CN102010508B - 一种阳离子聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阳离子聚合物及其制备方法和应用，该阳离子聚合物具有式I所示的结构，通过双炔单体与双叠氮单体之间的Huisgen-1，3偶极环加成反应制备出R为氢的线型阳离子聚合物，进一步地，可对线型阳离子聚合物进行侧链修饰，在R基团位置引入侧链胺基，获得梳状阳离子聚合物。本发明的线型和梳状阳离子聚合物可用作基因载体，与DNA或siRNA形成复合物，应用于基因治疗。
Description
技术领域
本发明涉及聚合物基因载体，特别涉及一类线型或梳状的多功能阳离子聚合物基因载体及其制备方法，属于生物医用高分子领域。
背景技术
随着人类基因组的测序完成以及对DNA的深入研究，科学家发现很多遗传性疾病是由于基因组的缺陷造成的，因此，针对DNA序列中的基因缺陷展开治疗的手段也就成为了解决重症恶疾的一把新钥匙。
早期的重组病毒载体由于无法在生物体内实现长期稳定的表达而效果不佳，随后采用腺病毒和逆转录病毒治疗则不幸地发生了一些免疫原性的问题，严重时甚至会导致病人死亡(Thomas，C.E.；Ehrhardt，A.；Kay，M.A.Nat.Rev.Genet.2003，4，346-358.)。由此衍生出一系列的非病毒类载体，人们希望能够藉此发展出具有病毒载体的高效性而又无免疫原性之虞的安全治疗方法。其中借助于化学载体来导入外源基因的方法近年来受到人们的关注。化学载体可以分为脂质体和阳离子聚合物，后者以聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺胺类超支化聚合物(PAMAM)等为代表。聚合物类载体有着易于制备、装载量大、免疫副作用小、可修饰余地大等方面的优势，然而用于体内基因输送时，效率却远低于病毒类载体(Wagner，E.；Kloeckner，J.Adv.Polym.Sci.2006，192，135-173.)。
现有的阳离子聚合物基因载体在功能性、安全性和选择性方面尚且存在一些不足：
1、对于一些基于支化PEI修饰体系或者交联体系的阳离子聚合物，虽然能够得到相对较为理想的转染效果，但是由于其结构的不明确性，导致了结构-性能分析困难重重，不利于对各个化学基团在整体性能中所起的作用进行探讨；
2、利用阳离子聚合物对基因进行包裹，形成阳离子聚合物/核酸复合物可以实现转染过程中核酸的保护，但核酸从复合物中顺利释放也是发挥其作用的先决条件，对核酸过强的复合将有碍于其释放过程的顺利进行；
3、聚电解质的分子量对其之间的相互作用有重要的影响。高分子量的阳离子聚合物有较强的复合DNA的能力，能够将DNA压缩成体积更小的复合物，并对其提供相对较好的保护(Wen，Y.T.；Pan，S.R.；Luo，X.；Zhang，X.；Zhang，W.；Feng，M.Bioconjugate Chem.2009，20，322-332.)，然而高分子量的阳离子聚合物不可避免的具有较大的细胞毒性(Kunath，K.；von Harpe，A.；Fischer，D.；Peterson，H.；Bickel，U.；Voigt，K.；Kissel，T.J.Controlled Release2003，89，113-125.)；
4、生物体内的生理机制要求将核酸输送到适合的位点加以释放方能激活下游的生理过程，在组织器官层面，需要聚合物能够具有一定的靶向性；在细胞内过程层面，对siRNA治疗来讲需要实现核酸在细胞质内的定点释放，对DNA治疗来讲则需要将DNA输送到细胞核中。
2001年，诺贝尔化学奖得主Sharpless定义了“点击”化学(“click”chemistry)这一概念，其内涵是此类反应应该具有高产率，副产物无害且易分离，具有区域专一性并且在多种环境下都能适用的特征(Kolb，H.C.；Finn，M.G.；Sharpless，K.B.Angew.Chem.Int.Ed.2001，40，2004-2021.)。Michael加成和Huisgen 1，3-偶极环加成(CuAAC)反应作为最常用的“点击”化学手段之一，近年来以其高效性、适用的广泛性和产物的精确区域选择性在制备各种聚合物的合成工作中得到广泛应用(Mather，B.D.；Viswanathan，K.；Miller，K.M.；Long，T.E.Prog Polym.Sci.2006，31，487-531；Hein，C.D.；Liu，X.M.；Wang，D.Pharm.Res.2008，25，2216-2230.)。
发明内容
针对阳离子类基因载体的研究现状并基于前人的研究成果，本发明的目的在于利用“点击”化学反应设计合成一种具有多功能性、结构可调的可降解阳离子聚合物，并使这种聚合物成为具有良好生物相容性的基因载体。
在本发明的第一方面，提供如下式I所示的阳离子聚合物：
式I中，n为5～100的整数，x为2～6的整数，t为1～3的整数；
Y为如下结构中的一种：
R为如下结构中的一种：
其中Z代表氢或C1-C6的直链或支链烷基，所述烷基例如Me，Et，n-Pr，i-Pr，n-Bu和t-Bu等；p为0～20的整数。
上述式I所示阳离子聚合物是通过双炔单体与双叠氮单体之间的Huisgen-1，3偶极环加成反应来制备线型缩聚产物，进一步地，对线型缩聚产物进行侧链修饰，获得梳状的聚合物。其合成过程中所涉及的中间体，包括双炔单体和各种侧链修饰的聚合物中间体都在本发明的保护范围内。
在本发明的第二方面，提供式3所示的双炔化合物：
式3中，x为2～6的整数，t为1～3的整数。
在本发明的第三方面，提供式8所示的聚合物中间体：
式8中，n，x，t和Y如式I中所定义；R1是如下结构中的一种：
其中Z代表氢或C1-C6的支链或直链烷基，L代表C1-C6的直链或支链烷基，所述烷基例如Me，Et，n-Pr，i-Pr，n-Bu和t-Bu等。
在本发明的第四方面，提供了合成式I所示阳离子聚合物的方法。
步骤一，通过Michael加成反应，制备含有不同二级胺数目的双炔单体(化合物3)，如下反应式所示：
炔胺(化合物1)与丙烯酰氯反应得到丙烯酰炔胺(化合物2)，丙烯酰炔胺再与含有不同二级胺数目的寡聚多胺反应得到双炔单体。
步骤二，通过用对甲苯磺酰氯活化羟基并用叠氮基团进行取代的方法，制备结构不同，性质各异的双叠氮单体(化合物6)，如下反应式所示：
Y为
其中q为2～12的整数，m为1～3的整数。
步骤三，通过“点击”化学反应，实现步骤一、二中制备的双炔单体和双叠氮单体之间的聚合反应，制备出线型的阳离子聚合物(化合物7)，如下所示：
步骤四，聚合物侧链修饰中间体的制备。为了在线型阳离子聚合物上引入具有不同数目胺基的侧链，可以通过下述两种途径获得侧链修饰中间体。
途径一：通过向线型聚合物引入丁二酸酐或马来酸酐衍生物制备侧链修饰中间体，如下所示：
途径二：通过向线型聚合物引入丙烯酸酯类化合物，制备侧链修饰中间体，如下所示：
步骤五，对步骤四得到的聚合物侧链修饰中间体进行多胺基修饰，得到梳状的阳离子聚合物。根据中间体的不同，利用下述方法一和方法二引入侧链胺基：
方法一：通过胺基与羧基的缩合反应引入侧链胺基，如下所示：
方法二：通过胺基与酯键的交换反应制备梳状阳离子聚合物，如下所示：
在本发明的第五方面，提供了上述线型和梳状阳离子聚合物作为基因载体的应用，用于基因治疗。
通过对聚合物分子量、缓冲容量、复合DNA能力、光散射及体外转染和细胞毒性方面的考察实验，证实了本发明的阳离子聚合物作为基因转染材料的效能。
本发明合成了一类阳离子聚合物多功能基因载体，与现有技术相比，本发明具有如下特点：
1)通过双炔单体与双叠氮单体之间的Huisgen-1，3偶极环加成反应，来制备线型缩聚产物，与文献中报道的通过Michael加成得到的聚酰胺胺(Poly(amido amine))和聚胺基酯(Poly(amino ester))相比，此类载体可以保证主链的绝对线型结构。这种化学结构清晰的聚合物为下游的精确理化性质分析研究提供了可能。
2)核酸被包裹并输送到体内的最终目的是在生理过程中实现其活性，因此，进入细胞内部的核酸需要在适当的时间和位点从复合物中释放出来。阳离子聚合物载体对核酸的高强度复合可以有效地保证体内循环时免于被降解，但同时也构成了核酸解复合过程的一大障碍。通过调节电荷密度来适当降低载体/核酸结合强度则有可能会使转染效果有一定程度的提升(Gabrielson，N.P.；Pack，D.W.Biomacromolecules 2006，7，2427-2435；Forrest，M.L.；Meister，G.E.；Koerber，J.T.；Pack，D.W.Pharm.Res.2004，21，365-371)。本发明所设计的阳离子聚合物，其主链正电荷密度可以调节。通过改变聚合物表面电荷密度，可以有效调节聚合物与DNA的结合强度，进而影响下游基因表达效率。
3)作为生物体内部的还原性物质还原型谷胱甘肽(GSH)在动物细胞内浓度为0.5-10mM，可以断裂进入细胞质的二硫键。对于肿瘤细胞来说，GSH浓度更是在健康细胞的4倍以上(Manickam，D.S.；Hirata，A.；Putt，D.A.；Lash，L.H.；Hirata，F.；Oupicky，D.Biomaterials 2008，29，2680-2688)，同时生物体体液和细胞外基质中GSH的浓度则很低，为2-20μM。基于此，主链中带有双硫键的聚合物被视为可以在细胞质内触发释放的载体材料得到了广泛的研究和关注。本发明可以通过改变单体的选用来调节聚合物主链的亲疏水性质及还原敏感性，进而影响聚合物整体的性质。
4)通过侧链不同数目胺基的引入，增强聚合物复合DNA或siRNA后形成纳米颗粒的稳定性。
5)主链和侧链中胺基数目的差异会造成聚合物缓冲能力的差异，进而影响聚合物-核酸复合物逃离内含体的性质。
6)主链中含有双硫基团的聚合物，进入细胞后，在细胞质内的还原性环境刺激下，会发生断裂，降解成小分子片段，进而加速DNA或siRNA的释放并且降低细胞毒性。
技术效果
本发明成功的利用Michael加成和Huisgen 1，3-偶极环加成(CuAAC)反应制备了线型和梳状的两大类阳离子聚合物。实验证明，本发明的阳离子聚合物7a～7d样品均能够在高N/P比例时对DNA形成复合。在加入还原试剂DTT时，多种手段均能有效证明含有双硫键的7a和7b样品能释放包裹的DNA。在体外转染实验中，7a样品取得了超过商业试剂线型PEI的转染效率并且没有表现出明显的细胞毒性。
附图说明
图1是本发明的阳离子聚合物的化学结构式。
图2显示了实施例五制备的阳离子聚合物7a～7d与DNA形成的复合物的溶液性质，其中A是复合物粒径测试结果，B是复合物表面电势测试结果(参见实施例九)。
图3是DTT存在下阳离子聚合物7a(A)与7b(B)与DNA形成复合物的凝胶电泳图，图中数字表示DTT的最终浓度(参见实施例十)。
图4显示了阳离子聚合物/DNA复合物的粒径(A)和表面电势(B)对还原性物质二巯基苏糖醇(DTT)的响应性(参见实施例十)，其中“7a w DTT”和“7a w/o DTT”分别代表在聚合物7a/DNA复合物的溶液中加入或未加入DTT(对照组)的情况，“7b w DTT”和“7b w/o DTT”分别代表在聚合物7b/DNA复合物的溶液中加入或未加入DTT(对照组)的情况。
图5(A)～图5(D)是本发明的阳离子聚合物/DNA复合物的体外细胞转染与毒性测试结果，其中：图5(A)和图5(B)分别是复合物在B16F10细胞系和COS7细胞系中转染GFP结果，图中数字15、30、60、100指的是聚合物中N原子与DNA中P原子的摩尔比(即N/P比)；图5(C)和图5(D)分别是复合物在B16F10细胞系和COS7细胞系中细胞毒性测试结果(参见实施例十一)。
图6是聚合物/DNA复合物转染B16F10细胞系后体外表达荧光素酶测试结果(参见实施例十二)。
具体实施方式
下面结合附图，通过实施例对本发明做进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。
实施例一至二为双炔单体的合成实例。
实施例一：丙烯酰丙炔胺(化合物2)的制备方法。
如上式，将丙炔胺(化合物1)(60g，1.09mol)和三乙胺(132g)溶解在900mL干燥氯仿中。在冰浴上向此溶液中加入溶解有丙烯酰氯(118.2g，1.3mol)的氯仿溶液。将此反应混合物置于冰上半小时，室温反应8小时。在旋蒸浓缩、过滤除去三乙胺盐后，在硅胶柱上利用乙酸乙酯∶石油醚(1∶1，体积比)为展开剂进行柱色谱分离。除去溶剂并经P2O5真空干燥后得到丙烯酰丙炔胺(化合物2)。收率74％。
由其它炔胺为原料制备对应丙烯酰化产物方法与实施例一所述类似。
实施例二：双炔单体(化合物3)的制备
如上式，首先将丙烯酰丙炔胺(化合物2)(20g，183mmol)溶解在40mL氯仿中，而后将此溶液滴入到40mL溶解有乙二胺(2.2g，36.7mmol)的氯仿溶液中。向溶液中通氮气以除氧，并在25℃反应72小时。反应结束后除去氯仿，用乙醇溶解粗产物，加入盐酸酸化得到白色固体。收集白色固体，溶解于浓盐酸，并向乙醇中再次沉淀，得到化合物3a。收率33％。
如上式，将丙烯酰炔胺(化合物2)(50.7g，465mmol)溶解在80mL氯仿中，而后将此溶液滴入到80mL溶解有二乙撑三胺(8g，77.5mmol)的氯仿溶液中。反应条件与产物纯化处理与3a化合物相同，最终得到3b化合物。收率40％。
实施例三至四为双叠氮单体的合成。
实施例三：双对甲苯磺酸酯化合物的制备
如上式，将2-羟乙基双硫化合物(化合物4a)(15g，97.4mmol)，三乙胺(53.8mL，388mmol)和三甲胺(3.7g，38.5mmol)溶解于500mL氯仿中，并在冰浴下向其中加入150mL溶解有对甲苯磺酰氯(55.3g，291mmol)的氯仿溶液。将反应置于冰浴1小时，室温2小时。减压过滤除去不溶物后，用饱和NaHCO3溶液洗至水层无色，再用去离子水和饱和食盐水各洗两次。用K2CO3干燥后，旋蒸除去有机溶剂。浓缩后产物在硅胶柱上用乙酸乙酯∶石油醚(2∶5，体积比)进行柱色谱分离，得到化合物5a。收率40％。
如上式，将1，6-己二醇(化合物4b)(10g，84.7mmol)，三乙胺(46.7mL，337mmol)和三甲胺(3.24g，33.7mmol)溶解于330mL氯仿中，并在冰浴下向其中加入100mL溶解有对甲苯磺酰氯(48.3g，254mmol)的氯仿溶液。反应条件与产物纯化处理与5a化合物相同，最终得到5b化合物。收率31％。
其它各种双羟基化合物的对甲苯磺酰化方法与实施例三中描述方法相同。
实施例四：双叠氮单体(化合物6)的制备
如上式，将16g(34.6mmol)化合物5a和9g(138mmol)NaN3溶解于300mL干燥DMF中，置于80℃反应24小时。经旋蒸除去DMF后，将反应体系用饱和NaHCO3溶液洗涤2次。粗产物在硅胶柱上以乙酸乙酯∶石油醚(1∶5，体积比)为洗脱机进行柱色谱分离，得到双叠氮乙基双硫化物(化合物6a)。收率81％。
如上式，向带有冷凝管的反应容器中加入1，6-对甲苯磺酸己二醇酯(化合物5b)(18g，42.2mmol)和NaN3(11g，169mmol)。将反应体系分散到430mL干燥DMF中并置于80℃反应24小时。将反应体系冷却至室温，减压除去溶剂。加入少量水利用共沸蒸馏除去残余DMF，重复5次。经P2O5干燥，得到1，6-叠氮己烷(化合物6b)。收率65％。
其它各种对甲苯磺酰化产物的叠氮取代反应，与实施例四中描述方法相同。
实施例五：通过“点击”化学制备聚合物
如上式，将化合物3a(349.3mg，0.984mmol)，化合物6a(200.7mg，0.984mmol)和L-抗坏血酸钠(158mg，0.798mmol)溶解于7mL叔丁醇∶水(1∶1，体积比)的混合溶剂中。将反应体系在真空线上除氧三次后，向其中加入无水硫酸铜(64mg，0.4mmol)。将体系密封后置于60℃反应72小时。反应结束后，将反应体系用水稀释，并用截留分子量3500的透析膜在pH＝1的水中透析三天，再用中性水透析12小时。冻干后得到聚合物7a。
如上式，将化合物3b(458.6mg，1.047mmol)，化合物6a(213.6mg，1.047mmol)和L-抗坏血酸钠(158mg，0.798mmol)溶解于7mL叔丁醇∶水(1∶1，体积比)的混合溶剂中。反应条件与产物纯化处理与7a化合物相同，最终得到7b化合物。
如上式，将化合物3a(351.2mg，0.989mmol)，化合物6b(166.2mg，0.989mmol)和L-抗坏血酸钠(158mg，0.798mmol)溶解于7mL叔丁醇∶水(1∶1，体积比)的混合溶剂中。反应条件与产物纯化处理与7a化合物相同，最终得到7c化合物。
如上式，将化合物3b(449.5mg，1.026mmol)，化合物6b(172.4mg，1.026mmol)和L-抗坏血酸钠(158mg，0.798mmol)溶解于7mL叔丁醇∶水(1∶1，体积比)的混合溶剂中。反应条件与产物纯化处理与7a化合物相同，最终得到7d化合物。
其它各种双叠氮单体与双炔单体之间的聚合反应方法同实施例五中所描述的制备方法。
实施例六：对聚合物进行修饰制备活化中间体(化合物8)
下述化合物8a～8e为步骤四途径一中利用丁二酸酐或马来酸酐衍生物修饰聚合反应的产物：
如上式，将化合物7a(3g，6.22mmol)和甲基丁二酸酐(4.28g，37.5mmol)溶解于60mL DMSO中，并向溶液中加入三乙胺(1.7mL，12mmol)，向体系中通N2 10分钟。在25℃反应16小时，将溶液浓缩后，向丙酮中沉淀，除去甲基丁二酸酐，得到粘稠状沉淀。将此沉淀透析后冻干，得到化合物8a。接枝率95.5％。
如上式，将化合物7b(1.7g，3.24mmol)和甲基丁二酸酐(3.32g，29.1mmol)溶解于34mL DMSO中，并向溶液中加入三乙胺(1.3mL，9.2mmol)，向体系中通N2 10分钟。反应过程与产物纯化与制备8a过程相同，最终得到化合物8b。接枝率88.6％。
如上式，取化合物7a(50mg，0.1mmol)，向其中加入丁二酸酐(41mg，0.41mmol)，混合后加入1.5mL DMSO。用真空线除氧两次后于45℃反应16小时。旋蒸除去DMSO后，溶于水中，离心后取上清液冻干，得到化合物8c。
如上式，取化合物7a(30mg，0.062mmol)和马来酸酐(50mg，0.51mmol)溶解于10mL DMSO中，向其中加入二异丙基乙基胺(DIPEA)(36μL，0.21mmol)。在30℃反应24小时。反应结束后将溶剂浓缩，向丙酮中沉淀，离心得到固体，用丙酮洗沉淀两次。真空干燥后得到产物8d。接枝率50％。
如上式，取化合物7b(100mg，0.19mmol)和马来酸酐(223mg，2.28mmol)溶解于2mL DMSO中，向其中加入二异丙基乙基胺(DIPEA)(100μL，0.58mmol)。在30℃反应24小时。产物纯化方法与8d相同，最终得到化合物8e。接枝率83％。
下述化合物8f和8g为步骤四途径二中用丙烯酸酯类化合物修饰聚合反应的产物：
如上式，取化合物7a(3.2g，6.64mmol)溶于76mL DMSO，向其中加入34mL溶解有丙烯酸甲酯(24.8mL，274mmol)和二异丙基乙基胺(2.4mL，13.7mmol)的DMSO溶液，加样完成后向体系加入甲醇(0.55mL，13.6mmol)。将反应置于30℃反应60小时，在旋转蒸发仪上除去可挥发性有机溶解和大部分DMSO，将剩余混合物冻干，得到化合物8f。接枝率＞99％。
如上式，取化合物7b(1.4g，2.67mmol)溶于32mL DMSO，向其中加入14mL溶解有丙烯酸甲酯(14.5mL，160mmol)和二异丙基乙基胺(1.4mL，8mmol)的DMSO溶液，加样完成后向体系加入甲醇(0.32mL，7.9mmol)。反应过程与产物纯化方法与化合物8f制备过程相同，最终得到化合物8g。接枝率＞99％。
实施例七：利用多胺对聚合物活化中间体(化合物8)进行接枝修饰
下述化合物9a～9d由中间体8a修饰制得。
如上式，事先将化合物8a溶解于DMSO中，配置成浓度为100mg/mL的均相溶液。称取二乙撑三胺(2.81g，27.3mmol)，加水稀释至10mL。在pH计上用浓盐酸将pH值调节到4.5～5.0的范围区间内。待胺溶液冷却至室温后，取含有200mg(0.29mmol)的化合物8a溶液，滴加到胺溶液中。称取130mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，溶解于0.5mL pH＝5的水中，溶解完成后迅速加入到反应体系内。室温反应16小时。反应结束后，用截留分子量3500的透析袋透析。冻干后得到化合物9a。收率76％。
如上式，将四乙撑五胺(5.2g，27.5mmol)加水稀释至10mL。反应条件与纯化方法与9a化合物制备过程相同，最终得到化合物9b。收率41％。
如上式，将五乙撑六胺(6.38g，27.5mmol)加水稀释到10mL水中。反应条件与纯化方法与9a化合物制备过程相同，最终得到化合物9c。收率59％。
如上式，将分子量为800的聚乙烯亚胺(OEI 800)(22.4g，28mmol)溶解于40mL水中。反应条件与纯化方法与9a化合物制备过程相同，最终得到化合物9d。收率84％。
下述化合物9e～9h由中间体8b修饰制得。
如上式，事先将化合物8b溶解于DMSO中，配置成100mg/mL的均相溶液。称取二乙撑三胺(3.31g，32.1mmol)，加水稀释至10mL。在pH计上用浓盐酸将pH值调节到4.5～5.0的范围区间内。待胺溶液冷却至室温后，取含有200mg(0.24mmol)的化合物8b溶液，滴加到胺溶液中。称取130mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，溶解与0.5mL pH＝5的水中，溶解完成后迅速加入到反应体系内。室温反应16小时。反应结束后，用截留分子量3500的透析袋透析。冻干后得到化合物9e。收率77％。
如上式，将四乙撑五胺(6.05g，32.0mmol)加水稀释至10mL。反应条件与纯化方法与9e化合物制备过程相同，最终得到化合物9f。收率69％。
如上式，将五乙撑六胺(7.42g，32.0mmol)加水稀释至10mL。反应条件与纯化方法与9e化合物制备过程相同，最终得到化合物9g。收率73％。
如上式，将分子量为800的聚乙烯亚胺(OEI 800)(25.6g，32.0mmol)加水稀释至40mL。反应条件与纯化方法与9e化合物制备过程相同，最终得到化合物9h。收率75％。
如上式，称取五乙撑六胺(44g，190mmol)，向其中加入10mL含有化合物8f(0.62g，0.95mmol)的DMSO溶液。将反应置于50℃反应48小时。反应结束后，透析，冻干得到化合物9i。
如上式，称取五乙撑六胺(27.6g，119mmol)，向其中加入6mL含有化合物8g(0.31g，0.40mmol)的DMSO溶液。将反应置于50℃反应48小时。反应结束后，透析，冻干得到化合物9j。
实施例八：聚合物化学性质测试
通过元素分析测定聚合物中的氮含量。由于酰胺和“点击”化学反应中产生的三唑氮杂环中的氮原子在生理条件下不具有复合DNA的能力，因此，将7a～7d化合物所测得的元素分析氮含量结果(Nwt％)根据聚合物的结构式分别乘以2/10，3/11(分别对应由单体3a，3b所制备的聚合物)，记做Neff％，即在生理条件下能够发生质子化的氮原子含量。以下实施例中用此数值计算表征中所需N/P比。
根据元素分析结果，将7a～7d聚合物溶解在0.1M NaCl中，配置成含有0.015mg/mL可质子化胺基的溶液。用浓盐酸将溶液pH值调至2，而后用0.1M的NaOH溶液在恒温水浴上进行滴定，待读数稳定后记录pH值。缓冲容量通过公式(NNaOH-polymer-NNaOH-blank)/Namine×100％计算，式中NNaOH-polymer和NNaOH-blank分别代表在滴定聚合物和空白溶液过程中，pH值从5.1变化到7.4所消耗的NaOH的物质的量，Namine表示溶液中所含有的二级胺的总量。
缓冲容量能够代表聚合物在pH 5.1-7.4的区间内捕获质子的能力。实验测试结果表明，由3a单体制备而成的聚合物7a和7c具有较大的缓冲容量，见表1。
表1.聚合物7a～7d样品表征
| 样品编号 | 收率(％) | Mp a(×104) | Nwt b(％) | Neff c(％) | BCd(％) |
| 7a | 28 | 4.9 | 22.9 | 4.6 | 38.3 |
| 7b | 46 | 5.0 | 23.8 | 6.5 | 22.8 |
| 7c | 60 | 5.7 | 25.2 | 5.0 | 39.9 |
| 7d | 72 | 7.1 | 25.0 | 6.8 | 15.5 |
a含20mM LiBr DMF相GPC中所测得的乙酰化后聚合物分子量；
b元素分析中所测得氮元素含量；
c经折算后，聚合物含有的可质子化二级胺含量；
d缓冲容量(Buffer Capacity)由酸碱滴定实验测定。
实施例九：利用聚合物实现对DNA的包裹
将质粒DNA溶解于pH＝7.4的20mM HEPES缓冲溶液中。于10000转/分钟离心2分钟后，收集上清液作为DNA储存溶液。通过此DNA溶液在260nm和280nm的紫外吸光度来确定DNA溶液的浓度和纯度。本发明所述及的各种阳离子聚合物均溶解在pH＝7.4的20mM HEPES缓冲溶液中并用220nm的PVDF滤膜加以过滤。
制备DNA复合物之前，先将DNA溶液稀释至10μg/mL，而后根据不同的N/P比例加入聚合物溶液，利用移液枪反复抽打数次或者在涡旋仪上以1200转/分的速度涡旋30秒，室温静置半小时后即得到该N/P比例的阳离子聚合物/DNA复合物。通过粒度仪和zeta电势方法，测量了复合物的溶液性质。如图2所示。
结果表明，由6b单体制备的聚合物7c和7d能够在N/P为60时将复合物颗粒稳定到300～400nm左右的区间；而6a单体制备的聚合物7a和7b，与DNA结合后形成的复合物粒径较大，均在800nm以上。
由6b单体制备的聚合物7c和7d能够在N/P＝60时形成表面带有15～20mV正电的复合物颗粒，而由6a单体制备的聚合物7a和7b，所形成的复合物电势不超过5mV。
实施例十：还原条件下7a、7b所形成的复合物包裹DNA的释放
向6μL含有0.3μg pEGFP-N1 DNA(注：质粒pEGFP-N1能够表达绿色荧光蛋白红移突变种，参见文献Biomacromolecules 2008，9，109-115)的溶液中加入7a溶液(2.21μL，2mg/mL)或7b溶液(1.56μL，2mg/mL)，混合均匀后放置半小时。待复合物制备完成后，向其中加入还原物质二巯基苏糖醇(DTT)，使DTT最终浓度为0.5，5，50mM，在室温下静置30分钟后与1.2μL上样缓冲液(85％甘油和15％溴酚蓝)混合，加入到经SYBR Green I染色的0.7wt％的琼脂糖凝胶中。于90V电压下在0.5X TBE缓冲液中电泳50分钟。此后，用VDS热成像系统进行拍照观察。如图3所示。
按照实施例九描述方法制备聚合物/DNA复合物，室温静置半小时后，向其中加入300mM的还原试剂二巯基苏糖醇(DTT)溶液，使其最终浓度为20mM。稳定半小时后，检测复合物的尺寸和表面电势。如图4所示。
实验表明，加入还原试剂DTT后，复合物的粒径不随时间增长而增长(见图4A中“7aw DTT”和“7b w DTT”)，而未加入DTT的对照组，其粒径均随时间延长而增大(见图4A中“7a w/o DTT”和“7b w/o DTT”)。从表面电势来看，加入DTT后，复合物表面电势由正变负(见图4B中“7a w DTT”和“7b w DTT”)，而未加入DTT的对照组中，其表面电势未见显著变化(见图4B中“7a w/o DTT”和“7b w/o DTT”)。在凝胶电泳实验中可以发现，当DTT浓度达到5mM以上时，7a和7b形成的复合物均能够在30分钟之内发生降解，进而在电泳实验中释放出所包裹的DNA。
实施例十一：细胞转染与毒性测试
转染前24小时，取处在对数生长期的B16F10或COS-7细胞，以每孔5000个细胞的密度将细胞接种于96孔板内。继续在37℃培养一天直到60～70％细胞融合。转染时，按照每孔0.3μg pEGFP-N1 DNA的量配置聚合物/DNA复合物溶液，复合30分钟后将其加入到细胞培养板中，4小时后，将细胞培养板中的培养基吸出，加入100μL DMEM完全培养基。继续培养48小时后在荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白(GFP)表达量。如图5(A)和图5(B)所示。
向细胞培养板中每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液。于培养箱中培养4小时后，将培养基全部小心吸出，晾干后，加入150μL DMSO，用酶标仪检测570nm的吸光度，测定细胞毒性。如图5(C)和图5(D)所示。
在体外转染实验中，聚合物7a的效率最高，尤其在B16F10细胞系中，其转染效率超过了选用的商业化参比：分子量25000的线型PEI(1PEI)，见图5(A)和图5(B)。
在B16F10细胞系中，由6b单体制备的聚合物7c和7d的细胞毒性均较大，而由6a单体制备的7a和7d均未体现出明显的毒性，见图5(C)。而在COS7细胞系中，7d样品表现出明显的细胞毒性，而其它三种聚合物毒性均不明显，见图5(D)。
实施例十二：荧光素酶测试
转染前24小时，取处在对数生长期的B16F10细胞，以每孔5000个细胞的密度将细胞接种于96孔板内。继续在37℃培养一天直到60～70％细胞融合。转染时，按照每孔0.3μgpCMV-Luc DNA(注：质粒pCMV-Luc可以表达荧光素酶，参见文献Biomacromolecules 2008，9，109-115)的量配置聚合物/DNA复合物溶液，复合30分钟后将其加入到细胞培养板中。4小时后，将细胞培养板中的培养基吸出，加入100μL DMEM完全培养基。继续培养36小时后，按照Promega公司生产荧光素酶试剂盒操作程序，检测细胞表达的荧光素酶含量。以每毫克细胞对应相对荧光强度(RLU/mg cell)计量。如图6所示。
从结果看出7a样品转染效率最高，在N/P 30以上，其效率要超过商业化试剂线型PEI，而7b样品转染效率最低，7c和7d介乎其间。
Claims (10)
1.一种梳状阳离子聚合物，具有式9所示的结构：
式9中，n为5～100的整数，x为2～6的整数，t为1～3的整数；
Y为或
或
其中q为2～12的整数，m为1～3的整数；
R为
或
或
其中Z代表氢或C1-C6的直链或支链烷基，p为0～20的整数。
2.如权利要求1所述的梳状阳离子聚合物，其特征在于，该梳状阳离子聚合物选自下列聚合物9a～9j中的一种：
上述聚合物9a～9j中，n为5～100的整数，OEI800表示分子量为800的聚乙烯亚胺。
3.一种线型阳离子聚合物，具有式7所示的结构：
式7中，n为5～100的整数，x为2～6的整数，t为1～3的整数；
Y为
或
或
其中q为2～12的整数，m为1～3的整数。
4.如权利要求3所述的线型阳离子聚合物，其特征在于，该线型阳离子聚合物选自下列聚合物7a～7d中的一种：
上述聚合物7a～7d中，n为5～100的整数。
5.一种聚合物，具有式8所示的结构：
式8中，n为5～100的整数，x为2～6的整数，t为1～3的整数；
Y为或或其中q为2～12的整数，m为1～3的整数；
R1为
或
或其中Z代表氢或C1-C6的直链或支链烷基，L代表C1-C6的直链或支链烷基。
6.如权利要求5所述的聚合物，其特征在于，该聚合物选自下列聚合物8a～8g中的一种：
上述聚合物8a～8g中，n为5～100的整数。
7.一种制备权利要求3所述线型阳离子聚合物的方法，包括下述步骤：
1)将式1所示的炔胺与丙烯酰氯反应得到式2所示的丙烯酰炔胺，式2所示的丙烯酰炔胺再与含有不同二级胺数目的寡聚多胺反应得到式3所示双炔化合物，如下反应式所示：
上述反应式中x为2～6的整数，t为1～3的整数；
2)通过用对甲苯磺酰氯活化羟基，再用叠氮基团进行取代的方法，制备式6所示的双叠氮单体，如下反应式所示：
上述反应式中Y为
或或
其中q为2～12的整数，m为1～3的整数；
3)通过“点击”化学反应实现式3所示双炔化合物和式6所示双叠氮单体之间的聚合，制备出式7所示的线型阳离子聚合物：
式7中，n，x，t和Y如权利要求3所定义。
8.一种制备权利要求5所述聚合物的方法，包括下述步骤：
1)将式1所示的炔胺与丙烯酰氯反应得到式2所示的丙烯酰炔胺，式2所示的丙烯酰炔胺再与含有不同二级胺数目的寡聚多胺反应得到式3所示双炔化合物，如下反应式所示：
上述反应式中x为2～6的整数，t为1～3的整数；
2)通过用对甲苯磺酰氯活化羟基，再用叠氮基团进行取代的方法，制备式6所示的双叠氮单体，如下反应式所示：
上述反应式中Y为
或
或
其中q为2～12的整数，m为1～3的整数；
3)通过“点击”化学反应实现式3所示双炔化合物和式6所示双叠氮单体之间的聚合，制备出式7所示的线型阳离子聚合物：
式7中，n为5～100的整数，x为2～6的整数，t为1～3的整数，Y如步骤2)所定义；
4)通过向式7所示的线型阳离子聚合物引入丁二酸酐或马来酸酐衍生物，或者是丙烯酸酯类化合物，制备出权利要求5所述的聚合物，如下反应式所示：
或者
或者
其中，Z代表氢或C1-C6的直链或支链烷基，L代表C1-C6的直链或支链烷基。
9.一种制备权利要求1所述梳状阳离子聚合物的方法，首先根据权利要求8所述的方法制备权利要求5所述的聚合物，然后通过胺基与羧基的缩合反应在式8-1或式8-2所示聚合物中引入侧链胺基，或者通过胺基与酯键的交换反应在式8-3所示聚合物中引入侧链胺基，得到权利要求1所述梳状阳离子聚合物，如下反应式所示：
或者
或者
其中，n，x，t和Y如权利要求1所定义，Z代表氢或C1-C6的直链或支链烷基，L代表C1-C6的直链或支链烷基。
10.权利要求1或3所述阳离子聚合物作为基因载体的应用。
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