KR101112756B1 - 광반응성 키토산 유도체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자외선 조사에 의해 경화되는 광 반응성을 나타내는 하기 화학식 1의 키토산 유도체 및 이를 포함하는 생체적합성 생체조직접착제 및 물질 고정화제에 관한 것이다:

화학식 1

본 발명의 키토산 유도체는 생체적합성 생체조직접착제로서 독성이 거의 없어 인체에 적용되는 경우 안전성을 담보할 수 있다. 본 발명의 키토산 유도체는 조직의 접착, 상처치유, 피부 봉합, 혈관과 같은 관 구조의 봉합 및 누출 방지, 지혈 또는 유착방지제로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 키토산 유도체는 약물의 고정화 및 약물의 방출 측면에서 우수한 효율을 나타내며, 독성이 없기 때문에 약물운반체로서의 응용 가능성이 매우 높다.

생체조직접착제, 약물운반체, 키토산, 아지도, 생체적합성

Description

광반응성 키토산 유도체 및 그의 용도{Photoreactive Chitosan Derivatives and Their Uses}

본 발명은 광반응성 키토산 유도체 및 이를 포함하는 생체조직접착제, 물질 고정화제에 관한 것이다.

광 반응성을 나타내는 화합물을 연구하는 목적은 여러 가지가 있지만, 유기 고분자 소재가 매우 다양하고 분자 설계가 용이하며, 성형이나 가공이 쉬워 많은 감광성 고분자들이 연구, 개발되고 있으며, 반응의 특성에 따라서 여러 가지로 응용을 할 수 있기 때문에 현재 많은 연구가 활발히 진행 되고 있다.

광 반응성을 나타내는 고분자 화합물들이 특별히 가지고 있는 부분이 있는데 신만산(Cinnamic acid)을 감광성 부분으로 하는 고분자, 아지도 화합물을 감광성으로 한 고분자, 나프토퀴논 다이아지드(Naphthoquinone diazide)를 감광성 부분으로 한 고분자가 있다.

한편, 키토산은 글루코오스아민(Glucose amine)과 N-아세틸글루코오스아민(N-Acetylglucose amine)이 β-1,4 결합을 한 양이온을 띄는 다당류로서, 분자 결합이 강하고 단단하다. 키토산은 키틴(Chitin)을 탈아세틸화(Deacetylation)시켜서 제조된다. 이러한 키틴은 바다 갑각류인 게나 새우, 거미, 개미, 메뚜기 같은 곤충이나 녹조류, 효모 등의 미생물의 세포벽에 많이 포함되어 있다. 특히 게나 새우의 외피의 25-35%가 키틴으로 이루어져 있다. 이러한 키틴은 지상에 존재하는 생체 적합성을 나타내는 물질 중에서 특히 큰 존재 비율을 차지한다.

이러한 키틴으로 만든 키토산은 어느 정도는 키틴의 특징을 가지고 있다. 그 중 가장 문제가 되는 것이 키토산은 물에 용해되지 않고 산에만 용해된다. 키토산이 물에 녹지 않을 경우 활용을 하는 범위가 제한되어 폭 넓게 이용 할 수 없다. 하지만 저분자화 된 키토산은 화학적인 반응으로 분자의 구조가 변하여 물에 녹는 성질을 나타내어 여러 분야로의 응용이 가능하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 자외선(UV)에 의해 경화되는 광 반응성을 나타내며 생체적합성이 있는 생체조직접착제 및 약물고정화 제제로 사용 가능한 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 키토산 바람직하게는 저분자화 수용성 키토산에 아지도기를 도입하여 제조된 키토산 유도체가 광 반응성을 나타내며 생체접착에서도 우수한 효과를 나타낼 뿐만 아니라 약물 예컨대 단백질을 고정화 하여 약물운반체로서의 작용도 할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 자외선 조사에 의해 경화되는 광 반응성을 나타내는 수용성의 키토산 유도체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 저분자화된 키토산 유도체를 포함하며, 자외선 조사에 의해 경화되는 광 반응성을 나타내는 생체적합성 생체조직접착제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 키토산 유도체를 포함하는 물질고정화제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 자외선 조사에 의해 경화되는 광 반응성을 나타내는 하기 화학식 1의 키토산 유도체를 제공한다:

화학식 1

상기 화학식에서, R₁은 수소, 아지도기 또는 아지도기를 포함하는 화합물이고; R₂는 하이드록시기를 포함하는 화합물이며; 상기 R₁ 및 R₂ 중 최소 하나는 아지도기 또는 아지도기를 포함하는 화합물이고; 상기 R₂가 하이드록시기인 경우에는 치환 또는 비치환될 수 있다.

본 발명자들은 자외선(UV)에 의해 경화되는 광 반응성을 나타내며 생체적합성이 있는 생체조직접착제 및 약물고정화 제제로 사용 가능한 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 키토산 바람직하게는 저분자화 수용성 키토산에 아지도기를 도입하여 제조된 키토산 유도체가 광 반응성을 나타내며 생체접착에서도 우수한 효과를 나타낼 뿐만 아니라 약물 예컨대 단백질을 고정화 하여 약물운반 체로서의 작용도 할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 광 반응성 키토산 유도체는 상기 화학식 1로 표시된다. 즉, 본 발명의 키토산 유도체는 키토산 또는 그의 유도체에 아지도기가 도입된 모든 고분자를 포함한다.

화학식 1에서, 용어 “아지도기를 포함하는 화합물”은 아지도기를 포함하는 지방족 화합물 또는 방향족 화합물으로부터 유래된 라디칼을 의미한다. 예를 들어, 아지도기를 포함하는 화합물은 아지도벤조산, 4,4'-다이아지도스틸벤, 4,4'-다이아지도칼콘, 4,4'-다이아지도벤조페논, 2,6-bis(4'-아지도벤질리덴)사이클로헥사논, 1-아지도파이렌, 1,6-다이아지도파이렌, 2-(4'-메톡시아닐리노)-5-아지도벤조익 메틸 에스테르, 2-아닐리노-5-아지도벤조산, 2-(4'-아지도페닐)-6-메틸 벤조티아졸 또는 2-(4'-아지도페닐)-(나프톨-1',2'-4,5-옥사졸)으로부터 유래된 라디칼을 포함한다.

화학식 1에서, R₂가 하이드록시기인 경우에는 이는 치환 될 수 있으며, 예컨대 카르복실기로 치환될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 화학식 1에서 R₁은 아지도기를 포함하는 화합물이고; R₂는 비치환 또는 치환된 하이드록시기, 아지도기 또는 아지도기를 포함하는 화합물이다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 키토산 유도체는 다음 화학식 2로 표시되는 광 반응성 키토산 유도체이다:

화학식 2

상기 화학식에서, R₂는 비치환 또는 치환된 하이드록시기, 아지도기 또는 아지도기를 포함하는 화합물이고; n은 2-100,000의 정수이다.

보다 더 바람직하게는, 본 발명의 키토산 유도체는 다음 화학식 3, 화학식 4 또는 화학식 5로 표시되는 키토산 유도체이다:

화학식 3

상기 화학식에서, n은 2-100,000의 정수이다.

화학식 4

상기 화학식에서, n은 2-100,000의 정수이다.

화학식 5

상기 화학식에서, n은 2-100,000의 정수이다.

가장 바람직하게는, 본 발명의 키토산 유도체는 화학식 3 또는 화학식 5로 표시되는 키토산 유도체이다.

본 발명의 다른 바람직한 변형예에 따르면, 본 발명의 키토산 유도체는 다음 화학식 6으로 표시되는 키토산 유도체이다:

화학식 6

상기 화학식에서, R₁은 수소, 아지도기 또는 아지도기를 포함하는 화합물이고; n은 2-100,000의 정수이다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 키토산 유도체는 다음 화학식 7로 표시되는 키토산 유도체이다:

화학식 7

상기 화학식에서, n은 2-100,000의 정수이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 키토산은 저분자량의 키토산이다. 본 명세서에서 용어 “저분자량 키토산”은 평균분자량 200- 100,000, 바람직하게는 평균분자량 500-50,000, 보다 바람직하게는 평균분자량 1,000-50,000, 가장 바람직하게는 평균분자량 1,000-30,000의 키토산을 의미한다. 키토산은 연결되어 있는 단량체의 개수에 따라 단량체 12개 정도 내외의 올리고머와 고분자에 속하는 폴리머로 나뉘고, 폴리머는 분자량 15만 미만의 저분자량 키토산, 분자량 70만에서 100만에 이르는 고분자 키토산, 그리고 그 사이의 범위를 가지는 중분자 키토산으로 나뉘어진다.

보다 바람직하게는, 상기 화학식들에서 n은 10-10,000이고, 보다 더 바람직하게는 n은 20-1,000이며, 보다 더욱 더 바람직하게는 n은 20-500이고, 보다 더 더욱 더 바람직하게는 n은 20-100이며, 가장 바람직하게는 n은 20-80이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 키토산은 저분자량의 수용성 키토산이다.

본 발명의 광 반응성 키토산 유도체는 생체에 대하여 독성이나 부작용을 나타내지 않고 안전성을 나타내며, 광반응에 의해 경화되고 접착성을 나타내기 때문에 생체 조직 또는 생체접착 또는 약물고정화에 이용되는 생체접착제 및 약물고정화 제제로서의 기능을 할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 키토산 유도체를 포함하며, 자외선 조사에 의해 경화되는 광 반응성을 나타내는 생체적합성 생체조직접착제 조성물을 제공한다.

본 발명의 생체적합성 생체조직접착제 조성물은 상술한 본 발명의 저분자화 된 키토산 유도체를 주성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 생체접착성 및 약물고정화 제제는 현재 시중에서 주로 이용되고 있는 시아노아크릴계 접착제를 대체할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 생체적합성 생체조직접착제는 외과 수술용 봉합사를 대체 할 수 있고, 불필요한 혈관을 폐색하는데 사용될 수 있으며, 안면조직, 연골 등의 연조직과 뼈, 치아 등의 경조직 지혈 및 봉합에 이용될 수 있고, 가정 상비약으로 적용하는 것이 가능하다.

본 발명의 생체적합성 생체조직접착제 조성물의 다양한 응용분야를 정리하면 다음과 같다:

본 발명의 생체조직접착제는 인체의 내부 및 외부 표면에 적용될 수 있으며, 즉 본 발명의 생체조직접착제는 인체의 외부(예컨대, 피부) 또는 외과수술 과정에서 노출되는 내부기관의 표면과 같은 내부 표면에 국소적으로 적용될 수 있다.

본 발명의 생체조직접착제는 조직의 에쥐 부분을 접착시키거나 조직에서 공기/유체가 누출되는 것을 봉합하거나, 의료기구를 조직에 접착시키거나 또는 조직의 결함부분을 채우는데 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “생체조직”은 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어 피부, 뼈, 신경, 액손, 연골, 혈관, 각막, 근육, 근막, 뇌, 전립선, 유방, 자궁내막, 폐, 비장, 소장, 간, 정소, 난소, 경부, 직장, 위, 림프절, 골수 및 신장 등을 포함한다.

본 발명의 생체조직접착제는 상처치유(wound healing)에 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 생체적합성 생체조직접착제는 상처에 적용되는 드레싱으로 이용될 수 있다.

본 발명의 생체조직접착제는 피부 봉합에 이용될 수 있다. 즉, 본 발명의 생체조직접착제는 국소적으로 적용되어 상처를 봉합하는 데 이용되어, 봉합사를 대체 할 수 있다. 또한, 본 발명의 생체조직접착제는 탈장복원에도 적용될 수 있으며, 예를 들어 탈장복원에 이용되는 메쉬의 표면 코팅에 이용될 수 있다.

본 발명의 생체조직접착제는 혈관과 같은 관 구조의 봉합 및 누출을 방지하는 데 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 생체조직접착제는 지혈에도 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 생체조직접착제는 수술 후의 유착방지제로 이용될 수 있다. 유착이란 모든 수술 부위에서 발생하는 것으로 수술 부위의 주변에서 다른 조직들이 상처 주위에 달라붙는 현상이다. 유착은 수술 후 97% 정도 발생을 하며, 특히 그 중에서 5-7%가 심각한 문제를 야기한다. 이러한 유착을 방지하기 위해서 수술시 상처를 최소화 한다거나 소염제를 사용하기도 한다. 또한 섬유소의 형성을 방지하기 위하여 TPA(tissue plasminogen activator)를 활성화 하거나 결정성 용액, 고분자 용액, 고체 막 등의 물리적 장벽을 사용하고 있지만 이러한 방법들은 생체 내에서 독성을 나타낼 수 있으며 다른 부작용을 나타낼 수 있다. 본 발명의 생체조직접착제는 수술 후에 노출된 조직에 적용되어 그 조직과 주위의 조직 사이에 발생되는 유착을 방지하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 생체조직접착제로 이용되는 키토산 유도체는 자외선 노출된 키토산 유도체이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 키토산 유도체를 포함하는 물질고정화제를 제공한다.

본 발명의 물질고정화제는 상술한 본 발명의 저분자화된 키토산 유도체를 주성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 물질고정화제는, “약물고정화제” 또는 “약물전달시스템” 등으로 표현될 수 있다.

본 발명의 약물고정화제에 의해 고정화될 수 있는 물질은 특별하게 제한되지 않으며, 화학물질, 작은 분자, 폴리펩타이드(단백질), 펩타이드, 핵산 또는 바이러스를 포함한다.

본 발명에서 고정화 되는 작은 분자는 예를 들어, 약물, 조영제(예컨대, T1 조영제, 초상자성 물질과 같은 T2 조영제, 방사성 동위 원소 등), 형광 마커, 염색 물질 등이 될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 폴리펩타이드는 둘 또는 그 이상의 잔기로 구성되는 아미노산의 중합체로 펩타이드 및 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 예를 들어, 세포 불멸에 관여하는 단백질(예컨대, SV40 라지 T 항원 및 텔로머라아제), 항-아폽토시스 단백질(예컨대, 돌연변이 p53 및 BclxL), 항체, 암유전자(예컨대, ras, myc, HPV E6/E7 및 아데노바이러스 Ela), 세포 주기 조절 단백질(예컨대, 사이클린 및 사이클린 의존성 인산화효소) 또는 효소(예컨대, 녹색 형광 단백질, 베타-갈락토시다아제 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제)가 될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 또한, 핵산은 예컨대, RNA, DNA 또는 cDNA가 될 수 있으며, 핵산의 시퀀스는 암호화 부위 서열 또는 비암호화 부위 서열(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)이 될 수 있다. 바이러스는 바이러스 전체 또는 바이러스의 핵산을 포함하는 바이러스 코어(즉, 바이러스의 엔빌로프 없이 패키지된 바이러스의 핵산)가 될 수 있다. 운반될 수 있는 바이러스 및 바이러스 코어의 예로는 파필로마 바이러스, 아데노 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로 바이러스 코어 및 세밀키 바이러스 코어 등이 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 핵산 카고로서의 뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드(예컨대, 아데노신, 시토신, 구아닌, 티민, 이노신 및 우라실) 또는 아날로그(예컨대, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드)일 수 있다. 예를 들어, 핵산 카고는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드로 구성된 안티센스 시퀀스 또는 RNAi일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 고정화제에 의해 고정화되는 물질은 단백질이다.

본 발명의 고정화제에 의해 운반되는 단백질은 특별하게 제한되지 않으며, 성장인자, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자 , 혈액 응고 인자 및 백신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 상세하게는, 본 발명의 고정화제에 의해 고정화 되는 단백질은 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulating factors), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 알파 및 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH (adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A (dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRH-II(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20 (enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin) 및 지코노타이드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 고정화제로 이용되는 키토산 유도체는 자외선 노출된 키토산 유도체이다.

하기의 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 고정화제는 세포에 대한 접 착력이 있다. 이와 같은 특성은 적은 양의 약물을 이용하여도 약물의 국소적 농도를 증가시켜 보다 높은 활성을 나타낼 수 있도록 한다. 또한, 본 발명의 고정화제는 세포독성이 없어 안전한 물질이며, 약물을 고정화하는 효율 및 방출하는 시간은 키토산 유도체의 양을 증가시켜 향상시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명의 키토산 유도체는 키토산에 아지도기를 도입하여 제조된다.

(b) 본 발명의 키토산 유도체는 생체적합적이면서 생체조직접착제로서 독성이 거의 없어 인체에 적용되는 경우 안전성을 담보할 수 있다.

(c) 본 발명의 키토산 유도체는 조직의 접착, 상처치유, 피부 봉합, 혈관과 같은 관 구조의 봉합 및 누출 방지, 지혈 또는 유착방지제로 이용될 수 있다.

(d) 본 발명의 키토산 유도체는 약물의 고정화 및 약물의 방출 측면에서 우수한 효율을 나타내며, 독성이 없기 때문에 약물운반체로서의 응용 가능성이 매우 높다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료

키토산은 (주)자광(대한민국)으로부터 구입하였고 탈아세틸화도(DAc)는 88%이다. 키토산은 추가적인 정제 없이 사용하였다. 저분자화 키토산을 얻기 위하여 사용된 아세트산, 소듐 니트라이드, 암모늄 하이드록사이드, 소듐 테트라하이드리도보레이트, 메탄올, 아세톤 및 에테르는 덕산약품공업(주)으로부터 구입하였다. N-(4-아지도벤조일옥시)석시너마이드를 제조하기 위한, N-하이드록시석시너마이드, N,N-다이사이클로헥실카보다이이마이드 및 다이에틸에테르는 Wako Pure Chem. Ind.(일본)으로부터 구입하였고, 4-아지도벤조산은 Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd. (일본) 그리고 다이옥산은 삼전화학(대한민국)으로부터 구입하였다. 2,2-아조비스(이소부티로니트릴)은 Wako Pure Chem. Ind.(일본)으로부터 구입하였다. 폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트 및 4-아지도페닐 메타크릴레이트는 Sigma-Aldrich (미국)로부터 구입하여 아지도-폴리(에틸렌 글리콜) (Az-PEG)를 제조하는 데 이용하였으며 이 경우 Acta biomaterialia Inc.의 Yoshihiro Ito 등의 방법[22]에 따랐다. 세포 배양, 단백질 방출 시험 및 MTT 분석을 위하여, DMEM(Dulbecco’'s Modified Eagle’'s Medium)을 WelGene Inc.로부터 구입하였고, FBS(fetal bovine serum) 및 페니실린-스트렙토마이신은 GIBCO로부터 구입하였다. 트립신-EDTA, (3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸리움 브로마이드, 테르 라졸) MTT 포르마잔 및 BSA(Bovine Serum Albumin)는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 세포 배양 커버슬립, Sterile, Thermanox 플라스틱(15 mm 직경)은 NUNC(미국)으로부터 구입하였다. 6 웰 및 96 웰 플레이트는 각각 Becton Dickinson Labware (미국) 및 TPP Immunomaxi (스위스)로부터 구입하였다. CV-1, 원숭이 세포주(Cercopithecus aethops)로부터 유래된 아프리카 녹색원숭이 신장세포인 COS7 (African Green Monkey SV40-transf'd kidney fibroblast cell line) 세포는 Riken Cell Bank로부터 구입하였다. 3T3(mouse embryonic fibroblast cell line) 세포는 경북대학교 의과대학으로부터 얻었다.

실시예 1: 저분자화 수용성 키토산의 제조

키토산((주)자광) 25 g을 4 %(v/v)의 초산 수용액에 용해시킨 다음, 얼음중탕에서 교반하면서 아질산나트륨 수용액(증류수 43.47 ml에 4.35 g NaNO₂ 용해)을 키토산의 유리아민에 대해 0.5 몰비로 첨가하였다. 3시간 반응 후, 암모니아수를 사용하여 pH 7.4로 중화하였다. 제조된 저분자화된 키토산 수용액에 2 몰비의 NaBH₄ 10.55 g을 고체상태 그대로 소량씩 첨가하면서 탈아민화 반응 중에 생성된 말단기를 환원시킨 후 1 N의 HCl 수용액으로 pH 7.4로 중화하였다. 아질산 분해로 얻어진 키토산 올리고머를 여과하여 불용성 물질을 제거하고 물, 메탄올 및 아세톤을 서로 다른 혼합비를 가진 혼합용액을 이용하여 분별침전 시켰다. 본 연구에 이용된 저분자화된 키토산은 물과 메탄올의 혼합비가 1:3 인 혼합용액으로부터 분 별침전시킨 것이며 여과후 아세톤 및 에테르 순으로 세척하고 진공건조하여 분말형태의 키토산 올리고머를 얻었다. 상기 키토산 중에서 평균분자량 약 10,000인 키토산 올리고머를 이용하여 아지도페닐 키토산 유도체를 제조하였다.

한편, 저분자량 키토산의 분자량은 풀루란 표준(컬럼, Shodex Asahipak GS-320, 30 ㎝ X 7.6)이 있는 HPLC(high performance liquid chromatography, Gilson, 프랑스)를 이용하여 결정하였다. 이동상은 0.2 M CH₃COOH 및 0.036 M CH₃COONa로 구성되어 있다. 0.1% (w/v)의 시료를 로딩하고 25°C에서 0.5 ml/min의 유속으로 용출하였다. 용출된 피크를 RI 검출기(132 RI detector, Gilson, 프랑스)로 검출하였다. 저분자화 키토산의 주요 거대구조 및 DAc는 각각 FT-IR(Fourier-transform infrared) 및 양성자 핵자기공명(¹H-NMR) 분석으로 규명하였다. FT-IR 스펙트럼은 FT-IR 스펙트로포토미터(FT-IR 8400s, Shimadzu, 일본)에서 KBr 펠릿을 이용하여 얻었다. ¹HNMR 스펙트럼은 용매로서 D₂O 및 CD₃COOD를 이용하고 NMR 스펙트로포토미터(Gemini 2000, 300MHz, Varian, 미국)를 이용하여 얻었다. 10 mg 시료를 0.5 ml D2O/CD3COOD 용액이 있는 5 ㎜ NMR 시험관에 넣었다.

FT-IR 스펙트럼의 결과, 저분자화 키토산의 IR 스펙트럼은 고분자량 키토산 중합체의 스펙트럼과 유사하였다. 이는 키토산 중합체의 주요 거대분자 구조가 저분자화 키토산에 그대로 남아 있음을 보여준다.

키토산 중합체 및 저분자화 키토산의 탈아세틸화도(DAc)는 ¹H NMR 스펙트로 스코피로 결정하였다. 키토산 중합체 및 저분자화 키토산의 DAc는 아세트아미드기 상의 CH₃ 잔기의 적분화 세기(I_acetyl-H) 및 H₂, H₃, H₄, H₅, H₆ 및 H_6’양성자의 적분화 세기의 합(I_acetyl-H)에 의해 평가하였다[24].

DAc (%) = [1 - ((1/3) I_{acetyl H}/(1/6)I_H2-H6)] x 100

2.04 ppm에서의 공명은 아세트아미드기 상의 CH₃ 잔기에 기인한 것이고, H₂-H₆의 공명은 3.1-4.0 ppm 범위에서 발생하였다[25]. 키토산 중합체 및 저분자화 키토산의 DAc 값은 각각 87.62% 및 86.24%이었다. 저분자화 키토산의 중량평균분자량(Mw)은 HPLC 분석으로 결정하였으며, 약 10,973으로 측정되었다.

실시예 2: 아지도 페닐화된 저분자화된 수용성 키토산의 제조

상기에서 얻어진 평균분자량이 약 10,000 정도인 저분자화된 키토산 2 g을 물 30 ml에 용해시켰다. 냉욕 하에서 이 수용액에 다이옥산 20 ml에 용해된 4-아지도벤조일록시숙신이미드1.15 g을 첨가하였다. 자연승온 후 60℃에서 3시간 반응시킨 후에 감압 하에서 용매를 제거한 후에 아세톤으로 충분히 세척한 후에 건조하여 상기 화학식 3의 아지도페닐-키토산 유도체를 제조하였다. 아지도페닐 키토산 유도체의 주요 거대구조는 FT-IR(Fourier-transform infrared) 및 양성자 핵자기공명(¹H-NMR) 분석으로 분석하였다. FT-IR 스펙트럼(도 1)에 따르면, 아지도페닐-키토산 유도체의 스펙트럼 프로파일은 저분자화 키토산 및 키토산 중합체의 스펙트럼과 유사하였다. 이 결과는, 아지도페닐-키토산 유도체가 저분자화 키토산 및 키토산 중합체의 프라노오스 구조를 그대로 유지하고 있음을 나타낸다. 아지도페닐-키토산 유도체의 IR 스펙트럼은 2125 cm^-1 근처에서 특징적인 흡수 밴드를 보이며 이는 아지도기의 존재를 나타내는 것이다. 아지도페닐 키토산 유도체의 구조를 검증하기 위하여, ¹H-NMR 스펙트로스코피 분석을 실시하였다(도 2). ¹H-NMR 스펙트럼에서 7.0-8.0 ppm에서 방향족 고리가 분석되었고 이는 아지도페닐기의 일부분으로서의 벤젠 고리를 나타내는 것이다. 따라서 아지도페닐 키토산이 성공적으로 제조되었음을 알 수 있다.

아지도페닐기는 아지도페닐 키토산 유도체의 제조 동안에 저분자화 키토산의 아미노기에 도입되었다. 아지도페닐기의 도입 정도는 ¹H-NMR 스펙트럼으로 결정되었다. 상술한 저분자화 키토산의 DAc 공식이 이용되었고, 다음과 같은 수학식에 따라 아지도페닐기의 도입 정도를 결정하였다: D (%) = (1/4 X I_benzeneH ) / (1/6 X I_H2-H6) X 100

실시예 3: 1.0 중량% 아지도페닐-키토산 유도체의 시간에 따른 광 반응성 정도

상기 실시예에서 제조된 아지도페닐-키토산 유도체 0.1 g을 물 9.9 g에 용해시켜 1.0 중량%로 수용액을 제조하였다. 이 수용액 20 ㎕를 유리판위에 적하한 후에 자외선(UV)을 조사하고 유리판을 직각으로 세워 시간에 따른 광 반응성을 조 사하였다. 여기서 자외선을 조사하기 위해 사용된 광 조사기는 SP-9 spot cure 시스템(USHIO, Inc.)을 사용하였다. 광을 조사하지 않는 대조군과 광을 조사하는 시간에 따라 경화하는 정도에 차이를 나타내도록 여러 가지 실험군을 설정하여 비교하였다. 광을 조사하는 시간에 따라 차이를 주었다. 실험 결과는 표 1 및 도 3에 나타나 있다. 광 경화도(photocuring degree)는 아래의 방법으로 계산하였다: 경화도 = (흘러내린 거리/광을 조사하지 않았을 때의 흘러내린 거리)

실험군과 대조군의 광 조사 결과물을 10분 동안 흐르는 물에 세척을 하였다. 이때, 광 반응성을 나타내어 생체 접착제로서의 기능을 나타내는 것은 흐르는 물에 씻겨 내려가지 않았으며, 광을 조사한 시간이 길수록 커버슬립에 접착이 더 잘 되었다.

1.0 중량% 아지도페닐-키토산 유도체의 시간에 따른 광 반응성 정도

광 조사 시간 (sec)	광 경화도 (%)
0	0
30	8
60	13
90	18
120	15
150	19
180	26
210	34
240	100
270	100
300	100

표 1 및 도 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 아지도페닐-키토산 유도체는 우수한 광 반응성을 나타내어 UV 조사 시간이 경과 할수록 광 경화도가 증가하였다.

실시예 4: 3.0 중량% 아지도페닐-키토산 유도체의 시간에 따른 광 반응성 정도

실시예 3과 동일한 방법으로 실험을 수행하되, 아지도페닐-키토산 유도체의 농도를3.0 중량%로 조절하였다. 실험결과는 표 2 및 도 4에 나타나 있다.

3.0 중량% 아지도페닐-키토산 유도체의 시간에 따른 광 반응성 정도

광 조사 시간 (sec)	광 경화도 (%)
0	0
30	15
60	12
90	26
120	38
150	100
180	100
210	100

표 2 및 도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 3.0 중량% 아지도페닐-키토산 유도체는 1.0 중량% 아지도페닐-키토산 유도체보다 단축된 시간 내에 경화되는 패턴을 나타내었다. 예를 들어, 100% 광 경화도를 나타내는 시간이 1.0 중량% 아지도페닐-키토산은 240초인 반면, 3.0 중량% 아지도페닐-키토산은 150초 이었다.

실시예 5: 아지도페닐-키토산 유도체를 이용한 접착력 분석

동물의 결체조직에 대한 아지도페닐-키토산의 접착력을 시험하기 위하여, 시중에서 쉽게 구입할 수 있는 돼지 피부조직이 있는 소위 돼지 껍데기를 이용해 아지도페닐-키토산 유도체의 접착력을 조사 하였다. 돼지 껍데기를 (가로× 세로 × 높이) (5 cm× 5 cm× 1.5 cm)로 절단하였다. 절단 부위에 10중량% 아지도페닐-키토산 유도체를 도포한 다음, 절단된 부위가 접착될 수 있게 UV를 5분간 조사하였다. 도 5에서 볼 수 있듯이, 아지도페닐-키토산 유도체가 광 반응성을 나타내어 생체에 적합한 접착제로서 작용을 하여 잘려나간 부위가 다시 접착되는 효과를 나타내었다.

실시예 6: UV 조사의 유무에 따른 아지도페닐-키토산 유도체의 경화 정도 차이

실험을 하기에 앞서, Thermanox^TM 플라스틱 커버스립상과 Az-PEG(azido-polyethylene glycol)에 표면에 코팅 되어있는 Thermanox^TM 플라스틱 커버스립상에 배양된 COS7 세포를 비교해 보았다. 도 6 및 도 7에서 확인할 수 있듯이, Thermanox^TM 플라스틱 커버스립상에서는 실제 세포가 잘 배양이 되지만, Az-PEG가 그 위에 코팅되면 세포 배양이 거의 이루어지지 않았다.

이렇게 세포가 잘 배양이 되지 않는 조건을 갖춘 Az-PEG 위에 아지도페닐-키토산 물질을 재코팅 하였다. Az-PEG는 배양된 세포가 커버슬립에 접착되는 것을 방해한다. 따라서 아지도페닐-키토산이 UV에 의해 경화되지 않는다면 흐르는 물로 세척할 경우 수용성으로 인해 상당양의 부분이 씻겨져 나갈 것이다. 결과적으로 Az-PEG로 코팅된 부분이 노출 되면 세포가 부착, 증식하지 못할 것이다. 반면에 아지도페닐-키토산이 UV에 의해 경화된다면 수용성을 잃어버려 흐르는 물로 세척하여도 대부분이 잔존하여 Az-PEG로 코팅된 부분이 노출 되지 않을 것이다. 결과적으로 이러한 경우에는 세포가 부착, 증식 할 수 있게 될 것이다. 이러한 가설을 바탕으로 Az-PEG와 0.1 중량% 아지도페닐-키토산이 코팅된 커버슬립 위에 세포를 배양 시키고, 충분히 자란 세포 위에 UV를 조사한 후 30분간 흐르는 물 위에 두어 접착성이 없는 세포들은 떨어져 나가게 하였다. 실험 결과, UV를 조사한 세포는 아지도페닐-키토산의 광 반응성에 의한 접착성에 의해 커버슬립 위에 잘 붙어 있는 반면, UV를 조사하지 않고 흐르는 물에 30분간 씻은 세포의 경우는 접착성을 나타내지 못하여 그대로 물에 씻겨 나가는 효과를 보였다(참조: 도 8 및 도 9). 따라서 세포는 아지도페닐-키토산 유도체에 강하게 결합함을 알 수 있다.

성장인자의 농도는 세포의 유도체와 성장인자의 사이의 반응속도를 증가시키거나 성장인자의 활성을 증가시키는 데 매우 중요한 요소이다. 성장인자의 농도를 증가시키기 위한 간편한 방법은 보다 많은 양의 성장인자를 이용하는 것이다. 그러나 많은 양의 성장인자를 이용하는 것은 상업적으로 문제가 있고 부작용을 유발할 가능성이 높아지는 문제가 있다. 성장인자의 투여량을 감소시키면 부작용을 줄일 수 있다[7]. 만일 고정화된 성장인자가 세포 표면 상의 유도체에 방출되면 세포 유도체 주위의 성장인자의 국소적 농도는 증가하게 된다. 따라서 이 경우에는 보다 적은 양의 성장인자가 필요하게 된다. 상기 실험 결과에 따르면, 성장인자를 고정화한 아지도페닐-키토산 유도체가 세포 표면에 결합할 수 있다. 따라서, 아지도페닐-키토산 유도체는 필요로 하는 성장인자의 양을 줄일 수 있고, 또한 유리(free) 성장인자와 비교하여 보다 높은 성장인자 활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 아지도페닐-키토산 유도체는 세포 표면 상에 성장인자의 국소적 농도를 증가시켜 보다 높은 성장인자의 활성을 나타낼 수 있도록 한다[26].

실시예 7: 아지도페닐-키토산 유도체의 세포독성 실험

UV 노출된 아지도페닐 키토산 유도체의 세포독성을 검사하기 위해서, 일반적인 MTT 분석방법을 이용하는 것은 적합하지 않으며, 이는 UV에 노출된 아지도페닐 키토산 유도체가 수 불용성이기 때문이다. 아지도페닐 키토산 유도체 용액의 다양한 농도(5 w/v%, 10 w/v%, 15 w/v% 및 20 w/v%) 시료를 준비하였다. 이어, 6웰 배양 플레이트에서 웰의 표면을 코팅하기 위하여 시료를 다양한 시간(1분, 3분, 5분 및 7분) 동안 UV에 노출시켰다. 10% 우태아혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium )에서 3T3(마우스 배아 섬유아세포주)를 37°C, 5% CO₂/95% 대기공기의 조건에서 배양하였다. 상기 세포를 아지도페닐 키토산 유도체로 코팅된 6웰 배양 플레이트에 1.0 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 씨딩하였다. 이어, 배지를 적합한 시험 배지(혈청-부재 DMEM) 200 ㎕로 교체하고 플레이트를 37°C, 5% CO₂/95% 대기공기의 조건에서 48시간 동안 인큐베이팅 하였다. 아지도페닐 키토산 유도체로 코팅되지 않는 플레이트(대조군)에서도 세포를 상기의 조건들과 동일하게 하여 배양하였다. MTT 포르마잔을 플레이트에 첨가하고 4시간 동안 반응시켰다. DMSO를 각각의 플레이트에 첨가하고 플레이트 내의 혼합물을 96웰 플레이트에 옮겼다. 그런 다음, 통상적인 MTT 분석 방법을 실시하였다.

아지도페닐 키토산 유도체를 의약으로 이용되는 성장인자에 응용하기 위해서, 아지도페닐 키토산 유도체가 세포독성이 있는 지 여부를 반드시 확인하여야 한다. MTT 분석 결과, 모든 아지도페닐 키토산 유도체 시료는 세포독성이 없었으며, 혈청-부재 DMEM에서 아지도페닐 키토산 유도체 시료를 처리하고 48시간째에 3T3 세포의 증식에 영향을 주지 않았다.

실시예 8: 아지도페닐-키토산 유도체의 표면 관찰

아지도페닐 키토산 유도체 및 BSA 용액의 혼합물을 UV에 노출시켰다. 이어, 아지도페닐 키토산 유도체 및 BSA 컨쥬게이트의 표면을 주자전자현미경(S-3400N, Hitachi, 일본)으로 관찰하였다.

아지도페닐 키토산 유도체 및 아지도페닐 키토산 유도체-BSA의 SEM(Scanning Electron Microscope) 결과가 도 10에 나타나 있다. 물에 용해된 아지도페닐 키토산 유도체는 UV에 노출시킨 경우 서로 결합을 하여 거대분자로 변화되었다. BSA는 UV 노출 아지도페닐 키토산 유도체에 의해 코팅 또는 포위 되었다. 내입 억제에 의해 높은 활성이 나타날 것으로 기대된다[26].

실시예 9: 단백질 방출 분석

아지도페닐 키토산 유도체 용액 시료의 다양한 농도(5%, 10%, 15%, 20%, w/v)를 준비하였다(하나의 실험군에 대하여 동일 농도 당 4개의 시료, 총 16 시료, 4 실험군). BSA 200 ㎍을 각각의 시료 용액에 용해시켰다. 각각의 시료 실험군을 UV에 1분, 3분, 5분 및 7분 동안 노출시켰다. 모든 시료를 PBS(phosphate buffer saline)로 3회 세척하여 아지도페닐 키토산 유도체에 의해 고정화 되지 않은 BSA를 제거하고 PBS 1 ml를 각각의 시료에 첨가하였다. 방출된 BSA의 양은 12시간 마다 Bradford 분석(Bio-rad protein assay, Bio Rad laboratories, Inc.)에 따라 분석하였고, UV/VIS 스펙트로포토미터(Optizen 3220UV, Mecasys Co., Ltd. Korea)를 이용하였다. BSA가 없는 상술한 농도의 시료를 대조군으로 이용하였다. 모든 측정 후, PBS 1 ml을 각각의 시료에 첨가하였다.

아지도페닐 키토산 유도체의 성장인자 고정화 효율을 가장 높게 하기 위한 최적 UV 노출 시간 및 아지도페닐 키토산 유도체 농도를 결정하기 위하여, 단백질 방출 실험을 실시하였다. 시료를 농도에 따라 4개의 실험군으로 나누었다. 20 w/v% 농도 이상의 시료는 아지도페닐 키토산 유도체의 용해도 때문에 준비할 수 없었다. 아지도페닐 키토산 유도체의 포화점은 20 w/v%으로 판단된다. BSA의 방출양은 시간이 진행됨에 따라 감소하였다. 실험 초기에 BSA의 소량이 방출되었고 방출된 BSA 양의 큰 변화가 있었다. 그러나 36시간 이후에는 방출된 BSA의 양이 크게 감소하였고 방출된 BSA 양이 거의 변화가 없었다. 상기 실험 결과에 따르면, 고정화된 BSA의 양과 고정화에 이용된 아지도페닐 키토산 유도체의 농도 사이의 상관관계가 명확하게 나타난다. 각각의 실험군에서 방출된 BSA의 평균 양은 약 36.6㎍ in A 실험군, 93.9 5㎍ in B 실험군, 134.49 ㎍ in C 실험군 및 162.96㎍ in D 실험군이었다. 방출된 BSA 양은 아지도페닐 키토산 유도체에 의해 고정화된 BSA 양으로 간주할 수 있기 때문에, 초기 고정화에 이용된 BSA의 양과 비교하여 BSA 18.3% in A 실험군, 46.98% in B 실험군, 67.25% in C 실험군 및 81.48% in D 실험군이 아지도페닐 키토산 유도체에 의해 고정화된 것으로 판단된다. 상기 실험 결과에 따르면, 고정화 BSA의 양이 고정화에 이용된 아지도페닐 키토산 유도체의 농도에 비례하여 증가함을 알 수 있다. 그러나, 아지도페닐 키토산 유도체의 UV 노출 시간 및 고정화 BSA 양 사이에는 명확한 상관관계가 없었다. 각각의 실험군의 BSA가 276 시간 in A 실험군, 336 시간 in B 실험군, 420 시간 in C 실험군 및 432 시간 in D 실험군 방출되었다. 상기 실험결과에 따르면, 아지도페닐 키토산 유도체의 농도가 높을수록 BSA 방출기간도 길어진다는 것을 알 수 있다. 따라서, 고정화에 이용되는 아지도페닐 키토산 유도체의 농도를 포화농도 이하의 범위에서 가장 높게 하면 성장인자의 고정화 양 및 방출시간의 측면에서 가장 높은 효율을 얻을 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조 문헌

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도 1은 저분자화 키토산(a) 및 아지도페닐-키토산 유도체(b)의 FT-IR 스펙트럼이다.

도 2는 CD3COOD의 존재 하에서 D2O 내의 저분자화 키토산(a) 및 아지도페닐-키토산 유도체(b)의 300 MHz ¹H-NMR 스펙트럼이다.

도 3은 본 발명의 1.0 중량% 아지도페닐-키토산 유도체의 시간에 따른 광 반응성 정도를 보여주는 그래프이다.

도 4는 본 발명의 3.0 중량% 아지도페닐-키토산 유도체의 시간에 따른 광 반응성 정도를 보여주는 그래프이다.

도 5는 은 절단된 돼지 피부조직이 본 발명의 아지도페닐-키토산 유도체에 의해 재 접착된 양상을 보여주는 사진이다.

도 6는 플라스틱 커버스립 상에서 세포를 배양하고 세척한 후 커버슬립 표면 상의 세포를 보여주는 사진이다.

도 7은 AZ-PEG(azido-polyethylene glycol)로 코팅된 플라스틱 커버슬립 상에서 세포를 배양하고 세척한 후 커버슬립 표면 상의 세포를 보여주는 사진이다. 커버슬립 표면 상에서 세포가 관찰되지 않는다.

도 8은 아지도페닐-키토산으로 코팅된 플라스틱 커버슬립 상에서 세포를 배양하고 UV(자외선)을 조사한 다음 세척한 후 커버슬립 표면 상의 세포를 보여주는 사진이다. 아지도페닐-키토산의 광 반응성에 의한 접착성에 의해 커버슬립 위에 잘 붙어 있는 것을 관찰할 수 있다.

도 9는 아지도페닐-키토산으로 코팅된 플라스틱 커버슬립 상에서 세포를 배양하고 세척한 후 커버슬립 표면 상의 세포를 보여주는 사진이다. UV를 조사하지 않은 경우에는 세포들이 커버슬립 표면에 접착되지 않아 그대로 물에 씻겨 나가는 양상을 나타내었다.

도 10a-10c는 UV 노출된 아지도페닐-키토산 유도체(도 10a) 및 아지도페닐-키토산 유도체-BSA(도 10b, 도 10c)에 대한 SEM(Scanning Electron Microscope) 분석 이미지이다.

Claims (11)

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7. 하기 화학식 3의 키토산 유도체를 포함하며, 자외선 조사에 의해 경화되는 광 반응성을 나타내는 생체적합성 생체조직접착제 조성물:

   화학식 3

   

   상기 화학식에서, n은 2-100,000의 정수이다.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 n은 20-1,000의 정수인 것을 특징으로 하는 생체적합성 생체조직접착제 조성물.
9. 하기 화학식 3의 키토산 유도체를 포함하는 물질고정화제:

   화학식 3

   

   상기 화학식에서, n은 2-100,000의 정수이다.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 n은 20-1,000의 정수인 것을 특징으로 하는 물질고정화제.
11. 제 9 항에 있어서, 상기 물질은 단백질인 것을 특징으로 하는 물질고정화제.

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