CN101605743A - 用于产生报告分子的点击化学 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产生适于分析物如核酸的检测的报告分子的方法。此外，本发明涉及检测分析物的方法和区域。

Description

用于产生报告分子的点击化学
本发明涉及产生适于检测分析物，如核酸的报告分子。此外，本发明涉及检测分析物的方法和区域。
发明背景
在DNA合成领域中的划时代突破，最重要的是聚合酶链式反应(PCR)和亚磷酰胺化学，已经导致天然DNA修饰的所有组成不断增加。在PCR中，使用某些B族聚合酶可以掺入在嘧啶的5位或在7-脱氮杂嘌呤的7位上携带接头的经修饰的核苷三磷酸[1]。这些结构单元向DNA中掺入的容易程度强烈依赖于侧链的空间体积和分子结构。原则上，在PCR中所有天然的核碱基都可以被经修饰的核碱基替代[2]。如果使用亚磷酰胺化学，原则上任何分子结构都可以掺入DNA中。最大的限制是掺入DNA的经修饰的核碱基对于亚磷酰胺DNA合成和所得DNA链的去保护条件必须是稳定的。
在我们的研究小组中已经开发了避免修饰的空间体积以及潜在化学不稳定性的问题的方法[3]。经修饰的核苷酸携带含有内部和末端炔的接头。内部炔有助于通过PCR的掺入，因为与核碱基很接近的空间体积被减少了。末端炔是点击反应(click reaction)的反应性位点[4]，点击反应是铜催化的叠氮化物和炔之间的Huisgen偶极环加成[5]。该反应可以方便地用于生物分子的合成后标记。从而叠氮化物可以在高产率反应中连接到DNA而不会遇到任何严重的副反应，因为天然的生物分子不携带任何叠氮化物或者末端炔。该方法也描述于PCT/EP2006/004017，将其内容引入本文作为参考。
根据以前描述的方法，仅仅一种类型的标记基团可以以位点选择性方式导入。从而，本发明的目的是克服这种限制并允许用至少两种不同的标记基团(例如，染料或其他功能分子)以连续的方式位点特异性标记报告分子，从而实现修饰中前所未有的通用性。
发明概述
本发明允许向报告分子中以连续方式位点特异性掺入两种或多种不同的官能团。这可以通过在报告分子合成期间向其掺入至少两种不同的手柄基团，其可以选择性偶联到包含不同官能团的反应配偶体。
从而，本发明的第一方面涉及产生包含至少两种不同官能团的报告分子的方法，其中至少一个第一和至少一个第二手柄基团掺入到报告分子中，其中手柄基团选自炔基、经保护的炔基、叠氮基、醛基、经保护的醛基、肼基或者羟胺基，并且其中第一和第二手柄基团是不同的并且其中第一和第二手柄基团选择性偶联到包含第一和第二不同官能团的第一和第二反应配偶体。
本发明的另一方面涉及产生包含至少两种不同官能团的报告分子的方法，其包括
(a)从多个结构单元合成报告分子，其中至少一个结构单元包含选自炔基、经保护的炔基、叠氮基、醛基、经保护的醛基、肼基或者羟胺基的第一手柄基团，其中至少一个结构单元包含选自炔基、经保护的炔基、叠氮基、醛基、经保护的醛基、肼基或者羟胺基的第二手柄基团，并且其中第一手柄基团不同于第二手柄基团；
(b)在其中第一手柄基团是反应性并且第二手柄基团不是反应性的条件下将第一反应配偶体与第一手柄基团偶联，其中第一反应配偶体包含第一官能团，并随后
(c)将第二反应配偶体与第二手柄基团偶联，其中第二反应配偶体包含第二官能团并且其中第一官能团不同于第二官能团。
本发明的另一方面涉及检测样品中的分析物的方法，其包括步骤：
(a)提供样品；
(b)将样品与报告分子接触，该报告分子包含至少两个不同的官能团，其中所述官能团通过包含1，2，3-三唑环的接头基团结合至报告分子，
(c)检测报告分子与分析物的相互作用，其表明样品中分析物的存在和/或量。
本发明的另一方面是报告分子，其包含至少两种不同的官能团，其中所述官能团通过包含1，2，3-三唑环的接头基团结合至报告分子。
本发明的另一方面是式(I)的化合物
C-S-N
其中C是经保护的炔基，
S是间隔体或键，并且
N是核酸或核酸类似物结构单元，如核苷或核苷酸或非核苷化合物。
本发明的另一方面是式(II)的化合物
B-S-N3
其中B是生物素或生物素衍生物，如脱硫生物素或氨基生物素，
S是间隔体或键，并且
N3是叠氮基。
本发明的另一方面是式(III)的化合物
Q-S-N
其中Q是淬灭基团，
S是间隔体或键，并且
N是叠氮基。
此外，本发明涉及式(IV)的化合物
Z-S-N
其中Z是醛糖基，其中羟基用酰基和/或甲硅烷基保护，或者是经保护或未保护的1，2二醇基，
S是间隔体或键，并且
N是核酸或核酸类似物结构单元，如核苷或核苷酸化合物。
此外，本发明涉及式(V)的化合物
D-S-N
其中D是红外(IR)染料，
S是间隔体或键，并且
N是叠氮基。
式(I)-(V)的化合物适于在用于检测分析物，尤其如下文详述的照相方法中用作试剂。
本发明允许有效产生包含两种、三种或多种不同官能团的报告分子。这些报告分子允许高度灵敏地检测生物样品，如临床样品、环境样品或农业样品中的分析物，如核酸或核酸结合蛋白。优选的应用包括但不限于，检测遗传变异性，例如，单核苷酸多态性(SNP)、杀虫剂或者药物抗性、耐受性或者不耐性，基因分型，例如，检测生物物种或者株系，检测遗传修饰的生物或者株系，或者检测病原体或害虫，和诊断疾病，例如，遗传疾病、变应性疾病、自身免疫病或者感染性疾病。另一优选的应用是检测样品中的核酸用于商标保护，其中产品，如农产品、食品、或者有价值的商品和/或这些产品的包装用产品特定信息编码，例如，但不限于产地、生产日期、经销商，等等，并且其中该信息用如上述的方法和试剂检测。
优选实施方案详述
本发明的第一方面涉及报告分子的生产。报告分子可以是任一类型的分子，其适于诊断应用并且其可以通过选择性偶联反应用至少两个，例如，2、3、4或更多不同的官能团官能化。例如，报告分子可以是核酸分子、核酸类似物分子或者肽。优选地，从结构单元，例如，单体结构单元，如氨基酸、核苷酸或核苷酸类似物合成报告分子。合成可以涉及化学合成，例如，化学固相合成或者酶促合成，例如，通过引物延伸进行酶促核酸合成。优选地，报告分子包含至少4个、更优选至少6个，最优选至少10个结构单元。尽管可以使用具有几百到多至数千个结构单元长度的报告分子，但是优选最多至300个结构单元。更优选地，长度为多至200，最优选多至100个结构单元。
官能团优选选自标记基团，如染料，尤其荧光染料、光敏基团、淬灭基团和附着基团。标记基团可以是直接标记基团，即产生可检测信号的基团，或者间接标记基团，即通过不同的基团引起产生可检测信号的基团。
在特别优选的实施方案中，标记基团是荧光染料，例如，蓝色、红色或者绿色荧光染料，如花青染料或者部花青染料。尤其优选IR染料。这些染料可以如实施例18中所述官能化为叠氮化物衍生物。
淬灭基团是能够淬灭从荧光基团发出荧光的基团。淬灭基团可以选自已知的淬灭基团，例如，如参考文献[12-16]中所述的分子信标(Molecular Beacon)报告分子中的淬灭基团。
附着基团是通过高亲和力相互作用附着特定结合配偶体的基团。附着基团的特定实例是生物素和生物素衍生物，如脱硫生物素或氨基生物素，或者半抗原，例如，特别能够与抗体相互作用的低分子量基团(例如，分子量≤2000)，如三硝基苯基或肽表位，如FLAG序列。
本发明包括不同官能团与报告分子的偶联。不同的官能团优选包含至少一个标记基团。在特别优选的实施方案中，第一官能团是标记基团，第二官能团是淬灭基团或者附着基团。
当第一官能团是标记基团并且第二官能团是淬灭基团时，报告分子可以是分子信标(MB)。分子信标是单链杂交探针，例如，形成茎-环结构的核酸或核酸类似物探针。环可以含有与靶序列互补的探针序列，通过位于探针序列任一边的互补的臂序列的退火形成茎。标记基团，例如，荧光团优选连接到臂的末端并且淬灭剂连接到另一臂。当分子信标在溶液中时游离的时候它们不发荧光。然而，当它们与含有靶序列的核酸链杂交时，它们经历构象改变，其产生明亮的荧光。分子信标报告分子的长度优选为15-100并且更优选20-50个核苷酸或核苷酸类似物结构单元。
在另一实施方案中，第一和第二官能团是能够进行荧光共振能量转移(FRET)的标记基团。
本发明的方法涉及向报告分子掺入至少两种不同类型的手柄基团，至少两种不同类型的官能团可以偶联到所述报告分子。根据本发明，手柄基团选自未保护或经保护的炔基、叠氮基、醛基、经保护的醛基、肼基或者羟胺基，并且其中第一和第二手柄基团是不同的。
在优选实施方案中，手柄基团选自炔基，其中第一手柄基团是未保护的炔基并且第二手柄基团可以是经保护的炔基或者其中第一手柄基团可以是第一经保护的炔基并且第二炔基可以是第二经保护的炔基，其中第一和第二保护基是不同的并且其中第一保护基可以从报告分子选择性除去而不除去第二保护基。合适的保护基是例如如参考文献[6]中所述的甲硅烷基，尤其是三(烷基/芳基)甲硅烷基，如三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、三苯基甲硅烷基或叔丁基-二甲基甲硅烷基(TBDMS)。甲硅烷基保护基可以通过用酸和/或氟化物处理从炔基除去。小的甲硅烷基保护基如TMS是不稳定的并且可以在温和条件下除去，而较大的甲硅烷基保护基如TBDMS或TIPS的去除需要更严格的条件。
本发明的方法包括第一反应配偶体与报告分子上的第一手柄基团的选择性偶联，该选择性偶联在第一手柄基团未保护并且从而能够反应而第二手柄基团是不反应性的，例如，由于存在保护基的条件下进行。可以通过点击反应使用叠氮基使炔基与反应配偶体偶联，点击反应即叠氮化物与炔基之间的(3+2)环加成，导致形成1，2，3-三唑环。点击反应优选在铜离子存在下进行，例如，使用CuBr、三(1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)和抗坏血酸盐。
在另一优选实施方案中，手柄基团可以选自醛基，尤其选自含有不同类型保护基的经保护的醛基。醛基可以与肼(H2N-NH)基或羟胺基(NH2-O)反应得到腙(-C＝N-NH-)或肟(C＝N-O-)。通过用还原剂如NaBH4处理可以任选还原CN双键。
优选的经保护醛基是乙缩醛或半缩醛基，其可以通过用酸，如有机或无机酸处理转化为游离醛基。乙缩醛或半缩醛基的优选实例是用多元醇如丙二醇或乙二醇形成的乙缩醛基，或者糖或糖相关化合物如醛糖(如葡萄糖或半乳糖)中的半缩醛基。经保护的醛基的其他实例是亚氨基(例如，＝NH基)，其当用酸处理时产生醛基；硫缩醛或二硫缩醛基(例如，C(SR)2基团，其中R可以是烷基)，其当用汞盐处理时得到醛基；肟基(例如，＝NOH基)，其当用酸处理时产生醛基；腙基(例如，＝N-NHR基，其中R可以是烷基)，其当用酸处理时产生醛基；和咪唑啉酮或咪唑烷基或苯并噻唑或二氢苯并噻唑基，其当例如用酸水解时产生醛。
特别优选的经保护的醛基是醛糖基，例如，环状形式的丙糖、丁糖、戊糖或己糖，其中羟基被合适的保护基，尤其酰基或甲硅烷基保护。酰基保护基，例如，乙酰基、丁酰基、新戊酰基或其他脂肪族和/或芳香族羧酸保护基可以在碱性条件下除去。通过用酸和/或氟化物处理可以除去甲硅烷基。在其他优选的实施方案中，经保护的醛基是经保护或不经保护的1，2二醇基，其可以与氧化剂如NaIO4反应产生游离醛基。
本发明也允许向报告分子中掺入两个以上不同的手柄基团。在该情况中，第一手柄基团可以是未保护的基团炔基。第二手柄基团可以第一经保护的基团，例如，第一经保护的炔基，其可以在第一去保护条件下切除。第三手柄基团可以是第二经保护的基团，例如，第二经保护的炔基，其在导致第一经保护的基团去保护的第一去保护条件下是稳定的并且可以在与第一去保护条件不同的第二去保护条件下被切除。第一和第二去保护基团的特定实例是TMS和TIPS。TMS可以在温和的酸性条件下，例如1％乙酸中被切除。TIPS在这些条件下是稳定的并且可以通过氟化物处理，例如用乙腈/DMF中的正叔丁基氟化铵(TBAF)处理而被切除。
报告分子的合成可以包括化学合成(例如，图17)或者酶促合成(例如，图18)。优选地，合成是化学合成，例如，化学固相合成，其中通过在结合至固相时逐步装配结构单元合成报告分子。第一反应配偶体和第二反应配偶体以及任选地其他反应配偶体的连续偶联可以在化学合成方法期间在不同的步骤发生。例如，至少第一反应配偶体可以是偶联的，同时报告分子结合至固相。在该情况下，可以发生第二反应配偶体和任选地其他反应配偶体的偶联，同时报告分子也仍然结合至固相或者在报告分子从固相切割后发生所述偶联。另一方面，在报告分子从固相切除后第一反应配偶体在溶液中偶联也是可能的。在该情况下，其他反应配偶体的逐步去保护和偶联也在溶液中发生。
本发明的另一方面涉及使用报告分子检测样品中分析物的方法，所述报告分子包含两种不同的官能团，其中所述官能团通过包含1，2，3-三唑环的接头基团结合至报告分子。这些接头基团导致进行点击反应，其涉及通过炔基和叠氮基之间的点击反应将至少两种不同的官能团偶联到报告分子的主链。
检测可以是定性检测，例如，测定待分析的样品中分析物，例如特定核酸序列的存在或不存在。然而，本发明也允许定量检测分析物，例如，待分析的样品中的核酸序列。定性和/或定量检测可以包括根据本领域已知的方法测定标记基团。
待检测的分析物优选选自核酸和结合核苷、核苷酸或核酸的分子，例如，结合核苷、核苷酸或核酸的蛋白质。更优选地，分析物是核酸，例如，可以根据已知的技术，尤其根据杂交技术检测的任一类型的核酸。例如，核酸分析物可以选自DNA，例如，双链或单链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体。核酸分析物的具体实例是基因组DNA、mRNA或从其衍生的产物，例如，cDNA。此外，核酸分析物可以是DNA片段，其通过连接酶从许多、例如两个子片段连接得到。
可以根据适于检测样品中分析物，尤其核酸分析物的任何已知的测试形式进行本发明的方法。例如，该方法可以涉及检测固定在固体表面，如膜，例如，在Southern或Northern印迹、芯片、阵列或者如小珠的颗粒上的分析物。此外，可以在凝胶中，例如在电泳分离凝胶中的样品中后，例如在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中进行检测。该方法可以涉及检测单一分析物或者平行地检测多种分析物，例如，以芯片或微阵列形式进行检测。
在优选实施方案中，检测涉及在怀疑含有分析物的样品和报告分子的存在下，照射光敏介质，所述报告分子包含光敏剂标记基团，例如，荧光基团，其能够实现能量向光敏介质的转移，其中在该介质中可以形成标记物基团。优选地，使用报告分子，其中不存在分析物时，光敏基团被淬灭。存在分析物时，光敏基团的淬灭被减小或消除。
由于高度灵敏性，本发明的方法适于不用扩增而直接检测分析物。根据本发明，甚至在不扩增的情况下测定微量的分析物，例如核酸，例如，0.1ng或更低，优选0.01ng或更低，更优选1pg或更低，甚至更优选0.1pg或更低，甚至更优选0.01pg或更低，最优选0.001pg或更低。通过向报告分子掺入多个标记基团可以得到特别高的灵敏度。例如，通过组合Southern印迹和本发明方法可以进行生物样品中分析物，如基因的检测。然而，应该注意到，本发明的方法也允许与扩增步骤组合检测核酸，扩增步骤可以根据已知的方案如PCR或其修饰方案，如不对称PCR、实时PCR、逆转录PCR等等或者其他扩增方案如LCR进行。
在本发明的优选实施方案中，进行分析物的序列特异性检测，其中例如，具有特定序列的核酸与样品中的其他核酸序列区分或者能够结合特定核酸序列的多肽与样品中的其他多肽区分。此类序列特异性检测优选包括序列特异性杂交反应，通过该反应，待检测的核酸序列与携带标记物基团或标记物前体基团的化合物结合。然而，应该注意到，本发明也允许序列非特异性检测核酸，例如，检测样品中存在的任何核酸。
手柄基团连接到适于合成报告分子的结构单元。优选地，手柄基团连接到，核碱基可以选自天然的和非天然的嘌呤和嘧啶碱基。优选地，核碱基选自胞苷、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、次黄苷和黄嘌呤。手柄基团优选连接到嘧啶核碱基的5或6位，优选5位，或者连接到嘌呤核碱基的7或8位，优选7位，尤其如果希望酶促掺入到核酸的情况下。
备选地，手柄基团也连接到核苷酸结构单元的磷酸或糖基。
此外，本发明也允许携带手柄基团的非核苷结构单元掺入到报告分子。优选具有通式(V)的非核苷结构单元：
其中
A是经保护或未保护的炔基，
S1和S2在每种情况下独立地为非核苷基团，例如，间隔体或键，并且例如S1是如下定义的间隔体并且S2是共价键，
P是磷酸或磷酸类似物基团，例如，亚磷酰胺基团，
R是用于核酸合成的偶联基团，例如，二甲氧基三苯甲基(DMT)基团。
手柄基团可以共价连接到结构单元，例如通过直接的键或者间隔体，例如具有多至20个原子的链长的间隔体连接到结构单元。间隔体可以是柔性间隔体，例如，基于亚烷基的间隔体，任选含有杂原子，如O、S和/或N或者至少部分刚性间隔体，例如，包含至少一个刚性基团的间隔体，其选自烯基、炔基、环状基团，尤其芳族或杂芳族基团，并且环脂肪族基团和其组合。如果结构单元化合物包含炔或叠氮化物，那么优选通过直接的键、柔性间隔体或部分刚性间隔体进行官能团的附着，其中柔性间隔体可以例如具有多至6个原子、更尤其多至4个原子的链长，并且其中部分刚性间隔体优选具有多至20个原子，例如，多至10个原子的链长并且包含如上文定义的至少一个刚性基团，尤其是炔基，和至少一个柔性基团，例如，亚烷基。如果另一方面，手柄基团是醛基或经保护的醛基或醛基前体基团，那么通过如上文定义的部分刚性间隔体或者具有2到10个原子链长的至少部分刚性间隔体连接是优选的。含有刚性基团的间隔体，例如部分刚性间隔体的结构是优选的，使得刚性基团直接连接到核碱基。
根据本发明的术语“核苷酸”特别涉及核糖核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸或2’，3’-二脱氧核糖核苷酸。核苷酸类似物可以选自糖或骨架修饰的核苷酸，尤其可以是酶促掺入核酸的核苷酸类似物。在优选的糖修饰的核苷酸中，核糖糖的2’-OH或H基被选自OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团取代，其中R是C1-C6烷基、烯基或炔基并且卤素是F、Cl、Br或I。核糖自身可以被其他碳环或杂环5或6元基团如环戊烷或环己烷基团取代。在优选的骨架修饰的核苷酸中，磷酸(三)酯基团可以被修饰基团，例如，被硫代磷酸基团或者H-膦酸基团取代。进一步优选的核苷酸类似物包括用于合成核酸类似物如吗啉代核酸、肽核酸或锁核酸(locked nucleic acid)的结构单元。
官能化的核酸可以是寡核苷酸，例如，具有多至30个核苷酸(或核苷酸类似物)结构单元长度的核酸，或者具有或大于30个核苷酸(或核苷酸类似物)结构单元长度的多核苷酸。优选地，核酸和核酸类似物能够特异结合分析物，例如能够在测定条件下与核酸分析物杂交。最小长度优选为12并且更优选为14个核苷酸(或核苷酸类似物)结构单元。
通过用于化学合成的标准技术和/或通过酶促掺入可以向核酸中掺入结合至核酸或核酸类似物结构单元的手柄基团。例如，在标准合成方案中使用经修饰的核苷亚磷酰胺作为结构单元，通过标准亚磷酰胺化学可以进行化学合成。用于化学合成的其他类型的优选结构单元包括H-膦酸或磷酸三酯修饰的核苷。
另一方面，通过酶促方法可以向核酸中掺入经修饰的核苷酸。令人惊奇地，发现手柄修饰的核苷三磷酸被核酸合成酶接受为酶底物，所述酶为诸如DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶或端粒酶。例如，发现经修饰的核苷三磷酸被常用于引物延伸和扩增方案的DNA聚合酶接受，所述DNA聚合酶为诸如热稳定的DNA聚合酶，如Taq聚合酶、Vent聚合酶、Pfx聚合酶、Pwo聚合酶或Therminator聚合酶。酶接受经修饰的三磷酸酯而不丧失保真性并且允许基于模板掺入核酸，如DNA和RNA。
本发明的方法提供了分析物检测的多种实施方案。例如，可以提供酶促掺入核酸分子中的经修饰的核酸结构单元，例如，核苷酸或核苷酸类似物，以及合适的酶。在本发明中，可以使用多种不同类型的官能化核苷酸。
通过任何已知的核酸检测方案，例如，涉及使用固相支持体的方案进行本发明的检测方法。例如，可以提供固相支持体，例如，芯片或阵列或如小珠的颗粒物质，能够与待检测的分析物杂交的捕获探针与所述固相支持体结合。可以如下检测固相结合的核酸分析物：使用官能化的杂交探针，其作为捕获探针与核酸分析物在不同序列部分中杂交，并随后例如用金属化试剂检测结合的杂交探针。该方法尤其适于农业和临床领域中的诊断应用，例如用于检测来自植物，例如，遗传经修饰的植物的DNA和/或mRNA，来自病原体或植物害虫等的DNA，或者用于商标保护。
在特定实施方案中，检测可以涉及将分析物与包含光敏基团的报告分子的联合产物与光敏介质接触，例如，通过点样、移液等等转移样品或样品等分试样，其中联合产物可以存在于光敏介质上。照射时，实现能量从光敏基团向光敏介质的转移，使得在光敏基团存在下而不是缺失时，在光敏介质中形成标记物基团如金属，如银核。如果必要，标记物基团可以根据照相技术进行显影步骤，例如，化学或光化学显影步骤。光敏介质可以是能够形成标记物基团，如金属核的任何固相支持体或任何受支持的材料。
优选地，光敏介质是光敏感介质，如光敏纸或者支持材料上的光敏乳剂或凝胶剂。更优选地，光敏介质是照相介质，如晒像纸。在例如照射光的波长和/或强度的条件下进行照射，在所述条件下在光敏基团存在下发生选择性标记物基团形成。优选地，取决于介质的灵敏性，用红外线和/或用长波可见光进行照射。对于可见光，照射波长可以为例如500nm或更高，520nm或更高，540nm或更高，560nm或更高，580nm或更高，或对于红外线，照射波长可以为700nm到10μm。
本发明的方法包括检测标记基团。标记基团可以优选选自形成金属沉积物的基团(例如，醛官能化基团)，荧光或形成荧光的基团，或者氧化还原活性基团。
金属沉积物的形成需要用金属化试剂处理醛基，所述金属化试剂为例如包含选自Ag、Au、Bi、Cu、Pd或Pt的金属原子和/或离子的试剂，所述金属原子和/或离子可以例如通过还原选择性沉积在醛基周围。优选地，金属化试剂包含Ag+盐，如Ag-铵络合物，即Tollens试剂。金属化试剂的进一步优选的实例是Cu(NO3)/I2、铂三联吡啶络合物，如[Pt(三联吡啶)Cl]Cl、Pd(OAc)2或KAuCl4。
可以根据已知的方法进行标记物基团的检测。例如，通过光学方法和/或电学方法可以定性和/或定量测定金属沉积物。在优选实施方案中，通过测量电学参数，例如，电导率来测定固相表面上的金属沉积物。通过已知的荧光测量方法，例如，通过合适的光源如激光激发并检测发生的荧光来定性和/或定量测定荧光标记物基团。
在另一实施方案中，本发明包括检测在光敏基团存在下在光敏介质中位点特异性形成的标记物基团。光敏基团优选选自荧光或发光基团。光敏介质包含这样的基团，其当在光敏基团存在下照射时形成可检测的标记物基团，如金属核，所述标记物基团可以根据标准照相技术，如通过化学或光化学显影技术进行显影。
此外，本发明涉及核酸或核酸类似物结构单元与经保护的炔基任选通过如式(I)所示的分子连接的缀合物。优选地，间隔体具有3-10个原子的链长。此外，优选间隔体包含内部刚性基团，例如，炔基。经保护的炔基优选为如上述的甲硅烷基保护的炔基。
此外，本发明涉及生物素或生物素衍生物如脱硫生物素或氨基生物素与叠氮基任选通过如式(II)所示的间隔体连接的缀合物。间隔体优选具有1-10个原子的链长。
此外，本发明涉及淬灭剂基团与核酸或核酸类似物结构单元任选通过如式(III)所示间隔体连接的缀合物。间隔体优选具有3-10个原子的链长并且可以包含内部刚性基团，如炔基。
此外，本发明涉及经保护的醛糖基或者经保护的或未保护的1，2二醇基与核酸或核酸类似物结构单元任选通过如式(IV)所示间隔体连接的缀合物，所述醛糖基中醛糖的羟基优选用酰基和/或甲硅烷基保护。酰基或甲硅烷基保护基优选如上述。
间隔体优选具有3-10个原子的链长并且优选包含刚性基团，例如，炔基。
本发明还涉及式(I)、式(II)、式(III)以及式(IV)的化合物。这些化合物尤其可用于标记核酸，尤其是DNA或RNA。使用这些化合物，一个、优选至少两个官能团与分子的连接是可能的。化合物尤其可用于DNA纯化，例如，使用生物素标记，用于DNA-微阵列，用于DNA-芯片，用于实时PCR以及用于RNAi实验和用于定位细胞中的DNA。
通过下面的实施例和附图进一步描述本发明。
附图简述
图1：用于DNA的合成后标记的经修饰的脱氧核糖核苷酸。
图2：通过点击化学的DNA官能化。
图3：通过顺序点击反应的DNA官能化。
图4：合成炔官能化的2’-脱氧尿苷三磷酸和亚磷酰胺。
图5：合成炔官能化的2’-脱氧胞苷三磷酸和两种亚磷酰胺。
图6：合成炔官能化的2’-脱氧鸟苷三磷酸。
图7：PAGE凝胶电泳(Vent exo-，0.5mM Mg2+，50mM TMAC)。泳道1：100bp DNA序列梯，泳道2：天然的289bp片段，泳道3：与2相同，所有胸苷都是经修饰的，泳道4：所有胸苷和胞苷都是经修饰的。
图8：对DNA的点击反应。
图9：反应顺序，产生共价连接到两个不同分子(R1-R2)的寡核苷酸。
图10：糖修饰的核苷酸结构单元。
图11：合成环状二醇官能化的尿苷三磷酸和亚磷酰胺。
图12：醛的NaIO4-去保护。
图13：炔修饰的胸苷和胞苷结构单元。
图14：叠氮化物结构单元。苄基叠氮35、香豆素叠氮36、生物素叠氮37、蒽醌叠氮38、半乳糖叠氮39、dabcyl叠氮40、芘叠氮41、荧光素叠氮42、TAMRA叠氮43、Cy3叠氮44。
图15：用dabcyl叠氮40和香豆素叠氮36修饰的寡核苷酸ODN-3的初步HPLC迹线(260nm)(表2，条目10)和MALDI谱(插图)。
图16：非核苷DNA修饰剂13和14。
图17：固相合成后通过顺序点击反应进行核酸官能化的图示。
图18：PCR后通过顺序点击反应进行核酸官能化的图示。
实施例
1.合成经修饰的核苷酸结构单元
可以以短而有效的反应顺序实现合成如图1中所示的作为三磷酸和作为亚磷酰胺的核苷酸结构单元1-5。根据标准方案可以在标准固相化学中使用这些亚磷酰胺进行DNA合成，只是对于经修饰的结构单元偶联时间延长。通过PCR掺入三磷酸在实施例6中描述。这些结构单元可以用于通过如图2所示的点击化学官能化报告分子，尤其DNA分子。如图3所示，可以通过顺序点击反应掺入不同的官能团。
2.合成携带炔手柄基团的2’-脱氧尿苷衍生物
炔官能化的2’-脱氧尿苷衍生物的合成在图4中图示。它用可商购的5-2’-脱氧碘代尿苷6开始。通过标准的保护-Sonogashira-去保护顺序，使用1-三甲基甲硅烷基-1，7-辛二烯在Sonogashira交叉偶联中导入容易官能化的接头，可以得到游离的、官能化的核苷8。使用标准方法可以得到亚磷酰胺9。通过Yoshikawa的磷酸化方法可以制备三磷酸10[7]。
3.合成携带炔或甲硅烷基保护的炔手柄基团的2’-脱氧胞苷衍生物
通过对未保护的和可商购的5-碘代-2’-脱氧胞苷进行Sonogashira交叉偶联可以制备容易官能化的、游离的核苷12。用铵处理可以除去TMS基团。以逐步方式制备N4-苯甲酰基保护的亚磷酰胺13。通过两步LudwigEckstein方法[8]制备三磷酸14。在Sonogashira交叉偶联后，通过简单地省略TMS去保护步骤得到带有TMS保护的炔的亚磷酰胺16。反应方案在图5中显示。通过类似方法，可以得到携带TIPS保护的炔基的亚磷酰胺。
4.合成携带炔手柄基团的2’-脱氧鸟苷衍生物
17的合成按照Froehler等人的合成方法[9]。Sonogashira交叉偶联、总体去保护和Yoshikawa方法的磷酸化[7]的标准反应顺序得到三磷酸18。反应方案在图6中显示。
5.合成携带炔手柄基团的2’-脱氧腺苷衍生物
经修饰的2’-脱氧腺苷衍生物4的合成与脱氧鸟苷衍生物的合成非常类似。它非常类似于Froehler等人的工作[9]。类似于鸟苷合成，成功地进行了Sonogashira交叉偶联。最后的步骤类似于对衍生物18所述的。
6.通过PCR掺入核苷三磷酸
通过引物延伸进行结构单元1和2向289mer DNA链的同时掺入。对于2的三磷酸实现了最佳的掺入效率。使用的聚合酶是来自B族的Vent exo-和Pwo。在高密度修饰的情况下，添加剂(DMSO、甲酰胺、TMAC、甜菜碱)的加入变得必须。通过PAGE凝胶电泳可以显示不同水平的炔修饰。图7中的泳道2-4显示了炔向DNA中增加掺入的效果。所观察到的偏移是由于DNA链的分子量的提高。
7.合成后官能化
如引言中概述的，合成后标记策略的主要优点是可能向DNA中引入不稳定的或反应性的部分。待附着到DNA的分子仅仅必须携带叠氮化物以便用于点击反应中。该方法是高度模块化的并且因此可以被改变而不需要精心合成。
点击反应已经成功地用于在高密度水平官能化DNA。接头具有足够柔性以允许甚至通过点击反应掺入六个连续的修饰，如在一行中带有六个炔修饰的碱基的短寡核苷酸修饰中所示。反应在水和氧的存在下进行并且不需要任何复杂的设备。Cu(I)是活性催化物并且可以通过配体稳定化。反应方案在图8中显示。
8.逐步官能化的策略
8.1一般考虑
使用上述方法可以制备用于合成后修饰的含有两个接头的DNA。通过PCR制备的DNA不连接到树脂并且在核碱基上不含有任何保护基并且可以以如图9中所示的直接方式官能化。
未保护的炔可以用R1-N3进行点击反应。TMS保护的炔在测试反应中显示出对标准点击反应条件的足够稳定性。TMS-炔基可以用TBAF去保护，从而释放游离炔。另一叠氮化物R2-N3然后可以在第二点击反应中连接到DNA。
通过固相亚磷酰胺化学制备的DNA附着到树脂并且在核碱基上携带碱基不稳定的保护基。使用H2O/MeOH中的氨可以将TMS-炔基去保护。然而，15中甲硅烷基的制备使用的去保护(图5)需要2-4天才完成。该显著的稳定性可以用于从树脂选择性切除DNA和/或去保护核碱基而不用去保护大量的经修饰的炔，例如，TMS-炔。原则上，有三种方法可以处理该问题，其将在下文中提出。
8.2特定方案
例如，使用Expedite DNA合成仪(Applied Biosystems)或在Amersham Biosciences的Oligopilot上，通过DMT-和β-(氰乙基)亚磷酰胺方法在CPG支持体(500
Figure G2007800405932D00172
)上制备寡核苷酸(ODN)。为偶联经修饰的碱基，使用双偶联方案(每个10当量)并且将偶联时间延长到10分钟。作为活化剂，苯甲基硫代四唑(BTT)得到最佳的偶联产率。自动化合成后，通过在25℃下浸入浓氨水/乙醇溶液(3∶1)中24小时从固相支持体切除ODN。在SpeedVac中除去氨水，并通过RP-HPLC纯化粗ODN。UV/Vis光谱和MALDI-TOF质谱法用于表征ODN。
9.树脂上的点击化学
9.1一般考虑
可以在树脂上进行点击化学[10]。在第一官能团R1附着到DNA时，使用氨可以在延长的时间内一步实现TMS-基团(核碱基保护基)的总体去保护和树脂的切除。此时，通过标准点击反应可以引入第二官能团R2。在该方法中，R1必须是碱基稳定的分子。
9.2特定方案
例如，DNA合成后在高真空下干燥CPG树脂上的约0.02μmol的DNA并将其与20μL苄基叠氮35一起置于1.5mL瓶中。在单独的瓶中，将40μL CuBr溶液(DMSO/t BuOH 3∶1中10mM)，10μL抗坏血酸钠(水中100mM)和80μL配体溶液(DMSO/tBuOH 3∶1中10mM)进行涡旋并加入到DNA中。将反应瓶轻轻旋转过夜，离心并且小心取出并丢弃溶液。通过加入溶剂(2×DMSO，2×H2O，2×乙醇)、涡旋、离心并丢弃该溶液反复洗涤树脂。随后如上述将DNA去保护。
10.第一点击反应前的总体DNA去保护
在第一点击反应前(氨，12h)可以对DNA核碱基去保护并从树脂切除所述链。TMS-炔对去保护条件的稳定性应该足够高以使其多数保持完整形式。必须进行HPLC纯化以除去含有去保护的TMS-炔位点的DNA。从这点向前，可以使用图9概述的合成。
11.从树脂单独切除
11.1一般考虑
从树脂切除DNA后，也可以不去除保护基而在溶液中进行点击化学反应。
DNA与树脂的连接在碱性条件下的稳定性低于核碱基保护基的稳定性。从而，可以通过用氨处理30分钟从树脂切除DNA。该处理后，将核碱基部分去保护，TMS-炔基应该保持几乎定量。必须将该复杂混合物进行点击反应，引入R1。此时，可以在长时间内用氨处理DNA，导致核碱基和TMS-炔的总体去保护。该步骤释放第二点击位点，其可以与R2-N3反应。
11.2具体方案
将DNA(0.38μM，200μL)和叠氮化物(10mM，114μL)置于1.5mL瓶中。在第二个瓶中，对17μL CuBr溶液(DMSO/t BuOH 3∶1中100mM)和34μL配体溶液(DMSO/tBuOH 3∶1中100mM)进行涡旋并加入DNA中。将该溶液在25℃摇动4h并在SpeedVac中蒸发至接近干燥。加入乙酸钠溶液(0.3M，100μL)并将悬浮液静置1h，偶尔涡旋。加入1mL乙醇，将瓶子涡旋并置于冰箱(-20℃)中过夜。离心(13000rpm 15分钟)后，从DNA沉淀小心地去除上清液。加入70％乙醇(-20℃)，涡旋小瓶，离心并除去上清液。重复该洗涤步骤两次。最后一次洗涤步骤后，将沉淀物风干并优选用水或缓冲液吸收。
11.3TIPS-炔基的去保护
将冻干的DNA溶于无水乙腈(400μL)和无水DMF(100μL)中。加入两滴TBAF(THF中1.0M)并将溶液在45℃摇动2h。用MeOTMS(10μL)淬灭过量的氟离子。如果将对DNA链进行额外的点击反应，那么应该如下将有机溶剂交换成水：在SpeedVac中蒸发反应液至接近干燥，加入水(1mL)，冷冻溶液，冻干，并用适量水吸收。
12.糖修饰的结构单元的合成
已经成功地将三磷酸22-26掺入DNA中。也已经合成了23的对应的亚磷酰胺并将其掺入DNA中。化合物26中的乙酰基保护的糖引起在聚丙烯酰胺凝胶中经修饰的DNA的有效染色，因为保护基在Tollens处理条件下被切除。丙酮化合物保护的糖24和25需要在酸性条件下去保护。初步实验表明乙缩醛保护基的切割是可行的，不引起DNA的脱嘌呤作用。
在下文中，详细给出了环状二醇修饰的核苷酸的示例性合成。
用环状二醇修饰的尿苷三磷酸31的合成用已知的化合物27开始[11]。关键步骤是吡咯啉双键的Sharpless邻位二羟基化。根据已知的方法，从中间体30可以合成亚磷酰胺32。
13.通过PCR掺入核苷三磷酸
通过PCR可以向DNA中掺入所有五种给出的核苷酸。核苷酸26甚至掺入到2000bp链中。迄今用核苷酸26得到的结果开启了任何目的基因的有效银染的方法。原则上，应该可能合成用末端二醇修饰的胞苷从而实现DNA中每个碱基对的醛官能化。
通过酶促合成(例如PCR)掺入三磷酸并且三元点击反应在图18中示例。使用的优选的聚合酶是来自B族的Vent exo-和Pwo。在高密度修饰的情况下，添加剂(DMSO、甲酰胺、TMAC和/或甜菜碱)的加入是优选的。通过PAGE凝胶电泳可以显示不同水平的炔修饰。
14.合成后官能化
如具有二醇修饰的尿嘧啶的DNA链的化学修饰所示，可以在温和条件下用NaIO4处理所得链，得到二醇部分的温和切割，而无任何可观察到的副反应。通过MALDI，以及通过用二硝基苯肼的清洁偶联反应(clean coupling reaction)，可以表征带有醛的链。已经进行了长的二醇修饰的DNA链的切割，并且消化研究已经表明切割与短寡核苷酸中一样有效地进行。在带有醛的DNA与含有肼的染料的偶联中已经得到了初步结果，证明了高碘酸切割的有效性。
对于含糖DNA链的情况，消化实验也表明向DNA的有效掺入。对于乙酰基保护的糖已经显示了有效银染。
也提出了新的二醇修饰的核苷酸以及新的糖修饰的核苷酸向DNA的直接掺入。这些三磷酸向DNA的直接掺入及其后接着进行温和的合成后去保护极大地简化了我们的研究组中开发的银染方法。与“点击-点击”化学组合，通过高碘酸盐切割对我们的经修饰的DNA的选择性醛修饰可以用于开发新的三元标记策略。
15.生物素叠氮的合成
活性酯与1-氨基-3-叠氮基丙烷反应形成生物素叠氮。
Figure G2007800405932D00201
16.用点击化学进行单、双和三DNA修饰
16.1导入两种不同的标记
16.1.1树脂上的双点击反应
第一种方法涉及为第一点击反应引入一个自由炔和用弱酸在树脂上去保护后为第二点击方法引入第二个TMS保护的炔。为了测试树脂上点击反应的可行性，我们制备了含有一个自由炔的测试链33并直接在树脂上进行点击反应，接着DNA去保护。官能化DNA链与相同系列的未处理的DNA链的HPLC迹线(trace)的比较显示了几乎定量转化，表明点击反应在用于DNA合成的可控孔度玻璃支持体上高效率地进行(数据未显示)。
为了引入两种标记，我们使用标准亚磷酰胺化学向寡核苷酸如ODN-1或ODN-2(表1)中掺入了胸苷和胞苷结构单元33和34a。两种亚磷酰胺的偶联产率是优秀的。在固相支持体上完全装配寡核苷酸后，干燥树脂并通过用CuBr、TBTA配体、抗坏血酸钠和苄基叠氮35的溶液摇动树脂进行第二点击反应。用1％乙酸洗涤并冲洗树脂以切割第二个炔上的TMS保护基。最后，使用dabcyl叠氮40与第一点击反应类似地再次进行第二点击反应。最后从树脂切除DNA并通过将树脂暴露于氨(H2O/EtOH 3∶1)除去所有保护基。发现所得的原始-MALDI谱与预期的双修饰寡核苷酸完全一致(表2，条目1)，表明可以在固相支持体上直接向DNA中引入稳定的标记。
16.1.2树脂上的单点击反应和组合切割/去保护
在一些情况下，优选在溶液中进行第二点击反应。用溶于水/乙醇的浓NH3处理单修饰的ODN-2(表1)从树脂切除了DNA。在这些条件下，也除去了碱基保护基和保护醛的TMS基团。所得的粗DNA带有一个clicked-on修饰和一个自由炔，将该DNA在溶液(CuBr，TBTA配体，叠氮化物)中进行第二点击反应，以优良的产率和纯度得到双修饰的DNA(表2，条目2)。
16.1.3溶液中的双点击反应
用带有两个炔的结构单元33和34b容易得到用两种碱基和亲核试剂敏感性分子修饰的寡核苷酸。使用标准固相亚磷酰胺化学方法将它们都掺入ODN-3(表1)中。脱保护并从树脂切除寡核苷酸后，进行第一点击反应(使用上述溶液条件)，产生单修饰的寡核苷酸，具有平均＞90％的高产率。在第二步中，我们用溶于乙腈/DMF(4∶1 v/v)中的TBAF溶液切割TIPS保护基，对带有一个标记的DNA链不引起任何损害。溶液中的第二点击反应在三步骤方法中以通常60-90％到优良产率产生双修饰的寡核苷酸。
为了研究双点击修饰的宽应用性，我们用整个系列的不同标记进行双点击，并且发现了对DNA的优良化学方法产率(表2，条目3-15)。值得一提的是各点击反应和去保护步骤如此干净使得在每个反应步骤后简单的乙醇沉淀就足够纯化。图15显示了典型的原始HPLC层析图和ODN-3的双修饰后得到的MALDI分析(插图)。对于非常灵敏的应用，推荐一次最终的HPLC纯化。在罕见情况下，如对于Cy3叠氮44，我们发现接头在很小程度上被切割。
16.2引入三种不同的标记
使用点击反应及其后通过乙醇沉淀，也可能用三种不同的标记修饰寡核苷酸。为此，我们向寡核苷酸如ODN-4中引入了三种结构单元33、34a和34b(表1)。直接在树脂上进行第一点击反应。随后在TMS基团的相伴切割下从支持体切除单修饰的寡核苷酸并通过HPLC纯化。在溶液中以高产率进行第二点击反应。乙醇沉淀双修饰的寡核苷酸，用TBAF切割TIPS基团并随后在溶液中进行第三点击反应提供了所希望的三重修饰的寡核苷酸，在最终的乙醇沉淀后产率为约50％(表2，条目16和17)。
16.3在非核苷酸结构单元上引入手柄基团
尽管非常希望在一些碱基(这里为dC和dT)上直接标记寡核苷酸，但是经常需要在核碱基外，例如在磷酸或糖上引入标记。为了允许容易引入标记，我们制备了带有炔的非核苷DNA修饰剂37和38(图16)。在DNA中使用这些结构单元的点击反应一样有效。
16.4结论
总之，我们报导了DNA的高效的、模块化的和稳健的多官能化方案。该方法的效率是基于三个特征：1.在DNA去保护中的氨处理期间定量去除了TMS保护的炔。2.在该氨处理期间定量保留了TIPS保护的炔。3.可以有效而温和地实现TIPS保护的炔的切除。带有经保护的炔的三磷酸的合成允许我们以逐步的方式标记PCR片段。该方法极大地扩宽了我们对于分子生物学诊断和纳米技术应用所需的操作DNA的能力。此外，多个经修饰的DNA链的文库的组合合成得到新的适体。
表1.用于该研究中的ODN[a]
[a]X＝基于1的DNA核苷酸，Y＝基于34a的DNA核苷酸，Z＝基于34b的DNA核苷酸。
表2.ODN 1-4的合成后标记
Figure G2007800405932D00231
[a]最后一次点击反应后通过260nm处初步HPLC的积分确定，[b]从树脂切割后无HPLC纯化。因此，产率包括来自DNA合成的杂质，[c]树脂上点击后HPLC纯化。*在树脂上进行的点击反应。
17.用于DNA(和RNA)中三元点击反应的结构单元
核糖核苷酸的合成遵循脱氧核糖系列的相同方法。所有炔可以作为自由炔、作为TMS保护的炔或者作为TIPS保护的炔产生。这得到了12种脱氧核糖核苷酸-亚磷酰胺和12中脱氧核糖核苷酸-三磷酸(每种核碱基3种不同的炔)和其他24种核糖核苷酸系列。此外，也可以得到6种末端炔亚磷酰胺。
方案1：用于DNA的合成后标记的经修饰的脱氧核糖核苷酸(或核糖核苷酸)和末端炔。
核苷酸结构单元作为三磷酸和作为亚磷酰胺的合成可以在短的和有效的反应顺序中实现。在下面报告这些合成的一些实例。
带有末端炔的尿苷衍生物的合成
Figure G2007800405932D00251
方案2：合成炔官能化的尿苷三磷酸和亚磷酰胺
炔官能化的尿苷衍生物的合成用可商购的5-碘代尿苷7开始。通过标准的保护-Sonogashira-去保护顺序，使用1-三甲基甲硅烷基-1，7-辛二炔在Sonogashira交叉偶联中导入容易官能化的接头可以得到官能化的核苷9。使用标准方法可以得到亚磷酰胺10。通过Yoshikawa的磷酸化方法可以制备三磷酸11。
合成带有末端炔和甲硅烷基保护的炔的胞苷衍生物
方案3：合成炔官能化的胞苷三磷酸和两种亚磷酰胺
通过对未保护的和可商购的5-碘代胞苷进行Sonogashira交叉偶联可以制备容易官能化的游离的核苷13。通过用氨处理可以除去TMS基团。以逐步的方式制备N4-苯甲酰基保护的亚磷酰胺14。通过两步Ludwig-Eckstein方法制备三磷酸15。在Sonogashira1交叉偶联后通过简单地省略TMS去保护步骤得到带有TMS保护的炔的亚磷酰胺17。
合成带有末端炔的鸟苷和腺苷衍生物
方案4：合成炔官能化的鸟苷和腺苷三磷酸
18的合成按照Froehler等人的合成方法。Sonogashira交叉偶联、总体去保护和Yoshikawa方法的磷酸化的标准反应顺序产生了三磷酸19。经修饰的腺苷衍生物4的合成与鸟苷衍生物的合成非常类似并且仍然在发展中。其非常类似于Froehler等人的工作。已经类似于鸟苷合成成功地进行了Sonogashira交叉偶联。最终的步骤类似于为鸟苷衍生物19所述的。
在标准固相化学中使用这些经修饰的亚磷酰胺的DNA(或RNA)合成是直接的，只是对于经修饰的结构单元延长了偶联时间。
使用三种不同的炔以便实现三元点击反应：一种游离的炔，一种TMS保护的炔和一种TIPS保护的炔。第一点击反应仍然在树脂存在下进行(用于自动化合成的固相支持体)。从树脂的标准DNA(或RNA)切除后(其也除去了TMS基团)，使用标准点击方案实现了第二点击反应。对TIPS基团的最后的TBAF(四丁基氟化铵)去保护后，进行第三次点击反应(方案4)。
18.作为叠氮化物修饰商业IR-染料的实例
IR-染料可以容易地转化为它们的叠氮化物衍生物。下面的方案显示了来自许多其他可能的合成中的两种不同的合成路径。
在第一次情况下，接头通过Sonogashira偶联附着到该染料。
下面的甲磺酸化和叠氮化产生了可用于DNA中的点击反应的叠氮化物。
在第二次合成中，直接在染料核心上产生叠氮化物(方案2)。
Figure G2007800405932D00291
IR染料叠氮化物可以用于DNA照相中作为被设计和开发用于通过红外线感光的相纸的光敏剂。此类纸可以在正常光条件下处理，消除了对暗室的限制。
参考文献
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Claims (34)

1.产生包含至少两种不同官能团的报告分子的方法，其中至少一个第一和至少一个第二手柄基团掺入到报告分子中，其中手柄基团选自炔基、经保护的炔基、叠氮基、醛基、经保护的醛基、肼基或者羟胺基，并且其中第一和第二手柄基团是不同的并且其中第一和第二手柄基团选择性偶联到包含不同的第一和第二官能团的第一和第二反应配偶体。
2.产生包含至少两种不同官能团的报告分子的方法，其包括
(a)从多个结构单元合成报告分子，其中至少一个结构单元包含选自炔基、经保护的炔基、叠氮基、醛基、经保护的醛基、肼基或者羟胺基的第一手柄基团，其中至少一个结构单元包含选自炔基、经保护的炔基、叠氮基、醛基、经保护的醛基、肼基或者羟胺基的第二手柄基团，并且其中第一手柄基团不同于第二手柄基团；
(b)在其中第一手柄基团是反应性并且第二手柄基团不是反应性的条件下将第一种反应配偶体与第一手柄基团偶联，其中第一反应配偶体包含第一官能团，并随后
(c)将第二反应配偶体与第二手柄基团偶联，其中第二反应配偶体包含第二官能团并且其中第一官能团不同于第二官能团。
3.权利要求1或2的方法，其中所述报告分子选自肽、核酸和核酸类似物。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述报告分子包含多至2000，优选4-200，更优选10-100个结构单元。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述官能团选自标记基团，如染料、淬灭基团和附着基团，如生物素、生物素衍生物和半抗原。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中第一和第二官能团是标记基团和淬灭基团或者其中第一和第二官能团是标记基团和附着基团。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中手柄基团选自炔基和经保护的炔基。
8.权利要求7的方法，其中包含叠氮基的反应配偶体通过点击反应偶联到炔基。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中第一和第二手柄基团是炔基和经保护的炔基或者其中第一和第二手柄基团是第一经保护的炔基和第二经保护的炔基。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中在第一手柄基团为未保护并且第二手柄基团为经保护的条件下，第一种反应配偶体偶联到第一手柄基团。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中至少三种手柄基团掺入到报告分子中。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中第一手柄基团是炔基并且第二和第三手柄基团是携带不同保护基的经保护的炔基。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中报告分子的合成是化学合成，优选化学固相合成，其中在结合固相的情况下通过结构单元的逐步装配合成报告分子。
14.权利要求13的方法，其中至少第一反应配偶体是偶联的而报告分子结合至固相。
15.权利要求13的方法，其中在报告分子从固相切除后，第一反应配偶体被偶联。
16.权利要求1-12任一项的方法，其中合成是报告分子合成，其中报告分子从核苷三磷酸结构单元合成。
17.检测样品中分析物的方法，其包括步骤：
(a)提供样品；
(b)将样品与报告分子接触，该报告分子包含至少两种不同的官能团，其中所述官能团通过包含1，2，3-三唑环的接头基团结合至报告分子，
(c)检测报告分子与分析物的相互作用，其表明样品中分析物的存在和/或量。
18.权利要求17的方法，其中分析物是核酸或者核酸切割或结合蛋白。
19.权利要求17或18任一项的方法，其中报告分子与分析物的相互作用是结合，优选杂交。
20.权利要求12-19任一项的方法，其中报告分子是核酸或核酸类似物，优选分子信标。
21.报告分子，其包含至少两种不同的官能团，其中所述官能团通过包含1，2，3-三唑环的接头基团结合至该报告分子。
22.权利要求21的报告分子，其是核酸或核酸类似物，优选分子信标。
23.式(I)的化合物
C-S-N
其中C是经保护的炔基，
S是间隔体或键，并且
N是核酸或核酸类似物结构单元，如核苷或核苷酸或非核苷化合物。
24.式(V)的非核苷化合物
Figure A2007800405930004C1
其中
A是经保护或未保护的炔基，
S1和S2在每种情况下独立地为非核苷基团，例如，间隔体或键，
P是磷酸或磷酸类似物基团，并且
R是用于核酸合成的偶联基团。
25.权利要求24的化合物，其中S1是间隔体并且S2是共价键。
26.权利要求23-25任一项的化合物，其中间隔体具有3到10个原子的链长。
27.权利要求23-26任一项的化合物，其中间隔体包含炔基。
28.权利要求23-27任一项的化合物，其中经保护的炔基是甲硅烷基保护的炔基。
29.权利要求28的化合物，其中甲硅烷基是三(烷基/芳基)甲硅烷基，如三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基或叔丁基-二甲基甲硅烷基或环状桥接的甲硅烷基。
30.式(II)的化合物
B-S-N3
其中B是生物素或生物素衍生物，如脱硫生物素或氨基生物素，
S是间隔体或键，并且
N3是叠氮基。
31.式(III)的化合物
Q-S-N3
其中Q是淬灭基团，
S是间隔体或键，并且
N3是叠氮基。
32.式(IV)的化合物
Z-S-N
其中Z是醛糖基，其中羟基用酰基和/或甲硅烷基保护，或者经保护或未保护的1，2二醇基，
S是间隔体或键，并且
N是核酸或核酸类似物结构单元，如核苷或核苷酸化合物。
33.权利要求32的化合物，其中酰基选自乙酰基、丁酰基或新戊酰基。
34.式(V)的化合物
D-S-N
其中D是红外(IR)染料，
S是间隔体或键，并且
N是叠氮基。
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