioactive factor may be performed after the irradiation step. Details of the added physiologically active factor (for example, cell growth factor and extracellular matrix) are the same as those described in the above [Gel kit containing hydrogel of the present invention].
  • pH adjustment process performed on the gel that has not been irradiated is also referred to as “neutralization pH adjustment process”, and the pH adjustment process performed on the gel after irradiation is also referred to as “post-irradiation pH adjustment process”. .
  • a high-purity bovine dermis-derived type I collagen solution (collagen gel cell culture kit Tri-D manufactured by Nippi Co., Ltd .; the same applies hereinafter) was applied to fibroblast growth factor-1 (FGF1, R & D Systems Inc., 232) as a growth factor. -FA-025 / CF) at 0, 30, 300, and 3000 ng / mL.
  • 100 ⁇ L of the obtained mixture was put into a glass base dish, and immediately heated to 37 ° C. in a CO 2 incubator to fibrillate collagen.
  • a neutralized collagen gel containing 0, 10, 100, and 1000 ng / mL of FGF1 as a protein containing a growth factor was obtained.
  • Each neutralized collagen gel was stained with an FGF1 antibody (Santa Cruz Biotechnology, sc-55520) and a secondary antibody (Invitrogen, A32723), and observed under fluorescence under the same conditions to obtain neutralized collagen having different FGF1 contents.
  • the relationship between the gel and the fluorescence intensity, that is, the calibration curve was obtained.
  • a neutralized collagen gel containing 1000 ng / mL of FGF1 was irradiated with 1 kGy of gamma rays (corresponding to gel 1-1), and a neutralized collagen gel containing 1000 ng / mL of FGF1 was irradiated with 1 kGy of gamma rays and then PBS. Products adjusted to have a pH of 7.4 at 37 ° C. or higher (corresponding to Gel 1-2) were obtained. Immunostaining was performed on these gels in the same manner as described above, and the fluorescence intensity was measured.
  • FIG. 9 shows the measurement results of the fluorescence intensity after the immunostaining.
  • the higher the value of the fluorescence intensity the higher the FGF1 concentration in the gel.
  • the FGF1 concentration was reduced in all the gels.
  • the fluorescence intensity of gel 1-2 was lower than gel 1-1, and lower than the detection limit (200 ng / mL). From these facts, it can be seen that the FGF1 concentration can be further reduced by adjusting the pH after irradiation, and even if the raw material contains FGF1 at a concentration as high as 1000 ng / mL, the amount can be reduced to below the detection limit. all right.
  • a high-purity bovine dermis-derived type I collagen solution was prepared as a high-purity collagen solution, and FGF1 was added to each of 0, 10, and 100 ng / mL. 10 ⁇ L of this was placed in a 96-well microplate, 5 ⁇ L of a colorless DMEM medium was added, the temperature was raised to 37 ° C. in a CO 2 incubator, and the pH was adjusted to 7.1 to 7.5. As a result, the collagen in the collagen solution became fibrous, and a neutralized collagen gel was obtained.
  • the neutralized collagen gel corresponds to a protein containing a growth factor that has been subjected to a neutralization pH adjustment treatment.
  • FIG. 2 shows a change in absorbance depending on the concentration of FGF1, that is, a change in proliferation activity, where FGF1 was not added, as 100%. Proliferation activity increases with increasing FGF1 concentration, indicating that 3T3 cells are affected by growth factors. This result indicates that when a biological material containing one or more known or unknown growth factors is used as a culture substrate, the cell culture is affected by the growth factors. In addition, it shows that the suppression of growth factors is not sufficient with the pH adjustment treatment using 5 ⁇ L of DMEM medium.
  • Fibroblast growth factor FGF1 was added to a colorless DMEM solution containing 10% fetal bovine serum (FBS) at a concentration of 0, 1, and 10 ng / mL, gamma-irradiated at 5 kGy, and then 10 ⁇ L was added to a 96-well microplate. 3T3 cells were further seeded at a concentration of 5,000 cells / well at 90 ⁇ L. After culturing for 24 hours, 10 ⁇ L / well of Cell Counting Kit-8 was added, and then a color reaction was performed in an incubator for 4 hours, and the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader.
  • FGF1 Fibroblast growth factor
  • FIG. 3 shows a change in absorbance depending on the concentration of FGF1, that is, a change in proliferation activity, where FGF1 was not added, as 100%. Proliferation activity increases with increasing FGF1 concentration, indicating that 3T3 cells are affected by growth factors. This result shows that even when gamma rays are irradiated to a biological material containing one or more known or unknown growth factors for the culture substrate, the cells are affected by the substrate-derived growth factors, and the culture results are stable. Indicates that it will not. In addition, it is shown that the suppression of the growth factor is insufficient with the gamma ray irradiation treatment of 5 kGy.
  • Example 1 Evaluation of proliferation activity of 3T3 cells when a protein containing a growth factor was used as a scaffold material (influence of irradiation treatment and post-irradiation pH adjustment treatment) Using a protein containing a growth factor as a precursor, irradiating with gamma rays, producing a hydrogel, and adjusting the pH at 37 ° C. or higher as a scaffold, culturing 3T3 cells, which are fibroblasts derived from mouse fetal skin, Proliferative activity was evaluated.
  • FGF1 was added at a concentration of 0, 10, or 100 ng / mL, added to a 96-well microplate at 10 ⁇ L each, irradiated with 5 kGy of gamma rays, and added with a colorless DMEM medium.
  • a pH adjustment treatment (a pH adjustment treatment after irradiation) was performed so that the pH was 7.1 to 7.5 at ° C.
  • FIG. 4 shows the change in the absorbance depending on the concentration of FGF1, that is, the change in the proliferative activity, assuming that FGF1 was not added as 100%.
  • the proliferative activity was less than 105% regardless of the concentration of FGF1, indicating that 3T3 cells were not affected by growth factors.
  • This result is obtained by irradiating gamma rays to a biological material containing one or more known or unknown growth factors, performing pH adjustment treatment at 37 ° C. or more, and then using it for culture, that is, the hydrogel obtained by the present invention. This shows that when was used as a culture substrate, the cultured cells were not affected by the growth factors contained in the substrate, and the culture results were stable.
  • Example 2 Culture of phagocytes derived from mouse peritoneal cavity on hydrogel scaffold The growth of phagocytes derived from mouse peritoneal cavity seeded and cultured on the hydrogel scaffold was directly observed by an optical microscope. The state of phagocyte proliferation was observed from the obtained images.
  • Porcine gelatin (10 wt%) was added to 1 L of distilled water, and the mixture was sufficiently stirred at 50 ° C. to obtain an aqueous gelatin solution. Further, this solution was transferred to a 35 mm dish, and after physical gelation and air saturation at a temperature of 20 ° C., gamma rays were irradiated at a temperature of 25 ° C., a dose rate of 10 kGy / h, and a dose of 20 kGy. The resulting crosslinked gelatin hydrogel was confirmed to have an elastic modulus of 16 kPa from a stress-strain curve obtained by a compression test.
  • mice peritoneal phagocytic cell population was obtained by administering a thioglycolate medium into the mouse peritoneal cavity, and culturing peritoneal exudate cells collected from the mice four days later in an RPMI medium containing 10% FCS in a polystyrene dish. Then, the cells adhered to the petri dish were collected, cultured for further 7 days, and then peeled off from the petri dish using trypsin.
  • FIG. 5 shows the obtained microscope image.
  • most cells in the phagocyte population differentiate, spread on the dish surface, adhere firmly, and lose their proliferative ability. Lose. Spherical cells scattered on the surface of the spread cells are poorly differentiated cells having high proliferative ability and suitable for transplantation, but the number obtained is small (FIG. 5 (a)).
  • the phagocyte population is cultured on a crosslinked gelatin having an elastic modulus of 16 kPa, only a small part of the cells adhere to the surface and elongate (FIG. 5 (b), elongated linear cells).
  • FIG. 5 shows the obtained microscope image.
  • the hydrogels of the present invention have been shown to be capable of expanding poorly differentiated or undifferentiated cell populations and are closely related to the preparation of cell sources in regenerative medicine.
  • Example 3 Culture of melanoma cells on a hydrogel scaffold The proliferation of melanoma cells seeded and cultured on the hydrogel scaffold and coloring due to melanin production were directly observed with an optical microscope. Further, the amount of melanin production was measured by absorbance.
  • Porcine gelatin (10 wt%) was added to 1 L of distilled water, and the mixture was sufficiently stirred at 50 ° C. to obtain an aqueous gelatin solution. Further, the solution was transferred to a 35 mm dish, and after physical gelation and air saturation at a temperature of 20 ° C., gamma rays were irradiated at a temperature of 25 ° C., a dose rate of 10 kGy / h, and doses of 10, 20, and 40 kGy. The resulting crosslinked gelatin hydrogel was confirmed to have elastic moduli of about 5, about 16, and about 48 kGy from a stress-strain curve obtained by a compression test.
  • B16F10 cells derived from mouse malignant melanoma were each cultured on the obtained gelatin cross-linked body and on a plastic dish used in a usual culture experiment, and thereafter observed with an optical microscope and quantified for the amount of melanin production over time. .
  • the amount of melanin produced was calculated from the amount of available protein in the presence of 1% Triton X100 after washing the collected cells with PBS, and the amount of melanin solubilized when treated with 1N NaOH at 85 ° C. for 30 minutes.
  • FIG. 6 shows the obtained microscope image. From the observed images, no clear melanin production was observed in the cells cultured 2D on the plastic dish (FIG. 6 (a)), but the cells cultured on the gelatin cross-linked body showed any elastic modulus of 5 to 48 kPa. It forms cell aggregates (spheroids), and it is recognized that some cell aggregates produce high-density melanin (FIGS. 6 (b) to (d)). Also, the results of the quantitative analysis show that melanin is hardly produced under 2D culture conditions, but is remarkably produced over time in culture on cross-linked gelatin. It has also been recognized that the hardness of the crosslinked gelatin has an effect on the production amount. These results indicate that the gene expression of cells can be modulated by the elastic modulus of the hydrogel as in vivo, and are closely related to drug discovery and cancer treatment research.
  • Example 4 Culture of human cervical cancer-derived HeLa cells on a hydrogel scaffold (1) The morphology of HeLa cells, human-derived cervical cancer-derived cancer cells, seeded and cultured on a hydrogel scaffold having a surface provided with a smooth and 5 ⁇ m line-shaped unevenness (parallel groove) microstructure is optically analyzed. Observed directly by microscope. From the obtained image, the cell size (adhesion area), aspect ratio, and rotation were measured.
  • Porcine gelatin (10 wt%) was added to distilled water (1 L), and the mixture was sufficiently stirred at 50 ° C. to obtain an aqueous gelatin solution. Further, this solution was transferred to a 35 mm dish, and after physical gelation and air saturation at a temperature of 20 ° C., gamma rays were irradiated at a temperature of 25 ° C., a dose rate of 10 kGy / h, and doses of 10 kGy and 40 kGy. From the stress-strain curve obtained by the compression test, it was confirmed that the obtained crosslinked gelatine had elastic moduli of 5 kPa and 48 kPa, respectively.
  • a hydrogel scaffold was prepared. HeLa cells were cultured on the surface of the obtained four types of hydrogel scaffolds and on the surface of a polystyrene dish used in a usual culture experiment, and observed with an optical microscope.
  • FIG. 7 shows the obtained microscope image.
  • the observed image shows that HeLa of epithelial cells forms a three-dimensional cell mass on a smooth hydrogel having a hardness of 5 kPa (FIG. 7 (a)).
  • a smooth hydrogel having a hardness of 48 kPa it extends two-dimensionally and shows a mesenchymal-like morphology (FIG. 7 (b)).
  • the elastic modulus is 5 kPa
  • the shape changes in response to the shape if there is a linear unevenness of 5 ⁇ m (FIG. 7D).
  • FIG. Measurement the results of examining the growth rate of the cell culture in a hydrogel having a modulus of elasticity of 5 to 67 kPa (culture surface is smooth) and a polystyrene dish are shown in FIG. Measurement). From FIG. 8, it can be seen that any of the hydrogels having an elastic modulus of 5 to 67 kPa can culture cells at the same speed as a normal plastic dish. In other words, it indicates that it is possible to control only gene expression while maintaining the cell growth rate. The present results indicate that gene expression and differentiation state of cells can be controlled by the elastic modulus and surface shape of the hydrogel, and are closely related to the preparation of cell sources in regenerative medicine.
  • Example 5 Culture of human cervical cancer-derived HeLa cells on a hydrogel scaffold (2) An aqueous gelatin solution prepared under the same conditions as in Example 4 was irradiated with 2 MeV electron beams 1 to 20 times at a dose rate of 10 kGy / time and a total dose of 10 to 200 kGy in an air atmosphere at a temperature of 25 ° C.
  • a morphological change due to the elastic modulus was observed as in Example 4.
  • the present results show that, similarly to gamma-ray irradiation, the elastic modulus of the hydrogel can be adjusted by the dose, and the gene expression can be controlled by electron beam irradiation. That is, it is shown that the present invention is not limited to electromagnetic waves such as gamma rays, but can be extended to radiation in general.
  • Example 6 A culture test of various cells was performed on a hydrogel scaffold under the following conditions to examine gene expression ability. Table 1 shows the results.
  • gene expression can be controlled by appropriately selecting the elastic modulus and / or surface shape of the hydrogel scaffold.
  • an equal amount of an aqueous solution of glutaraldehyde (0.48% by weight), which is a chemical cross-linking agent, is added to the above-mentioned aqueous gelatin solution and reacted at 40 ° C. for 12 hours.
  • a gelatin gel was obtained.
  • the crosslinked gelatin gel obtained by each method was vacuum-dried at 30 ° C. for 24 hours, and about 1 mg was collected in a 1.5 mL small vial. It was hydrolyzed with hydrochloric acid at 110 ° C. for 24 hours under nitrogen saturation condition. Uncrosslinked gelatin was similarly hydrolyzed as a reference. Thereafter, the mixture was neutralized with sodium hydroxide, and each amino acid was fluorescently labeled with 4-Fluoro-7-nitrobenzofurazan, and qualitatively and quantitatively measured by HPLC.
  • the hydrogel for cell culture of the present invention may be used as a scaffold incorporated in a cell incubator (cell culture vessel).
  • the cells to be cultured in the method for producing a cell culture of the present invention may be used for culturing cells for treatment such as transplantation, and may be used for culturing cells for pharmacological tests (for example, for screening drugs). May be used.
  • These cell cultures can also be used in therapy (eg, regenerative medicine) and pharmacological test methods (eg, screening methods) using cell cultures.
  • any radiation irradiating device that can scan in the form of a beam of radiation can be prepared based on the presence or absence of radiation.
  • a hydrogel scaffold having parallel grooves can be formed by repeating raster scan of a two-dimensional plane and irradiating odd lines and not irradiating even lines.
  • Example 22 Evaluation on content of cell growth factor in hydrogel obtained by production method according to the present invention
  • the following two types of hydrogels were prepared, and 3T3 cells were cultured using these as a scaffold, and cell proliferation activity was obtained. Were compared to evaluate the content of the cell growth factor.
  • the gel 22-2 corresponds to the hydrogel obtained from the production method according to the present invention.
  • (Gel 22-1) Protein containing defined amount of growth factor (Gel 22-2) Irradiation treatment and pH adjustment treatment (post-irradiation pH adjustment treatment) using protein containing defined amount of growth factor as raw material
  • DMEM DMEM + FGF1 at 0, 0.015, 0.3, 1.5, 3, and 30 ng / mL was added to the high-purity bovine dermis-derived type I collagen solution.
  • the obtained mixture was placed in a 96-well microplate in an amount of 40 ⁇ L, and immediately heated to 37 ° C. in a CO 2 incubator to fibrillate collagen.
  • a neutralized collagen gel containing 0, 0.005, 0.1, 0.5, 1, and 10 ng / mL of FGF1 as a protein containing a growth factor was obtained.
  • the neutralized collagen gel corresponds to gel 22-1.
  • a neutralized collagen gel containing various concentrations of FGF1 was irradiated with 1 kGy of gamma rays, and then a DMEM medium was added thereto to obtain a hydrogel adjusted to pH 7.1 to 7.5 at 37 ° C.
  • the hydrogel corresponds to gel 22-2.
  • 3T3 cells were seeded at 60 ⁇ L at a concentration of 5,000 cells / well on each of the gel 22-1 and the gel 22-2, cultured for 48 hours, and 10 ⁇ L / well of Cell Counting Kit-8 was added. Thereafter, a color reaction was performed in an incubator for 1 hour, and the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader.
  • FIG. 10 shows a change in absorbance according to the FGF1 concentration in the neutralized collagen gel, that is, a change in cell growth activity.
  • the higher the absorbance value the higher the cell proliferation activity of the gel.
  • the cell proliferation activity of the gel 22-1 was significantly higher than that of the gel 22-2.
  • the FGF1 in the gel was 100 pg / mL or less when compared with the calibration curve obtained from the gel 22-1. It was considerable.
  • the gel 22-2 has a cell growth activity of 100 pg / mL or less in terms of FGF1 activity, and this amount is more remarkable than the cell growth factor amount in a hydrogel (such as matrigel) derived from a commercially available biological extract. Few.
  • Example 23 Preparation of high concentration protein-containing hydrogel From a solution containing a high concentration of protein (collagen, gelatin, or collagen peptide), a hydrogel was prepared by irradiation, and the polymer concentration in the gel was evaluated. did.
  • Collagen peptide solution 10 wt% of porcine collagen peptide was added to 1 L of distilled water, and the mixture was sufficiently stirred at 50 ° C to obtain an aqueous collagen peptide solution.
  • each of the above solutions was transferred to a 35 mm dish, the collagen solution and the gelatin solution were air-saturated at a temperature of 20 ° C, and the collagen peptide solution was air-saturated at 4 ° C.
  • gamma rays were irradiated at a temperature of 15 ° C. and a dose rate of 10 kGy / h at a dose of 5 kGy to 60 kGy. From the weight of the obtained hydrogel before and after drying, the polymer concentration in the hydrogel was evaluated.
  • FIG. 11 shows the polymer concentration in the hydrogel with respect to the irradiation dose.
  • the polymer concentration in the hydrogel increased.
  • the polymer concentration in the hydrogel obtained by the above method is higher than the polymer concentration (generally 1% or less) in a general neutralized collagen gel or a hydrogel (such as matrigel) derived from a biological extract.
  • the polymer concentration in the hydrogel could be adjusted by the irradiation dose.
  • Example 24 Addition of predetermined component to hydrogel
  • a hydrogel in which the amount of a growth factor contained in a raw material is reduced can be obtained.
  • a predetermined component was added to the thus obtained hydrogel, it was examined whether the component functions on the hydrogel. Specifically, laminin which is an extracellular matrix (a protein involved in cell adhesion, proliferation and differentiation) was added to the hydrogel, and it was evaluated whether the gel contained laminin.
  • Porcine gelatin (10% by weight) was added to 1 L of distilled water, and the mixture was sufficiently stirred at 50 ° C. to obtain an aqueous gelatin solution. Further, the solution was transferred to a 35 mm dish, subjected to physical gelation and air saturation at a temperature of 20 ° C., and then irradiated with gamma rays at a temperature of 25 ° C., a dose rate of 10 kGy / h, and a dose of 20 kGy to obtain a hydrogel (not laminin-coated). (Hydrogel) was obtained.
  • laminin-coated hydrogel 1 mL of 0.1 mg / mL laminin (Invitrogen 23017-015) dissolved in ultrapure water was added, and stored at 4 ° C. overnight to obtain a laminin-coated hydrogel.
  • rat hippocampal neurons were cultured at 37 ° C. in 5% CO 2 on each of the gel not coated with laminin and the gel coated with laminin, and the growth state was periodically observed. Then, it was stained with a laminin antibody (Abcam ab11575) and a secondary antibody (Invitrogen A32731), and it was confirmed by fluorescence observation whether laminin was contained in the hydrogel.
  • FIG. 12 shows the results of the fluorescence observation.
  • (A) is an observation result of a gel not coated with laminin
  • (B) is an observation result of a gel coated with laminin. If the laminin coating is functioning (ie, if the gel contains laminin), hippocampal neurons will adhere to the gel. As shown in (A), no nerve cells adhered on the uncoated gel. On the other hand, on the laminin-coated gel shown in (B), hippocampal neurons adhered and extended the projections.
  • FIG. 12 (C) shows the result of confirming that laminin was actually coated in the laminin-coated gel by fluorescent staining. From the above results, it was found that even when a predetermined component (such as a growth factor) was added to the hydrogel of the present invention, the component functions on the hydrogel.
  • a predetermined component such as a growth factor
  • Example 25 Capture and culture of single cell by hydrogel Using a hydrogel provided with a concave shape of 100 to 200 ⁇ m square as a scaffold, melanoma cells were seeded in the concave portion, and the appearance was observed with an optical microscope over time. .
  • Porcine gelatin (10% by weight) was added to 1 L of distilled water, and the mixture was sufficiently stirred at 50 ° C. to obtain an aqueous gelatin solution. Further, this solution was transferred to a dish, and a mold having a convex structure of 100 to 200 ⁇ m square and 100 ⁇ m height was pressed. After physical gelation and air saturation at a temperature of 20 ° C., gamma rays were irradiated at a temperature of 15 ° C. and a dose rate of 5 kGy. / H, irradiation at a dose of 20 kGy to produce a hydrogel having a concave shape on the surface. B16F10 melanoma cells derived from mouse malignant melanoma were seeded in the recesses of the obtained hydrogel, and observed with an optical microscope over time.
  • FIG. 13 shows the results of culture using a hydrogel provided with a concave shape of 100 ⁇ m square, which is a state immediately after cell seeding. As shown in FIG. 13, the melanoma cells were captured one by one in the concave depression. From these results, it was found that the hydrogel of the present invention can capture one cell and culture it. Although data is not shown, the shape of the concave portion provided to the hydrogel is not limited to a square, and culturing was possible even with an arbitrary shape.
  • FIG. 14 shows the results of culture using a hydrogel provided with a concave shape of 100 ⁇ m square, which is a state 8 days after seeding of the cells.
  • spheroids with different amounts of melanin production from melanoma cells could be obtained.
  • the fact that spheroids having different amounts of melanin were obtained despite the fact that the culture conditions did not change means that the gene expression of each melanoma cell was different from each other. From these results, it was found that the hydrogel of the present invention allows cells to be individually cultured on a hydrogel scaffold one by one to produce cell clusters having different gene expressions.

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Abstract

本発明の課題は、ハイドロゲルを足場に用いた細胞培養において、足場の原料に混入した未詳の成長因子に起因する増殖活性を低減しつつ、遺伝子発現を制御し得る技術を提供することである。　本発明は、細胞増殖活性が、線維芽細胞増殖因子－１活性換算で１００ｐｇ／ｍＬ以下であり、弾性率が、０．１～５００ｋＰａであり、親水性高分子の放射線架橋構造を有する、細胞培養用ハイドロゲルを提供する。

Description

細胞培養用ハイドロゲル、ゲルキット、細胞培養物の製造方法、及び細胞培養用ハイドロゲルの製造方法
　本発明は、細胞培養用ハイドロゲル、ゲルキット、細胞培養物の製造方法、及び細胞培養用ハイドロゲルの製造方法に関する。
　細胞の遺伝子発現を細胞培養用足場材料によって制御する技術の開発は、再生医療や創薬、がん治療分野において喫緊の課題である。細胞培養で一般的に用いられてきたプラスチックやガラスディッシュの場合、生体内環境とかけ離れているため、培養細胞の形質が生体内細胞と異なってしまうという課題があった。そこで、より近い生体内環境で細胞培養するために、現在は、プラスチックやガラスなどの市販の基材にポリアクリルアミドゲルなどの合成樹脂を主体とする高分子ゲルがコーティングされたもの（硬さを生体内軟組織に近づけたもの）、或いは、コラーゲンなどのタンパク質がコーティングされたもの（化学組成で生体内環境を模擬したもの）などが用いられている。
田口光正、「新材料ゼラチンゲルによる再生医療への挑戦－量子ビーム微細加工技術を駆使した細胞操作デバイスの開発－」、放射線利用フォーラム２０１７　ｉｎ　高崎（２０１７） Ａ．　Ｊ．　Ｅｎｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｍａｔｒｉｘ　Ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ　Ｄｉｒｅｃｔｓ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅａｇｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．"　Ｃｅｌｌ，　１２６，　６７７　（２００６）
　しかしながら、市販の足場材（コーティング剤）を用いて細胞培養を行うと、ロットごとに細胞培養結果が異なり、再現性が低いという不都合が生じる場合があった。さらに、足場材の製造時に架橋剤を使用すると、足場材中に未反応のモノマーや架橋剤が残存する場合があり、当該未反応の架橋剤が細胞培養培地に溶出して細胞毒性を生じる虞が指摘されている。
　本発明は、上記の状況に鑑みてなされたものであり、ハイドロゲルを足場に用いた細胞培養において、足場の原料に混入した未詳の成長因子に起因する増殖活性を低減しつつ、遺伝子発現を制御し得る技術の提供を目的とする。
　本発明人は、上記細胞培養足場材（市販のコーティング剤）のロット差に起因して細胞培養結果の再現性が低下する現象について鋭意検討を行ったところ、上記コーティング剤中に成長因子が混入する場合があり、かかる成長因子の種類及びその活性が細胞培養結果に大きく影響していることを確認した。そして、放射線照射により、足場材中の成長因子の活性を低減させつつ、足場を形成する方法、並びに細胞培養物の製造方法を確立した。
　なお、以下、本発明における「成長因子」とは、細胞培養結果に影響する因子である「細胞増殖因子」と同義であり、具体的には、線維芽細胞増殖因子－１などが例示される。
　本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）　細胞増殖活性が、線維芽細胞増殖因子－１活性換算で１００ｐｇ／ｍＬ以下であり、
　弾性率が、０．１～５００ｋＰａであり、
　親水性高分子の放射線架橋構造を有する、細胞培養用ハイドロゲル。
（２）　前記細胞増殖活性が、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞のＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８を用いた２８時間インキュベートにおける増殖活性として、酸処理によって抽出された牛真皮由来Ｉ型コラーゲンゲルに比し、１０５％未満である（１）に記載の細胞培養用ハイドロゲル。
（３）　前記親水性高分子は、タンパク質である、（１）又は（２）に記載のハイドロゲル。
（４）　コラーゲン、コラーゲンペプチド、及び、ゼラチンからなる群から選択される１以上を、前記ハイドロゲルに対して、１質量％以上３０質量％以下含む、（１）から（３）のいずれかに記載のハイドロゲル。
（５）　凹部及び／又は平行溝を表面に有する（１）から（４）のいずれかに記載のハイドロゲル。
（６）　前記ハイドロゲルとは別体である生理活性因子を後添加するための、（１）から（５）のいずれかに記載のハイドロゲル。
（７）　分化誘導因子、接着因子、走化因子及び細胞外マトリックスからなる群から選択される１以上の因子が配合された、（１）から（５）のいずれかに記載のハイドロゲル。
（８）　（１）から（５）のいずれかに記載のハイドロゲルと、前記ハイドロゲルとは別体の生理活性因子と、を含む、ゲルキット。
（９）　（１）から（５）のいずれかに記載のハイドロゲルに、細胞を接触させることにより、細胞を培養する細胞培養物の製造方法。
（１０）　前記ハイドロゲルとして、所望の遺伝子発現に対応する弾性率及び／又は表面形状を有するハイドロゲルを選択して用いる、（９）に記載の製造方法。
（１１）　前記遺伝子発現が、細胞の分化にかかわる遺伝子の発現、又は細胞の成長にかかわる遺伝子発現である、（１０）に記載の製造方法。
（１２）　前記細胞培養物が、メラニン産生細胞である（９）から（１１）のいずれかに記載の細胞培養物の製造方法。
（１３）　前記細胞培養物が、腹腔由来の食細胞である（９）から（１１）のいずれかに記載の細胞培養物の製造方法。
（１４）　前記細胞培養物が、心筋細胞である（９）から（１１）のいずれかに記載の細胞培養物の製造方法。
（１５）　前記細胞培養物が、乳がん細胞である（９）から（１１）のいずれかに記載の細胞培養物の製造方法。
（１６）　前記細胞培養物が、子宮がん細胞である（９）から（１１）のいずれかに記載の細胞培養物の製造方法。
（１７）　前記細胞培養物が、細胞塊である（９）から（１６）のいずれかに記載の細胞培養物の製造方法。
（１８）　細胞培養用ハイドロゲルの製造方法であって、
　親水性高分子を、０．１～７０質量％含む水溶液に対し、
　線量１～１０００ｋＧｙの放射線を照射する照射工程を含み、
　前記照射後のハイドロゲルは、細胞増殖活性が線維芽細胞増殖因子－１活性換算で１００ｐｇ／ｍＬ以下であり、
　前記照射後のハイドロゲルの弾性率は、０．１～５００ｋＰａであり、
　前記照射後のハイドロゲルは、親水性高分子の放射線架橋構造を有する、細胞培養用ハイドロゲルの製造方法。
（１９）　前記照射後のハイドロゲルは、前記細胞増殖活性が、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞のＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８を用いた２８時間インキュベートにおける増殖活性として、酸処理によって抽出された牛真皮由来Ｉ型コラーゲンゲルに比し、１０５％未満である（１８）に記載の細胞培養用ハイドロゲルの製造方法。
（２０）　前記親水性高分子を含む水溶液が、細胞増殖因子を、０以上１０００ｎｇ／ｍＬ以下で含む、（１８）又は（１９）に記載の製造方法。
（２１）　前記照射工程に続き、ｐＨを６～８に調整するｐＨ調整工程をさらに含む、（１８）から（２０）のいずれかに記載の製造方法。
（２２）　前記ｐＨ調整工程が、緩衝溶液、培地、及び水のいずれかを用いる調整工程である（２１）に記載の製造方法。
（２３）　所定の間隔の平行溝を表面に有するモールドを押圧する表面加工工程をさらに含む（１８）から（２２）のいずれかに記載の製造方法。
（２４）　前記親水性高分子は、タンパク質である、（１８）から（２３）のいずれかに記載の製造方法。
（２５）　前記照射後のハイドロゲルが、コラーゲン、コラーゲンペプチド、及び、ゼラチンからなる群から選択される１以上を、該ハイドロゲルに対して、１質量％以上３０質量％以下含む、（１８）から（２４）のいずれかに記載の製造方法。
（２６）　前記照射後に、生理活性因子を添加する工程をさらに含む、（１８）から（２５）のいずれかに記載の製造方法。
　本発明によれば、細胞培養における遺伝子発現を安定的に制御し、細胞培養物を製造する製造技術が提供される。
ガンマ線線量と弾性率の関係を示す図である。 ＦＧＦ１添加量と、増殖活性の関係を示す図である。 ＦＧＦ１添加量と、増殖活性の関係を示す図である。 ＦＧＦ１添加量と、増殖活性の関係を示す図である。 マウス腹腔由来の食細胞培養における分化制御を示す図である。 マウス悪性黒色腫由来のＢ１６Ｆ１０細胞培養における形態制御を示す図である。 ヒト由来子宮頸癌由来のＨｅＬａ細胞培養における形態制御を示す図である。 ヒト由来子宮頸癌由来のＨｅＬａ細胞培養における増殖率を示す図である。 放射線照射後のｐＨ調整処理がハイドロゲル中のＦＧＦ１濃度に及ぼす影響を示す図である。 ＦＧＦ１が含まれるハイドロゲルに対する放射線照射後のｐＨ調整処理の有無が、ハイドロゲルを用いた細胞培養後の細胞増殖活性に及ぼす影響を示す図である。 放射線照射の線量がハイドロゲル中の高分子濃度に及ぼす影響を示す図である。 本発明の一態様に係るハイドロゲルにラミニンを後添加した結果を示す図である。 本発明の一態様に係るハイドロゲルを用いてマウス悪性黒色腫由来のＢ１６Ｆ１０細胞を培養した結果を示す図である。 本発明の一態様に係るハイドロゲルを用いてマウス悪性黒色腫由来のＢ１６Ｆ１０細胞を培養した結果を示す図である。
　以下、本発明の実施形態について説明する。
（１）細胞培養用ハイドロゲル
　本発明の細胞培養用ハイドロゲル（細胞培養足場用ハイドロゲル）は、細胞増殖活性が、線維芽細胞増殖因子－１活性換算で１００ｐｇ／ｍＬ以下であるとともに、弾性率が、０．１～５００ｋＰａであり、親水性高分子の放射線架橋構造を有する細胞培養用ハイドロゲルである。
　以下、本発明の細胞培養用ハイドロゲルを単に「本発明のハイドロゲル」ともいう。
　本発明において、ハイドロゲルとは、水を内包して、ゲル状に硬化したものであり、例えばタンパク質などの親水性高分子の構成分子が、互いに橋渡しをするように、架橋して構成される。後述するように、放射線による架橋は、放射線が有する固有の高いエネルギーを利用したものであり、いわゆる架橋剤（例えば熱架橋剤（重合開始剤）、紫外線架橋剤（光重合開始剤）とも呼ばれる）を必要としないものであるので、架橋剤を一切含まない放射線架橋構造を構成する。
　かかる放射線架橋構造を有することで、細胞培養条件下に放置した場合であってもハイドロゲル状態を保持することができる。
　上記ハイドロゲルとして、典型的に、１０質量％以上（好ましくは３０質量％以上）の含水率のものを好適に使用し得る。含水率の上限は特に限定されず、例えば９９質量％以下で適宜設定すればよい。
　また、上記ハイドロゲルとして、ハイドロゲルに対する親水性高分子の含有量が、例えば１質量％以上、好ましくは３質量％以上のものを好適に使用し得る。ハイドロゲルに対する親水性高分子の含有量の上限は特に限定されず、例えば５０質量％以下、好ましくは４０質量％以下のものを好適に使用し得る。
（親水性高分子の放射線架橋構造）
　放射線架橋とは、特に限定するものではないが、放射線照射によって、高分子鎖上に活性点が生じ、そこを起点としての高分子鎖がＸ型或いはＴ型に結合することで、３次元的な網目構造（ネットワーク構造）を形成する。架橋剤などの添加剤を用いることなしに、室温或いはそれ以下の温度でも進行するのが、放射線架橋の特徴であり、材料のゲル化、耐熱性の向上、形状記憶性の付与などに応用される。
　また、親水性高分子は、公知の親水性高分子と同様のものである。具体的には、分子中に親水性基を有する高分子をいう。
　上記親水性基として、例えば水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エーテル基、アシル基、スルホ基が例示される。すなわち、上記親水性高分子は、かかる親水性基を分子中に少なくとも１以上、好ましくは２以上有する高分子である。
　また、上記親水性高分子の分子量は特に限定されず、例えば、１５０から２，０００，０００の範囲の高分子を適宜選択して用いればよい。典型的には、１，０００から１，０００，０００の範囲の高分子を適宜選択して用いることができる。なお、組成が同一の高分子であれば、分子量が大きいほどハイドロゲルの弾性率が大きくなる傾向がある。なお、本明細書では、特に言及しない限り、「分子量」は重量平均分子量を意味するものとする。なお、かかる重量平均分子量は、従来公知のサイズ排除クロマトグラムにより測定すればよい。
　上記親水性高分子として、例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、核酸といった、天然物由来の親水性高分子、或いはその誘導体が挙げられる。なお、天然物由来とは、天然物（地球資源、典型的には生物、例えば動物、植物、菌）から抽出或いは精製することにより入手可能であることを意味し、それ自体が天然物であることに限定されない。例えば、天然物からの抽出物或いは精製物を原料として人為的に合成した合成タンパク質は、上記天然物由来の親水性高分子（以下、天然高分子ともいう）に包含される。なお、ここで合成タンパク質とは、細胞利用のタンパク質合成系で合成されたタンパク質及び無細胞タンパク質合成系で合成されたタンパク質のいずれも包含する。
　上記天然物由来の親水性高分子の具体例として、例えば、デキストリン、デキストラン、キチン、キトサン、寒天、アガロース、ジェランガム、キサンタンガム、カラヤガム、カラギーナン、セルロース、スターチなどの多糖類、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルブミン、ラミニン、ケラチン、オボアルブミン、ミオシン、グロブリン、ペプチドなどのタンパク質、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸などが挙げられる。
　なお、上記天然物由来の親水性高分子は、単一のサブタイプのみをハイドロゲルの原料として用いてもよいし、複数の異なるサブタイプを組み合わせてハイドロゲルの原料としてもよい。例えばコラーゲンはＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンといったサブタイプが知られている。したがって、これらのサブタイプのうち１つ又は２つ以上のサブタイプのコラーゲンを組み合わせて用いることができる。Ｉ型コラーゲンは生体内に最も大量に存在することから、比較的安価に入手し得る点で好ましい。また、ＩＶ型コラーゲンは皮膚の基底膜に存在するコラーゲンであり、比較的簡便に入手できる点で好ましい。
ここで、上記タンパク質とは、複数のアミノ酸がペプチド結合により結合されてなる高分子を意味し、当該タンパク質を構成するアミノ酸の数により限定されるものではない。例えば、２個又は３個以上のアミノ酸からなるペプチドを包含する。なお、本明細書中で特に「ペプチド」という場合には、２個以上２，０００個以下のアミノ酸からなる高分子をいう。
　また、上記天然物由来の親水性高分子（天然高分子）の誘導体としては、特に限定されないが、例えば当該天然物由来の高分子を低級アルキル基、低級アルコキシアルキル基、又はヒドロキシ低級アルキル基で置換した誘導体が挙げられる。具体的には、低級アルキル基置換セルロース誘導体、低級アルコキシアルキル基置換セルロース誘導体、ヒドロキシ低級アルキル基置換セルロース誘導体、低級アルコキシアルキル基置換キトサン誘導体、低級アルコキシアルキル基置換キチン誘導体、低級アルコキシアルキル基置換スターチ誘導体及び低級アルコキシアルキル基置換カラギーナン誘導体からなる群から選択される天然高分子誘導体が例示される。
　なお、上記親水性高分子は、人工的に合成した合成高分子（合成樹脂）であってもよい。従来公知の親水性高分子を特に制限なく使用することができるが、例えば、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド及びポリエチレングリコールからなる群から選択される合成高分子が挙げられる。或いはまた、人工的に設計された配列を有する高分子も当該合成分子に包含し得る。例えば、人工的に設計された配列を有する人工タンパク質（ペプチドを含む）、核酸、多糖が挙げられる。
　上記ハイドロゲルは、上記親水性高分子のうち１種のみが相互に架橋（結合）したものであってもよいし、２種又は３種以上の親水性高分子が相互に架橋（結合）したものであってもよい。
　特に限定するものではないが、対象細胞の生存環境に近い環境での培養を実現する観点からは、動物由来の細胞を培養する目的で使用する場合であれば、動物由来の親水性高分子又はその誘導体を選択することが好ましく、生体（動物生体）から抽出又は精製して得られる親水性高分子（以下、生体由来高分子ともいう）又はその誘導体がより好ましい。例えば、生体から抽出した精製度の低いタンパク質材料を上記親水性高分子として採用し得る。具体的には、複数のサブタイプのコラーゲンの混合物、或いは例えばコラーゲンとラミニンといった複数のタンパク質の混合物、或いは例えばタンパク質と多糖類、タンパク質と核酸といった異なる高分子の混合物を細胞培養足場用ハイドロゲルの原料高分子として使用し得る。
　例えば、上記細胞培養足場用ハイドロゲル上で培養した細胞を生体内へ移植する場合、移植用の細胞集団中に足場用ハイドロゲルが混入する可能性を考慮し、生体適合性の親水性高分子を選択することが好ましい。かかる生体適合性の親水性高分子として、例えば上記生体由来高分子が挙げられる。ゼラチン、コラーゲンに例示されるタンパク質を主体とする高分子は、移植先（ドナー）のコラゲナーゼやプロテアーゼなどの酵素により分解、吸収され得るため、移植用細胞を培養するための足場用ハイドロゲルの原料として好ましい。
（弾性率）
　弾性率（以降、便宜的に硬さということがある）は、ＪＩＳ　Ｋ　６２７２などに準じた公知の応力－歪（Ｓｔｒｅｓｓ－Ｓｔｒａｉｎ）曲線の測定方法によって定義されるものであり、例えば圧縮弾性率によって測定される。すなわち、本発明のハイドロゲルは、圧縮弾性率０．１～５００ｋＰａであるハイドロゲルを含むものである。哺乳動物の細胞を対象とした細胞培養足場用ハイドロゲルであれば、圧縮弾性率が好ましくは１ｋＰａ～２００ｋＰａ、より好ましくは３ｋＰａ～６０ｋＰａの範囲のハイドロゲルを好適に使用し得る。
　培養細胞は、生体内の種々の組織より分離された細胞である。ここで組織の弾性率はそれぞれ異なり、骨であればＧＰａ以上、軟骨であればＭＰａ以上（例えば１～１００ＭＰａ程度）、軟組織であれば０．１～５００ｋＰａ（例えば５０ｋＰａ程度）であることが知られている。すなわち、対象の培養細胞をｉｎ　ｖｉｖｏに近い環境で培養するためには、当該対象細胞の由来組織の弾性率を反映した弾性率の足場材を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養することが求められる。
　言い換えれば、細胞培養において所望の細胞を培養しようとする場合には、足場となるハイドロゲルは、その弾性率を、所望の細胞を分離した由来組織の弾性率に合せて選択することができる。具体的には、圧縮弾性率０．１～５００ｋＰａである本発明のハイドロゲルは、神経や筋肉などの軟組織由来細胞の培養に適している。
（細胞増殖活性）
　また、本発明の細胞培養足場用ハイドロゲルは、安定な細胞培養結果が得られるよう、天然高分子基材（以降、タンパク質で例示することがある）に含まれる成長因子の影響を低減したものである。成長因子の影響は、線維芽細胞増殖因子－１（ＦＧＦ１）を評価用の成長因子として用いることで、定量的に定義できる。
　具体的には、本発明のハイドロゲルは、細胞増殖活性が、ＦＧＦ１活性換算で１００ｐｇ／ｍＬ以下であり、好ましくは５０ｐｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ以下である。
　上記のとおり、成長因子の影響は、評価用細胞の増殖を測定することによって、定量的に定義することができる。例えば、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞を用いた系で評価した細胞増殖活性を指標とすることができる。具体的には、マウス胎児皮膚から分離した培養細胞であるＮＩＨ－３Ｔ３細胞（以下、３Ｔ３細胞ということがある）を評価用細胞として用いた場合の増殖活性が、成長因子の活性がない（典型的には成長因子を含まない）ことをあらかじめ確認した親水性高分子を用いて作成したハイドロゲルに比し、１０５％未満であり得る。
　上記親水性高分子に成長因子の活性がないことは、例えば高速液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）などを用いて純度試験をすることで確認することができる。また、レポーターアッセイにより、含まれる可能性がある成長因子の活性を確認するといった手法により確認することができる。
　また、親水性高分子を酸性（又はアルカリ性）の環境下に晒す、高温条件で加熱するといった失活処理を施すことで、混入可能性のある成長因子の活性を失活させた高分子を用いることもできる。例えば、酸処理によって抽出された牛真皮由来Ｉ型コラーゲン（ニッピ株式会社製のＴｒｉ－Ｄ）は当該酸処理によって成長因子の活性が失活していることが知られているため、Ｔｒｉ－Ｄコラーゲンをリファレンス用の足場として採用し得る。
　上記増殖活性は細胞増殖測定試薬（例えばＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８、株式会社同仁化学研究所製）を用いて測定してもよいし、市販のセルカウンターを用いて培養前後の細胞数を測定・比較する、或いは血球計算計を用いて顕微鏡下で培養前後の細胞数を測定・比較してもよい。
　また、上記増殖活性を評価するための細胞培養時間は特に限定されないが、例えば２８時間の培養（２４時間のインキュベートの後に４時間の呈色反応を行う）で評価すればよい。
　具体的には、所定の評価用細胞を、細胞培養足場用ハイドロゲル上に、所定数（所定量）を播種し、所定時間にわたり培養することで評価できる。簡便な評価としては、所定の波長における吸光光度法による吸光度を測定することにより、あらかじめ求めた吸光度－細胞数の相関グラフ（検量線）より、細胞数を推定することができる。このとき、細胞播種にあたっては、水溶性テトラゾリウム塩（例えば、Ｃ２０Ｈ１３Ｎ６Ｏ１１Ｓ２Ｎａ）を添加しておくことで、細胞増殖に伴う還元反応を、特定波長における吸光度の増加により測定し、細胞数の増加が再現性良く評価できる。この測定は、汎用的に販売されている測定キット、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（株式会社同仁化学研究所製）を用いて行ってもよい。また吸光度の測定には、マイクロプレートリーダー、吸光度計、分光光度計のいずれも用いることができる。
　本発明の細胞培養足場用ハイドロゲルにおいては、評価用細胞として３Ｔ３細胞を用い、５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で、複数のウェルに対して、９０μＬずつ播種し、２４時間前培養する（培養条件：５％二酸化炭素雰囲気、３７℃）。続いて、水溶性テトラゾリウム塩溶液からなるＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８を、１０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加する。その後インキュベーター内で４時間本培養を行い、呈色反応を行う（培養条件：５％二酸化炭素雰囲気、３７℃）。次に、マイクロプレートリーダーにより、４５０ｎｍの吸光度を測定する（合計２８時間インキュベート）。
　ここで、同様な方法による、成長因子を含まない純度の高い天然高分子で作成したゲル（例えば、酸処理によって抽出された牛真皮由来Ｉ型コラーゲンゲル）をリファランスサンプルとし、この４５０ｎｍにおける吸光度と比較する。細胞が増殖すると、吸光度が増加することを利用し、合計２８時間インキュベートしたサンプルにおける吸光度を、レファランスサンプルの吸光度により除し、百分率（％）で表現することで増殖活性を定義できる。本発明の細胞培養足場用ハイドロゲルは、このような評価方法によって定義されるものであり、２８時間インキュベートにおいて、１０５％未満の増殖活性を有するものである。
　すなわち、本発明の細胞培養足場用ハイドロゲルの好適な一実施態様は、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞のＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８を用いた２８時間インキュベートにおける増殖活性が、酸処理によって抽出された牛真皮由来Ｉ型コラーゲンゲルに比し、１０５％未満である。
　なお、上記成長因子の影響は、線維芽細胞増殖因子－１（ＦＧＦ１）を評価用の成長因子として用いることで、定量的に定義することもできる。例えば、所望の細胞培養足場用ハイドロゲルに所定量のＦＧＦ１を添加したリファレンス用ハイドロゲルを作成し、上記リファレンス用ハイドロゲルで所定時間細胞を培養した際の細胞増殖率の検量線と比較することで、目的の細胞培養足場用ハイドロゲル中に混入した成長因子の活性をＦＧＦ１量に換算して評価することができる。
　或いはまた、培養液中にＦＧＦ１を添加して培養した際の細胞増殖率を検量線として比較することで、目的の細胞培養足場用ハイドロゲル中に混入した成長因子の活性をＦＧＦ１量に換算して評価してもよい。
　本発明の細胞培養足場用ハイドロゲルは、基材となる天然高分子に含まれる成長因子の影響が低減されている。具体的には、細胞増殖活性がＦＧＦ１換算で１００ｐｇ／ｍＬ以下という低い活性に抑えられており、このため、遺伝子発現や分化状態を安定的に制御することができる。好ましくは、上記定義による増殖活性値が１０５％未満と低く抑えられていれば、遺伝子発現や分化状態をより安定的に制御することができる。
　このように、本発明のハイドロゲルは、所望の細胞培養に適した弾性率を有するとともに、親水性高分子基材に含まれる生理活性因子（成長因子）の影響を低減したものであり、細胞培養足場に用いたときに、遺伝子発現や分化状態を安定的に制御することができる。
　特に親水性高分子として天然物由来（典型的には生体由来）の親水性高分子であるタンパク質を用いる場合には、タンパク質に含まれる生体由来の生理活性因子（成長因子）が培養結果に影響を及ぼしがちであるが、本発明のハイドロゲルは、親水性高分子として上記タンパク質を用いた場合であっても、生体由来の生理活性因子（成長因子）の影響を低減したものである。
［本発明のハイドロゲルの好ましい態様］
　以下、本発明において好ましい態様について説明する。
　好適な一実施態様として、ハイドロゲルの細胞培養面に所望の形状の凹凸が形成されていてもよい。例えば、平行溝、凹部（略円状の凹部など）、及びこれらの組み合わせを有するものであり得る。
　ここで、平行溝を構成する溝は、直線であっても、点線であってもよい。平行溝の間隔は任意であるが、０．５～１０００μｍを好適に用いることができる。平行溝の間隔は、一定であっても可変であってもよい。平行溝凹部の深さは任意であるが、０．５～５００μｍを好適に用いることができる。
　上記凹部は任意の形状とすればよく、例えばドット状であってよい。例えば直径１０μｍ～１０００μｍの略円形状（典型的には円）とし得る。このような凹部によると、複数の細胞（例えば細胞集団、コロニー、受精卵）を凹部に補足して、培養することができる。
　また、例えば直径１０～１００μｍの凹部を形成してもよい。凹部の直径をこの範囲とすることにより、この凹部に補足可能な細胞数を制限し得る。例えば直径２０～３０μｍの凹部を形成してもよい。
　このような凹部を有する培養用足場は、凹部１個当たり平均１～１０個程度（典型的には平均１～３個、好ましくは平均１個）の細胞を隔離、保持して培養する目的に対し、好適に用いることができる。
　本発明のハイドロゲルは細胞塊（スフェロイド、スフィア）培養に適する。細胞塊培養に用いる場合、本発明のハイドロゲルには、細胞塊の直径に応じた大きさの凹部を設けることができ、例えば、直径５０～１０００μｍ、直径１００～８００μｍ、直径１０～２００μｍ、直径２０～１００μｍの凹部を設けてもよい。凹部の深さは、ハイドロゲル表面からの最も深い距離が１０～１０００μｍであってもよい。ハイドロゲルに設ける凹部は１つであってもよく、複数（例えば２～１００００個）であってもよい。凹部を複数設ける場合、隣り合う凹部同士の間隔は最も長い距離が１０～１００００μｍであってもよい。
　また、別の好適な一実施態様として、ハイドロゲルの弾性率を不均一としてもよい。例えば、厚み方向に不均一となるように設定することができる。例えば弾性率の異なる複数のハイドロゲル層で構成されるように設定してもよいし、細胞培養面の弾性力が低く設定され且つ深さ方向（厚み方向）に弾性力が高くなるように設定したグラジエントゲルとしてもよい。このように、厚み方向に弾性率が不均一（典型的には細胞培養面の弾性率を低く）となるように設定することで、例えば、細胞がハイドロゲル中に侵入しやすくなり、立体培養を実現できる。
　或いは、弾性率が水平方向に不均一となるように設定してもよい。例えば、周囲と弾性率が異なる部位を設けてもよいし、特定方向に徐々に弾性率が低くなるように設定したグラジエントゲルとしてもよい。このように水平方向に弾性率が不均一となるように設定することで、例えば、所定の弾性率の足場を好む細胞を分離する方法に利用することができる。
　また、別の好適な一実施態様として、本発明のハイドロゲルは、従来よりも高濃度の高分子を含むゲルであり得る。例えば、ハイドロゲルに対して、１質量％以上３０質量％以下の高分子を含んでいてもよい。具体的には、コラーゲンもしくはゼラチンもしくはコラーゲンペプチドからなる群から選択される１以上を、本発明のハイドロゲルに対して、１質量％以上３０質量％以下含んでいてもよい。
　上記濃度は、一般的な中和コラーゲンや市販の生体抽出物由来のハイドロゲル（マトリゲルなど）に含まれる濃度よりも高い。本発明によれば、放射線照射によって、このような高濃度の高分子を含むハイドロゲルが得られる。
　上記濃度の高分子を含むハイドロゲルは、適宜濃度を調整した各高分子の溶液を、必要に応じて空気飽和させた後、放射線照射することで得られる。ハイドロゲルの製造方法の条件は、下記［（４）細胞培養用ハイドロゲルの製造方法］で挙げるものを採用できる。
［本発明のハイドロゲルへの各種生理活性因子の後添加］
　本発明のハイドロゲルに、該ハイドロゲルとは別体の生理活性因子を添加（後添加）することで、添加された成分に応じた所望の作用を、選択的に、且つ、所望の程度で、ハイドロゲルに付与することができる。したがって、本発明は、ハイドロゲルとは別体の生理活性因子を後添加するための、ハイドロゲルも包含する。なお、ハイドロゲルに後添加される生理活性因子としては、細胞増殖因子、分化誘導因子、接着因子、走化因子、細胞外マトリックスなどが例示され、これらから選択される１以上が添加され得る。
　本発明のハイドロゲルに後添加される細胞増殖因子は特に限定されず、細胞培養などに用いられる任意の成分が挙げられる。このような成分として、肝細胞増殖因子、血小板由来成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、上皮成長因子、血管内皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン用成長因子、トランスフォーミング成長因子、神経成長因子、骨形成因子、などが挙げられる。
　本発明のハイドロゲルに後添加される分化誘導因子は特に限定されず、細胞培養などに用いられる任意の成分が挙げられる。このような成分として、Ａｃｔｉｖｉｎ、ＴＧＦ　β２、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、Ｄｅｘ（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、Ｒａｃ１（ＲＡＳ－ｒｅｌａｔｅｄ　Ｃ３　ｂｏｔｕｌｉｎｕｓ　ｔｏｘｉｎ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　１）、Ｚｆｐ５２１（Ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５２１）などが挙げられる。
　本発明のハイドロゲルに後添加される接着因子は特に限定されず、細胞培養などに用いられる任意の成分が挙げられる。このような成分として、インテグリン、ネフロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、テネイシン、フィビュリン、ＥＭＩＬＩＮ、ＱＢＲＩＣＫ、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ｐｏｌｙｄｏｍ、ＭＡＥＧ、ｆｉｂｒｏｎｏｇｅｎなどが挙げられる。
　本発明のハイドロゲルに後添加される走化因子は特に限定されず、細胞培養などに用いられる任意の成分が挙げられる。このような成分として、ＣＣＬ２１、ｆＭＬＰ、ロイコトリエンＢ４、ＩＬ－８、Ｃ５ａ、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）などが挙げられる。
　後添加される細胞外マトリックスは特に限定されず、細胞培養などに用いられる任意の成分が挙げられる。このような成分として、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、多糖類などが挙げられる。
　本発明のハイドロゲルに後添加される生理活性因子（細胞増殖因子、分化誘導因子、接着因子、走化因子、細胞外マトリックスなど）の量などは特に限定されず、後添加される因子の種類などに応じて適宜選択される。
　本発明は、上記の本発明のハイドロゲルに対して、分化誘導因子、接着因子、走化因子、及び細胞外マトリックスからなる群から選択される１以上の因子が配合されたハイドロゲルも包含する。これら分化誘導因子、接着因子、走化因子、及び細胞外マトリックスは、後添加される生理活性因子として例示したものから適宜選択して配合すればよい。
［本発明のハイドロゲルを含むゲルキット］
　本発明のハイドロゲルに、該ハイドロゲルとは別体の生理活性因子（例えば細胞増殖因子及び／又は細胞外マトリックス）を添加（後添加）することで、添加された成分に応じた所望の作用を、選択的に、且つ、所望の程度で、ハイドロゲルに付与することができる。したがって、本発明は、本発明のハイドロゲルと、該ハイドロゲルとは別体の生理活性因子（例えば細胞増殖因子及び／又は細胞外マトリックス）と、を含むゲルキットも包含する。これらゲルキットに含まれる生理活性因子は、細胞増殖因子、分化誘導因子、接着因子、走化因子、細胞外マトリックスなどが例示され、これらから選択される１以上であり得る。
　本発明のゲルキットに含まれ得る細胞増殖因子は特に限定されず、細胞培養などに用いられる任意の成分が挙げられる。このような成分として、肝細胞増殖因子、血小板由来成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、上皮成長因子、血管内皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン用成長因子、トランスフォーミング成長因子、神経成長因子、骨形成因子、などが挙げられる。
　本発明のゲルキットに含まれ得る分化誘導因子は特に限定されず、細胞培養などに用いられる任意の成分が挙げられる。このような成分として、Ａｃｔｉｖｉｎ、ＴＧＦ　β２、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、Ｄｅｘ（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、Ｒａｃ１（ＲＡＳ－ｒｅｌａｔｅｄ　Ｃ３　ｂｏｔｕｌｉｎｕｓ　ｔｏｘｉｎ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　１）、Ｚｆｐ５２１（Ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５２１）などが挙げられる。
　本発明のゲルキットに含まれ得る接着因子は特に限定されず、細胞培養などに用いられる任意の成分が挙げられる。このような成分として、インテグリン、ネフロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、テネイシン、フィビュリン、ＥＭＩＬＩＮ、ＱＢＲＩＣＫ、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ｐｏｌｙｄｏｍ、ＭＡＥＧ、ｆｉｂｒｏｎｏｇｅｎなどが挙げられる。
　本発明のゲルキットに含まれ得る走化因子は特に限定されず、細胞培養などに用いられる任意の成分が挙げられる。このような成分として、ＣＣＬ２１、ｆＭＬＰ、ロイコトリエンＢ４、ＩＬ－８、Ｃ５ａ、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）などが挙げられる。
　本発明のゲルキットに含まれ得る細胞外マトリックスは特に限定されず、細胞培養などに用いられる任意の成分が挙げられる。このような成分として、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、多糖類などが挙げられる。
　本発明のゲルキットにおける、本発明のハイドロゲルと、該ハイドロゲルとは別体の生理活性因子（例えば細胞増殖因子及び／又は細胞外マトリックス）との質量比などは特に限定されず、ゲルキットの用途などに応じて適宜選択される。
　本発明のゲルキットの使用方法は特に限定されないが、本発明のハイドロゲルに、該ハイドロゲルとは別体の生理活性因子（例えば細胞増殖因子及び／又は細胞外マトリックス）を所望のタイミングで添加した後、後述する細胞培養物の製造などに供することができる。添加の方法などは、ゲルキットの用途や、生理活性因子（例えば細胞増殖因子及び細胞外マトリックス）の種類などに応じて適宜選択される。
（２）細胞培養物の製造方法
　本発明の細胞培養物の製造方法は、本発明のハイドロゲルを足場として、培養しようとする細胞を接触させることにより、細胞を培養する方法である。特に、ハイドロゲルとして、所望の遺伝子発現や分化状態に対応する弾性率及び／又は表面形状を有するハイドロゲルを選択して用いることが好ましい。該遺伝子発現は、細胞の分化にかかわる遺伝子の発現、又は細胞の成長にかかわる遺伝子発現であり得る。
　なお、「所望の遺伝子発現や分化状態に対応する弾性率及び／又は表面形状」とは、発現する遺伝子の種類に応じて適宜選択される。
　例えば、発現する遺伝子がメラミン遺伝子である場合について、遺伝子発現のために用いる細胞に応じた好ましいゲルの弾性率及び表面形状は以下のとおりである。
　マウス悪性黒色腫由来のＢ１６Ｆ１０細胞を用いる場合：ハイドロゲルの弾性率は５～４８ｋＰａであることが好ましく、表面形状は平坦であることが好ましい。
　ヒト由来子宮頸癌由来のＨｅＬａ細胞を用いる場合－１：ＨｅＬａ細胞スフェロイドを形成するためには、ハイドロゲルの弾性率は１ｋＰａ～３０ｋＰａ（より好ましくはおよそ５ｋＰａ）が好ましく、表面形状は平坦であることが好ましい。
　ヒト由来子宮頸癌由来のＨｅＬａ細胞を用いる場合－２：ＨｅＬａ細胞が２次元形態をとるためには、ハイドロゲルの弾性率が３０ｋＰａ～５００ｋＰａ程度（より好ましくはおよそ４８ｋＰａ）であることが好ましく、表面形状は平坦であることが好ましい。あるいは、ハイドロゲルの弾性率が５ｋＰａ～５００ｋＰａ以上程度（より好ましくは５ｋＰａ～４８ｋＰａ）であることが好ましく、表面形状は平行溝（好ましくは、溝の幅が１μｍ～１０μｍのライン状凹凸、より好ましくは溝の幅が５μｍのライン状凹凸）を有することが好ましい。
　足場用ハイドロゲル上で培養する細胞は特に限定されず、所望の細胞を選択することができる。例えば、ヒト由来の細胞、ヒト以外のほ乳類由来の細胞、ほ乳類以外の動物由来の細胞、植物由来の細胞などが例示される。かかる細胞は細胞株（セルライン）或いは初代培養細胞であってもよいし、所定の遺伝子が導入された遺伝子導入細胞であってもよい。例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞といった多能性幹細胞の製造、又は分化誘導に本発明の細胞培養足場用ハイドロゲルを好適に適用し得る。
　なお、ここで「細胞」とは、単一細胞が相互に独立して存在する状態に限定されず、複数の細胞が集合した細胞集団（例えばセルクラスター、組織）を包含しる。すなわち、コロニー培養、細胞塊（スフェロイド、スフィア）培養、組織培養といった種々の培養に、本発明のハイドロゲルを、培養足場として利用し得る。
　後述する実施例が示すように、各種動植物の細胞、例えば、メラニン産生細胞、腹腔由来の食細胞、心筋細胞、神経細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、幹細胞、抗体産生細胞、破骨細胞、上皮細胞、線維芽細胞、乳がん細胞、乳腺がん細胞、脳腫瘍細胞、子宮がん細胞、子宮頸癌細胞、膵臓がん細胞、筋芽細胞、各種幹細胞（ＥＳ細胞など）などを培養することができる。培養対象である細胞には組織片などが含まれていてもよい。
　具体的には、例えば、マウス腹腔由来の食細胞の培養については、１６ｋＰａ程度（典型的には１３～１９ｋＰａ程度）の弾性率を有するハイドロゲルを足場として用いることにより、分化が進むことなく、未分化のまま、細胞が増殖し、未分化細胞として製造することができる。
　また、例えば、ヒト由来子宮頸癌由来のＨｅＬａ細胞の培養については、１～１６ｋＰａ前後の弾性率を有するハイドロゲルを足場として用いることにより、三次元的に細胞が増殖し、細胞塊（スフェロイド、スフィア）を製造することができる。
　細胞を培養する環境は、公知の環境条件でよく、例えば５％ＣＯ２、３７℃の雰囲気による培養であってよい。また、培養装置（環境装置）として、公知のＣＯ２インキュベーターを用いることができる。
　培養された細胞培養物は、上記足場から、公知の方法で分取することができる。
　すなわち本発明は、メラニン産生細胞培養用の細胞培養足場用ハイドロゲル、腹腔由来の未分化食細胞を培養するための細胞培養用ハイドロゲル、心筋細胞培養用のハイドロゲル、破骨細胞培養用のハイドロゲル、上皮細胞培養用のハイドロゲル、線維芽細胞培養用のハイドロゲル、乳がん細胞培養用のハイドロゲル、乳腺がん細胞培養用のハイドロゲル、脳腫瘍細胞培養用のハイドロゲル、子宮がん培養用のハイドロゲル、膵臓がん細胞培養用のハイドロゲル、ｉＰＳ細胞培養用のハイドロゲル、ＥＳ細胞培養用のハイドロゲル、ＭＵＳＥ細胞培養用のハイドロゲル、幹細胞培養用のハイドロゲル、神経細胞培養用のハイドロゲル、血球細胞培養用のハイドロゲル、筋芽細胞培養用のハイドロゲルを提供することができる。
（３）細胞培養足場用ハイドロゲルの前駆体
　本発明の細胞培養足場用ハイドロゲルの前駆体は、親水性高分子、例えばタンパク質を０．１～７０質量％含む水溶液である。
　なお、上記前駆体中の親水性高分子の濃度は特に限定されないが、高濃度の前駆体に放射線を照射することで単位体積当たりに生じる放射線架橋の割合が増大するため、弾性率の高いハイドロゲルは、含水率が低下しがちとなる。したがって求められる弾性率と含水率とから、前駆体中の親水性高分子の濃度を定めることができる。
　ハイドロゲルの前駆体は、生理活性因子、例えば成長因子を包含してもよい。すなわち、ハイドロゲルの前駆体としての水溶液中に生理活性因子を含有していたとしても、放射線の作用により、上記因子の活性を低減したハイドロゲルを提供し得る。
　ここで、上記親水性高分子として、天然物由来の高分子（天然高分子、典型的には生体由来の高分子）も使用し得る。天然高分子とは、上述した定義によるものである。多細胞動物の細胞外基質に多く含まれるコラーゲンや、コラーゲンを熱変性させたゼラチン、コラーゲンペプチドなどに例示される。
　上記天然物由来の高分子には、生体由来の生理活性因子（成長因子）が含まれることがある。特に、生体由来の親水性高分子、特に生体から分離したタンパク質は、生理活性因子（成長因子）が含まれている可能性がある。成長因子は、前駆体が架橋してハイドロゲルを形成した後も、ある程度の量で残存し、ハイドロゲルを足場として用いる細胞培養において、培養細胞の遺伝子発現や分化状態を含む細胞培養結果を不安定にさせる、又は阻害する要素となる。
　したがって、基材としては、成長因子の少ない、言い換えれば純度の高い高分子（例えばタンパク質）であることが好ましい。一方で、高純度のタンパク質を多量に精製することには、多大なコストがかかるという生産上の課題もある。
　なお、成長因子としては、細胞の増殖や分化を促進する、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ又はＦＧＦ２）、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、骨形成因子（ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ；　ＢＭＰ）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、顆粒コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ：Ｇ－ＣＳＦ）などが含まれる。
　しかしながら、ハイドロゲル前駆体に対して、後述する放射線照射工程、及び生理活性因子の活性低減処理（典型的にはｐＨ調整処理工程）を適切に施すことによって、天然高分子に成長因子がある程度含まれていても、ハイドロゲルを足場として用いる細胞培養において、培養細胞の遺伝子発現が安定的に行われる。具体的には、一例として線量５ｋＧｙ放射線照射を前提とする場合において、前駆体には、線維芽細胞成長因子に換算したときに、０～１０００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞成長因子と同程度の増殖活性を有する成長因子を含むことができる。一実施態様において、０～５００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞成長因子と同程度の増殖活性を有する成長因子を含むことができる。また、他の実施態様において、０～１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞成長因子と同程度の増殖活性を有する成長因子を含むことができる。また、他の実施態様において、０～１０ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞成長因子と同程度の増殖活性を有する成長因子を含むことができる。
　また、放射線線量の増加は、許容し得る成長因子の量を増加させることができる。したがって、線量５ｋＧｙ超の放射線照射を前提とする場合においては、前駆体には、線維芽細胞成長因子に換算したときに、１０００ｎｇ／ｍＬ超の線維芽細胞成長因子と同程度の増殖活性を有する成長因子を含むことができる。
（４）細胞培養用ハイドロゲルの製造方法
　本発明の細胞培養用ハイドロゲル（細胞培養足場用ハイドロゲル）の製造方法は、上述した前駆体に対し、線量１～１０００ｋＧｙの放射線を照射する工程を含む細胞培養足場用ハイドロゲルの製造方法である。該製造方法により、本発明のハイドロゲルを好ましく製造できる。
　ここで、放射線とは、紫外線より波長の短い電磁波と、電子線、イオンビームを含む概念であり、電磁波は、Ｘ線、ガンマ線を含む。放射線照射装置は、公知のこれら放射線の発生装置を用いることができる。
（放射線照射工程）
　放射線照射工程では、前駆体に対し、連続的に、又は間欠的に、放射線照射装置を用いて、線量１～１０００ｋＧｙの放射線を照射する。線量の下限は、２ｋＧｙ以上、５ｋＧｙ以上、１０ｋＧｙ以上、１００ｋＧｙ以上、５００ｋＧｙ以上であってよく、線量の上限は、５００ｋＧｙ以下、３００ｋＧｙ以下、２００ｋＧｙ以下、１００ｋＧｙ以下であってよい。一実施態様において、線量５～２００ｋＧｙの放射線照射を好ましく用いることができる。
　ここで、線量とは、放射線の時間当たりの照射量を、時間積分したものであり、各々の放射線ごとに販売されている線量計によって、測定することができる。なお、放射線照射装置において、照射エネルギーは１００ｋｅＶから１０ＭｅＶ程度に設定することが望ましい。
　前駆体への放射線照射によって、親水性高分子（例えばタンパク質）が部分的に開裂してラジカルを発生するとともに、架橋反応が生じることにより、水を内包するようにゲルが生成する（ハイドロゲルの生成）。放射線の照射が終了すると、ただちに架橋反応も停止する。反応の際の架橋密度は、照射する放射線の線量に依存し、その結果、ゲルの弾性率も放射線の線量に依存することになる。
　また、親水性高分子の架橋密度が高いほど、含水率が低くなる（ハイドロゲル中の親水性高分子の含有率が高くなる）。よって、ハイドロゲル中の親水性高分子の含有率も、照射する放射線の線量に依存することになる。
　牛由来のゼラチンと、豚由来のゼラチンについて、ガンマ線の線量と、架橋したハイドロゲルの弾性率を調べた例を、図１に示す。ゼラチンの種類により、多少傾向は異なるが、０～１００ｋＧｙのガンマ線線量の間で、線量と弾性率とは、およそ直線関係にあることがわかる。言い換えると、求められるハイドロゲルの弾性率に応じて、放射線の線量を定めることができる。
　なお、放射線照射に際して、環境温度は４～５０℃、前駆体中の溶存酸素濃度は０～４０ｍｇ／Ｌであることが望ましい。
　上記放射線照射時の環境温度は、親水性高分子の性質に応じて適宜設定すればよい。例えばコラーゲンを用いる場合であれば４～２５℃程度の低温で放射線を照射することで効率よく放射線架橋することができ、ゼラチンを用いる場合であれば１０～３０℃の温度環境下で放射線を照射することで効率よく放射線架橋することができる。
　また、放射線照射における前駆体の溶存酸素は、ラジカルを捕捉する効果がある。換言すると、前駆体中の溶存酸素濃度を高濃度とすることで、架橋密度が低くなり、結果としてハイドロゲルの弾性率を低くすることができる。具体的な手法としては、例えば、酸素濃度が高い環境で放射線を照射する、高酸素濃度下に上記前駆体を放置する、上記前駆体に酸素をバブリングする、といった方法により、上記前駆体中の溶存酸素濃度を増大させることができる。
　また、前駆体中の溶存酸素濃度を低濃度とすることで、架橋密度が高くなり、結果としてハイドロゲルの弾性率を高くすることができる。具体的な手法としては、窒素環境下で放射線を照射する、上記前駆体に窒素をバブリングするといった方法により、上記前駆体中の溶存酸素濃度を低減することができる。
　また、溶存酸素濃度の低い前駆体を、高酸素濃度下で放射線照射することで、酸素と接する面（典型的には細胞培養面）とそれ以外の部分とで溶存酸素濃度を変化させることができる。これら酸素濃度の制御により、ハイドロゲルの細胞培養に供する表面のみ（培養する細胞と接触する表面のみ）を、所望の弾性率とし、それ以外の部分を表面よりも高い弾性率とすることも可能である。例えば、平板状のハイドロゲルの場合、基底部分を高い弾性率とし、細胞培養に供する面のみを低い弾性率とすることができる。
　以上述べたように、細胞培養足場用ハイドロゲルの製造方法は、放射線を照射する工程（線量１～１０００ｋＧｙ）を含むものである。放射線照射工程は、所定の放射線照射により親水性高分子に架橋が生じ、所定の弾性率を付与するものである。このとき、放射線が有する高いエネルギーが、ハイドロゲル前駆体内の成長因子にも作用して、当該成長因子の活性を低減することができる。すなわち、放射線照射により、親水性高分子の架橋と生理活性因子の活性低減の両方の効果を奏することから、簡便な方法で足場用ハイドロゲルを提供することができる。放射線照により足場用ハイドロゲルを製造する製造方法は、上記前駆体中に含まれる生理活性因子の活性が比較的低い場合に特に好適である。さらに、上記放射線照射は、細胞培養足場用ハイドロゲルを殺菌（滅菌）することができる観点からも優れている。
（放射線照射前後の各種処理）
　細胞培養足場用ハイドロゲルの製造方法は、生理活性因子（例えば成長因子）の活性を低減する処理をさらに含んでもよい。
　例えば、放射線照射により架橋したハイドロゲルに対して、ｐＨの調整処理を行う（ｐＨ調整工程）ことで、当該ハイドロゲル中の生理活性因子（例えば成長因子）の活性を低減することができる。放射線照射後に、塩基性の溶液や緩衝溶液を用いて、ｐＨ＝６～８にｐＨ調整することによって、生理活性因子の活性が低減された細胞培養の足場として用いることができるようになる。
　放射線照射後のｐＨ調整工程において用いられ得る塩基性の溶液や緩衝溶液としては、様々に市販されている緩衝溶液（例えば、ＰＢＳ）や培地、もしくは水を選択することができる。培地には、フェノールスルホンフタレイン（フェノールレッド）を含んでもよい。
　例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル最小必須培地α改変型（α－ＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（ＧＭＥＭ）、Ｉイスコフ改変ダルベッコ培地、栄養混合物Ｆ－１２ハム（Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２）、ＲＰＭＩ－１６４０などを用いることができる。
　放射線照射後のｐＨ調整工程の温度条件としては特に限定されないが、好ましくは４～６０℃、より好ましくは３２～３８℃で行ってもよい。
　上記生理活性因子の活性低減処理として、加熱処理を行ってもよい。生理活性因子は高温環境に晒すことでその活性が不可逆的に失活することができる。この加熱処理は、上記放射線照射工程を行うよりも前、或いは放射線照射工程後のいずれのタイミングで実施してもよい。例えば、放射線照射前の前駆体に加熱処理を施すことで、前駆体中の生理活性因子の活性を低減することができる。特に限定するものではないが、５０℃以上で１分以上加熱すればよい。なお、加熱温度の上限は特に限定されないが、例えば６０℃以下とすればよく、加熱時間の上限は、５分以下とすればよい。
　また、上記生理活性因子の活性低減処理として、放射線照射に先立って、あらかじめ前駆体のｐＨをｐＨ５以下（好ましくはｐＨ４以下）とする酸処理、或いはｐＨ８以上（好ましくはｐＨ９以上）とするアルカリ処理を施してもよい。生理活性因子は酸環境下或いはアルカリ環境下に晒されることでその活性が不可逆的に失活することができる。すなわち、かかる酸処理又はアルカリ処理を施すことで、前駆体中の生理活性因子の活性を低減することができる。
　これら生理活性因子の活性低減処理の方法は、親水性高分子の性質に応じて適宜選択すればよい。
　例えば、親水性高分子としてゼラチンを選択する場合であれば、前駆体を加熱処理する方法を好適に採用することができる。この方法を採用することで、水溶液中にゼラチンを溶解させる処理と、生理活性因子の活性低減処理とを、同時に実現することができ、細胞培養足場用ハイドロゲルを簡便に製造することができる。
　また、例えば、親水性高分子としてコラーゲンを選択する場合であれば、放射線照射して得たハイドロゲルを、ｐＨ調整処理することが好ましい。典型的に、コラーゲンを高温環境下に晒すと変性しがちであり、放射線照射による架橋が困難となりがちである。このため、放射線照射前の前駆体の加熱処理よりも、放射線照射後の成長因子の活性低減処理（例えばｐＨ調整処理、加熱処理）を選択することが好ましい。
　以上述べたように、細胞培養足場用ハイドロゲルの製造方法の好適な実施態様は、放射線を照射する工程と、生理活性因子の活性を低減する工程を含むものである。放射線照射工程と、生理活性因子の活性低減工程の両工程を有することにより、前駆体に含まれる成長因子を大幅に減らすことができ、上述した定義によるハイドロゲルの増殖活性を１０５％未満に抑制することができる。
　ここで、放射線照射工程と、生理活性因子の活性低減工程の両工程を有する本発明のハイドロゲル製造方法は、２つの工程の成長因子削減作用を加算した以上の効果を発揮する。すなわち、放射線照射によってのみ、成長因子の活性を所定レベル以下に減じようとする場合、放射線の照射により、ハイドロゲルに求める弾性率を超えることがあり得る。つまり成長因子の活性減少は、放射線線量を増大する方向に作用させることとなるから、例えば神経細胞の培養のような、数ｋＰａ程度の弾性率の小さいゲルを得ようとするときに障害となる。
　また、生理活性因子の活性低減処理によってのみでは、成長因子の活性を所望のレベルまで減少させることが困難な場合がある。
　したがって、放射線照射工程と、生理活性因子の活性低減工程の両工程を有することにより、成長因子の活性を効果的に減少させつつ、所望の細胞の培養に必要な弾性率の確保とを、同時に獲得しやすくなる。さらに、上記生理活性因子の活性低減工程として、上記ｐＨ調整は、細胞培養用足場材のｐＨを細胞培養に最適なｐＨとすることができる点で好ましい。
　なお、上記生理活性因子の活性低減処理は、１種のみを採用してもよいし、２種以上の処理を組み合わせて実施してもよい。
　このように、放射線照射工程と、生理活性因子の活性低減工程の両工程の処理を行うことにより、前駆体に成長因子が、ある程度含まれていても、培養細胞の遺伝子発現や分化状態の制御が安定的に行われる。具体的には、上述したように、前駆体には、成長因子を、０～１０００ｎｇ／ｍＬで含むことができる。これにより、親水性高分子として高度に精製された原料を用いる必要がなくなり、汎用的に流通している親水性高分子（例えばタンパク質）を用いることができ、材料の選択幅が広がるとともに、材料コストも低減することができる。
　上述した放射線照射工程、生理活性因子の活性失活工程に加えて、ハイドロゲル表面の形状を加工する表面加工工程を加えてもよい。かかる表面加工工程は、ハイドロゲル前駆体に所定形状のモールドを押圧する方法が例示される。本発明のハイドロゲル前駆体は、弾性率が比較的低いため、モールドを押し当てたまま放射線照射することで、モールドの形状をハイドロゲルに転写できる。かかるモールドの表面形状は、所望のハイドロゲルの細胞培養面の形状に対応した形状とすればよい。例えば、所定の間隔の平行溝を有するモールド、所定の大きさ及び間隔の凸部を有するモールドが例示される。細胞培養において、平行溝は、細胞に一定の形態、一定の活動方向性を付与する効果がある。また、モールドの凸部がハイドロゲルに転写された凹部は、細胞培養において、所定の細胞を隔離・保持するマイクロウェルとしての役割を果たす効果を発揮し得る。
　モールドの材質は、非水溶性の材料ならば特に制限はなく、シリコン、ガラス、合成樹脂などを用いることができる。モールドは、押圧後に剥離するため、フレキシブルなものが好ましく、合成樹脂が望ましい。
　平行溝を構成する溝は、直線であっても、点線であってもよい。平行溝の間隔は任意であるが、０．５～１０００μｍを好適に用いることができる。平行溝の間隔は、一定であっても可変であってもよい。平行溝の深さは任意であるが、０．５～５００μｍを好適に用いることができる。
　上記凸部は任意の形状とすればよく、例えばドット状とすればよい。例えば直径１０μｍ～１０００μｍの略円形状（典型的には円）とし得る。このような凸部を転写することで、直径１０μｍ～１０００μｍの凹部を形成し得る。このような凹部によると、複数の細胞（例えば細胞集団、コロニー、受精卵）を凹部に補足して培養し得る。
　また、例えば直径１０μｍ～１００μｍの凸部を転写して、直径１０～１００μｍの凹部を形成してもよい。凹部の大きさをこの範囲とすることで、当該凹部に補足可能な細胞数を制限し得る。例えば直径２０～３０μｍの凸部を転写して、直径２０～３０μｍの凹部を形成してもよい。
　このような凹部を有する培養用足場は、凹部１個当たり平均１～１０個程度（典型的には平均１～３個、好ましくは平均１個）の細胞を隔離、保持して培養する目的に対し、好適に用いることができる。
　以上の点を踏まえ、一実施形態において、線維芽細胞、子宮頸癌細胞を培養するための、弾性率５～６０ｋＰａのハイドロゲル（コラーゲンゲル）を製造する場合、以下の条件の試料にガンマ線照射し、ｐＨ調整処理される。
　親水性高分子（コラーゲン）の分子量：６００，０００以下（例えば、２００，０００～６００，０００、好ましくは４００，０００～５００，０００）
　親水性高分子（コラーゲン）溶液の濃度：０．１～５．０質量％
　溶存酸素濃度：０～８ｍｇ／Ｌ
　ガンマ線線量：１～１００ｋＧｙ（好ましくは２～５０ｋＧｙ）、
　ガンマ線照射時の溶液温度が４～３７℃（好ましくは４～２５℃）、
　ｐＨ調整処理：ＤＭＥＭ培地、３７℃で１０～１８０分。
　また、他の実施形態において、メラニン産生細胞、腹腔由来の食細胞、心筋細胞、破骨細胞、上皮細胞、線維芽細胞、心筋細胞、乳がん細胞、乳腺がん細胞、脳腫瘍細胞、子宮がん細胞、子宮頸癌細胞、膵臓がん細胞、筋芽細胞を培養するための、弾性率１～２００ｋＰａのハイドロゲル（ゼラチンゲル）を製造する場合、以下の条件の試料を調製し、前処理後のガンマ線照射が選択される。
　親水性高分子（ゼラチン）の分子量：２００，０００以下（例えば、１００，０００～１７０，０００）
　親水性高分子（ゼラチン）溶液の濃度：０．１～７０質量％
　溶存酸素濃度：０～８ｍｇ／Ｌ
　ガンマ線線量：１～３００ｋＧｙ（好ましくは２～２００ｋＧｙ）
　ガンマ線照射時の溶液温度が４～３７℃（好ましくは１０～３０℃）。
　ｐＨ調整処理：ＤＭＥＭ培地、５０℃で１０～１８０分。
　上記［本発明のハイドロゲルを含むゲルキット］のとおり、本発明のハイドロゲルに、生理活性因子を添加することで、添加された成分に応じた所望の作用をハイドロゲルに付与することができる。
　したがって、放射線照射工程後に生理活性因子を添加する工程を行ってもよい。
　添加される生理活性因子（例えば細胞増殖因子及び細胞外マトリックス）の詳細は上記［本発明のハイドロゲルを含むゲルキット］で説明したものと同様である。
　以下、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　なお、以下、放射線照射されていないゲルに対して行うｐＨ調整処理を「中和ｐＨ調整処理」ともいい、放射線照射後のゲルに対して行うｐＨ調整処理を「照射後ｐＨ調整処理」ともいう。
（参考例１）成長因子を含むタンパク質に対する、放射線照射処理の影響、並びに、放射線照射処理及び照射後ｐＨ調整処理の影響
　以下の２種類のハイドロゲルを作製し、ハイドロゲル中の成長因子の存在量を抗体染色の蛍光強度から評価した。なお、ゲル２が本発明のハイドロゲルに相当する。
（ゲル１－１）成長因子を含むタンパク質にガンマ線を照射したもの
（ゲル１－２）成長因子を含むタンパク質にガンマ線を照射した後にｐＨ調整処理（照射後ｐＨ調整処理）したもの
＜材料及び方法＞
　高純度の牛真皮由来Ｉ型コラーゲン溶液（株式会社ニッピ製コラーゲンゲル細胞培養キットＴｒｉ－Ｄ、以下同様。）に対し、成長因子である線維芽細胞増殖因子－１（ＦＧＦ１、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、２３２－ＦＡ－０２５／ＣＦ）を０、３０、３００、３０００ｎｇ／ｍＬの各濃度で添加したＤＭＥＭ培地を加えた。混合比は、コラーゲン溶液：ＤＭＥＭ＝２：１とした。次いで、得られた混合物をガラスベースディッシュに１００μＬずつ入れ、すみやかにＣＯ２インキュベーター内で３７℃に昇温してコラーゲンを繊維化した。
　上記の操作により、成長因子を含むタンパク質として、ＦＧＦ１を０、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬ含む中和コラーゲンゲルを得た。
　各中和コラーゲンゲルをＦＧＦ１抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ｓｃ－５５５２０）及び二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ３２７２３）で染色し、同一条件下で蛍光観察することによって、ＦＧＦ１含有量の異なる中和コラーゲンゲルと蛍光強度の関係、すなわち検量線を得た。
　そして、ＦＧＦ１を１０００ｎｇ／ｍＬ含む中和コラーゲンゲルにガンマ線を１ｋＧｙ照射したもの（ゲル１－１に相当する。）、及び、ＦＧＦ１を１０００ｎｇ／ｍＬ含む中和コラーゲンゲルにガンマ線を１ｋＧｙ照射後にＰＢＳにより３７℃以上でｐＨ７．４となるように調整したもの（ゲル１－２に相当する。）をそれぞれ得た。これらのゲルに対して、上記同様に免疫染色を行って蛍光強度を計測した。
＜結果＞
　免疫染色後の蛍光強度の計測結果を図９に示す。なお、図９中、蛍光強度の値が高いほど、ゲル中のＦＧＦ１濃度が高いことを意味する。
　図９に示すように、いずれのゲルにおいてもＦＧＦ１濃度は低減されていた。さらに、ゲル１－２の蛍光強度はゲル１－１よりも低く、検出限界（２００ｎｇ／ｍＬ）よりも低かった。これらのことから、放射線照射後にｐＨ調整することでＦＧＦ１濃度をより低減でき、原料中に１０００ｎｇ／ｍＬもの高濃度でＦＧＦ１が含まれていたとしても、その量を検出限界以下にまで低減できることがわかった。
（参考例２）成長因子を含むタンパク質を足場原料に用いた場合のＮＩＨ－３Ｔ３細胞の増殖活性の評価（中和ｐＨ調整処理の影響）
　成長因子を含むタンパク質をｐＨ調整処理した後、昇温によりハイドロゲル足場とし、足場上でマウス胎児皮膚由来の線維芽細胞である３Ｔ３細胞を培養し、増殖活性を評価した。
＜材料及び方法＞
　高純度のコラーゲン溶液として、高純度の牛真皮由来Ｉ型コラーゲン溶液を用意し、これにＦＧＦ１を０、１０、１００ｎｇ／ｍＬの各濃度で添加した。これを９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１０μＬ入れ、５μＬの無色ＤＭＥＭ培地を加え、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃に昇温し、ｐＨ＝７．１～７．５にｐＨ調整処理した。これにより、コラーゲン溶液中のコラーゲンが繊維化し、中和コラーゲンゲルが得られた。該中和コラーゲンゲルは、成長因子を含むタンパク質を中和ｐＨ調整処理したものに相当する。
　この中和コラーゲンゲルを足場として、３Ｔ３細胞を５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で９０μＬ播種し、２４時間培養してＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（株式会社同仁化学研究所製）を１０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。その後インキュベーター内で４時間呈色反応を行い、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。
＜結果＞
　図２に、ＦＧＦ１の濃度による吸光度の変化、すなわち増殖活性の変化を、ＦＧＦ１無添加の場合を１００％として示す。ＦＧＦ１の濃度上昇に応じ、増殖活性が上昇しており、３Ｔ３細胞が成長因子の影響を受けていることがわかる。
　本結果は、既知又は未詳の成長因子を１つ以上含む生体由来のタンパク質材料を培養基材として用いる場合、細胞培養が成長因子の影響を受けることを示している。
　また、成長因子の抑制は、５μＬのＤＭＥＭ培地によるｐＨ調整処理では不充分であることを示している。
（参考例３）成長因子を含むタンパク質を足場原料に用いた場合の３Ｔ３細胞の増殖活性の評価（放射線照射処理の影響）
　成長因子を含むタンパク質を前駆体として、ガンマ線を照射し、マウス胎児皮膚由来の線維芽細胞である３Ｔ３細胞を培養し、増殖活性を評価した。
＜材料及び方法＞
　１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）を含む無色ＤＭＥＭ溶液に線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ１）を０、１、１０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、ガンマ線を５ｋＧｙ照射してから、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１０μＬずつ入れ、さらに３Ｔ３細胞を５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で９０μＬ播種した。２４時間培養してＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８を１０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、その後インキュベーター内で４時間呈色反応を行い、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。
＜結果＞
　図３に、ＦＧＦ１の濃度による吸光度の変化、すなわち増殖活性の変化を、ＦＧＦ１無添加の場合を１００％として示す。ＦＧＦ１の濃度上昇に応じ、増殖活性が上昇しており、３Ｔ３細胞が成長因子の影響を受けていることがわかる。
　本結果は、既知又は未詳の成長因子を１つ以上含む生体由来材料にガンマ線を照射したものを培養基材に用いても、細胞が基材由来の成長因子の影響を受け、培養結果が安定しないことを示している。
　また、成長因子の抑制は、５ｋＧｙのガンマ線照射処理では不充分であることを示している。
（実施例１）成長因子を含むタンパク質を足場原料に用いた場合の３Ｔ３細胞の増殖活性の評価（放射線照射処理及び照射後ｐＨ調整処理の影響）
　成長因子を含むタンパク質を前駆体として、ガンマ線を照射し、ハイドロゲルを製造し、３７℃以上でｐＨ調整処理したものを足場として、マウス胎児皮膚由来の線維芽細胞である３Ｔ３細胞を培養し、増殖活性を評価した。
＜材料及び方法＞
　高純度の牛真皮由来Ｉ型コラーゲン溶液に、ＦＧＦ１を０、１０、１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１０μＬずつ入れ、ガンマ線を５ｋＧｙ照射してから、無色ＤＭＥＭ培地を加えて３７℃でｐＨ７．１～７．５となるようにｐＨ調整処理（照射後ｐＨ調整処理）を行った。ｐＨ調整処理に用いた無色ＤＭＥＭ培地を除いてから、３Ｔ３細胞を５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で９０μＬ播種し、２４時間培養して、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８を１０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。その後インキュベーター内で４時間呈色反応を行い、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。
＜結果＞
　図４に、ＦＧＦ１の濃度による吸光度の変化、すなわち増殖活性の変化を、ＦＧＦ１無添加の場合を１００％として示す。増殖活性はＦＧＦ１の濃度にかかわらず１０５％未満であり、３Ｔ３細胞が成長因子の影響を受けていないことがわかる。
　本結果は、既知又は未詳の成長因子を１つ以上含む生体由来材料に対し、ガンマ線を照射し、３７℃以上でｐＨ調整処理を行ったのち培養に用いる場合、すなわち本発明により得られるハイドロゲルを培養基材に用いた場合、培養細胞が基材中に含まれていた成長因子の影響を受けず、培養結果が安定することを示している。
　また、本結果及び上記（参考例１）は、成長因子を含むタンパク質を原料に用いても、放射線照射処理及びｐＨ調整処理（照射後ｐＨ調整処理）によって、細胞培養結果に影響を与えないレベルにまで成長因子を不活化できることを示している。
（実施例２）ハイドロゲル足場におけるマウス腹腔由来の食細胞の培養
　ハイドロゲル足場に播種・培養したマウス腹腔由来の食細胞の増殖を光学顕微鏡により直接観測した。得られた画像より食細胞の増殖の様子を観測した。
＜材料及び方法＞
　蒸留水１Ｌに豚ゼラチン１０ｗｔ％を加え、５０℃において充分に攪拌してゼラチン水溶液を得た。さらに、この溶液を３５ｍｍディッシュに移し、温度２０℃で物理ゲル化・空気飽和したのちに、ガンマ線を温度２５℃、線量率１０ｋＧｙ／ｈ、線量２０ｋＧｙ照射した。得られたハイドロゲルであるゼラチン架橋体は、圧縮試験による応力―ひずみ曲線から、弾性率が１６ｋＰａであることを確認した。
　得られたハイドロゲルにＲＰＭＩ－１０％ＦＣＳ培地及び１，０００，０００のマウス腹腔食細胞集団を投入し、５％ＣＯ２下、３７℃で培養して、定期的に生育状態を位相差顕微鏡で観察した。
　なお、マウス腹腔食細胞集団は、チオグリコレート培地をマウス腹腔内に投与し、４日後にマウスから採取した腹腔滲出細胞を、ポリスチレンシャーレ内の１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地中で１日培養して、シャーレに付着した細胞を分取し、さらに７日間培養したのちに、シャーレからトリプシンで剥がして調製したものである。
＜結果＞
　図５に得られた顕微鏡像を示す。通常の培養実験で用いられるポリスチレンディッシュを使用すると、食細胞集団中のほとんどの細胞は分化してディッシュ表面に広がって強固に付着して増殖能力を失い、生体に移植してもすぐに活動能力を失う。広がった細胞の表面に散在した球形細胞は増殖能の高い低分化細胞であり、移植に適しているものの、得られる数は少ない（図５（ａ））。
　一方、弾性率１６ｋＰａのゼラチン架橋体上で食細胞集団を培養すると、ごく一部の細胞が表面に付着して細長く伸び（図５（ｂ）、細長い線状の細胞）、その表面に房のように、大多数の細胞をその球形を維持させたまま付着させている。さらに培養を進め、球形細胞の数は増殖を続けて数を増し（図５（ｃ））、移植可能な増殖能力のある球状の低分化細胞を多量に調製することもできる。
　本発明のハイドロゲルは、低分化又は未分化の細胞集団を増殖可能であることを示しており、再生医療における細胞ソースの調製に、密接に関連するものである。
（実施例３）ハイドロゲル足場におけるメラノーマ細胞の培養
　ハイドロゲル足場上に播種・培養したメラノーマ細胞の増殖、及びメラニン産生による着色を、光学顕微鏡により直接観測した。さらにメラニン産生量を吸光度により測定した。
＜材料及び方法＞
　蒸留水１Ｌに豚ゼラチン１０ｗｔ％を加え、５０℃において充分に攪拌してゼラチン水溶液を得た。さらに、この溶液を３５ｍｍディッシュに移し、温度２０℃で物理ゲル化・空気飽和したのちに、ガンマ線を温度２５℃、線量率１０ｋＧｙ／ｈ、線量１０、２０、４０ｋＧｙで照射した。得られたハイドロゲルであるゼラチン架橋体は、圧縮試験による応力―ひずみ曲線から、弾性率がそれぞれ約５、約１６、約４８ｋＧｙであることを確認した。得られたゼラチン架橋体上と通常の培養実験で用いられるプラスチックディッシュ上で、マウス悪性黒色腫由来のＢ１６Ｆ１０細胞をそれぞれ培養し、その後経時的に光学顕微鏡で観察並びにメラニン産生量の定量を行った。メラニン産生量は、回収した細胞をＰＢＳで洗浄後、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００存在下での可用性タンパク質量と、１Ｎ　ＮａＯＨで、８５℃、３０分処理した際に可溶化したメラニン量により算出した。
＜結果＞
　図６に得られた顕微鏡像を示す。観察された像よりプラスチックディッシュ上で２Ｄ培養した細胞には明確なメラニン産生が認められない（図６（ａ））が、ゼラチン架橋体上で培養した細胞は、弾性率５～４８ｋＰａのいずれでも、細胞塊（ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）を形成し、細胞塊によっては高密度のメラニンを産生していることが認められる（図６（ｂ）～（ｄ））。
　また、定量的解析の結果から、メラニンは２Ｄ培養条件下ではほとんど産生されないが、ゼラチン架橋体上での培養では経時的に顕著に産生されることを示している。またこの産生量にゼラチン架橋体の硬さが影響していることも認められている。
　本結果は、ハイドロゲルの弾性率によって、生体内同様に、細胞の遺伝子発現を変調できることを示しており、創薬やがん治療研究に密接に関連するものである。
（実施例４）ハイドロゲル足場におけるヒト子宮頸癌由来のＨｅＬａ細胞の培養（１）
　平滑、及び５μｍのライン状凹凸（平行溝）の微細構造を付与した表面を有するハイドロゲル足場上に、播種・培養したヒト由来の子宮頸癌由来がん細胞であるＨｅＬａ細胞の形態を、光学顕微鏡により直接観測した。得られた画像より、細胞のサイズ（接着面積）、縦横比、回転を計測した。
　＜材料及び方法＞
　蒸留水１Ｌに、豚ゼラチン１０ｗｔ％を加え、５０℃において充分に攪拌して、ゼラチン水溶液を得た。さらに、この溶液を３５ｍｍディッシュに移し、温度２０℃で物理ゲル化・空気飽和したのちに、ガンマ線を温度２５℃、線量率１０ｋＧｙ／ｈ、線量を１０ｋＧｙ及び４０ｋＧｙ照射した。得られたゼラチン架橋体は、圧縮試験による応力―ひずみ曲線から、弾性率がそれぞれ５ｋＰａと４８ｋＰａであることを確認した。
　また、水溶液上に５μｍのライン状凹凸（平行溝）を有するモールドを押圧し、上記と同様に放射線を照射し、同じ弾性率（それぞれ５ｋＰａと４８ｋＰａ）であり、表面に５μｍのライン状凹凸を有するハイドロゲル足場を作製した。
　得られた４種類のハイドロゲル足場表面上と、通常の培養実験で用いられるポリスチレンディッシュ表面上で、それぞれＨｅＬａ細胞を培養し、光学顕微鏡で観察した。
＜結果＞
　図７に得られた顕微鏡像を示す。観察された像より、上皮系細胞のＨｅＬａが硬さ５ｋＰａの平滑なハイドロゲル上では、３次元的に細胞塊を作ることがわかる（図７（ａ））。その一方、硬さ４８ｋＰａの平滑なハイドロゲル上では２次元的に伸展し、且つ、間葉系様の形態を示すことがわかる（図７（ｂ））。
　また、５ｋＰａの弾性率であっても、５μｍのライン状凹凸があると、その形状に応答して、形態が変化することがわかる（図７（ｄ））。５μｍのライン状凹凸を有する弾性率４８ｋＰａの場合も、５ｋＰａ弾性率の場合と同様に形態が変化する（図７（ｅ））。
　一方、ハイドロゲル足場を用いず、ポリスチレンディッシュ上にて培養した場合、２次元的に伸展し、且つ敷石状の上皮系様形態を示す（図７（ｃ））。
　これらの結果は、ハイドロゲルの弾性率と、表面形状（表面の微細構造）の両方が、細胞の遺伝子発現に影響を及ぼすことが示している。
　次に、弾性率５～６７ｋＰａのハイドロゲル（培養表面は平滑）と、ポリスチレンディッシュにおける細胞培養の増殖率を調べた結果を、図８に示す（培養開始時を１とし、１～３日目に計測）。図８より、弾性率５～６７ｋＰａのハイドロゲルのいずれも、通常のプラスチックディッシュと同等の速度で、細胞を培養できることがわかる。すなわち、細胞の増殖率はそのままで、遺伝子発現のみ制御することが可能であることを示している。
　本結果は、細胞の遺伝子発現や分化状態が、ハイドロゲルの弾性率や表面形状によって制御できることを示しており、再生医療における細胞ソースの調製に密接に関連する。
（実施例５）ハイドロゲル足場におけるヒト子宮頸癌由来のＨｅＬａ細胞の培養（２）
　実施例４と同じ条件で作製したゼラチン水溶液を、空気雰囲気で、温度２５℃で、２ＭｅＶの電子線を、線量率１０ｋＧｙ／回で１～２０回、トータル線量で１０～２００ｋＧｙ照射した。得られたタンパク質架橋体上に子宮頸癌由来がん細胞を播種したところ、実施例４と同様の、弾性率による形態変化が観測された。
　本結果は、電子線照射でも、ガンマ線照射と同様に、線量によるハイドロゲルの弾性率の調整が可能であり、遺伝子発現の制御が可能であることを示している。すなわちガンマ線のような電磁波に限らず、本発明が放射線全般に拡張可能であることを示すものである。
（実施例６～２１）
　以下の条件のハイドロゲル足場上で、各種細胞の培養試験を行い、遺伝子発現能を調べた。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　表１に示すように、培養細胞の種類により異なった応答を示すものの、ハイドロゲル足場の弾性率及び／又は表面形状を適切に選択することにより、遺伝子発現を制御し得ることを示している。
（参考例３）　放射線架橋と化学架橋後の残存アミノ酸の比較
　分子量１５０，０００の豚ゼラチン１０質量％に蒸留水９０質量％を加え、２５℃において空気雰囲気で（酸素含有量約２１％、大気圧）、１０分間攪拌して溶存酸素濃度８ｍｇ／Ｌのゼラチン水溶液を得た。
　この水溶液に対し、空気雰囲気で、温度２５℃で、Ｃｏ６０照射施設においてガンマ線を線量率１０ｋＧｙ／ｈ、線量６０ｋＧｙで照射し、放射線架橋ゼラチンゲルを得た。
　また、上記ゼラチン水溶液に、化学架橋剤であるグルタルアルデヒドの水溶液（０．４８重要％）を等量加え４０℃で１２時間反応させたのち、１００ｍＭのグリシン水溶液で５０℃１時間洗浄し化学架橋ゼラチンゲルを得た。
　それぞれの手法で得られた架橋ゼラチンゲルを３０℃で２４時間真空乾燥し、約１ｍｇを１．５ｍＬの小型バイアルに採取した。窒素飽和条件下、１１０℃で塩酸により２４時間加水分解した。
　リファレンスとして未架橋のゼラチンも同様に加水分解した。その後、水酸化ナトリウムで中和し、各アミノ酸を４－Ｆｌｕｏｒｏ－７－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎにより蛍光標識し、ＨＰＬＣにより定性、定量測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　解析の結果、表２に示すように、未処理のゼラチンと比較して、グルタルアルデヒド処理ではリジンが２０％程度まで減少するものの、ガンマ線照射では４０％程度に留まることが明らかにされた。さらに、放射線照射では、マイクロ秒の寿命を持つ中間体を形成するフェニルアラニンが架橋に関与すると考えられる。
　以上、本発明の細胞培養用ハイドロゲル、細胞培養物の製造方法、細胞培養用ハイドロゲルの製造方法について、実施例を含めて説明してきた。上記説明は、本発明の基本的な構成態様を示したものにすぎず、各種応用が可能である。
　例えば本発明の細胞培養用ハイドロゲルを、細胞培養器（細胞培養容器）に内蔵する足場として用いてもよい。
　また、本発明の細胞培養物の製造方法において培養する細胞は、移植などの治療用の細胞の培養に用いるものであってよく、また、薬理試験用（例えば薬物のスクリーニング用）の細胞の培養に用いるものであってもよい。また、これら細胞培養物を、治療（例えば再生医療）、細胞培養物を用いた薬理試験方法（例えばスクリーニング方法）に用いることもできる。
　また、細胞培養用ハイドロゲルの製造方法において、平行溝の形成は、上述の溝形成工程によってのみ形成し得るものではない。放射線照射工程において、放射線がビーム状であり、スキャンのできる放射線照射装置であれば、放射線照射の有無によって作成することもできる。例えば２次元平面のラスタースキャンを行い、奇数ラインを放射線照射し、偶数ラインを放射線照射しない、を繰り返すことによって、平行溝を有するハイドロゲル足場を形成することができる。この製造方法による溝形成を行う場合には、モールドを用いる溝形成は不要とすることができる。
（実施例２２）本発明に係る製造方法から得られたハイドロゲルにおける細胞増殖因子の含有量に関する評価
　以下の２種類のハイドロゲルを作製し、これらを足場として３Ｔ３細胞を培養し、細胞増殖活性を比較することで、細胞増殖因子の含有量を評価した。なお、ゲル２２－２が本発明に係る製造方法から得られたハイドロゲルに相当する。
（ゲル２２－１）規定量の成長因子を含むタンパク質
（ゲル２２－２）規定量の成長因子を含むタンパク質を原料として放射線照射処理及びｐＨ調整処理（照射後ｐＨ調整処理）したもの
＜材料及び方法＞
　高純度の牛真皮由来Ｉ型コラーゲン溶液に対し、ＦＧＦ１を０、０．０１５、０．３、１．５、３、３０ｎｇ／ｍＬの各濃度で添加したＤＭＥＭ培地を加えた。混合比は、コラーゲン溶液：ＤＭＥＭ＝２：１とした。得られた混合物を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに４０μＬずつ入れ、すみやかにＣＯ２インキュベーター内で３７℃に昇温し、コラーゲンを繊維化した。
　上記の操作により、成長因子を含むタンパク質として、ＦＧＦ１を０、０．００５、０．１、０．５、１、１０ｎｇ／ｍＬ含む中和コラーゲンゲルを得た。該中和コラーゲンゲルは、ゲル２２－１に相当する。
　また、種々の濃度のＦＧＦ１を含む中和コラーゲンゲルにガンマ線を１ｋＧｙ照射してから、ＤＭＥＭ培地を加えて３７℃でｐＨ７．１～７．５となるように調整したハイドロゲルを得た。該ハイドロゲルはゲル２２－２に相当する。
　ゲル２２－１及びゲル２２－２に、それぞれ３Ｔ３細胞を５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で６０μＬ播種し、４８時間培養して、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８を１０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。その後インキュベーター内で１時間呈色反応を行い、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。
＜結果＞
　図１０に、中和コラーゲンゲル中のＦＧＦ１濃度に応じた吸光度の変化、すなわち細胞増殖活性の変化を示す。なお、図１０中、吸光度の値が高いほど、ゲルの細胞増殖活性が高いことを意味する。
　図１０のとおり、ゲル２２－１はゲル２２－２よりもゲルの細胞増殖活性が顕著に高かった。
　また、ゲル２２－２においては、原料として配合したＦＧＦ１濃度にかかわらず、増殖活性に増加傾向が見られず、ゲル２２－１から得られる検量線と比較するとゲル中のＦＧＦ１が１００ｐｇ／ｍＬ以下相当だった。すなわち、ゲル２２－２は、細胞増殖活性がＦＧＦ１活性換算で１００ｐｇ／ｍＬ以下であり、この量は、市販の生体抽出物由来のハイドロゲル（マトリゲルなど）中の細胞増殖因子量よりも顕著に少ない。
（実施例２３）高濃度タンパク質含有ハイドロゲルの作製
　高濃度のタンパク質（コラーゲン、ゼラチン、又はコラーゲンペプチド）を配合した溶液から、放射線照射によってハイドロゲルを作製し、該ゲル中の高分子濃度を評価した。
＜材料及び方法＞
　以下の３種の溶液を調製した。
（１）コラーゲン溶液
　豚真皮由来Ｉ型コラーゲン溶液（新田ゼラチン製Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＢＭ、６３９－３０８６１）を濃度５ｗｔ％に調製してコラーゲン水溶液を得た。
（２）ゼラチン溶液
　蒸留水１Ｌに、豚ゼラチン１０ｗｔ％を加え、５０℃で充分に攪拌してゼラチン水溶液を得た。
（３）コラーゲンペプチド溶液
　蒸留水１Ｌに豚コラーゲンペプチド１０ｗｔ％を加え、５０℃で充分に攪拌してコラーゲンペプチド水溶液を得た。
　上記溶液をそれぞれ３５ｍｍディッシュに移し、コラーゲン溶液及びゼラチン溶液は温度２０℃で空気飽和させ、コラーゲンペプチド溶液は４℃で空気飽和させた。次いで、ガンマ線を温度１５℃、線量率１０ｋＧｙ／ｈで線量５ｋＧｙから６０ｋＧｙ照射した。
　得られたハイドロゲルの乾燥前後の重量から、ハイドロゲル中の高分子濃度を評価した。
＜結果＞
　図１１に放射線照射量に対するハイドロゲル中の高分子濃度を示す。図１１に示されるとおり、放射線照射量が増えるほど、ハイドロゲル中の高分子濃度が増加した。この結果は、ハイドロゲルの原料であるコラーゲン、ゼラチン、又はコラーゲンペプチドが、放射線照射によってゲル化し、高分子を形成したことを意味する。上記方法で得られたハイドロゲル中の高分子濃度は、一般的な中和コラーゲンゲルや生体抽出物由来のハイドロゲル（マトリゲルなど）中の高分子濃度（一般的に１％以下）よりも高かった。この結果から、ハイドロゲル中の高分子濃度を放射線照射量によって調整できることがわかった。
（実施例２４）ハイドロゲルへの所定成分の添加
　上記のとおり、本発明によれば、原料に含まれる成長因子量を低減させたハイドロゲルが得られる。本例では、このように得られたハイドロゲルへ所定成分を添加した場合に、該成分がハイドロゲル上で機能するかを検討した。具体的には、ハイドロゲルへ、細胞外マトリックスであるラミニン（細胞の接着、増殖、分化に関与するタンパク質）を添加し、ゲルにラミニンが含まれるかを評価した。
＜材料及び方法＞
　蒸留水１Ｌに豚ゼラチン１０ｗｔ％を加え、５０℃で充分に攪拌してゼラチン水溶液を得た。さらに、この溶液を３５ｍｍディッシュに移し、温度２０℃で物理ゲル化及び空気飽和させたのちに、ガンマ線を温度２５℃、線量率１０ｋＧｙ／ｈ、線量２０ｋＧｙ照射し、ハイドロゲル（ラミニンコーティングされていないハイドロゲル）を得た。
　得られたハイドロゲルに、超純水に溶解した０．１ｍｇ／ｍＬのラミニン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　２３０１７－０１５）を１ｍＬ添加し、４℃で一晩保管し、ラミニンコーティングされたハイドロゲルを得た。
　次いで、ラミニンコーティングされていないゲル、及び、ラミニンコーティングされたゲルのそれぞれで、ラット海馬神経細胞を５％ＣＯ２下、３７℃で培養して、定期的に生育状態を観察した。その後、ラミニン抗体（Ａｂｃａｍ　ａｂ１１５７５）及び二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ａ３２７３１）で染色し、蛍光観察によってラミニンがハイドロゲルに含まれるかどうかを確認した。
＜結果＞
　図１２に蛍光観察の結果を示す。図１２中、（Ａ）はラミニンコーティングされていないゲルの観察結果であり、（Ｂ）はラミニンコーティングされたゲルの観察結果である。ラミニンコーティングが機能していれば（つまり、ゲルにラミニンが含まれていれば）、海馬神経細胞がゲルに接着する。
　（Ａ）に示されるとおり、未コーティングのゲル上では神経細胞は接着しなかった。これに対し、（Ｂ）に示された、ラミニンコーティングされたゲル上では海馬神経細胞が接着し、突起を伸ばしていた。
　なお、図１２（Ｃ）は、ラミニンコーティングされたゲルにおいて、ラミニンが実際にコーティングされていることを蛍光染色で確認した結果である。
　以上の結果から、本発明のハイドロゲルに対して所定成分（成長因子など）を添加しても、該成分がハイドロゲル上で機能することがわかった。
（実施例２５）ハイドロゲルによるシングルセルの捕捉と培養
　１００～２００μｍ角の凹形状を付与したハイドロゲルを足場として用い、凹部へメラノーマ細胞を播種してその様子を光学顕微鏡により経時的に観測した。
＜材料及び方法＞
　蒸留水１Ｌに豚ゼラチン１０ｗｔ％を加え、５０℃で充分に攪拌してゼラチン水溶液を得た。さらに、この溶液をディッシュに移し、１００～２００μｍ角、高さ１００μｍの凸構造を有するモールドを押圧し、温度２０℃で物理ゲル化及び空気飽和したのちに、ガンマ線を温度１５℃、線量率５ｋＧｙ／ｈ、線量２０ｋＧｙ照射し、表面に凹形状を有するハイドロゲルを作製した。
　得られたハイドロゲルの凹部にマウス悪性黒色腫由来のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を播種した後、経時的に光学顕微鏡で観察した。
＜結果＞
　図１３は、１００μｍ角の凹形状を付与したハイドロゲルを用いた培養結果であり、細胞播種直後の状態である。図１３に示すように、メラノーマ細胞は１細胞ずつ凹形状のくぼみに補足された。
　この結果から、本発明のハイドロゲルによって、１細胞の捕捉とその培養が可能であることがわかった。なお、データは示していないが、ハイドロゲルに付与する凹部の形状は四角形に限られず、任意の形状であっても培養が可能であった。
　また、図１４は、１００μｍ角の凹形状を付与したハイドロゲルを用いた培養結果であり、細胞播種後８日後の状態である。図１４に示すように、メラノーマ細胞からのメラニン産生量の異なるスフェロイドを得ることができた。培養条件は変わらないにもかかわらず、メラニン産生量が異なるスフェロイドが得られたことは、各メラノーマ細胞の遺伝子発現が互いに異なることを意味する。
　この結果から、本発明のハイドロゲルによって、細胞を１つずつ個別にハイドロゲル足場上で培養し、異なる遺伝子発現を持つ細胞塊を作製できることがわかった。

Claims (26)

  1. 　細胞増殖活性が、線維芽細胞増殖因子－１活性換算で１００ｐｇ／ｍＬ以下であり、
    　弾性率が、０．１～５００ｋＰａであり、
    　親水性高分子の放射線架橋構造を有する、細胞培養用ハイドロゲル。
  2. 　前記細胞増殖活性が、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞のＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８を用いた２８時間インキュベートにおける増殖活性として、酸処理によって抽出された牛真皮由来Ｉ型コラーゲンゲルに比し、１０５％未満である請求項１に記載の細胞培養用ハイドロゲル。
  3. 　前記親水性高分子は、タンパク質である、請求項１又は２に記載のハイドロゲル。
  4. 　コラーゲン、コラーゲンペプチド、及び、ゼラチンからなる群から選択される１以上を、前記ハイドロゲルに対して、１質量％以上３０質量％以下含む、請求項１から３のいずれかに記載のハイドロゲル。
  5. 　凹部及び／又は平行溝を表面に有する請求項１から４のいずれかに記載のハイドロゲル。
  6. 　前記ハイドロゲルとは別体である生理活性因子を後添加するための、請求項１から５のいずれかに記載のハイドロゲル。
  7. 　分化誘導因子、接着因子、走化因子及び細胞外マトリックスからなる群から選択される１以上の因子が配合された、請求項１から５のいずれかに記載のハイドロゲル。
  8. 　請求項１から５のいずれかに記載のハイドロゲルと、前記ハイドロゲルとは別体の生理活性因子と、を含む、ゲルキット。
  9. 　請求項１から５のいずれかに記載のハイドロゲルに、細胞を接触させることにより、細胞を培養する細胞培養物の製造方法。
  10. 　前記ハイドロゲルとして、所望の遺伝子発現に対応する弾性率及び／又は表面形状を有するハイドロゲルを選択して用いる、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　前記遺伝子発現が、細胞の分化にかかわる遺伝子の発現、又は細胞の成長にかかわる遺伝子発現である、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 　前記細胞培養物が、メラニン産生細胞である請求項９から１１のいずれかに記載の細胞培養物の製造方法。
  13. 　前記細胞培養物が、腹腔由来の食細胞である請求項９から１１のいずれかに記載の細胞培養物の製造方法。
  14. 　前記細胞培養物が、心筋細胞である請求項９から１１のいずれかに記載の細胞培養物の製造方法。
  15. 　前記細胞培養物が、乳がん細胞である請求項９から１１のいずれかに記載の細胞培養物の製造方法。
  16. 　前記細胞培養物が、子宮がん細胞である請求項９から１１のいずれかに記載の細胞培養物の製造方法。
  17. 　前記細胞培養物が、細胞塊である請求項９から１６のいずれかに記載の細胞培養物の製造方法。
  18. 　細胞培養用ハイドロゲルの製造方法であって、
    　親水性高分子を、０．１～７０質量％含む水溶液に対し、
    　線量１～１０００ｋＧｙの放射線を照射する照射工程を含み、
    　前記照射後のハイドロゲルは、細胞増殖活性が線維芽細胞増殖因子－１活性換算で１００ｐｇ／ｍＬ以下であり、
    　前記照射後のハイドロゲルの弾性率は、０．１～５００ｋＰａであり、
    　前記照射後のハイドロゲルは、親水性高分子の放射線架橋構造を有する、細胞培養用ハイドロゲルの製造方法。
  19. 　前記照射後のハイドロゲルは、前記細胞増殖活性が、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞のＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８を用いた２８時間インキュベートにおける増殖活性として、酸処理によって抽出された牛真皮由来Ｉ型コラーゲンゲルに比し、１０５％未満である請求項１８に記載の細胞培養用ハイドロゲルの製造方法。
  20. 　前記親水性高分子を含む水溶液が、細胞増殖因子を、０以上１０００ｎｇ／ｍＬ以下で含む、請求項１８又は１９に記載の製造方法。
  21. 　前記照射工程に続き、ｐＨを６～８に調整するｐＨ調整工程をさらに含む、請求項１８から２０のいずれかに記載の製造方法。
  22. 　前記ｐＨ調整工程が、緩衝溶液、培地、及び水のいずれかを用いる調整工程である請求項２１に記載の製造方法。
  23. 　所定の間隔の平行溝を表面に有するモールドを押圧する表面加工工程をさらに含む請求項１８から２２のいずれかに記載の製造方法。
  24. 　前記親水性高分子は、タンパク質である、請求項１８から２３のいずれかに記載の製造方法。
  25. 　前記照射後のハイドロゲルが、コラーゲン、コラーゲンペプチド、及び、ゼラチンからなる群から選択される１以上を、該ハイドロゲルに対して、１質量％以上３０質量％以下含む、請求項１８から２４のいずれかに記載の製造方法。
  26. 　前記照射後に、生理活性因子を添加する工程をさらに含む、請求項１８から２５のいずれかに記載の製造方法。
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