JP2003334097A - リアルタイム核酸検出法と組成物 - Google Patents

リアルタイム核酸検出法と組成物

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、リアルタイム核酸検出法で使用す
るための組成物を提供する。 【解決手段】 そのようなリアルタイム核酸検出法は、
核酸プライマー、ヌクレオチド、核酸プローブ、または
核酸結合物質に結合した、エネルギー移動要素を用いて
行われる。リアルタイム核酸検出は、試料中の目的の１
本鎖または２本鎖核酸の定性的または定量的検出または
測定を可能にする。ホモポリマー配列の一部（例えば、
ポリＡ配列またはテイル）を、アナライトまたはアナラ
イトのライブラリーから除去する方法を含む他の方法が
提供される。そのような除去法を実施するのに有用な組
成物も、記載され提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、核酸技術の分野に
関する。さらに詳しくは本発明は、核酸プライマーまた
は構築体を含む組成物、および核酸測定、分析、および
リアルタイム核酸検出法におけるその使用に関する。本
発明に関する分野の技術の現状をより詳細に説明するた
めに、本出願で引用または特定される特許、特許出願、
特許刊行物、科学論文などは、参照することによりその
全体が本明細書に組み込まれる。 【０００２】（関連出願の相互参照）本出願は、標題
「標識試薬と標識された標的、標的標識法、および核酸
の測定と分析におけるこれらの使用のための他の方法」
でラッバニ（Rabbani）らにより２００２年３月１２日
に、同時出願された米国特許出願第１０／０９６，０７
５号に関する。前記の第１０／０９６，０７５号の内容
は、参照することによりその全体が本明細書に組み込ま
れる。 【０００３】 【従来の技術】（発明の背景）構成のために、背景は以
下の７つの部分に分割されている。 （１）標識試薬の反応性基 （２）標識物を標的に連結するためのリンカーアーム （３）標識物としてのポルフィリン蛍光色素 （４）蛍光性の改変 （５）蛍光性インターカレーター （６）化学発光 （６）蛍光によるリアルタイム検出 （７）アナライト中のプライマー結合配列 【０００４】（１）標識試薬の反応性基 生化学と分子生物学における非放射性標識物の使用は、
近年指数的に増加した。非放射性標識物として使用され
た種々の化合物のうちで、蛍光又は発光シグナルを生成
する芳香族色素が特に有用である。このような化合物の
重要な例には、フルオレセイン、ローダミン、クマリン
およびシアニン色素（例えば、Ｃｙ３とＣｙ５）があ
る。複合色素もまた、２つの異なる色素を融合して合成
されている（リー（Lee）ら、(1992) Nucleic Acids Re
s. 20:2471-2488；リー（Lee）ら、米国特許第５，９４
５，５２６号、およびワッゴナー（Waggoner）ら、米国
特許第６，００８，３７３号、これらのすべては、参照
することにより本明細書に組み込まれる）。 【０００５】非放射性標識法はまず、シグナル生成基を
タンパク質に結合させるために開発された。これは、標
識物がタンパク質上に天然に存在するアミン、チオー
ル、およびヒドロキシル基と反応できるように、化学基
で修飾することにより行われた。この目的に使用された
反応性基の例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テルのような活性化エステル、イソチオシアネート、お
よび他の化合物がある。従って、ヌクレオチドや核酸を
非放射性手段で標識することが必要になった時、ヌクレ
オチドやポリヌクレオチドを、官能基がタンパク質と類
似するような形に変換する方法が開発された。例えば、
米国特許第４，７１１，９５５号（参照することにより
本明細書に組み込まれる）は、プリンの８位、ピリミジ
ンの５位、およびデアザプリンの７位への、アミンの添
加を開示した。これで、タンパク質のアミン基に標識物
を添加できる同じ方法を、これらの修飾ヌクレオチドの
ために応用できるであろう。 【０００６】蛍光標識物として使用される化合物の中で
は、シアニンに基づく色素が、大きい吸光係数と狭い発
光バンドを有するため広く使用されるようになった。さ
らに、これらの化合物が光を吸収し蛍光を発する特定の
波長を改変できるように、その構造を修飾することがで
きる。シアニン色素は、一連の結合体形成した２重結合
により結合した２つのインドレニンに基づく環を含む一
般的構造を有する。この色素は、２つの環構造を連結す
る中央の２重結合の数（ｎ）により分類される；ｎ＝１
の時は、モノカルボシアニンまたはトリメチンカルボシ
アニン；ｎ＝２の時は、ジカルボシアニンまたはペンタ
メチンカルボシアニン；そしてｎ＝３の時は、トリカル
ボシアニンまたはヘプタメチンカルボシアニン。シアニ
ン色素のスペクトル特性は、特定の経験則に従うことが
観察されている。例えば、環の間の各追加の結合体形成
２重結合は、吸収極大と発光極大を約１００nm上昇させ
るであろう。すなわち、ｎ＝１を有する化合物の吸収極
大が約５５０nmである時、ｎ＝２またはｎ＝３を有する
同等の化合物は、それぞれ６５０nmと７５０nmの吸収極
大を有するであろう。分子の横に芳香族基を追加する
と、１５nm長い波長に吸収を移動させることができる。
インドレニン環を含む基は、吸収と発光特性に寄与す
る。基準点としてジエム（gem）−ジメチル基を用いて
得られる値を使用すると、ジエム−ジメチル基の代わり
に環中に代用された酸素は、吸収と発光極大を約５０nm
低下させる。これに対してイオウの代用は、吸収と発光
極大を約２５nm上昇させる。アルキル、アルキル−スル
ホン酸およびアルキル−カルボン酸のような芳香族環上
のＲ基は、シアニン色素の吸収と発光極大にほとんど影
響を与えない（米国特許第６，１１０，６３０号）。 【０００７】官能基を含有するアームを用いて合成され
たシアニン色素は、タンパク質上のスルフヒドリル基と
反応するヨードアセトアミド、イソチオシアネート、お
よびスクシンイミジルエステルを用いて調製されている
（エルンスト（Ernst）ら、(1980), Cytometry 10, 3-1
0；ムジュンダー（Mujumdar）ら、(1989), Cytometry1
0, 11-19；サウスウィック（Southwick）ら、(1990), C
ytometry 11, 4187-430）。インドレニン環のフェニル
部分上にスルホネート基を含有するする新しい一連の修
飾色素が調製され（ムジュンダー（Mujumdar）ら、(198
9), Bioconjugate Chemistry 4, 105-111、参照するこ
とにより本明細書に組み込まれる）、これは、色素の水
溶性を上昇させた。これらの色素を炭酸ジスクシンイミ
ジルで処理して活性化してスクシンイミジルエステルを
形成させ、次にこれを使用して、アミン基で置換してタ
ンパク質を標識した。以来、他の活性化基がシアニン色
素上に置かれている。米国特許第５，６２７，０２７号
と米国特許第５，２６８，４８６号（参照することによ
り本明細書に組み込まれる）では、イソチオシアネー
ト、イソシアネート、モノクロロトリアジン、ジクロロ
トリアジン、モノもしくはジハロゲン置換ピリジン、モ
ノもしくはジハロゲン置換ジアジン、アジリジン、ハロ
ゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミドエ
ステル、イミドエステル、グリオキザル基およびアルデ
ヒド基、および他の基を含むシアニン色素が調製された
（これらはすべては、標的分子上のアミン、チオール、
またはヒドロキシル基と共有結合を形成することができ
る）。 【０００８】米国特許第６，１１０，６３０号（参照す
ることにより本明細書に組み込まれる）では、シアニン
色素は、Ｎ−ヒドロキシナフタリミドから得られる一連
の反応性基を用いて調製された。これらの基には、ヒド
ロキシスクシンイミド、パラ−ニトロフェノール、Ｎ−
ヒドロキシフタリミド、およびＮ−ヒドロキシナフタリ
ミドがあり、これらはすべて、一級アミンで修飾された
ヌクレオチドと反応することができる。前記と同じ化学
反応はまた、米国特許第６，１１４，３５０号（参照す
ることにより本明細書に組み込まれる）で記載されてい
るが、成分は逆転している。この開示では、シアニン色
素は、アミン、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基で
修飾され、標的分子は、適当な反応性基を含むように修
飾された。 【０００９】反応性官能基を含むアームを含有するシア
ニン色素は、一般的スキームにより調製されており、こ
こでは、２つのインドレニン構造と介在する不飽和鎖を
含む全複素環化合物をまず合成し、次に、色素をタンパ
ク質または核酸に連結するのに必要な末端反応性基また
は他の官能基を、全ダイマー色素単位の完了後、付加し
た。 【００１０】（２）標的に標識物を連結するためのリン
カーアーム 標識ヌクレオチドは、ターミナルトランスフェラーゼ標
識、ニック（nick）トランスレーション法、ランダムプ
ライミング、逆転写、ＲＮＡ転写、およびプライマー伸
長を含む多くの酵素法で、ＤＮＡとＲＮＡのプローブの
合成のために使用されている。これらのヌクレオチドの
標識ホスホラミダイト（phosphoramidite）物も、標識
オリゴヌクレオチドを調製するために自動合成機と共に
用いられている。生じる標識プローブは、ノーザンブロ
ッティング、サザンブロッティング、インサイチュー
（in situ）ハイブリダイゼーション、ＲＮＡｓｅ保護
分析、ＤＮＡ配列決定反応、ＤＮＡおよびＲＮＡマイク
ロアレイ分析、および染色体染色のような標準的方法で
広く使用される。 【００１１】核酸の化学的修飾について膨大な文献があ
り、これらを利用して、シグナル残基が、核酸に直接あ
るいは間接的に付加される。この技術の主要な懸念は、
核酸中のどの部位（すなわち、糖、塩基またはリン酸類
似体）が結合に使用され、これらの部位が破壊的または
非破壊的であるか（例えば、米国特許第４，７１１，９
５５号および米国特許第５，２４１，０６０号を参照；
いずれも参照することにより本明細書に組み込まれ
る）、核酸と反応性基またはシグナル伝達残基とスペー
サーの末端の反応性基（例えば、シグナル伝達残基への
結合を可能にするＯＨ、ＮＨ、ＳＨまたは他の基）との
距離を提供するための、反応性基またはシグナル伝達残
基への、通常、単一の芳香族基（米国特許第４，９５
２，６８５号および５，０１３，８３１号、いずれも参
照することにより本明細書に組み込まれる）または炭素
／炭素脂肪族鎖からなるスペーサー基の連結を可能にす
る結合部位の化学、およびシグナル伝達残基の性質に関
する。 【００１２】 【発明が解決しようとする課題】前記はすべて、修飾ヌ
クレオチドまたはポリヌクレオチドの合成に関する種々
の態様の説明であるが、これらはまた、生じるヌクレオ
チドおよびポリヌクレオチドの性質に関して重要な因子
であることが証明されている。実際、現状で記載されて
いる修飾ヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドと比較し
て欠点を有するという多くの証拠がある。 【００１３】例えば、これらの因子は、ポリメラーゼに
より取り込まれるからの修飾ヌクレオチドの能力に大き
な影響を有する。この結果は、特定のヌクレオチドの唯
一の供給源として修飾塩基を使用すると、非修飾ヌクレ
オチドを用いる反応と比較して、核酸合成の量の喪失が
あるかも知れないということである。その結果、修飾ヌ
クレオチドは通常、あるヌクレオチドの修飾および非修
飾物の混合物の一部として使用される。これは、修飾ヌ
クレオチドの無い反応に匹敵するレベルまで、合成を回
復するが、ヌクレオチドの修飾物の使用に対して、しば
しば偏見が見られる。そのため、修飾／非修飾ヌクレオ
チドの最終比率は、試薬の比率よりはるかに低いかも知
れない。次にユーザーは、わずかに標識された核酸を使
用するかまたは収率の低い核酸を使用する選択肢があ
る。塩基に結合したリンカーアームのみを含む同等の修
飾ヌクレオチド（アリルアミンｄＵＴＰ）が使用される
時、取り込みの困難さはめったに見られない。そのた
め、前記の問題は、合成が起きている標識物とポリメラ
ーゼまたは活性部位との相互作用による可能性がある。 【００１４】ポリメラーゼの使用における困難さは、オ
リゴヌクレオチド合成機を使用することにより避けるこ
とができ、ここで、ヌクレオチドのホスホラミダイト誘
導体のきちんとした化学結合を使用して、目的の標識核
酸を産生することができる。しかし、修飾ヌクレオチド
上のシグナル物質の存在は、この系では問題となり得
る。例えば修飾ヌクレオチドのホスホラミダイトは、鎖
が伸長されるとともに、結合効率の喪失が起きることが
ある。これ自体が問題かも知れないが、修飾ヌクレオチ
ドの頻回の特に連続的な使用により、生成物の劇的な累
積的喪失が起きることがある。さらに、化学合成自体が
いつも適切な答えではない。標識核酸が、合成機に実用
的な長さ以上に長いことが必要な場合がある。また合成
法の本質的な部分は、核酸の分かれた配列に必須であ
る。多くの目的のために、核酸のプールまたはライブラ
リーは、合成アプローチのために、非現実的に多くの数
の異なる分子種が必要である。 【００１５】標識オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレ
オチドの収率を上昇させる方法の一例は、ポリメラーゼ
またはオリゴヌクレオチド合成機による合成で、アリル
アミン修飾類似体のような非妨害基を使用することであ
る。次に、化学反応性アリルアミン残基を介して、所望
の基を合成後に結合させることにより、標識が行われ
る。しかしこの場合、取り込みまたは結合効率は回復さ
れるかも知れないが、アルリアミンへの所望の基の結合
効率の問題があるかも知れない。例えば、核酸中のアリ
ルアミン残基への標識物の結合は、１本鎖標的と比較し
て２本鎖ＤＮＡでは劇的に低い。収率の問題の可能性以
外に、これが塩基にどのように結合するかにより、修飾
官能基が影響を受けることがある。例えばハプテンが塩
基に結合するなら、ハプテンを塩基から分離するアーム
の性質が、結合パートナー候補の近づき安さに影響を与
えるかも知れない。シグナル生成残基が塩基を介して結
合する時、アームの性質はまた、シグナル生成残基と、
ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドとの相互作用に影
響を与えるかも知れない。 【００１６】これらの有害な相互作用を制限しようとす
る試みが、いくつかの方法で行われている。例えば、塩
基へのアームの結合は、２重結合アルケン基（米国特許
第４，７１１，９５５号）または３重結合アルキン基
（米国特許第５，０４７，５１９号）を介して行われ、
こうしてヌクレオチドまたはポリヌクレオチドから離れ
る方向へのリンカーの指向性が誘導される。しかし、こ
のアプローチでは、その剛性が、塩基へのリンカーの結
合の近傍に限定されるため、有用性が限定される。さら
に、スペーサー基を延長することによりヌクレオチドま
たはポリヌクレオチドからの活性基またはシグナル基の
分離を、アームにさせるようにして、相互作用を制限す
る試みが行われている。例えば、ある市販の修飾ヌクレ
オチドは、シグナル生成に使用される塩基とビオチン残
基の間で、７つの炭素の脂肪族鎖（カタログ番号４２７
２４、エンゾーバイオケム（ENZO Biochem, Inc.）、ニ
ューヨーク、ニューヨーク州）を有した。この生成物
は、１１個または１６個の炭素長のリンカーを代用する
ことにより、さらに改善された（カタログ番号４２７２
２と４２７２３、これらも、エンゾーバイオケム（ENZO
Biochem, Inc.）、ニューヨーク、ニューヨーク州から
入手できる）。また、異なる長さのリンカーアームとシ
アニン色素標識ヌクレオチドを使用して、比較が行われ
た（ズー（Zhu）ら、1994, Nucl Acid Res. 22:3418-34
22）。長さを１０から１７へ、および１７から２４へ延
長すると、効率の直接の改善が認められた。しかし、最
も長いリンカーでさえ、効率の点で、蛍光マーカーの存
在の補償は不完全であった。これは、このスペーサーセ
グメントに使用される脂肪族炭素鎖の可撓性により、コ
ンフォメーション中にレポーター基がめったに見られ
ず、ここで、これらは、ヌクレオチド自体からは完全に
遠くに延長されている、という事実の結果かも知れな
い。すなわち、このアプローチは、リンカーの長さを変
化させたが、これはスペーサーの可撓性の変化ではなか
った。 【００１７】この問題を回避するために、カーン（Kha
n）らの米国特許第５，９４８，６４８号は、マーカー
をヌクレオチドに連結する複数のアルキン基または芳香
族基の使用を開示した。しかしこの方法は、リンカーと
マーカーとの相互作用を誘導し得るリンカー中で、極性
の非常に低い基を使用しており、これが、結合効率を低
下させることにより、またはこれらの基を含む標識物化
合物による非特異結合を上昇させることにより、その有
効性を制限しているかも知れない。さらに、これらの基
は、標識化合物または標識化合物を作成するのに使用さ
れる種々の中間体の水溶性を低下させるかも知れない。 【００１８】前記特徴を取り込んだ活性化または標識ヌ
クレオチドの使用において継続している困難さは、先行
技術の方法において、塩基、オリゴヌクレオチドまたは
ポリヌクレオチド、およびアームの末端の残基との間
に、有害な相互作用が発生するを証明している。前記
は、核酸の結合に関して説明されたが、これらの問題
は、マーカーまたは標識物を結合することが有用である
他の基でも同様である。 【００１９】（３）標識物としてのポルフィリン蛍光色
素 蛍光標識されたプローブを使用する測定法は、ある特定
の波長での照射と別の波長での発光の検出（ストークス
シフト（the Stokes shift））に依存する。そのような
測定法に適した種々の吸収／発光スペクトル特性を有す
る種々の化合物について、広範な文献がある。比較発現
分析のために蛍光化合物が使用される時、各標識物につ
いて同時にシグナル検出を行う能力は、標識物間の差が
どれだけ大きいかに依存する。すなわち、Ｃｙ３やＣｙ
５のような蛍光物質は、それぞれ５７０と６６７に発光
ピークを有するため、発現分析に一般的に使用されてい
る。この分析のために有効に使用されていない１つのク
ラスの化合物は、ポルフィリンである。 【００２０】光エネルギーを吸収しそれを効率的に放出
するポルフィリンの能力は、多くの他の系で使用されて
いる。例えば、光誘導性の核酸の切断は、溶液中で遊離
しているかまたは配列特異的オリゴヌクレオチドに結合
した多くの金属ポルフィリンにより行われる（ドアン
（Doan）ら、(1986) Biochemistry 26:6736-6739）。こ
の系の１つの応用は、金属ポルフィリンの吸収後の、光
誘導性ＤＮＡ傷害による癌細胞のターゲティングと死滅
である（モアン（Moan）ら、(1986) Photochemistry an
d Photobiology 43:681-690）。金属ポルフィリンの高
エネルギー能の別の例は、非酵素的化学発光について触
媒性物質として使用されるその使用で見られる（フォー
ギオン（Forgione）ら、米国特許第４，３７５，９７２
号）。さらに、ポルフィリンが標識試薬として使用され
ている場合があり、例えばロエラント（Roelant）ら、
米国特許第６，００１，５７３号とヘンドリックス（He
ndrix）、米国特許第５，４６４，７４１号（参照する
ことにより本明細書に組み込まれる）があり、ここで、
Ｐｄオクタエチルポルフィリンは、イソチオシアネート
に変換され、特に免疫測定法で使用するための標識試薬
として使用された。しかしこれらの場合に、もっぱら金
属ポルフィリンが使用された。 【００２１】金属ポルフィリンの使用の欠点は、この化
合物の破壊性能力は、アナライトまたはプローブの核酸
鎖の完全性の維持を必要とするアレイ分析または他の測
定系で使用される時、逆効果であることである。従っ
て、その核酸破壊性を排除しながら、蛍光および化学発
光性のためにポルフィリンを利用できるなら、非常に有
利であろう。 【００２２】（４）蛍光性の変化 先行技術において、フェニルアセチレン基のアントラセ
ンへの付加が、発光極大を７２nm上昇させることが証明
されている（モールディング（Maulding）とロバーツ
（Roberts）、1968 J Org Chem）。さらに、ストークス
シフト（吸収極大と発光極大の差）もまた、アントラセ
ン色素へのフェニルアセチレン基の付加により上昇し
た。具体的には、２つのフェニルアセチレン基の付加後
に、６nmの差が３１nmに上昇した。フェニルアセチレン
基をナフタセンに付加すると、吸収極大と発光極大の差
は、７nmから３２nmに上昇した。さらに、アントラセン
とナフタセンの量子収率は、これらにフェニルアセチレ
ン基を付加することにより、有意に上昇した。 【００２３】これらの置換基の付加に使用される化学と
反応は、ケトンまたはアルデヒド基を必要とするため、
この作用の応用はこれらの化合物に限定される。また、
不飽和基を色素に付加すると、水溶液中の溶解度を低下
させる可能性があるという好ましくない作用がある。さ
らに、モールディング（Maulding）とロバーツ（Robert
s）が記載した修飾されたアントラセン色素は、結合に
使用可能な反応性基が欠如していた。 【００２４】（５）蛍光性インターカレーター（fluore
scent intercalators） 挿入結合性色素（intercalating dyes）は、電気泳動ゲ
ル中のＤＮＡの検出、インサイチューハイブリダイゼー
ション、フローサイトメトリー、および増幅のリアルタ
イム検出を含む多くの方法で、ＤＮＡの検出と視覚化の
ために使用されている。一般的に使用されてきた長い歴
史のある挿入結合性色素は、臭化エチジウムである。臭
化エチジウムは、核酸に対する高親和性と、結合後に蛍
光が上昇するという有用な性質を示す。蛍光のこの増強
は、１本鎖核酸と２本鎖核酸の両方で起き、２本鎖ＤＮ
Ａがはるかに顕著な作用（一般に約３０倍）を示す。核
酸に結合すると蛍光シグナルの上昇を示す他の色素が、
近年開発されており、アクリジンオレンジ、ＳＹＢＲグ
リーン、およびピコグリーンなどの化合物がある。しか
し、特にリアルタイム増幅のような方法で使用するため
に、核酸との結合または挿入結合後のシグナル生成の上
昇に対する、継続したニーズが存在する。 【００２５】（６）化学発光 シグナル検出のための化学発光試薬は、近年、広く使用
されるようになった。１，２−ジオキセタンとルミノー
ルを含む、発光シグナルを生成することができるいくつ
かの異なるクラスの化合物がある。１，２−ジオキセタ
ンは、２つの隣接酸素を含有する４員環である。これら
の化合物のいくつかの型は、非常に不安定であり、分解
すると発光する。一方、アダマンチル基の存在により、
半減期が数年という非常に安定な型となることができる
（ウィエリンガ（Wieringa）ら（1972）Tetrahedron Le
tters 169-172、参照することにより本明細書に組み込
まれる）。安定な型の１，２−ジオキセタンを酵素結合
測定法において基質として使用することができ、ここ
で、酵素の存在が、基質を不安定な型に変換し、こうし
て、シグナル生成のために化学発光を使用する。酵素切
断の基質である追加の基を用いて、アダマンチルジオキ
セタンが合成された、化学発光シグナルの酵素的誘導が
記載されている（米国特許第５，７０７，５５９号、シ
ャープ（Shaap）ら（1987）Tetrahedron Letters 28:93
5-938；シャープ（Shaap）ら（1987）Tetrahedron Lett
ers 28:1159-1163、これらのすべては、参照することに
より本明細書に組み込まれる）。適切な酵素の存在下で
は、切断が起き、不安定な化合物が形成され、これは分
解すると発光する。 【００２６】この方法のためのジオキセタン誘導体の一
般的な設計は、保護基を含有するヒドロキシル置換基を
有するアリール基の結合である。適切な酵素による保護
基の除去は、陰性荷電した酸素を与える。この中間体は
不安定であり、化合物は分解され、発光する。保護基の
性質により異なる酵素により活性化することができる種
々の１，２−ジオキセタン誘導体が、開発されている。
この目的に有用な可能性のあるとされている酵素には、
特に、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、グ
ルコシダーゼ、エステラーゼ、トリプシン、リパーゼ、
およびホスホリパーゼがある（例えば、米国特許第４，
９７８，６１４号を参照、参照することにより本明細書
に組み込まれる）。 【００２７】この基礎的な方法の変法も開示されてい
る。例えばウルデア（Urdea）は、シグナルを生成する
ために２つの酵素の活性を必要とする、安定な１，２−
ジオキセタン誘導体を開示している（米国特許第５，１
３２，２０４号、参照することにより本明細書に組み込
まれる）。ハセス（Haces）は、１，２−ジオキセタン
の分解が、末端求核性物質を放出する酵素反応または化
学反応により開始される方法を開示している（米国特許
第５，２４８，６１８号、参照することにより本明細書
に組み込まれる）。これは、分子内置換反応を受けて、
フェノキシ基を放出し、これが１，２−ジオキセタンの
分解を開始させる。分子内反応が起きる連鎖は、１重結
合から構成され、従ってすべての結合の周りで完全に自
由に回転でき、分子内反応に参加する基の間のランダム
な相互作用に依存する。 【００２８】化学発光シグナル伝達分野の改良にもかか
わらず、新しい基質と試薬に対するニーズが存在する。
現在利用可能な基質の多くは、酵素に非依存性の基質分
解の開始と化学発光シグナルの放出のために、高レベル
のバックグランドを生成する。従って、酵素の非存在下
でより安定な新しいタイプの１，２−ジオキセタンは、
好適な試薬となるでしたあろう。 【００２９】（７）蛍光によるリアルタイム検出 臨床試料からの核酸の増幅は、広く使用される技術とな
っている。この方法の最初の技術であるポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）は、ムリス（Mullis）らの米国特許第
４，６８３，２０２号に記載された（参照することによ
り本明細書に組み込まれる）。それ以来、他の方法、例
えば結合連鎖反応（ＬＣＲ）（米国特許第５，４９４，
８１０号）、ＧＡＰ−ＬＣＲ（米国特許第６，００４，
２８６号）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）（米
国特許第５，１３０，２３８号）、鎖置換増幅（ＳＤ
Ａ）（米国特許第５，２７０，１８４号と米国特許第
５，４５５，１６６号）、およびループ介在増幅（米国
特許出願０９／１０４，０６７号；ヨーロッパ特許出願
ＥＰ０９７１０３９Ａ）が記載されている（これらはす
べて、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
適切な標的から得られた増幅産物の検出は、多くの方法
により行われている。ムリス（Mullis）らが記載した初
期の方法は、別個の核酸種の存在を検出するために、ゲ
ル分析を使用した。目的の標的の存在を示すこの分子種
の同定は、サイズの評価と、標的配列が欠如した陰性対
照の使用により測定された。増幅に使用されるプライマ
ーを含めると、適切な標的配列からの生成物の特定のサ
イズを決定した。非標的配列から生成される擬増幅産物
は、標的から得られる配列と同じサイズの生成物を有す
る可能性は低い。あるいは、増幅産物中に存在する配列
の特定の性質を調べるのに、より複雑な方法が使用され
ている。例えば、特異的な配列の存在、欠如、または空
間的位置を測定するのに、制限酵素消化が使用されてい
る。適切な配列の存在はまた、ハイブリダイゼーション
実験により確立されている。この方法では、増幅産物
は、標的またはプローブとして使用することができる。 【００３０】前記検出法は歴史的に、増幅反応が完了後
に使用されている。さらに最近は、増幅中の合成の程度
を測定（すなわち、「リアルタイム検出」）するための
方法が記載されている。例えば、最も簡単な系では、増
幅反応中に、挿入結合する物質が存在する（ヒグチ（Hi
guchi）、米国特許第５，９９４，０５６号、およびウ
ィトワー（Wittwer）ら、米国特許第６，１７４，６７
０号；両方とも、参照することにより本明細書に組み込
まれる）。この方法は、２本鎖核酸へのインターカレー
ターの結合により示される蛍光の増強を利用する。蛍光
量の測定は、反応が終わった後に、合成後に蛍光計で行
われるか、または、蛍光検出系を備え反応のために毛細
管を使用する特殊なＰＣＲサイクラー装置を使用して、
反応の経過中にリアルタイム測定を行うことができる
（米国特許第５，４５５，１７５号、および米国特許第
６，１７４，６７０号、参照することにより本明細書に
組み込まれる）。増幅の経過中に２本鎖物質の量が増加
すると、シグナルの量も増加する。この系の感度は、産
生される２本鎖核酸の充分量に依存し、これは、ａ）非
結合インターカレーター、およびｂ）反応混合物中の１
本鎖プライマーに結合したインターカレーター分子、の
蛍光から区別可能なシグナルを生成する。特異性は、増
幅反応自体の本質から、または反応生成物のＴｍプロフ
ィールを見ることにより得られる。初期の研究は、臭化
エチジウムを用いて行われたが、現在ではＳＹＢＲグリ
ーン（登録商標）がより一般的に使用されている。この
システムの変法は、シンガー（Singer）とホーグランド
（Haugland）、米国特許第６，３２３，３３７Ｂ１号
（参照することにより本明細書に組み込まれる）により
記載されており、ここでは、ＰＣＲ反応に使用されるプ
ライマーが、消光物質で修飾され、こうしてプライマー
のダイマー分子に結合する蛍光性インターカレーターの
シグナル生成が減少する。標的配列から得られたアンプ
リコンは、消光物質からは充分に遠いセグメントに結合
したインターカレーターを含むため、標的由来のアンプ
リコンからのシグナル生成がまだ起きる。 【００３１】取り込みに依存する別の分析法は、ナザレ
ンコ（Nazarenko）（米国特許第５，８６６，３３６
号；参照することにより本明細書に組み込まれる）によ
り記載されている。この系では、シグナル生成は、２本
鎖増幅産物へのプライマーの取り込みに依存する。プラ
イマーは、その５’末端に余分の配列が付加されるよう
に、設計される。増幅が無い場合は、分子内ハイブリダ
イゼーションによりステムループ構造が形成され、これ
は次に、エネルギードナーの近傍に消光物質を取り込
み、こうして蛍光を妨害する。しかし、プライマーが２
本鎖アンプリコンに取り込まれると、消光物質とドナー
は物理的に分離され、ドナーは蛍光シグナルを生成する
ことが可能となる。この系の特異性は、増幅反応自体の
特異性に依存する。ステムループ配列は余分の配列から
得られるため、アンプリコンが適切な標的分子から得ら
れてもまたは非標的配列から得られても、シグナル生成
のＴｍプロフィールは同じである。 【００３２】取り込みに基づく測定法以外にプローブに
基づく測定法も、リアルタイム分析に使用されている。
例えば、適切な標的配列の存在を検出するための均一測
定法には、２重プローブ系を使用することができる。こ
の方法では、１つのプローブがエネルギードナーを含
み、他のプローブがエネルギーアクセプターを含む（ミ
シェルヘラー（Michael Heller）のヨーロッパ特許出願
００７０６８５号、１９８３年１月２６日公開）。すな
わち、標的配列が存在する時は、２つのプローブが隣接
配列に結合し、エネルギー移動が起きる。標的配列が存
在しない時は、プローブは非結合のままであり、エネル
ギー移動は起きない。たとえ偶然に、１つまたは両方の
プローブの結合が起きるのに充分に均一な試料中に非標
的配列があっても、エネルギー移動には両方のプローブ
が結合して、これらが互いに特定の近傍になければなら
ないため、シグナルは生成されない。この系の利点は、
ウィトワー（Wittwer）ら、米国特許第６，１７４，６
７０号（参照することにより本明細書に組み込まれる）
により、前記の毛細管を備えたＰＣＲ装置を使用して、
ＰＣＲ増幅のリアルタイム検出のために、利用されてい
る。個々のサイクル中のプライマーアニーリング工程は
また、各プローブが同時に標的配列に結合することを可
能にして、標的配列の有無の評価を提供する。この方法
のさらなる改良法では、プライマーの１つはエネルギー
移動要素を含有し、単一のエネルギー移動プローブが使
用される。蛍光性インターカレーターとともに標識プロ
ーブも使用され、プローブ法の特異性を、核酸への結合
から得られる蛍光の増強と組合せることが可能となる。
これは、米国特許第４，８６８，１０３号に初めて記載
され、後にＰＣＴ国際出願ＷＯ９９／２８５００で増幅
反応に適用された（両方とも参照することにより本明細
書に組み込まれる）。 【００３３】同じ核酸中にエネルギードナーとエネルギ
ーアクセプターを含むプローブも、使用されている。こ
れらの測定法において、エネルギーアクセプターは、適
切な相補的標的の非存在下で蛍光性エネルギー放出を
「消す（quench）」。リザルジ（Lizardi）ら、米国特
許第５，１１８，８０１号に記載された１つの系におい
て、「分子標識（molecular beacons）」が使用され、
ここで、エネルギードナーと消光物質は、内部塩基対合
を用いる２次構造により、近傍に維持される。標的配列
が存在する時は、分子標識中の相補配列は、ハイブリダ
イゼーションを可能にし、これは、２次構造を破壊し
て、こうしてエネルギー放出を可能にする。タクマン
（Taqman）と呼ぶ別の系において、Ｔａｑポリメラーゼ
のエキソヌクレアーゼ活性の２本鎖選択性が使用される
（ゲルファンド（Gelfand）ら、米国特許第５，２１
０，０１５号）。標的分子が存在する時、相補的配列へ
のプローブのハイブリダイゼーションは、１本鎖プロー
ブを、エキソヌクレアーゼの基質に変換する。プローブ
の分解により、ドナーが消光物質から分離され、こうし
て光が放出される。 【００３４】（８）アナライト中のプライマー結合配列 真核細胞ｍＲＮＡの特徴の１つは、３’末端におけるポ
リＡテイルの存在である。この特徴は、ポリＡセグメン
トが、真核生物ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーの合成のため
の普遍的な結合部位として使用することができるため、
ｍＲＮＡを扱う場合の大きな利点を提供する。しかし、
ｍＲＮＡの３’末端は容易に得られかつ充分に研究され
ているが、５’末端はそのような共通配列は欠如してた
め、これはまた、ＲＮＡ研究においていくつかの偏見を
与える。すなわち、その主要な目的が、元々の５’末端
配列を完全に示すクローンを作成することである多数の
系が、記載されている。これはまた、比較転写研究のた
めのアレイ分析に引き継がれている。この目的に使用さ
れる実質的にすべての系は、ｍＲＮＡの３’末端でのオ
リゴＴプライミングにより開始されるため、下流の配列
は、３’開始点から離れる合成の継続に依存する。しか
し、特定の数の塩基の合成後にポリメラーゼがしばしば
鋳型から離れるため、重合の減衰作用があることは公知
である。別の作用は、多くの逆転写酵素の成分であるＲ
ＮａｓｅＨの存在により形成される。いったん停止した
ＤＮＡ鎖は、ＤＮＡの３’末端の近くでＲＮＡの消化を
可能にし、こうして、ＲＮＡ鋳型のコピーされない部分
を、成長するＤＮＡ鎖から分離する。この作用はまた、
ｃＤＮＡの合成中にランダムに起きる。従って、配列の
表示は、３’ポリＡプライマー部位からのその距離に反
比例する。 【００３５】先行技術は、ＲＮＡのポリＡセグメントを
広く利用してきたが、生体系においてポリＡ ｍＲＮＡ
は、核酸のほんの一部であることを認識されたい。先行
技術の別の制限は、ポリＡテイルの使用が、真核生物ｍ
ＲＮＡでのみ可能であることである。特に関係する２つ
の領域は、この利点を利用できない。１つの領域は、細
菌ｍＲＮＡであり、これはポリＡ付加物が本質的に欠如
しているためである。２つ目は、真核生物系における異
種ＲＮＡである。特定の真核生物遺伝子にとって、異種
ＲＮＡ中に存在する大量の遺伝情報があり、これは、１
つのみのエキソン情報を含む転写体のポリアデニル化成
熟型の使用により失われる。 【００３６】これらの系におけるプライマー共通配列の
欠如は、オリゴＴプライミングの代替の使用を必要とし
ている。先行技術において、オクタマーを用いるランダ
ムプライミング（セリンガー（Sellinger）ら、2000 Na
ture Biotechnology 18:1262-1268）、３７個の７量体
と８量体の選択されたセット（タラート（Talaat）ら、
2000 Nature Biotechnology 18:679-682）、および4290
遺伝子特異的プライマーのセット（タオ（Tao）ら、199
9 J. Bact. 181:6425-6490）により、細菌発現試験が行
われている。ランダムプライマーのセットと遺伝子特異
的プライマーのセットにより示されるプライマーの大き
いセットの使用は、反応を進めるのに多量のプライマー
を必要とし、プライマーと標的配列の複雑さのために、
乏しい速度を示す。すなわち、アナライト中のある特定
の配列について、その配列に相補的なプライマーのほん
の一部のみしか無い。大きいセットのランダムプライマ
ーはまた、互いをプライマーと鋳型として使用する能力
を有し、こうしてナンセンス核酸を生成し、利用可能な
プライマーの有効量を低下させる。ランダムオリゴヌク
レオチドの量を増加させてプライミングの速度を改良す
る試みは、非常に限定されている。まず、反応混合物中
に溶解するオリゴヌクレオチドの量に、物理的制約があ
る。第２に、プライマー濃度が上昇すると、自己プライ
ミングが増加し、こうしてより多くのナンセンス配列が
生成され、本来アナライト依存合成に使用される試薬の
吸収が増加するため、プライマーの量の増加は、自己制
限性である。プライマーの複雑さ（すなわち、配列の長
さ）を低下させることにより、より低濃度を使用するこ
とは理論的に可能であるが、ハイブリッド形成の安定性
が限定される。一方、前記の７量体および８量体の分か
れたサブセットは、目的の標的生物の完全なゲノムの知
識を必要とする。従って、これらは、完全に配列決定さ
れた生物でのみ使用され、各標的生物についてユニーク
なセットを個々に開発しなければならず、その応用が限
定される。ＲＮＡ連結によりまたはポリＡポリメラーゼ
により、共通配列を酵素的に付加することができるが、
これらの両方とも、遅くて非効率的な方法である。こう
して、低レベルの複雑さを維持しながら、可変のまたは
未知の配列の多数の非ポリアデニル化鋳型の安定なプラ
イミングを、効率的に提供することができる方法と組成
物に対するニーズが存在する。 【００３７】また、増幅目的のためにアナライト中に配
列を導入するための方法が記載されている。例えば、標
的配列に相補的なセグメントおよびプロモーター配列を
含むセグメントを含む、オリゴヌクレオチドも記載され
ており、ここで標的は、選択された別個の配列または天
然のポリＡ配列である（米国特許第５，５５４，５１６
号および米国特許第６，３３８，９５４号（両方とも参
照することにより本明細書に組み込まれる））。標的ｍ
ＲＮＡにハイブリダイゼーション後、相補的セグメント
にハイブリダイズしたアナライトのセグメントを切断
し、次にプロモーターセグメントを鋳型として使用して
アナライトの３’末端を伸長するのに、ＲＮａｓｅＨが
使用される。これらの方法で使用されるオリゴヌクレオ
チドは、均一なため、この具体的な方法は、エンドヌク
レアーゼ反応がアナライトの相補的セグメントの消化を
完了する前に開始される伸長反応に依存する。 【００３８】 【課題を解決するための手段】（発明の要約）本発明
は、少なくとも２つの部分を含む組成物であって、第１
の部分は、（ｉ）少なくとも１つの第１のエネルギー移
動要素と（ii）目的の核酸の少なくとも一部の配列に相
補的な核酸配列とを含む、少なくとも１つの第１の核酸
プライマーまたは核酸構築体を含み、第２の部分は、
（ｉ）少なくとも１つの第２のエネルギー移動要素と
（ii）目的の核酸の少なくとも一部の核酸配列と同一で
ある核酸配列とを含む、少なくとも１つの第２の核酸プ
ライマーまたは核酸構築体を含み、ここで、第１の核酸
プライマーまたは核酸構築体は第２のエネルギー移動要
素を含まず、第２の核酸プライマーまたは核酸構築体は
第１のエネルギー移動要素を含まない、上記組成物を提
供する。 【００３９】本発明はまた、少なくとも２つの部分を含
む組成物であって、第１の部分は、少なくとも２つのセ
グメントを含み、ここで第１のセグメントは、第１の核
酸プライマーまたは核酸構築体および少なくとも１つの
第１のエネルギー移動要素を含み、第２のセグメント
は、目的の核酸の少なくとも一部に相補的な伸長プライ
マーを含み、第２の部分は、少なくとも２つのセグメン
トを含み、ここで第２の部分の第１のセグメントは、第
２の核酸プライマーまたは核酸構築体および少なくとも
１つの第２のエネルギー移動要素を含み、第２の部分の
第２のセグメントは、目的の核酸の少なくとも一部に相
補的なプライマーで伸長された核酸配列を含み、ここ
で、第１の核酸プライマーまたは核酸構築体は第２のエ
ネルギー移動要素を含まず、第２の核酸プライマーまた
は核酸構築体は第１のエネルギー移動要素を含まない、
上記組成物を提供する。 【００４０】本発明はまた、２つの核酸鎖を含む組成物
であって、２つの鎖の第１は、少なくとも１つの第１の
エネルギー移動要素を含み、２つの鎖の第２は、少なく
とも１つの第２のエネルギー移動要素を含み、ここで、
第１の鎖またはその部分は、第２の鎖またはその部分い
ハイブリダイズし、第１の鎖は第２のエネルギー移動要
素が欠如し、第２の鎖は第１のエネルギー移動要素が欠
如している、上記組成物を提供する。 【００４１】また本発明は、試料中の目的の１本鎖また
は２本鎖核酸の存在を、上記の最初に記載した組成物を
使用して、定性的または定量的に検出する方法を提供す
る。この方法は、（ａ）（ｉ）上記組成物、（ii）目的
の核酸を含有することが疑われる試料、および（iii）
核酸鎖伸長を実施するための試薬、を提供する工程；
（ｂ）上記（ｉ）、（ii）および（iii）を含む反応混
合物を形成する工程；（ｃ）ハイブリダイゼーション条
件下で、組成物（ｉ）中の第１の核酸プライマーに目的
の核酸の１つの鎖を接触させ、そしてハイブリダイゼー
ション条件下で、組成物（ｉ）中の第２の核酸プライマ
ーに目的の核酸の相補鎖（存在するなら）を接触させる
工程；（ｄ）第１の核酸プライマーと第２の核酸プライ
マーとを伸長して、第１のプライマー伸長核酸配列と、
第２のプライマー伸長核酸配列（もし相補鎖が存在する
なら）を形成させる工程；（ｅ）第１のプライマー伸長
核酸配列を目的の核酸から分離し、第２のプライマー伸
長核酸配列を目的の核酸の相補鎖（もし存在するなら）
から分離する工程；（ｆ）ハイブリダイゼーション条件
下で、組成物（ｉ）中の第１の核酸プライマーに、目的
の核酸または工程（ｅ）からの第２のプライマー伸長核
酸配列を接触させ、ハイブリダイゼーション条件下で、
組成物（ｉ）中の第２の核酸プライマーに、工程（ｅ）
からの第１のプライマー伸長核酸配列を接触させる工
程；そして（ｇ）組成物（ｉ）中の第１と第２のエネル
ギー移動要素により、目的の核酸の存在または量を検出
する工程、とを含む。 【００４２】本明細書に記載の発明はまた、２つのセグ
メントを含む核酸鎖を含む組成物であって、第１のセグ
メントはプライマーまたは核酸構築体を含み、第２のセ
グメントはプライマー伸長配列を含み、ここで、プライ
マーまたは核酸構築体は第１のエネルギー移動要素を含
み、プライマー伸長配列は第２のエネルギー移動要素を
含み、プライマー伸長配列は２つ以上のヌクレオチドを
含む、上記組成物を提供する。 【００４３】本発明はまた、試料中の目的の１本鎖また
は２本鎖核酸の存在を、定性的または定量的に検出する
方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）目的の核酸
を含有することが疑われる試料、（ii）（Ａ）目的の核
酸の少なくとも一部に相補的な核酸配列と（Ｂ）第１の
エネルギー移動要素とを含む、核酸プライマーまたは核
酸構築体、（iii）第２のエネルギー移動要素を含む標
識ヌクレオチド；および（iv）核酸鎖伸長を実施するた
めの試薬、を提供する工程；（ｂ）上記（ｉ）、（i
i）、（iii）および（iv）を含む反応混合物を形成する
工程；（ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物
（ii）中の核酸プライマーに目的の核酸を接触させる工
程；（ｄ）２つ以上のヌクレオチドにより核酸プライマ
ーを伸長させ、こうして標識ヌクレオチドを取り込む工
程；そして（ｅ）核酸プライマー中の第１のエネルギー
移動要素と、取り込まれたヌクレオチド中の第２のエネ
ルギー移動要素の間のエネルギー移動により、目的の核
酸の存在または量を検出する工程、とを含む。 【００４４】本発明により提供される別の態様は、試料
中の目的の１本鎖または２本鎖核酸の存在を、定性的ま
たは定量的に検出する方法である。この方法は、（ａ）
（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われる試料、（i
i）目的の核酸の１つの鎖の少なくとも一部に相補的な
核酸配列を含む、第１の核酸プライマーまたは核酸構築
体、（iii）１つの鎖の少なくとも一部と同一の核酸配
列を含む、第２の核酸プライマーまたは核酸構築体、
（iv）第１のエネルギー移動要素を含む標識ヌクレオチ
ド；および（ｖ）核酸鎖伸長を実施するための試薬、を
提供する工程であって、ここで（ii）、（iii）または
（ii）と（iii）の両方は第２のエネルギー移動要素を
含む、工程；（ｂ）上記（i）、（ii）、（iii）、（i
v）および（ｖ）を含む反応混合物を形成する工程；
（ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii）
中の第１の核酸プライマーに目的の核酸の１つの鎖を接
触させ、ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii
i）中の第２の核酸プライマーに目的の核酸の相補鎖
（もし存在するなら）を接触させる工程；（ｄ）第１の
核酸プライマーと第２の核酸プライマーとを伸長して、
第１のプライマー伸長核酸配列と第２のプライマー伸長
核酸配列（もし相補鎖が存在するなら）を形成させて、
こうして標識ヌクレオチドを取り込む工程；（ｅ）第１
のプライマー伸長核酸配列を目的の核酸から分離し、第
２のプライマー伸長核酸配列を目的の核酸の相補鎖（も
しくは存在さらなる）から分離する工程；（ｆ）ハイブ
リダイゼーション条件下で、組成物（ii）中の第１の核
酸プライマーに、目的の核酸または工程（ｅ）からの第
２のプライマー伸長核酸配列を接触させ、ハイブリダイ
ゼーション条件下で、組成物（iii）中の第２の核酸プ
ライマーに、工程（ｅ）からの第１のプライマー伸長核
酸配列を接触させる工程；そして（ｇ）第１の核酸プラ
イマー、第２の核酸プライマー、またはこの両方中の第
２のエネルギー移動要素と、取り込まれたヌクレオチド
中の第１のエネルギー要素の間のエネルギー移動によ
り、目的の核酸の存在または量を検出する工程、とを含
む。 【００４５】本発明の別の態様は、核酸鎖を含む組成物
であって、この鎖は、２つのセグメントを含み、第１の
セグメントは、プライマーまたは核酸構築体を含み、第
２のセグメントは、プライマー伸長配列を含み、ここで
プライマー伸長配列は、１つ以上の第１のエネルギー移
動要素と１つ以上の第２のエネルギー移動要素とを含
む。 【００４６】本発明はまた、試料中の目的の１本鎖また
は２本鎖核酸の存在を、定性的または定量的に検出する
方法であって、（ａ）（ｉ）目的の核酸を含有すること
が疑われる試料、（ii）目的の核酸の少なくとも一部に
相補的な核酸配列を含む、核酸プライマーまたは核酸構
築体、および（iii）第１のエネルギー移動要素を含む
１つ以上の第１のヌクレオチドと、第２のエネルギー移
動要素を含む１つ以上の第２のヌクレオチド；（iv）核
酸鎖伸長を実施するための試薬、を提供する工程；
（ｂ）上記（ｉ）、（ii）、（iii）および（iv）を含
む反応混合物を形成する工程；（ｃ）ハイブリダイゼー
ション条件下で、組成物（ii）中の核酸プライマーに、
目的の核酸を接触させる工程；（ｄ）核酸プライマーを
伸長させ、こうして第１および第２のヌクレオチドを取
り込む工程；そして（ｅ）第１のエネルギー移動要素と
第２のエネルギー移動要素の間のエネルギー移動によ
り、目的の核酸の存在または量を検出する工程、とを含
む上記方法が提供される。 【００４７】また、試料中の目的の１本鎖または２本鎖
核酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法が提
供される。この方法は、（ａ）（ｉ）目的の核酸を含有
することが疑われる試料、（ii）目的の核酸の１つの鎖
の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含む、第１の核
酸プライマーまたは核酸構築体、（iii）１つの鎖の少
なくとも一部と同一の核酸配列を含む、第２の核酸プラ
イマーまたは核酸構築体、（iv）第１のエネルギー移動
要素を含む１つ以上の第１のヌクレオチドと、第２のエ
ネルギー移動要素を含む１つ以上の第２のヌクレオチ
ド；および（ｖ）核酸鎖伸長を実施するための試薬、を
提供する工程；（ｂ）上記（i）、（ii）、（iii）、
（iv）および（ｖ）を含む反応混合物を形成する工程；
（ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii）
中の第１の核酸プライマーに目的の核酸の１つの鎖を接
触させ、ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii
i）中の第２の核酸プライマーに目的の核酸の相補鎖
（もし存在するなら）を接触させる工程；（ｄ）第１の
核酸プライマーと第２の核酸プライマーとを伸長して、
第１のプライマー伸長核酸配列と第２のプライマー伸長
核酸配列（もし相補鎖が存在するなら）を形成させて、
こうして第１および第２のヌクレオチドを取り込む工
程；そして（ｅ）第１のエネルギー移動要素と第２のエ
ネルギー移動要素とのエネルギー移動により、目的の核
酸の存在または量を検出する工程、とを含む。 【００４８】本発明はまた、核酸鎖を含む組成物に関
し、この鎖は、２つ以上のリボヌクレオチドを含み、こ
こで、少なくとも１つのリボヌクレオチドは第１のエネ
ルギー移動要素を含み、少なくとも１つの他のリボヌク
レオチドは第２のエネルギー移動要素を含む。 【００４９】本発明はまた、試料中の目的の１本鎖また
は２本鎖核酸の存在を、定性的または定量的に検出する
方法であって、（ａ）（ｉ）目的の核酸を含有すること
が疑われる試料、（ii）第１の核酸プライマーまたは核
酸構築体、または場合により第２の核酸プライマーまた
は核酸構築体は、ＲＮＡプロモーター配列を含む、少な
くとも１つの第１の核酸プライマーまたは核酸構築体、
および場合により第２の核酸プライマーまたは核酸構築
体、（iii）第１のエネルギー移動要素を含む１つ以上
の第１のリボヌクレオチド、および第２のエネルギー移
動要素を含む１つ以上の第２のリボヌクレオチド、（i
v）核酸鎖伸長とＲＮＡ転写とを実施するための試薬、
を提供する工程；（ｂ）上記（i）、（ii）、および（i
ii）を含む反応混合物を形成する工程；（ｃ）ハイブリ
ダイゼーション条件下で、第１の核酸プライマーまたは
核酸構築体（ii）に、目的の核酸の１つの鎖を接触させ
る工程；（ｄ）核酸プライマーを伸長して、プライマー
伸長核酸配列を形成させる工程；（ｅ）プライマー伸長
核酸配列またはその一部に相補的な第２の核酸鎖を合成
し、こうして２本鎖核酸を形成する工程；（ｆ）工程
（ｅ）で形成した２本鎖核酸を転写して、第１および第
２のリボヌクレオチド（iii）を転写体中に取り込む工
程；（ｇ）第１のエネルギー移動要素と第２のエネルギ
ー移動要素の間のエネルギー移動により、目的の核酸の
存在または量を検出する工程とを含み、ここで転写工程
（ｆ）は、工程（ｅ）で合成されたプライマー伸長核酸
配列または第２の核酸鎖中のＲＮＡプロモーター配列に
より行われる、上記方法を提供する。 【００５０】また、２つの部分を有する組成物が提供さ
れ、ここで第１の部分は２つのセグメントを含む核酸鎖
であり、第１のセグメントは核酸プライマーまたは核酸
構築体を含み、第２のセグメントはプライマー伸長配列
を含み、第２の部分は核酸結合物質を含み、核酸プライ
マーまたは核酸構築体は１つ以上の蛍光性の第１のエネ
ルギー移動要素を含み、核酸結合物質は１つ以上の第２
のエネルギー移動要素を含む。 【００５１】また、（ａ）鎖の少なくとも１つは２つの
セグメントを含み、第１のセグメントは核酸プライマー
または核酸構築体を含み、第２のセグメントはプライマ
ー伸長配列を含む、２つの核酸鎖、および（ｂ）核酸プ
ライマーまたは核酸構築体は１つ以上の蛍光性第１のエ
ネルギー移動要素を含み、核酸結合物質は１つ以上の第
２のエネルギー移動要素を含む、核酸結合物質とを含む
組成物が提供される。 【００５２】本発明の別の態様は、試料中の目的の１本
鎖または２本鎖核酸の存在を、定性的または定量的に検
出する方法であって、この方法は、（ａ）（ｉ）目的の
核酸を含有することが疑われる試料、（ii）（Ａ）目的
の核酸の少なくとも一部に相補的な核酸配列と（Ｂ）１
つ以上の蛍光性の第１のエネルギー移動要素とを含む、
核酸プライマーまたは核酸構築体、（iii）１つ以上の
第２のエネルギー移動要素を含む核酸結合物質；（iv）
核酸鎖伸長を実施するための試薬、を提供する工程；
（ｂ）上記（ｉ）、（ii）、（iii）および（iv）を含
む反応混合物を形成する工程；（ｃ）ハイブリダイゼー
ション条件下で、組成物（ii）中の核酸プライマーに目
的の核酸を接触させる工程；（ｄ）核酸プライマーまた
は核酸構築体を伸長させて、プライマー伸長配列を形成
する工程；（ｅ）核酸結合物質（iii）を、プライマー
伸長配列に、または目的の核酸とプライマー伸長配列と
を含む複合体に結合させる工程；および（ｆ）第１のエ
ネルギー移動要素と第２のエネルギー移動要素の間のエ
ネルギー移動により、目的の核酸の存在または量を検出
する工程、とを含む。 【００５３】また、試料中の目的の１本鎖または２本鎖
核酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であ
って、（ａ）（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われ
る試料、（ii）目的の核酸の１つの鎖の少なくとも一部
に相補的な核酸配列を含む、第１の核酸プライマーまた
は核酸構築体、（iii）１つの鎖の少なくとも一部と同
一の核酸配列を含む、第２の核酸プライマーまたは核酸
構築体、（iv）１つ以上の第１のエネルギー移動要素を
含む核酸結合物質；および（ｖ）核酸鎖伸長を実施する
ための試薬、を提供する工程であって、（ii）、（ii
i）または（ii）と（iii）の両方は１つ以上の蛍光性の
第２のエネルギー移動要素を含む、工程；（ｂ）上記
（i）、（ii）、（iii）、（iv）および（ｖ）を含む反
応混合物を形成する工程；（ｃ）ハイブリダイゼーショ
ン条件下で、組成物（ii）中の第１の核酸プライマーに
目的の核酸の１つの鎖を接触させ、ハイブリダイゼーシ
ョン条件下で、組成物（iii）中の第２の核酸プライマ
ーに目的の核酸の相補鎖（もし存在するなら）を接触さ
せる工程；（ｄ）第１の核酸プライマーと第２の核酸プ
ライマーとを伸長して、第１のプライマー伸長核酸配列
と第２のプライマー伸長核酸配列（もし相補鎖が存在す
るなら）を形成させる工程；（ｅ）核酸結合物質（iv）
を、プライマー伸長核酸配列に、または目的の核酸とプ
ライマー伸長配列とを含む複合体に結合させる工程；そ
して（ｆ）第１の核酸プライマー、第２の核酸プライマ
ー、またはこの両方中の第２のエネルギー移動要素と、
核酸結合物質（iv）中の第１のエネルギー移動要素の間
のエネルギー移動により、目的の核酸の存在または量を
検出する工程、とを含む方法が提供される。 【００５４】さらに本発明により、（ａ）プライマーま
たは核酸構築体を含む第１のセグメントと、プライマー
伸長配列を含む第２のセグメントとの、２つのセグメン
トを含む核酸鎖；および（ｂ）プライマー伸長配列は１
つ以上の第１のエネルギー移動要素を含み、核酸結合物
質は１つ以上の第２のエネルギー移動要素を含む、核酸
結合物質を含む、組成物が提供される。 【００５５】また本発明により、（ａ）鎖の少なくとも
１つは２つのセグメントを含み、第１のセグメントは核
酸プライマーまたは核酸構築体を含み、第２のセグメン
トはプライマー伸長配列を含む、２つの核酸鎖、および
（ｂ）プライマー伸長配列は１つ以上の第１のエネルギ
ー移動要素を含み、核酸結合物質は１つ以上の第２のエ
ネルギー移動要素を含む、核酸結合物質を含む、組成物
が提供される。 【００５６】本発明はまた、試料中の目的の１本鎖また
は２本鎖核酸の存在を、定性的または定量的に検出する
方法であって、（ａ）（ｉ）目的の核酸を含有すること
が疑われる試料、（ii）目的の核酸の少なくとも一部に
相補的な少なくとも１つの核酸プライマーまたは核酸構
築体、（iii）第１のエネルギー移動要素を含む標識ヌ
クレオチド；（iv）１つ以上の第２のエネルギー移動要
素を含む核酸結合物質；および（ｖ）核酸鎖伸長を実施
するための試薬、を提供する工程；（ｂ）上記（i）、
（ii）、（iii）、（iv）および（ｖ）を含む反応混合
物を形成する工程；（ｃ）ハイブリダイゼーション条件
下で、組成物（ii）中の核酸プライマーに目的の核酸を
接触させる工程；（ｄ）核酸プライマーを伸長して、標
識ヌクレオチドを取り込む工程；（ｅ）核酸結合物質を
プライマー伸長核酸配列に結合させる工程；そして
（ｆ）第１のエネルギー移動要素と第２のエネルギー移
動要素の間のエネルギー移動により、目的の核酸の存在
または量を検出する工程、とを含む方法を提供する。 【００５７】また、試料中の目的の１本鎖または２本鎖
核酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であ
って、（ａ）（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われ
る試料、（ii）目的の核酸の１つの鎖の少なくとも一部
に相補的な核酸配列を含む、第１の核酸プライマーまた
は核酸構築体、（iii）１つの鎖の少なくとも一部と同
一の核酸配列を含む、第２の核酸プライマーまたは核酸
構築体；（iv）第１のエネルギー移動要素を含む１つ以
上の標識ヌクレオチド；（ｖ）１つ以上の第２のエネル
ギー移動要素を含む核酸結合物質；および（vi）核酸鎖
伸長を実施するための試薬、を提供する工程；（ｂ）上
記（i）、（ii）、（iii）、（iv）、（ｖ）および（v
i）を含む反応混合物を形成する工程；（ｃ）ハイブリ
ダイゼーション条件下で、第１の核酸プライマーまたは
核酸構築体（ii）に、目的の核酸の１つの鎖を接触さ
せ、ハイブリダイゼーション条件下で、第２の核酸プラ
イマーまたは核酸構築体（iii）に、目的の核酸の相補
鎖（もし存在するなら）を接触させる工程；（ｄ）第１
の核酸プライマーと第２の核酸プライマーを伸長して、
第１のプライマー伸長核酸配列と第２のプライマー伸長
核酸配列（もし相補鎖が存在するなら）を形成させ、こ
うして標識ヌクレオチドを取り込む工程；（ｅ）核酸結
合物質（Ｖ）を第１のプライマー伸長核酸配列、および
第２のプライマー伸長核酸配列（もし相補鎖が存在する
なら）に結合させる工程；そして（ｆ）第１のエネルギ
ー移動要素と第２のエネルギー移動要素の間のエネルギ
ー移動により、目的の核酸の存在または量を検出する工
程、とを含む方法が提供される。 【００５８】さらに本発明により、（ｉ）少なくとも１
つのリボヌクレオチドは第１のエネルギー移動要素を含
む１つ以上のリボヌクレオチドを含む、核酸鎖；および
（ii）１つ以上の第２のエネルギー移動要素を含む核酸
結合物質を含む、組成物が提供される。 【００５９】本発明の別の態様は、試料中の目的の１本
鎖または２本鎖核酸の存在を、定性的または定量的に検
出する方法であって、（ａ）（ｉ）目的の核酸を含有す
ることが疑われる試料、（ii）少なくとも１つの第１の
核酸プライマーまたは核酸構築体、および場合により第
２の核酸プライマーまたは核酸構築体、ここで、第１の
核酸プライマーまたは核酸構築体、または場合により第
２の核酸プライマーまたは核酸構築体は、ＲＮＡプロモ
ーター配列を含む、（iii）第１のエネルギー移動要素
を含む１つ以上の標識リボヌクレオチド、（iv）第２の
エネルギー移動要素を含む核酸結合物質、（ｖ）核酸鎖
伸長とＲＮＡ転写とを実施するための試薬、を提供する
工程；（ｂ）上記（i）、（ii）、（iii）、（iv）およ
び（ｖ）を含む反応混合物を形成する工程；（ｃ）ハイ
ブリダイゼーション条件下で、第１の核酸プライマーま
たは核酸構築体（ii）に、目的の核酸の１つの鎖を接触
させる工程；（ｄ）核酸プライマーを伸長して、プライ
マー伸長核酸配列を形成させる工程；（ｅ）プライマー
伸長核酸配列またはその一部に相補的な第２の核酸鎖を
合成し、こうして２本鎖核酸を形成する工程；（ｆ）工
程（ｅ）で形成した２本鎖核酸を転写して、標識リボヌ
クレオチド（iii）を標識転写体中に取り込む工程；
（ｇ）核酸結合物質（iv）を標識転写体に結合させる工
程；（ｈ）第１のエネルギー移動要素と第２のエネルギ
ー移動要素の間のエネルギー移動により、目的の核酸の
存在または量を検出する工程とを含み、ここで転写工程
（ｆ）は、工程（ｅ）で合成されたプライマー伸長核酸
配列または第２の核酸鎖中のＲＮＡプロモーターにより
行われる、上記方法である。 【００６０】本発明はまた、ハイブリダイズした第１と
第２の核酸を含む組成物を提供し、第１の鎖は２つのセ
グメントを含み、第１のセグメントはプライマーまたは
核酸構築体を含み、第２のセグメントはプライマー伸長
配列を含み、第２の鎖は、プライマー伸長配列またはそ
の一部にハイブリダイズした核酸プローブを含み、プラ
イマー伸長配列は、１つ以上の第１のエネルギー移動要
素を含み、核酸プローブは１つ以上の第２のエネルギー
移動要素を含む。 【００６１】本発明はまた、試料中の目的の１本鎖また
は２本鎖核酸の存在を、定性的または定量的に検出する
方法であって、（ａ）（ｉ）目的の核酸を含有すること
が疑われる試料、（ii）目的の核酸の少なくとも一部に
相補的な核酸プライマーまたは核酸構築体、（iii）第
１のエネルギー移動要素を含む標識ヌクレオチド、（i
v）１つ以上の第２のエネルギー移動要素を含む核酸プ
ローブ；および（ｖ）核酸鎖伸長を実施するための試
薬、を提供する工程；（ｂ）上記（i）、（ii）、（ii
i）、（iv）および（ｖ）を含む反応混合物を形成する
工程；（ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物
（ii）中の核酸プライマーに目的の核酸を接触させる工
程；（ｄ）核酸プライマーを伸長して、こうして標識ヌ
クレオチドを取り込む工程；（ｅ）プライマー伸長配列
を目的の核酸（ｉ）から分離する工程；（ｆ）核酸プロ
ーブをプライマー伸長配列にハイブリダイズさせる工
程；そして（ｇ）第１のエネルギー移動要素と第２のエ
ネルギー移動要素の間のエネルギー移動により、目的の
核酸の存在または量を検出する工程、とを含む上記方法
を提供する。 【００６２】本発明によりまた、試料中の目的の１本鎖
または２本鎖核酸の存在を、定性的または定量的に検出
する方法であって、（ａ）（ｉ）目的の核酸を含有する
ことが疑われる試料、（ii）目的の核酸の１つの鎖の少
なくとも一部に相補的な核酸配列を含む、第１の核酸プ
ライマーまたは核酸構築体、（iii）１つの鎖の少なく
とも一部と同一の核酸配列を含む、第２の核酸プライマ
ーまたは核酸構築体；（iv）第１のエネルギー移動要素
を含む１つ以上の標識ヌクレオチド；（ｖ）１つ以上の
第２のエネルギー移動要素を含む核酸プローブ；および
（vi）核酸鎖伸長を実施するための試薬、を提供する工
程；（ｂ）上記（i）、（ii）、（iii）、（iv）、
（Ｖ）および（vi）を含む反応混合物を形成する工程；
（ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、第１の核酸プ
ライマーまたは核酸構築体（ii）に、目的の核酸の１つ
の鎖を接触させ、ハイブリダイゼーション条件下で、第
２の核酸プライマーまたは核酸構築体（iii）に、目的
の核酸の相補鎖（もし存在するなら）を接触させる工
程；（ｄ）第１の核酸プライマーと第２の核酸プライマ
ーを伸長して、第１のプライマー伸長核酸配列と第２の
プライマー伸長核酸配列（もし相補鎖が存在するなら）
を形成させ、こうして標識ヌクレオチドを取り込む工
程；（ｅ）第１のプライマー伸長核酸配列と第２のプラ
イマー伸長核酸配列（もし工程（ｄ）で産生されるな
ら）を分離する工程；（ｆ）核酸プローブ（ｖ）を第１
のプライマー伸長核酸配列または第２のプライマー伸長
核酸配列にハイブリダイズさせる工程；および（ｇ）第
１のエネルギー移動要素と第２のエネルギー移動要素の
間のエネルギー移動により、目的の核酸の存在または量
を検出する工程、とを含む方法が提供される。 【００６３】また、ハイブリダイズされた第１および第
２の核酸を含む組成物が提供され、第１の鎖は少なくと
も１つのリボヌクレオチドを含み、この少なくとも１つ
のリボヌクレオチドは第１のエネルギー移動要素を含
み、第２の鎖は、第１の鎖またはその一部にハイブリダ
イズした核酸プローブ含み、核酸プローブは、１つ以上
の第２のエネルギー移動要素を含む。 【００６４】本発明の別の態様は、試料中の目的の１本
鎖または２本鎖核酸の存在を、定性的または定量的に検
出する方法であって、（ａ）（ｉ）目的の核酸を含有す
ることが疑われる試料、（ii）第１の核酸プライマーま
たは核酸構築体、または場合により第２の核酸プライマ
ーまたは核酸構築体は、ＲＮＡプロモーター配列を含
む、少なくとも１つの第１の核酸プライマーまたは核酸
構築体、および場合により第２の核酸プライマーまたは
核酸構築体、（iii）第１のエネルギー移動要素を含む
１つ以上の標識リボヌクレオチド、（iv）第２のエネル
ギー移動要素を含む核酸結合プローブ、（ｖ）核酸鎖伸
長とＲＮＡ転写とを実施するための試薬、を提供する工
程；（ｂ）上記（i）、（ii）、（iii）、（iv）および
（ｖ）を含む反応混合物を形成する工程；（ｃ）ハイブ
リダイゼーション条件下で、第１の核酸プライマーまた
は核酸構築体（ii）に、目的の核酸の１つの鎖を接触さ
せる工程；（ｄ）核酸プライマーを伸長して、プライマ
ー伸長核酸配列を形成させる工程；（ｅ）プライマー伸
長核酸配列またはその一部に相補的な第２の核酸鎖を合
成し、こうして２本鎖核酸を形成する工程；（ｆ）工程
（ｅ）で形成した２本鎖核酸を転写して、標識リボヌク
レオチド（iii）を標識転写体中に取り込む工程；
（ｇ）核酸プローブ（iv）を標識転写体に結合させる工
程；（ｈ）第１のエネルギー移動要素と第２のエネルギ
ー移動要素の間のエネルギー移動により、目的の核酸の
存在または量を検出する工程とを含み、ここで転写工程
（ｆ）は、工程（ｅ）で合成されたプライマー伸長核酸
配列または第２の核酸鎖中のＲＮＡプロモーターにより
行われる、上記方法である。 【００６５】さらに本発明は、少なくとも２つのセグメ
ントを含むキメラ核酸構築体を提供し、第１のセグメン
トは５個以上のユニバーサル塩基を含み、第２のセグメ
ントは、分かれた核酸配列を合成するための鋳型を含
む。 【００６６】さらに本発明により、所望の核酸配列をア
ナライトまたはアナライトのライブラリーに取り込む方
法であって、（ａ）（ｉ）アナライトまたはアナライト
のライブラリー、（ii）第１のセグメントは８個以上の
ユニバーサル塩基を含み、第２のセグメントは、所望の
核酸配列を合成するための鋳型を含む、少なくとも２つ
のセグメントを含むキメラ核酸構築体；および（iii）
ハイブリダイゼーションと鋳型依存性鎖伸長を実施する
ための試薬、を提供する工程；（ｂ）キメラ核酸構築体
（ii）をアナライトまたはアナライトのライブラリー
（ｉ）に結合またはハイブリダイズさせる工程；および
（ｃ）アナライトまたはアナライトのライブラリーの
３’末端を伸長させる工程とを含み、第２のセグメント
がアナライトまたはアナライトのライブラリーの３’末
端の近傍にある時、第２のセグメントは伸長工程（ｃ）
の鋳型である、上記方法が提供される。 【００６７】また、キメラ核酸構築体のセットを含む組
成物であって、そのような各構築体は少なくとも３つの
セグメントを含み、第１のセグメントは４つ以上のユニ
バーサル塩基を含み、第２のセグメントは、１〜８個の
ヌクレオチドの並べ換えを含み、第３のセグメントは、
所望の核酸配列を合成するための鋳型を含み、ここで第
２のセグメントでは、１〜８個のヌクレオチドの並べ換
えは、 （Ｎ）n （式中、Ｎは独立に、Ｇ、Ａ、ＴまたはＣであり、ｎは
１〜８の整数である）を含む、上記組成物が提供され
る。 【００６８】本発明はまた、所望の核酸配列をアナライ
トまたはアナライトのライブラリーに取り込む方法であ
って、（ａ）（ｉ）アナライトまたはアナライトのライ
ブラリー、（ii）各構築体が少なくとも３つのセグメン
トを含む、キメラ核酸構築体のセットであって、第１の
セグメントは４つ以上のユニバーサル塩基を含み、第２
のセグメントは、１〜８個のヌクレオチドの並べ換えを
含み、第３のセグメントは、所望の核酸配列を合成する
ための鋳型を含み、ここで第２のセグメントでは、１〜
８個のヌクレオチドの並べ換えは、 （Ｎ）n （式中、Ｎは独立に、Ｇ、Ａ、ＴまたはＣであり、ｎは
１〜８の整数である）をからなる、上記セット；および
（iii）ハイブリダイゼーションと鋳型依存性鎖伸長を
実施するための試薬、を提供する工程；（ｂ）キメラ核
酸構築体（ii）をアナライトまたはアナライトのライブ
ラリー（ｉ）に結合またはハイブリダイズさせる工程；
および（ｃ）アナライトまたはアナライトのライブラリ
ーの３’末端を伸長させる工程とを含み、第２のセグメ
ントがアナライトまたはアナライトのライブラリーの
３’末端にハイブリダイズしている時、第３のセグメン
トは伸長工程（ｃ）の鋳型である、上記方法を提供す
る。 【００６９】本発明はまた、４つ以上のユニバーサル塩
基を含む無第１のセグメントと、目的の分かれた核酸配
列に相補的な第２のセグメントの、少なくとも２つのセ
グメントを含むキメラ核酸構築体であって、第１のセグ
メントの５’末端は第２のセグメントの３’末端に結合
し、第２のセグメントの５’末端は第３のセグメントの
３’末端に結合している、上記キメラ核酸構築体に関す
る。 【００７０】アナライトまたはアナライトのライブラリ
ーを選択された位置または配列で切断する方法は、前記
組成物に関する。本発明により、（ａ）（ｉ）アナライ
トまたはアナライトのライブラリー、（ii）前記組成
物、（iii）特異的エンドヌクレアーゼ、（iv）ハイブ
リダイゼーションとエンドヌクレアーゼ性分解消化のた
めの試薬を、提供する工程；（ｂ）組成物（ii）をアナ
ライトまたはアナライトのライブラリー（ｉ）にハイブ
リダイズさせて、類似体またはアナライトのライブラリ
ー（ｉ）中の第２のセグメントと選択された部位または
配列の間でハイブリッドを形成する工程；および（ｃ）
ハイブリッドをエンドヌクレアーゼ性分解する工程を含
む、上記方法が提供される。 【００７１】また本発明により、所望の核酸配列をアナ
ライトまたはアナライトのライブラリーに取り込む方法
であって、（ａ）（ｉ）アナライトまたはアナライトの
ライブラリー、（ii）少なくとも２つのセグメントを含
むキメラ核酸構築体であって、２つのセグメントの第１
は、第１のアナライト核酸配列に相補的であり、２つの
セグメントの第２は、第２のアナライト核酸配列に相補
的である、上記キメラ核酸構築体、（iii）ハイブリダ
イゼーションとエンドヌクレアーゼ性分解消化のための
試薬、（iv）エンドヌクレアーゼ、および（ｖ）鎖伸長
のための試薬、を提供する工程；（ｂ）上記（ｉ）、
（ii）、（iii）および（iv）を含む混合物を形成する
工程；（ｃ）キメラ核酸構築体（ii）をアナライトまた
はアナライトのライブラリー（ｉ）とハイブリダイズさ
せ、こうして第１のセグメントと第１のアナライト核酸
配列の間で第１の複合体を形成させ、第２のセグメント
と第２のアナライト核酸配列の間で第２の複合体を形成
させる工程であって、ここで、第１の複合体はエンドヌ
クレアーゼによる消化に対して耐性であり、第２の複合
体は、エンドヌクレアーゼ性分解消化に感受性の１つ以
上の部位を含む、上記工程；（ｄ）第２の複合体をエン
ドヌクレアーゼ（iv）で消化する工程；および（ｅ）
３’末端はエンドヌクレアーゼ（iv）により生成され
た、第２のアナライト核酸配列の３’末端を伸長する工
程であって、ここで伸長工程（ｅ）は、鋳型依存性重合
または連結により行われる、上記方法が提供される。 【００７２】本発明はさらに、少なくとも２つの核酸セ
グメントを含むキメラ核酸構築体であって、第１のセグ
メントと第２のセグメントは、それぞれ目的の核酸中の
ホモポリマー配列の異なる部分に相補的な配列を含み、
ホモポリマー配列の第１の部分への第１のセグメントの
ハイブリダイゼーションが、第１の複合体を産生し、ホ
モポリマー配列の第２の部分への第２のセグメントのハ
イブリダイゼーションが、第２の複合体を産生し、第２
の複合体中のホモポリマー配列の第２の部分は、特異的
エンドヌクレアーゼの基質であり、第１の複合体は特異
的エンドヌクレアーゼに対して耐性である、上記キメラ
核酸構築体を提供する。 【００７３】さらなる態様は、アナライトまたはアナラ
イトのライブラリーからホモポリマー配列の一部を除去
する方法であって、（ａ）（ｉ）アナライトまたはアナ
ライトのライブラリー、（ii）前記構築体、（iii）エ
ンドヌクレアーゼ、（iv）ハイブリダイゼーションとエ
ンドヌクレアーゼ性分解消化のための試薬、を提供する
工程；（ｂ）構築体（ii）に、アナライトまたはアナラ
イトのライブラリー（ｉ）をハイブリダイズさせて、ホ
モポリマー配列の一部にハイブリダイズした構築体（i
i）中の第２のセグメントを含む少なくとも１つの第２
の複合体と、ホモポリマー配列の異なる一部にハイブリ
ダイズした構築体（ii）中の第１のセグメントを含む少
なくとも１つの第１の複合体とを形成させる工程；
（ｃ）第２の複合体中の第２のセグメントにハイブリダ
イズしたホモポリマー配列の一部を、エンドヌクレアー
ゼ性分解により除去する工程を含む、上記方法である。 【００７４】 【発明の実施の形態】本発明の他の多くの態様および実
施態様を、以下に詳述する。 【００７５】（発明の詳細な説明）本発明は、リガンド
や色素で標識された化合物の調製のための新規方法と組
成物を開示する。本開示には、本発明の新規試薬を合成
するのに使用できる、新規標識試薬、新規色素、および
新規方法が含まれる。本発明の新規方法はまた、既に記
載されている化合物の合成にも応用される。 【００７６】１．炭素−炭素結合形成にに参加する標識
試薬 本発明の１つの態様は、マーカーまたは標識物と所望の
標的分子の間で炭素−炭素結合を作成することができる
反応性基を含む新規標識試薬を開示する。これは、アミ
ン、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基と、適切な反
応性基の間の結合形成が関与する、タンパク質由来の化
学を利用した先行技術の標識試薬とは異なる。本発明の
新規標識試薬は、シグナル残基を所望の標的分子に結合
させる非常に効率的な手段を与える。すなわち、本発明
の新規標識試薬は、炭素−炭素結合を作成することがで
きるリガンドまたは色素部分と反応性基とを含む。さら
に、反応性基から、リガンドまたは色素部分を分離させ
るリンカーアームを挿入することが好ましい。これは、
新規標識試薬と目的の標的分子との、より効率的な結合
を提供する。リンカーアームの存在と性質はまた、標識
標的分子の生物活性または化学活性を上昇させることが
ある。本発明の新規試薬は、標識試薬の反応性基との結
合形成に参加することができる任意の標的分子を標識す
るのに使用することができる。標的分子は、未変性の状
態でも、または新規標識試薬との炭素−炭素結合の形成
に参加するように修飾されていてもよい。 【００７７】本発明で使用されるリガンドには、特に限
定されないが、糖、レクチン、抗原、インターカレータ
ー、キレート剤、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびこれ
らの組合せがある。本発明の新規標識試薬を合成するの
に使用される色素の具体的な選択は、吸収極大、発光極
大、量子収率、化学的安定性、および溶媒の溶解度など
の物性に依存する。タンパク質や核酸の標識に多数の蛍
光および化学発光化合物が有用であることが証明されて
いる。色素部分として使用される化合物の例には、特に
限定されないが、キサンテン、アントラセン、シアニ
ン、ポルフィリン、およびクマリン色素がある。本発明
で使用可能なキサンテン色素の例には、特に限定されな
いが、フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン
（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−
ＦＡＭ）、５−または６−カルボキシ−４，７，２’，
７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５−ま
たは６−カルボキシ−４’５’２’４’５’７’ヘキサ
クロロフルオレセイン（ＨＥＴ）、５−または６−カル
ボキシ−４’、５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキ
シフルオレセイン（ＪＯＥ）、５−カルボキシ−２’，
４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＺＯ
Ｅ）ロドール（rhodol）、ローダミン、テトラメチルロ
ーダミン（ＴＡＭＲＡ）、４，７−ジクロロテトラメチ
ルローダミン（ＤＴＡＭＵＲＡ）、ローダミンＸ（ＲＯ
Ｘ）およびテキサスレッドがある。本発明で使用可能な
シアニン色素の例には、特に限定されないが、Ｃｙ３、
Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７およびＣｙ
７．５がある。本発明で使用可能な他の色素には、特に
限定されないが、エネルギー移動色素、複合色素、およ
び蛍光シグナルを出す他の芳香族化合物がある。本発明
で使用可能な化学発光化合物には、特に限定されない
が、ジオキセタンおよびアクリジニウムエステルがあ
る。またリガンドと色素は互いに排除的な基ではないこ
とも、理解されたい。例えば、フルオレセインは、蛍光
標識物としても、標識抗体の抗原としても使用されてい
る残基の公知の例である。 【００７８】本発明の新規標識試薬の反応性基は、炭素
−炭素結合形成に参加でき、従って新規標識試薬が、標
識物を適当な標的分子に結合させることを可能にするこ
とが知られている化学残基から選択される。そのような
反応性基の例には、特に限定されないが、アルケン、ア
ルキン、金属−有機化合物、およびハロゲン化化合物が
ある。金属−有機化合物とハロゲン化化合物は、芳香
族、複素環、アルケンおよびアルキン基、ならびにこれ
らの種々の組合せを含むことができる。そのような基
は、標識化合物の合成に既に記載されているが、それら
の反応性基は、ヌクレオチドやポリヌクレオチドをタン
パク質のようにするために、核酸にアミノ基を付加する
点でのみ使用された（米国特許第４，７１１，９５５号
と米国特許第５，０４７，５１９号、これらは参照する
ことにより本明細書に組み込まれる）。本発明におい
て、新規標識試薬の反応性基は、リンカーアームの末端
でまたはリンカーアーム内の内部部位で、リガンドまた
は色素に直接結合することができる。金属−有機化合物
およびハロゲン化化合物の使用のための種々の方法の総
説が、ラロック（Larock）（1982、Tetrahedron Report
128:1713-1754）、ロビンズ（Robins）ら（J. Org Che
m 1983, 48:1854-1862）、ホブス（Hobbs）とコクザ（C
ocuzza）（米国特許第５，０４７，５１９号）、エグリ
ントン（Eglington）とマクリー（McCrae）（1963、Adv
ances in Organic Synthesis 4:225-328）およびリーケ
（Rieke）（2000、Aldrichimica Acta 33:52-60）にあ
り、これらはすべて、参照することにより本明細書に組
み込まれる。 【００７９】新規標識試薬の部分を含むリンカーアーム
は、任意の所望の長さでよく、特に限定されないが、炭
素、窒素、酸素、イオウおよびこれらの任意の組合せを
含む適当な原子を含んでよい。リンカーアームを含むこ
とができる化学基には、特に限定されないが、脂肪族結
合、２重結合、３重結合、ペプチド結合、芳香環、脂肪
族環、複素環、エーテル、エステル、アミド、およびチ
オアミドがある。リンカーアームは、自然界で環構造を
形成するかまたは可撓性である。 【００８０】本発明は、多様な標的分子を標識するのに
使用してもよい。標的は本質的に、新規標識試薬の反応
性基との炭素−炭素結合形成に参加することができる化
学残基を含有するか、または標的は、そのような基を含
むように修飾されてもよい。新規標識試薬の反応性基と
結合することができる化学残基または標的分子の例に
は、特に限定されないが、アルケン、アルキン、金属−
有機化合物、およびハロゲン化化合物がある。金属−有
機化合物とハロゲン化化合物は、芳香族、複素環、アル
ケンおよびアルキン基、ならびにこれらの種々の組合せ
を含むことができる。本発明で使用可能な標的分子に
は、特に限定されないが、ヌクレオチド、オリゴヌクレ
オチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、オリゴペプチ
ド、タンパク質、リガンド、合成化合物、合成ポリマ
ー、糖、多糖、脂質およびホルモンがある。これらの化
合物により標識可能なヌクレオチドには、特に限定され
ないが、１リン酸、２リン酸、または３リン酸がある。
これらは、リボヌクレオチドでもデオキシヌクレオチド
でもよい。前記のいずれかの修飾ヌクレオチドまたはヌ
クレオチド類似体も、所望であれば使用することができ
る。修飾ヌクレオチドの例には、特に限定されないが、
ジデオキシヌクレオチド、および３’アミノ基または
３’リン酸塩基を有するヌクレオチドがある。ヌクレオ
チド類似体の例には、特に限定されないが、ペプチド核
酸、アラビノシド、およびアシクロ物がある。これらの
類似体は、ヌクレオチドとして、またはオリゴヌクレオ
チドもしくはポリヌクレオチドの成分として使用しても
よい。標識オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド
の合成は、新規標識試薬により標識されたヌクレオチド
を使用して行うことができる。あるいは、新規標識試薬
との炭素−炭素結合形成に使用できる化学基を有する修
飾ヌクレオチドを使用して、オリゴヌクレオチドまたは
ポリヌクレオチドを合成してもよい。この方法では、オ
リゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド生成物中の反
応性基の存在が、以後の本発明の新規標識試薬との反応
を可能にする。さらに、非修飾オリゴヌクレオチドおよ
びポリヌクレオチドを、炭素−炭素結合形成に参加でき
る基を含むように、化学的に処理してもよい。 【００８１】所望の標的分子への本発明の新規標識試薬
の結合は、当該分野で公知の種々の方法のいずれかを使
用して行うことができる。例えばアセトキシ水銀化反応
は、ピリミジン環の５位またはデアザプリン環のＣ−７
位に、共有結合した水銀原子を導入するための、公知の
確立された方法である（デール（Dale）ら、(1975) Bio
chemistry 14:2447-2457、(1973) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 70:2238-2242）。ヌクレオチドは、酢酸水銀
（II）で処理されて水銀塩に変換される。Ｋ2ＰｄＣｌ4
の存在下で、末端２重結合を用いて調製された本発明の
標識試薬を添加すると、ヌクレオチドの芳香環と標識試
薬の２重結合の末端炭素との間で炭素−炭素２重結合が
形成され、こうして標識物がヌクレオチドに結合され
る。リンカーの末端に２重結合を有するシアニン色素の
新規標識試薬の場合、ヌクレオチド水銀が、シアニン色
素残基の２つの環の間の芳香環または結合２重結合では
なく、リンカーの末端の２重結合と反応する。 【００８２】前記反応の別の用途において、反応性基が
水銀塩である本発明の新規標識試薬を調製することがで
きる。これで、この化合物は、標識することが好ましい
標的上の不飽和結合と反応することができる。この結合
は、標的分子の固有の部分であっても、またはそのよう
な基を含むように標的分子を修飾してもよい。例えばラ
ロック（Larock）（1982、前述、Eqns. 146-151）は、
それぞれ構造Ｒ1−Ｃ＝Ｃ--ＨｇＣｌを有する２つの基
が、適切な触媒の存在下でいかに結合することができる
かを記載している。 【００８３】水銀およびパラジウム触媒の付加反応の１
つの利点は、必要であれば溶解度を上げるために少量の
有機溶媒を加えた水の中で反応を実施できることであ
る。この方法は、任意の型のヌクレオチド、例えばリボ
ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ジデオキシヌク
レオチド、および任意の類似体、ならびにオリゴヌクレ
オチド、オリゴヌクレオチド類似体、タンパク質核酸複
合体、およびポリヌクレオチドを用いて行うことができ
る。あるいは、末端３重結合を有する反応性アーム、ま
たは標的分子と炭素−炭素２重結合を形成することがで
きる任意の他の分子を用いて、新規標識試薬を調製する
ことができる。 【００８４】２．炭素−炭素結合形成によるタンパク質
の標識 新規標識試薬の重要な用途はまた、タンパク質にシグナ
ル基を結合させることである。この具体的なケースで
は、タンパク質が、前記の核酸標的に似るように、タン
パク質を修飾することができる。例えば、標的タンパク
質を酢酸水銀（II）と反応させて、タンパク質のチロシ
ン、トリプトファンまたはフェニルアラニン残基で、化
合物を水銀化することができる。これで、タンパク質
は、２重結合反応性基を有する新規標識試薬との反応に
使用することができ、水銀が置換されて標識が結合す
る。所望であれば、２，２’−ジピリジルジスルフィド
で処理してタンパク質中のチオール基を保護した後、水
銀化工程を行うことができる。 【００８５】一級アミンを有するアミノ酸はまた、新規
標識試薬で使用できるタンパク質上の部位である。例え
ば、チロシン基が欠如したタンパク質は、ボルトンハン
ター活性エステルで修飾して、チロシン基を一級アミン
に導入することができる。次に、これらを前記のように
使用することができる。あるいはタンパク質を、アクリ
ル酸活性エステルで修飾して、一級アミンを含有する残
基中に末端２重結合を導入することができる。この修飾
により、反応性基として水銀化合物を有する、本発明の
新規標識試薬とともに、タンパク質を使用することが可
能になる。 【００８６】３．炭素−炭素結合形成のための反応性基
を有する色素前駆体 炭素−炭素結合に参加するのに適したマーカーへの基の
結合は、マーカーの修飾により行うことができる。一
方、結合は、特定のマーカーを合成するのに使用される
中間体を用いて、行うことができる。例えば、シアニン
色素標識試薬は以下の構造を有する： （式中、ｎ＝１、２または３である；Ｘ１とＸ２は、
Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ2 またはＣ（ＣＨ3）2であり、Ｒ1 〜
Ｒ8 は、シアニン色素を所望の標的分子に結合するのに
使用される反応性基を含む）。シアニン色素は、２つの
インドレニン前駆体単位を介在不飽和鎖と連結すること
により、調製できる。鎖を構成する単位の具体的な数
は、シアニン色素の具体的な吸収スペクトルと発光スペ
クトルを決定する。 【００８７】本発明の方法において、シアニン色素は、
シアニン色素の前駆体であるインドレニンに、炭素−炭
素結合を生成することができる反応性基を含有するリン
カーアームを結合させることにより、調製することがで
きる。この修飾インドレニンは、新規化合物であり、介
在不飽和アルキル鎖を介して第２のインドレニン環に結
合して、前記構造を有するシアニン色素を合成する反応
の試薬として使用することができる。第２のインドレニ
ンは、第１のインドレニンと同じでも、リンカーアーム
および反応性基が欠如した非修飾物でもよい。同じ新規
インドレニン化合物を使用して、第２のインドレニン環
の性質と２つの環をつなぐ具体的な不飽和鎖に依存し
て、種々の異なるシアニン色素を作成することができ
る。この操作の結果として、前駆体環を結合することに
よりシアニン色素生成物が形成される時、これは、反応
性基を有するリンカーアームを含み、適当な標的分子に
結合する準備ができる。 【００８８】４．フェニル基の無い新規ローダミン色素 本発明の別の態様において、新しい色素およびその合成
手段が開示される。先行技術において、ローダミンの誘
導体は、一般的には色素と、ローダミンを所望の分子に
結合するのに使用される反応性基との間に、芳香族基を
有する。本発明において、色素をヌクレオチド上の塩基
に結合させるリンカーアームが、通常ローダミン上に存
在する芳香族基が欠く、ローダミン類似体を含む安定な
ヌクレオチドを合成することができることが開示され
る。そのようなヌクレオチドの取り込みは、ポリメラー
ゼにより許容されるものになり、従って修飾ヌクレオチ
ドは、非修飾ヌクレオチドと混合することなく使用でき
ることは、驚くべき結果である。従って、本発明は、以
下の新規ローダミン類似体を開示する： および （式中、Ｒは反応性基である）。 【００８９】５．剛性リンカーアーム 本発明の別の態様において、酵素的および化学的合成手
段において、修飾ヌクレオチドをより効率的に使用する
ことを可能にし、および／または、これらがポリヌクレ
オチドの一部である時、より効率的に機能することを可
能にする方法と組成物が開示される。本発明のある実施
態様において、標的分子と、マーカーまたは標識物を提
供するために加えられる基との間で、向上した指向性の
分離が行われる。本発明において、以下の式を有する新
規組成物が開示される： Ｔ----Ｌ----Ｍ および Ｒ----Ｌ----Ｍ 前記の略図において、Ｔはマーカーまたは標識物の結合
の標的であり、Ｒは、標的への結合のために使用される
反応性基であり、Ｍはマーカーまたは標識物である。 【００９０】本発明のある態様において、Ｌは、Ｍ残基
をＴ残基またはＲ残基に共有結合させる化学基であり、
１つ以上の以下の基を含む： 【００９１】アルケン基は、互いにシスまたはトランス
配置でもよく、炭素原子に結合した水素原子のみを含有
してもよく、またはこれらは置換されていてもよい。好
適なモードにおいて、前記の基の１つを、標的のすぐ近
くに結合させ、１つ以下の介在原子により分離し、また
は剛性の極性単位を介して標的に結合させることによ
り、指向性が得られる。 【００９２】本発明の別の態様において、Ｌは、Ｍ残基
をＴ残基に共有結合させる化学基であり、少なくとも２
つの連続的剛性極性単位を含む。 【００９３】本発明で使用される標的の例には、特に限
定されないが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポ
リヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、サイトカイ
ン、リガンド、ハプテン、抗原、および固体支持体があ
る。本発明で使用される固体支持体の例には、特に限定
されないが、ビーズ、試験管、プラスチックスライド、
ガラススライド、マイクロチップアレイ、ウェル、およ
びくぼみがある。 【００９４】本発明で使用される反応性基の例には、特
に限定されないが、イソチオシアネート、イソシアネー
ト、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ
−もしくはジ−ハロゲン置換ピリジン、モノ−もしくは
ジ−ハロゲン置換ジアジン、アジリジン、ハロゲン化ス
ルホニル、酸ハロゲン化物、ヒドロキシスクシンイミド
エステル、ヒドロキシ−スルホスクシンイミドエステ
ル、イミドエステル、グリオキザル基、アルデヒドアミ
ン、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基がある。また、
前記のように、炭素−炭素結合形成に参加することがで
きる基が含まれる。 【００９５】本発明において、剛性単位は、原子間の空
間的関係が比較的静的である、原子群として定義され
る。本発明において、２つの残基が連続として記載され
る時、残基は近接しているかまたは直接隣にある。さら
に、２つの連続的残基は、１つ以下の原子（すなわち、
単一の原子）により分離することができる。本発明にお
いて、剛性単位は、基本的に同じ型の原子を含む時、非
極性である。非極性剛性単位の例は、アルケン、アルキ
ン、不飽和環、部分飽和環、および炭素と水素のみを含
む完全に飽和した環である。 【００９６】本発明において、剛性単位は、少なくとも
２つまたはそれ以上の異なる原子を含有し、こうして電
荷を単位内に不均等に分布させる時、極性である。極性
に寄与する配置の例には、特に限定されないが、Ｎ、
Ｓ、Ｏ、Ｐまたはハロゲンに結合した炭素原子がある。
炭素に結合したヘテロ原子は、単独でも、または極性も
しくは荷電官能基の一部でもよい。後者の例には、特に
限定されないが、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ3 、−ＰＯ
4 、−ＣＯＯＨ、および−ＮＨ2 基がある。剛性単位
は、線形の、分岐した、または環状の骨格を含有するこ
とができる。環に結合した極性または荷電官能基をも含
む環型は、不飽和環、部分的不飽和環、および完全に飽
和した環でもよい。２つ以上のそのような極性剛性単位
のマルチマーは、剛性の伸長したアームを提供し、これ
は、標的分子とマーカーまたはシグナル生成残基との規
定された空間関係を生み出す。 【００９７】本発明において、非置換の複素環式芳香族
化合物は、環内の電子共有のために、非極性剛性単位で
あると考えられる。一方、環に結合した極性または荷電
官能基を含む置換複素環式芳香族化合物は、極性剛性単
位であると考えられる。 【００９８】本発明で有用な線形の極性剛性単位の例
は、特に限定されないが、ペプチド結合を含む残基であ
る。固有の剛性を有する環状極性単位の例は、特に限定
されないが、糖である。サブユニット間の相互作用から
得られる剛性を有する本発明で有用な基の例は、特に限
定されないが、電荷の反発がサブユニットの間の距離を
最大にする荷電成分である。陰性荷電した成分が使用さ
れる時、陰性荷電したポリヌクレオチド自体からの反発
もある。リンカーはまた、回転電荷を妨害する大きな側
鎖基を有するように設計され、こうして塩基とシグナル
または反応性基の関係に対して、別個の空間構造を維持
する。 【００９９】標的分子からの反応性基またはシグナル残
基の距離は、スペーサーを構成する剛性単位の数と性質
により決定されるであろう。従って、２つのペプチド結
合が後に続くアルケン結合を含む一連の３つの剛性単位
は、図１Ａに示すように、ヌクレオチドから直接離れて
シグナル基を延長させるであろう。この具体例は、非極
性剛性単位ならびに２つの極性剛性単位を含むであろ
う。一連の複数のペプチド結合は、図１Ｂに示すよう
に、標的分子からさらに離れるように色素またはマーカ
ーを伸長しながら、剛性を提供するであろう。この具体
例において、ウラシルヌクレオシドが標的として使用さ
れ、グリシンサブユニットは、一連のペプチド結合を提
供するのに使用される。所望であれば、異なるアミノ酸
を使用してもよく、ここで、剛性アームに溶解度または
電荷のような他の性質を付与するために、アミノ酸のＲ
基の種々の成分が選択される。 【０１００】全体の構造が剛性であるか否かについて、
剛性単位からなるリンカーは、剛性単位間の特定の関係
に依存するであろう。例えば、複数のペプチド結合が先
行技術で使用されている。しかし、そのような結合を有
する利点は、ペプチドの間に脂肪族炭素基を含めること
により失われた。基本的に、これらは、可撓性のリンカ
ーにより結合された剛性単位である。図１に示すよう
に、本発明は、剛性単位間の最大で１つの原子を可能に
し、こうして、剛性単位間の可撓性の程度を制限する。
同様に、所望の指向性に寄与する可能性を有しながら、
全体的剛性を維持する基の間で、非炭素性の他の基を使
用できるであろう。そのような基の例は、２つの剛性単
位間の−Ｓ−結合であろう。 【０１０１】前記したように、糖基もまた、本発明の実
施に使用される。個々の剛性単位として使用可能な広範
な糖があり、これらの糖が酵素的または化学的に連結さ
れる多くの方法が、文献に広く記載されている。 【０１０２】本発明は、２つ以上の極性剛性単位を使用
して剛性リンカーアームを作成するが、可撓性の基や非
極性剛性単位もまた、剛性リンカーアーム中に含めても
よいことを理解されたい。例えば図１は、ペプチド結合
とウラシル残基との間でアルケン結合を利用する。さら
に、リンカーの有効性を保持しながら、追加の可撓性単
位、剛性単位またはこれらの組合せが、図１で前記ペプ
チド結合と色素分子の間に含まれる。 【０１０３】本発明において、問題のある基は、酵素的
取り込みが起きる活性部位から空間的に排除されるた
め、ヌクレオチドから遠いそのような伸長結合の存在
は、取り込み時の有害な作用を減少させるはずである。
さらに、修飾ヌクレオチドが酵素的にまたは合成で取り
込まれた後に、本発明の使用により官能基が増加する。
例えば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドか
らのハプテンまたは化学的反応性基の伸長は、近づきや
すやを上昇させ、こうして結合効率を改善するはずであ
る。さらに、近接さのために妨害作用が引き起こされる
なら、本発明の使用により、シグナル生成基もまた、オ
リゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドから排除され
る。 【０１０４】本発明で記載したリンカー結合のための特
定の点は、可撓性リンカーについて前記した技術を利用
してもよい。すなわち、ヌクレオチドは通常のヌクレオ
チドでも、米国特許第４，７１１，９５５号、米国特許
第５，２４１，０６０号、米国特許第４，９５２，６８
５号、米国特許第５，０１３，８３１号（これらのすべ
ては、参照することにより本明細書に組み込まれる）に
記載のように、付加されたか、塩基、糖またはリン酸残
基中の成分を置換する種々の置換基を有する修飾ヌクレ
オチドまたはヌクレオチド類似体でもよい。さらに、こ
れらの修飾は、非破壊性、半破壊性または破壊性でもよ
い。結合点は、前記開示において、塩基、糖またはリン
酸でもよいが、本発明において塩基への結合が特に有用
である。 【０１０５】本発明のさらなる利点は、記載されたリン
カーの一部は、その化学ならびに構造のために、有利な
結果を与え得ることである。例えば、ペプチドサブユニ
ットからなるリンカー中の最後のペプチドは、アミン基
を与え、これは、シグナル残基のような有用な基を結合
するのに使用される。先行技術において、アミン基は脂
肪族鎖の末端に位置し、ｐＫ値は約１１である。しか
し、結合反応は通常約８のｐＨ値で行われるため、ある
時点で反応性型のアミン基はほとんど無く、従って反応
の効率と速度を制限する。これに対して、ペプチド鎖の
末端のアミン基はｐＨが約９であり、目的の結合反応に
より適合する。従って本発明は、適切な基へのヌクレオ
チドまたはポリヌクレオチドのより有効な結合を可能に
する。 【０１０６】また本発明のこの具体的な態様は、ヌクレ
オチドと色素の間に介在する剛性リンカーについて記載
されているが、他の応用も本発明の利点を享受できる。
例えば、タンパク質の標識は、タンパク質とシグナル残
基の間で、本発明の剛性アームを使用して改良すること
ができる。これらの利点を享受するタンパク質の例は、
特に限定されないが、抗体、酵素、サイトカイン、およ
びオリゴペプチドまたはポリペプチドのライブラリーが
ある。核酸について前記したように、本発明の使用は、
標識化合物の性質ならびに標識自体の効率を改良する。
さらに、固体支持体へのリガンド、ハプテン、タンパク
質または核酸の結合を含む多くの方法がある。そのよう
な支持体の例には、特に限定されないが、ビーズ、試験
管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラ
スチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、お
よびくぼみがある。本発明は、支持体の表面からリガン
ド、ハプテン、タンパク質または核酸の指向性分離を形
成するのに使用される。これらの利点を享受するタンパ
ク質の例は、特に限定されないが、抗体、酵素、サイト
カイン、およびオリゴペプチドまたはポリペプチドのラ
イブラリーがある。 【０１０７】６．非ピロール位に反応性基を有する非金
属性ポルフィリン 本発明の別の態様において、非ピロール位に反応性基を
有する非金属性ポルフィリンを含む新規標識試薬が開示
される。蛍光色素としての非金属性アルキル化ポルフィ
リンのスペクトル性質は、ヘンドリックス（Hendrix）
の米国特許第４，７０７，４５４号（参照することによ
り本明細書に組み込まれる）に記載されており、ここで
１５０nmを超えるストークスシフトが開示された。しか
し、ポルフィリンの反応性基を記載する時、開示された
唯一の教示は、ピロール位の化学基を利用した。従っ
て、８個のピロール位のいずれかまたはすべてに、水
素、脂肪族、不飽和脂肪族、環状、複素環、芳香族、複
素環式芳香族、荷電または極性基を独立に含み、反応性
基を結合するための部位として非ピロール位置の１つを
使用する非金属性ポルフィリンを得ることができること
が、本発明の主題である。この組成物は以下の構造を有
する： （式中、Ｒ0 は、ポルフィリンの非ピロール位置（すな
わち、α、β、γ、またはδ位）に、直接または間接に
結合した反応性基を含み、Ｒ1 〜Ｒ8 は、前記で定義し
たものである）。 【０１０８】既に記載した反応性基のいずれかも、Ｒ0
として本発明で使用できる。Ｒ1 〜Ｒ8 は同じ基を含ん
でも、あるいはこれらは異なってもよい。所望であれ
ば、アルキル基はまた、ポルフィリンの水溶性の上昇を
助ける極性または荷電基をさらに含んでよい。また所望
であれば、ポルフィリンに反応性基を結合させるのにリ
ンカーが使用される。本発明のこの態様で使用される具
体的な剛性アームは、既に開示または記載された任意の
リンカーアームでもよいが、本発明の剛性リンカーの使
用が特に好ましい。ファーホップ（Fuhrhop）とスミス
（Smith）”Laboratory Methods” 第１９章の Porphyr
ins and Metalloporphyrins、ケビン・エム・スミス（K
evin M. Smith）編、エルスビアサイエンティフックパ
ブリッシングカンパニー（Elsevier Scientific Publis
hing Company）、アムステルダム、１９７５年（参照す
ることにより本明細書に組み込まれる）に記載のよう
に、非ピロール位置にニトロ基を付加することができ
る。この基をアミンに還元することは、当該分野で公知
であり、さらに、標準的方法によりリンカーまたは反応
性基を付加する反応を行うことができる。 【０１０９】前記の任意の標的を、本発明の非金属性ポ
ルフィリンで標識してもよい。例えば、本発明の非金属
性ポルフィリンは、ポルフィリン標識ヌクレオチドの取
り込みにより、またはポルフィリン標識ホスホラミダイ
トにより合成的に、使用できる。あるいは合成後の工程
で、非金属性ポルフィリンの化学的適合性誘導体との反
応に適した、誘導体化ヌクレオチドを有するオリゴヌク
レオチドまたはポリヌクレオチドを合成することができ
る。本発明の非金属性ポルフィリンを含む標識オリゴヌ
クレオチドおよびポリヌクレオチドは、高効率発光を有
する大きなストークスシフトを有するはずである。この
組成物と検出法は、高レベルの感度を有し、同じ波長で
励起される他の化合物からの高レベルの区別を可能にす
るであろう。例えば、転写体のライブラリーをフルオレ
セインで標識し、第２のライブラリーをオクタエチルポ
ルフィンで標識するなら、４９０nmの単一波長で照射す
ることができる。しかし、フルオレセインの発光ピーク
が５３０nmであり、オクタエチルポルフィリンの発光ピ
ークが６２０nmであるため、この具体的な蛍光物質間の
区別は容易である。同時に、オクタエチルポルフィリン
の量子収率がフルオレセインの発光ピークに匹敵する。
また、非金属性ポルフィリンは、本明細書に開示の他の
任意の新規方法とともに使用されることを理解された
い。 【０１１０】７．結合および／または電子非局在化系に
参加する基による色素の修飾 本発明の他の実施態様において、中間体中にケトン基が
存在する必要無く、フルオレセイン色素に付加された２
つ以上の不飽和化合物を含む新規組成物の合成法が開示
される。本発明においてこれらの不飽和化合物は、不飽
和脂肪族基、不飽和環状化合物、不飽和複素環式化合
物、芳香族基、またはこれらの任意の組合せでもよい。
そのような基の結合は、これらが、色素の結合および／
または電子非局在化系（モールディング（Maulding）と
ロバーツ（Roberts）、前述、参照することにより本明
細書に組み込まれる）に参加することを可能にし、色素
のスペクトル特性に変化を与える。これらの変化には、
励起ピークと発光ピークの幅の変化、励起ピークと発光
ピークの位置の移動、および量子収率の上昇がある。 【０１１１】色素に不飽和基を付加すると、溶解度が低
下し、非特異的疎水性相互作用が起きるため、荷電また
は極性基をさらに添加することにより、この作用を補償
することが本発明の目的である。これらは、色素または
不飽和化合物に結合してもよい。またこれらの新規色素
は、標識試薬として使用できるため、これらはまた、標
識物を所望の標的分子に結合させるのに適した反応性基
を含んでもよい。反応性基は、直接または間接に、色
素、不飽和化合物、または荷電もしくは極性修飾基に結
合できる。 【０１１２】本発明のこの態様の新規化合物は、以下の
構造を有する： Ｒ−Ｄｙｅ （式中、Ｄｙｅは蛍光色素であり、Ｒは、Ｄｙｅに共有
結合し、Ｒは、不飽和脂肪族基、不飽和環状化合物、不
飽和複素環式化合物、芳香族基、またはこれらの組合せ
でよい２つ以上の不飽和化合物を含む）。さらに、Ｒの
１つ以上のメンバーは、Ｄｙｅの結合および／または電
子非局在化系に参加する。不飽和化合物は、置換されて
も非置換でもよい。不飽和脂肪族基は、アルケンまたは
アルキンを含むことができる。芳香族基は、フェニル
基、アリール基、または芳香族複素環を含むことができ
る。基が置換される時、置換基は、特に限定されない
が、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、フェノキ
シ基、ヒドロキシル基、アミン、アミノ基、アミド基、
カルボキシル基、スルホン酸塩、スルフヒドリル基、ニ
トロ基、リン酸塩、または色素の性質を改良できる任意
の基を含む。芳香族基の場合、これは、縮合環構造の一
部であることにより、置換されてもよい。そのような縮
合環の例は、特に限定されないが、ナフタレン、アント
ラセン、およびフェナントレンを含む。 【０１１３】Ｒのすべてまたは一部として使用可能な基
はまた、以下のように記載される： 【０１１４】前記略図において、Ａｒは、不飽和環状化
合物、不飽和複素環式化合物、または芳香族基である。
前記したように、前記の基は置換されても非置換でもよ
い。 【０１１５】本発明で使用される蛍光色素には、特に限
定されないが、アントラセン、キサンテン、シアニン、
ポルフィリン、クマリンおよび複合色素がある。アント
ラセンが、中央の環に結合したアルキンとアルキンに結
合したフェニル基ともにＤｙｅとして使用される場合、
フェニル基は置換されるであろう。 【０１１６】本発明の別の態様において、新規組成物は
以下の構造を有する： （式中、ＲとＤｙｅは前記したものであり、Ｒ1 は、
Ｒ、Ｄｙｅ、またはＲとＤｙｅの両方に共有結合してい
る）。Ｒ1 はさらに、１つ以上の荷電または極性基を有
して、さらなる溶解性を与える。これは、色素またはＲ
修飾を有する色素の水への溶解度が限定されているか、
または非特異的疎水性相互作用に問題がある時、有用で
あろう。 【０１１７】本発明の別の態様において、新規組成物は
以下の構造を有する： （式中、Ｒ、ＤｙｅおよびＲ1 は前記したものであり、
Ｒ2 は、Ｒ、Ｄｙｅ、Ｒ 1 またはこれらの任意の組合せ
に共有結合しており、Ｒ2 はさらに、色素を適当な標的
分子に結合するのに使用できる反応性基を含む）。Ｒ2
は、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、およびアミン
基を含む前記した反応性基、スルフヒドリル基、ヒドロ
キシル基、およびアミン基と反応することができる基、
および炭素−炭素結合を形成することができる基の任意
のものを含む。Ｒ2 はさらに、色素から反応性基を分離
するリンカーアームを含む。リンカーアームは、任意の
所望の長さであり、炭素ならびに非炭素原子の骨格を含
む。使用可能な非炭素原子には、特に限定されないが、
イオウ、酸素、および窒素がある。リンカーアームは、
飽和、不飽和、または芳香族基を含み、また前記の剛性
アームを含んでよい。 【０１１８】本発明の別の態様において、新規の標識さ
れた標的は以下の構造を含む： （式中、ＲとＤｙｅは前記したものである）。本発明で
使用される標的には、特に限定されないが、タンパク
質、ペプチド、核酸、ヌクレオチドまたはヌクレオチド
類似体、受容体、天然のもしくは合成薬剤、合成オリゴ
マー、合成ポリマー、ホルモン、リンフォカイン、サイ
トカイン、トキシン、リガンド、抗原、ハプテン、抗
体、炭水化物、糖、またはオリゴ−もしくは多糖があ
る。標識された標的はまた、Ｒ、ＤｙｅまたはＲとＤｙ
ｅの両方に共有結合したＲ1 を含むことができる。Ｒ1
はさらに、溶解性を与えるための１つ以上の荷電または
極性基を含む。これは、標識された標的または標識され
た標的を作成するために使用される中間体の水への溶解
度が限定されているか、または非特異的疎水性相互作用
に問題がある時、有用であろう。標識された標的はま
た、前記リンカーアームをさらに含むことができ、色素
を標的から分離する。 【０１１９】８．インターカレーター 本発明の別の態様において、結合しないままの色素と比
較して標的に結合した挿入結合性色素の区別を増強する
新規方法が開示される。前記したように、臭化エチジウ
ムは、多くのフォーマットにおいてＤＮＡの検出と視覚
化のための一般的な試薬である。核酸への親和性に対す
る第２のフェナントリジニウム環系の作用を調べるため
に、ホモダイマー型の臭化エチジウムのを合成し、試験
した（クールマン（Kuhlmann）ら、(1978) Nucleic Aci
ds Research 5:2629-2633）。この化合物Ｎ，Ｎ−ビス
［３−（３，８−ジアミノ−５−メチルフェナントリジ
ニウム−６−イル）ベンゾイル］１，５−ジアミノペン
タンジクロリド（メタ−ＥｔｈＤ）は、核酸に対してモ
ノマー型よりはるかに高い親和性を示した。しかし、４
９３nmの標準的波長で蛍光を測定すると、核酸への結合
後の蛍光発光の上昇は、基本的にすでに臭化エチジウム
モノマーで見られたものと同じであった。 【０１２０】メタ−ＥｔｈＤを標準的フォーマットとは
異なる方法で使用した時、結合型と非結合型の区別の大
幅な増強が観察されたことは、驚くべきかつ予想外の結
果であった。本発明は、２つの臭化エチジウム分子がそ
のフェニル基を介して結合される時、試料を４９３nmで
励起した時見られた６倍の上昇に対して、４００nm以下
の波長で励起すると、ホモダイマーへのＤＮＡの結合に
より１５０倍を超える蛍光発光の上昇が見られたことを
開示している。 【０１２１】２つの他のホモダイマー臭化エチジウム化
合物（ＥｔｈＤ−１とＥｔｈＤ−２）は、モレキュラー
プローブズインク（Molecular Probes, Inc.）（ユージ
ーン（Eugene）、オレゴン州）から販売されている。し
かし、メタ−ＥｔｈＤで得られた結果とは異なり、結合
と非結合色素との区別は、４００nm未満の波長で励起し
てもあまり変化しなかった。メタ−ＥｔｈＤ、ＥｔｈＤ
−１およびＥｔｈＤ−２はすべて臭化エチジウムダイマ
ーであるが、これらは化学的に異なることを指摘した
い。（図２）に示すように、メタ−ＥｔｈＤは、アミド
結合によりフェニル環のメタ位置を介して結合した２つ
のフェナントリジニウム環からなる。これに対して、Ｅ
ｔｈＤ−１とＥｔｈＤ−２ダイマーのフェナントリジニ
ウム環は、フェニル環ではなく中央の環の窒素を介して
結合している。介在鎖は、ＥｔｈＤ−１中で２級であ
り、メチル化されてＥｔｈＤ−２の４級塩を与える２つ
のアミン結合基を有するアルキル鎖からなる。ＥｔｈＤ
−１とＥｔｈＤ−２化合物がメタ−ＥｔｈＤで見られた
結果と同じ結果を示すことができないことは、本発明の
方法が、エチジウムダイマー自体の予測可能な性質では
ないことを証明している。 【０１２２】本発明の方法は、臭化エチジウム、臭化エ
チジウムホモダイマー、および他のインターカレーター
についてこれまで記載されている多くの方法で使用でき
る。特に、核酸増幅とメタ−ＥｔｈＤで標識されたプロ
ーブのリアルタイム分析に対する本発明の応用は、有用
である。４００nm以下の波長での照射後の蛍光の大きな
上昇は、従来法より大きなシグナル対ノイズ比を可能に
するであろう。従って、本発明は、そのような増幅法に
おいて核酸合成の検出のためのより高い感度を享受す
る。 【０１２３】先行技術において臭化エチジウムはまた、
中央の環を介して他のインターカレーターの結合（米国
特許第５，６４６，２６４号）およびインターカレータ
ーの断片（米国特許第５，５８２，９８４号および米国
特許第５，５９９，９３２号）により修飾され、２本鎖
ＤＮＡへの結合性能が改良されている。米国特許第５，
５８２，９８４号に開示されたものと類似の修飾基が、
臭化エチジウムの中央の環に付加されて、ＲＮＡを用い
る性能が改良されている（米国特許第５，７３０，８４
９号）。メタ−ＥｔｈＤで得られた結果を考慮すると、
米国特許第５，６４６，２６４号；５，５８２，９８４
号；５，５９９，９３２号；および５，７３０，８４９
号（これらはすべて、参照することにより本明細書に組
み込まれる）中の修飾はまた、結合部位として中央の環
をフェニル環で置換することにより、新規化合物を合成
するのに使用されることが開示される。これらはまた、
臭化エチジウム、臭化エチジウムダイマー、臭化エチジ
ウムヘテロダイマー、修飾臭化エチジウム組成物、およ
び他のインターカレーターについて従来記載された多く
の応用で使用される。 【０１２４】９．新規化学発光試薬 本発明の他の実施態様において、新規１，２−ジオキセ
タン化合物が開示され、これは選択された酵素の基質と
して使用されると、芳香環の異なる部位に結合した２つ
の基の間の分子内反応が起き、化学発光シグナルが生成
する。本発明の別の態様において、新規１，２−ジオキ
セタン化合物が開示され、これは、分解性酵素より修飾
酵素の基質であり、修飾により化学発光シグナルが生成
する。 【０１２５】ａ．環上の異なる部位に結合した２つの基
の間の酵素依存性相互作用 本発明の別の態様において、環の異なる部位に結合した
２つの基を含む新規１，２−ジオキセタンが開示され、
ここで、適切な酵素による触媒後に、試薬は分子内反応
を受け、化学発光シグナルが生成する。本発明のこの態
様の試薬は以下の構造を有する： （式中、Ｑは、ジオキセタンの片側に位置するシクロア
ルキルまたはポリシクロアルキル基であり、Ｒ1 とＲ2
は、１，２−ジオキセタンの反対側に結合した環の異な
る部位に位置する）。Ｚは、水素、アルキル、アリー
ル、アルカリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、
シクロアルキル、またはシクロへテロアルキル基を含ん
でよい。好適な実施態様においてＱは、アダマンチル基
を含む。別の好適な実施態様において、Ｒ1 とＲ2 が結
合した２つの部位は、芳香環上で互いに隣接している。
Ｒ1 は、酵素活性の基質である化学基を含む。適切な酵
素の存在下で、Ｒ1 は、Ｒ1 *（これは、化学的反応性基
Ｇ１を含む）に触媒的に変換される。Ｒ2 は、酸素原子
を介して環に結合し、Ｒ1 からＲ1 *への変換により産生
されるＧ１基と相互作用できる化学基Ｇ２を含む。環に
より付与される剛性のために、Ｇ１はＧ２に極めて近接
しており、従って好ましい速度で相互作用を引き起こ
す。この相互作用により、不安定なジオキセタンが生成
され、こうして化学発光が発生する。 【０１２６】Ｒ2 は、脂肪族基、置換脂肪族基、芳香族
基、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。
Ｒ2 が置換脂肪族基を含む場合、置換基は、ハロゲン、
硝酸塩、イオウまたは亜硝酸塩でもよい。脂肪族基は、
１つの位置またはいくつかの位置で置換されてもよい。
各位置の置換基は、同じでも異なってもよい。 【０１２７】前記したように、Ｒ1 からＲ1 *への酵素的
変換後、化学的反応性基Ｇ１が形成される。Ｇ１の一部
として使用される化学反応性原子には、特に限定されな
いが、窒素、イオウ、または酸素がある。本発明で使用
される酵素には、特に限定されないが、アミダーゼ、エ
ステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、酸性および
アルカリ性ホスファターゼ、脱炭酸酵素、リパーゼ、グ
ルコシダーゼ、キシロシダーゼ、トリプシン、およびキ
モトリプシンがある。Ｒ1 の成分として使用される酵素
基質には、特に限定されないが、アミド、エステル、リ
ン酸塩、カルボン酸、脂肪酸、グルコース、キシロー
ス、フコースまたはアミノ酸がある。 【０１２８】必須ではないが、Ｒ1 はまた、Ｒ1 からＲ
1 *への酵素的変換後、Ｇ１とＧ２との相互作用が、基本
的に安定なコンフォメーションであることが公知の５員
環または６員環を作成するように、設計される。そのよ
うな中間体生成の例は、以下のように、Ｒ2 の芳香環へ
の結合として酸素を使用して証明される：【０１２９】上記したように、中間体構造は、内部置換
反応を受け、これはＧ２基をＲ1 *残基のＧ１基に移動
し、こうして酸素を放出し、不安定なフェノキシイオン
を形成して、不安定な型のジオキセタンとし化学発光シ
グナルを産生する。剛性構造のセグメント上に各基を配
置することにより引き起こされるＧ１とＧ２基の並置
は、効率的な相互作用と以後の置換および転位を可能に
して、酵素活性によるＧ１の産生後に光発生性中間体を
生成する。 【０１３０】ｂ．修飾酵素から得られる化学発光生成 本発明の別の態様において、化学発光シグナルの分解と
産生に開始させる作用は、構造の特異的な基の酵素修飾
である、新規１，２−ジオキセタン誘導体が開示され
る。これは、開始作用が置換基の切断である以前の例と
は正反対である。好適なモードにおいて、置換基の修飾
は、酵素反応に依存する。そのような組成物の例は、以
下により与えられる： 【０１３１】上記略図において、ＱとＺは既に記載した
ものであり、Ｒは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓまたは他の任意の必
要な原子からなる原子鎖を含む。Ｒはまた、飽和または
不飽和基を含む。さらにＲ’は、特に限定されないが、
アルコールまたはカルボキシル基を含む。光産生反応に
至る修飾反応には、特に限定されないが、酸化と還元が
ある。本発明のこの態様で使用される酵素には、特に限
定されないが、オキシダーゼとリダクターゼがある。 【０１３２】末端アルコールを含むジオキセタン誘導体
が、アルコール脱水素酵素の作用により酵素的にアルデ
ヒドに変換される、このプロセスの代表例を以下に示
す。 【０１３３】次に、生じる生成物はβ脱離を受け、これ
は次に、不安定なフェノキシドイオンを形成させ、これ
が１，２−ジオキセタンの分解を開始させ、化学発光シ
グナルが生成される。 【０１３４】１０．リアルタイムシグナル生成 本発明は、別個の核酸または複数の配列のライブラリー
を標識するために使用可能な、シグナル生成法を開示す
る。本発明は、目的のアナライトを他の核酸配列の存在
下で、特異的に標識するための方法と組成物を提供す
る。本発明はまた、さらなる核酸合成のためにそのよう
な核酸を使用する過程で、目的の核酸の存在および／ま
たは量の検出に使用してもよい。これは、合成後分析、
またはそのような合成過程のリアルタイム分析により行
われる。本発明において、エネルギー移動対の少なくと
も１つの第１の要素と、エネルギー移動対の少なくとも
１つの第２の要素とを含む核酸が合成される。第１のエ
ネルギー移動要素がエネルギードナーとして作用するこ
とができる時、第２のエネルギー移動要素はエネルギー
移動アクセプターとして作用することができる。逆に、
第１の要素がエネルギー移動アクセプターであり、第２
の要素がエネルギードナーでもよい。この第２の要素
は、第１の要素を含む同じ核酸鎖中に取り込まれるか、
または核酸鎖に結合することにより、第１の要素と結合
する。核酸合成または結合が無い時、ドナーからアクセ
プターへのエネルギー移動はほとんどまたはまったく無
い。しかし適切な設計により、本発明は、核酸合成中ま
たは合成後の、ドナーからアクセプターへのエネルギー
移動を可能にする。 【０１３５】本発明の種々の実施態様は、標識プライマ
ー、プローブ、ヌクレオチド、核酸結合物質、および固
体支持体を、エネルギー移動要素の供給源として使用す
る。本発明において、プローブとプライマーは、プライ
マーが伸長可能な追加の性質を有するという条件下で、
相補配列に結合する共通の特徴を有する。核酸構築体は
また、本発明においてプライマー、プローブまたは鋳型
として使用される。本発明において、核酸構築体は、目
的の核酸のすべてまたは一部と同一または相補的な配列
を有する核酸を含み、少なくとも１つの非天然のまたは
人工的要素をさらに含んでよい。 【０１３６】核酸構築体を含む非天然のまたは人工的要
素の例は、特に限定されないが、プロモーター配列、捕
捉配列、本体タグ配列、共通配列、タンパク質結合配
列、人工的プライマー結合配列、修飾ヌクレオチド、ヌ
クレオチド類似体、非塩基部位、標識物、リガンド、ペ
プチドおよびタンパク質を含む。さらに核酸構築体は、
アナライトを含有してもよい。これらは、元々のアナラ
イト自体またはそのコピーでもよい。これらは、染色
体、エピソームまたはこれらの断片から得ることができ
る。エピソームの例には、特に限定されないが、プラス
ミド、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、およびウ
イルスがある。 【０１３７】ａ．標識プライマー間のエネルギー移動 本発明のある実施態様において、第１と第２のエネルギ
ー移動要素は、適切な核酸の存在下で伸長できる、少な
くとも２つのプライマーまたは核酸構築体の成分であ
る。これらのプライマーまたは核酸構築体の少なくとも
１つは、目的の核酸の一部に存在する配列に相補的な配
列を含むであろう。少なくとも１つの他のプライマーま
たは核酸構築体は、目的の核酸の別の一部に存在する配
列と同一の配列を含むであろう。こうして、目的の核酸
を、プライマーまたは核酸構築体の結合と伸長のための
鋳型として使用することができる。伸長したプライマー
の標的からの分離または排除は、標的鎖が別のプライマ
ー結合／伸長に使用されることを可能にする。さらに、
その伸長したプライマー自体は、プライマー結合／伸長
に使用することができる。従って、互いにハイブリダイ
ズした２つの伸長したプライマーを含む生成物が作成さ
れるであろう。本発明のこの態様において、前記の連続
的プライマー結合／伸長に使用されるプライマーは、第
１のエネルギー移動要素または第２のエネルギー移動要
素を含む。各鎖のプライマーが互いに充分近いなら、こ
れらは、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動を
可能にするであろう。この工程は、２本鎖標識核酸を作
成するのに使用することができる。診断目的で特に有用
なことは、この工程により発生するシグナルの程度を使
用して、鋳型として使用される特定の核酸を存在と量を
同定できることである。 【０１３８】シグナル量はまた、増幅法の導入により増
加させることができる。例えば、所望の核酸標的の各鎖
についてのプライマーの使用は、各プライマーの鎖伸長
がさらなる合成のための鋳型を生成させる、多くの標的
増幅法の基礎である。これらの方法は、ＰＣＲ（米国特
許第４，６８３，２０２号）で使用されるように分かれ
た工程に依存するか、またはＳＤＡ（米国特許第５，２
７０，１８４号と５，４５５，１６６号）およびループ
介在増幅（米国特許出願第０９／１０４，０６７号；お
よびヨーロッパ特許出願ＥＰ０９７１０３９Ａ）（これ
らのすべては参照することにより本明細書に組み込まれ
る）のような連続的等温法でもよい。すなわち本発明
は、適切な核酸の合成量の合成後評価のために使用でき
るが、これはまた増幅中に起きる複数の合成工程（すな
わち、リアルタイム分析）で使用することもできる。増
幅は、標識プライマーの非存在下で使用されるものと同
じ条件下で行われるか、またはシグナル生成の効率また
は選択性を上昇することができる追加の工程を含めても
よい。例えば、等温反応のリアルタイム分析のために、
連続的にまたは選択された間隔でモニタリングが行われ
る。後者の方法では、追加の工程が行われ、分析のため
に試料が採取されるか、または特定の状態でシグナル生
成または読みを促進するが、反応の継続を実質的に妨害
しない熱工程が導入される。 【０１３９】先行技術では、診断目的の２本鎖合成核酸
産物のプライマー位置の設計は、各鎖のプライマーが充
分離れて位置し、そのため、これらの間に追加の配列
（これは、プローブを用いるハイブリダイゼーションま
たは制限酵素による性状解析に使用できる）を取り込む
ことができるようにすることである。すなわち、２本鎖
合成核酸産物の配列は、２つの起源から得られる。第１
に、プライマーから得られる固有の配列とその相補体が
ある。これらは、鋳型として使用される特定の標的セグ
メントに非依存性に存在する。第２に、プライマーセグ
メント間の配列がある。これらは、核酸合成の鋳型とし
て使用される特定の核酸セグメントの性質に、完全に依
存するであろう。増幅反応に使用されるプライマーの設
計の本質、反応条件、および試料中の特定の核酸配列に
依存して、特定の所望の配列のみが合成されるか、また
は他の所望ではない配列も合成される。診断目的には、
プライマー間のセグメントは、所望の配列のみの存在と
量に依存するであろうシグナルを生成するための標識プ
ローブの標的として使用されている。 【０１４０】本発明のこの具体例において、プローブは
増幅産物の検出のために使用されないため、プライマー
セグメント間の伸長配列の要件は不要となる。実際、本
発明は、アンプリコンの各末端のプライマー間の近接性
が、シグナル生成の新規手段のために使用される、好ま
しい配置であることを開示する。１つの標的鎖のプライ
マーに第１の要素を導入し、相補的標的鎖のプライマー
に第２の要素を導入することにより、各要素が異なる鎖
の上にあっても、２本鎖アンプリコン中のこれらのプラ
イマーの近接性が、ドナーとして作用する要素からアク
セプターとして作用する要素へのエネルギー移動が起き
ることを可能にする。 【０１４１】前記したように、取り込まれたプライマー
を有する２本鎖アンプリコンを与える一連のプライマー
伸長反応に基づく種々の増幅系は、本発明のこの実施態
様を享受することができるであろう。例えば図３は、
ａ）ＰＣＲとｂ）ＳＤＡの増幅産物候補を示す。これら
の増幅法に使用できる方法の詳細は、これらの各方法に
ついての元々の特許を含む多くの刊行物に見られる（ム
リス（Mullis）ら、米国特許第４，６８３，２０２号、
およびウォーカー（Walker）ら、米国特許第５，２７
０，１８４号と５，４５５，１６６号；参照することに
より本明細書に組み込まれる）。これらの方法は異なる
原理を使用するが、２本鎖核酸の各鎖中の標識プライマ
ーまたは核酸構築体の存在は、本発明の使用を可能にす
る。さらに、既に開示されている他の方法も本発明で使
用でき、マルチプライマー増幅（米国特許出願第０８／
１８２，６２１号；１９９４年１月１３日出願；０９／
３０２，８１６号、１９９８年３月３１日出願；および
０９／３０２，８１８号、１９９８年２月３日；および
０９／３０２，８１７号、１９９９年４月１６日出
願）、および逆オリゴヌクレオチドを用いる増幅（米国
特許出願第５，４６２，８５４号）（これらのすべて
は、参照することにより本明細書に組み込まれる）があ
る。 【０１４２】既に記載されているように、本発明のこの
実施態様は、各鎖上のプライマーまたは核酸構築体の間
の近接性に依存する。第１のプライマーまたは核酸構築
体から作成された伸長鎖について、これは、相補鎖を合
成するための、取り込まれた第１のプライマーまたは核
酸構築体から得られるセグメントと、第２のプライマー
または核酸構築体の結合部位として使用できるセグメン
トとの近接性であるとも説明される。例えば、伸長鎖上
で互いにすぐ隣接するこれらの２つのセグメントを有す
ることにより、近接性は達成される。そのような場合、
伸長鎖の核酸配列は、完全にタンパク質または核酸構築
体の配列およびその相補体から得られるであろう。これ
をより明瞭に説明するために、本発明で使用される可能
なプライマー配置を有する任意の配列を図４に示す。図
４（Ａ）において、プライマー用に選択された配列は、
各鎖上で互いに隣接している。あるいは、増幅産物中で
ドナーとアクセプター間がエネルギー移動のために充分
近接していれば、プライマーセグメントとプライマー結
合セグメントとの間に空隙があってもよい。同じ標的配
列を使用するより長い間隔の例を、図４（Ｂ）に示す。 【０１４３】シグナル生成の新規な系を可能にする以外
に、プライマー結合領域以外はあまり含まないようにア
ンプリコンサイズを低下させることは、より伝統的な長
いアンプリコンに対して利点を与えることに注意された
い。これらには、合成の量が最小になるため、各増幅ラ
ウンドでのより短い伸長時間、狭い融点、および全体的
高効率がある。また適切なエネルギー移動要素と検出系
の選択は、複合増幅が、２つ以上の標的配列を追跡する
ことを可能にする。 【０１４４】適切な標的配列の存在下では、より多くの
標識されたプライマーが２本鎖核酸中に取り込まれるた
め、シグナル生成が増加する。このシグナル生成は、試
料中の適切な標的分子の存在に、特異的でありかつ比例
する。すなわち、各要素は、別個のプライマーまたは核
酸構築体上に位置するため、核酸合成の非存在下では、
ドナーとアクセプター分子間にほとんどまたはまったく
エネルギー移動が無い。第２に、適切な標的鋳型の非存
在下では、シグナル生成を、核酸合成がほとんどまたは
まったく起きない反応条件下で行うことができる。これ
を行う１つの方法は、例えば３’末端で重複の無いプラ
イマー配列を選択することにより、プライマー−ダイマ
ー生成が最小になるように、プライマー自体を適切に設
計することである。一方、プライマー結合配列とある程
度の類似性を有する配列を有する非標的核酸が存在する
なら、核酸合成が起きるが、核酸産物が、エネルギー移
動が起きるように適切な長さに取り込まれるプライマー
を有する可能性は低い。標的特異的シグナル生成を上昇
させることができる別の方法は、いわゆる「ネステッド
（nested）ＰＣＲ」の使用による。この方法では、ほと
んどの増幅は、標識プライマーの横に位置する第２セッ
トのプライマーにより行われる。これを図３（Ｃ）に示
す。標識プライマーは、減少した量で存在することがで
き、異なるアニーリング条件を必要とするか、または別
の短い増幅反応で使用される。これは、プライマー−ダ
イマーまたは非標的配列の増幅における標識プライマー
の関与を減少させるはずである。この具体例では、３’
末端間にある程度の重複を有する標識プライマーまたは
核酸構築体を用いて、標的依存性シグナルをうまく生成
することが可能かも知れない。最後に、標的非依存性産
物は、異なる長さおよび／または塩基組成を有し、従っ
てその熱プロフィールにより標的特異的２本鎖核酸と不
適切な産物の区別を可能にする。前記したように、この
プロフィールは、方法の一部として得られるか、または
別の工程を導入してそのようなプロフィールを得てもよ
い。 【０１４５】本発明のこの具体例は、ヌクレオチドの取
り込みについて説明したが、個々のヌクレオチドではな
くポリヌクレオチドの添加に依存する、プライマー伸長
手段もある。そのような方法として、ＬＣＲ（米国特許
第５，４９４，８１０号）とＧＡＰ−ＬＣＲ（米国特許
第６，００４，２８６号）の２つの方法も、本発明の利
点を享受する。これらの方法は、２セットの隣接オリゴ
ヌクレオチドの使用に依存し、ここで各セットは、標的
核酸の１つの特定の鎖に相補的である。本発明におい
て、第１のエネルギー移動要素は、１つの鎖に相補的な
１つ以上のオリゴヌクレオチド中であり、第２のエネル
ギー移動は、他の鎖に相補的な１つ以上のオリゴヌクレ
オチド中である。この方法による本発明の使用の例を図
３（Ｄ）に示す。 【０１４６】ｂ．標識プライマーとヌクレオチド間のエ
ネルギー移動 本発明の別の実施態様において、第１のエネルギー移動
要素を含む１つ以上のプライマーまたは核酸構築体は、
第２のエネルギー移動要素を含む少なくとも１つのヌク
レオチドとともに使用される。プライマーまたは核酸構
築体への、標的鋳型に従うヌクレオチドの付加後に、１
つのプライマーまたは核酸構築体中の第１のエネルギー
移動要素と、取り込まれたヌクレオチド中の第２のエネ
ルギー移動要素との相互作用により、エネルギー移動が
可能である。プライマー伸長中に単一のプライマーまた
は核酸構築体のみが使用されるなら、標識プライマーま
たは核酸構築体と標識ヌクレオチドは、同じ鎖の上にあ
ってもよい。結合／伸長の連続的ラウンドで、プライマ
ーまたは核酸構築体が使用されるなら、線形増幅を行う
ことができる。 【０１４７】一方、前記したように、伸長プライマーま
たは伸長核酸構築体を鋳型として使用することができる
１つ以上のプライマーまたは核酸構築体の取り込みは、
さらなる合成を可能にする。この場合、ヌクレオチド取
り込みにより導入される第２のエネルギー移動要素は、
伸長鎖およびその相補的コピーの両方でもよい。図５
は、本発明のこの具体例を例示する種々の増幅法により
作成される可能な増幅産物を示す。図５（Ａ）、５
（Ｂ）および５（Ｃ）において、増幅に使用される１つ
以上のプライマーは、エネルギー移動要素を含有する。
この図は、アクセプター要素（Ａ）がプライマー中に存
在し、ドナー要素（Ｄ）が、増幅中に取り込まれるヌク
レオチド中に存在することを示すが、反対の構成も使用
できる。本発明のこの具体的な態様において、プライマ
ー間の空隙は、増幅を行うのに適した任意の所望の長さ
である。 【０１４８】前記したように、適切な標的のみからシグ
ナルを選択的に生成するのに、種々の方法を使用するこ
とができる。これらには、プライマー設計、２本鎖核酸
の熱プロフィール、およびネステッド（nested）増幅が
ある。本発明のこの具体例はまた、多重フォーマットが
可能である。例えば、２つ以上の伸長プライマー種が合
成されるように種々のプライマーが使用されるなら、こ
れらは、ヌクレオチド中の共通のエネルギー移動ドナー
と、各プライマー中の異なるエネルギー移動アクセプタ
ーとを使用することにより、互いに区別することができ
る。個々の核酸産物のそれぞれは、プライマー上のアク
セプターのスペクトル特性により同定することができ
る。 【０１４９】先行技術は、第１のエネルギー移動要素を
含むプライマーと、第２のエネルギー移動要素を含むジ
デオキシリボヌクレオチドの両方の使用を記載している
（クウォック（Kwok）とチェン（Chen）、米国特許第
５，９４５，２８３号）。本発明は、反応混合物中で鎖
停止物質ではないヌクレオチドを使用し、従ってａ）複
数の取り込みを可能にする、およびｂ）所望であれば相
補的核酸の合成のために、鋳型として伸長鎖を使用する
ことができる充分な合成を可能にする、ヌクレオチドを
使用する点で、先行技術とは異なる。 【０１５０】ｃ．標識ヌクレオチド間のエネルギー移動 本発明の別の実施態様において、標識ヌクレオチドのみ
を用いる合成中に、シグナル生成が可能であることが開
示される。この具体例において、合成は、第１のおよび
第２のエネルギー移動要素を含む少なくとも１つのヌク
レオチドの存在下で行われる。第１のエネルギー移動要
素と第２のエネルギー移動要素を含むヌクレオチドは、
例えばｄＵＴＰの混合物を使用して、同じヌクレオチド
でもよく、一部はエネルギー移動ドナーで標識され、一
部はエネルギー移動アクセプターで標識される。一方、
これらは、例えばエネルギー移動ドナーで標識されたｄ
ＵＴＰと、エネルギー移動アクセプターで標識されたｄ
ＣＴＰを有する混合物を使用して、異なるヌクレオチド
でもよい。 【０１５１】前記したように、第１のおよび第２のエネ
ルギー移動要素を含むヌクレオチドの取り込みは、鎖伸
長の単一のラウンド、線形増幅のための１つの鎖の伸長
の複数のラウンド、または指数的増幅のための少なくと
も１つの第２のプライマーまたは核酸構築体の提供によ
り、起こすことができる。図５（Ｄ）は、ドナーとアク
セプターの両方が標識ヌクレオチドを介して取り込まれ
ているＰＣＲ増幅産物を示す。取り込みの非存在下で
は、あるヌクレオチドから別のヌクレオチドへのエネル
ギー移動はほとんどまたはまったく無いであろう。しか
し、核酸鎖にいったん取り込まれると、これらは、エネ
ルギー移動が起きることを可能にする位置にある。これ
は、同じ鎖内の鎖内相互作用によっても、または相補的
鎖上のヌクレオチド間の鎖間相互作用によってもよい。
具体的なヌクレオチド塩基は、完全にヌクレオチドから
なるか、または標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオチド
の混合物でもよい。 【０１５２】ＰＣＲやＳＤＡのような方法は、主要な生
成物として２本鎖アンプリコンを産生するが、２本鎖Ｄ
ＮＡと１本鎖ＲＮＡ型を行き来するＮＡＳＢＡのような
系がある。これらの増幅法において、本発明は、ＤＮＡ
を標識するためのエネルギー移動標識デオキシリボヌク
レオチド、またはＲＮＡ産物を標識するためのエネルギ
ー移動標識リボヌクレオチドを提供することにより、使
用される。後者の場合、ＲＮＡ鎖中のドナー標識および
アクセプター標識リボヌクレオチドの存在は、鎖内エネ
ルギー移動を可能にするであろう。前記したように、適
切なアンプリコンからのみシグナルを選択的に生成する
ために、種々の方法が使用される。これらには、プライ
マー設計、２本鎖核酸の熱プロフィール、およびネステ
ッド（nested）増幅がある。さらに、本発明のこの具体
例のシグナル生成は、取り込まれたヌクレオチド間のエ
ネルギー移動から得られるため、プライマーがエネルギ
ー消光物質を含むシンガー（Singer）とホーグランド
（Haugland）（米国特許第６，３２３，３３７Ｂ１号）
が記載した方法も使用できる。この目的に使用される消
光物質には、シンガー（Singer）とホーグランド（Haug
land）（前述）が記載したフルオレセイン、ローダミ
ン、ロドールまたはトリアリールメタン色素の非蛍光誘
導体がある。 【０１５３】ｄ．蛍光インターカレーターと標識プライ
マーまたはヌクレオチド間のエネルギー移動 本発明の前記の実施態様は、プライマーとヌクレオチド
をエネルギー移動要素として使用した。本発明の別の実
施態様は、核酸結合物質が、鎖伸長後のエネルギー移動
要素として使用できることを開示する。米国特許第４，
８６８，１０３号には、標識タンパク質とインターカレ
ーターとが関与するハイブリダイゼーション測定法で、
エネルギー移動を使用できることを既に記載している。
この技術に対して、第１のエネルギー移動要素を有する
標識プライマーまたは核酸構築体は伸長されて、第２の
エネルギー移動要素を含み実質的に配列非依存性である
核酸結合物質により結合される核酸を合成する。伸長鎖
がその鋳型と塩基対合していてもまたは鋳型からの分離
後でも、結合は起き、すなわち、伸長鎖は、２本鎖型で
も１本鎖型でもよい。核酸結合物質は、核酸に対して高
親和性を有するタンパク質でも化学物質でもよい。本発
明で使用されるタンパク質の例には、特に限定されない
が、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ＳＳＢタンパク質、ヒ
ストンおよび抗体がある。Ｔ４遺伝子３２タンパク質と
ＳＳＢタンパク質は、１本鎖核酸に対する親和性を有
し、ヒストンは２本鎖核酸に対する親和性を有する。核
酸およびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対して特異的な
抗体が、文献に記載されている（米国特許第６，２２
１，５８１号と米国特許第６，２２８，５７８号）。蛍
光標識物をタンパク質に結合させる方法は、当該分野で
広く開示されている。１本鎖核酸に対して優先的な親和
性を有する化学物質には、特に限定されないが、ＳＹＢ
Ｒ（登録商標）グリーンIIがある。２本鎖核酸に対して
優先的な親和性を有する化学物質の例には、特に限定さ
れないが、インターカレーターがある。本発明で使用さ
れるインターカレーターの例には、特に限定されない
が、アクリジン、臭化エチジウム、臭化エチジウムホモ
ダイマー、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩ、ＴＯＴＯ
（登録商標）、ＹＯＹＯ（登録商標）、ＢＯＢＯ（登録
商標）およびＰＯＰＯ（登録商標）がある。結合物質
は、エネルギー移動要素を直接または間接に含むことが
できる。エネルギー移動要素で標識されたタンパク質
は、間接的手段の例である。上記で列挙したインターカ
レーターは、直接手段の例である。 【０１５４】また核酸結合物質へのまたは核酸結合物質
からのエネルギー移動は、所望であれば、標識プライマ
ーではなく標識ヌクレオチドにより行われる。核酸が２
本鎖型である時、本発明のこの実施態様は、一部のイン
ターカレーターが、２本鎖核酸への結合により蛍光が増
強するという能力を利用する。前記したように、この作
用は、増幅反応中のリアルタイム核酸合成を追跡するの
に使用される。しかし、単独で使用すると、この方法
は、色素単独または１本鎖プライマーと結合する色素が
示すバックグランドの量という欠点がある。非結合色素
は、非取り込まれる標識ヌクレオチドとのエネルギー移
動相互作用を受けないため、この欠点は本発明により克
服される。従って本発明は、標識核酸結合物質単独を使
用することと比較して、シグナル生成の選択性を増強す
る。 【０１５５】前記したように、適切な標的分子のみから
シグナルを選択的に生成するのに、種々の方法が使用さ
れる。これらには、プライマー設計、２本鎖アンプリコ
ンの熱プロフィール、およびネステッド（nested）増幅
がある。 【０１５６】ｅ．標識タンパク質とヌクレオチド間のエ
ネルギー移動 核酸タンパク質が与える特異性が好ましい場合がある。
すなわち、本発明の別の態様は、第１のエネルギー移動
要素を含む少なくとも１つの核酸プローブが、第２のエ
ネルギー移動要素を含むヌクレオチドとともに使用され
る、シグナル生成の新規手段を開示する。先行技術は、
エネルギー移動標識プライマーとエネルギー移動標識配
列特異的タンパク質の使用を記載している（ウィトワー
（Wittwer）ら、米国特許第６，１７４，６７０号）。
この技術に対して、本方法は、プライマーのみの近傍に
あるプローブの使用に限定されず、所望の核酸鎖上の任
意の位置にアニーリングするように設計されたプローブ
の使用を可能にする。さらに本発明は、伸長核酸の種々
のセグメントをプローブ標的として使用することによ
り、複数のエネルギー移動プローブを使用する能力を付
与する。すなわち、エネルギー移動要素を含むヌクレオ
チドを使用する時、標識核酸鎖への標識プローブのハイ
ブリダイゼーション後にシグナル生成が起きる。 【０１５７】例えば、鎖伸長後、鋳型鎖の分離または除
去が、１本鎖の伸長鎖へのプローブの結合を可能にし、
こうしてプローブ中の第１のエネルギー移動要素と伸長
鎖中に取り込まれた第２のエネルギー移動要素とで、エ
ネルギー移動が可能になる。プローブ中の第１の要素へ
のまたは第１の要素からのエネルギー移動は、プローブ
にハイブリダイズしたセグメントから得られるか、また
はこれらが充分に近傍にあるなら、隣接する１本鎖領域
から得られる。本発明の別の例は、ループ介在増幅を使
用する（米国特許出願第０９／１０４，０６７号；ヨー
ロッパ特許出願ＥＰ０９７１０３９Ａ）。この系により
生成する構造の１つは、２本鎖ステムに隣接した１本鎖
ループである。すなわち、本発明に開示されるように、
プローブはループ領域中の配列に結合でき、取り込まれ
たヌクレオチドとのエネルギー移動反応を受けることが
できる。 【０１５８】本発明のこの実施態様において、特異性は
２つの要因により与えられる。第１に、鎖伸長は、プラ
イマー結合／伸長反応自体の特異性に依存する。第２
に、プローブは３’末端でブロックされ、プライマー伸
長反応の結果として合成される時は、適切な配列に結合
することによってのみ参加する。 【０１５９】上記で開示した本発明の種々の実施態様
は、均一測定系で使用することができる。しかし、本発
明により、固体支持体の使用により与えられる利点もあ
る。固体支持体への固定は、伸長反応の開始前に、鎖伸
長中に、および鎖伸長の完了後に起きる。本発明で使用
される固体支持体の例には、特に限定されないが、ビー
ズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライ
ド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウ
ェル、およびくぼみがある。支持体への固定は、直接ま
たは間接に行われる。間接的固定の例として、捕捉物質
が固体支持体に結合される。この捕捉物質は、プライマ
ー、核酸構築体、アナライトまたはアナライトのコピー
中に存在する配列に相補的な配列、従ってハイブリダイ
ゼーションにより固定可能な配列を有する核酸でもよ
い。捕捉物質の他の例は、核酸に対する親和性を有する
抗体でもよい。（米国特許第４，９９４，３７３号、米
国特許第４，８９４，３２５号、米国特許第５，２８
８，６０９号；米国特許第６，２２１，５８１Ｂ１号；
および米国特許第６，２２８，５７８号；これらのすべ
ては参照することにより本明細書に組み込まれる）。 【０１６０】直接固定の例として、多くの前記実施態様
は鎖伸長のプライマーを使用する。従って所望であれ
ば、これらのプライマーは、伸長反応を行う前に、固体
支持体に共有結合することができる。適切な核酸の存在
下では、前記したように鎖伸長が起き、こうして、鎖伸
長産物も直接固体支持体に結合する。第１のおよび第２
のエネルギー移動要素は、固体支持体に固定されたプラ
イマー中でもよく、および／またはこれらは、上記の種
々の実施態様に記載のように、ヌクレオチド、プローブ
または核酸結合物質中でもよい。この例は、第１のエネ
ルギー移動要素を含む遺伝子座の少なくとも１セットの
プライマーと第２のエネルギー移動要素を含むヌクレオ
チドを用いる、ラッバニ（Rabbani）ら、米国特許出願
第０９／８９６，８９７号（２００１年６月３０日出
願）（参照することにより本明細書に組み込まれる）に
記載のマイクロアレイ上の増幅の使用であろう。適切な
装置を用いて、次にチップ上の各遺伝子座は、増幅の過
程で合成の程度について別々に追跡される。直接結合の
別の例は、リガンドと適切なリガンド受容体を含む固体
支持体を含む、プライマーの使用であろう。この構成の
例は、ビオチンで標識されたポリＴプライマーの使用
と、固定のためにアビジンまたはストレプトアビジンで
被覆されたビーズの使用であろう。第１のエネルギー移
動要素を含むヌクレオチドは、ポリＴプライマーを用い
て作成したｃＤＮＡコピー中に取り込むことができ、そ
のＲＮＡ鋳型に結合したｃＤＮＡの複合体は、第２のエ
ネルギー移動要素を含むインターカレーターに結合する
ことができる。この例では、ビーズへのプライマーの結
合は、鎖伸長の前、その最中、または後に起きる。 【０１６１】ｆ．エネルギー移動要素を含む固体支持体 さらに固体支持体は、受動的な役割に甘んじてはいな
い。本発明の別の実施態様において、固体支持体は第１
のエネルギー移動要素を含む。支持体への核酸の固定
は、第２のエネルギー移動要素を、シグナルを生成する
のに充分な近傍に持ってくることができる。本発明のこ
の実施態様において、第２のエネルギー移動要素は、ヌ
クレオチド、プライマー、プローブまたは核酸結合物質
の一部でもよい。例として、アレイ上に核酸プローブを
選択してマトリックスが作成される。次にマトリックス
は、第１のエネルギー移動要素も表面に固定されるよう
に処理される。適切な鋳型またはアナライトの存在下で
は、前記したように、第２のエネルギー移動要素を用い
て一群の核酸が合成される。標識核酸をアレイにハイブ
リダイズさせることにより、第２のエネルギー移動要素
が、表面に結合した第１のエネルギー移動要素の近傍に
くる。次に、アレイ上の特定の遺伝子座に結合した核酸
の量に対応するエネルギー移動によりシグナルが生成す
る。この原理ならびに前記の他の実施態様の一部の例
を、図６に記載する。捕捉要素を有する固体支持体はま
た、伸長反応の必要の無い方法で使用することができ
る。例えば、固体支持体、核酸に特異的な捕捉オリゴま
たは抗体は、第１の要素を含有することができる。次
に、１本鎖または２本鎖型の非標識アナライトが支持体
に結合した後にシグナルが生成され、ここで第２の要素
の存在は、支持体に結合されるアナライトの存在と量に
より決定される。例えば、第２の要素は、プローブまた
は核酸結合物質の形の複合体の一部でもよい。 【０１６２】ｇ．標識に使用される前の方法（ａ〜ｆ） 標的依存性の鎖合成後の第１のエネルギー移動要素と第
２のエネルギー移動要素からのシグナル生成は、試料中
の目的の核酸の存在または量を検出するために使用する
ことができる。シグナル生成がプライミングの特異性に
依存する時、標的非依存性プライマー伸長が最小になる
条件下で操作が行われるか、または前記したように、標
的由来核酸と突発的な鎖伸長産物とを区別できる方法を
含める。一方、核酸ハイブリダイゼーションの鑑別能力
を利用する工程を含めることは、プライマー特異性の必
要性を制限するかまたは不要にすることができる。例え
ば、ポリＡ ｍＲＮＡ配列の完全なライブラリーは、普
遍的なポリＴプライマーの使用によりｃＤＮＡコピーの
ライブラリーに変換することができる。次に、ｃＤＮＡ
鎖のライブラリーは、第２の鎖の合成のための鋳型とし
て無差別に使用することができる。第１の鎖プライマー
（米国特許第５，８９１，６３６号）または第２の鎖プ
ライマー（ラッバニ（Rabbani）ら、米国特許出願第０
９／８９６，８９７号（２００１年６月３０日出願）
（参照することにより本明細書に組み込まれる）は、個
々の元々のｍＲＮＡの複数のＲＮＡのコピーを合成する
ことを可能にする。この生成物またはｃＤＮＡコピーの
いずれかを標識する時、核酸のマイクロアレイとのハイ
ブリダイゼーションを使用して、元々の試料中の特定の
分子種の量を決定することができる。本発明は、第１の
および第２のエネルギー移動要素を、プライマー、ヌク
レオチド、プローブ、核酸結合物質またはマトリックス
自体に含めることにより、そのような方法とともに使用
することができる。 【０１６３】一方、既知量の目的の核酸をユーザーが供
給することができ、上記の種々の本発明に開示の実施態
様を使用して、標識プローブを合成することができる。
例えば、目的の核酸の単一の精製分子種は、１つまたは
２つのプライマーとの標識反応のための鋳型として提供
される。従って、別個の群の種々の核酸の標識が所望の
場合、プライマーセットを伸長することができる。次
に、前記の任意の手段により第１のおよび第２のエネル
ギー移動要素を含有させることにより、標識プローブ作
成することができる。次にこれらのプローブを使用し
て、当業者に公知の種々のフォーマットのいずれかの、
試料中の非標識核酸の存在または量を同定することがで
きる。 【０１６４】ｈ．プライマー伸長基質としてのアナライ
ト 目的の核酸または目的の核酸のコピーもまた、末端トラ
ンスフェラーゼ付加、結合、またはプライマーとして作
用させることにより、鎖伸長により直接使用することが
できる。例えば、個々の核酸または核酸ライブラリーの
３’末端への、第１のエネルギー移動要素の鋳型非依存
性付加により、末端トランスフェラーゼを使用すること
ができる。次に、第２のエネルギー移動要素を、末端付
加反応の一部として含めるか、またはこれらは、プライ
マー、プローブ、核酸結合物質、または固体支持体を含
むことができる。別の例において、ＤＮＡの制限消化後
に、第１のおよび第２のエネルギー移動要素を用いてヌ
クレオチド混合物の末端付加を行う。次に、核酸の個々
の分子種を、アレイ上の別個の遺伝子座上の種々の捕捉
配列にハイブリダイズさせて、個々の標識配列の存在ま
たは量を測定する。 【０１６５】類似体またはアナライトのコピーを、鋳型
依存性標識反応のプライマーとして使用できることも、
本発明の主題である。この点で、鋳型に従う合成は、適
切なハイブリダイズされた鋳型中の成分に対応する類似
体中の別個の配列の存在に依存するため、取り込み自体
も測定法として使用することができる。すなわち、所望
の核酸配列は、混合物中に存在し得る他の核酸の存在下
で、特異的に標識することができる。少なくとも１つの
セグメントは、所望のアナライト配列に一致するように
設計されるが、アナライト上に付加された配列に向くよ
うに用いられる鋳型のセグメントは、天然の配列でも任
意の配列でもよい。 【０１６６】この方法の例として、ポリＴを含む第１の
セグメントと、鋳型として使用される第２のセグメント
とを含むプローブを使用して、ポリＡ ｍＲＮＡのライ
ブラリーを、総ＲＮＡの存在下で標識することができ
る。第１のセグメントを介してｍＲＮＡのポリＡ配列に
結合している時、ｍＲＮＡの３’末端は、第２のセグメ
ントを鋳型として使用して伸長することができる。第２
のセグメントを鋳型として使用して取り込まれるヌクレ
オチドは、標識しても標識しなくてもよい。第２のセグ
メントとして使用される人工的配列の例には、プライマ
ー結合部位、ＲＮＡプロモーター配列がある。他の例
は、分離した細菌ＲＮＡ種の３’末端に相補的な第１の
セグメントを含む一連のプローブである。各特定の種特
異的セグメントについて、別個の鋳型配列を使用するこ
とができる。試料中に存在するＲＮＡによる特異的プラ
イミング後に、伸長配列に相補的な捕捉配列を有するア
レイを用いて評価し、こうして個々の伸長したＲＮＡを
分離することができる。最後に、標準的方法を使用して
ｍＲＮＡのプールからｃＤＮＡのコピーを作成すること
ができる。元々のｍＲＮＡの全コピーである各ｃＤＮＡ
は、元々のｍＲＮＡの５’末端である分かれた３’末端
を有する。次に、定量すべき各ｃＤＮＡについて、鋳型
／プローブを使用することができる。鋳型依存性伸長に
おいてプライマーとしてアナライトを使用するこれらの
例において、先行技術に記載の単一の標識種の取り込み
により標識を行うか、または第１のおよび第２のエネル
ギー移動要素を使用して、上記で開示した方法を使用し
てもよい。 【０１６７】１１．所望の核酸セグメントの断片化およ
び／または取り込み ａ．アナライトの末端への所望の核酸配列の鋳型依存性
付加 本発明の別の態様は、アナライトまたは標的核酸への所
望の核酸配列の鋳型依存性付加のための、新規組成物と
方法を提供することである。先行技術において、ｍＲＮ
Ａ操作のための多くの方法の基礎として、ポリＡ配列が
使用されている。さらに、ｍＲＮＡの有用性は、そのよ
うな操作のいずれかおよびすべてを行うための鋳型とし
てのその使用に由来する。例えば、ポリＡは、ｃＤＮＡ
コピーを作成し、ｍＲＮＡの線形または指数的増幅を行
うためのプライマー結合部位として使用されている。し
かし、前記したように、この特徴は、すべてのＲＮＡ標
的で普遍的に共有されている訳ではない。さらに、これ
はｍＲＮＡの３’末端の選択的特徴である。先行技術に
対して本発明は、アナライトまたは標的核酸を鋳型とし
てではなく、鎖伸長の基質（すなわち、プライマー）と
見なして使用することにより、核酸分析の限定された範
囲を克服する。従って、これらの方法で提供される核酸
構築体は、プライマーとしては使用されず、ユーザーが
所望する任意の配列を、アナライトまたは標的核酸が取
り込むことを可能にする鋳型として作用する。そのよう
な配列には、プロモーター、プライマー結合部位、また
はシグナル生成残基を含む。 【０１６８】本発明において、核酸分析で使用すること
を目的とする方法はまた、任意の所望の核酸アナライト
でも使用し得る。アナライトまたは標的核酸は、ＲＮＡ
またはＤＮＡならびにＲＮＡまたはＤＮＡのコピーから
なってもよい。アナライトまたは標的核酸は、生物的試
料から抽出されるか、またはこれらは、インビトロで産
生されてよい。これらはまた、消化、断片化、増幅、抽
出および分離のような操作および方法を受けていてもよ
い。 【０１６９】本発明は、核酸の末端が、２つのセグメン
トを有する相補的キメラ核酸構築体（ＣＮＡＣｓ）にハ
イブリダイズできることを開示する。第１のセグメント
は、アナライトの３’末端に結合またはハイブリダイズ
することができるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似
体を含む。第２のセグメントは、アナライトの３’末端
の伸長のための鋳型として使用できるヌクレオチドまた
はヌクレオチド類似体を含む。先行技術とは異なり、ア
ナライトの末端のポリＡセグメントのような選択された
配列の存在に依存しない方法が開示されるが、本発明
は、アナライトのまたはアナライトのライブラリーの
３’末端に存在してもよい任意のかつすべての配列が、
結合と鋳型依存性伸長反応のための部位である方法を開
示する。本発明において、鋳型依存性鎖伸長は、個々の
核酸の取り込み（重合）により、またはあらかじめ合成
されたオリゴヌクレオチドの付加（結合）により、起き
る。結合が代わりに使用される時、３’伸長はポリメラ
ーゼに支配される方法に特徴であるため、本発明は一般
的に３’伸長で説明されるが、５’末端もまた、鋳型依
存性鎖伸長のための適当な基質である。標的またはアナ
ライト核酸の３’末端に任意の核酸配列を導入する能力
は、アナライトをさらなる操作のために使用可能なプロ
ーブまたは核酸構築体に変換するための、単純で強力な
ビヒクルを提供する。種々の配列を有する核酸のライブ
ラリーはまた、シグナル伝達目的、プライミング、捕捉
または増幅のために、制御されたかつ測定された方法で
直接、さらなる操作のために後に使用し得る普遍的な配
列を有するライブラリーに変換される。 【０１７０】本発明の１つの具体例において、第１のセ
グメントがヌクレオチド配列のすべての可能な組合せを
含むＣＮＡＣｓのセットが使用される。すなわち、ＣＮ
ＡＣｓのセットの第１のセグメントが６つの可変ヌクレ
オチドを含むなら、第１のヌクレオチド（Ｎ１）はＧ、
ＴまたはＣで、第２のヌクレオチド（Ｎ２）はＧ、Ａま
たはＣなどでもよく、このセット自体は４6 （４，０９
６）の異なるＣＮＡＣｓを含むであろう。この点で、こ
れは、核酸コピーの合成のためのランダムプライマーの
使用と類似性を有する。しかし本発明は、ＣＮＡＣｓは
それ自体伸長しない（すなわち、プライマーとして作用
する）が、そのアナライトに対して相補的結合を提供
し、ＣＮＡＣｓの第２のセグメントが、アナライトの鋳
型依存性伸長に使用できるようになる点で、ランダムプ
ライミングとは異なる。このために、ＣＮＡＣｓの末端
はブロックされることが好ましい。すなわち、本発明は
ランダム配列を使用するが、互いをプライマーと鋳型と
して使用するランダムプライマーの副反応は完全に避け
られる。本発明はまた、アナライトの特定の部位へのラ
ンダムプライマーの結合が伸長を可能にする点で、異な
る。本発明において、ＣＮＡＣがアナライトの末端で相
補的配列に結合する時のみ、伸長が起きる。アナライト
鎖の複数の部位上でＣＮＡＣｓのランダムな結合と解離
が起きるが、実際には末端への結合の動的な好みがある
ため、これは平衡状態ではない。例えば、アナライト中
の３’ＯＨと相補的ＣＮＡＣの並置は、ポリメラーゼに
結合することができ、内部部位に結合したＣＮＡＣより
安定な複合体を形成することができる。複合体形成によ
り末端へのＣＮＡＣの結合のより長い半減期を提供する
以外に、複合体は、アナライトを伸長して、より安定な
型を生成し、こうして相補的に塩基対合している塩基の
数を増加させる。この平衡喪失は等温反応で行われる
か、または所望であれば、反応温度を上げて非生産性結
合部位からのＣＮＡＣｓの解離を促進し、次に同じ反応
温度に戻して、別のラウンドのアナライトへのＣＮＡＣ
ｓの結合を促進する。所望であれば、これらの可変条件
は複数回繰り返して、鋳型依存性付加を受けるアナライ
ト末端の量を最適化することができる。 【０１７１】本発明のさらなる目的は、ユニバーサル塩
基（すなわち、２つ以上の相補的塩基と塩基対合するこ
とができる塩基）を用いて合成されたＣＮＡＣｓを使用
する新規組成物と方法を開示することである。ユニバー
サル塩基を含むヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体
は、複雑さを増すことなく安定性に寄与することができ
る。従って本発明のこの態様において、前記の２つのセ
グメントを含む新規ＣＮＡＣが開示されるが、ヌクレオ
チドの並べ換えを利用する代わりに、配列特異性の無い
ユニバーサル塩基が第１のセグメントで使用される。例
えば、６つの位置での並べ換え（従って４，０９６個の
異なるＣＮＡＣｓを必要とする）を含むＣＮＡＣｓのセ
ットを有する例を上記した。ユニバーサル塩基を使用す
ることにより、末端の配列に無関係に、類似体または類
似体のセットに、所望の核酸配列の鋳型依存性付加を提
供するのに、単一のＣＮＡＣ種が必要なだけである。ユ
ニバーサル塩基は、必ずしも区別の完全な欠如や特定の
ヌクレオチドに結合する能力の欠如を示すものではない
ため、異なるユニバーサル塩基またはユニバーサル塩基
類似体、またはユニバーサル塩基とユニバーサル塩基類
似体との異なる混合物を含む、ＣＮＡＣｓのセットを使
用することが、可能でありかつ好ましくさえある。前記
したように、この方法は、ＣＮＡＣが３’末端に結合す
るまで、ＣＮＡＣｓが、アナライトのランダムセグメン
トへのユニバーサル塩基の一連の結合と解離を受ける、
自己選択性プロセスが関与する。この具体例において、
各ＣＮＡＣはユニバーサル塩基対合能を有し、生産性伸
長は、アナライトの３’末端とＣＮＡＣの第２のセグメ
ントとの関係に最も相関するため、末端での塩基対合は
問題ではない。合成される最初の塩基が、第２のセグメ
ントの最初の塩基の相補体であるように、ＣＮＡＣの第
２のセグメントの開始が、アナライトの３’末端と整列
する効率的な鎖伸長が起きることができる。一方、ユニ
バーサル塩基はまた、鋳型として使用可能なある程度の
能力を有し、従って、アナライトの３’末端が、ＣＮＡ
Ｃの第１のセグメントと第２のセグメントとの結合部に
完全には隣接していないハイブリッドは、アナライトの
鎖伸長を行うことができるはずである。 【０１７２】本発明のさらなる目的は、ＣＮＡＣが、ヌ
クレオチドの並べ換えとともにユニバーサル塩基を含
む、新規組成物と方法を開示することである。この具体
例においてＣＮＡＣは、３つの異なるセグメント（第１
のセグメントがユニバーサル塩基を含有し、第２のセグ
メントが１つ以上の位置で並べ換えシリーズの別個のヌ
クレオチドであり、第３のセグメントが３’末端の伸長
のための鋳型として使用可能な核酸を含む）を含むと考
えられる。すなわち本発明は、並べ換えられた第２セグ
メントアンカーによる特異的塩基対合により与えられる
選択性とさらなる安定性とともに、第１のセグメントの
ユニバーサル塩基の複雑さの無い安定性を享受すること
ができる。すなわち、もしＣＮＡＣの第１のセグメント
に使用されるユニバーサル塩基が正常の核酸間の塩基対
合の結合親和性の約半分を有するなら、４つの可変ヌク
レオチド位置と４つのユニバーサル塩基を含むＣＮＡＣ
ｓのセットは、ランダムヘキサマーと同じ平均Ｔｍを有
するであろうが、４4 すなわちわずかに２５６の異なる
ＣＮＡＣｓが必要なだけであろう。これは、ヘキサマー
並べ換えである第１のセグメントで必要な４，０９６の
異なるＣＮＡＣｓとは異なる。同様に４つのユニバーサ
ル塩基と６つの可変位置を有するＣＮＡＣは、４，０９
６の異なるＣＮＡＣｓを含むであろうが、４8 の並べ換
え（すなわち、６５，５３６の異なるＣＮＡＣｓ）を必
要とするランダムオクタマーの第１のセグメントを有す
るＣＮＡＣｓと同様の結合性を有するであろう。 【０１７３】従って、その由来に無関係に、任意のアナ
ライトの末端に存在するであろうすべての可能な並べ換
えの組合せをカバーできるであろうし、同時に、第１の
セグメント中のユニバーサル塩基は、さらなる特異性を
負荷することなく、追加の結合安定性を提供するため、
適度に高い結合効率と能力を享受できるであろう。すな
わち、反応混合物中の同じ数のＣＮＡＣ分子について、
前記例のアナライトの特定の３’末端に結合する濃度よ
り１６倍高い濃度のＣＮＡＣｓが、有効にあるであろ
う。これは、並べ換えセグメントのみを有するＣＮＡＣ
ｓと比較して、優れた速度と効率とを提供する。 【０１７４】ユニバーサル塩基（すなわち、２つ以上の
相補的塩基と塩基対合することができる塩基）はまず、
ヌクレオチド配列の正体が不明であった標的核酸との安
定なハイブリダイゼーションを維持するために、オリゴ
ヌクレオチド中で使用された。この公知の例は、ＰＣＲ
プライム中のイノシンの置換である（リウ（Liu）とニ
コルス（Nichols）、(1994) Biotechniques 16:24-2
6）。イノシンは、相補鎖中のＧ、Ａ、ＴまたはＣと効
率的に塩基対合できる性質を有する（カワセ（Kawase）
ら、1986, Nucleic Acids Res. 19:7727-7736）。融点
は、通常の塩基対合より低いが、ミスマッチよりは高
い。鋳型として使用される時、イノシンは、有効にＧで
あるように認識され、Ｃが優先的に相補的コピー中に取
り込まれる。ユニバーサル塩基として作用するヌクレオ
チドの他の類似体も記載されている。例えば、５−ニト
ロインドレニンと３−ニトロピロール類似体もまた、ユ
ニバーサル塩基として記載されている（ローケス（Loak
es）とブラウン（Brown）、1994,Nucleic Acids Res. 2
2:4039-4043、ニコルス（Nichols）ら、1994, Nature 3
69:492-493、これらは両方とも、参照することにより本
明細書に組み込まれる）。これらのおよび他のユニバー
サル塩基の使用は、ローケス（Loakes）の総説、（200
1） Nucleic Acids Res. 29:2437-2447がある（参照す
ることにより本明細書に組み込まれる）。ユニバーサル
塩基がプライマーの複雑さを付加することなく安定性を
加える能力は、ボール（Ball）らにより記載され（199
8, Nucleic Acids Res. 26:5225-5227、参照することに
より本明細書に組み込まれる）、５’末端の５−ニトロ
インドレニン残基の付加は、サイクル配列決定に使用さ
れるオクタマープライマーの特異性とシグナル強度を改
善した。すなわち、これらのおよび他のユニバーサル塩
基は、本発明において使用される。 【０１７５】前記したように本発明は、核酸または核酸
断片を鋳型依存性伸長に使用することを可能にし、ポリ
Ａテイルへの依存性を不要にする。アナライト鎖中に取
り込まれる所望の核酸（または目的の核酸）は、任意の
核酸または核酸断片を、以前はポリアデニル化核酸によ
り享受された機能を実施できるプライマー結合配列を提
供する型に変換することができる。ＣＮＡＣ中の所望の
核酸（または目的の核酸）としてプロモーターを取り込
むことにより、線形増幅を実施することができ、ポリＡ
標的について既に記載されている方法のいずれかを使用
して、所望のプライマー結合核酸配列を用いて、指数的
増幅をすることができる。さらに、アナライトへの核酸
の鋳型依存性取り込みはまた、取り込み工程で標識ヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチドを使用して、類似体
を直接標識する機会を提供すると考えられる。 【０１７６】基質としての利用しやすさや便利さのため
に、ポリＡ ｍＲＮＡに研究の焦点が当てられてきた。
本発明は、従来ポリＡに与えられたものと同じ使用の容
易さで、非ポリアデニル化核酸を操作することを可能に
する。すなわち本発明は、ＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲ
ＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、細菌ｍＲＮＡ、またはポリ
Ａ配列が欠如した任意のＲＮＡで使用することができ
る。ポリＡ ｍＲＮＡでさえ、本発明で使用することが
できる。３’ポリＡテイルへの依存により、この末端に
含有される情報に偏見が生まれた。先行技術のほとんど
の方法では、ｍＲＮＡの他端の配列はまだ、３’でプラ
イミングが起きる効率に依存した。従って、５’末端と
ポリＡ末端とのコピープロセスまたは切断の妨害は、試
験または操作に利用可能な５’配列の量を減少させた。
すなわち、大きなｍＲＮＡ分子中の単一のニックでさ
え、分子の５’末端の使用を排除し、多くの報告や市販
品でさえ、単離中のｍＲＮＡの５’末端と３’末端の連
続性の保持に向けられている。本発明は、ポリＡに非依
存性である方法を開示するため、ポリＡ領域から分離さ
れたポリＡ ＲＮＡの断片は、使用と研究に利用可能に
なる。 【０１７７】実際、ポリＡ ｍＲＮＡのすべてのセグメ
ントは、その３’末端との関係からの偏り無しで、独立
にかつ効率的に使用することができるため、そのような
断片化プロセスは有利である。この断片化は、充分活用
されていない研究分野になっているｈｎＲＮＡにとっ
て、特に有用であろう。このように無視されてきたこと
は、ｈｎＲＮＡの２つの特徴から来ている：ハンドルと
してのポリＡが無いこととサイズが非常に大きいこと。
ｈｎＲＮａ中に存在するイントロンは、最終遺伝子産物
のコード配列が欠如しているが、調節、制御、および他
の遺伝子および遺伝子産物との相互作用に重要な、最終
生成物中に現れない多数の配列が存在する可能性があ
る。本発明は、ｈｎＲＮＡ中に配列する配列を、従来ポ
リＡ ｍＲＮＡがそうであったように、完全に利用可能
にする。 【０１７８】本発明の多くの実施態様は、ＲＮＡ分析に
ついて記載されるが、これらの方法の多くは、ＤＮＡ断
片にも容易に応用可能であることを指摘する。前記断片
化法で使用される方法は、物理的でも酵素的でもよい。
物理的手段は、化学的方法ならびに機械的剪断および音
波破壊がある。本発明で使用される断片化の酵素的手段
には、特に限定されないが、Ｓ１ヌクレアーゼ、大豆ヌ
クレアーゼ、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ、および制限酵素
のようなエンドヌクレアーゼがある。所望であれば、伸
長可能な３’末端を提供するために、アナライトをホス
ファターゼで処理できることは、本発明のさらなる目的
である。本発明のＣＮＡＣは、ＤＮＡ、ＲＮまたはこれ
らの任意の組合せを含有してもよく、ヌクレオチドは、
所望により、修飾されても修飾されなくてもよい。ＣＮ
ＡＣｓは、標準的ヌクレオチドを含有しても、またはヌ
クレオチド類似体、糖類似体、およびリン酸塩類似体を
含有してもよい。これらのそれぞれの例は、ペプチドヌ
クレオチド（ＰＮＡｓ）、アラビノシドおよびホスホロ
チオエート結合である。 【０１７９】ｂ．シス特異的断片化のためのＣＮＡＣ 複雑さを増すことなく安定性を提供するユニバーサル塩
基の有用性は、他のプロセスでも応用される。本発明の
別の態様は、アナライトまたはアナライトのライブラリ
ーの制御断片化のための組成物と方法を開示する。２つ
のセグメント（非特異結合を提供するためのユニバーサ
ルヌクレオチドを含む第１のセグメント、およびエンド
ヌクレアーゼ性消化を提供する複合体を形成する、分か
れた選択された配列を有する第２のセグメント）を含
む、新規ＣＮＡＣが開示される。適切なハイブリダイゼ
ーション条件下で、ＣＮＡＣは、ＣＮＡＣの第２のセグ
メントに充分に相補的な、アナライト中の各位置でエン
ドヌクレアーゼ感受性部位を形成する。選択された配列
のサイズと性質は、エンドヌクレアーゼ部位間の平均間
隔を決定し、従って、断片の具体的な平均サイズを決定
する。例えば、４つまたはそれ以上のデオキシリボヌク
レオチドを有する第２のセグメントは、ＲＮａｓｅＨの
基質である複合体を形成するはずである。これにより、
第２のセグメントに相補的なアナライト中の各部位が切
断される。平均して、特定の４塩基配列が、約２５０塩
基毎に現れるはずである。２つ以上のＣＮＡＣを使用す
ることによりより小さいサイズの分布も得られ、こうし
て、可能な消化部位の数が増える。所望であれば、より
大きな第２のセグメントが使用でき、より少ない間隔で
複合体が形成されるようにハイブリダイゼーション／消
化条件が適用され、こうして断片サイズのより大きな平
均分布が得られる。第１のまたは第２のセグメントに別
個の塩基を付加し、これらの塩基の正しい塩基対合によ
り生成する安定性で、安定なハイブリッドのみが形成さ
れる条件を使用して、特異性を上昇させてもよい。 【０１８０】１本鎖ＤＮＡの消化に、同じ方法を適用す
ることができる。ＣＮＡＣの第２のセグメントを、制限
酵素の認識部位を有するように設計することができる。
ほとんどの制限部位は４〜６塩基のみであるため、ＣＮ
ＡＣ中にユニバーサル塩基が存在すると、４〜６塩基セ
グメントのみを使用するより、はるかに安定なハイブリ
ッドを提供するはずである。本発明のこの具体例におい
て、第２のセグメントは断片化に使用されるが、これは
また、エンドヌクレアーゼ性消化後に断片化アナライト
中に所望の核酸配列を取り込むための、鎖伸長の鋳型と
しても使用される。前記したように、これは、その末端
でアナライト断片を標識するための、標識ヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチドの鋳型依存性取り込みのため
の手段を提供することができる。 【０１８１】所望であれば上記ＣＮＡＣは、第３のセグ
メントをさらに含むことができる。例えば、第３のセグ
メントは、第２のセグメント中の分かれた塩基の反対側
に隣接する別のセットのユニバーサル塩基を含むことが
できる。ＣＮＡＣは、式「Ｕ n−Ｄp−Ｕq 」で示され、
ここで「ｎ」は、第１のセグメント中のユニバーサル塩
基の数であり、「ｐ」は、第２のセグメント中の分かれ
た塩基の数であり、「ｑ」は、第３のセグメント中のユ
ニバーサル塩基の数である。追加の第３のセグメント
は、追加の安定性を提供するか、またはハイブリダイズ
した第２のセグメントを、エンドヌクレアーゼ性分解消
化のより効率的な酵素基質としてもよい。あるいは、第
１と第２のセグメントは上記したものであり、第３のセ
グメントは、前記したように１つ以上の標識物または所
望の核酸配列の取り込みのための鋳型を提供する分かれ
た核酸配列である。ユニバーサル塩基は、無差別な結合
を可能にするため、ＣＮＡＣ中の分かれた塩基と正しい
整列を含むハイブリダイゼーションのみが、ＣＮＡＣと
アナライトとの安定なハイブリッドを形成する条件下
で、反応が起きることができる。あるいは、非生産性に
結合し、アナライト上の実質的にすべての所望の部位が
消化されるまで、部位特異的断片化に至る追加の結合を
可能にするＣＮＡＣｓを解離するために、熱サイクリン
グを行うことができる。 【０１８２】ｃ．消化／伸長のためのＣＮＡＣｓ 本発明の別の態様において、第１のセグメントが第１の
アナライト核酸配列に相補的で、第２のセグメントが第
２のアナライト核酸配列に相補的な、少なくとも２つの
セグメントを含む新規ＣＮＡＣｓが開示される。アナラ
イト核酸と混合後、第１のアナライト核酸配列への第１
のセグメントのハイブリダイゼーションが、特定のエン
ドヌクレアーゼに対して耐性の第１の複合体を形成し、
第２のアナライト核酸配列への第２のセグメントのハイ
ブリダイゼーションが、エンドヌクレアーゼの基質であ
る第２の複合体を形成するように、ＣＮＡＣは設計され
る。さらに、第２の複合体は、アナライト鎖のみが、ニ
ッキングまたはエンドヌクレアーゼによるヌクレオチド
の除去を受けるように、不斉切断をすることができる。
この処理により、アナライト鎖中に新しい３’末端が生
成し、これは次に、アナライト鎖へのヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチドの鋳型依存性付加のために使用す
ることができる。 【０１８３】ＣＮＡＣはさらに、第３のアナライト核酸
配列に相補的でも相補的でなくてもよい第３のセグメン
トを含む。ＣＮＡＣの第３のセグメントは、第３のセグ
メントが、エンドヌクレアーゼ性分解消化に感受性の第
３の複合体を生成しない点で、第２のセグメントから区
別される。第３のセグメントは、第３のアナライト核酸
配列に相補的ではない時、第３の複合体は決して形成さ
れない。一方、第３のセグメントが第３のアナライト核
酸配列に相補的である時、第３の複合体が形成される
が、第１の複合体を耐性にするために使用することがで
きる手段のいずれかにより、エンドヌクレアーゼ耐性が
与えられる。エンドヌクレアーゼ消化後、第２のおよび
第３のセグメント中の配列は、末端の作用により形成さ
れている３’末端からの鎖伸長のための鋳型として作用
する。鎖伸長は、鋳型依存性重合酵素（ＤＮＡポリメラ
ーゼまたは逆転写酵素）、または鋳型依存性結合酵素
（ＤＮＡリガーゼ）により行われる。エンドヌクレアー
ゼ消化により生成する断片は、所望により３’末端また
は５’末端にリン酸基を付加または除去するために、キ
ナーゼまたはホスファターゼ処理をさらに受ける。 【０１８４】本発明で使用されるアナライトは、ＣＮＡ
Ｃとエンドヌクレアーゼの性質に依存して、ＤＮＡまた
はＲＮＡであり得る。本発明で使用されるアナライト中
の配列は、アナライトのライブラリーのすべてまたはほ
とんどに存在する、分かれた個々の配列、コンセンサス
配列、または包括的配列でもよい。本発明で使用される
ＲＮＡの例は、特に限定されないが、ｈｎＲＮＡ、ｒＲ
ＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｓｎＲＮＡを含む。
本発明で使用されるＤＮＡの例は、特に限定されない
が、染色体、１本鎖、プラスミド、ウイルス、細菌ＤＮ
Ａを含む。第２の複合体の消化は、ＲＮａｓｅＨのよう
なエンドヌクレアーゼおよび制限酵素により行われる。
ＣＮＡＣとのハイブリダイゼーションの前に、標的核酸
またはアナライト核酸はまた、消化、断片化、抽出およ
び分離を含む前処理を受ける。これらの断片化前処理
は、剪断、音波処理または化学処理のような物理的手段
を含むことができる。前処理はまた、エンドヌクレアー
ゼまたはエキソヌクレアーゼ処理を含んでよい。前処理
のために本発明で使用されるエンドヌクレアーゼの例
は、特に限定されないが、Ｓ１ヌクレアーゼ、大豆ヌク
レアーゼ、制限酵素、ＤＮＡｓｅ、リボヌクレアーゼＨ
および他のＲＮａｓｅがある。 【０１８５】キメラ核酸構築体ポリマーの種々のセグメ
ントは、同じまたは異なる骨格を含んでよい。例えば、
ＣＮＡＣの第１のセグメントがオリゴリボヌクレオチド
を含み、第２のセグメントがオリゴデオキシヌクレオチ
ドを含んでもよい。一般に、糖−リン酸骨格は、リン酸
塩、リボース、またはデオキシリボースのような天然の
要素を含むか、またはホスホロチオエートのようなリン
酸塩の類似体、アラビノシドのような糖の類似体を含有
してもよい。所望であれば、ＣＮＡＣの３’末端または
５’末端をブロックして、プライマーとして作用させる
かまたは結合に参加するのを防いでもよい。ＣＮＡＣの
セグメントはさらに、ポリペプチドのような合成骨格を
含有してもよい。塩基が、塩基対合が起きるように正し
い配向で加えられるなら、任意の合成ポリマーを骨格と
して使用することができる。この能力と有用性を有する
合成ポリマーのようなの顕著な例は、ペプチド核酸（Ｐ
ＮＡ）である。塩基は、天然の精製およびピリミジン塩
基、ならびにこれらの修飾型からなってよい。塩基はま
た、天然の塩基の類似体を含んでよい。例えば、本発明
のこの実施態様で、前記したユニバーサル塩基を使用し
てもよい。ＣＮＡＣの異なるセグメントは、同じかまた
は異なる骨格を含み、所望の機能に依存して、任意の塩
基構造体または要素であってよい。すなわち、上記の種
々の成分および要素から所望のＣＮＡＣを構築すること
ができる。成分の具体的な選択は、使用されるアナライ
トとエンドヌクレアーゼの性質に依存するであろう。 【０１８６】例えば、アナライトがＲＮＡ分子なら、第
１のセグメントの骨格がオリゴリボヌクレオチドを含
み、第２のセグメントの骨格がオリゴデオキシリボヌク
レオチドを含む時、ＲＮａｓｅＨをエンドヌクレアーゼ
として使用することができる。従って、第１のセグメン
トのＲＮＡアナライトへのハイブリダイゼーションは、
リボヌクレアーゼＨに耐性の２本鎖ＲＮＡの第１の複合
体と、ＲＮａｓｅＨ活性の基質であるＲＮＡ−ＤＮＡの
第２の複合体を作成する。ＲＮａｓｅＨで処理すると、
第２の複合体に関与するＲＮＡアナライトのすべてまた
は一部を非対称的に切断するが、第１の複合体のＲＮＡ
−ＲＮＡハイブリッドおよびＣＮＡＣの第２のセグメン
トを無傷で残すであろう。前記したように、ＣＮＡＣは
また、第３のセグメントを含んでよい。前記例におい
て、第３のセグメントがＲＮＡアナライトに相補的な
ら、第３のセグメントはまた、アナライトへのハイブリ
ダイゼーションが、ＲＮａｓｅＨの作用に対して耐性で
あるＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを生成するように、オ
リゴリボヌクレオチドを含んでよい。あるいは前記した
ように、第３のセグメントはＲＮＡアナライトには相補
的ではなく、ハイブリッドは形成されない。 【０１８７】本発明のこの態様を実施するのに使用され
る具体的なエンドヌクレアーゼの選択は、多くの要因に
依存する。エンドヌクレアーゼは、ヌクレオチドのニッ
キングまたは除去の基質としてアナライトを利用できな
ければならないため、主要な要因はアナライトの性質で
ある。第２に、エンドヌクレアーゼは、そのようなニッ
キングまたは除去が実質的に非対称であり、アナライト
鎖中で起きる状況を可能にしなければならない。第３
に、エンドヌクレアーゼは、第１のまたは第２の複合体
がエンドヌクレアーゼの作用に対して実質的に耐性であ
り続けることができるような状況を可能にしなければな
らない。最後に、エンドヌクレアーゼは、ＣＮＡＣとの
第２の複合体の形成に参加するアナライトの部分にのみ
作用する、充分な特異性を有する必要がある。前記ＲＮ
ａｓｅＨを用いる例は、これらのすべての基準を満たす
ことがわかる。 【０１８８】他の例は、本質的に非対称切断を与えるエ
ンドヌクレアーゼを利用することであろう。例えば、制
限酵素Ｎ．ＢｓｔＮＢＩを用いる２本鎖ＤＮＡの消化に
より、認識配列５’ＧＡＧＴＣ３’から４塩基下流の１
つの鎖でのみニックが生じる。すなわち、この配列に相
補的なオリゴデオキシリボヌクレオチド配列を有するキ
メラ核酸構築体の第２のセグメントと、第２のセグメン
トの結合部位に隣接する配列に相補的な第１のセグメン
トを設計することができるであろう。そのような方法
で、ＣＮＡＣをアナライトにハイブリダイズすることに
より第２の複合体が形成される時、２本鎖ＤＮＡはこの
特異的制限酵素の基質であり、アナライト配列のみが切
断を受けるであろう。前記したように、ＣＮＡＣは、エ
ンドヌクレアーゼ消化により作成されたニックの３’末
端への付加により、新規核酸配列の導入のための鋳型と
して作用することができる第３のセグメントを含有して
もよい。この例は、ＣＮＡＣが、化学的に均一な分子で
ある時でさえ、「キメラ」と見なされることの例示であ
る。例えば、上記ＣＮＡＣは、オリゴデオキシリボ核酸
のみを含む３つのセグメントを用いて合成することがで
きる。本発明においてこれは、各セグメントが異なる機
能的性質を有する（すなわち、第１のセグメントは、相
補的塩基対合と安定性を与える；第２のセグメントは、
エンドヌクレアーゼ感受性を提供する；および第３のセ
グメントは、鎖伸長の鋳型を提供する）ため、キメラ分
子であろう。この方法はまた、前記で開示した本発明の
他の実施態様と組合せてもよい。例えば、２つのセグメ
ントを有するＣＮＡＣは、前記の非対称エンドヌクレア
ーゼによる認識と消化に必要な部位でのみ、特異的ヌク
レオチドを有するユニバーサル塩基を含むことができ
る。 【０１８９】本発明のこの態様がいかに実施されるかの
別の例は、成分が修飾されるかまたは類似体を含む、人
工的または合成の第２のセグメントの使用であろう。そ
のような修飾または類似体は、ａ）第２のセグメントと
アナライトとの間でハイブリダイゼーションを起こさせ
る、ｂ）エンドヌクレアーゼ消化を受けやすい複合体を
生成するアナライトとのハイブリダイゼーション、およ
びｃ）第２のセグメントは、エンドヌクレアーゼの作用
に実質的に耐性のままである限り、この目的のために使
用される。例えば、第２のセグメントは、塩基間のホス
ホロチオエート結合を含む。２本鎖分子中の制限酵素部
位が、非修飾セグメントとホスホロチオエートセグメン
トとを含む時、非修飾セグメントのみが切断を受けるこ
とは、従来から知られている（米国特許第５，２７０，
１８４号、および米国特許第５，４５５，１６６号；参
照することにより本明細書に組み込まれる）。すなわち
第２のセグメントの制限酵素配列中に１つ以上のホスホ
ロチオエート結合を有するＣＮＡＣは、アナライトの相
補的セグメントとハイブリダイズすることができ、アナ
ライト鎖のみがエンドヌクレアーゼ消化を受けるはずで
ある。 【０１９０】一般に、第３のセグメントは、標的核酸に
関連するかまたは関連しない任意の配列セグメントを含
有してもよい。第３のセグメントは、その上で、切断さ
れた標的核酸またはアナライトがプライマーとして作用
する鋳型を提供し、こうして、所望の核酸配列がアナラ
イト中に導入されることを可能にする。アナライトへの
そのような鋳型依存性配列導入を介して、シグナル残基
または他の要素（例えば、プライマー結合配列）を、直
接アナライト中に導入することができる。さらに、その
ような方法により、ユニバーサル配列を、アナライト核
酸に導入することができ、これは後に、米国特許第５，
８９１，６３６号、およびラッバニ（Rabbani）らの米
国特許出願第０９／８９６，８９７号（これらの両方と
も、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記
載のように、アナライトのコピーを調製するための、ユ
ニバーサルプライマーまたはプライマー指令プロモータ
ー系の導入のための鋳型として作用する。核酸断片を、
そのような方法によりそのような構築体に変換すること
ができるという事実は、３’末端配列への偏り無しで、
核酸ライブラリーの均等な増幅を提供するであろう。さ
らにそのような配列は、プライミングまたは捕捉のため
に直接または増幅後に使用されるであろう。場合によ
り、エンドヌクレアーゼ切断が残りのアナライト中の遊
離３’−ＯＨを残さないなら、残りのアナライトをホス
ファターゼで処理して３’−ＯＨを作成することがで
き、これがプライミングを促進する。所望の時または場
所で、洗浄、溶融または分離工程を使用することができ
る。一般に、３つの配列セグメントを有するキメラ核酸
構築体を用いて、所望の核酸配列を任意の位置で、アナ
ライト核酸配列（任意の可能な内部配列部位を含む）に
導入することができる。 【０１９１】本発明の種々の方法は、鋳型に従う方法
で、所望の特異配列をアナライト中に導入することを可
能にし、こうしてアナライトまたはアナライトのセット
に、多様な性質と能力（プローブとして；鋳型として；
プライマーとして作用）とを付与する。ＣＮＡＣおよび
／またはＣＮＡＣを使用して標識されたアナライトは、
固体支持体（これは、試験管、キュベット、プレート、
マイクロタイターウェル、ビーズ、磁性ビーズ、および
チップを含む）に、直接または間接に固定化することが
できる。この具体例を実施するための方法と組成物は、
米国特許第４，９９４，３７３号；米国特許第４，８９
４，３２５号；米国特許第５，２８８，６０９号；およ
び米国特許第６，２２１，５８１Ｂ１号；米国特許第
５，５７８，８３２号；および米国特許第５，８４９，
４８０号に記載されている（これらはすべて、参照する
ことにより本明細書に組み込まれる）。この固定化は、
鎖伸長およびアナライトの標識の前または後に行うこと
ができる。例えば、そのような能力は、核酸アレイ分析
で使用でき、ここでは、アナライトをプローブ探索する
代わりに、アナライトは、多様なアナライトの鎖伸長の
鋳型を提供することができるＣＮＡＣのアレイを含むマ
トリックス上のプライマーとして作用する。本発明の具
体例に依存して、ハイブリダイズしたアナライトは、直
接伸長されるか、またはエンドヌクレアーゼ工程を受け
た後に伸長される。１つ以上の標識物またはシグナル残
基を、直接またはそのようなアレイとともに間接に取り
込み、アレイ上の部位への、アナライトの特異的ハイブ
リダイゼーションを示すことができる。 【０１９２】ｄ．ホモポリマー配列の部分的除去のため
のＣＮＡＣ 本発明の別の態様は、ホモポリマー配列の部分的除去の
ための新規組成物と方法を開示する。ホモポリマー配列
は、ポリＡメッセンジャーＲＮＡ中に自然に存在し、ク
ローニングに使用される多くの方法で人工的に存在す
る。後者の例は、２本鎖ｃＤＮＡ分子のポリＣとポリＧ
テイリングである（オカヤマ（Okayama）とバーグ（Ber
g）、1982, Mol. Cell. Biol. 2:161）。これらのホモ
ポリマー部分の存在は、ユニバーサルプライマー結合と
クローニングのための有利な作用を提供するが、通常必
要なのはそのほんの一部であり、大きなセグメントの存
在は実際には問題になる。例えば、ｍＲＮＡのｃＤＮＡ
コピーから作成される転写鋳型では、長いホモポリマー
セグメントは、早期の停止を誘導することがある。 【０１９３】従って、本発明は、２つのセグメントを含
むＣＮＡＣを開示する。第１のセグメントは、選択され
たホモポリマー配列に相補的であり、ホモポリマー配列
と第１のセグメントとの間で形成される複合体が、特定
のエンドヌクレアーゼの作用に対して耐性である第１の
複合体を形成するように、設計される。第２のセグメン
トもまた、ホモポリマー配列に相補的な配列を含むが、
ホモポリマーのエンドヌクレアーゼ消化を可能にする第
２の複合体を形成する。すなわち、各セグメントは、同
じ標的配列に相補的な配列を含むが、これらは、ハイブ
リダイゼーション後に付与する性質が異なる。 【０１９４】例えば、ｒＵでできた第１のセグメントと
ｄＴでできた第２のセグメントを含むＣＮＡＣは、ｍＲ
ＮＡのポリＡテイルの任意のセグメントにハイブリダイ
ズすることができる。ＲＮａｓｅＨによる消化は、第２
のセグメントにハイブリダイズしたポリＡセグメントの
みを除去する。ＣＮＡＣは、熱サイクリングまたは温度
を使用して、複数回使用することができる（ここで、第
１のセグメントまたはセグメントのみをによるハイブリ
ダイゼーションは、安定なハイブリダイゼーションには
不充分である）。例えば、１０個のｒＵと１０個のｄＴ
塩基からなるＣＮＡＣは、３７℃で２０塩基ポリＡセグ
メントに効率的にハイブリダイズすることができるであ
ろう。このセグメント中のｒＡ塩基をＲＮａｓｅＨ活性
により排除すると、ＣＮＡＣが不安定になり、これが新
しいセグメントに結合できるようになる。このプロセス
は、そのｍＲＮＡ分子が有する３’末端に残るｒＡ塩基
が２０未満になるまで続く。次に、残りの小ポリＡセグ
メントを適切なハイブリダイゼーション条件を使用する
ことにより、プライマー結合部位として使用することが
できる。ＣＮＡＣまたはオリゴＴを含有するＤＮＡプラ
イマーがこの目的に使用されるなら、この消化に使用さ
れるＲＮａｓｅＨ活性を、プライミングの前に除去して
おくことが好ましい。 【０１９５】耐性および感受性の複合体を生成するため
の上記ＣＮＡＣは、本発明を例示するためのみであり、
他のサイズも、第１のセグメントと第２のセグメントに
使用することができる。例えば、４塩基のデオキシリボ
ヌクレオチドセグメントは、ＲＮａｓｅＨ活性の基質で
ある複合体を形成するのに充分であることが証明されて
いる。ＣＮＡＣのセグメントのサイズは、エンドヌクレ
アーゼ消化の前に効率的な複合体形成があり、エンドヌ
クレアーゼ消化のために使用される条件下で、無傷にと
どまるホモポリマー標的の充分な部分があるように、設
計される。 【０１９６】さらに、本発明のＣＮＡＣは、ホモポリマ
ー標的配列に相補的であるか相補的ではない第３のセグ
メントを含むことができる。前記したように、もし第３
のセグメントが相補的なら、エンドヌクレアーゼと第３
のセグメントの性質は、第３の複合体が、エンドヌクレ
アーゼによる消化に対して耐性でとどまるようなもので
ある。第３のセグメントは、その目的に依存して、ホモ
ポリマーまたはヘテロポリマーでもよい。ＣＮＡＣの種
々のセグメント中のヌクレオチドは、所望の配列とのよ
り弱いまたはより強いハイブリッド形成を提供する、天
然の塩基またはその類似体、またはそのユニバーサル塩
基または組合せでもよい。例えば、第３のセグメント中
のユニバーサル塩基の使用は、通常の結合より弱い相補
的セグメントの合成を可能にする。すなわち、もしアナ
ライト上の新しいセグメントを、プライマー結合部位と
して使用することを所望なら、プライマー結合部位に相
補的な通常の塩基を有するプライマーは、ＣＮＡＣ中の
ユニバーサル塩基による再アニーリングに対してより有
利であろう。 【０１９７】上記の組成物、固体支持体、試薬、色素、
プライマー、核酸構築体などのいずれも、キットとして
調製でき、これらは、本明細書に記載のまたは特許請求
した方法、およびそのような方法の変法を実施するのに
使用できることを、当業者は容易に理解できるであろ
う。例えば、キットは、タンパク質または核酸標識キッ
ト、核酸処理キット、所望の核酸配列を取り込むための
キット、標的、アナライトおよびアナライトのライブラ
リーを増幅するための増幅キットとして、調製すること
ができる。合成後およびリアルタイム増幅キットもま
た、組成物、固体支持体、試薬、色素、プライマー、核
酸構築体などから調製することができる。以下の例は、
例示のためであり、決して本発明を限定するものではな
い。 【０１９８】 【実施例】例１ Ｃｙ３標識試薬の調製 （ａ）化合物Ｉ（２，３，３−トリメチルインドリニウ
ム５−スルホン）の調製 ｐ−ヒドラジノベンゼンスルホン酸（２５０ｇ）を氷酢
酸（７５０ml）および３−メチル−２−ブタノン（４２
０ml）と混合し、３時間加熱還流した。溶液を、２Ｌの
ビーカーに注ぎ、一晩冷却した。生じる懸濁液をろ過
し、酢酸で洗浄し、凍結乾燥して、残存酢酸を除去し
た。生じた固体をメタノール（１．５Ｌ）に溶解し、２
−プロパノール（９００ml）中の水酸化カリウム飽和溶
液をゆっくり加えた。溶液の色が徐々に薄くなり、２，
３，３−トリメチルインドリニウム５−スルホンのカリ
ウム塩が沈殿した。沈殿物を吸引ろ過し、２−プロパノ
ールで洗浄し、凍結乾燥により乾燥して２３８ｇの化合
物Ｉを得た。 【０１９９】（ｂ）化合物IIの調製（１−エチル−２，
３，３−トリメチルインドレンニニウム５−スルホン） 工程（ａ）で合成した化合物Ｉの一部（７８ｇ）を１，
２−ジクロロベンゼン（７００ml）に懸濁した。ヨウ化
エチル（２５０ml）を加え、混合物を、攪拌しながら９
０〜１００℃で１２時間加熱した。混合物を３Ｌの酢酸
エチル／エーテルの１：１混合物中に注ぎ、２時間攪拌
した。生じた沈殿物をろ過し、１：１の酢酸エチル／エ
ーテルで洗浄し、風乾して６８ｇの生成物（化合物II）
を得た。 【０２００】（ｃ）化合物III（６−ブロモヘキサノイ
ルアリルアミド）の調製 ６−ブロモヘキサン酸（２０ｇ）とＮ−ヒドロキシスク
シンイミド（１５ｇ）を、２００mlの無水ジメチルホル
ムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。無水ＤＭＦ（５０ml）
中のジシクロヘキシルカルボジイミド（２２ｇ）を加
え、混合物を室温で一晩放置した。沈殿した尿素をろ過
して除去し、生成物（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−
６−ブロモヘキサノエート）を含有するＤＭＦ溶液を、
−１０〜−２０℃に冷却した。Ｈ2Ｏ （１１ml）中の等
モル量のアリルアミンを、まず氷酢酸でｐＨ８〜９に
し、次にゆっくり攪拌して活性エステルにした。固体重
炭酸ナトリウム（１０ｇ）をゆっくり加えて過度の発泡
を避け、混合物を２時間で温度が−１０℃に上がるま
で、カバーをせずに放置した。混合物をＨ2Ｏ （１Ｌ）
中に注ぎ、生成物をクロロホルム（３００ml）で２回抽
出した。抽出物を、１Ｎ塩酸で１回、５％ＮａＨＣＯ3
（３００ml）で１回、そして１０％ＮａＣｌで３回洗浄
した。固体ＭｇＳＯ4 を加えてクロロホルム相を乾燥
し、攪拌しながら一晩放置した。真空下で蒸発させてク
ロロホルムを除去すると、液体が残り、これを、さらに
精製することなく次の工程に使用した。 【０２０１】（ｄ）化合物IV（化合物IIIへのリンカー
アームの添加）の調製 工程（ａ）からの化合物Ｉ（１１ｇ）と工程（ｃ）から
の化合物III（１５ｇ）を一緒に、１，２−ジクロロベ
ンゼン（１００ml）に溶解し、アルゴン下で攪拌しなが
ら１１０℃で１２時間加熱した。混合物を酢酸エチル／
エーテルの１：１混合物（７００ml）中にゆっくり注
ぎ、３０分後、固体沈殿物をろ過し、酢酸エチル／エー
テルの１：１混合物で洗浄し、風乾し、取って置いた。
フラスコの底に生成したガラス状固体を、乳鉢で砕き、
酢酸エチル／エーテルの１：１混合物で粉砕し、ろ過
し、２−プロパノールで洗浄し、真空下で乾燥し、上記
からの沈殿物と組合せて、化合物IVを得て、これをさら
に精製することなく使用した。 【０２０２】（ｅ）Ｃｙ３標識試薬（化合物Ｖ）の合成 酢酸（６０ml）中の工程（ｂ）からの化合物II（１２
ｇ）の一部とＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミジン（１０
ｇ）を、攪拌しながら１００〜１１０℃で９０分加熱し
た。反応中、２８６nmと４１５nmの吸光度を測定した。
最初の６０分中に４１５／２８６の比が増加し、次の２
０分間に２．２で一定に維持された。９０分後、ホット
混合物を７００mlの酢酸エチル／エーテルの１：１混合
物にゆっくり注いだ。生じた固体沈殿物をロートで加圧
して集め、酢酸エチル／エーテルの１：１混合物で洗浄
し、ケーキにアルゴンを通過させて乾燥した。加圧フィ
ルターロート沈殿物を集め、工程（ｄ）からの化合物IV
の６．５ｇ、５０mlのピリジンおよび５０mlの無水酢酸
の混合物に、ゆっくり加えた。３８５nmの吸光度の減少
と５５０nmの吸光度の上昇とにより、反応の進行を追跡
した。反応は、室温で攪拌しながら一晩行った。５５０
nmの吸光度は経時的に上昇し、溶液から生成物が沈殿す
ると、吸光度が急に低下した。反応の最後に、褐色の沈
殿物を集め、取って置いた。液体部分に、７倍量の酢酸
エチルを加えて処理した。生成した沈殿物を集め、最初
の沈殿物と一緒にした。ピリジンは、後のパラジウム触
媒工程を妨害するため、一緒にした沈殿物を１００mlの
０．５Ｍ炭酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ８．０）
（ＴＥＡＣ）に溶解して、残存するピリジンを除去し
た。次に、真空下で蒸発させてＴＥＡＣを除去し、固体
ペレットを残した。この生成物（化合物Ｖ）を次に、Ｈ
2Ｏ に溶解し、使用するまで−７０℃に保存した。 【０２０３】例２ Ｃｙ５標識試薬（化合物VI）の調製 例１の工程（ｂ）からの化合物II（８ｇ）と塩酸マロニ
ルアルデヒドジアニル（１０ｇ）を、氷酢酸と無水酢酸
の１：１混合物１００mlに溶解し、次に１１０℃で２時
間加熱した。この混合物を、酢酸エチル／エーテルの
１：１混合物５００mlにゆっくり注ぎ、沈殿物をろ過
し、酢酸エチル／エーテルの１：１混合物で洗浄し、上
記のようにアルゴンで乾燥した。次に沈殿物を、ピリジ
ン／無水酢酸の１：１混合物１５０mlに溶解した化合物
IVの１２ｇの混合物に、攪拌しながらゆっくり加えた。
混合物を、９０〜１００℃に維持した浴に攪拌を続けな
がら３０分間移した。所望であれば、この工程は９０分
まで延長することができた。次に反応混合物を室温まで
冷却し、沈殿物を、例１のＣｙ３標識試薬について前記
したように処理した。 【０２０４】例３ Ｃｙ３（化合物Ｖ）のｄＵＴＰへの
結合 米国特許第５，４４９，７６７号に記載のように調製し
た水銀化ｄＵＴＰ（３０μmol）を、１mlの１Ｍ酢酸リ
チウムに溶解し、例１（化合物Ｖ）で調製したＣｙ３標
識試薬（６０μmol、０．６ml）を攪拌しながら加え
た。アルゴン下でカリウムテトラクロロパラデート
（０．５mlのＨ2Ｏ 中の３０μmol）を加えた。ＨＰＬ
Ｃにより反応を追跡し、４０℃で１時間後完了した。一
晩インキュベートしても、収率は増加しなかった。反応
混合物に４倍量のアセトンを加え、−２０℃に一晩放置
した。翌日、遠心分離して沈殿物を集めた。 【０２０５】ペレットを０．１Ｍ酢酸リチウム（ｐＨ
４）に溶解し、ＤＥＡＥセファデックスＡ25カラムにの
せた。０．１Ｍ酢酸リチウム中０．１〜０．７ＭのＬｉ
Ｃｌの線形勾配により、カラムを展開させた。ＨＰＬＣ
により画分を調べ、単一の後のピークを含有する画分を
集め、取って置いた。他の群の画分は２つのピークを示
した：上記の後のピークと前のピーク。これらの画分を
一緒にし、０．１Ｍ ＬｉＣｌに調整し、再度ＤＥＡＥ
セファデックスＡ25カラムにのせ、前記したように再分
画した。再度、単一の後のピークを含有する画分を集
め、取って置いた。この例ではしなかったが、第２のク
ロマトグラフィー後に２つのピークを含有する画分を一
緒にして、別の時にカラムにのせて、単一ピーク生成物
の収率を上昇させることができた。ＨＰＬＣにより単一
の後のピークを示した画分を一緒にし、真空下で蒸発さ
せてＨ2Ｏ を除去した。最後の微量のＨ2Ｏ を、５０ml
の１００％エタノール中への半固体残渣の再懸濁と次の
溶媒留去により、除去した。アルコール工程をもう１回
繰り返した。残渣を３０mlのエタノールに再懸濁し、１
mlの３Ｍ酢酸リチウムを加えた。溶液を充分混合し、−
２０℃に一晩放置して、三リン酸の完全な沈殿を促進し
た。遠心分離して沈殿物を集め、Ｈ2Ｏ に再溶解し、部
分的に凍結乾燥して残存エタノールを除去した。生成物
の量を５５０nmの吸光度とモル吸光係数１５０，０００
により測定した。次に、溶液を１０mMのストック濃度に
再調整して、−７０℃に保存した。 【０２０６】上記方法は、Ｃｙ３標識ｄＵＴＰの調製を
記載するが、前記例で使用したＣｙ３標識試薬（例１か
らの化合物Ｖ）の代わりにＣｙ５標識試薬（例２からの
化合物VI）を使用して、Ｃｙ５標識ｄＵＴＰの調製につ
いて、同じ工程を行うことができた。 【０２０７】例４ 剛性アームリンカーと非フェニル性
ＴＡＭＲＡ類似体を用いる標識ヌクレオチドの調製 （ａ）化合物VII（３，６−ビス−（ジメチルアミノ）
−キサンテン−９−プロピオン酸）の調製 ３−（ジメチルアミノ）フェノール（５．８ｇ）を無水
コハク酸（２．１ｇ）と混合し、アルゴン下で攪拌しな
がら１２０℃で９０分加熱した。混合物を冷却し、Ｈ2
Ｏ （８０ml）を加え、混合物を１０分間加熱還流し
た。水相を捨て、暗褐色のゴム状の物質が残った。Ｈ2
Ｏ を加えてこの物質を溶解し、次に攪拌しながら１Ｍ
ＮａＯＨでｐＨ１０に調整した。次に１Ｍ塩酸を加え
て、清澄な溶液のｐＨを２に下げた。最終濃度２．５Ｍ
までＮａＣｌを添加して、色素を塩析した。沈殿物をろ
過し、ＮａＣｌ（２．５Ｍ）で洗浄し、凍結乾燥により
乾燥して、１．２ｇの化合物VIIを得た。化合物VIIの蛍
光スペクトルを図７に示す。 【０２０８】（ｂ）化合物VIII（化合物VIIの活性エス
テル）の調製 工程（ａ）からの化合物VIIをクロロホルム（２００m
l）に溶解し、攪拌しながらＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド（１．５ｇ）を加えた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドが溶解後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド（２ｇ）を加え、混合物を暗
所で一晩攪拌した。混合物をＨ2Ｏ （８０ml）で抽出
し、化合物VIIIを含有するクロロホルム相を、無水硫酸
マグネシウムで乾燥し、−２０℃で保存した。 【０２０９】（ｃ）化合物IX（グリセリルグリシンの遊
離酸型）の調製 １３ｇのグリシルグリシンを、３００mlの無水メタノー
ル中の等モルのトリエチルアミンの混合物に懸濁し、
１．５モル過剰のメチルトリフルオロ酢酸エステルと混
合した。懸濁液を、均一な溶液が得られるまで還流し
た。ロータリーエバポレーターでメタノールを除去し、
残渣を１００mlのＨ2Ｏ に懸濁した。次にｐＨを１０．
０に調整して、トリフルオログリセリルグリシンを溶液
にした。次に、塩酸でｐＨを１〜２に下げると、トリフ
ルオログリセリルグリシンが溶液から沈殿した。この混
合物を４℃で一晩放置して、生成物を完全に沈殿させ
た。翌日、沈殿物（化合物IX）をろ過して集め、次に乾
燥した。 【０２１０】（ｄ）化合物Ｘ（グリセリルグリシンのＮ
ＨＳエステル）の調製 工程（ｃ）からの１５ｇの化合物IXを１００mlのＤＭＦ
に溶解し、２倍モル過剰のＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドを攪拌しながら加えた。次に、１０mlのＤＭＦに溶解
した１．１倍モル過剰のジシクロヘキシルカルボジイミ
ドを加え、混合物を室温で一晩放置して、ＮＨＳエステ
ル（化合物Ｘ）を得た。 【０２１１】（ｅ）化合物XI（グリシルグリシンリンカ
ーを有するｄＵＴＰ）の調製 １０μmolのアリルアミンｄＵＴＰを、０．５mlの０．
３Ｍ ＮａＨＣＯ3 に溶解し、次に工程（ｄ）からの１
５μmolの化合物Ｘを加え、室温で２時間インキュベー
トして、化合物XIを得た。次に、最終濃度０．５Ｍまで
ＬｉＡｃを加え、５倍量のエタノールを加え、溶液を−
２０℃に一晩放置して、ヌクレオチド生成物（化合物X
I）を沈殿させた。室温で１時間、１ＭのＬｉＯＨ中の
沈殿物を溶解して、アミンを脱保護した。冷所で溶液を
氷酢酸で中和し、上記のようにエタノールで三リン酸を
沈殿させた。 【０２１２】（ｆ）化合物XII（テトラグリシルリンカ
ーを有するｄＵＴＰ）の調製 工程（ｅ）を繰り返して追加のグリシルグリシンリンカ
ー単位を加えることにより、工程（ｅ）からの化合物XI
をさらに処理し、５’−アリルアミド−（テトラグリシ
ル）アミンｄＵＴＰ（化合物XII）が生成した。アミン
を脱保護し、工程（ｅ）で前記したように三リン酸を沈
殿させた。 【０２１３】（ｇ）化合物XIII（ｄＵＴＰへの非フェニ
ル性ＴＡＭＲＡ類似体の結合）の調製 工程（ｆ）からの２０μmolの化合物XIIを２mlのＮａＨ
ＣＯ3 （０．３Ｍ）とＬｉＣｌ（０．７Ｍ）に溶解し、
氷上で冷却した。工程（ｂ）からのクロロホルム中の色
素活性エステル（４０μmol）（化合物VIII）を真空下
で乾燥し、ＤＭＦ（２ml）中に溶解した。次に、この溶
液を氷冷ｄＵＴＰ溶液に加え、混合物を暗所で室温で一
晩攪拌した。混合物を２０mlの水で希釈し、４℃でＤＥ
ＡＥセファデックスＡ24（２０ml）カラムにのせた。カ
ラムをＴＥＡＣ（０．１Ｍ、ｐＨ７．８、５０ml）で洗
浄し、生成物を、０．１〜０．８Ｍ ＴＥＡＣ（ｐＨ
７．８）の線形勾配により、溶出させた。ＨＰＬＣによ
り純粋な画分を一緒にした。吸引を繰り返して真空下で
ＴＥＡＣを除去し、次に水を加えた。残渣を酢酸リチウ
ム（４Ｍ）に溶解し、４倍量の無水エタノールで沈殿さ
せ、次に水に溶解し、−７０℃で保存して１３．６mgの
化合物XIIIを得た。 【０２１４】上記例では、テトラグリシル剛性アームリ
ンカーを使用したことに注意されたい。上記と同じ方法
は、他の長さの化合物を合成するのに使用できるであろ
う。例えば、工程（ｆ）からの化合物XII（テトラグリ
シルアームを有するｄＵＴＰ）は、工程（ｅ）の繰り返
しによりさらに操作し、別のグリシルグリシンを加え
て、こうしてヘキサグリシルアームを作成した。同様
に、グリシンを出発物質として、グリシルグリシンの調
製について記載した活性化工程（工程ｃとｄ）をまた行
い、こうして単一のグリシル単位の添加を可能にした。 【０２１５】例５ 剛性リンカーアームと非フェニル性
テキサスレッド類似体を有する標識ヌクレオチドの調製 （ａ）化合物XIV（３，６−ビス−ジュロリジノキサン
テン（Julolidinoxanthen）−９−プロピオン酸）の調
製 ８−ヒドロキシジュロリジン（Hydroxyjulolidine）
（１０ｇ）と無水コハク酸（２．６ｇ）をアルゴン下で
一緒にし、攪拌しながら１３０℃で２時間加熱した。混
合物を冷却し、Ｈ2Ｏ （１５０ml）を加え、混合物を１
５分間還流し、次に冷却した。水層を捨て、Ｈ2Ｏ を加
えてガラス状の暗褐色の残渣を溶解し、次に攪拌しなが
ら１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ１０に調整した。次に１Ｍ塩酸
を加えて、溶液のｐＨを２に下げ、ここで再度生成物が
沈殿した。混合物を遠心分離し、上清を捨て、ペレット
を水に懸濁し、再遠心分離して洗浄した。次に、ペレッ
トを凍結乾燥して３．６ｇの生成物（化合物XIV）を得
た。化合物XIVの蛍光スペクトルを図８に示す。 【０２１６】（ｂ）ヌクレオチドへの標識物の結合 化合物XIVの活性エステルの調製と、剛性リンカーアー
ムを有するｄＵＴＰの結合のための以後の工程は、例４
に記載のように行った。 【０２１７】例６ 剛性リンカーアームを有するシアニ
ン色素の調製 （ａ）化合物XV［（２，３，３，トリメチル−３−Ｈ−
インドール−５−イル）酢酸］の調製 １１０ｇの４−ヒドラジノ安息香酸を、攪拌しながら４
５０mlの氷酢酸および２５０mlの３−メチル−２−ブタ
ノンと混合した。混合物を１２８℃〜１３０℃で６時間
加熱し、室温で一晩放置して冷却させた。氷酢酸と３−
メチル−２−ブタノンを真空下で除去し、固体を３００
mlのＨ2Ｏ で粉砕し、ろ過し、３００mlのＨ2Ｏ で再洗
浄した。次に、ケーキを真空下で乾燥した。次に、固体
を酢酸エチルから再結晶化して化合物XVを得た。 【０２１８】（ｂ）化合物XVI（ジグリシルアリルアミ
ン）の調製 例４の工程（ｄ）からの化合物Ｘを、ＤＭＦ／Ｈ2Ｏ の
５０：５０混合物中の１．２倍過剰の酢酸アリルアミン
と反応させた。トリエチルアミンを加えて、溶液をｐＨ
８で維持し、室温で４時間反応を行った。溶液を真空下
で乾燥し、混合物をＨ2Ｏ で粉砕して、トリエチルアミ
ン塩を除去した。スラリーをろ過し、冷Ｈ2Ｏ で洗浄
し、凍結乾燥し、乾燥して化合物XVIを得た。 【０２１９】（ｃ）化合物XVII［（２，３，３トリメチ
ル−３−Ｈ−インドール−５−イル）アセトアミドジグ
リシルアリルアミン］の調製 例７で調製した２０．６ｇの化合物XVを、１００mlのＤ
ＭＦで溶解し、次に攪拌しながら２０ｇのＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドを加えた。次に、３０mlのＤＭＦに溶
解した２２ｇのジシクロヘキシルカルボジイミドの混合
物を加えた。混合物を室温で一晩放置し、翌日、ろ過し
て尿素を除去した。工程（ａ）からの３０ｇの化合物XV
Iを、エタノールとＨ2Ｏ 中の１Ｍ ＬｉＯＨの５０：
５０混合液１００mlに溶解して、アミンを放出させた。
この溶液を酢酸でｐＨ８に中和し、前記ろ液に加えた。
この溶液に等量のトリエタノールアミンをゆっくり１時
間かけて加えた。混合物を室温で一晩放置し、生じた沈
殿物をろ過し、５００mlのクロロホルムで抽出して、化
合物XVIIを得た。 【０２２０】（ｄ）化合物XVIII［ヨウ化（２，３，３
トリメチル−３−Ｈ−インドール−５−イル）アセトア
ミドジグリシルアリルアミドエチルアンモニウム］の調
製 真空により化合物XVIIからクロロホルムを除去した。ガ
ラス状の残渣を２００mlのＤＭＦに溶解し、次に真空で
ＤＭＦを除去した。残渣を１５０mlのジクロロベンゼン
および１００mlのヨウ化エチルと混合して、１００℃で
１６時間還流した。冷却後、デカントして溶媒を除去し
た。ガラス状の残渣をエーテルで粉砕して化合物XVIII
を得た。 【０２２１】（ｅ）シアニン色素とシアニン色素標識ヌ
クレオチドの調製 さらに精製することなく化合物XVIIIを使用して、例１
と２に記載のシアニン色素を合成した。化合物XVIIIで
作成したＣｙ３類似体の構造を以下に示す。 【０２２２】末端アルケン結合の存在は、例３に記載の
ようにｄＵＴＰの標識を可能にした。従来のｃＤＮＡ合
成測定法で試験すると、アマシャムバイオサイエンシー
ズ社（Amersham Biosciences Corp.）（ピスカタウェイ
（Piscataway）、ニュージャージー州）から市販されて
いるＣｙ−３標識ｄＵＴＰ（カタログ番号ＰＡ５３０２
２０）と比較して、化合物XVIIIで標識したｄＵＴＰで
は、有意に高い取り込みが見られた。 【０２２３】例７ メタ−ＥｔｈＤ、ＤＮＡ有りおよび
無し ａ）メタ−ＥｔｈＤの合成 クールマン（（Kuhlmann）ら、前述）により記載された
方法に従って、メタ−ＥｔｈＤの合成を行った。合成工
程の略図を図９に示す。この方法では、２−アミノ−ジ
フェニル−化合物（１）を酸塩化物（２）と縮合させ
て、アミド（３）を得て、次にこれを環状型に変換して
フェナントリジン（４）を得た。この化合物（４）を加
水分解して、酸（５）を得て、酸塩化物（６）に変換
し、次に１，５−ジアミノ−ペンタンと縮合させて、ホ
モダイマーを得た。このホモダイマーをメチル化して
（７）を得て、これを還元して、最終生成物（８）メタ
−ＥｔｈＤ（この構造を図２に示す）を得た。 【０２２４】ｂ）スペクトル分析 メタ−ＥｔｈＤを４９３nmで励起して、６１７nmで１×
１０5 カウント／秒の発光を得た（図１０Ａ）。２本鎖
ＤＮＡを加えると、発光は６×１０5 に増加した（図１
０Ｂ）。これに対して、３５０nmの波長で励起すると、
６００nmでの発光は２×１０4 カウント／秒であり、こ
れは、ＤＮＡを添加すると、３．２５×１０6 カウント
／秒に上昇した（図１１）。 【０２２５】例８ ドナーヌクレオチドとアクセプター
ヌクレオチドとのエネルギー移動 ＨＩＶアンチセンス構築体から作成することができるア
ンプリコンの配列を図１２に示す。この構築体の誘導の
説明は、リウ（Liu）ら（1997）J. Virol 71:4079-4085
に記載されている。試料中の標的アナライトのＰＣＲ
は、エネルギードナーとしてフルオレセインで標識した
ｄＵＴＰとエネルギーアクセプターとして例４からの化
合物XIIIで標識したｄＵＴＰの混合物の存在下で、図１
２に示すプライマーを使用して行うことができる。増幅
の最中に、これらの標識物のそれぞれを取り込む核酸鎖
が合成される。フルオレセインに適した波長で照射し、
次に化合物XIIIの発光に適した波長で照射すると、ドナ
ーヌクレオチドとアクセプターヌクレオチドが充分な近
傍にあるといつもシグナルが生成する。この目的のため
に、１本鎖または２本鎖のいずれも分析することができ
る。 【０２２６】例９ インターカレーターと取り込まれた
色素の間のエネルギー移動 例８で使用したものと同じプライマーを使用して、ＰＣ
Ｒが行われる。しかしこの例では、ＳＹＢＲグリーンと
例７からの標識ｄＵＴＰの存在下で、反応が行われる。
取り込みが進行すると、化合物XVIIIで標識したヌクレ
オチドを取り込んだ２本鎖ＤＮＡが蓄積し始める。前記
したように、ＳＹＢＲグリーンは５２１nmで最大に発光
し、化合物XVIIIは５５０nmで最大に吸収するため、Ｓ
ＹＢＲグリーンドナーからアクセプターとしての化合物
XVIIIへのエネルギー移動により、化合物XVIIIからの蛍
光は、合成の進行とともに上昇し、こうして標的配列の
増幅が成功していることを示している。 【０２２７】例１０ インターカレーターと消光物質残
基を含むプライマーを有する取り込まれた色素の間のエ
ネルギー移動 本例は、例９に記載のように行われるが、プライマーは
以下の消光物質で標識される： ５'ＣＡＵ*ＧＡＴＣＣＧＧＡＵ*ＧＧＧＡＧＧＴＧ ３’
および５'ＧＣＡＣＡＵ*ＣＣＧＧＡＵ*ＡＧＵ*ＡＧＡ
３’ ここで、Ｕ* は、約５３０nmで吸光する、シンガー（Si
nger）とホーグランド（Haugland）（米国特許第６，３
２３，３３７号）が記載した非蛍光３−アミノキサンテ
ンで修飾したウリジン残基である。ＰＣＲは、これらの
プライマーを使用して、例７からの標識ｄＵＴＰと前記
のＳＹＢＲグリーンの存在下で行われる。挿入結合した
ＳＹＢＲグリーンからの蛍光は、化合物XVIIIまたは消
光物質により吸収することができる。プライマー−ダイ
マーが形成されるなら、これらは、プライマーとこれら
の相補体のみを含む。そのようなエネルギー移動は、消
光物質で効率的に起き、こうしてプライマー−ダイマー
合成からの突発的なシグナル生成を減少させる。一方、
標的配列の増幅から得られるアンプリコンは、化合物XV
IIIのみが、エネルギー移動が起きるためにＳＹＢＲに
充分な近傍にあるセグメントを有し、合成が進むにつれ
て、標的依存性シグナルが生成される。 【０２２８】例１１ プローブと取り込まれたヌクレオ
チドの間のエネルギー移動 ＰＣＲは例８で使用したものと同じプライマーを用いて
行うことができる。この反応混合物で、ドナー候補は、
例７からの化合物XVIIIで標識したｄＵＴＰの形で供給
される。反応混合物はまた、エネルギーアクセプターと
して作用することができるテキサスレッド残基で標識し
たＤＮＡプローブを含有する。プローブは以下の配列を
有する ５’ＵFＡＡＴＧＧＵFＧＡＧＴＡＴＣＣＣＵFＧＣＣＴ
ＡＡＣＴＣＵF ３’ ここで、ＵF は、テキサスレッドで標識されたウリジン
を示す。アンプリコン中のプローブの位置を図１２に示
す。プローブはまた、伸長できないように３’末端でブ
ロックされる。増幅が行われると、標識されたアンプリ
コン鎖へのプローブのハイブリダイゼーションが、化合
物XVIIIとテキサスレッドとの間でエネルギー移動が起
きることを可能にし、これは、より多くのアンプリコン
鎖が生成されると増加する。 【０２２９】例１２ 基質としてホモポリマー標的を使
用するエンドヌクレアーゼ消化と鎖伸長 この例の工程を図１３に示す。３つのセグメントを有す
る以下の配列を有するＣＮＡＣを合成することができ
る： ５’−ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＴＴＴＴＱＱＱＱＱＱＱＱ
−３’ ここで、Ｕはウリジンリボヌクレオチドであり、Ｔはチ
ミジンデオキシリボヌクレオチドであり、Ｑはイノシン
リボヌクレオチドであり、３’末端は、伸長を防ぐため
に修飾されている。本例において、リボヌクレオチド
は、シバハラ（Shibahara）ら（1987）Nucleic Acids R
es. 15:4403-4415とバラノフ（Baranov）ら（1997）Nuc
leic Acids Res. 25:2266-2273（この両方とも参照する
ことにより本明細書に組み込まれる）が記載したように
２’−Ｏ−メチルである。ＣＮＡＣは、ポリＡ ｍＲＮ
Ａのライブラリーとハイブリダイズ（工程Ａ）して、以
下を形成する：ポリＡテイルの一部に結合したオリゴ−
ウリジン第１のセグメントとの第１の複合体、ポリＡテ
イルの一部に結合したオリゴ−チミジン第２のセグメン
トとの第２の複合体、ポリＡテイルの一部に結合したオ
リゴ−イノシン第３のセグメントとの第３の複合体。 【０２３０】本例において、４つのデオキシリボヌクレ
オチドは充分であることが知られているため、第１の複
合体と第３の複合体は、ＲＮａｓｅＨの作用に対して耐
性であり、第２の複合体は、ＲＮＡｓｅ活性の基質を形
成する。２０〜２５℃でＲＮａｓｅＨで消化（工程Ｂ）
すると、第２の複合体中のオリゴＴに結合したポリＡセ
グメントの切断が誘導され、切断されたポリＡテイルが
放出される。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよび逆転写酵素を供
給すると、ｍＲＮＡの３’末端が伸長可能となる（工程
Ｃ）。さらに、もしＲＮａｓｅＨ消化工程中にこれらの
試薬が存在すると、これらは、前記したようにエンドヌ
クレアーゼ性切断後の３’末端へのＣＮＡＣの結合を安
定化するのを助ける。イノシンは、鋳型として使用され
ると、ポリＡセグメントに結合することができるが、こ
れはシトシンを優先的に取り込み、こうして新しいオリ
ゴＣセグメントをｍＲＮＡの末端に導入することに注意
されたい。ＣＮＡＣを除去すると、相補的オリゴＧセグ
メントとＲＮＡプロモーター配列を含有するオリゴヌク
レオチドのプライマー結合部位として、オリゴＣセグメ
ントを使用することが可能になる。次に、ｃＤＮＡ鎖の
合成、第２のｃＤＮＡ鎖の産生、および標識ライブラリ
ーの生成は、米国特許第５，８９１，６３６号とラッバ
ニ（Rabbani）ら、米国特許出願第０９／８９６，８９
７号（２００１年６月３０日出願）を含む既に記載され
た任意の方法により行われる。 【０２３１】例１３ アナライトへのＲＮＡポリメラー
ゼ配列の付加 本例は、例１２に記載のように行われるが、ＣＮＡＣの
第３のセグメントは、非修飾リボヌクレオチドを含み、
ＲＮＡプロモーターの配列を含有する。従って、工程
（ｃ）の鎖伸長後、新しい第３の複合体が形成され、こ
こで、伸長されたヌクレオチドはデオキシリボヌクレオ
チドであり、ＣＮＡＣ第３のセグメントはリボヌクレオ
チドを含む。これはＲＮａｓｅＨ消化の基質であり、Ｒ
ＮＡプロモーター配列に相補的なｍＲＮＡの３’末端
で、１本鎖セグメントを形成するのに使用することがで
きる。次に、プロモーター配列を有するプライマーをｍ
ＲＮＡの伸長セグメントにハイブリダイズさせて、５’
末端にプロモーターを有するｃＤＮＡを合成することが
できる。以後は、例１２に記載のように行われる。ＣＮ
ＡＣの残りの部分は、プライマーの結合前に除去される
か、またはプライマーの伸長は、鎖の除去を可能にす
る。 【０２３２】例１４ 酵素に触媒された鎖内転位後に発
光することができるジオキセタン誘導体の調製 ジオキセタンの誘導のための中間体化合物を合成するの
に使用できる工程の略図を、図１４に示す。この略図に
示す工程のシリーズは、標準的な化学法を使用して行う
ことができる。この方法の最後の工程で、化合物（ｅ）
はジオキセタン誘導体に結合される（ここで「Ｑ」と
「Ｚ」の両方とも既に記載したものである）。このジオ
キセタン誘導体（ｆ）は、本発明で開示し定義した環の
隣接部位に結合したＲ１とＲ２基を含む。 【０２３３】例１５ 例１４からの化合物（ｆ）を用い
る酵素依存性事象の可能なシリーズ アシラーゼＩの存在下で、図１５の化合物（ｇ）に変換
される化合物（ｆ）により示される遊離の一級アミンを
生成する切断が起きる。化合物（ｇ）中のベンゾイル残
基への放出される一級アミンの近接性と、遷移状態の６
員環化合物（ｈ）の以後の生成のために、化合物（ｉ）
を生成する内部転位は、非常に速い反応である。化合物
（ｉ）中のフェノキシ基の存在は、これを不安定なジオ
キセタンとし、これは分解する時光を生成する。アシル
残基およびアシル基に結合した鎖の一級アミンまたはチ
オールで、同様の置換が起きることは、すでに文献に記
載されている。これらの既に記載された反応は、本例に
示す反応の好適な速度は持たない。 【０２３４】本例は、Ｒ１をＲ1 * に変換する酵素反応
を示し、こうして環の１つの部位に結合した鎖の末端に
ある反応性基Ｇ１を産生する。この具体例では、アシラ
ーゼＩは酵素であり、Ｇ１は遊離の一級アミンである。
Ｇ１との反応は続き、Ｇ１は、環の異なる部位に結合し
たベンゾイル基（Ｇ２）と相互作用する。この中間体
を、図１５に（ｈ）として示す。アミンとベンゾイル基
（それぞれＧ１とＧ２）の間で内部転位が起き、こうし
て、ベンゾイル基の鎖内移動が起き、不安定な発光性ジ
オキセタンが生成する。 【０２３５】上記の詳細な説明と本発明の例から、当業
者には多くの変更が可能であろう。そのような変更は、
さらに特許請求の範囲で詳細に説明する本発明の範囲と
精神により完全に包含される。
【図面の簡単な説明】 【図１】剛性極性単位で作成したリンカーアームのいく
つかの例を示す。 【図２】臭化エチジウムの種々のホモダイマーの構造を
示す：Ａ）メタ−ＥｔｈＤ、Ｂ）ＥｔｈＤ−１、および
Ｃ）ＥｔｈＤ−２。 【図３】第１および第２のエネルギー移動要素を有する
プライマーの使用を例示する：２つのプライマーの伸長
から作成した２本鎖核酸、２本鎖ＳＤＡアンプリコン、
ネステッド（nested）ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応。 【図４】２本鎖核酸中のプライマーの位置の変化を示
す。 【図５】エネルギー移動要素を有するプライマーの使用
の例示である。 【図６】エネルギー移動要素を有するマトリックスの使
用を示す。 【図７】ＴＡＭＲＡの非フェニル性類似体のスペクトル
である。 【図８】テキサスレッドの非フェニル性類似体のスペク
トルである。 【図９】ホモダイマーの合成法の概略である。 【図１０】ＤＮＡの存在下および非存在下での４９３nm
でメタ−ＥｔＢｒを照射した結果を示す。 【図１１】ＤＮＡの存在下での３５０nmでメタ−ＥｔＢ
ｒを照射した結果を示す。 【図１２】本発明のエネルギー移動の新規使用を例示す
るために以下の例で使用した、ＨＩＶアンチセンスアン
プリコンの配列と、２つのプライマーと１つのプローブ
の配列を示す。 【図１３】オリゴＣプライマー結合配列の取り込みによ
る、ポリＡテイル部分を排除するためのＣＮＡＣの使用
を示す。 【図１４】ジオキサン誘導体の合成のための種々の工程
を示す。 【図１５】ジオキサンの不安定な発光型の酵素的産生を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (72)発明者 ジャニス ジー、スタブリアノポウロス アメリカ合衆国 ニューヨーク、ベイショ ア、サウス クリントン アヴェニュー 99、アパートメント 10シー (72)発明者 ジェイムズ ジェイ、ドネガン アメリカ合衆国 ニューヨーク、ロングビ ーチ、イースト ブロードウェイ 210、 アパートメント ３ジー (72)発明者 ジャック、コールマン アメリカ合衆国 ニューヨーク、イースト ノースポート、 ファーウッド ドライ ブ 37 (72)発明者 ダカイ リュー アメリカ合衆国 ニューヨーク、アイスリ ップ、 フィッチバーグ ストリート 56 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 CA10 CA11 CA12 HA08 HA11 HA13 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 CC13 FA12 GA02 GA03 4B063 QA13 QQ42 QQ52 QR01 QR08 QR13 QR14 QR32 QR35 QR48 QR55 QR56 QR58 QR62 QR63 QR66 QR82 QS03 QS25 QS32 QS34 QS36 QS39 QX02

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 少なくとも２つの部分を含む組成物であ
    って、 第１の部分は、 （ｉ）少なくとも１つの第１のエネルギー移動要素と （ii）目的の核酸の少なくとも一部の配列に相補的な核
    酸配列とを含む、少なくとも１つの第１の核酸プライマ
    ーまたは核酸構築体を含み、 第２の部分は、 （ｉ）少なくとも１つの第２のエネルギー移動要素と （ii）目的の核酸の少なくとも一部の核酸配列と同一で
    ある核酸配列とを含む、少なくとも１つの第２の核酸プ
    ライマーまたは核酸構築体を含み、 ここで、第１の核酸プライマーまたは核酸構築体は第２
    のエネルギー移動要素を含まず、第２の核酸プライマー
    または核酸構築体は第１のエネルギー移動要素を含まな
    い、上記組成物。 【請求項２】 第１のエネルギー移動要素がエネルギー
    ドナーであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターであるか、または第１のエネルギー移
    動要素がエネルギーアクセプターであり、かつ第２のエ
    ネルギー移動要素がエネルギードナーである、請求項１
    の組成物。 【請求項３】 第１の核酸プライマーまたは構築体は、
    ２つ以上の第１のエネルギー移動要素を含む、請求項１
    の組成物。 【請求項４】 第２の核酸プライマーまたは構築体は、
    ２つ以上の第２のエネルギー移動要素を含む、請求項１
    の組成物。 【請求項５】 第１の部分は、２つ以上の核酸プライマ
    ーまたは核酸構築体を含むか、第２の部分は、２つ以上
    の核酸プライマーまたは核酸構築体を含むか、または第
    １の部分と第２の部分の両方は、２つ以上の核酸プライ
    マーまたは核酸構築体を含む、請求項１の組成物。 【請求項６】 ２つ以上の核酸プライマーまたは核酸構
    築体は、同一のまたは異なる核酸配列を含む、請求項５
    の組成物。 【請求項７】 第１のエネルギー要素と第２のエネルギ
    ー要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソ
    チオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオレ
    セイン（６−ＦＡＭ）、ナフトフルオレセイン、ローダ
    ミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＸ、ロドール、スル
    ホローダミン１０１、テトラメチルローダミン（ＴＡＭ
    ＲＡ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート
    （ＴＲＩＴＣ）、４，７−ジクロロローダミン、エオシ
    ン、エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ダンシ
    ル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはｐ
    −（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣ
    ＹＬ）、シアニン色素、または前記のいずれかの誘導体
    を含む、請求項１の組成物。 【請求項８】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ３ま
    たはＣｙ５を含む、請求項７の組成物。 【請求項９】 核酸プライマーまたは構築体の少なくと
    も１つは、固体支持体に固定または固定化されている、
    請求項１の組成物。 【請求項１０】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイ
    クロタイタープレート、ガラススライド、プラスチック
    スライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはくぼ
    みを含む、請求項９の組成物。 【請求項１１】 固定または固定化は、直接または間接
    である、請求項１の組成物。 【請求項１２】 少なくとも２つの部分を含む組成物で
    あって、 第１の部分は、少なくとも２つのセグメントを含み、こ
    こで、第１のセグメントは、第１の核酸プライマーまた
    は核酸構築体と、少なくとも１つの第１のエネルギー移
    動要素を含み、第２のセグメントは、目的の核酸の少な
    くとも一部に相補的なプライマー伸長を含み、そして第
    ２の部分は、少なくとも２つのセグメントを含み、ここ
    で、第２の部分の第１のセグメントは、第２の核酸プラ
    イマーまたは核酸構築体と、少なくとも１つの第２のエ
    ネルギー移動要素を含み、第２の部分の第２のセグメン
    トは、目的の核酸の少なくとも一部と同一のプライマー
    伸長核酸配列を含み、 ここで、第１の核酸プライマーまたは核酸構築体は第２
    のエネルギー移動要素を含まず、第２の核酸プライマー
    または核酸構築体は第１のエネルギー移動要素を含まな
    い、上記組成物。 【請求項１３】 第１のエネルギー移動要素がエネルギ
    ードナーであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギーアクセプターであるか、または第１のエネルギー
    移動要素がエネルギーアクセプターであり、かつ第２の
    エネルギー移動要素がエネルギードナーである、請求項
    １２の組成物。 【請求項１４】 第１の核酸プライマーまたは構築体
    は、２つ以上の第１のエネルギー移動要素を含む、請求
    項１２の組成物。 【請求項１５】 第２の核酸プライマーまたは構築体
    は、２つ以上の第２のエネルギー移動要素を含む、請求
    項１２の組成物。 【請求項１６】 第１の部分は、２つ以上の核酸プライ
    マーまたは核酸構築体を含むか、第２の部分は、２つ以
    上の核酸プライマーまたは核酸構築体を含むか、または
    第１の部分と第２の部分の両方は、２つ以上の核酸プラ
    イマーまたは核酸構築体を含む、請求項１の組成物。 【請求項１７】 ２つ以上の核酸プライマーまたは核酸
    構築体は、同一のまたは異なる核酸配列を含む、請求項
    １６の組成物。 【請求項１８】 第１のエネルギー要素と第２のエネル
    ギー要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイ
    ソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオ
    レセイン（６−ＦＡＭ）、ナフトフルオレセイン、ロー
    ダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＸ、ロドール、ス
    ルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン（ＴＡ
    ＭＲＡ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート
    （ＴＲＩＴＣ）、４，７−ジクロロローダミン、エオシ
    ン、エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ダンシ
    ル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはｐ
    −（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣ
    ＹＬ）、シアニン色素、または前記のいずれかの誘導体
    を含む、請求項１２の組成物。 【請求項１９】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ３
    またはＣｙ５を含む、請求項１８の組成物。 【請求項２０】 核酸プライマーまたは構築体の少なく
    とも１つは、固体支持体に固定または固定化されてい
    る、請求項１２の組成物。 【請求項２１】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイ
    クロタイタープレート、ガラススライド、プラスチック
    スライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはくぼ
    みを含む、請求項２０の組成物。 【請求項２２】 固定または固定化は、直接または間接
    である、請求項１２の組成物。 【請求項２３】 プライマー伸長配列は、ＤＮＡポリメ
    ラーゼにより付加されるかまたは影響を受ける、請求項
    １２の組成物。 【請求項２４】 プライマー伸長配列は、リガーゼによ
    り付加されるかまたは影響を受ける、請求項１２の組成
    物。 【請求項２５】 ２つの核酸鎖を含む組成物であって、
    ２つの鎖の第１は少なくとも１つの第１のエネルギー移
    動要素を含み、２つの鎖の第２は少なくとも１つの第２
    のエネルギー移動要素を含み、ここで第１の鎖またはそ
    の一部は、第２の鎖またはその一部にハイブリダイズし
    ており、第１の鎖は第２のエネルギー移動要素が欠如
    し、第２の鎖は第２のエネルギー移動要素が欠如してい
    る、上記組成物。 【請求項２６】 第１のエネルギー移動要素がエネルギ
    ードナーであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギーアクセプターであるか、または第１のエネルギー
    移動要素がエネルギーアクセプターであり、かつ第２の
    エネルギー移動要素がエネルギードナーである、請求項
    ２５の組成物。 【請求項２７】 第１の鎖は、２つ以上の第１のエネル
    ギー移動要素を含む、請求項２５の組成物。 【請求項２８】 第２の鎖は、２つ以上の第２のエネル
    ギー移動要素を含む、請求項２５の組成物。 【請求項２９】 第１のエネルギー要素と第２のエネル
    ギー要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイ
    ソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオ
    レセイン（６−ＦＡＭ）、ナフトフルオレセイン、ロー
    ダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＸ、ロドール、ス
    ルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン（ＴＡ
    ＭＲＡ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート
    （ＴＲＩＴＣ）、４，７−ジクロロローダミン、エオシ
    ン、エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ダンシ
    ル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはｐ
    −（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣ
    ＹＬ）、シアニン色素、または前記のいずれかの誘導体
    を含む、請求項２５の組成物。 【請求項３０】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ３
    またはＣｙ５を含む、請求項２９の組成物。 【請求項３１】 鎖の少なくとも１つは、固体支持体に
    固定または固定化されている、請求項２５の組成物。 【請求項３２】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイ
    クロタイタープレート、ガラススライド、プラスチック
    スライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはくぼ
    みを含む、請求項３１の組成物。 【請求項３３】 固定または固定化は、直接または間接
    である、請求項２５の組成物。 【請求項３４】 試料中の目的の１本鎖または２本鎖核
    酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であっ
    て、 （ａ）（ｉ）請求項１の組成物、 （ii）目的の核酸を含有することが疑われる試料、およ
    び （iii）核酸鎖伸長を実施するための試薬、を提供する
    工程； （ｂ）上記（ｉ）、（ii）および（iii）を含む反応混
    合物を形成する工程； （ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ｉ）
    中の第１の核酸プライマーに目的の核酸の１つの鎖を接
    触させ、そしてハイブリダイゼーション条件下で、組成
    物（ｉ）中の第２の核酸プライマーに目的の核酸の相補
    鎖（存在するなら）を接触させる工程； （ｄ）第１の核酸プライマーと第２の核酸プライマーと
    を伸長して、第１のプライマー伸長核酸配列と、第２の
    プライマー伸長核酸配列（もし相補鎖が存在するなら）
    を形成させる工程； （ｅ）第１のプライマー伸長核酸配列を目的の核酸から
    分離し、第２のプライマー伸長核酸配列を目的の核酸の
    相補鎖（もし存在するなら）から分離する工程； （ｆ）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ｉ）
    中の第１の核酸プライマーに、目的の核酸または工程
    （ｅ）からの第２のプライマー伸長核酸配列を接触さ
    せ、ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ｉ）中
    の第２の核酸プライマーに、工程（ｅ）からの第１のプ
    ライマー伸長核酸配列を接触させる工程；そして （ｇ）組成物（ｉ）中の第１と第２のエネルギー移動要
    素により、目的の核酸の存在または量を検出する工程、
    とを含む上記方法。 【請求項３５】 目的の核酸の相補鎖が存在する、請求
    項３４の方法。 【請求項３６】 接触工程（ｆ）後の、処理は伸長工程
    （ｅ）を繰り返すことをさらに含む、請求項３４の方
    法。 【請求項３７】 処理は、第２のプライマー伸長核酸配
    列から第１のプライマー伸長核酸配列を分離し、次に工
    程（ｆ）を繰り返すことをさらに含む、請求項３６の方
    法。 【請求項３８】 工程（ｄ）、（ｅ’）および（ｆ）が
    繰り返される、請求項３７の方法。 【請求項３９】 検出工程（ｇ）は、伸長工程（ｄ）、
    分離工程（ｅ’）、または接触工程（ｆ）の間、または
    その後に行われる、請求項３８の方法。 【請求項４０】 提供工程（ａ）において、試薬（ii
    i）はＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、またはこ
    の両方を含む、請求項３４、３６、３７または３８の方
    法。 【請求項４１】 ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガー
    ゼ、またはこの両方は、熱安定性である、請求項４０の
    方法。 【請求項４２】 分離工程は、熱変性または鎖置換によ
    り行われる、請求項３４、３６、３７または３８の方
    法。 【請求項４３】 目的の核酸（ii）は、反応混合物形成
    工程（ｂ）の前またはその最中に、１本鎖にされてい
    る、請求項３４の方法。 【請求項４４】 提供工程（ａ）において、第１のエネ
    ルギー移動要素がエネルギードナーであり、かつ第２の
    エネルギー移動要素がエネルギーアクセプターである
    か、または第１のエネルギー移動要素がエネルギーアク
    セプターであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギードナーである、請求項３４の方法。 【請求項４５】 提供工程（ａ）において、第１の核酸
    プライマーまたは構築体は、２つ以上の第１のエネルギ
    ー移動要素を含む、請求項３４の方法。 【請求項４６】 提供工程（ａ）において、第２の核酸
    プライマーまたは構築体は、２つ以上の第２のエネルギ
    ー移動要素を含む、請求項３４の方法。 【請求項４７】 提供工程（ａ）において、２つ以上の
    第１の核酸プライマーまたは核酸構築体、または２つ以
    上の第２の核酸プライマーまたは核酸構築体、またはこ
    の両方が提供される、請求項３４の方法。 【請求項４８】 提供工程（ａ）において、第１のエネ
    ルギー要素と第２のエネルギー要素は独立に、フルオレ
    セイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
    Ｃ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、
    ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、
    ローダミンＸ、ロドール、スルホローダミン１０１、テ
    トラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルロ
    ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、４，７−
    ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシア
    ネート（ＥＩＴＣ）、ダンシル、ヒドロキシクマリン、
    メトキシクマリン、またはｐ−（ジメチルアミノフェニ
    ルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、シアニン色素、ま
    たは前記のいずれかの誘導体を含む、請求項３４の方
    法。 【請求項４９】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ３
    またはＣｙ５を含む、請求項４８の方法。 【請求項５０】 第１のまたは第２の核酸プライマーま
    たは構築体の少なくとも１つは、固体支持体に固定また
    は固定化されている、請求項３４の方法。 【請求項５１】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイ
    クロタイタープレート、ガラススライド、プラスチック
    スライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはくぼ
    みを含む、請求項５０の方法。 【請求項５２】 固定または固定化は、直接または間接
    である、請求項５０の方法。 【請求項５３】 いずれかまたはすべての工程が、閉じ
    た容器系で行われる、請求項３４、３６、３７または３
    ８の方法。 【請求項５４】 閉じた容器系は、照射源と検出装置ま
    たはユニットを含む、請求項５３の方法。 【請求項５５】 プライマーまたは核酸構築体を含む第
    １のセグメントと、プライマー伸長配列を含む第２のセ
    グメントとの、２つのセグメントを含む核酸鎖を含む組
    成物であって、 ここで、プライマーまたは核酸構築体は、第１のエネル
    ギー移動要素を含み、プライマー伸長配列は第２のエネ
    ルギー移動要素を含み、プライマー伸長配列は２つ以上
    のヌクレオチドを含む、上記組成物。 【請求項５６】 第１のエネルギー移動要素がエネルギ
    ードナーであり、第２のエネルギー移動要素がエネルギ
    ーアクセプターである、請求項５５の組成物。 【請求項５７】 第１のエネルギー移動要素がエネルギ
    ーアクセプターであり、第２のエネルギー移動要素がエ
    ネルギードナーである、請求項５５の組成物。 【請求項５８】 第１の核酸プライマーまたは構築体
    は、２つ以上の第１のエネルギー移動要素を含む、請求
    項５５、５６または５７のいずれかの組成物。 【請求項５９】 プライマー伸長配列は、２つ以上の第
    ２のエネルギー移動要素を含む、請求項５５、５６また
    は５７のいずれかの組成物。 【請求項６０】 第１のエネルギー要素と第２のエネル
    ギー要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイ
    ソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオ
    レセイン（６−ＦＡＭ）、ナフトフルオレセイン、ロー
    ダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＸ、ロドール、ス
    ルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン（ＴＡ
    ＭＲＡ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート
    （ＴＲＩＴＣ）、４，７−ジクロロローダミン、エオシ
    ン、エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ダンシ
    ル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはｐ
    −（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣ
    ＹＬ）、シアニン色素、または前記のいずれかの誘導体
    を含む、請求項５５の組成物。 【請求項６１】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ３
    またはＣｙ５を含む、請求項６０の組成物。 【請求項６２】 プライマーまたは核酸構築体を含む第
    １のセグメントと、プライマー伸長配列を含む第２のセ
    グメントとの、２つのセグメントを含む第２の核酸鎖を
    さらに含む、請求項５５の組成物であって、 ここで、プライマーまたは核酸構築体は、第１のエネル
    ギー移動要素を含み、プライマー伸長配列は第２のエネ
    ルギー移動要素を含む、上記組成物。 【請求項６３】 核酸プライマーまたは構築体は、固体
    支持体に固定または固定化されている、請求項５５また
    は６２の組成物。 【請求項６４】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイ
    クロタイタープレート、ガラススライド、プラスチック
    スライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはくぼ
    みを含む、請求項６３の組成物。 【請求項６５】 固定または固定化は、直接または間接
    である、請求項６３または６４の組成物。 【請求項６６】 試料中の目的の１本鎖または２本鎖核
    酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であっ
    て、 （ａ）（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われる試
    料、 （ii）（Ａ）目的の核酸の少なくとも一部に相補的な核
    酸配列と （Ｂ）第１のエネルギー移動要素とを含む、核酸プライ
    マーまたは核酸構築体、 （iii）第２のエネルギー移動要素を含む標識ヌクレオ
    チド；および （iv）核酸鎖伸長を実施するための試薬、を提供する工
    程； （ｂ）上記（ｉ）、（ii）、（iii）および（iv）を含
    む反応混合物を形成する工程； （ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii）
    中の核酸プライマーに目的の核酸を接触させる工程； （ｄ）２つ以上のヌクレオチドにより核酸プライマーを
    伸長させ、こうして標識ヌクレオチドを取り込む工程；
    そして （ｅ）核酸プライマー中の第１のエネルギー移動要素
    と、取り込まれたヌクレオチド中の第２のエネルギー移
    動要素の間のエネルギー移動により、目的の核酸の存在
    または量を検出する工程、とを含む上記方法。 【請求項６７】 目的の核酸（ｉ）は、反応混合物形成
    工程（ｂ）の前またはその最中に、１本鎖にされてい
    る、請求項６６の方法。 【請求項６８】 検出工程（ｅ）の前に、（ｂ’）伸長
    された核酸を目的の核酸から分離する工程と、接触工程
    （ｃ）と伸長工程（ｄ）とをさらに含む、請求項６６の
    方法。 【請求項６９】 分離工程（ｂ’）、接触工程（ｃ）、
    および伸長工程（ｄ）は、１回以上繰り返される、請求
    項６８の方法。 【請求項７０】 提供工程（ａ）において、試薬（ｖ）
    は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項６６の方
    法。 【請求項７１】 分離工程は、熱変性または鎖置換によ
    り行われる、請求項６８または６９の方法。 【請求項７２】 提供工程（ａ）において、第１のエネ
    ルギー移動要素がエネルギードナーであり、かつ第２の
    エネルギー移動要素がエネルギーアクセプターである
    か、または第１のエネルギー移動要素がエネルギーアク
    セプターであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギードナーである、請求項６６の方法。 【請求項７３】 提供工程（ａ）において、核酸プライ
    マーまたは構築体は、２つ以上の第１のエネルギー移動
    要素を含む、請求項６６の方法。 【請求項７４】 提供工程（ａ）において、第１のエネ
    ルギー要素と第２のエネルギー要素は独立に、フルオレ
    セイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
    Ｃ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、
    ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、
    ローダミンＸ、ロドール、スルホローダミン１０１、テ
    トラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルロ
    ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、４，７−
    ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシア
    ネート（ＥＩＴＣ）、ダンシル、ヒドロキシクマリン、
    メトキシクマリン、またはｐ−（ジメチルアミノフェニ
    ルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、シアニン色素、ま
    たは前記のいずれかの誘導体を含む、請求項６６の方
    法。 【請求項７５】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ３
    またはＣｙ５を含む、請求項７４の方法。 【請求項７６】 核酸プライマーまたは構築体は、固体
    支持体に固定または固定化されている、請求項６６の方
    法。 【請求項７７】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイ
    クロタイタープレート、ガラススライド、プラスチック
    スライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはくぼ
    みを含む、請求項７６の方法。 【請求項７８】 固定または固定化は、直接または間接
    である、請求項７６の方法。 【請求項７９】 いずれかまたはすべての工程が、閉じ
    た容器系で行われる、請求項６６、６８、または６９の
    方法。 【請求項８０】 閉じた容器系は、照射源と検出装置ま
    たはユニットを含む、請求項７９の方法。 【請求項８１】 試料中の目的の１本鎖または２本鎖核
    酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であっ
    て、 （ａ）（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われる試
    料、 （ii）目的の核酸の１つの鎖の少なくとも一部に相補的
    な核酸配列を含む、第１の核酸プライマーまたは核酸構
    築体、 （iii）１つの鎖の少なくとも一部と同一の核酸配列を
    含む、第２の核酸プライマーまたは核酸構築体、 （iv）第１のエネルギー移動要素を含む標識ヌクレオチ
    ド；および （ｖ）核酸鎖伸長を実施するための試薬、を提供する工
    程であって、ここで（ii）、（iii）または（ii）と（i
    ii）の両方は第２のエネルギー移動要素を含む、工程； （ｂ）上記（i）、（ii）、（iii）、（iv）および
    （ｖ）を含む反応混合物を形成する工程； （ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii）
    中の第１の核酸プライマーに目的の核酸の１つの鎖を接
    触させ、ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii
    i）中の第２の核酸プライマーに目的の核酸の相補鎖
    （もし存在するなら）を接触させる工程； （ｄ）第１の核酸プライマーと第２の核酸プライマーと
    を伸長して、第１のプライマー伸長核酸配列と第２のプ
    ライマー伸長核酸配列（もし相補鎖が存在するなら）を
    形成させて、こうして標識ヌクレオチドを取り込む工
    程； （ｅ）第１のプライマー伸長核酸配列を目的の核酸から
    分離し、第２のプライマー伸長核酸配列を目的の核酸の
    相補鎖（もし存在するなら）から分離する工程； （ｆ）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii）
    中の第１の核酸プライマーに、目的の核酸または工程
    （ｅ）からの第２のプライマー伸長核酸配列を接触さ
    せ、ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（iii）
    中の第２の核酸プライマーに、工程（ｅ）からの第１の
    プライマー伸長核酸配列を接触させる工程；そして （ｇ）第１の核酸プライマー、第２の核酸プライマー、
    またはこの両方中の第２のエネルギー移動要素と、取り
    込まれたヌクレオチド中の第１のエネルギー要素の間の
    エネルギー移動により、目的の核酸の存在または量を検
    出する工程、とを含む上記方法。 【請求項８２】 目的の核酸の相補鎖が存在する、請求
    項８１の方法。 【請求項８３】 目的の核酸（ｉ）は、反応混合物形成
    工程（ｂ）の前またはその最中に、１本鎖にされてい
    る、請求項８２の方法。 【請求項８４】 検出工程（ｆ）の後に、伸長工程
    （ｄ）とをさらに繰り返すことを含む、請求項８１の方
    法。 【請求項８５】 第１のプライマー伸長核酸配列を第２
    のプライマー伸長核酸配列から分離する工程（ｅ’）
    と、次に工程（ｆ）を繰り返すことをさらに含む、請求
    項８４の方法。 【請求項８６】 工程（ｄ）、（ｅ’）および（ｆ）は
    繰り返される、請求項８５の方法。 【請求項８７】 検出工程（ｇ）は、伸長工程（ｄ）、
    分離工程（ｅ’）、または接触工程（ｆ）の間またはそ
    の後に、特定の間隔で行われる、請求項８１、８４、８
    ５、または８６の方法。 【請求項８８】 提供工程（ａ）において、試薬（ｖ）
    は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項８１、８
    ４、８５、または８６の方法。 【請求項８９】 分離工程は、熱変性または鎖置換によ
    り行われる、請求項８１、８４、８５、または８６の方
    法。。 【請求項９０】 提供工程（ａ）において、第１のエネ
    ルギー移動要素がエネルギードナーであり、かつ第２の
    エネルギー移動要素がエネルギーアクセプターである
    か、または第１のエネルギー移動要素がエネルギーアク
    セプターであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギードナーである、請求項８１の方法。 【請求項９１】 提供工程（ａ）において、第１の核酸
    プライマーまたは構築体は、２つ以上の第１のエネルギ
    ー移動要素を含む、請求項８１の方法。 【請求項９２】 提供工程（ａ）において、第２の核酸
    プライマーまたは構築体は、２つ以上の第２のエネルギ
    ー移動要素を含む、請求項８１の方法。 【請求項９３】 提供工程（ａ）において、２つ以上の
    第１の核酸プライマーまたは核酸構築体、または２つ以
    上の第２の核酸プライマーまたは核酸構築体、またはこ
    の両方が提供される、請求項８１の方法。 【請求項９４】 提供工程（ａ）において、第１のエネ
    ルギー要素と第２のエネルギー要素は独立に、フルオレ
    セイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
    Ｃ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、
    ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、
    ローダミンＸ、ロドール、スルホローダミン１０１、テ
    トラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルロ
    ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、４，７−
    ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシア
    ネート（ＥＩＴＣ）、ダンシル、ヒドロキシクマリン、
    メトキシクマリン、またはｐ−（ジメチルアミノフェニ
    ルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、シアニン色素、ま
    たは前記のいずれかの誘導体を含む、請求項８１の方
    法。 【請求項９５】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ３
    またはＣｙ５を含む、請求項９４の方法。 【請求項９６】 少なくとも１つの第１のまたは第２の
    核酸プライマーまたは構築体は、固体支持体に固定また
    は固定化されている、請求項８１の方法。 【請求項９７】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイ
    クロタイタープレート、ガラススライド、プラスチック
    スライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはくぼ
    みを含む、請求項９６の方法。 【請求項９８】 固定または固定化は、直接または間接
    である、請求項９６の方法。 【請求項９９】 いずれかまたはすべての工程が、閉じ
    た容器系で行われる、請求項８１、８４、８５、または
    ８６の方法。 【請求項１００】 閉じた容器系は、照射源と検出装置
    またはユニットを含む、請求項９９の方法。 【請求項１０１】 プライマーまたは核酸構築体を含む
    第１のセグメントと、プライマー伸長配列を含む第２の
    セグメントとの、２つのセグメントを含む核酸鎖を含む
    組成物であって、 ここで、プライマー伸長配列は、１つ以上の第１のエネ
    ルギー移動要素と１つ以上の第２のエネルギー移動要素
    とを含む、上記組成物。 【請求項１０２】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギードナーであり、第２のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターである、請求項１０１の組成物。 【請求項１０３】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターであり、第２のエネルギー移動要素が
    エネルギードナーである、請求項１０１の組成物。 【請求項１０４】 第１のエネルギー要素と第２のエネ
    ルギー要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセイン
    イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフル
    オレセイン（６−ＦＡＭ）、ナフトフルオレセイン、ロ
    ーダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＸ、ロドール、
    スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン（Ｔ
    ＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネー
    ト（ＴＲＩＴＣ）、４，７−ジクロロローダミン、エオ
    シン、エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ダン
    シル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、または
    ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢ
    ＣＹＬ）、シアニン色素、または前記のいずれかの誘導
    体を含む、請求項１０１の組成物。 【請求項１０５】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項１０４の組成物。 【請求項１０６】 ２つのセグメントを含む第２の鎖を
    さらに含む、請求項１０１の組成物であって、第２の鎖
    の第１のセグメントはプライマーまたは核酸構築体を含
    み、第２の鎖の第２のセグメントは、プライマー伸長配
    列を含み、 ここで、第２のセグメントのプライマー伸長配列は、１
    つ以上の第１のエネルギー移動要素と１つ以上の第２の
    エネルギー移動要素とを含む、上記組成物。 【請求項１０７】 少なくとも１つの核酸プライマーま
    たは構築体は、固体支持体に固定または固定化されてい
    る、請求項１０１または１０６の組成物。 【請求項１０８】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項１０７の組成物。 【請求項１０９】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項１０７の組成物。 【請求項１１０】 少なくとも１つの核酸プローブまた
    は構築体は、消光物質をさらに含む、請求項１０１また
    は１０６の組成物。 【請求項１１１】 試料中の目的の１本鎖または２本鎖
    核酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であ
    って、 （ａ）（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われる試
    料、 （ii）目的の核酸の少なくとも一部に相補的な核酸配列
    を含む、核酸プライマーまたは核酸構築体、および （iii）第１のエネルギー移動要素を含む１つ以上の第
    １のヌクレオチドと、第２のエネルギー移動要素を含む
    １つ以上の第２のヌクレオチド； （iv）核酸鎖伸長を実施するための試薬、を提供する工
    程； （ｂ）上記（ｉ）、（ii）、（iii）および（iv）を含
    む反応混合物を形成する工程； （ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii）
    中の核酸プライマーに、目的の核酸を接触させる工程； （ｄ）核酸プライマーを伸長させ、こうして第１および
    第２のヌクレオチドを取り込む工程；そして （ｅ）第１のエネルギー移動要素と第２のエネルギー移
    動要素の間のエネルギー移動により、目的の核酸の存在
    または量を検出する工程、とを含む上記方法。 【請求項１１２】 目的の核酸（ｉ）は、反応混合物形
    成工程（ｂ）の前またはその最中に、１本鎖にされてい
    る、請求項１１１の方法。 【請求項１１３】 第１のヌクレオチドと第２のヌクレ
    オチドは同一の塩基を含む、請求項１１１の方法。 【請求項１１４】 第１のヌクレオチドと第２のヌクレ
    オチドは異なる塩基を含む、請求項１１１の方法。 【請求項１１５】 検出工程（ｅ）において、（ｂ’）
    伸長核酸を目的の核酸から分離する工程と、接触工程
    （ｃ）と伸長工程（ｄ）とを繰り返すことをさらに含
    む、請求項１１１の方法。 【請求項１１６】 分離工程（ｂ’）において、接触工
    程（ｃ）と伸長工程（ｄ）は、１回以上繰り返される、
    請求項１１５の方法。 【請求項１１７】 提供工程（ａ）において、試薬
    （ｖ）は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１
    １１の方法。 【請求項１１８】 分離工程は、熱変性または鎖置換に
    より行われる、請求項１１５または１１６の方法。。 【請求項１１９】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー移動要素がエネルギードナーであり、かつ第２
    のエネルギー移動要素がエネルギーアクセプターである
    か、または第１のエネルギー移動要素がエネルギーアク
    セプターであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギードナーである、請求項１１１の方法。 【請求項１２０】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー要素と第２のエネルギー要素は独立に、フルオ
    レセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
    Ｃ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、
    ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、
    ローダミンＸ、ロドール、スルホローダミン１０１、テ
    トラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルロ
    ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、４，７−
    ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシア
    ネート（ＥＩＴＣ）、ダンシル、ヒドロキシクマリン、
    メトキシクマリン、またはｐ−（ジメチルアミノフェニ
    ルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、シアニン色素、ま
    たは前記のいずれかの誘導体を含む、請求項１１１の方
    法。 【請求項１２１】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項１２０の方法。 【請求項１２２】 核酸プライマーまたは構築体は、固
    体支持体に固定または固定化されている、請求項１１１
    の方法。 【請求項１２３】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項１２２の方法。 【請求項１２４】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項１２２の方法。 【請求項１２５】 いずれかまたはすべての工程が、閉
    じた容器系で行われる、請求項１１１、１１５、または
    １１６の方法。 【請求項１２６】 閉じた容器系は、照射源と検出装置
    またはユニットを含む、請求項１２５の方法。 【請求項１２７】 核酸プライマーまたは構築体は、消
    光物質をさらに含む、請求項１１１の方法。 【請求項１２８】 試料中の目的の１本鎖または２本鎖
    核酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であ
    って、 （ａ）（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われる試
    料、 （ii）目的の核酸の１つの鎖の少なくとも一部に相補的
    な核酸配列を含む、第１の核酸プライマーまたは核酸構
    築体、 （iii）１つの鎖の少なくとも一部と同一の核酸配列を
    含む、第２の核酸プライマーまたは核酸構築体、 （iv）第１のエネルギー移動要素を含む１つ以上の第１
    のヌクレオチドと、第２のエネルギー移動要素を含む１
    つ以上の第２のヌクレオチド；および （ｖ）核酸鎖伸長を実施するための試薬、を提供する工
    程； （ｂ）上記（i）、（ii）、（iii）、（iv）および
    （ｖ）を含む反応混合物を形成する工程； （ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii）
    中の第１の核酸プライマーに目的の核酸の１つの鎖を接
    触させ、ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii
    i）中の第２の核酸プライマーに目的の核酸の相補鎖
    （もし存在するなら）を接触させる工程； （ｄ）第１の核酸プライマーと第２の核酸プライマーと
    を伸長して、第１のプライマー伸長核酸配列と第２のプ
    ライマー伸長核酸配列（もし相補鎖が存在するなら）を
    形成させて、こうして第１および第２のヌクレオチドを
    取り込む工程；そして （ｅ）第１のエネルギー移動要素と第２のエネルギー移
    動要素の間のエネルギー移動により、目的の核酸の存在
    または量を検出する工程、とを含む上記方法。 【請求項１２９】 以下をさらに含む請求項１２８の方
    法： （ｂ’）第１のプライマー伸長核酸配列を目的の核酸か
    ら分離し、第２のプライマー伸長核酸配列を目的の核酸
    の相補鎖（もし存在するなら）から分離する； （ｃ’）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（i
    i）中の第１の核酸プライマーに、工程（ｂ’）からの
    第２のプライマー伸長核酸配列を接触させ（もし鎖が存
    在するなら）、ハイブリダイゼーション条件下で、組成
    物（iii）中の第２の核酸プライマーに、工程（ｂ’）
    からの第１のプライマー伸長核酸配列を接触させ、次に
    伸長工程（ｄ）を繰り返す。 【請求項１３０】 請求項１２９の方法であって、第１
    のプライマー伸長核酸配列を、第２のプライマー伸長核
    酸配列から分離する工程（ｂ”）と、ハイブリダイゼー
    ション条件下で、組成物（ii）中の第１の核酸プライマ
    ーに、工程（ｂ”）からの第２のプライマー伸長核酸配
    列を接触させ、ハイブリダイゼーション条件下で、組成
    物（iii）中の第２の核酸プライマーに、工程（ｂ”）
    からの第１のプライマー伸長核酸配列を接触させる工程
    （ｃ”）を含み、次に伸長工程（ｄ）を繰り返す、上記
    方法。 【請求項１３１】 分離した（ｂ”）、接触工程
    （ｃ”）、および伸長工程（ｄ）は繰り返される、請求
    項１３０の方法。 【請求項１３２】 目的の核酸の相補鎖は存在する、請
    求項１２８の方法。 【請求項１３３】 目的の核酸（ｉ）は、反応混合物形
    成工程（ｂ）の前またはその最中に、１本鎖にされてい
    る、請求項１３２の方法。 【請求項１３４】 検出工程（ｅ）は、接触工程、伸長
    工程、または分離工程の間またはその後に、特定の間隔
    で行われる、請求項１２８、１２９、１３０または１３
    １の方法。 【請求項１３５】 提供工程（ａ）において、試薬
    （ｖ）は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１
    ２８の方法。 【請求項１３６】 分離工程は、熱変性または鎖置換に
    より行われる、請求項１２９、１３０、または１３１の
    方法。。 【請求項１３７】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー移動要素がエネルギードナーであり、かつ第２
    のエネルギー移動要素がエネルギーアクセプターである
    か、または第１のエネルギー移動要素がエネルギーアク
    セプターであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギードナーである、請求項１２８の方法。 【請求項１３８】 提供工程（ａ）において、２つ以上
    の第１の核酸プライマーまたは核酸構築体、または２つ
    以上の第２の核酸プライマーまたは核酸構築体、または
    この両方が提供される、請求項１２８の方法。 【請求項１３９】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー要素と第２のエネルギー要素は独立に、フルオ
    レセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
    Ｃ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、
    ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、
    ローダミンＸ、ロドール、スルホローダミン１０１、テ
    トラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルロ
    ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、４，７−
    ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシア
    ネート（ＥＩＴＣ）、ダンシル、ヒドロキシクマリン、
    メトキシクマリン、またはｐ−（ジメチルアミノフェニ
    ルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、シアニン色素、ま
    たは前記のいずれかの誘導体を含む、請求項１２８の方
    法。 【請求項１４０】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項１３９の方法。 【請求項１４１】 少なくとも１つの第１のまたは第２
    の核酸プライマーまたは構築体または任意のプライマー
    伸長核酸配列は、固体支持体に固定または固定化されて
    いる、請求項１２８の方法。 【請求項１４２】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項１４１の方法。 【請求項１４３】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項１４１の方法。 【請求項１４４】 いずれかまたはすべての工程が、閉
    じた容器系で行われる、請求項１２８、１２９、１３
    ０、または１３１の方法。 【請求項１４５】 閉じた容器系は、照射源と検出装置
    またはユニットを含む、請求項１４４の方法。 【請求項１４６】 少なくとも１つの核酸プライマーま
    たは構築体は、消光物質をさらに含む、請求項１２８の
    方法。 【請求項１４７】 ２つ以上のリボヌクレオチドを含む
    核酸鎖を含む組成物であって、少なくとも１つのリボヌ
    クレオチドは第１のエネルギー移動要素を含み、少なく
    とも１つの他のリボヌクレオチドは第２のエネルギー移
    動要素を含む、上記組成物。 【請求項１４８】 第１のエネルギー移動要素はエネル
    ギードナーであり、第２のエネルギー移動要素はエネル
    ギーアクセプターであるか、または第１のエネルギー移
    動要素がエネルギーアクセプターであり、第２のエネル
    ギー移動要素がエネルギードナーである、請求項１４７
    の組成物。 【請求項１４９】 第１のエネルギー要素と第２のエネ
    ルギー要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセイン
    イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフル
    オレセイン（６−ＦＡＭ）、ナフトフルオレセイン、ロ
    ーダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＸ、ロドール、
    スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン（Ｔ
    ＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネー
    ト（ＴＲＩＴＣ）、４，７−ジクロロローダミン、エオ
    シン、エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ダン
    シル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、または
    ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢ
    ＣＹＬ）、シアニン色素、または前記のいずれかの誘導
    体を含む、請求項１４８の組成物。 【請求項１５０】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項１４９の組成物。 【請求項１５１】 核酸鎖は、固体支持体に固定または
    間接的に固定化されている、請求項１４７の組成物。 【請求項１５２】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項１５１の組成物。 【請求項１５３】 試料中の目的の１本鎖または２本鎖
    核酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であ
    って、 （ａ）（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われる試
    料、 （ii）第１の核酸プライマーまたは核酸構築体、または
    場合により第２の核酸プライマーまたは核酸構築体は、
    ＲＮＡプロモーター配列を含む、少なくとも１つの第１
    の核酸プライマーまたは核酸構築体、および場合により
    第２の核酸プライマーまたは核酸構築体、 （iii）第１のエネルギー移動要素を含む１つ以上の第
    １のリボヌクレオチド、および第２のエネルギー移動要
    素を含む１つ以上の第２のリボヌクレオチド、 （iv）核酸鎖伸長とＲＮＡ転写とを実施するための試
    薬、を提供する工程； （ｂ）上記（i）、（ii）、および（iii）を含む反応混
    合物を形成する工程； （ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、第１の核酸プ
    ライマーまたは核酸構築体（ii）に、目的の核酸の１つ
    の鎖を接触させる工程； （ｄ）核酸プライマーを伸長して、プライマー伸長核酸
    配列を形成させる工程； （ｅ）プライマー伸長核酸配列またはその一部に相補的
    な第２の核酸鎖を合成し、こうして２本鎖核酸を形成す
    る工程； （ｆ）工程（ｅ）で形成した２本鎖核酸を転写して、第
    １および第２のリボヌクレオチド（iii）を転写体中に
    取り込む工程； （ｇ）第１のエネルギー移動要素と第２のエネルギー移
    動要素の間のエネルギー移動により、目的の核酸の存在
    または量を検出する工程とを含み、 ここで転写工程（ｆ）は、工程（ｅ）で合成されたプラ
    イマー伸長核酸配列または第２の核酸鎖中のＲＮＡプロ
    モーター配列により行われる、上記方法。 【請求項１５４】 合成工程（ｅ）において、第２の核
    酸鎖は、ＲＮａｓｅＨの作用により産生されるＲＮＡ断
    片のプライマー伸長により合成される、請求項１５３の
    方法。 【請求項１５５】 合成工程（ｅ）において、第２の核
    酸鎖は、随時の第２の核酸プライマーまたは核酸構築体
    のプライマー伸長により合成される、請求項１５３の方
    法。 【請求項１５６】 合成工程（ｅ）において、第２の核
    酸鎖は、プライマー伸長核酸配列への末端付加または末
    端結合により合成される、請求項１５３の方法であっ
    て、この末端付加または結合の後に、末端付加または結
    合した配列に、末端付加または結合した配列に相補的な
    １つ以上の随時の第２の核酸プライマーまたは構築体を
    接触させ、次に随時の第２の核酸プライマーまたは構築
    体を伸長する、上記方法。 【請求項１５７】 ＲＮＡプロモーターは、Ｔ３プロモ
    ーター、Ｔ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターを
    含む、請求項１５３の方法。 【請求項１５８】 転写工程（ｆ）は、同種のＲＮＡポ
    リメラーゼにより行われる、請求項１５７の方法。 【請求項１５９】 目的の核酸（ｉ）は、反応混合物形
    成工程（ｂ）の前またはその最中に、１本鎖にされてい
    る、請求項１５３の方法。 【請求項１６０】 検出工程（ｅ）は、特定の間隔で１
    回以上行われる、請求項１５３の方法。 【請求項１６１】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー移動要素がエネルギードナーであり、かつ第２
    のエネルギー移動要素がエネルギーアクセプターである
    か、または第１のエネルギー移動要素がエネルギーアク
    セプターであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギードナーである、請求項１５３の方法。 【請求項１６２】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー要素と第２のエネルギー要素は独立に、フルオ
    レセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
    Ｃ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、
    ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、
    ローダミンＸ、ロドール、スルホローダミン１０１、テ
    トラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルロ
    ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、４，７−
    ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシア
    ネート（ＥＩＴＣ）、ダンシル、ヒドロキシクマリン、
    メトキシクマリン、またはｐ−（ジメチルアミノフェニ
    ルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、シアニン色素、ま
    たは前記のいずれかの誘導体を含む、請求項１５３の方
    法。 【請求項１６３】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項１６２の方法。 【請求項１６４】 工程（ｆ）で得られる転写体は、固
    体支持体に固定または固定化されている、請求項１５３
    の方法。 【請求項１６５】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項１６４の方法。 【請求項１６６】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項１６４の方法。 【請求項１６７】 いずれかまたはすべての工程が、閉
    じた容器系で行われる、請求項１５３の方法。 【請求項１６８】 閉じた容器系は、照射源と検出装置
    またはユニットを含む、請求項１６７の方法。 【請求項１６９】 ２つの部分を含む組成物であって、
    第１の部分は、少なくとも２つのセグメントを含み、こ
    こで、第１のセグメントは、核酸プライマーまたは核酸
    構築体を含み、第２のセグメントは、プライマー伸長配
    列を含み、そして第２の部分は、核酸結合物質を含み、
    ここで、核酸プライマーまたは核酸構築体は、１つ以上
    の蛍光性第１のエネルギー移動要素を含み、核酸結合物
    質は、１つ以上の第２のエネルギー移動要素を含む、上
    記組成物。 【請求項１７０】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギードナーであり、第２のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターである、請求項１６９の組成物。 【請求項１７１】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターであり、第２のエネルギー移動要素が
    エネルギードナーである、請求項１６９の組成物。 【請求項１７２】 第１のエネルギー要素と第２のエネ
    ルギー要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセイン
    イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフル
    オレセイン（６−ＦＡＭ）、ナフトフルオレセイン、ロ
    ーダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＸ、ロドール、
    スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン（Ｔ
    ＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネー
    ト（ＴＲＩＴＣ）、４，７−ジクロロローダミン、エオ
    シン、エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ダン
    シル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、または
    ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢ
    ＣＹＬ）、シアニン色素、または前記のいずれかの誘導
    体を含む、請求項１６９の組成物。 【請求項１７３】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項１７２の組成物。 【請求項１７４】 核酸結合物質はタンパク質またはポ
    リペプチドを含む、請求項１６９の組成物。 【請求項１７５】 タンパク質またはポリペプチドは、
    Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ＳＳＢタンパク質、または
    抗体を含む、請求項１７４の組成物。 【請求項１７６】 核酸結合物質は、１本鎖核酸結合色
    素を含む、請求項１６９の組成物。 【請求項１７７】 核酸鎖は、固体支持体に固定または
    固定化されている、請求項１６９の組成物。 【請求項１７８】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項１７７の組成物。 【請求項１７９】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項１７７の組成物。 【請求項１８０】 以下を含む組成物 （ａ）２つの核酸鎖、 ここで、鎖の少なくとも１つは２つのセグメントを含
    み、第１のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築
    体を含み、第２のセグメントはプライマー伸長配列を含
    む、および （ｂ）核酸結合物質、 ここで、核酸プライマーまたは核酸構築体は１つ以上の
    蛍光性第１のエネルギー移動要素を含み、核酸結合物質
    は１つ以上の第２のエネルギー移動要素を含む。 【請求項１８１】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギードナーであり、第２のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターである、請求項１８０の組成物。 【請求項１８２】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターであり、第２のエネルギー移動要素が
    エネルギードナーである、請求項１８０の組成物。 【請求項１８３】 第１のエネルギー要素と第２のエネ
    ルギー要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセイン
    イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフル
    オレセイン（６−ＦＡＭ）、ナフトフルオレセイン、ロ
    ーダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＸ、ロドール、
    スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン（Ｔ
    ＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネー
    ト（ＴＲＩＴＣ）、４，７−ジクロロローダミン、エオ
    シン、エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ダン
    シル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、または
    ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢ
    ＣＹＬ）、シアニン色素、または前記のいずれかの誘導
    体を含む、請求項１８０の組成物。 【請求項１８４】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項１８３の組成物。 【請求項１８５】 第２の鎖は２つのセグメントを含
    み、第１のセグメントは第２の核酸プライマーまたは核
    酸構築体を含み、第２のセグメントはプライマー伸長配
    列を含む、請求項１８０の組成物。 【請求項１８６】 第２のプライマーまたは核酸構築体
    は、１つ以上の第１のエネルギー移動要素を含む、請求
    項１８５の組成物。 【請求項１８７】 核酸結合物質は、タンパク質または
    ポリペプチドを含む、請求項１８０の組成物。 【請求項１８８】 タンパク質またはポリペプチドは、
    ヒストンまたは抗体を含む、請求項１８７の組成物。 【請求項１９０】 核酸結合物質は、インターカレータ
    ーを含む、請求項１８０の組成物。 【請求項１９１】 インターカレーターは、ＳＹＢＲグ
    リーンＩ、臭化エチジウム、臭化エチジウムまたはその
    誘導体を含むホモダイマーまたはヘテロダイマーを含
    む、請求項１９０の組成物。 【請求項１９２】 少なくとも１つの核酸鎖は、固体支
    持体に固定または固定化されている、請求項１８０の組
    成物。 【請求項１９３】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項１９２の組成物。 【請求項１９４】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項１９２の組成物。 【請求項１９５】 試料中の目的の１本鎖または２本鎖
    核酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であ
    って、 （ａ）（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われる試
    料、 （ii）（Ａ）目的の核酸の少なくとも一部に相補的な核
    酸配列と （Ｂ）１つ以上の蛍光性の第１のエネルギー移動要素と
    を含む、核酸プライマーまたは核酸構築体、 （iii）１つ以上の第２のエネルギー移動要素を含む核
    酸結合物質； （iv）核酸鎖伸長を実施するための試薬、を提供する工
    程； （ｂ）上記（ｉ）、（ii）、（iii）および（iv）を含
    む反応混合物を形成する工程； （ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii）
    中の核酸プライマーに目的の核酸を接触させる工程； （ｄ）核酸プライマーまたは核酸構築体を伸長させて、
    プライマー伸長配列を形成する工程； （ｅ）核酸結合物質（iii）を、プライマー伸長配列
    に、または目的の核酸とプライマー伸長配列とを含む複
    合体に結合させる工程；および （ｆ）第１のエネルギー移動要素と第２のエネルギー移
    動要素の間のエネルギー移動により、目的の核酸の存在
    または量を検出する工程、とを含む上記方法。 【請求項１９６】 提供工程（ａ）において、核酸結合
    物質（iii）はタンパク質またはポリペプチドを含む、
    請求項１９５の方法。 【請求項１９７】 タンパク質またはポリペプチドは、
    Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ＳＳＢタンパク質、ヒスト
    ンまたは抗体を含む、請求項１９６の方法。 【請求項１９８】 提供工程（ａ）において、核酸結合
    物質（iii）は、１本鎖核酸結合色素を含む、請求項１
    ９５の方法。 【請求項１９９】 提供工程（ａ）において、核酸結合
    物質（iii）は、インターカレーターを含む、請求項１
    ９５の方法。 【請求項２００】 インターカレーターは、ＳＹＢＲグ
    リーンＩ、臭化エチジウム、臭化エチジウムまたはその
    誘導体を含むホモダイマーまたはヘテロダイマーを含
    む、請求項１９９の方法。 【請求項２０１】 目的の核酸（ｉ）は、反応混合物形
    成工程（ｂ）の前またはその最中に、１本鎖にされてい
    る、請求項１９５の方法。 【請求項２０２】 伸長工程（ｄ）で形成されるプライ
    マー伸長配列は、結合工程（ｅ）の前に１本鎖にされて
    いる、請求項１９５の方法。 【請求項２０３】 検出工程（ｆ）の前に、（ｂ’）伸
    長された核酸を目的の核酸から分離する工程と、接触工
    程（ｃ）、伸長工程（ｄ）および結合工程（ｅ）を繰り
    返す工程をさらに含む、請求項１９５の方法。 【請求項２０４】 分離工程（ｂ’）、接触工程
    （ｃ）、および伸長工程（ｄ）、および結合工程（ｅ）
    は、１回以上繰り返される、請求項２０３の方法。 【請求項２０５】 提供工程（ａ）において、試薬（i
    v）は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１９
    ５の方法。 【請求項２０６】 １本鎖にする工程または分離工程
    は、熱変性または鎖置換により行われる、請求項２０
    ２、２０３、または２０４の方法。 【請求項２０７】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー移動要素がエネルギードナーであり、かつ第２
    のエネルギー移動要素がエネルギーアクセプターである
    か、または第１のエネルギー移動要素がエネルギーアク
    セプターであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギードナーである、請求項１９５の方法。 【請求項２０８】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー要素と第２のエネルギー要素は独立に、フルオ
    レセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
    Ｃ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、
    ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、
    ローダミンＸ、ロドール、スルホローダミン１０１、テ
    トラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルロ
    ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、４，７−
    ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシア
    ネート（ＥＩＴＣ）、ダンシル、ヒドロキシクマリン、
    メトキシクマリン、またはｐ−（ジメチルアミノフェニ
    ルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、シアニン色素、ま
    たは前記のいずれかの誘導体を含む、請求項１９５の方
    法。 【請求項２０９】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項２０８の方法。 【請求項２１０】 核酸プライマーまたは構築体は、固
    体支持体に固定または固定化されている、請求項１９５
    の方法。 【請求項２１１】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項２１０の方法。 【請求項２１２】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項２１０の方法。 【請求項２１３】 いずれかまたはすべての工程が、閉
    じた容器系で行われる、請求項１９５、２０２、２０
    ３、または２０４の方法。 【請求項２１４】 閉じた容器系は、照射源と検出装置
    またはユニットを含む、請求項２１３の方法。 【請求項２１５】 試料中の目的の１本鎖または２本鎖
    核酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であ
    って、 （ａ）（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われる試
    料、 （ii）目的の核酸の１つの鎖の少なくとも一部に相補的
    な核酸配列を含む、第１の核酸プライマーまたは核酸構
    築体、 （iii）１つの鎖の少なくとも一部と同一の核酸配列を
    含む、第２の核酸プライマーまたは核酸構築体、 （iv）１つ以上の第１のエネルギー移動要素を含む核酸
    結合物質；および （ｖ）核酸鎖伸長を実施するための試薬、を提供する工
    程であって、（ii）、（iii）または（ii）と（iii）の
    両方は１つ以上の蛍光性の第２のエネルギー移動要素を
    含む、工程； （ｂ）上記（i）、（ii）、（iii）、（iv）および
    （ｖ）を含む反応混合物を形成する工程； （ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii）
    中の第１の核酸プライマーに目的の核酸の１つの鎖を接
    触させ、ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii
    i）中の第２の核酸プライマーに目的の核酸の相補鎖
    （もし存在するなら）を接触させる工程； （ｄ）第１の核酸プライマーと第２の核酸プライマーと
    を伸長して、第１のプライマー伸長核酸配列と第２のプ
    ライマー伸長核酸配列（もし相補鎖が存在するなら）を
    形成させる工程； （ｅ）核酸結合物質（iv）を、プライマー伸長核酸配列
    に、または目的の核酸とプライマー伸長配列とを含む複
    合体に結合させる工程；そして （ｆ）第１の核酸プライマー、第２の核酸プライマー、
    またはこの両方中の第２のエネルギー移動要素と、核酸
    結合物質（iv）中の第１のエネルギー移動要素の間のエ
    ネルギー移動により、目的の核酸の存在または量を検出
    する工程、とを含む上記方法。 【請求項２１６】 提供工程（ａ）において、核酸結合
    物質(iv）はタンパク質またはポリペプチドを含む、請
    求項２１５の方法。 【請求項２１７】 タンパク質またはポリペプチドは、
    Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ＳＳＢタンパク質、ヒスト
    ンまたは抗体を含む、請求項２１６の方法。 【請求項２１８】 提供工程（ａ）において、核酸結合
    物質（iv）は、１本鎖核酸結合色素を含む、請求項２１
    ５の方法。 【請求項２１９】 提供工程（ａ）において、核酸結合
    物質（iii）は、インターカレーターを含む、請求項２
    １５の方法。 【請求項２２０】 インターカレーターは、ＳＹＢＲグ
    リーンＩ、臭化エチジウム、臭化エチジウムまたはその
    誘導体を含むホモダイマーまたはヘテロダイマーを含
    む、請求項２１９の方法。 【請求項２２１】 以下をさらに含む、請求項２１５の
    方法： （ｂ’）第１のプライマー伸長核酸配列を目的の核酸か
    ら分離し、第２のプライマー伸長核酸配列を目的の核酸
    の相補鎖（もし存在するなら）から分離する； （ｃ’）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（i
    i）中の第１の核酸プライマーに、工程（ｂ’）からの
    第２のプライマー伸長核酸配列（もし第２の鎖が存在す
    るなら）を接触させ、ハイブリダイゼーション条件下
    で、組成物（iii）中の第２の核酸プライマーに、工程
    （ｂ’）からの第１のプライマー伸長核酸配列を接触さ
    せ、そして工程（ｄ）の伸長と以後の結合工程（ｅ）を
    繰り返す。 【請求項２２２】 （ｂ”）第１のプライマー伸長核酸
    配列を第２のプライマー伸長核酸配列から分離する工
    程、および（ｃ”）ハイブリダイゼーション条件下で、
    組成物（ii）中の第１の核酸プライマーに、工程
    （ｂ”）からの第２のプライマー伸長核酸配列を接触さ
    せ、ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（iii）
    中の第２の核酸プライマーに、工程（ｂ”）からの第１
    のプライマー伸長核酸配列を接触させ、そして伸長工程
    （ｄ）と結合工程（ｅ）を繰り返す工程を含む、請求項
    ２２１の方法。 【請求項２２３】 分離工程（ｂ”）、接触工程
    （ｃ”）、伸長工程（ｄ）および結合工程（ｅ）が繰り
    返される、請求項２２２の方法。 【請求項２２４】 目的の核酸の相補鎖が存在する、請
    求項２１５の方法。 【請求項２２５】 目的の核酸（ｉ）は、反応混合物形
    成工程（ｂ）の前またはその再中に１本鎖にされてい
    る、請求項２１５の方法。 【請求項２２６】 結合工程（ｅ）は、分離または変性
    工程後に行われる、請求項２１５、２２１、２２２、ま
    たは２２３の方法。 【請求項２２７】 検出工程（ｅ）は、結合工程（ｅ）
    の最中または後に、特定の間隔で行われる、請求項２１
    ５、２２１、２２２、または２２３の方法。 【請求項２２８】 提供工程（ａ）において、試薬
    （ｖ）は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項２
    １５の方法。 【請求項２２９】 分離工程は、熱変性または鎖置換に
    より行われる、請求項２１５、２２１、２２２、または
    ２２３の方法。 【請求項２３０】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー移動要素がエネルギードナーであり、かつ第２
    のエネルギー移動要素がエネルギーアクセプターである
    か、または第１のエネルギー移動要素がエネルギーアク
    セプターであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギードナーである、請求項２１５の方法。 【請求項２３１】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー要素と第２のエネルギー要素は独立に、フルオ
    レセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
    Ｃ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、
    ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、
    ローダミンＸ、ロドール、スルホローダミン１０１、テ
    トラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルロ
    ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、４，７−
    ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシア
    ネート（ＥＩＴＣ）、ダンシル、ヒドロキシクマリン、
    メトキシクマリン、またはｐ−（ジメチルアミノフェニ
    ルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、シアニン色素、ま
    たは前記のいずれかの誘導体を含む、請求項２１５の方
    法。 【請求項２３２】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項２３１の方法。 【請求項２３３】 少なくとも１つの第１のまたは第２
    の核酸プライマーまたは構築体または任意のプライマー
    伸長核酸配列は、固体支持体に固定または固定化されて
    いる、請求項２１５の方法。 【請求項２３４】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項２３３の方法。 【請求項２３５】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項２３３の方法。 【請求項２３６】 いずれかまたはすべての工程が、閉
    じた容器系で行われる、請求項２１５、２２１、２２
    ２、または２２３の方法。 【請求項２３７】 閉じた容器系は、照射源と検出装置
    またはユニットを含む、請求項２３６の方法。 【請求項２３８】 以下を含む組成物 （ａ）２つのセグメントを含む核酸鎖であって、第１の
    セグメントはプライマーまたは核酸構築体を含み、第２
    のセグメントはプライマー伸長配列を含む、および
    （ｂ）核酸結合物質、ここで、プライマー伸長配列は１
    つ以上の第１のエネルギー移動要素を含み、核酸結合物
    質は１つ以上の第２のエネルギー移動要素を含む。 【請求項２３９】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギードナーであり、第２のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターである、請求項２３８の組成物。 【請求項２４０】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターであり、第２のエネルギー移動要素が
    エネルギードナーである、請求項２３８の組成物。 【請求項２４１】 第１のエネルギー要素と第２のエネ
    ルギー要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセイン
    イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフル
    オレセイン（６−ＦＡＭ）、ナフトフルオレセイン、ロ
    ーダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＸ、ロドール、
    スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン（Ｔ
    ＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネー
    ト（ＴＲＩＴＣ）、４，７−ジクロロローダミン、エオ
    シン、エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ダン
    シル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、または
    ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢ
    ＣＹＬ）、シアニン色素、または前記のいずれかの誘導
    体を含む、請求項２３８の組成物。 【請求項２４２】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項２４１の組成物。 【請求項２４３】 核酸結合物質（ｂ）は、タンパク質
    またはポリペプチドを含む、請求項２３８の組成物。 【請求項２４４】 タンパク質またはポリペプチドは、
    Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ＳＳＢタンパク質、または
    抗体を含む、請求項２３１の組成物。 【請求項２４５】 核酸結合物質（ｂ）は、１本鎖核酸
    結合色素を含む、請求項２３８の組成物。 【請求項２４６】 核酸鎖（ａ）は、固体支持体に固定
    または固定化されている、請求項２３８の組成物。 【請求項２４７】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項２４６の組成物。 【請求項２４８】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項２４６の組成物。 【請求項２４９】 以下を含む組成物 （ａ）２つの核酸鎖、ここで、鎖の少なくとも１つは２
    つのセグメントを含み、第１のセグメントは核酸プライ
    マーまたは核酸構築体を含み、第２のセグメントはプラ
    イマー伸長配列を含む、および（ｂ）核酸結合物質、こ
    こで、プライマー伸長配列は１つ以上の第１のエネルギ
    ー移動要素を含み、核酸結合物質は１つ以上の第２のエ
    ネルギー移動要素を含む。 【請求項２５０】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギードナーであり、第２のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターである、請求項２４９の組成物。 【請求項２５１】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターであり、第２のエネルギー移動要素が
    エネルギードナーである、請求項２４９の組成物。 【請求項２５２】 第１のエネルギー要素と第２のエネ
    ルギー要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセイン
    イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフル
    オレセイン（６−ＦＡＭ）、ナフトフルオレセイン、ロ
    ーダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＸ、ロドール、
    スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン（Ｔ
    ＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネー
    ト（ＴＲＩＴＣ）、４，７−ジクロロローダミン、エオ
    シン、エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ダン
    シル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、または
    ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢ
    ＣＹＬ）、シアニン色素、または前記のいずれかの誘導
    体を含む、請求項２４９の組成物。 【請求項２５３】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項２５２の組成物。 【請求項２５４】 核酸結合物質（ｂ）は、タンパク質
    またはポリペプチドを含む、請求項２４９の組成物。 【請求項２５５】 タンパク質またはポリペプチドは、
    ヒストンまたは抗体を含む、請求項２５４の組成物。 【請求項２５６】 核酸結合物質（ｂ）は、インターカ
    レーターを含む、請求項２４９の組成物。 【請求項２５７】 インターカレーターは、ＳＹＢＲグ
    リーンＩ、臭化エチジウム、臭化エチジウムまたはその
    誘導体を含むホモダイマーまたはヘテロダイマーを含
    む、請求項２５６の組成物。 【請求項２５８】 核酸鎖（ａ）は２つのセグメントを
    含み、第１のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構
    築体を含み、第２のセグメントはプライマー伸長配列を
    含む、請求項２４９の組成物。 【請求項２５９】 プライマー伸長配列は第１のエネル
    ギー移動要素を含む、請求項２５８の組成物。 【請求項２６０】 核酸鎖（ａ）の少なくとも１つは、
    固体支持体に固定または固定化されている、請求項２４
    ９の組成物。 【請求項２６１】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項２６０の組成物。 【請求項２６２】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項２６０の組成物。 【請求項２６３】 核酸プライマーまたは構築体は、消
    光物質をさらに含む、請求項２４９の組成物。 【請求項２６４】 試料中の目的の１本鎖または２本鎖
    核酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であ
    って、 （ａ）（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われる試
    料、 （ii）目的の核酸の少なくとも一部に相補的な少なくと
    も１つの核酸プライマーまたは核酸構築体、 （iii）第１のエネルギー移動要素を含む標識ヌクレオ
    チド； （iv）１つ以上の第２のエネルギー移動要素を含む核酸
    結合物質；および （ｖ）核酸鎖伸長を実施するための試薬、を提供する工
    程； （ｂ）上記（i）、（ii）、（iii）、（iv）および
    （ｖ）を含む反応混合物を形成する工程； （ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii）
    中の核酸プライマーに目的の核酸を接触させる工程； （ｄ）核酸プライマーを伸長して、標識ヌクレオチドを
    取り込む工程； （ｅ）核酸結合物質をプライマー伸長核酸配列に結合さ
    せる工程；そして （ｆ）第１のエネルギー移動要素と第２のエネルギー移
    動要素の間のエネルギー移動により、目的の核酸の存在
    または量を検出する工程、とを含む上記方法。 【請求項２６５】 提供工程（ａ）において、目的の核
    酸の異なる部分に相補的な少なくとも１つの他の核酸プ
    ライマーまたは核酸構築体がある、請求項２６４の方
    法。 【請求項２６６】 提供工程（ａ）において、核酸結合
    物質（iv）はタンパク質またはポリペプチドを含む、請
    求項２６４の方法。 【請求項２６７】 タンパク質またはポリペプチドは、
    Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ＳＳＢタンパク質、ヒスト
    ンまたは抗体を含む、請求項２６６の方法。 【請求項２６８】 提供工程（ａ）において、核酸結合
    物質（iv）は、１本鎖核酸結合色素を含む、請求項２６
    ４の方法。 【請求項２６９】 提供工程（ａ）において、核酸結合
    物質（iv）鎖は、インターカレーターを含む、請求項２
    ６４の方法。 【請求項２７０】 インターカレーターは、ＳＹＢＲグ
    リーンＩ、臭化エチジウム、臭化エチジウムまたはその
    誘導体を含むホモダイマーまたはヘテロダイマーを含
    む、請求項２６９の方法。 【請求項２７１】 目的の核酸（ｉ）は、反応混合物形
    成工程（ｂ）の前またはその最中に、１本鎖にされてい
    る、請求項２６４の方法。 【請求項２７２】 検出工程（ｆ）の前に、（ｂ’）伸
    長された核酸を目的の核酸から分離する工程と、接触工
    程（ｃ）、伸長工程（ｄ）、および結合工程（ｅ）とを
    さらに含む、請求項２６４の方法。 【請求項２７３】 分離工程（ｂ’）、接触工程
    （ｃ）、伸長工程（ｄ）、および結合工程（ｅ）は、１
    回以上繰り返される、請求項２６４の方法。 【請求項２７４】 伸長工程（ｄ）で形成されるプライ
    マー伸長配列は、結合工程（ｅ）の前に１本鎖にされて
    いる、請求項２６４、２７２、または２７３の方法。 【請求項２７５】 提供工程（ａ）において、試薬
    （ｖ）は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項２
    ６４の方法。 【請求項２７６】 分離工程は、熱変性または鎖置換に
    より行われる、請求項２７２または２７３の方法。 【請求項２７７】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー移動要素がエネルギードナーであり、かつ第２
    のエネルギー移動要素がエネルギーアクセプターである
    か、または第１のエネルギー移動要素がエネルギーアク
    セプターであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギードナーである、請求項２６４の方法。 【請求項２７８】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー要素と第２のエネルギー要素は独立に、フルオ
    レセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
    Ｃ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、
    ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、
    ローダミンＸ、ロドール、スルホローダミン１０１、テ
    トラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルロ
    ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、４，７−
    ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシア
    ネート（ＥＩＴＣ）、ダンシル、ヒドロキシクマリン、
    メトキシクマリン、またはｐ−（ジメチルアミノフェニ
    ルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、シアニン色素、ま
    たは前記のいずれかの誘導体を含む、請求項２６４の方
    法。 【請求項２７９】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項２７８の方法。 【請求項２８０】 核酸プライマー、核酸構築体または
    プライマー伸長配列は、固体支持体に固定または固定化
    されている、請求項２６４の方法。 【請求項２８１】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項２８０の方法。 【請求項２８２】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項２８０の方法。 【請求項２８３】 いずれかまたはすべての工程が、閉
    じた容器系で行われる、請求項２６４、２７２、または
    ２７３の方法。 【請求項２８４】 閉じた容器系は、照射源と検出装置
    またはユニットを含む、請求項２８３の方法。 【請求項２８５】 試料中の目的の１本鎖または２本鎖
    核酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であ
    って、 （ａ）（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われる試
    料、 （ii）目的の核酸の１つの鎖の少なくとも一部に相補的
    な核酸配列を含む、第１の核酸プライマーまたは核酸構
    築体、 （iii）１つの鎖の少なくとも一部と同一の核酸配列を
    含む、第２の核酸プライマーまたは核酸構築体； （iv）第１のエネルギー移動要素を含む１つ以上の標識
    ヌクレオチド； （ｖ）１つ以上の第２のエネルギー移動要素を含む核酸
    結合物質；および （vi）核酸鎖伸長を実施するための試薬、を提供する工
    程； （ｂ）上記（i）、（ii）、（iii）、（iv）、（ｖ）お
    よび（vi）を含む反応混合物を形成する工程； （ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、第１の核酸プ
    ライマーまたは核酸構築体（ii）に、目的の核酸の１つ
    の鎖を接触させ、ハイブリダイゼーション条件下で、第
    ２の核酸プライマーまたは核酸構築体（iii）に、目的
    の核酸の相補鎖（もし存在するなら）を接触させる工
    程； （ｄ）第１の核酸プライマーと第２の核酸プライマーを
    伸長して、第１のプライマー伸長核酸配列と第２のプラ
    イマー伸長核酸配列（もし相補鎖が存在するなら）を形
    成させ、こうして標識ヌクレオチドを取り込む工程； （ｅ）核酸結合物質（Ｖ）を第１のプライマー伸長核酸
    配列、および第２のプライマー伸長核酸配列（もし相補
    鎖が存在するなら）に結合させる工程；そして （ｆ）第１のエネルギー移動要素と第２のエネルギー移
    動要素の間のエネルギー移動により、目的の核酸の存在
    または量を検出する工程、とを含む上記方法。 【請求項２８６】 提供工程（ａ）において、核酸結合
    物質(ｖ）はタンパク質またはポリペプチドを含む、請
    求項２８５の方法。 【請求項２８７】 タンパク質またはポリペプチドは、
    Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ＳＳＢタンパク質、ヒスト
    ンまたは抗体を含む、請求項２８６の方法。 【請求項２８８】 提供工程（ａ）において、核酸結合
    物質（ｖ）は、１本鎖核酸結合色素を含む、請求項２８
    ５の方法。 【請求項２８９】 提供工程（ａ）において、核酸結合
    物質（ｖ）は、インターカレーターを含む、請求項２８
    ５の方法。 【請求項２９０】 インターカレーターは、ＳＹＢＲグ
    リーンＩ、臭化エチジウム、臭化エチジウムまたはその
    誘導体を含むホモダイマーまたはヘテロダイマーを含
    む、請求項２８９の組成物。 【請求項２９１】 以下をさらに含む、請求項２８５の
    方法： （ｂ’）第１のプライマー伸長核酸配列を目的の核酸か
    ら分離し、第２のプライマー伸長核酸配列を目的の核酸
    の相補鎖（もし存在するなら）から分離する； （ｃ’）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（i
    i）中の第１の核酸プライマーに、工程（ｂ’）からの
    第２のプライマー伸長核酸配列（もし第２の鎖が存在す
    るなら）を接触させ、ハイブリダイゼーション条件下
    で、第２の核酸プライマーまたは核酸構築体（iii）
    に、工程（ｂ’）からの第１のプライマー伸長核酸配列
    を接触させ、そして工程（ｄ）の伸長と以後の結合工程
    （ｅ）を繰り返す。 【請求項２９２】 請求項２９１の方法であって、
    （ｂ”）第１のプライマー伸長核酸配列を第２のプライ
    マー伸長核酸配列から分離する工程、および（ｃ”）ハ
    イブリダイゼーション条件下で、第１の核酸プライマー
    または核酸構築体（ii）に、工程（ｂ”）からの第２の
    プライマー伸長核酸配列を接触させ、ハイブリダイゼー
    ション条件下で、第２の核酸プライマーまたは核酸構築
    体（iii）に、工程（ｂ”）からの第１のプライマー伸
    長核酸配列を接触させ、そして伸長工程（ｄ）と結合工
    程（ｅ）を繰り返す工程を含む、上記方法。 【請求項２９３】 分離工程（ｂ”）、接触工程
    （ｃ”）、伸長工程（ｄ）および結合工程（ｅ）が繰り
    返される、請求項２９２の方法。 【請求項２９４】 目的の核酸の相補鎖が存在する、請
    求項２８５の方法。 【請求項２９５】 目的の核酸（ｉ）は、反応混合物形
    成工程（ｂ）の前またはその再中に１本鎖にされてい
    る、請求項２８５の方法。 【請求項２９６】 結合工程（ｅ）は、結合工程（ｅ）
    の最中または後に、特定の間隔で行われる、請求項２８
    ５、２９１、２９２、または２９３の方法。 【請求項２９７】 提供工程（ａ）において、試薬
    （ｖ）は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項２
    ８５の方法。 【請求項２９８】 分離工程は、熱変性または鎖置換に
    より行われる、請求項２９１、２９２、または２９３の
    方法。 【請求項２９９】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー移動要素がエネルギードナーであり、かつ第２
    のエネルギー移動要素がエネルギーアクセプターである
    か、または第１のエネルギー移動要素がエネルギーアク
    セプターであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギードナーである、請求項２８５の方法。 【請求項３００】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー要素と第２のエネルギー要素は独立に、フルオ
    レセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
    Ｃ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、
    ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、
    ローダミンＸ、ロドール、スルホローダミン１０１、テ
    トラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルロ
    ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、４，７−
    ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシア
    ネート（ＥＩＴＣ）、ダンシル、ヒドロキシクマリン、
    メトキシクマリン、またはｐ−（ジメチルアミノフェニ
    ルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、シアニン色素、ま
    たは前記のいずれかの誘導体を含む、請求項２８５の方
    法。 【請求項３０１】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項３００の方法。 【請求項３０２】 少なくとも１つの第１のまたは第２
    の核酸プライマーまたは構築体または任意のプライマー
    伸長核酸配列は、固体支持体に固定または固定化されて
    いる、請求項２８５の方法。 【請求項３０３】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項３０２の方法。 【請求項３０４】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項３０２の方法。 【請求項３０５】 いずれかまたはすべての工程が、閉
    じた容器系で行われる、請求項２８５、２９１、２９
    ２、または２９３の方法。 【請求項３０６】 閉じた容器系は、照射源と検出装置
    またはユニットを含む、請求項３０５の方法。 【請求項３０７】 以下を含む組成物 （ｉ）１つ以上のリボヌクレオチドを含み、少なくとも
    １つのリボヌクレオチドは第１のエネルギー移動要素を
    含む、核酸鎖、および（ii）１つ以上の第２のエネルギ
    ー移動要素を含む核酸結合物質。 【請求項３０８】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギードナーであり、第２のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターである、請求項３０７の組成物。 【請求項３０９】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターであり、第２のエネルギー移動要素が
    エネルギードナーである、請求項３０７の組成物。 【請求項３１０】 第１のエネルギー要素と第２のエネ
    ルギー要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセイン
    イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフル
    オレセイン（６−ＦＡＭ）、ナフトフルオレセイン、ロ
    ーダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＸ、ロドール、
    スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン（Ｔ
    ＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネー
    ト（ＴＲＩＴＣ）、４，７−ジクロロローダミン、エオ
    シン、エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ダン
    シル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、または
    ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢ
    ＣＹＬ）、シアニン色素、または前記のいずれかの誘導
    体を含む、請求項３０７の組成物。 【請求項３１１】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項３１０の組成物。 【請求項３１２】 核酸結合物質（ｂ）は、タンパク質
    またはポリペプチドを含む、請求項３０７の組成物。 【請求項３１３】 タンパク質またはポリペプチドは、
    Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ＳＳＢタンパク質、または
    抗体を含む、請求項３０７の組成物。 【請求項３１４】 核酸結合物質（ii）は、１本鎖核酸
    結合色素を含む、請求項３０７の組成物。 【請求項３１５】 核酸鎖は、固体支持体に固定または
    固定化されている、請求項３０７の組成物。 【請求項３１６】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項３１５の組成物。 【請求項３１７】 試料中の目的の１本鎖または２本鎖
    核酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であ
    って、 （ａ）（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われる試
    料、 （ii）少なくとも１つの第１の核酸プライマーまたは核
    酸構築体、および場合により第２の核酸プライマーまた
    は核酸構築体、ここで、第１の核酸プライマーまたは核
    酸構築体、または場合により第２の核酸プライマーまた
    は核酸構築体は、ＲＮＡプロモーター配列を含む、 （iii）第１のエネルギー移動要素を含む１つ以上の標
    識リボヌクレオチド、 （iv）第２のエネルギー移動要素を含む核酸結合物質、 （ｖ）核酸鎖伸長とＲＮＡ転写とを実施するための試
    薬、を提供する工程； （ｂ）上記（i）、（ii）、（iii）、（iv）および
    （Ｖ）を含む反応混合物を形成する工程； （ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、第１の核酸プ
    ライマーまたは核酸構築体（ii）に、目的の核酸の１つ
    の鎖を接触させる工程； （ｄ）核酸プライマーを伸長して、プライマー伸長核酸
    配列を形成させる工程； （ｅ）プライマー伸長核酸配列またはその一部に相補的
    な第２の核酸鎖を合成し、こうして２本鎖核酸を形成す
    る工程； （ｆ）工程（ｅ）で形成した２本鎖核酸を転写して、標
    識リボヌクレオチド（iii）を標識転写体中に取り込む
    工程； （ｇ）核酸結合物質（iv）を標識転写体に結合させる工
    程； （ｈ）第１のエネルギー移動要素と第２のエネルギー移
    動要素の間のエネルギー移動により、目的の核酸の存在
    または量を検出する工程とを含み、 ここで転写工程（ｆ）は、工程（ｅ）で合成されたプラ
    イマー伸長核酸配列または第２の核酸鎖中のＲＮＡプロ
    モーターにより行われる、上記方法。 【請求項３１８】 合成工程（ｅ）において、第２の核
    酸鎖は、ＲＮａｓｅＨの作用により産生されるＲＮＡ断
    片のプライマー伸長により合成される、請求項３１７の
    方法。 【請求項３１９】 合成工程（ｅ）において、第２の核
    酸鎖は、随時の第２の核酸プライマーまたは核酸構築体
    のプライマー伸長により合成される、請求項３１７の方
    法。 【請求項３２０】 合成工程（ｅ）において、第２の核
    酸鎖は、プライマー伸長核酸配列への末端付加または末
    端結合により合成される、請求項３１７の方法であっ
    て、この末端付加または結合の後に、末端付加または結
    合した配列に、末端付加または結合した配列に相補的な
    １つ以上の第２の核酸プライマーまたは構築体を接触さ
    せ、次に第２の核酸プライマーまたは構築体を伸長す
    る、上記方法。 【請求項３２１】 ＲＮＡプロモーターは、Ｔ３プロモ
    ーター、Ｔ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターを
    含む、請求項３１７の方法。 【請求項３２２】 転写工程（ｆ）は、同種のＲＮＡポ
    リメラーゼにより行われる、請求項３１７の方法。 【請求項３２３】 目的の核酸（ｉ）は、反応混合物形
    成工程（ｂ）の前またはその最中に、１本鎖にされてい
    る、請求項３１７の方法。 【請求項３２４】 検出工程（ｈ）は、特定の間隔で１
    回以上行われる、請求項３１７の方法。 【請求項３２５】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー移動要素がエネルギードナーであり、かつ第２
    のエネルギー移動要素がエネルギーアクセプターである
    か、または第１のエネルギー移動要素がエネルギーアク
    セプターであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギードナーである、請求項３１７の方法。 【請求項３２６】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー要素と第２のエネルギー要素は独立に、フルオ
    レセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
    Ｃ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、
    ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、
    ローダミンＸ、ロドール、スルホローダミン１０１、テ
    トラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルロ
    ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、４，７−
    ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシア
    ネート（ＥＩＴＣ）、ダンシル、ヒドロキシクマリン、
    メトキシクマリン、またはｐ−（ジメチルアミノフェニ
    ルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、シアニン色素、ま
    たは前記のいずれかの誘導体を含む、請求項３１７の方
    法。 【請求項３２７】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項３２６の方法。 【請求項３２８】 提供工程（ａ）において、核酸結合
    物質（iv）はタンパク質またはポリペプチドを含む、請
    求項３１７の方法。 【請求項３２９】 タンパク質またはポリペプチドは、
    Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ＳＳＢタンパク質、または
    抗体を含む、請求項３２８の方法。 【請求項３３０】 提供工程（ａ）において、核酸結合
    物質（ｖ）は、１本鎖核酸結合色素を含む、請求項３１
    ７の方法。 【請求項３３１】 工程（ｆ）で得られる転写体は、固
    体支持体に固定または固定化されている、請求項３１７
    の方法。 【請求項３３２】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項３３１の方法。 【請求項３３３】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項３３１の方法。 【請求項３３４】 いずれかまたはすべての工程が、閉
    じた容器系で行われる、請求項３１７の方法。 【請求項３３５】 閉じた容器系は、照射源と検出装置
    またはユニットを含む、請求項３３４の方法。 【請求項３３６】 第１および第２の核酸を含む組成物
    であって、 第１の鎖は２つのセグメントを含み、第１のセグメント
    はプライマーまたは核酸構築体を含み、第２のセグメン
    トはプライマー伸長配列を含み、 第２の鎖は、プライマー伸長配列またはその一部にハイ
    ブリダイズした核酸プローブを含み、 ここで、プライマー伸長配列は、１つ以上の第１のエネ
    ルギー移動要素を含み、核酸プローブは、１つ以上の第
    ２のエネルギー移動要素を含む、上記組成物。 【請求項３３７】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギードナーであり、第２のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターである、請求項３３６の組成物。 【請求項３３８】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターであり、第２のエネルギー移動要素が
    エネルギードナーである、請求項３３６の組成物。 【請求項３３９】 第１のエネルギー要素と第２のエネ
    ルギー要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセイン
    イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフル
    オレセイン（６−ＦＡＭ）、ナフトフルオレセイン、ロ
    ーダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＸ、ロドール、
    スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン（Ｔ
    ＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネー
    ト（ＴＲＩＴＣ）、４，７−ジクロロローダミン、エオ
    シン、エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ダン
    シル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、または
    ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢ
    ＣＹＬ）、シアニン色素、または前記のいずれかの誘導
    体を含む、請求項３３６の組成物。 【請求項３４０】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項３３９の組成物。 【請求項３４１】 少なくとも１つの核酸鎖は、固体支
    持体に固定または固定化されている、請求項３３６の組
    成物。 【請求項３４２】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項３４１の組成物。 【請求項３４３】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項３４１の組成物。 【請求項３４４】 試料中の目的の１本鎖または２本鎖
    核酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であ
    って、 （ａ）（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われる試
    料、 （ii）目的の核酸の少なくとも一部に相補的な核酸プラ
    イマーまたは核酸構築体、 （iii）第１のエネルギー移動要素を含む標識ヌクレオ
    チド、 （iv）１つ以上の第２のエネルギー移動要素を含む核酸
    プローブ；および （ｖ）核酸鎖伸長を実施するための試薬、を提供する工
    程； （ｂ）上記（i）、（ii）、（iii）、（iv）および
    （ｖ）を含む反応混合物を形成する工程； （ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（ii）
    中の核酸プライマーに目的の核酸を接触させる工程； （ｄ）核酸プライマーを伸長して、こうして標識ヌクレ
    オチドを取り込む工程； （ｅ）プライマー伸長配列を目的の核酸（ｉ）から分離
    する工程； （ｆ）核酸プローブをプライマー伸長配列にハイブリダ
    イズさせる工程；そして （ｇ）第１のエネルギー移動要素と第２のエネルギー移
    動要素の間のエネルギー移動により、目的の核酸の存在
    または量を検出する工程、とを含む上記方法。 【請求項３４５】 核酸プローブ（iv）は、修飾ヌクレ
    オチドまたはヌクレオチド類似体を含む、請求項３４４
    の方法。 【請求項３４６】 核酸プローブ（iv）は、リボヌクレ
    オチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはこの両
    方を含む、請求項３４４の方法。 【請求項３４７】 目的の核酸（ｉ）は、反応混合物形
    成工程（ｂ）の前またはその最中に、１本鎖にされてい
    る、請求項３４４の方法。 【請求項３４８】 検出工程（ｇ）の前に、接触工程
    （ｃ）、伸長工程（ｄ）、分離工程（ｅ）、およびハイ
    ブリダイゼーション工程（ｆ）をさらに含む、請求項３
    ４４の方法。 【請求項３４９】 接触工程（ｃ）、伸長工程（ｄ）、
    分離工程（ｅ）、およびハイブリダイゼーション工程
    （ｆ）は、１回以上繰り返される、請求項３４８の方
    法。 【請求項３５０】 提供工程（ａ）において、試薬
    （ｖ）は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項３
    ４４の方法。 【請求項３５１】 分離工程は、熱変性または鎖置換に
    より行われる、請求項３４８または３４９の方法。 【請求項３５２】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー移動要素がエネルギードナーであり、かつ第２
    のエネルギー移動要素がエネルギーアクセプターである
    か、または第１のエネルギー移動要素がエネルギーアク
    セプターであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギードナーである、請求項３４４の方法。 【請求項３５３】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー要素と第２のエネルギー要素は独立に、フルオ
    レセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
    Ｃ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、
    ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、
    ローダミンＸ、ロドール、スルホローダミン１０１、テ
    トラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルロ
    ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、４，７−
    ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシア
    ネート（ＥＩＴＣ）、ダンシル、ヒドロキシクマリン、
    メトキシクマリン、またはｐ−（ジメチルアミノフェニ
    ルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、シアニン色素、ま
    たは前記のいずれかの誘導体を含む、請求項３４４の方
    法。 【請求項３５４】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項３５３の方法。 【請求項３５５】 プライマー伸長配列またはプローブ
    は、固体支持体に固定または固定化されている、請求項
    ３５４の方法。 【請求項３５６】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項３５５の方法。 【請求項３５７】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項３５５の方法。 【請求項３５８】 いずれかまたはすべての工程が、閉
    じた容器系で行われる、請求項３４４、３４８、または
    ３４９の方法。 【請求項３５９】 閉じた容器系は、照射源と検出装置
    またはユニットを含む、請求項３５８の方法。 【請求項３６０】 試料中の目的の１本鎖または２本鎖
    核酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であ
    って、 （ａ）（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われる試
    料、 （ii）目的の核酸の１つの鎖の少なくとも一部に相補的
    な核酸配列を含む、第１の核酸プライマーまたは核酸構
    築体、 （iii）１つの鎖の少なくとも一部と同一の核酸配列を
    含む、第２の核酸プライマーまたは核酸構築体； （iv）第１のエネルギー移動要素を含む１つ以上の標識
    ヌクレオチド； （ｖ）１つ以上の第２のエネルギー移動要素を含む核酸
    プローブ；および （vi）核酸鎖伸長を実施するための試薬、を提供する工
    程； （ｂ）上記（i）、（ii）、（iii）、（iv）、（Ｖ）お
    よび（vi）を含む反応混合物を形成する工程； （ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、第１の核酸プ
    ライマーまたは核酸構築体（ii）に、目的の核酸の１つ
    の鎖を接触させ、ハイブリダイゼーション条件下で、第
    ２の核酸プライマーまたは核酸構築体（iii）に、目的
    の核酸の相補鎖（もし存在するなら）を接触させる工
    程； （ｄ）第１の核酸プライマーと第２の核酸プライマーを
    伸長して、第１のプライマー伸長核酸配列と第２のプラ
    イマー伸長核酸配列（もし相補鎖が存在するなら）を形
    成させ、こうして標識ヌクレオチドを取り込む工程； （ｅ）第１のプライマー伸長核酸配列と第２のプライマ
    ー伸長核酸配列（もし工程（ｄ）で産生されるなら）を
    分離する工程； （ｆ）核酸プローブ（ｖ）を第１のプライマー伸長核酸
    配列または第２のプライマー伸長核酸配列にハイブリダ
    イズさせる工程；および （ｇ）第１のエネルギー移動要素と第２のエネルギー移
    動要素の間のエネルギー移動により、目的の核酸の存在
    または量を検出する工程、とを含む上記方法。 【請求項３６１】 核酸プローブ（ｖ）は、修飾ヌクレ
    オチドまたはヌクレオチド類似体を含む、請求項３６０
    の方法。 【請求項３６２】 核酸プローブ（ｖ）は、リボヌクレ
    オチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはこの両
    方を含む、請求項３６０の方法。 【請求項３６３】 目的の核酸の相補鎖が存在する、請
    求項３６０の方法。 【請求項３６４】 目的の核酸（ｉ）は、反応混合物形
    成工程（ｂ）の前またはその最中に、１本鎖にされてい
    る、請求項３６３の方法。 【請求項３６５】 以下をさらに含む請求項３６０の方
    法： （ｃ’）ハイブリダイゼーション条件下で、組成物（i
    i）中の第１の核酸プライマーに、工程（ｅ）からの第
    ２のプライマー伸長核酸配列（もし第２の鎖が存在する
    なら）を接触させ、ハイブリダイゼーション条件下で、
    第２の核酸プライマーまたは核酸構築体（iii）に、工
    程（ｅ）からの第１のプライマー伸長核酸配列を接触さ
    せ；そして、以後伸長工程（ｄ）、分離工程（ｅ）、お
    よびハイブリダイゼーション工程（ｆ）を繰り返す。 【請求項３６６】 以後、接触工程（ｃ’）、伸長工程
    （ｄ）、分離工程（ｅ）、およびハイブリダイゼーショ
    ン工程（ｆ）をさらに含む、請求項３６５の方法。 【請求項３６７】 検出工程（ｇ）は、ハイブリダイゼ
    ーション工程（ｆ）の最中またはその後に特定の間隔で
    行われる、請求項３６０、３６５、または３６６のいず
    れかの方法。 【請求項３６８】 提供工程（ａ）において、試薬
    （ｖ）は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項３
    ６０の方法。 【請求項３６９】 分離工程（ｅ）は、熱変性または鎖
    置換により行われる、請求項３６０、３６５、または３
    ６６の方法。 【請求項３７０】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー移動要素がエネルギードナーであり、かつ第２
    のエネルギー移動要素がエネルギーアクセプターである
    か、または第１のエネルギー移動要素がエネルギーアク
    セプターであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギードナーである、請求項３６０の方法。 【請求項３７１】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー要素と第２のエネルギー要素は独立に、フルオ
    レセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
    Ｃ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、
    ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、
    ローダミンＸ、ロドール、スルホローダミン１０１、テ
    トラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルロ
    ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、４，７−
    ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシア
    ネート（ＥＩＴＣ）、ダンシル、ヒドロキシクマリン、
    メトキシクマリン、またはｐ−（ジメチルアミノフェニ
    ルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、シアニン色素、ま
    たは前記のいずれかの誘導体を含む、請求項３６０の方
    法。 【請求項３７２】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項３７１の方法。 【請求項３７３】 プライマー伸長核酸配列または核酸
    プローブは、固体支持体に固定または固定化されてい
    る、請求項３６０の方法。 【請求項３７４】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項３７３の方法。 【請求項３７５】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項３７３の方法。 【請求項３７６】 いずれかまたはすべての工程が、閉
    じた容器系で行われる、請求項３６０、３６５、または
    ３６６の方法。 【請求項３７７】 閉じた容器系は、照射源と検出装置
    またはユニットを含む、請求項３７６の方法。 【請求項３７８】 ハイブリダイズした第１および第２
    の核酸を含む組成物であって、第１の鎖は、第１のエネ
    ルギー移動要素を含む少なくとも１つのリボヌクレオチ
    ドを含み、 第２の鎖は、第１の鎖またはその一部にハイブリダイズ
    した核酸プローブを含み、ここで核酸プローブは、１つ
    以上の第２のエネルギー移動要素を含む、上記組成物。 【請求項３７９】 核酸プローブ（ｖ）は、修飾ヌクレ
    オチドまたはヌクレオチド類似体を含む、請求項３７８
    の組成物。 【請求項３８０】 核酸プローブ（ｖ）は、リボヌクレ
    オチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはこの両
    方を含む、請求項３７８の組成物。 【請求項３８１】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギードナーであり、第２のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターである、請求項３７８の組成物。 【請求項３８２】 第１のエネルギー移動要素がエネル
    ギーアクセプターであり、第２のエネルギー移動要素が
    エネルギードナーである、請求項３７８の組成物。 【請求項３８３】 第１のエネルギー要素と第２のエネ
    ルギー要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセイン
    イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフル
    オレセイン（６−ＦＡＭ）、ナフトフルオレセイン、ロ
    ーダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＸ、ロドール、
    スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン（Ｔ
    ＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネー
    ト（ＴＲＩＴＣ）、４，７−ジクロロローダミン、エオ
    シン、エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、ダン
    シル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、または
    ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢ
    ＣＹＬ）、シアニン色素、または前記のいずれかの誘導
    体を含む、請求項３７８の組成物。 【請求項３８４】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項３８３の組成物。 【請求項３８５】 第１の鎖または核酸プローブは、固
    体支持体に固定または固定化されている、請求項３７８
    の組成物。 【請求項３８６】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項３８４の組成物。 【請求項３８７】 試料中の目的の１本鎖または２本鎖
    核酸の存在を、定性的または定量的に検出する方法であ
    って、 （ａ）（ｉ）目的の核酸を含有することが疑われる試
    料、 （ii）第１の核酸プライマーまたは核酸構築体、または
    場合により第２の核酸プライマーまたは核酸構築体は、
    ＲＮＡプロモーター配列を含む、少なくとも１つの第１
    の核酸プライマーまたは核酸構築体、および場合により
    第２の核酸プライマーまたは核酸構築体、 （iii）第１のエネルギー移動要素を含む１つ以上の標
    識リボヌクレオチド、 （iv）第２のエネルギー移動要素を含む核酸結合プロー
    ブ、 （ｖ）核酸鎖伸長とＲＮＡ転写とを実施するための試
    薬、を提供する工程； （ｂ）上記（i）、（ii）、（iii）、（iv）および
    （Ｖ）を含む反応混合物を形成する工程； （ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、第１の核酸プ
    ライマーまたは核酸構築体（ii）に、目的の核酸の１つ
    の鎖を接触させる工程； （ｄ）核酸プライマーを伸長して、プライマー伸長核酸
    配列を形成させる工程； （ｅ）プライマー伸長核酸配列またはその一部に相補的
    な第２の核酸鎖を合成し、こうして２本鎖核酸を形成す
    る工程； （ｆ）工程（ｅ）で形成した２本鎖核酸を転写して、標
    識リボヌクレオチド（iii）を標識転写体中に取り込む
    工程； （ｇ）核酸プローブ（iv）を標識転写体に結合させる工
    程； （ｈ）第１のエネルギー移動要素と第２のエネルギー移
    動要素の間のエネルギー移動により、目的の核酸の存在
    または量を検出する工程とを含み、 ここで転写工程（ｆ）は、工程（ｅ）で合成されたプラ
    イマー伸長核酸配列または第２の核酸鎖中のＲＮＡプロ
    モーターにより行われる、上記方法。 【請求項３８８】 核酸プローブ（iv）は、修飾ヌクレ
    オチドまたはヌクレオチド類似体を含む、請求項３８７
    の方法。 【請求項３８９】 核酸プローブ（iv）は、リボヌクレ
    オチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはこの両
    方を含む、請求項３８７の方法。 【請求項３９０】 合成工程（ｅ）において、第２の核
    酸鎖は、ＲＮａｓｅＨの作用により産生されるＲＮＡ断
    片のプライマー伸長により合成される、請求項３８７の
    方法。 【請求項３９１】 合成工程（ｅ）において、第２の核
    酸鎖は、随時の第２の核酸プライマーまたは核酸構築体
    のプライマー伸長により合成される、請求項３８７の方
    法。 【請求項３９２】 合成工程（ｅ）において、第２の核
    酸鎖は、プライマー伸長核酸配列への末端付加または末
    端結合により合成される、請求項３８７の方法であっ
    て、この末端付加または結合の後に、末端付加または結
    合した配列に、末端付加または結合した配列に相補的な
    １つ以上の第２の核酸プライマーまたは構築体を接触さ
    せ、次に第２の核酸プライマーまたは構築体を伸長す
    る、上記方法。 【請求項３９３】 ＲＮＡプロモーターは、Ｔ３プロモ
    ーター、Ｔ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターを
    含む、請求項３８７の方法。 【請求項３９４】 転写工程（ｆ）は、同種のＲＮＡポ
    リメラーゼにより行われる、請求項３８７の方法。 【請求項３９５】 目的の核酸（ｉ）は、反応混合物形
    成工程（ｂ）の前またはその最中に、１本鎖にされてい
    る、請求項３８７の方法。 【請求項３９６】 検出工程（ｈ）は、特定の間隔で１
    回以上行われる、請求項３８７の方法。 【請求項３９７】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー移動要素がエネルギードナーであり、かつ第２
    のエネルギー移動要素がエネルギーアクセプターである
    か、または第１のエネルギー移動要素がエネルギーアク
    セプターであり、かつ第２のエネルギー移動要素がエネ
    ルギードナーである、請求項３８７の方法。 【請求項３９８】 提供工程（ａ）において、第１のエ
    ネルギー要素と第２のエネルギー要素は独立に、フルオ
    レセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
    Ｃ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、
    ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、
    ローダミンＸ、ロドール、スルホローダミン１０１、テ
    トラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルロ
    ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、４，７−
    ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシア
    ネート（ＥＩＴＣ）、ダンシル、ヒドロキシクマリン、
    メトキシクマリン、またはｐ−（ジメチルアミノフェニ
    ルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、シアニン色素、ま
    たは前記のいずれかの誘導体を含む、請求項３８７の方
    法。 【請求項３９９】 シアニン色素または誘導体は、Ｃｙ
    ３またはＣｙ５を含む、請求項３９８の方法。 【請求項４００】 工程（ｆ）で得られる転写体は、固
    体支持体に固定または固定化されている、請求項３８７
    の方法。 【請求項４０１】 固体支持体は、ビーズ、試験管、マ
    イクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチッ
    クスライド、マイクロチップアレイ、ウェル、またはく
    ぼみを含む、請求項４００の方法。 【請求項４０２】 固定または固定化は、直接または間
    接である、請求項４００の方法。 【請求項４０３】 いずれかまたはすべての工程が、閉
    じた容器系で行われる、請求項３８７の方法。 【請求項４０４】 閉じた容器系は、照射源と検出装置
    またはユニットを含む、請求項４０３の方法。 【請求項４０５】 少なくとも２つのセグメントを含む
    キメラ核酸構築体であって、第１のセグメントは５個以
    上のユニバーサル塩基を含み、第２のセグメントは、分
    かれた核酸配列を合成するための鋳型を含む、上記構築
    体。 【請求項４０６】 分かれた核酸配列は、少なくとも１
    つのプライマー結合配列またはプロモーター配列を含
    む、請求項４０５の構築体。 【請求項４０７】 プライマー結合配列はホモポリマー
    性またはヘテロポリマー性である、請求項４０６の構築
    体。 【請求項４０８】 ホモポリマー配列は、ポリＴ、ポリ
    Ｕ、ポリＧ、ポリＣ、またはポリＡを含む、請求項４０
    ７の構築体。 【請求項４０９】 ヘテロポリマー配列はＲＮＡプロモ
    ーター配列を含む、請求項４０７の構築体。 【請求項４１０】 ＲＮＡプロモーター配列は、Ｔ３プ
    ロモーター、Ｔ７プロモーターまたはＳＰ６プロモータ
    ーを含む、請求項４０９の構築体。 【請求項４１１】 第１のセグメントは、約８〜約１５
    個のユニバーサル塩基を含む、請求項４１２の構築体。 【請求項４１２】 ユニバーサル塩基は、イノシン、５
    −ニトロインドール、または３−ニトロピロールを含
    む、請求項４０５の構築体。 【請求項４１３】 第１のセグメントの５’末端は、第
    ２のセグメントの３’末端に結合している、請求項４０
    ５の構築体。 【請求項４１４】 所望の核酸配列をアナライトまたは
    アナライトのライブラリーに取り込む方法であって、 （ａ）（ｉ）アナライトまたはアナライトのライブラリ
    ー、 （ii）第１のセグメントは５個以上のユニバーサル塩基
    を含み、第２のセグメントは、所望の核酸配列を合成す
    るための鋳型を含む、少なくとも２つのセグメントを含
    むキメラ核酸構築体；および （iii）ハイブリダイゼーションと鋳型依存性鎖伸長を
    実施するための試薬、を提供する工程； （ｂ）キメラ核酸構築体（ii）をアナライトまたはアナ
    ライトのライブラリー（ｉ）に結合またはハイブリダイ
    ズさせる工程；および （ｃ）アナライトまたはアナライトのライブラリーの
    ３’末端を伸長させる工程とを含み、 第２のセグメントがアナライトまたはアナライトのライ
    ブラリーの３’末端の近傍にある時、第２のセグメント
    は伸長工程（ｃ）の鋳型である、上記方法。 【請求項４１５】 第１のセグメントの５’末端は、第
    ２のセグメントの３’末端に結合している、請求項４１
    ４の構築体。 【請求項４１６】 所望の核酸配列は、少なくとも１つ
    のプライマー結合配列またはプロモーター配列を含む、
    請求項４１４の方法。 【請求項４１７】 プライマー結合配列はホモポリマー
    性またはヘテロポリマー性である、請求項４１６の方
    法。 【請求項４１８】 ホモポリマー配列は、ポリＴ、ポリ
    Ｕ、ポリＧ、ポリＣ、またはポリＡを含む、請求項４１
    ７の方法。 【請求項４１９】 ヘテロポリマー配列はＲＮＡプロモ
    ーター配列を含む、請求項４１７の方法。 【請求項４２０】 ＲＮＡプロモーター配列は、Ｔ３プ
    ロモーター、Ｔ７プロモーターまたはＳＰ６プロモータ
    ーを含む、請求項４１９の方法。 【請求項４２１】 提供工程（ａ）において、アナライ
    トまたはアナライトのライブラリーはＤＮＡまたはＲＮ
    Ａを含む、請求項４１４の方法。 【請求項４２２】 ＤＮＡは、染色体ＤＮＡ、エピソー
    ムＤＮＡ、またはウイルスＤＮＡを含む、請求項４２１
    の方法。 【請求項４２３】 ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｓ
    ｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはウイルスＲＮＡ
    を含む、請求項４２１の方法。 【請求項４２４】 提供工程（ａ）において、ＤＮＡま
    たはＲＮＡは断片化されている、請求項４１４の方法。 【請求項４２５】 断片化は、化学的、物理的、または
    酵素的方法により行われる、請求項４２４の方法。 【請求項４２６】 酵素的方法は、エンドヌクレアーゼ
    により行われる、請求項４２５の方法。 【請求項４２７】 提供工程（ａ）において、第１のセ
    グメントは、約８〜約１５個のユニバーサル塩基を含
    む、請求項４１４の方法。 【請求項４２８】 提供工程（ａ）において、ユニバー
    サル塩基は、イノシン、５−ニトロインドール、または
    ３−ニトロピロールを含む、請求項４１４の方法。 【請求項４２９】 提供工程（ａ）において、試薬（ii
    i）はポリメラーゼまたはリガーゼを含む、請求項４１
    ４の方法。 【請求項４３０】 ポリメラーゼは、逆転写酵素、ＤＮ
    Ａ ＰｏｌＩ、ＰｏｌＩのクレノウ断片を含む、請求項
    ４２９の方法。 【請求項４３１】 リガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼを
    含む、請求項４２９の方法。 【請求項４３２】 試薬（iii）は１つ以上の標識ヌク
    レオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項４１
    ４の方法。 【請求項４３３】 結合またはハイブリダイゼーション
    工程（ｂ）は、キメラ核酸構築体（ii）とアナライトま
    たはアナライトのライブラリー（ｉ）との安定な複合体
    またはハイブリッドを形成するための温度に近い温度お
    よび条件下で行われる、請求項４１４の方法。 【請求項４３４】 アナライトまたはアナライトのライ
    ブラリーをホスファターゼで前処理する工程（ａ’）を
    さらに含む、請求項４１４の方法。 【請求項４３５】 提供工程（ａ）において、キメラ核
    酸構築体（ii）は鎖伸長が不可能である、請求項４１４
    の方法。 【請求項４３６】 キメラ核酸構築体のセットを含む組
    成物であって、そのような各構築体は少なくとも３つの
    セグメントを含み、第１のセグメントは４つ以上のユニ
    バーサル塩基を含み、第２のセグメントは、１〜８個の
    ヌクレオチドの並べ換えを含み、第３のセグメントは、
    所望の核酸配列を合成するための鋳型を含み、 ここで第２のセグメントでは、１〜８個のヌクレオチド
    の並べ換えは、 （Ｎ）n （式中、Ｎは独立に、Ｇ、Ａ、ＴまたはＣであり、ｎは
    １〜８の整数である）を含む、上記組成物。 【請求項４３７】 各構築体において、第１のセグメン
    トの５’末端は、第２のセグメントの３’末端に結合
    し、第２のセグメントの５’末端は、第３のセグメント
    の３’末端に結合している、請求項４３６の組成物。 【請求項４３８】 所望の核酸配列は、少なくとも１つ
    のプライマー結合配列またはプロモーター配列を含む、
    請求項４３６の組成物。 【請求項４３９】 プライマー結合配列はホモポリマー
    性またはヘテロポリマー性である、請求項４３８の組成
    物。 【請求項４４０】 ホモポリマー配列は、ポリＴ、ポリ
    Ｕ、ポリＧ、ポリＣ、またはポリＡを含む、請求項４３
    ９の組成物。 【請求項４４１】 ヘテロポリマー配列はＲＮＡプロモ
    ーター配列を含む、請求項４３９の組成物。 【請求項４４２】 ＲＮＡプロモーター配列は、Ｔ３プ
    ロモーター、Ｔ７プロモーターまたはＳＰ６プロモータ
    ーを含む、請求項４４１の組成物。 【請求項４４３】 第１のセグメントは、約６〜約１５
    個のユニバーサル塩基を含む、請求項４３６の組成物。 【請求項４４４】 第１のセグメントは、４個のユニバ
    ーサル塩基を含み、ｎは４である、請求項４３６の組成
    物。 【請求項４４５】 第１のセグメントは、４個のユニバ
    ーサル塩基を含み、ｎは６である、請求項４３６の組成
    物。 【請求項４４６】 第１のセグメント中のユニバーサル
    塩基は、イノシン、５−ニトロインドール、または３−
    ニトロピロールを含む、請求項４３６の組成物。 【請求項４４７】 キメラ核酸構築体は、鎖伸長が不可
    能である、請求項４３６の組成物。 【請求項４４８】 所望の核酸配列をアナライトまたは
    アナライトのライブラリーに取り込む方法であって、
    （ａ）（ｉ）アナライトまたはアナライトのライブラリ
    ー、（ii）各構築体が少なくとも３つのセグメントを含
    む、キメラ核酸構築体のセットであって、第１のセグメ
    ントは４つ以上のユニバーサル塩基を含み、第２のセグ
    メントは、１〜８個のヌクレオチドの並べ換えを含み、
    第３のセグメントは、所望の核酸配列を合成するための
    鋳型を含み、ここで第２のセグメントでは、１〜８個の
    ヌクレオチドの並べ換えは、 （Ｎ）n （式中、Ｎは独立に、Ｇ、Ａ、ＴまたはＣであり、ｎは
    １〜８の整数である）を含む、上記セット；および（ii
    i）ハイブリダイゼーションと鋳型依存性鎖伸長を実施
    するための試薬、を提供する工程；（ｂ）キメラ核酸構
    築体（ii）をアナライトまたはアナライトのライブラリ
    ー（ｉ）に結合またはハイブリダイズさせる工程；およ
    び（ｃ）アナライトまたはアナライトのライブラリーの
    ３’末端を伸長させる工程とを含み、第２のセグメント
    がアナライトまたはアナライトの３’末端にハイブリダ
    イズしている時、第３のセグメントは伸長工程（ｃ）の
    鋳型である、上記方法。 【請求項４４９】 提供工程（ａ）、各構築体におい
    て、第１のセグメントの５’末端は、第２のセグメント
    の３’末端に結合し、第２のセグメントの５’末端は、
    第３のセグメントの３’末端に結合している、請求項４
    ４８の方法。 【請求項４５０】 所望の核酸配列は、少なくとも１つ
    のプライマー結合配列またはプロモーター配列を含む、
    請求項４４８の方法。 【請求項４５１】 プライマー結合配列はホモポリマー
    性またはヘテロポリマー性である、請求項４５０の方
    法。 【請求項４５２】 ホモポリマー配列は、ポリＴ、ポリ
    Ｕ、ポリＧ、ポリＣ、またはポリＡを含む、請求項４５
    １の方法。 【請求項４５３】 ヘテロポリマー配列はＲＮＡプロモ
    ーター配列を含む、請求項４５１の方法。 【請求項４５４】 ＲＮＡプロモーター配列は、Ｔ３プ
    ロモーター、Ｔ７プロモーターまたはＳＰ６プロモータ
    ーを含む、請求項４５３の方法。 【請求項４５５】 提供工程（ａ）において、アナライ
    トまたはアナライトのライブラリー（ｉ）はＤＮＡまた
    はＲＮＡを含む、請求項４４８の方法。 【請求項４５６】 ＤＮＡは、染色体ＤＮＡ、エピソー
    ムＤＮＡ、またはウイルスＤＮＡを含む、請求項４５５
    の方法。 【請求項４５７】 ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｓ
    ｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはウイルスＲＮＡ
    を含む、請求項４５５の方法。 【請求項４５８】 提供工程（ａ）において、ＤＮＡま
    たはＲＮＡは断片化されている、請求項４４８の方法。 【請求項４５９】 断片化は、化学的、物理的、または
    酵素的方法により行われる、請求項４５８の方法。 【請求項４６０】 酵素的方法は、エンドヌクレアーゼ
    により行われる、請求項４５９の方法。 【請求項４６１】 提供工程（ａ）において、第１のセ
    グメントは、約６〜約１５個のユニバーサル塩基を含
    む、請求項４４８の方法。 【請求項４６２】 提供工程（ａ）において、第１のセ
    グメントは、４個のユニバーサル塩基を含み、ｎは４で
    ある、請求項４４８の方法。 【請求項４６３】 提供工程（ａ）において、第１のセ
    グメントは、４個のユニバーサル塩基を含み、ｎは６で
    ある、請求項４３６の方法。 【請求項４６４】 提供工程（ａ）において、ユニバー
    サル塩基は、イノシン、５−ニトロインドール、または
    ３−ニトロピロールを含む、請求項４４８の方法。 【請求項４６５】 提供工程（ａ）において、試薬（ii
    i）はポリメラーゼまたはリガーゼを含む、請求項４４
    ８の方法。 【請求項４６６】 ポリメラーゼは、逆転写酵素、ＤＮ
    Ａ ＰｏｌＩ、ＰｏｌＩのクレノウ断片を含む、請求項
    ４６５の方法。 【請求項４６７】 リガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼを
    含む、請求項４６６の方法。 【請求項４６８】 試薬（iii）は１つ以上の標識ヌク
    レオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項４４
    ８の方法。 【請求項４６９】 結合またはハイブリダイゼーション
    工程（ｂ）は、キメラ核酸構築体（ii）とアナライトま
    たはアナライトのライブラリー（ｉ）との安定な複合体
    またはハイブリッドを形成するための温度に近い温度お
    よび条件下で行われる、請求項４４８の方法。 【請求項４７０】 アナライトまたはアナライトのライ
    ブラリーをホスファターゼで前処理する工程（ａ’）を
    さらに含む、請求項４４８の方法。 【請求項４７１】 提供工程（ａ）において、キメラ核
    酸構築体（ii）は鎖伸長が不可能にされている、請求項
    ４４８の方法。 【請求項４７２】 ４つ以上のユニバーサル塩基を含む
    無第１のセグメントと、 目的の分かれた核酸配列に相補的な第２のセグメント
    の、少なくとも２つのセグメントを含むキメラ核酸構築
    体であって、 第１のセグメントの５’末端は第２のセグメントの３’
    末端に結合し、第２のセグメントの５’末端は第３のセ
    グメントの３’末端に結合している、上記キメラ核酸構
    築体。 【請求項４７３】 ユニバーサル塩基は、イノシン、５
    −ニトロインドール、または３−ニトロピロールを含
    む、請求項４７２の構築体。 【請求項４７４】 第１のセグメントは、約６〜約１０
    個のユニバーサル塩基を含む、請求項４７２の構築体。 【請求項４７５】 第２のセグメントは、少なくとも４
    個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む、請
    求項４７２の構築体。 【請求項４７６】 第２のセグメントは、制限酵素の認
    識配列を含む、請求項４７２の構築体。 【請求項４７７】 第２のセグメントは、第２のセグメ
    ントを制限酵素に対して耐性にする修飾ヌクレオチドを
    含む、請求項４７２の構築体。 【請求項４７８】 少なくとも４個のユニバーサル塩基
    を含む第３のセグメントをさらに含む、請求項４７２の
    構築体。 【請求項４７９】 所望の核酸配列を含む第３のセグメ
    ントをさらに含む、請求項４７２の構築体。 【請求項４８０】 所望の核酸配列は、少なくとも１つ
    のプライマー結合配列またはプロモーター配列を含む、
    請求項４７９の構築体。 【請求項４８１】 プライマー結合配列はホモポリマー
    性またはヘテロポリマー性である、請求項４８０の構築
    体。 【請求項４８２】 ホモポリマー配列は、ポリＴ、ポリ
    Ｕ、ポリＧ、ポリＣ、またはポリＡを含む、請求項４８
    １の構築体。 【請求項４８３】 ヘテロポリマー配列はＲＮＡプロモ
    ーター配列を含む、請求項４８１の構築体。 【請求項４８４】 ＲＮＡプロモーター配列は、Ｔ３プ
    ロモーター、Ｔ７プロモーターまたはＳＰ６プロモータ
    ーを含む、請求項４８３の構築体。 【請求項４８５】 キメラ核酸構築体は鎖伸長が不可能
    である、請求項４７２の構築体。 【請求項４８６】 アナライトまたはアナライトのライ
    ブラリーを選択された位置または配列で切断する方法で
    あって、 （ａ）（ｉ）アナライトまたはアナライトのライブラリ
    ー、 （ii）請求項４７２の組成物、 （iii）特異的エンドヌクレアーゼ、 （iv）ハイブリダイゼーションとエンドヌクレアーゼ性
    分解消化のための試薬を、提供する工程； （ｂ）組成物（ii）をアナライトまたはアナライトのラ
    イブラリー（ｉ）にハイブリダイズさせて、類似体また
    はアナライトのライブラリー（ｉ）中の第２のセグメン
    トと選択された部位または配列の間でハイブリッドを形
    成する工程；および （ｃ）ハイブリッドをエンドヌクレアーゼ性分解する工
    程を含む、上記方法。 【請求項４８７】 提供工程（ａ）において、組成物
    （ii）中のユニバーサル塩基は、イノシン、５−ニトロ
    インドール、または３−ニトロピロールを含む、請求項
    ４８６の方法。 【請求項４８８】 提供工程（ａ）において、組成物
    （ii）中の第２のセグメントは、制限酵素の認識配列を
    含む、請求項４８６の方法。 【請求項４８９】 提供工程（ａ）において、組成物
    （ii）中の第２のセグメントは、第２のセグメントを制
    限酵素に対して耐性にする修飾ヌクレオチドを含む、請
    求項４８８の方法。 【請求項４９０】 提供工程（ａ）において、組成物
    （ii）は、所望の核酸配列を含む第３のセグメントをさ
    らに含む、請求項４８６の方法。 【請求項４９１】 所望の核酸配列は、少なくとも１つ
    のプライマー結合配列またはプロモーター配列を含む、
    請求項４９０の方法。 【請求項４９２】 提供工程（ａ）において、組成物
    （ii）は鎖伸長が不可能にされている、請求項４８６の
    方法。 【請求項４９３】 ホスファターゼで前処理する工程
    （ｄ）をさらに含む、請求項４８６の方法。 【請求項４９４】 提供工程（ａ）において、鎖伸長の
    ための試薬も提供される、請求項４８６の方法。 【請求項４９５】 残りのアナライトまたはアナライト
    のライブラリー中の３’末端を伸長する工程をさらに含
    み、ここで３’末端はエンドヌクレアーゼ性分解切断工
    程（ｃ）により産生されている、請求項４９４の方法。 【請求項４９６】 伸長工程は、１つ以上の標識ヌクレ
    オチドまたはオリゴヌクレオチドの存在下で行われる、
    請求項４９５の方法。 【請求項４９７】 所望の核酸配列をアナライトまたは
    アナライトのライブラリーに取り込む方法であって、 （ａ）（ｉ）アナライトまたはアナライトのライブラリ
    ー、 （ii）少なくとも２つのセグメントを含むキメラ核酸構
    築体であって、２つのセグメントの第１は、第１のアナ
    ライト核酸配列に相補的であり、２つのセグメントの第
    ２は、第２のアナライト核酸配列に相補的である、上記
    キメラ核酸構築体、 （iii）ハイブリダイゼーションとエンドヌクレアーゼ
    性分解消化のための試薬、 （iv）エンドヌクレアーゼ、および （ｖ）鎖伸長のための試薬を、提供する工程； （ｂ）上記（ｉ）、（ii）、（iii）および（iv）を含
    む混合物を形成する工程； （ｃ）キメラ核酸構築体（ii）をアナライトまたはアナ
    ライトのライブラリー（ｉ）とハイブリダイズさせ、こ
    うして第１のセグメントと第１のアナライト核酸配列の
    間で第１の複合体を形成させ、第２のセグメントと第２
    のアナライト核酸配列の間で第２の複合体を形成させる
    工程であって、 ここで、第１の複合体はエンドヌクレアーゼによる消化
    に対して耐性であり、第２の複合体は、エンドヌクレア
    ーゼ性分解消化に感受性の１つ以上の部位を含む、上記
    工程； （ｄ）第２の複合体をエンドヌクレアーゼ（iv）で消化
    する工程；および （ｅ）３’末端はエンドヌクレアーゼ（iv）により生成
    された、第２のアナライト核酸配列の３’末端を伸長す
    る工程であって、 ここで伸長工程（ｅ）は、鋳型依存性重合または連結に
    より行われる、上記方法。 【請求項４９８】 提供工程（ａ）において、アナライ
    トまたはアナライトのライブラリー（ｉ）は、ＤＮＡ、
    ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む、請求項
    ４９７の方法。 【請求項４９９】 提供工程（ａ）、第１のセグメント
    において、第１のアナライト核酸配列はＲＮＡを含み、
    第２のセグメントはＤＮＡを含み、第２のアナライト核
    酸配列はＲＮＡを含み、エンドヌクレアーゼ（iv）をＲ
    ＮａｓｅＨを含む、請求項４９７の方法。 【請求項５００】 提供工程（ａ）において、第２のセ
    グメントおよび第２のアナライト核酸配列は、非対称制
    限酵素の認識配列を含む、請求項４９７の方法。 【請求項５０１】 非対称制限酵素はＮ．ＢｓｔＮＢＩ
    を含む、請求項５００の方法。 【請求項５０２】 提供工程（ａ）において、第１のセ
    グメントは、エンドヌクレアーゼ（iv）による消化に対
    して耐性を付与する、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオ
    チド類似体を含む、請求項４９７の方法。 【請求項５０３】 形成工程（ｂ）において、（ｉ）、
    （ii）、および（iii）が混合され、次にハイブリダイ
    ゼーション工程（ｃ）後に（iv）と（ｖ）が加えられ
    る、請求項４９７の方法。 【請求項５０４】 形成工程（ｂ）において、（ｉ）、
    （ii）、（iii）および（ｖ）が混合され、次にハイブ
    リダイゼーション工程（ｃ）後に（iv）が加えられる、
    請求項４９７の方法。 【請求項５０５】 鎖伸長工程（ｅ）はまた、鎖置換を
    含む、請求項４９７の方法。 【請求項５０６】 脱リン酸化工程を実施する工程
    （ｆ）をさらに含む、請求項４９７の方法。 【請求項５０７】 請求項４９７の方法であって、キメ
    ラ核酸構築体（ii）は、第３のアナライト核酸配列に相
    補的な第３のセグメントをさらに含み、ハイブリダイゼ
    ーション工程（ｃ）は、第３のセグメントと第３のアナ
    ライト核酸配列との第３の複合体の形成をさらに含み、
    ここで第３の複合体は、エンドヌクレアーゼによる消化
    に対して耐性である、上記方法。 【請求項５０８】 提供工程（ａ）において、第３のセ
    グメントは、エンドヌクレアーゼ（iv）による消化に対
    して耐性を付与する、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオ
    チド類似体を含む、請求項５０７の方法。 【請求項５０９】 キメラ核酸構築体（ii）は、アナラ
    イトまたはアナライトのライブラリーに対して非相補的
    な第３のセグメントをさらに含む、請求項４９７の方
    法。 【請求項５１０】 第３のセグメントは、プライマー結
    合部位またはＲＮＡプロモーター配列を含む、請求項５
    ０９の方法。 【請求項５１１】 提供工程（ａ）においてアナライト
    またはアナライトのライブラリーは断片化されている、
    請求項４９７の方法。 【請求項５１２】 アナライトまたはアナライトのライ
    ブラリーはエンドヌクレアーゼにより断片化されてい
    る、請求項５１１の方法。 【請求項５１３】 エンドヌクレアーゼは、ＲＮａｓ
    ｅ、ＤＮａｓｅ、Ｓ１ヌクレアーゼ、大豆ヌクレアーゼ
    または制限酵素を含む、請求項５１２の方法。 【請求項５１４】 鎖伸長のための試薬は、１つ以上の
    標識ヌクレオチドまたは標識オリゴヌクレオチドを含
    む、請求項４９７の方法。 【請求項５１５】 キメラ核酸構築体（ii）は、鎖伸長
    が不可能であるかまたは不可能にされている、請求項４
    ９７の方法。 【請求項５１６】 少なくとも２つの核酸セグメントを
    含むキメラ核酸構築体であって、第１のセグメントと第
    ２のセグメントは、それぞれ目的の核酸中のホモポリマ
    ー配列の異なる部分に相補的な配列を含み、 ホモポリマー配列の第１の部分への第１のセグメントの
    ハイブリダイゼーションが、第１の複合体を産生し、 ホモポリマー配列の第２の部分への第２のセグメントの
    ハイブリダイゼーションが、第２の複合体を産生し、 第２の複合体中のホモポリマー配列の第２の部分は、特
    異的エンドヌクレアーゼの基質であり、第１の複合体は
    特異的エンドヌクレアーゼに対して耐性である、上記キ
    メラ核酸構築体。 【請求項５１７】 少なくとも２つの核酸セグメント
    は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまた
    はこれらの組合せを含む、請求項５１６の構築体。 【請求項５１８】 リボヌクレオチドまたはデオキシリ
    ボヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチド、リボヌクレ
    オチド類似体、修飾デオキシリボヌクレオチド、または
    デオキシリボヌクレオチド類似体を含む、請求項５１７
    の構築体。 【請求項５１９】 第１のセグメントの５’末端は、第
    ２のセグメントの３’末端に結合している、請求項５１
    ６の構築体。 【請求項５２０】 ホモポリマー配列はリボヌクレオチ
    ドを含む、請求項５１６の構築体。 【請求項５２１】 第１のセグメントはリボヌクレオチ
    ドを含み、第２のセグメントはデオキシリボヌクレオチ
    ドを含む、請求項５１７の構築体。 【請求項５２２】 特異的エンドヌクレアーゼはリボヌ
    クレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）を含む、請求項５１６の
    構築体。 【請求項５２３】 ホモポリマー配列は、リボヌクレオ
    チドを含み、第１のセグメントはリボヌクレオチドを含
    み、第２のセグメントはデオキシリボヌクレオチドを含
    み、そして特異的エンドヌクレアーゼはリボヌクレアー
    ゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）を含む、請求項５１７の構築体。 【請求項５２４】 ホモポリマー配列はオリゴＡまたは
    ポリＡを含む、請求項５１７の構築体。 【請求項５２５】 所望の核酸配列を含む第３のセグメ
    ントをさらに含む、請求項５１６の構築体。 【請求項５２６】 所望の核酸配列は、プライマー結合
    配列またはプロモーター配列を含む、請求項５２５の構
    築体。 【請求項５２７】 所望の核酸配列は、１つ以上のユニ
    バーサル塩基を含む、請求項５２５の構築体。 【請求項５２８】 アナライトまたはアナライトのライ
    ブラリーからホモポリマー配列の一部を除去する方法で
    あって、 （ａ）（ｉ）アナライトまたはアナライトのライブラリ
    ー、 （ii）請求項１の構築体、 （iii）エンドヌクレアーゼ、 （iv）ハイブリダイゼーションとエンドヌクレアーゼ性
    分解消化のための試薬、を提供する工程； （ｂ）構築体（ii）に、アナライトまたはアナライトの
    ライブラリー（ｉ）をハイブリダイズさせて、ホモポリ
    マー配列の一部にハイブリダイズした構築体（ii）中の
    第２のセグメントを含む少なくとも１つの第２の複合体
    と、ホモポリマー配列の異なる一部にハイブリダイズし
    た構築体（ii）中の第１のセグメントを含む少なくとも
    １つの第１の複合体とを形成させる工程； （ｃ）第２の複合体中の第２のセグメントにハイブリダ
    イズしたホモポリマー配列の一部を、エンドヌクレアー
    ゼ性分解により除去する工程を含む、上記方法。 【請求項５２９】 少なくとも２つの核酸セグメント
    は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまた
    はこれらの組合せを含む、請求項５２８の方法。 【請求項５３０】 リボヌクレオチドまたはデオキシリ
    ボヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチド、リボヌクレ
    オチド類似体、修飾デオキシリボヌクレオチド、または
    デオキシリボヌクレオチド類似体を含む、請求項５２９
    の方法。 【請求項５３１】 第１のセグメントの５’末端は、第
    ２のセグメントの３’末端に結合している、請求項５２
    ８の方法。 【請求項５３２】 ホモポリマー配列はリボヌクレオチ
    ドを含む、請求項５２８の方法。 【請求項５３３】 第１のセグメントはリボヌクレオチ
    ドを含み、第２のセグメントはデオキシリボヌクレオチ
    ドを含む、請求項５２９の方法。 【請求項５３４】 特異的エンドヌクレアーゼはリボヌ
    クレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）を含む、請求項５２８の
    方法。 【請求項５３５】 ホモポリマー配列は、リボヌクレオ
    チドを含み、第１のセグメントはリボヌクレオチドを含
    み、第２のセグメントはデオキシリボヌクレオチドを含
    み、そして特異的エンドヌクレアーゼはリボヌクレアー
    ゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）を含む、請求項５２８、５２９、
    または５３０の方法。 【請求項５３６】 ホモポリマー配列はオリゴＡまたは
    ポリＡを含む、請求項５２８の方法。 【請求項５３７】 所望の核酸配列を含む第３のセグメ
    ントをさらに含む、請求項５２８の方法。 【請求項５３８】 所望の核酸配列は、プライマー結合
    配列またはプロモーター配列を含む、請求項５３７の方
    法。 【請求項５３９】 所望の核酸配列は、１つ以上のユニ
    バーサル塩基を含む、請求項５３７の方法。 【請求項５４０】 ホスファターゼで前処理する工程
    （ｄ’）をさらに含む、請求項５２８の方法。 【請求項５４１】 提供工程（ａ）において、鎖伸長の
    ための試薬も提供される、請求項５２８の方法。 【請求項５４２】 残りのホモポリマー配列中の３’末
    端を伸長する工程（ｄ）をさらに含み、ここで３’末端
    はエンドヌクレアーゼ性分解切断工程（ｃ）により産生
    されている、請求項５４１の方法。 【請求項５４３】 伸長工程（ｄ）は、１つ以上の標識
    ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの存在下で行わ
    れる、請求項５４２の方法。
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